CN106370860A - 血清免疫球蛋白e胶体金层析定量检测试剂盒及试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种血清免疫球蛋白E胶体金层析定量检测试剂盒及试纸条,所述试剂盒包括:胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体、兔抗人IgE多克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体。本发明采用胶体金免疫层析技术,需要与免疫层析结果判读仪联合使用。本发明所述的试剂盒以及试纸条具有操作简单,无需培训,可迅速掌握,无需大型设备,适合基层实验室或社区实验室应用。
Description
技术领域
本发明属于临床医学检验领域,尤其是涉及一种血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒,采用胶体金免疫层析技术,与免疫层析结果判读仪联合使用。
背景技术
“过敏性疾病”是指机体对某些抗原初次应答后,再次接受相同抗原刺激时发生的一种病理性免疫应答。过敏性疾病主要由免疫球蛋白E(IgE)介导,导致过敏性疾病的抗原称为“过敏原(allergen)”。过敏原进入机体后可刺激B淋巴细胞产生特异性IgE(sIgE)抗体,sIgE与肥大细胞或嗜碱性粒细胞结合使机体处于致敏状态。当相同过敏原再次进入已致敏状态机体时,过敏原与特异性IgE抗体结合而触发致敏细胞的活化,释放活性介质产生过敏反应并导致临床症状。近年来,随着社会经济的发展,生活环境的改善和生活方式的变化,过敏性疾病正在迅速增加。研究发现,正常人血清tIgE水平很低,但在发生过敏反应时会显著升高。临床上,血清tIgE测定常作为过敏反应性疾病的初筛试验或鉴别诊断指标。
早期血清tIgE检测方法是上世纪60年代所建立的免疫放射分析方法。此方法以放射性核素(125I)作为标记物,采用双抗体夹心分析模式。基本原理如下:于固相材料包被抗人-IgE多克隆抗体(捕获抗体),用125I标记抗人-IgE单克隆抗体(标记抗体);待检血清中IgE与塑料试管表面的捕获抗体结合,同时结合标记抗体形成捕获抗体-待检IgE-标记抗体复合物,经洗涤分离游离标记抗体,通过γ计数器测定放射信号,信号强度与血清IgE含量呈正比例函数关系。免疫放射分析具有较高的分析敏感性和分析特异性,但因放射性污染问题,如今已被淘汰。
目前,被临床实验室广泛使用的血清IgE定量方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、发光免疫分析(FIA)和免疫比浊分析(含散射和透射)。ELISA方法采用96-T板式方式适合批量检测,技术成熟、检测成本低;但影响酶的因素较多,分析精密度差,不适合单一标本独立检测。发光免疫分析(FIA)具有较高分析特异性和分析精密度,但国内技术尚未成熟,分析仪器及其试剂主要依靠进口,检测成本较高不适合基层医疗单位应用。免疫比浊技术(IA)需采用乳球增强比浊分析技术(PETIA),用抗人-IgE抗体包被包被聚苯乙烯微粒作为主要试剂。当血清中IgE与聚苯乙烯微粒表面的抗IgE结合导致聚苯乙烯微粒靠近和聚集,此种聚集导致穿过溶液的光束发生散射。检测某种角度散射光,散射光的强度与样本IgE浓度呈正比例函数关系。此种方法是目前国内广泛应用血清IgE定量方法,采使用西门子(SIEMENS)公司BN ProSpec特种蛋白分析仪,配套使用相应进口试剂。正常血清IgE含量很低,而过敏患者血清IgE水平较高,因此,需要较宽检测范围,为保证任何水平IgE均获得准确结构,需使用高质量抗人IgE抗体和具有监测“钩状效应”软件和硬件***,故对分析仪器性能要求很高。
如前文所述,过敏性疾病是一种常见病和多发病,且中国人口众多,地域广阔,一些基层医疗单位因不能开展血清IgE定量检测,不能对过敏性疾病进行鉴别诊断,从而加重三级甲等医院的门诊负担。同时,正常人血清IgE水平低于100IU/ml,而过敏性疾病患者含量差异很大,从每毫升几百单位到几千单位。针对异常标本,精确定量到“十”位对临床诊断,特别是鉴别诊断没有实际意义。因此,针对基层医院的“初诊”患者,急需一种简单、快速、成本低POCT产品,能够快速检测外周血IgE含量的体外诊断试剂。
发明内容
有鉴于此,本发明旨在提出一种血清免疫球蛋白E胶体金层析定量检测试剂盒以及试纸条,以实现血清IgE含量的快速定量的检测。
为达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒,包括:胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体、兔抗人IgE多克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体。
优选的,所述胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体的浓度为2~20微克/毫升,优选的,5微克/毫升;所述兔抗人IgE多克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体均为0.5-1.0毫克/毫升,优选0.8毫克/毫升。
优选的,所述胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体通过如下方法制备而成,调节胶体金溶液pH至8.0-8.4;于胶体金溶液中加入抗体,搅拌5-10分钟;再加入牛血清白蛋白,至牛血清白蛋白的终浓度为2.5-25mg/mL,优选5mg/mL,搅拌混匀;再加入PEG 20000,至PEG20000终浓度为1-10mg/mL,优选2mg/mL,再持续搅拌混匀;2~8℃静置过夜;离心10000~13000rpm15~45分钟,小心弃上清;得到的沉淀即为胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体。
优选的,所述胶体金溶液中胶体金颗粒粒径为16-71.5nm,优选41nm的胶体金颗粒;所述抗体的加入量为0.4-0.8mg,优选0.6mg;用0.1M K2CO3或0.1M HCl调节胶体金溶液的pH。
优选的,将最后制备的沉淀用含有0.5毫克/毫升PEG 20000缓冲液悬浮,测定吸光度值A,调整浓度至A=1.5(1cm/525nm),加0.5毫克/毫升叠氮钠防腐;4℃保存,应用时将胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体稀释至5微克/毫升。
本发明还提供了一种血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试纸条,组装试剂包括如上所述的试剂盒中的试剂;所述试剂条包括胶体金抗体垫、硝酸纤维膜、PVC垫板、加样垫以及吸水纸;
其中胶体金抗体垫内置胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体;
硝酸纤维膜的检测区(T区),包被有兔抗人IgE多克隆抗体;质控区(C区)预包被有羊抗鼠IgG抗体;
所述PVC垫板上依次组装有加样垫、胶体金抗体垫、硝酸纤维膜以及吸水纸;所述硝酸纤维膜的检测区靠近胶体金抗体垫,质控区靠近吸水纸。
本发明同时提供了一种利用如上所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试纸条进行检测的方法,包括以下步骤,
1)将试纸条水平放置与实验台上;待试纸条平衡至室温后,再撕开试纸条外侧的铝板袋将试纸条取出;
2)新鲜血清、血浆或全血样本无需预处理,冰冻或2~8℃存储样本,应先平衡至室温再进行检测;
3)取出样本稀释液,混匀备用;优选的,样本稀释液为0.01M PH7.4PBS缓冲溶液;
4)加样及判读:用移液枪吸取10μL血清/血浆样本,或15μL全血样本,慢慢加到胶体金抗体垫上,立即在加样垫上加100μL样本稀释液,开始计时,10~20分钟内用免疫层析结果判读定量判定结果;超过20分钟判定,结果无效;
本发明采用双抗体夹心模式,将待检血清滴加样本孔,样本在层析果过程中首先溶解胶体金抗体并与之形成待检IgE-鼠抗人IgE-胶体金复合物,继续泳动至T区,与捕获抗体(兔抗人IgE多克隆抗体)结合形成双抗体夹心复合物,形成紫色条带,颜色强度与待检IgE含量呈正比例函数关系。游离(过剩)的胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体泳动至C区,与羊抗鼠IgG抗体结合形成免疫复合物,显色。将测试板放入免疫层析结果判读仪内,读取胶体金颜色密度,并通过内置剂量-反应函数计算待检标本IgE含量打印实验结果。
优选的,还包括校准步骤:读取试剂前确认所用免疫层析结果判读记录仪处于正常运行状态,并经过日常光度校准,仪器使用前按照标准曲线下载方式下载该批号试剂所使用标准曲线,并导入IC卡中作为试剂判读依据,不同批号试剂不可混用标准曲线。
本发明也提供了一种根据如上所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒在分析血清IgE水平中的应用。
本发明还提供了一种根据如上所述的试纸条在分析血清IgE水平中的应用。
相对于现有技术,本发明所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析定量检测试剂盒及试纸条,具有以下优势:
(1)本发明所述的试剂盒以及试纸条,其测定IgE时,操作简单,无需培训,可迅速掌握,无需大型设备,适合基层实验室或社区实验室应用。
(2)本发明采血后立即检测的POCT模式,可防止标本搞错,以及标本存放引起待测物降解所带来误差。
(3)本发明与现有检测方法相比,具有检测成本低的优点,同时具有临床鉴别诊断可介绍的分析准确度,非常适合疑似患者初诊时的广泛筛查。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1为本发明实施例所述的试纸条的结构示意图;
图2为本发明实施例所述的检测过程的示意图,加入样本时;
图3为本发明实施例所述的检测过程的示意图,加入样本稀释液时;
附图标记说明:
1、PVC垫板;2、加样垫;3胶体金抗体垫;4、硝酸纤维膜T(检测区),包被有兔抗人IgE多克隆抗体;C(质控区)预包被有羊抗鼠IgG抗体;5、吸水纸;6、待检IgE;7、金标记鼠抗人IgE单克隆抗体;8、兔抗人IgE多克隆抗体;9、羊抗鼠IgG抗体。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例一
1、胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体的制备
原料:鼠抗人IgE单克隆抗体,商品化试剂,英国ABCAM公司产品。胶体金颗粒,商品化试剂,中新科炬生物技术公司产品。
方法:
用0.1M K2CO3或0.1M HCl调节胶体金溶液pH至8.0-8.4左右;于20毫升胶体金溶液(胶体金颗粒的粒径41nm)中加入抗体(抗体加入量为0.6mg),搅拌5-10分钟;再加入100mg/mL牛血清白蛋白(BSA),至BSA终浓度为5mg/mL,搅拌混匀15min;再加入200mg/mL PEG20000(聚乙二醇,分子量为20,000)至PEG 20000终浓度为2mg/mL,再持续搅拌混匀15min;4℃静置过夜;离心14000rpm 30分钟,小心弃上清;沉淀用含有0.5毫克/毫升PEG 20000缓冲液悬浮,测定吸光度值A,调整浓度至A=1.5左右(1cm/525nm),加0.5毫克/毫升叠氮钠防腐;4℃保存,应用时将胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体稀释至5微克/毫升。
2、预包被抗体硝酸纤维膜的制备
原料:硝酸纤维膜商品化材料;兔抗人IgE多克隆抗体商品化试剂,英国ABCAM公司产品;羊抗鼠IgG抗体商品化试剂,美国Sigma公司产品
制备方法:
采用点样机进行点样。检测区(T)和质控区(C)同时点样,T区包被兔抗人IgE多克隆抗体,C区包被羊抗鼠IgG抗体,两种抗体浓度为0.8毫克/毫升。点样后迅速风干,裁剪备用。
3、试剂条的组装
如图1所示,所述试剂条包括胶体金抗体垫、硝酸纤维膜、PVC垫板、加样垫以及吸水纸;
其中胶体金抗体垫内置胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体;
硝酸纤维膜的检测区(T区),包被有兔抗人IgE多克隆抗体;质控区(C区)预包被有羊抗鼠IgG抗体;
所述PVC垫板上依次组装有加样垫、胶体金抗体垫、硝酸纤维膜以及吸水纸;所述硝酸纤维膜的检测区靠近胶体金抗体垫,质控区靠近吸水纸。
组装时,胶体金抗体垫进行胶体金标记抗体点样后需要在湿度≤30%RH的环境下进行干燥,干燥后的胶体金抗体垫内置干燥剂后密封包装,4~30℃保存备用。
4、试剂条的使用方法
1)、样本要求
血清(血浆)样本按常规方法由静脉采集,采血后立刻分离出血清或血浆用于分析,可使用EDTA(1.5g/L全血)或肝素(20~30U/mL全血)作抗凝剂,2天内测定的样本可放置4℃保存。样本放置在-20℃至少可保存3个月。样本尽可能避免溶血或反复冻溶。混浊或有沉淀的样本应离心或过滤澄清后再进行检测。
2)检测方法
如图2、图3所示,包括以下步骤:
a)打开包装盒,将检测试剂从密封铝箔袋中取出,水平放置于实验台上(如从冰箱中取出的检测试剂,需在铝箔包装密封完好情况下平衡至室温,再撕开铝箔袋取出检测试剂,否则将影响实验结果)。
b)新鲜血清、血浆或全血样本无需预处理,冰冻或2~8℃存储样本,应先平衡至室温再进行检测。
c)取出0.01M PH7.4PBS缓冲溶液,混匀备用。
d)加样及判读:用移液枪吸取10μL血清/血浆样本,或15μL全血样本,慢慢加入S孔(对应胶体金抗体垫)中,立即在B孔(对应加样垫)中加入100μL样本稀释液,开始计时,10~20分钟内用免疫层析结果判读记录仪(具体操作详见免疫层析结果判读记录仪说明书)定量判定结果。超过20分钟判定,结果无效。
e)校准程序:读取试剂前确认所用免疫层析结果判读记录仪处于正常运行状态,并经过日常光度校准,仪器使用前按照标准曲线下载方式下载该批号试剂所使用标准曲线,并导入IC卡中作为试剂判读依据,不同批号试剂不可混用标准曲线。
3)参考值(参考范围)
本试剂盒参考区间引用自:中华人民共和国***医政司:全国临床检验操作规程(第3版),及对本产品的验证结果,本产品检测正常成人血清、血浆和全血时,范围如下:
参考值:≤100ng/mL。
5、产品性能指标
1)分析灵敏度:测定浓度为10ng/mL灵敏度企业内控品,测定值与标定值偏差应不高于±20%。
2)特异性:分别测定浓度为50g/L的白蛋白(Alb)、16g/L免疫球蛋白G(IgG)、200g/L血红蛋白(Hb),检测结果小于10ng/mL。
3)准确度:测定浓度为200ng/mL和1000ng/mL准确度企业内控品,各质控点测定值与标定值偏差不高于±15%。
4)剂量-反应曲线的线性:在10-2000ng/mL检测范围内,相关系数r应不低于0.975,10ng/mL和50ng/mL两个低值质控点绝对偏差不大于±0.5,100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL五个质控点相对偏差不大于±15%。
5)批内不精密度:平行测定企业精密度内控品,重复10次,变异系数(CV)应不高于15%。
6)批间不精密度:用3个批号的产品平行测定企业精密度内控品,每个批号各重复10次,3个批号间的变异系数(CV)应不高于20%。
对比试剂:苏州浩欧博生物医药有限公司的总IgE抗体检测试剂盒(酶联免疫法)
对比试剂操作步骤:
1.将所有试剂平衡至室温(20-25℃)
2.在酶标板中分别加入100μL标准品系列、质控品系列、校准品系列、待测血清样本,混匀10秒,37℃温育45分钟
3.洗板:倒尽板内液体,每空加入250μL清洗液洗涤酶标板,然后倒尽液体,反复洗涤5次,最后将酶标板翻扣在厚叠吸水纸上拍干
4.在所有反应孔中加入100μL HRP酶联二抗,37℃温育45分钟。
5.洗板:重复步骤3操作。
6.在所有反应孔中加入100μL TMB底物显色液,置室温避光反应25-30分钟。
7.在所有反应孔中加入100μL终止液。
8.使用酶标仪在450nm波长下,测每空的OD值,根据公式计算相应浓度值。
对比实验:分别用对比试剂与本发明试剂检测IgE企业内控品系列,计算本发明试剂的灵敏度、特异性、准确度、剂量-反应曲线的线性及批内不精密度的检测结果,并以对比试剂的检测结果为标准,计算本试剂检测结果与对比试剂的相对偏差。
结果:
1.灵敏度:检测结果显示测定值与标定值偏差为8.4%,小于±20%,符合要求。
表1灵敏度检测结果
2.特异性:检测结果显示分别检测50g/L的白蛋白(Alb)、16g/L免疫球蛋白G(IgG)、200g/L血红蛋白(Hb),检测结果均小于10ng/mL,符合要求。
表2特异性检测结果
3.准确度:测定浓度为200ng/mL和1000ng/mL准确度企业内控品,各质控点测定值与标定值偏差分别为9.74%和7.37%,小于±15%,符合要求。
表3准确度检测结果
4.剂量-反应曲线的线性:分别检测10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL7个质控点,每个浓度测3次取平均值,记录各质控点检测数值并取平均值记为Mi。以检测浓度为横坐标,检测结果为纵坐标,进行线性回归,求得线性回归方程,相关系数r值为0.994,将各质控点代入回归方程求得各质控点的回归值记为Ni,按以下公式计算前两个质控点的绝对偏差为-0.39、-0.40,后五个质控点的相对偏差为-4.19%~11.28%,(公式:绝对偏差=Mi-Ni;相对偏差=(Mi—Ni)/Mi)符合绝对偏差≤0.5,相对偏差不大于±15%的要求。
表4剂量-反应曲线的线性检测结果
5.批内不精密度:测定浓度为200ng/mL不精密度企业内控品,检测结果的CV值为9.74%,小于±15%,符合要求。
6.对比实验:以对比试剂的检测结果为标准,计算本试剂检测结果与对比试剂的相对偏差在-5.85~5.64%,检测结果基本一致。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已,并不用以限制本发明创造,凡在本发明创造的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明创造的保护范围之内。
Claims (10)
1.血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒,其特征在于,包括:胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体、兔抗人IgE多克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体。
2.根据权利要求1所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒,其特征在于,所述胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体的浓度为2~20微克/毫升,优选的,5微克/毫升;所述兔抗人IgE多克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体均为0.5-1.0毫克/毫升,优选0.8毫克/毫升。
3.根据权利要求1所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒,其特征在于:所述胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体通过如下方法制备而成,调节胶体金溶液pH至8.0-8.4;于胶体金溶液中加入抗体,搅拌5-10分钟;再加入牛血清白蛋白,至牛血清白蛋白的终浓度为2.5-25mg/mL,优选5mg/mL,搅拌混匀;再加入PEG 20000,至PEG 20000终浓度为1-10mg/mL,优选2mg/mL,再持续搅拌混匀;2~8℃静置过夜;离心10000~13000rpm 15~45分钟,小心弃上清;得到的沉淀即为胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒,其特征在于:所述胶体金溶液中胶体金颗粒粒径为16-71.5nm,优选41nm的胶体金颗粒;所述抗体的加入量为0.4-0.8mg,优选0.6mg;用0.1M K2CO3或0.1M HCl调节胶体金溶液的pH。
5.根据权利要求3所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒,其特征在于:将最后制备的沉淀用含有0.5毫克/毫升PEG 20000缓冲液悬浮,测定吸光度值A,调整浓度至A=1.5(1cm/525nm),加0.5毫克/毫升叠氮钠防腐;4℃保存,应用时将胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体稀释至5微克/毫升。
6.一种血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试纸条,其特征在于:组装试剂包括如权利要求1~5任一项所述的试剂盒中的试剂;所述试剂条包括胶体金抗体垫、硝酸纤维膜、PVC垫板、加样垫以及吸水纸;
其中胶体金抗体垫内置胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体;
硝酸纤维膜的检测区,包被有兔抗人IgE多克隆抗体;质控区,预包被有羊抗鼠IgG抗体;
所述PVC垫板上依次组装有加样垫、胶体金抗体垫、硝酸纤维膜以及吸水纸;所述硝酸纤维膜的检测区靠近胶体金抗体垫,质控区靠近吸水纸。
7.一种利用如权利要求6所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试纸条进行检测的方法,其特征在于:包括以下步骤,
1)将试纸条水平放置与实验台上;待试纸条平衡至室温后,再撕开试纸条外侧的铝板袋将试纸条取出;
2)新鲜血清、血浆或全血样本无需预处理,冰冻或2~8℃存储样本,应先平衡至室温再进行检测;
3)取出样本稀释液,混匀备用;优选的,样本稀释液为0.01M PH7.4PBS缓冲溶液
4)加样及判读:用移液枪吸取10μL血清/血浆样本,或15μL全血样本,慢慢加到胶体金抗体垫上,立即在加样垫上加100μL样本稀释液,开始计时,10~20分钟内用免疫层析结果判读定量判定结果;超过20分钟判定,结果无效。
8.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于:还包括校准步骤:读取试剂前确认所用免疫层析结果判读记录仪处于正常运行状态,并经过日常光度校准,仪器使用前按照标准曲线下载方式下载该批号试剂所使用标准曲线,并导入IC卡中作为试剂判读依据,不同批号试剂不可混用标准曲线。
9.根据权利要求1~5任一项所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒在分析血清IgE水平中的应用。
10.根据权利要求6所述的试纸条在分析血清IgE水平中的应用。
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