ES2372463T3 - Diferenciación de células madre embrionarias humanas. - Google Patents

Diferenciación de células madre embrionarias humanas. Download PDF

Info

Publication number
ES2372463T3
ES2372463T3 ES08855258T ES08855258T ES2372463T3 ES 2372463 T3 ES2372463 T3 ES 2372463T3 ES 08855258 T ES08855258 T ES 08855258T ES 08855258 T ES08855258 T ES 08855258T ES 2372463 T3 ES2372463 T3 ES 2372463T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cells
fgf
characteristic markers
factor
approximately
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES08855258T
Other languages
English (en)
Inventor
Alireza Rezania
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LifeScan Inc
Original Assignee
LifeScan Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LifeScan Inc filed Critical LifeScan Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2372463T3 publication Critical patent/ES2372463T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C12N5/0678—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/335—Glucagon; Glucagon-like peptide [GLP]; Exendin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/42—Notch; Delta; Jagged; Serrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Abstract

Un procedimiento para producir células capaces de secretar insulina mediante estimulación con glucosa a partir de células madre pluripotentes, que comprende las etapas de: a. cultivar las células madre pluripotentes, b. diferenciar las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo, c. diferenciar células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático mediante el tratamiento de las células con una netrina, y d. diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático.

Description

Diferenciación de células madre embrionarias humanas
Campo de la invención
La presente invención proporciona procedimientos para promover la diferenciación de células madre pluripotentes y los productos relacionados con o que se obtienen mediante tales procedimientos. En concreto, la presente invención proporciona un procedimiento mejorado para la formación de células que expresan hormonas pancreáticas y células que secretan hormonas pancreáticas. Además, la presente invención también proporciona procedimientos para promover la diferenciación de células madre pluripotentes sin el uso de una capa de células alimentadoras y los productos relacionados con o que se obtienen mediante tales procedimientos. La presente invención también proporciona procedimientos para promover la secreción de insulina estimulada por glucosa en células productoras de insulina derivadas de células madre pluripotentes.
Antecedentes
Los avances alcanzados en la terapia de sustitución de células para la diabetes mellitus de tipo I y la escasez de los islotes de Langerhans transplantables han centrado el interés en el desarrollo de fuentes de células productoras de insulina o células � apropiadas para injertos. Un enfoque es la generación de células � funcionales procedentes de células madre pluripotentes, tales como, por ejemplo células madre embrionarias.
En el desarrollo embrionario de los vertebrados, una célula pluripotente da lugar a un grupo de células que comprende tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo) en un procedimiento conocido como gastrulación. Del endodermo, se desarrollarán tejidos tales como, por ejemplo, tiroides, timo, páncreas, intestino e hígado, mediante una etapa intermedia. La etapa intermedia de este procedimiento es la formación del endodermo definitivo. Las células del endodermo definitivo expresan una serie de marcadores, tales como HNF–3beta, GATA4, Mixl1, CXCR4 y Sox–17.
Las células madre pluripotentes pueden expresar uno o más antígenos embrionarios 3 y 4 específicos de etapas (SSEA) y marcadores detectables usando los anticuerpos denominados Tra–1–60 y Tra–1–81 (Thomson et al., Science 282: 1145, 1998). La diferenciación de células madre pluripotentes in vitro da como resultado la pérdida de la expresión de SSEA–4, Tra–1–60 y Tra–1–81 (si están presentes) y un aumento de la expresión de SSEA–1. Las células madre pluripotentes no diferenciadas tienen, comúnmente, actividad fosfatasa alcalina que se puede detectar fijando las células con paraformaldehído al 4% y luego revelando con rojo Vector como sustrato, según lo descrito por el fabricante (Vector Laboratories, Burlingame Calf.). Las células madre pluripotentes no diferenciadas también expresan comúnmente Oct–4 y TERT, según lo detectado mediante RT–PCR.
Las células madre pluripotentes se cultivan comúnmente sobre una capa de células alimentadoras que sostienen a las células madre pluripotentes de diversos modos. Alternativamente, las células madre pluripotentes se cultivan en un sistema de cultivo que está esencialmente libre de células alimentadoras, pero que, sin embargo, soporta la proliferación de células madre pluripotentes sin sufrir una diferenciación sustancial. El crecimiento de células madre pluripotentes en el cultivo libre de alimentadoras sin diferenciación se mantiene usando un medio acondicionado mediante el cultivo previo con otro tipo de célula. Alternativamente, el crecimiento de células madre pluripotentes en cultivo libre de alimentadoras sin diferenciación se mantiene usando un medio definido químicamente.
Por ejemplo, Reubinoff et al (Nature Biotechnology 18: 399 – 404 (2000)) y Thompson et al (Science, 6 de noviembre de 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145 – 1147) revelan el cultivo de líneas de células madre pluripotentes procedentes de blastocistos humanos usando una capa de células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón.
Richards et al, (Stem Cells 21: 546–556, 2003) evaluaron la capacidad de un grupo de 11 capas diferentes de células alimentadoras de adulto, feto y neonato humanos para mantener un cultivo de células madre pluripotentes humanas. Richards et al. exponen: “las líneas de células madre embrionarias humanas cultivadas sobre alimentadoras de fibroblastos cutáneos de adulto conservan la morfología de las células madre embrionarias humanas y permanecen pluripotentes”.
El documento US20020072117 revela líneas celulares que producen medios que mantienen el crecimiento de células madre pluripotentes de primate en cultivo libre de alimentadoras. Las líneas celulares empleadas son líneas celulares mesenquimales o de tipo fibroblástico obtenidas de tejido embrionario o diferenciadas de células madre embrionarias. El documento US20020072117 también revela el uso de las líneas celulares como una capa de células alimentadoras primarias.
En otro ejemplo, Wang et al (Stem Cells 23: 1221–1227, 2005) revelan procedimientos para el crecimiento a largo plazo de células madre pluripotentes humanas sobre capas de células alimentadoras derivadas de células madre
50 E08855258 28-10-2011
embrionarias humanas.
En otro ejemplo, Stojkovic et al (Stem Cells 2005 23: 306–314, 2005) revelan un sistema de células alimentadoras derivado de la diferenciación espontánea de células madre embrionarias humanas.
En otro ejemplo más, Miyamoto et al (Stem Cells 22: 433–440, 2004) revelan una fuente de células alimentadoras obtenida de placenta humana.
Amit et al (Biol. Reprod 68: 2150–2156, 2003) revelan una capa de células alimentadoras derivada de prepucio humano.
En otro ejemplo, Inzunza et al (Stem Cells 23: 544–549, 2005) revelan una capa de células alimentadoras de fibroblastos de prepucio postnatal humano.
El documento US6642048 revela medios que mantienen el crecimiento de células madre pluripotentes (pPS) de primate en cultivo libre de alimentadoras y líneas celulares útiles para la producción de tales medios. El documento US6642048 expone: “La presente invención incluye líneas celulares mesenquimales o de tipo fibroblástico obtenidas de tejido embrionario o diferenciadas de células madre embrionarias. Los procedimientos para obtener tales líneas celulares, los medios de procesamiento y las células madre en crecimiento que usan los medios acondicionados se describen e ilustran en la presente revelación”.
En otro ejemplo, el documento WO2005014799 revela medio acondicionado para el mantenimiento, la proliferación y la diferenciación de células de mamífero. El documento WO2005014799 expone: “El medio de cultivo producido según la presente invención está acondicionado por la actividad de secreción celular de células murinas, en particular, por aquellos hepatocitos transgénicos diferenciados e inmortalizados denominados NMH (Hepatocito murino Met)”.
En otro ejemplo, Xu et al. (Stem Cells 22: 972–980, 2004) revelan un medio acondicionado obtenido de derivados de células madre embrionarias humanas que han sido modificados genéticamente para sobreexpresar la transcriptasa inversa telomerasa humana.
En otro ejemplo, el documento US20070010011 revela un medio de cultivo definido químicamente para el mantenimiento de células madre pluripotentes.
Un sistema de cultivo alternativo emplea medio libre de suero complementado con factores de crecimiento capaces de fomentar la proliferación de células madre embrionarias. Por ejemplo, Cheon et al (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod. 105.046870, 19 de octubre de 2005) revelan un sistema de cultivo libre de suero y libre de alimentadoras en el que las células madre embrionarias se mantienen en medio de sustitución con suero (SR) no acondicionado complementado con factores de crecimiento diferentes capaces de desencadenar una autorrenovación de las células madre embrionarias.
En otro ejemplo Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568–574, 2006) revelan procedimientos para el cultivo a largo plazo de células madre embrionarias humanas en ausencia de fibroblastos o medio acondicionado, usando medios complementados con bFGF.
En otro ejemplo, el documento US20050148070 revela un procedimiento para cultivar células madre embrionarias humanas en medios definidos sin suero y sin células alimentadoras fibroblásticas, procedimiento que comprende: cultivar las células madre en un medio de cultivo que contiene albúmina, aminoácidos, vitaminas, minerales, al menos una transferrina o sustituto de transferrina, al menos una insulina o sustituto de insulina, el medio de cultivo esencialmente libre de suero fetal de mamífero y que contiene al menos aproximadamente 100 ng/ml de un factor de crecimiento fibroblástico capaz de activar un receptor de la señalización del factor de crecimiento fibroblástico, en el que el factor de crecimiento se suministra como una fuente distinta de sólo una capa alimentadora fibroblástica y en el que el medio mantuvo la proliferación de las células madre en un estado no diferenciado sin células alimentadoras ni medio acondicionado.
En otro ejemplo, el documento US20050233446 revela un medio definido útil en el cultivo de células madre, incluyendo células madre primordiales de primate no diferenciadas. En disolución, el medio es sustancialmente isotónico en comparación con las células madre que se están cultivando. En un cultivo dado, el medio particular comprende un medio base y una cantidad de cada uno entre bFGF, insulina y ácido ascórbico necesarios para mantener un crecimiento sustancialmente no diferenciado de las células madre primordiales.
En otro ejemplo, el documento US6800480 expone: “En una realización, se proporciona un medio de cultivo celular para desarrollar células madre primordiales derivadas de primate en un estado sustancialmente no diferenciado que incluye un medio básico bajo en endotoxinas a baja presión osmótica que es eficaz para mantener el crecimiento de células madre primordiales derivadas de primate. El medio básico se combina con suero de nutrientes eficaz para
50 E08855258 28-10-2011
mantener el crecimiento de células madre primordiales derivadas de primate y un sustrato seleccionados del grupo que consiste en células alimentadoras y un componente de la matriz extracelular derivado de células alimentadoras. El medio incluye además aminoácidos no esenciales, un antioxidante y un primer factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en nucleósidos y una sal de piruvato”.
En otro ejemplo, el documento US20050244962 expone: “En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para cultivar células madre embrionarias de primate. Uno cultiva las células madre en un cultivo esencialmente libre de suero fetal de mamífero (preferiblemente, también esencialmente libre de cualquier suero de animal) y en presencia de factor de crecimiento fibroblástico que se suministra desde una fuente distinta de sólo una capa alimentadora fibroblástica. En una forma preferida, la capa alimentadora fibroblástica, anteriormente necesaria para mantener un cultivo de células madre, se vuelve innecesaria mediante la adición de suficiente factor de crecimiento fibroblástico”.
En otro ejemplo, el documento WO2005065354 revela un medio de cultivo isotónico definido que está esencialmente libre de alimentadoras y libre de suero, que comprende: a. un medio basal; b. una cantidad de bFGF suficiente para mantener el crecimiento de células madre de mamífero sustancialmente no diferenciadas; c. una cantidad de insulina suficiente para mantener el crecimiento de células madre de mamífero sustancialmente no diferenciadas; y d. una cantidad de ácido ascórbico suficiente para mantener el crecimiento de células madre de mamífero sustancialmente no diferenciadas.
En otro ejemplo, el documento WO2005086845 revela un procedimiento para mantener una célula madre no diferenciada, procedimiento que comprende exponer una célula madre a un miembro de la familia de proteínas de de los factores transformantes del crecimiento beta (TGF ), un miembro de la familia de proteínas de los factores de crecimiento fibroblástico (FGF) o nicotinamida (NIC) en una cantidad suficiente para mantener la célula en un estado no diferenciado durante una cantidad de tiempo suficiente para conseguir un resultado deseado.
Las células madre pluripotentes se pueden cultivar y diferenciar sobre un sustrato de cultivo tisular revestido de una matriz extracelular. Es posible diluir la matriz extracelular antes de revestir el sustrato de cultivo tisular. En Kleinman, H.K., et al., Biochemistry 25:312 (1986) y Hadley, M.A., et al., J. Cell. Biol. 101:1511 (1985), se pueden encontrar ejemplos de procedimientos adecuados para diluir la matriz extracelular y revestir el sustrato de cultivo tisular.
La formación del páncreas se produce a partir de la diferenciación del endodermo definitivo en el endodermo pancreático. Las células del endodermo pancreático expresan el gen de la caja homeótica duodenal pancreática Pdx1. En ausencia del Pdx1, el páncreas no se puede desarrollar más allá de la formación de los brotes ventrales y dorsales. Así pues, la expresión de Pdx 1 marca una etapa fundamental en la organogénesis pancreática. El páncreas maduro contiene, entre otros tipos de células, tejido exocrino y tejido endocrino. Los tejidos exocrino y endocrino surgen de la diferenciación del endodermo pancreático.
Según se informa, se han obtenido células que portan las características de las células de los islotes a partir de células embrionarias de ratón. Por ejemplo, Lumelsky et al. (Science 292:1389, 2001) han publicado la diferenciación de células madre embrionarias de ratón en estructuras secretoras de insulina similares a los islotes pancreáticos. Soria et al. (Diabetes 49:157, 2000) informan que células secretoras de insulina obtenidas de células madre embrionarias de ratón normalizan la glucemia en ratones diabéticos inducidos con estreptozotocina.
En un ejemplo, Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) revelan que el tratamiento de células madre embrionarias de ratón con inhibidores de la fosfoinositida–3–quinasa (LY294002) produjo células semejantes a las células .
En otro ejemplo, Blyszczuk et al. (PNAS 100:998, 2003) informa de la generación de células productoras de insulina a partir de células madre embrionarias de ratón que expresaban constitutivamente a Pax4.
Micallef et al. informan que el ácido retinoico puede regular el compromiso de las células madre embrionarias para formar endodermo pancreático positivo en Pdx1. El ácido retinoico es el más eficaz en la inducción de la expresión de Pdx1 cuando se añade a cultivos el cuarto día de la diferenciación de células madre embrionarias durante un período correspondiente al final de la gastrulación del embrión (Diabetes 54:301, 2005).
Miyazaki et al. informan sobre una línea de células madre embrionarias de ratón que sobreexpresa a Pdx1. Sus resultados muestran que la expresión de Pdx1 exógeno aumenta claramente la expresión de insulina, somatostina, glucoquinasa, neurogenina3, P48, Pax6 y genes HNF6 en las células diferenciadas resultantes (Diabetes 53: 1030, 2004).
Skoudy et al. informan que la activina A (un miembro de la superfamilia de los TGF– ) sobrerregula la expresión de genes pancreáticos exocrinos (p48 y amilasa) y genes endocrinos (Pdx1, insulina y glucagón) en células madre embrionarias de ratón. El efecto máximo se observó usando activina A 1nM. También observaron que el nivel de expresión de la insulina y el ARNm de Pdx1 no fue afectado por el ácido retinoico; sin embargo, el tratamiento con
50 E08855258 28-10-2011
FGF7 3nM dio como resultado un aumento del nivel del transcripto para Pdx1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).
Shiraki et al. estudiaron los efectos de los factores de crecimiento que aumentan específicamente la diferenciación de células madre embrionarias en células positivas en Pdx1. Observaron que el TGF– 2 produjo reproduciblemente una proporción superior de células positivas en Pdx1 (Genes Cells. Junio de 2005; 10(6): 503–16).
Gordon et al. demostraron la inducción de células endodérmicas brachyury+/HNF–3beta+ a partir de células madre embrionarias de ratón en ausencia de suero y en presencia de activina junto con un inhibidor de la señalización de Wnt (US 2006/0003446A1).
Gordon et al. (PNAS, Vol 103, página 16806, 2006) exponen: "Fue necesaria la señalización simultánea de Wnt y TGF–beta/ nodal/activina para generar la estría primitiva anterior".
En cualquiera caso, el modelo murino de desarrollo de células madre embrionarias puede que no imite exactamente el programa de desarrollo en mamíferos superiores, tales como, por ejemplo, en seres humanos.
Thomson et al. aislaron células madre embrionarias de blastocistos humanos (Science 282:114, 1998). Simultáneamente, Gearhart y colaboradores obtuvieron líneas celulares germinales embrionarias humanas (hEG) de tejido gonadal fetal (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95:13726, 1998). A diferencia de las células madre embrionarias de ratón, de las que se puede evitar su diferenciación simplemente mediante el cultivo con factor inhibidor de la leucemia (LIF), las células madre embrionarias humanas se deben mantener en condiciones muy especiales (Patente estadounidense n.º 6.200.806; WO 99/20741; WO 01/51616).
D’Amour et al. describen la producción de cultivos enriquecidos de endodermo definitivo derivado de células madre embrionarias humanas en presencia de una alta concentración de activina y poco suero (Nature Biotechnology 2005). El transplante de estas células bajo la cápsula renal de ratones dio como resultado la diferenciación en células más maduras con características de algunos órganos endodérmicos. Las células de endodermo definitivo derivadas de células madre embrionarias humanas se pueden diferenciar más en células positivas en Pdx1 tras la adición de FGF–10 (US 2005/0266554A1).
D’Amour et al. (Nature Biotechnology – 24, 1392 – 1401 (2006)) exponen: "Hemos desarrollado un procedimiento de diferenciación que convierte las células madre embrionarias humanas (hES) en células endocrinas capaces de sintetizar las hormonas pancreáticas insulina, glucagón, somatostatina, polipéptido pancreático y ghrelina. Este procedimiento imita la organogénesis pancreática in vivo, dirigiendo las células a través de etapas que se asemejan al endodermo definitivo, endodermo del tubo digestivo, endodermo pancreático y precursor endocrino en su camino hacia células que expresan hormonas endocrinas”.
En otro ejemplo, Fisk et al. informan sobre un sistema para producir células de islotes pancreáticos a partir de células madre embrionarias humanas (US2006/0040387A1). En este caso, la ruta de diferenciación se dividió en tres etapas. Primero se diferenciaron las células madre embrionarias humanas en endodermo usando una combinación de butirato de sodio y activina A. Luego se cultivaron las células con antagonistas de TGF– , tales como nogina en combinación con EGF o betacelulina, para generar células positivas en Pdx1. La diferenciación terminal fue inducida mediante nicotinamida.
En un ejemplo, Benvenistry et al. exponen: “Concluimos que la sobreexpesión de Pdx1 aumentó la expresión de genes enriquecidos pancreáticos, la inducción de la expresión de la insulina puede requerir señales adicionales que sólo están presentes in vivo”. (Benvenistry et al, Stem Cells 2006; 24:1923–1930).
En otro ejemplo, Odorico et al. informan sobre procedimientos para dirigir la diferenciación in vitro de células madre pluripotentes de mamífero en células del linaje pancreático. Los procedimientos implican el cultivo de células madre en presencia de una cantidad eficaz de una proteína morfogenética ósea para inducir la diferenciación hacia el mesendodermo. Se siguen cultivando estas células de mesendodermo para formar cuerpos embrionarios (EB) enriquecidos en células dedicadas al endodermo definitivo, que bajo condiciones definidas se diferencian terminalmente en células del linaje pancreático (US20070259423).
En otro ejemplo, Tulachan et al (Developmental Biology, 305, 2007, Pgs 508–521) exponen: "La inhibición de la señalización de TGF–B en el período embrionario puede, por tanto, permitir que las células epiteliales pancreáticas progresen hacia el linaje endocrino".
Por lo tanto, todavía existe una necesidad significativa por desarrollar condiciones para establecer líneas de células madre pluripotentes que se puedan expandir para cubrir las necesidades clínicas actuales a la vez que conservan el potencial para diferenciarse en células endocrinas pancreáticas, células que expresan hormonas pancreáticas o células que secretan hormonas pancreáticas, y poseen la capacidad para secretar insulina como respuesta a cambios en la concentración de la glucosa. Hemos adoptado un enfoque alternativo para mejorar la eficiencia de la diferenciación de células madre embrionarias humanas hacia células endocrinas pancreáticas que sean capaces de secretar insulina como respuesta a cambios en los niveles de glucosa.
Resumen
En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para producir células capaces de secretar insulina mediante estimulación con glucosa a partir de células madre pluripotentes, que comprende las etapas de:
5 a. cultivar las células madre pluripotentes;
b.
diferenciar las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo;
c.
diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático; y
10 d. diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático.
En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para promover la secreción de insulina estimulada por glucosa en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático derivadas de células madre pluripotentes, que comprende las etapas de:
15 a. cultivar las células madre pluripotentes;
b.
diferenciar las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo;
c.
diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático; y
20 d. diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático.
En una realización, células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se diferencian de células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo mediante el tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo mediante uno
25 cualquiera de los siguientes procedimientos:
a. tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con un factor de crecimiento fibroblástico y un inhibidor de la ruta de señalización de Hedgehog; luego retirar el medio que contiene el factor de crecimiento fibroblástico y el inhibidor de la ruta de señalización de Hedgehog, y posteriormente, cultivar las células en medio que contiene ácido retinoico, un factor de crecimiento
30 fibroblástico y un inhibidor de la ruta de señalización de hedgehog o
b.
tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con ácido retinoico y al menos un factor de crecimiento fibroblástico o
c.
tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con ácido
retinoico, un inhibidor de Sonic Hedgehog, al menos un factor de crecimiento fibroblástico y al menos un 35 factor capaz de inhibir a BMP o
d.
tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con ácido retinoico, un inhibidor de Sonic Hedgehog, al menos un factor de crecimiento fibroblástico y una netrina o
e.
tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con ácido
retinoico, un inhibidor de Sonic Hedgehog, al menos un factor de crecimiento fibroblástico y al menos un 40 factor capaz de inhibir a BMP y una netrina o
f. tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con al menos un factor de crecimiento fibroblástico y un inhibidor de Sonic Hedgehog, luego retirar el al menos un factor de crecimiento fibroblástico y el inhibidor de Sonic Hedgehog, y posteriormente, tratar las células con un inhibidor de Sonic Hedgehog, al menos un factor de crecimiento fibroblástico y ácido retinoico o
45 g. tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con al menos un factor de crecimiento fibroblástico y un inhibidor de Sonic Hedgehog, luego retirar el al menos un factor de crecimiento fibroblástico y el inhibidor de Sonic Hedgehog, y posteriormente, tratar las células con un inhibidor de Sonic Hedgehog, al menos un factor de crecimiento fibroblástico, ácido retinoico y al menos un factor capaz de inhibir a BMP o
h. tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con al menos un factor de crecimiento fibroblástico y un inhibidor de Sonic Hedgehog, luego retirar el al menos un factor
5 de crecimiento fibroblástico y el inhibidor de Sonic Hedgehog, y posteriormente, tratar las células con un inhibidor de Sonic Hedgehog, al menos un factor de crecimiento fibroblástico, ácido retinoico y una netrina o
i. tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con al menos un factor de crecimiento fibroblástico y un inhibidor de Sonic Hedgehog, luego retirar el al menos un factor
10 de crecimiento fibroblástico y el inhibidor de Sonic Hedgehog, y posteriormente, tratar las células con un inhibidor de Sonic Hedgehog, al menos un factor de crecimiento fibroblástico, ácido retinoico, al menos un factor capaz de inhibir a BMP y una netrina.
En una realización, células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se diferencian de células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático mediante el tratamiento de
15 las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático mediante uno cualquiera de los siguientes procedimientos:
a. cultivar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en un medio que contiene un inhibidor de la y secretasa y un agonista de GLP–1, luego retirar el medio que contiene un inhibidor de la y secretasa y un agonista de GLP–1 y, posteriormente, cultivar las células en
20 medio que contiene un agonista de GLP–1, IGF–1 y HGF o
b. cultivar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en medio que contiene un agonista de GLP–1, luego retirar el medio que contiene un agonista de GLP–1 y, posteriormente, cultivar las células en medio que contiene un agonista de GLP–1, IGF–1 y HGF o
c. cultivar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en medio 25 que contiene un inhibidor de la y secretasa y un agonista de GLP–1 o
d.
cultivar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en medio que contiene un agonista de GLP–1 o
e.
tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con un factor que inhibe la ruta de señalización Notch o
30 f. tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con un factor que inhibe la ruta de señalización del TGF– R–1 o
g. tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con un factor que inhibe la ruta de señalización Notch y un factor que inhibe la ruta del TGF– R–1 o
h. cultivar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en medio 35 que contiene glucosa de aproximadamente 10mM a aproximadamente 20mM y un agonista de GLP–1.
Breve descripción de las figuras
La Fig. 1 muestra un esquema del protocolo de diferenciación usado en la presente invención. La representación a) se refiere al procedimiento publicado en la solicitud de patente estadounidense n.º de serie 11/736.908; y las representaciones b) y c) son los procedimientos de la presente invención.
40 La Figura 2 muestra un análisis PCR en tiempo real de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas según los procedimientos revelados en el Ejemplo 2. La expresión de los marcadores del endodermo pancreático (PDX–1, ISL–1) y los marcadores endocrinos (NeuroD, insulina y glucagón) se representa en las etapas 3 a 5 (E3–E5). Se produjo un aumento significativo en la expresión de la insulina y el glucagón en las etapas 4 a 5.
45 La Figura 3 muestra un análisis PCR en tiempo real de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas según los procedimientos revelados en el Ejemplo 3. Marcadores endocrinos pancreáticos a) insulina, b) NKX2, c) glucagón, d) NeuroD y marcador endodérmico pancreático d) PDX–1 en las etapas 3 a 5. Se evaluó el efecto de diversos inhibidores de la quinasa bien en la etapa 3 o la etapa 4, o en las etapas 3 y 4. (+/+ se refiere a la presencia de un determinado compuesto en ambas etapas 3 y 4; +/– se refiere a la presencia de un
50 determinado compuesto en la etapa 3 y su ausencia en la etapa 4; –/+ se refiere a la presencia de un determinado compuesto en la etapa 4 y su ausencia en la etapa 3).
50 E08855258 28-10-2011
La Figura 4 muestra un análisis PCR en tiempo real de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas según los procedimientos revelados en el Ejemplo 4. Se representan los marcadores pancreáticos: a) glucagón e insulina; b) HAND1 y NeuroD; c) HNF4a y PDX–1; d) NKX2.2 y Sox17 en las etapas 3 a
5. Se evaluó el efecto del inhibidor de ALK5 II bien en la etapa 4 o la etapa 5,o en las etapas 5 y 4. (+/+ se refiere a la presencia del inhibidor en ambas etapas 4 y 5; +/– se refiere a la presencia del inhibidor en la etapa 4 y su ausencia en la etapa 5; –/+ se refiere a la presencia del inhibidor en la etapa 5 y su ausencia en la etapa 4).
La Figura 5 muestra un análisis PCR en tiempo real de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas según los procedimientos revelados en el Ejemplo 5. Se representa el efecto de los inhibidores de ALK5 I y II 1–101M sobre la expresión de: a) glucagón; b) insulina; c) PDX–1; d) NeuroD en las etapas 3 a 5. El tratamiento control no incluyó ningún inhibidor de ALK5 durante el procedimiento de diferenciación.
La Figura 6 muestra un análisis PCR en tiempo real de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas según los procedimientos revelados en el Ejemplo 6. Se representan los efectos combinados del inhibidor de ALK5 11m y 0–500 ng/ml de nogina humana recombinante sobre la expresión de a) albúmina, b) CDX2, c) insulina, d) glucagón, e) PDX–1, f) NeuroD y g) NKX2.2 en las etapas 3 a 5. El inhibidor de ALK5 se añadió en las etapas 4 y 5, y la nogina, en la etapa 3.
La Figura 7 muestra un análisis PCR en tiempo real de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas según los procedimientos revelados en el Ejemplo 7. Se representan los efectos combinados del inhibidor de ALK5 11m y 100 ng/ml de nogina humana recombinante sobre la expresión de a) insulina, b) glucagón, c) ngn3, d) NeuroD, e) CDX–2, f) PDX–1 en las etapas 3 a 5. El inhibidor de ALK5 se añadió en las etapas 4 y 5, y la nogina se añadió en la etapa 3, 4 ó 3 y 4.
La Figura 8 muestra la morfología de células diferenciadas según los procedimientos revelados en el Ejemplo 7. a) imagen de contraste de fases x 4 de las células de la etapa 5 el día 6; b) imagen de contraste de fases x 10 de las células de la etapa 5 el día 6; c) imagen de contraste de fases x 4 de las células de la etapa 5 el día 12; d) imagen de contraste de fases x 10 de células de la etapa 5 el día 12.
La Figura 9 muestra las imágenes inmunofluorescentes de células diferenciadas según los procedimientos revelados en el Ejemplo 7. Las células están en la etapa 5 y el día 12. a) tinción con insulina de un solo grupo junto con b) colorante nuclear DAPI.
La Figura 10 muestra un análisis PCR en tiempo real de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas según los procedimientos revelados en el Ejemplo 7.
La Figura 11 muestra un análisis PCR en tiempo real de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas según los procedimientos revelados en el Ejemplo 8. Los datos representan los efectos combinados de la nogina añadida en las etapas 3 y 4 junto con netrina–4 y/o inhibidor de ALK5 añadido en la etapa 4 sobre la expresión de a) ngn3, b) PDX–1, c) NeuroD, d) Pax4, e) insulina y f) glucagón.
La Figura 12 muestra un análisis PCR en tiempo real de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas según los procedimientos revelados en el Ejemplo 8. Grupo a) insulina, b) glucagón, c) ngn3, d) NKX2.2, e) NeuroD y f) PDX–1.
La Figura 13 muestra la secreción de insulina estimulada por glucosa (SIEG) in vitro de cultivos en la etapa 5 ampliada. Se desafiaron con glucosa las células de la etapa 5 preparadas según los procedimientos revelados en el Ejemplo 9 en los días a) 6, b) 12 y c) 8–20 en cultivo en la etapa 5.
La Figura 14 muestra el efecto de la netrina–1 o la netrina–2 sobre la expresión de marcadores endocrinos. Análisis PCR en tiempo real de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas según los procedimientos revelados en el Ejemplo 10.
La Figura 15 muestra la inducción de marcadores endocrinos usando un procedimiento alternativo para inducir el endodermo definitivo. Análisis PCR en tiempo real de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas según los procedimientos revelados en el Ejemplo 11. Grupo a) insulina, b) glucagón, c) NKX2.2, d) Pax4, f) PDX–1 y g) NeuroD.
La Figura 16 muestra la expresión de diversos marcadores en las diversas etapas del protocolo de diferenciación representado en la Figura 1c. Grupo a): muestra la expresión de CXCR4 según lo determinado mediante FACS en células H1 el tercer día de la etapa 1. El grupo b) muestra la expresión de marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo y el linaje extraembrionario en células el tercer día de la etapa 1, según lo determinado mediante PCR en tiempo real. Los grupos c)–n) muestran la expresión de diversos genes en células cosechadas al final de las etapas 2–6 según lo determinado mediante PCR en tiempo real.
50 E08855258 28-10-2011
La Figura 17 muestra el número de células en las diversas etapas del protocolo de diferenciación representado en la Figura 1c.
La Figura 18 muestra la liberación de péptido C de células al final de la etapa 6 del protocolo de diferenciación representado en la Figura 1c como respuesta a diversos estímulos.
La Figura 19 muestra el contenido de péptido C y proinsulina de las células al final de la etapa 6 del protocolo de diferenciación representado en la Figura 1c en comparación con islotes pancreáticos humanos de adulto.
La Figura 20 muestra la expresión de insulina (grupo a), sinaptofisina (grupo b) y la coexpresión de sinaptofisina (eje X) e insulina (eje Y) (grupo c) en células al final de la etapa 6 del protocolo de diferenciación representado en la Figura 1c.
La Figura 21 muestra la expresión de sinaptofisina (grupos a y c) e insulina (grupos b y d) en células al final de la etapa 6 del protocolo de diferenciación representado en la Figura 1c que se trataron con 100 ng/ml de cordina en lugar de nogina en las etapas 3–4.
La Figura 22 muestra la expresión de diversos marcadores en células de la línea de células madre embrionarias humanas H9 tratadas según el protocolo de diferenciación representado en la Figura 1c. Los datos mostrados son la expresión de a) HNF4a, b) HNF6, c) CDX2, d) PDX–1, e) NKX6.1, f) Pax4, g) NKX2.2, h) NeuroD, i) NGN3, j) PECAM, k) glucagón y 1) insulina, según lo determinado mediante PCR en tiempo real en células cosechadas al final de las etapas 3–6.
La Figura 23 muestra la expresión de diversos marcadores en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 tratadas según el protocolo de diferenciación representado en la Figura 1c en el que las células se tratan bien con B27 o con N2. Los datos mostrados es la expresión de a) CDX2, b) glucagón, c) insulina y d) PDX– 1, según lo determinado mediante PCR en tiempo real en células cosechadas al final de las etapas 3–6.
Descripción detallada
Con el objeto de aclarar y no de limitar la revelación, se divide la descripción detallada de la invención en los siguientes subapartados que describen o ilustran ciertas características, realizaciones o aplicaciones de la presente invención.
Definiciones
Las células madre son células no diferenciadas definidas por su capacidad a nivel celular simple para tanto autorrenovarse como diferenciarse para producir células de una progenie, incluyendo progenitores autorrenovables, progenitores no renovables y células terminalmente diferenciadas. Las células madre también se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de diversos linajes celulares procedentes de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como para dar lugar a tejidos de múltiples capas germinales tras el transplante y para contribuir sustancialmente a la mayoría, si no a todos, los tejidos tras la inyección en blastocistos.
Las células madre se clasifican por su potencial de desarrollo como: (1) totipotente, que significa capaz de dar lugar a todo tipo de células embrionarias y extraembrionarias; (2) pluripotente, que significa capaz de dar lugar a todo tipo de células embrionarias; (3) multipotente, que significa capaz de dar lugar a un subconjunto de linajes celulares pero todos pertenecientes a un determinado tejido, órgano o sistema fisiológico (por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSC) pueden producir una progenie que incluye HSC (autorrenovación), progenitores oligopotentes restringidos a células sanguíneas y todo tipo de células y elementos (p.ej., plaquetas) que sean componentes normales de la sangre); (4) oligopotente, que significa capaz de dar lugar a un subconjunto más restringido de linajes celulares que las células madre multipotentes; y (5) unipotente, que significa capaz de dar lugar a un sólo linaje celular (p.ej., células madre espermatogénicas).
La diferenciación es el proceso mediante el cual una célula no especializada (“no comprometida”) o menos especializada adquiere las características de una célula especializada, tal como, por ejemplo, una célula nerviosa o una célula muscular. Una célula diferenciada o inducida a la diferenciación es una célula que ha sido tomada en una posición más especializada (“comprometida”) del linaje de una célula. El término “comprometido/a” cuando se aplica al proceso de diferenciación se refiere a una célula que ha continuado en la ruta de diferenciación hasta un punto en el que, en circunstancias normales, continuará diferenciándose en un tipo específico de célula o subconjunto de tipos de células, y que no puede, en circunstancias normales, diferenciarse en un tipo de célula diferente o volver a un tipo de célula menos diferenciada. La desdiferenciación se refiere al proceso mediante el cual una célula vuelve a una posición menos especializada (o comprometida) del linaje de una célula. Como se usa en la presente memoria, el linaje de una célula define la herencia de la célula, i.e., de qué célula procede y a qué células puede dar lugar. El linaje de una célula la coloca en un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación.
50 E08855258 28-10-2011
El marcador específico del linaje se refiere a una característica específicamente vinculada al fenotipo de células de un linaje de interés, y se puede usar para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida hacia el linaje de interés.
“Linaje de células ” se refiere a células con una expresión génica positiva para el factor de transcripción PDX–1 y al menos uno de los siguientes factores de transcripción: NGN–3, Nkx2.2, Nix6.1, NeuroD, Isl–1, HNF–3 beta, MAFA, Pax4 y Pax6. Las células que expresan marcadores característicos del linaje de células incluyen células .
“Células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo”, como se usa en la presente memoria, se refiere a células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: SOX–17, GATA–4, HNF–3 beta, GSC, Cer1 Nodal, FGF8, Brachyury, proteína de la caja homeótica de tipo mixto, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA–6, CXCR4, C–Kit, CD99 o OTX2. Las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo incluyen células precursoras de la estría primitiva, células de la estría primitiva, células mesendodérmicas y células de endodermo definitivo.
“Células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático”, como se usa en la presente memoria, se refiere a células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: PDX–1, HNF–1beta, PTF– 1 alfa, HNF–6 o HB9. Las células que expresan marcadores característicos el linaje endodérmico pancreático incluyen células de endodermo pancreático, células del tubo digestivo primitivo y células del intestino anterior y posterior.
“Células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático”, como se usa en la presente memoria, se refiere a células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: NGN–3, NeuroD, Islote–1, PDX–1, NKX6.1, Pax–4, Ngn–3 o PTF–1 alfa. Las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático incluyen células endocrinas pancreáticas, células que expresan hormonas pancreáticas, células que secretan hormonas pancreáticas y células del linaje de células .
“Endodermo definitivo”, como se usa en la presente memoria, se refiere a células que portan la característica de las células que proceden de epiblasto durante la gastrulación y que forman el tracto gastrointestinal y sus derivados. Las células endodérmicas definitivas expresan los siguientes marcadores: HNF–3 beta, GATA–4, SOX–17, Cerberus, OTX2, Goosecoid, C–kit, CD99 y Mixl1.
“Endodermo extraembrionario”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una población de células que expresa al menos uno de los siguientes marcadores: SOX–7, AFP y SPARC.
“Marcadores”, como se usa en la presente memoria, son moléculas de ácido nucleico o polipéptido que se expresan diferencialmente en una célula de interés. En este contexto, la expresión diferencial significa un aumento del nivel de un marcador positivo y una disminución del nivel de un marcador negativo. El nivel detectable del ácido nucleico
o polipéptido marcador es suficientemente superior o inferior en las células de interés en comparación con otras células, de manera que es posible identificar y distinguir la célula de interés de otras células usando cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos en la técnica.
"Célula mesendodérmica”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una célula que expresa al menos uno de los siguientes marcadores: CD48, eomesodermina (EOMES), SOX–17, DKK4, HNF–3 beta, GSC, FGF17, GATA–6.
“Célula endocrina pancreática” o “célula que expresa una hormona pancreática”, como se usan en la presente memoria, se refieren a una célula capaz de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático.
"Célula de endodermo pancreático", como se usa en la presente memoria, se refiere a una célula capaz de expresar al menos uno de los siguientes marcadores: NGN–3, NeuroD, Islote–1, PDX–1, PAX– 4, NKX2.2.
“Célula productora de hormonas pancreáticas”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una célula capaz de producir al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático.
“Célula secretora de hormonas pancreáticas”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una célula capaz de secretar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático.
"Célula de intestino anterior y posterior", como se usa en la presente memoria, se refiere a una célula capaz de secretar al menos uno de los siguientes marcadores: PDX–1, HNF–1, PTF–IA, HNF–6, HB–9, PROX–1.
“Célula de estría preprimitiva”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una célula que expresa al menos uno de los siguientes marcadores: Nodal o FGF8.
"Célula de tubo digestivo primitivo", como se usa en la presente memoria, se refiere a una célula capaz de secretar
50 E08855258 28-10-2011
al menos uno de los siguientes marcadores: HNF–1, HNF–4A.
“Célula de estría primitiva”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una célula que expresa al menos uno de los siguientes marcadores: Brachyury, proteína de caja homeótica de tipo mixto o FGF4.
Aislamiento, expansión y cultivo de células madre pluripotentes
Caracterización de células madre pluripotentes
Las células madre pluripotentes pueden expresar uno o más antígenos 3 y 4 embrionarios específicos de etapas (SSEA) y marcadores detectables usando los anticuerpos denominados Tra–1–60 y Tra–1–81 (Thomson et al., Science 282: 1145, 1998). La diferenciación de células madre pluripotentes in vitro da como resultado la pérdida de la expresión de SSEA–4, Tra–1–60 y Tra–1–81 (si están presentes) y un aumento de la expresión de SSEA–1. Las células madre pluripotentes no diferenciadas tienen comúnmente actividad fosfatasa alcalina, que se puede detectar fijando las células con paraformaldehído al 4% y luego revelando con rojo Vector como sustrato, según lo descrito por el fabricante (Vector Laboratories, Burlingame Calf.). Las células madre pluripotentes no diferenciadas también expresan comúnmente Oct–4 y TERT, según lo detectado mediante RT–PCR.
Otro fenotipo deseable de las células madre pluripotentes propagadas es un potencial para diferenciarse en células de las tres capas germinales: tejido endodérmico, mesodérmico y ectodérmico. La pluripotencia de células madre pluripotentes se puede confirmar, por ejemplo, inyectando células en ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID), fijando los teratomas que se forman con paraformaldehído al 4% y luego examinándolos histológicamente en busca de pruebas de los tipos de células de las tres capas germinales. Alternativamente, es posible determinar la pluripotencia mediante la creación de cuerpos embrionarios y la evaluación de cuerpos embrionarios en cuanto a la presencia de marcadores vinculados a las tres capas germinales.
Es posible cariotipar las líneas de células madre pluripotentes propagadas usando una técnica de bandeo G estándar y comparar los cariotipos publicados de la especie de primate correspondiente. Es deseable obtener células que tengan un “cariotipo normal”, lo que significa que las células sean euploides, en las que estén presentes todos los cromosomas humanos y no se encuentren perceptiblemente alterados.
Fuentes de células madre pluripotentes
Los tipos de células madre pluripotentes que se pueden usar incluyen líneas establecidas de células pluripotentes derivadas de tejido formado tras la gestación, incluyendo tejido pre–embrionario (tal como, por ejemplo, un blastocisto), tejido embrionario o tejido fetal tomado en algún momento de la gestación, comúnmente, pero no necesariamente, antes de aproximadamente las 10–12 semanas de gestación. Los ejemplos no restrictivos son líneas establecidas de células madre embrionarias humanas o células germinales embrionarias humanas, tales como, por ejemplo, las líneas de células madre embrionarias humanas H1, H7 y H9 (WiCell). También se contempla el uso de las composiciones de la presente revelación durante el establecimiento inicial o la estabilización de tales células, en cuyo caso las células fuente serían células pluripotentes primarias tomadas directamente de los tejidos fuente siempre y cuando el tejido no proceda de embriones humanos. También son adecuadas las células tomadas de una población de células madre pluripotentes ya cultivadas en ausencia de células alimentadoras. También son adecuadas las líneas de células madre embrionarias humanas mutantes, tales como, por ejemplo, BG01v (BresaGen, Athens, GA).
Cultivo de células madre pluripotentes
En una realización, las células madre pluripotentes se cultivan comúnmente sobre una capa de células alimentadoras que mantiene las células madre pluripotentes de diversos modos. Alternativamente, las células madre pluripotentes se cultivan en un sistema de cultivo que está esencialmente libre de células alimentadoras, pero que sin embargo, mantiene la proliferación de células madre pluripotentes sin sufrir una diferenciación sustancial. El crecimiento de células madre pluripotentes en el cultivo libre de alimentadoras sin diferenciación se mantiene usando un medio acondicionado mediante el cultivo previo con otro tipo de célula. Alternativamente, el crecimiento de células madre pluripotentes en el cultivo libre de alimentadoras sin diferenciación se mantiene usando un medio definido químicamente.
Las células madre pluripotentes se pueden colocar en placas sobre un sustrato de cultivo adecuado. En una realización, el sustrato de cultivo adecuado es un componente de la matriz extracelular, tal como, por ejemplo, aquéllos derivados de la membrana basal o que pueden formar parte de los acoplamientos de receptor–ligando de moléculas de adhesión. En una realización, el sustrato de cultivo adecuado es MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® es una preparación soluble de células tumorales de Engel–breth–Holm–Swarm que se gelifican a temperatura ambiente para formar una membrana basal reconstituida.
Como alternativa, son adecuados otros componentes y mezclas de componentes de la matriz extracelular. En
50 E08855258 28-10-2011
función del tipo de célula que está proliferando, ésta puede incluir laminina, fibronectina, proteoglucano, entactina, sulfato de heparano y similares, solo o en diversas combinaciones.
Las células madre pluripotentes se pueden colocar en placas sobre el sustrato en una distribución adecuada y en presencia de un medio que fomente la supervivencia, propagación y retención de la característica deseable de las células. Todas estas características se benefician de una cuidadosa atención a la distribución del sembrado y pueden ser fácilmente determinadas por cualquier experto en la técnica.
Los medios de cultivo adecuados se pueden elaborar a partir de los siguientes componentes, tales como, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), Gibco # 11965–092; medio de Eagle modificado por Dulbecco noqueado (KO DMEM), Gibco #10829–018; F12 de Ham/medio basal de DMEM al 50%; L–glutamina 200mM, Gibco # 15039–027; solución de aminoácidos no esenciales, Gibco 11140–050; –mercaptoetanol, Sigma # M7522; factor de crecimiento fibroblástico básico recombinante humano (bFGF), Gibco # 13256–029.
Formación de células capaces de secretar insulina mediante estimulación con glucosa a partir de células madre pluripotentes
En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para producir células capaces de secretar insulina mediante estimulación con glucosa a partir de células madre pluripotentes, que comprende las etapas de:
a.
cultivar las células madre pluripotentes;
b.
diferenciar las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo;
c.
diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático; y
d.
diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático.
En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para promover la secreción de insulina estimulada por glucosa en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático derivado de células madre pluripotentes, que comprende las etapas de:
a.
cultivar las células madre pluripotentes;
b.
diferenciar las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo;
c.
diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático; y
d.
diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático.
Las células madre pluripotentes adecuadas para su uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, la línea de células madre embrionarias humanas H9 (código NIH: WA09), la línea de células madre embrionarias humanas H1 (código NIH: WA01), la línea de células madre embrionarias humanas H7 (código NIH: WA07) y la línea de células madre embrionarias humanas SA002 (Cellartis, Suecia). También son adecuadas para su uso en la presente invención las células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores característicos de las células pluripotentes: ABCG2, cripto, CD9, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF–1, ZFP42, SSEA–3, SSEA–4, Tra1–60, Tral– 81.
Los marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se seleccionan del grupo que consiste en SOX–17, GATA4, Hnf–3beta beta, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, Brachyury, proteína de la capa homeótica de tipo mixto, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C–kit, CD99 y OTX2. Una célula adecuada para su uso en la presente invención es una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa los marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo es una célula precursora de la estría primitiva. En un aspecto alternativo, una célula que expresa los marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo es una célula mesendodérmica. En un aspecto alternativo, una célula que expresa los marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo es una célula de endodermo definitivo.
Los marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se seleccionan del grupo que consiste en Pdx1, HNF–1beta, PTF1a, HNF–6, HB9 y PROX1. Una célula adecuada para su uso en la presente invención es una
50 E08855258 28-10-2011
célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa los marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático es una célula de endodermo pancreático.
Los marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se seleccionan del grupo que consiste en NGN– 3, NeuroD, Islote–1, Pdx–1, NKX6.1, Pax–4, Ngn–3 y PTF–1 alfa. En una realización, una célula endocrina pancreática es capaz de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático. Una célula adecuada para su uso en la presente invención es una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático es una célula endocrina pancreática. La célula endocrina pancrática puede ser una célula que exprese una hormona pancreática. Alternativamente, la célula endocrina pancrática puede ser una célula secretora de una hormona pancreática.
En un aspecto de la presente invención, la célula endocrina pancreática es una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células . Una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células expresa Pdx 1 y al menos uno de los siguientes factores de transcripción: NGN–3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl–1, HNF–3 beta, MAFA, Pax4 y Pax6. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa los marcadores característicos del linaje de células es una célula .
Formación de células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo
Las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo mediante cualquier procedimiento de la técnica o mediante cualquier procedimiento propuesto en la presente invención.
Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo según los procedimientos revelados en D’Amour et al., Nature Biotechnology 23, 1534 – 1541 (2005).
Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo según los procedimientos revelados en Shinozaki et al., Development 131, 1651 – 1662 (2004).
Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo según los procedimientos revelados en McLean et al., Stem Cells 25, 29 – 38 (2007).
Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo según los procedimientos revelados en D’Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392 – 1401 (2006).
Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo mediante el cultivo de células madre pluripotentes en medio que contiene activita A en ausencia de suero, luego mediante el cultivo de las células con activina A y suero, y luego mediante el cultivo de las células con activina A y suero de una concentración diferente. En Nature Biotechnology 23, 1534 – 1541 (2005), se revela un ejemplo de este procedimiento.
Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo mediante el cultivo de células madre pluripotentes en medio que contiene activina A en ausencia de suero, luego mediante el cultivo de las células con activina A y suero a otra concentración. En D’Amour et al, Nature Biotechnology, 2005, se revela un ejemplo de este procedimiento.
Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo mediante el cultivo de células madre pluripotentes en medio que contiene activina A y un ligando Wnt en ausencia de suero, luego retirando el ligando Wnt y cultivando las células con activina y suero. En Nature Biotechnology 24, 1392 – 1401 (2006), se revela un ejemplo de este procedimiento.
Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes según los procedimientos revelados en la solicitud de patente estadounidense n.º de serie 11/736.908, transferida a LifeScan, Inc.
Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes según los procedimientos revelados en la solicitud de patente estadounidense n.º de serie 11/779.311, transferida a
50 E08855258 28-10-2011
LifeScan, Inc.
Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes según los procedimientos revelados en la solicitud de patente estadounidense n.º de serie 61/076.889.
Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes según los procedimientos revelados en la solicitud de patente estadounidense n.º de serie 61/076.900.
Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes según los procedimientos revelados en la solicitud de patente estadounidense n.º de serie 61/076.908.
Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes según los procedimientos revelados en la solicitud de patente estadounidense n.º de serie 61/076.915
Detección de células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo
La formación de células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se puede determinar analizando la presencia de los marcadores antes y después de seguir un determinado protocolo. Las células madre pluripotentes comúnmente no expresan tales marcadores. Así pues, la diferenciación de células pluripotentes se detecta cuando las células comienzan a expresarlos.
Es posible determinar la eficacia de la diferenciación exponiendo una población de células tratada a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico expresado por células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo.
Los procedimientos para evaluar la expresión de marcadores de proteína y de ácido nucleico en células cultivadas o aisladas son estándar en la técnica. Éstos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa (RT–PCR), transferencias Northern, hibridación in situ (véase, p.ej.: “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel et al., eds. Suplemento de 2001)) e inmunoanálisis tales como análisis inmunohistoquímicos de material seccionado, transferencia Western, y para los marcadores que son accesibles en células intactas, el análisis de citometría de flujo (FACS) (véase, p.ej., Harlow y Lane, “Using Antibodies: A Laboratory Manual”, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Las características de las células madre pluripotentes son ampliamente conocidas por los expertos en la técnica y se siguen identificando otras características de estas células. Los marcadores de células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, la expresión de uno o más de los siguientes: ABCG2, cripto, FoxD3, conexina 43, conexina 45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF–1, ZFP42, SSEA–3, SSEA–4, Tra1–60, Tra1–81.
Tras tratar las células madre pluripotentes con los procedimientos de la presente invención, es posible purificar las células diferenciadas exponiendo una población de células tratada ante un agente (tal como un anticuerpo) que reconozca específicamente un marcador proteico, tal como CXCR4, expresado por las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo.
Formación de células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático
Las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático mediante cualquier procedimiento de la técnica o mediante cualquier procedimiento propuesto en la presente invención.
Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático según los procedimientos revelados en D’Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392 – 1401 (2006).
Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo también se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático mediante el tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con un factor de crecimiento fibroblástico y el inhibidor de la ruta de señalización de Hedgehog KAAD–ciclopamina, luego mediante la eliminación del medio que contiene el factor de crecimiento fibroblástico y KAAD–ciclopamina, y posteriormente, mediante el cultivo de las células en medio que contiene ácido retinoico, un factor de crecimiento fibroblástico y KAAD–ciclopamina. En Nature Biotechnology 24, 1392 – 1401 (2006), se revela un ejemplo de este procedimiento.
50 E08855258 28-10-2011
En un aspecto de la presente invención, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo también se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático mediante el tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con ácido retinoico y, al menos, un factor de crecimiento fibroblástico durante un período de tiempo según los procedimientos revelados en la solicitud de patente estadounidense n.º de serie 11/736.908, transferida a LifeScan, Inc.
En un aspecto de la presente invención, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo también se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático mediante el tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con ácido retinoico y, al menos, un factor de crecimiento fibroblástico durante un período de tiempo según los procedimientos revelados en la solicitud de patente estadounidense n.º de serie 11/779.311, transferida a LifeScan, Inc.
En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para diferenciar células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático, que comprende las etapas de:
a.
cultivar células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo y
b.
tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en ácido retinoico, FGF–2, FGF–4, FGF–7, FGF–10, un inhibidor de Sonic Hedgehog, un factor capaz de inhibir a BMP y una netrina.
En una realización, las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en ácido retinoico, FGF–2, FGF–4, FGF–7, FGF–10, un inhibidor de Sonic Hedgehog, un factor capaz de inhibir a BMP y una netrina durante de aproximadamente uno a aproximadamente seis días. En una realización, las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en ácido retinoico, FGF–2, FGF–4, FGF–7, FGF–10, un inhibidor de Sonic Hedgehog, un factor capaz de inhibir a BMP y una netrina durante aproximadamente seis días.
Cualquier célula que exprese marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo es adecuada para diferenciarse en una célula que exprese marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con el uso de este procedimiento.
En una realización alternativa, la presente invención proporciona un procedimiento para diferenciar células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático, que comprende las etapas de:
a.
cultivar células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo,
b.
tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con al menos un factor seleccionados del grupo que consiste en ácido retinoico y un factor de crecimiento fibroblástico, y
c.
retirar el al menos un factor seleccionado del grupo que consiste en ácido retinoico y un factor de crecimiento fibroblástico, y posteriormente, tratar las células con al menos un factor seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de Sonic Hedgehog, ácido retinoico, un factor de crecimiento fibroblástico, un factor capaz de inhibir a BMP y una netrina.
En una realización, las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en ácido retinoico y un factor de crecimiento fibroblástico durante de aproximadamente uno a aproximadamente tres días. En una realización, las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en ácido retinoico y un factor de crecimiento fibroblástico durante aproximadamente tres días. En una realización, las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de Sonic Hedgehog, ácido retinoico, un factor de crecimiento fibroblástico, un factor capaz de inhibir a BMP y una netrina durante de aproximadamente uno a aproximadamente cuatro días. En una realización, las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de Sonic Hedgehog, ácido retinoico, un factor de crecimiento fibroblástico, un factor capaz de inhibir a BMP y una netrina durante aproximadamente cuatro días.
Cualquier célula que exprese marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo es adecuada para diferenciarse en una célula que exprese marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con el uso
45 E08855258 28-10-2011
de este procedimiento.
En una realización, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático producido mediante los procedimientos de la presente invención muestran un menor nivel de expresión de marcadores asociados con los tejidos hepáticos e intestinales. En una realización, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático producido mediante los procedimientos de la presente invención muestran un menor nivel de albúmina y CDX–2.
El al menos un factor de crecimiento fibroblástico se selecciona del grupo que consiste en FGF–2, FGF–4, FGF– 7 y FGF–10.
En una realización, la BMP es BMP4. En una realización, el al menos un factor capaz de inhibir a BMP4 es nogina.
La netrina se selecciona del grupo que consiste en netrina 1, netrina 2 y netrina 4.
El ácido retinoico se puede usar a una concentración de aproximadamente 1nM a aproximadamente 1mM. En una realización, el ácido retinoico se usa a una concentración de 11M.
El FGF–2 se puede usar a una concentración de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 50 1g/ml. En una realización, FGF–2 se usa a una concentración de 50 ng/ml.
El FGF–4 se puede usar a una concentración de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 50 µg/ml. En una realización, FGF–4 se usa a una concentración de 50 ng/ml.
El FGF–7 se puede usar a una concentración de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 50 µg/ml. En una realización, FGF–7 se usa a una concentración de 50 ng/ml.
El FGF–10 se puede usar a una concentración de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 50 µg/ml. En una realización, FGF–10 se usa a una concentración de 50 ng/ml.
La nogina se puede usar a una concentración de aproximadamente 500 ng/ml a aproximadamente 500 µg/ml. En una realización, la nogina se usa a una concentración de 100 ng/ml.
La netrina 1 se puede usar a una concentración de aproximadamente 500 ng/ml a aproximadamente 50 µg/ml. En una realización, la netrina 1 se usa a una concentración de 100 ng/ml.
La netrina 2 se puede usar a una concentración de aproximadamente 500 ng/ml a aproximadamente 50 µg/ml. En una realización, la netrina 2 se usa a una concentración de 100 ng/ml.
La netrina 4 se puede usar a una concentración de aproximadamente 500 ng/ml a aproximadamente 50 µg/ml. En una realización, la netrina 4 se usa a una concentración de 100 ng/ml.
En una realización, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con, al menos, uno de los siguientes factores: ácido retinoico, FGF–2, FGF–4, FGF–7, FGF–10, ciclopamina, nogina, netrina 1, netrina 2 o netrina 4.
En una realización, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con ácido retinoico, FGF–2, ciclopamina y nogina. En una realización alternativa, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con ácido retinoico, FGF–4, ciclopamina y nogina. En una realización alternativa, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con ácido retinoico, FGF–7, ciclopamina y nogina. En una realización alternativa, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con ácido retinoico, FGF–10, ciclopamina y nogina.
En una realización, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con ácido retinoico, FGF–2, ciclopamina y una netrina. En una realización alternativa, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con ácido retinoico, FGF–4, ciclopamina y una netrina. En una realización alternativa, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con ácido retinoico, FGF–7, ciclopamina y una netrina. En una realización alternativa, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con ácido retinoico, FGF–10, ciclopamina y una netrina.
La netrina se selecciona del grupo que consiste en netrina 1, netrina 2 y netrina 4.
En una realización, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con ácido retinoico, FGF–2, ciclopamina, nogina y una netrina. En una realización alternativa, las células que
50 E08855258 28-10-2011
expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con ácido retinoico, FGF–4, ciclopamina, nogina y una netrina. En una realización alternativa, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con ácido retinoico, FGF–7, ciclopamina, nogina y una netrina. En una realización alternativa, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con ácido retinoico, FGF–10, ciclopamina, nogina y una netrina.
La netrina se selecciona del grupo que consiste en netrina 1, netrina 2 y netrina 4.
Las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se pueden tratar con al menos uno de otros factores adicionales que pueden potenciar la formación de células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático. Alternativamente, el al menos uno de otros factores adicionales puede aumentar la proliferación de células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático formado mediante procedimientos de la presente invención. Además, el al menos uno de otros factores adicionales puede aumentar la capacidad de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático formado mediante los procedimientos de la presente invención para formar otros tipos de células o mejorar la eficiencia de cualquier otra etapa de diferenciación adicional.
El al menos un factor adicional puede ser, por ejemplo, nicotinamida, miembros de la familia de los TGF– , incluyendo TGF– 1, 2 y 3, albúmina de suero, miembros de la familia de los factores de crecimiento fibroblástico, factor de crecimiento derivado de plaquetas–AA y –BB, plasma rico en plaquetas, factor de crecimiento de insulina (IGF–I, II), factor de diferenciación del crecimiento (GDF–5, –6, –8, –10, 11), péptido I y II de tipo glucagón (GLP–I y II), mimético de GLP–1 y GLP–2, exendina–4, ácido retinoico, hormona paratiroidea, insulina, progesterona, aprotinina, hidrocortisona, etanolamina, beta mercaptoetanol, factor de crecimiento epidérmico (EGF), gastrina I y II, quelantes del cobre, tales como, por ejemplo, trietilenpentamina, forskolina, butirato de sodio, activina, betacelulina, ITS, nogina, factor de crecimiento de neuritas, nodal, ácido valpórico, tricostatina A, butirato de sodio, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), esfingosina–1, VEGF, MG132 (EMD, CA), complementos de N2 y B27 (Gibco, CA), alcaloides esteroideos tales como, por ejemplo, ciclopamina (EMD, CA), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), familia de las proteínas Dickkopf, extracto pituitario bovino, proteína asociada a la neogénesis de islotes (INGAP), Hedgehog de India, Sonic Hedgehog, inhibidores del proteasoma, inhibidores de la ruta Notch, inhibidores de Sonic Hedgehog o sus combinaciones.
El al menos uno de los otros factores adicionales se puede suministrar mediante medios acondicionados obtenidos de líneas de células pancreáticas, tales como, por ejemplo, PANC–1 (ATCC N.º: CRL–1469), CAPAN–1 (ATCC N.º: HTB–79), BxPC–3 (ATCC N.º: CRL–1687), HPAF–II (ATCC N.º: CRL–1997), líneas de células hepáticas, tales como, por ejemplo, HepG2 (ATCC N.º: HTB–8065) y líneas de células intestinales, tales como, por ejemplo, FHs 74 (ATCC N.º: CCL–241).
Definición de células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático
Los marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático son ampliamente conocidos por los expertos en la técnica y se siguen identificando más marcadores característicos de este linaje. Estos marcadores se pueden usar para confirmar que las células tratadas según la presente invención se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje endodérmico pancreático. Los marcadores específicos del linaje endodérmico pancreático incluyen la expresión de uno o más factores de transcripción, tales como, por ejemplo, Hlxb9, PTF–1a, PDX–1, HNF–6, HNF–1beta.
Es posible determinar la eficacia de la diferenciación exponiendo una población de células tratada ante un agente (tal como un anticuerpo) que reconozca específicamente un marcador proteico expresado por células que expresen marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático.
Los procedimientos para evaluar la expresión de marcadores proteicos y de ácido nucleico en células cultivadas o aisladas son estándar en la técnica. Éstos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa (RT–PCR), transferencias Northern, hibridación in situ (véase, p.ej.: “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel et al., eds. Suplemento de 2001)) e inmunoanálisis tales como análisis inmunohistoquímicos de material seccionado, transferencia Western, y para los marcadores que son accesibles en células intactas, el análisis de citometría de flujo (FACS) (véase, p.ej., Harlow y Lane, “Using Antibodies: A Laboratory Manual”, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Formación de células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático
Las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático mediante cualquier procedimiento de la técnica o mediante cualquier procedimiento revelado en la presente invención.
Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se pueden
50 E08855258 28-10-2011
diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático según los procedimientos revelados en D’Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392 – 1401 (2006).
Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático también se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático mediante el cultivo de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en medio que contiene DAPT y exendina 4, luego mediante la eliminación del medio que contiene DAPT y exendina 4, y posteriormente, el cultivo de células en medio que contiene exendina 1, IGF–1 y HGF. En Nature Biotechnology 24, 1392 – 1401 (2006), se revela un ejemplo de este procedimiento.
Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático también se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático mediante el cultivo de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en medio que contiene exendina 4, luego mediante la eliminación del medio que contiene exendina 4, y posteriormente, el cultivo de células en medio que contiene exendina 1, IGF–1 y HGF. En D’Amour et al, Nature Biotechnology, 2006, se revela un ejemplo de este procedimiento.
Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático también se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático mediante el cultivo de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en medio que contiene DAPT y exendina 4. En D’Amour et al, Nature Biotechnology, 2006, se revela un ejemplo de este procedimiento.
Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático también se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático mediante el cultivo de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en medio que contiene exendina 4. En D’Amour et al, Nature Biotechnology, 2006, se revela un ejemplo de este procedimiento.
En un aspecto de la presente invención, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático también se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático mediante el tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con un factor que inhibe la ruta de señalización Notch según los procedimientos revelados en la solicitud de patente estadounidense n.º de serie 11/736.908, transferida a LifeScan, Inc.
En un aspecto de la presente invención, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático también se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático mediante el tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con un factor que inhibe la ruta de señalización Notch según los procedimientos revelados en la solicitud de patente estadounidense n.º de serie 11/779.311, transferida a LifeScan, Inc.
En un aspecto de la presente invención, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático también se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático mediante el tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con un factor que inhibe la ruta de señalización Notch según los procedimientos revelados en la solicitud de patente estadounidense n.º de serie 60/953.178, transferida a LifeScan, Inc.
En un aspecto de la presente invención, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático también se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático mediante el tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con un factor que inhibe la ruta del TGF– R–1. El factor que inhibe la ruta del TGF– R–1 puede ser un antagonista del receptor extracelular 1 de TGF– . Alternativamente, el factor puede inhibir la actividad biológica del receptor TGF– R–1. Alternativamente, el factor puede inhibir o ser un antagonista de un elemento de la ruta de transducción de señales de TGF– R–1 en el interior de una célula.
Las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se tratan con un factor que inhibe la ruta del TGF– R–1 durante de aproximadamente uno a aproximadamente doce días. Alternativamente, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se tratan con el factor que inhibe la ruta del TGF– R–1 durante de aproximadamente cinco a aproximadamente doce días. Alternativamente, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se tratan con el factor que inhibe la ruta del TGF– R–1 durante aproximadamente doce días.
Cualquier célula que exprese marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático es adecuada para diferenciarse en una célula que exprese marcadores característicos del linaje endocrino pancreático con el uso de este procedimiento.
En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para diferenciar células que expresan
50 E08855258 28-10-2011
marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático, que comprende las etapas de:
a.
cultivar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático y
b.
tratar las células con un factor que inhibe la ruta de señalización Notch y un factor que inhibe la ruta de señalización del TGF– R–1.
Las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se tratan con el factor que inhibe la ruta de señalización Notch y el factor que inhibe la ruta del TGF– R–1 durante de aproximadamente uno a aproximadamente doce días. Alternativamente, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se tratan con el factor que inhibe la ruta de señalización Notch y el factor que inhibe la ruta del TGF– R–1 durante de aproximadamente cinco a aproximadamente doce días. Alternativamente, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se tratan con el factor que inhibe la ruta de señalización Notch y el factor que inhibe la ruta del TGF– R–1 durante aproximadamente doce días.
Cualquier célula que exprese marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático es adecuada para diferenciarse en una célula que exprese marcadores característicos del linaje endocrino pancreático con el uso de este procedimiento.
En una realización, el factor que inhibe la ruta de señalización Notch es un inhibidor de la y–secretasa. En una realización, el inhibidor de la y–secretasa es terc–butiléster de ácido 1S–bencil–4R–[1–(1S–carbamoil–2– fenetilcarbamoil)–1S–3–metilbutilcarbamoil]–2R–hidroxi–5–fenilpentil]carbámico, también conocido como L–
685.458.
El L–685.458 se puede usar a una concentración de aproximadamente 0,11M a aproximadamente 100µM. En una realización, el L–685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 90µM. En una realización, el L–685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 80µM. En una realización, el L–685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 70µM. En una realización, el L–685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 60µM. En una realización, el L–685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 50µM. En una realización, el L–685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 40µM. En una realización, el L–
685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 30µM. En una realización, el L–685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 20µM. En una realización, el L–685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 10µM.
En una realización, el factor que inhibe la ruta de señalización del TGF– R–1 es un inhibidor de la quinasa de TGF–
R–1. En una realización, el inhibidor de la quinasa de TGF– R–1 es (2–(3–(6–metilpiridin–2–il)–1H–pirazol–4–il)– 1,5–naftiridina). En otra realización, el inhibidor de la quinasa de TGF– R–1 es [3–(piridin–2–il)–4–(4–quinonil)]– 1H–pirazol.
El inhibidor de la quinasa de TGF– R–1 se puede usar a una concentración de aproximadamente 0,1µM a aproximadamente 100µM. En una realización, el inhibidor de la quinasa de TGF– R–1 se usa a una concentración de aproximadamente 90µM. En una realización, el inhibidor de la quinasa de TGF– R–1 se usa a una concentración de aproximadamente 80µM. En una realización, el inhibidor de la quinasa de TGF– R–1 se usa a una concentración de aproximadamente 70µM. En una realización, el inhibidor de la quinasa de TGF– R–1 se usa a una concentración de aproximadamente 60µM. En una realización, el inhibidor de la quinasa de TGF– R–1 se usa a una concentración de aproximadamente 50µM. En una realización, el inhibidor de la quinasa de TGF– R–1 se usa a una concentración de aproximadamente 40µM. En una realización, el inhibidor de la quinasa de TGF– R– 1 se usa a una concentración de aproximadamente 30µM. En una realización, el inhibidor de la quinasa de TGF–
R–1 se usa a una concentración de aproximadamente 20µM. En una realización, el inhibidor de la quinasa de TGF– R–1 se usa a una concentración de aproximadamente 10µM. En una realización, el inhibidor de la quinasa de TGF– R–1 se usa a una concentración de aproximadamente 1µM. En una realización, el inhibidor de la quinasa de TGF– R–1 se usa a una concentración de aproximadamente 0,1µM.
Las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se pueden tratar con al menos uno de otros factores adicionales que pueden potenciar la formación de células que expresen marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. Alternativamente, el al menos uno de otros factores adicionales puede aumentar la proliferación de células que expresen marcadores característicos del linaje endocrino pancreático formado mediante procedimientos de la presente invención. Además, el al menos uno de otros factores adicionales puede aumentar la capacidad de las células que expresen marcadores característicos del linaje endocrino pancreático formado mediante los procedimientos de la presente invención para formar otros tipos de células o mejorar la eficiencia de cualquier otra etapa de diferenciación adicional.
El al menos un factor adicional puede ser, por ejemplo, nicotinamida, miembros de la familia de los TGF– ,
55 E08855258 28-10-2011
incluyendo TGF– 1, 2 y 3, albúmina de suero, miembros de la familia de los factores de crecimiento fibroblástico, factor de crecimiento derivado de plaquetas–AA y –BB, plasma rico en plaquetas, factor de crecimiento de insulina (IGF–I, II), factor de diferenciación del crecimiento (GDF–5, –6, –8, –10, 11), péptido I y II de tipo glucagón (GLP–I y II), mimético de GLP–1 y GLP–2, exendina–4, ácido retinoico, hormona paratiroidea, insulina, progesterona, aprotinina, hidrocortisona, etanolamina, beta mercaptoetanol, factor de crecimiento epidérmico (EGF), gastrina I y II, quelantes del cobre, tales como, por ejemplo, trietilenpentamina, forskolina, butirato de sodio, activina, betacelulina, ITS, nogina, factor de crecimiento de neuritas, nodal, ácido valpórico, tricostatina A, butirato de sodio, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), esfingosina–1, VEGF, MG132 (EMD, CA), complementos de N2 y B27 (Gibco, CA), alcaloides esteroideos tales como, por ejemplo, ciclopamina (EMD, CA), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), familia de las proteínas Dickkopf, extracto pituitario bovino, proteína asociada a la neogénesis de islotes (INGAP), Hedgehog de India, Sonic Hedgehog, inhibidores del proteasoma, inhibidores de la ruta Notch, inhibidores de Sonic Hedgehog o sus combinaciones.
El al menos uno de los otros factores adicionales se puede suministrar mediante medios acondicionados obtenidos de líneas de células pancreáticas, tales como, por ejemplo, PANC–1 (ATCC N.º: CRL–1469), CAPAN–1 (ATCC N.º: HTB–79), BxPC–3 (ATCC N.º: CRL–1687), HPAF–II (ATCC N.º: CRL–1997), líneas de células hepáticas, tales como, por ejemplo, HepG2 (ATCC N.º: HTB–8065) y líneas de células intestinales, tales como, por ejemplo, FHs 74 (ATCC N.º: CCL–241).
Detección de células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático
Los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático son ampliamente conocidos por los expertos en la técnica y se siguen identificando más marcadores característicos de este linaje. Estos marcadores se pueden usar para confirmar que las células tratadas según la presente invención se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje endocrino pancreático. Los marcadores específicos del linaje endocrino pancreático incluyen la expresión de uno o más factores de transcripción, tales como, por ejemplo, NGN–3, NeuroD, Islote–1.
Los marcadores característicos del linaje de células son ampliamente conocidos por los expertos en la técnica y se siguen identificando más marcadores característicos de este linaje. Estos marcadores se pueden usar para confirmar que las células tratadas según la presente invención se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje de células . Los marcadores característicos del linaje de de células incluyen la expresión de uno o más factores de transcripción, tales como, por ejemplo, Pdx1 (gen pancreático y de la caja homeótica duodenal 1), Nkx2.2, Nix6.1, Isl1, Pax6, Pax4, NeuroD, Hnf1b, Hnf–6, Hnf–3beta y MafA, entre otros. Estos factores de transcripción están ampliamente establecidos en la técnica para la identificación de células endocrinas. Véase, p.ej., Edlund (Nature Reviews Genetics 3: 524–632 (2002)).
Es posible determinar la eficacia de la diferenciación exponiendo una población de células tratada ante un agente (tal como un anticuerpo) que reconozca específicamente un marcador proteico expresado por células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. Alternativamente, es posible determinar la eficacia de la diferenciación exponiendo una población de células tratada ante un agente (tal como un anticuerpo) que reconozca específicamente un marcador proteico expresado por células que expresan marcadores característicos del linaje de células .
Los procedimientos para evaluar la expresión de marcadores proteicos y de ácido nucleico en células cultivadas o aisladas son estándar en la técnica. Éstos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa (RT–PCR), transferencias Northern, hibridación in situ (véase, p.ej.: “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel et al., eds. Suplemento de 2001)) e inmunoanálisis tales como análisis inmunohistoquímicos de material seccionado, transferencia Western, y para los marcadores que son accesibles en células intactas, el análisis de citometría de flujo (FACS) (véase, p.ej., Harlow y Lane, “Using Antibodies: A Laboratory Manual”, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
En un aspecto de la presente invención, se determina la eficacia de la diferenciación midiendo el porcentaje de las células positivas en insulina de un cultivo celular dado tras el tratamiento. En un aspecto, los procedimientos de la presente invención producen células aproximadamente un 100% positivas en insulina en un cultivo dado. En un aspecto alternativo, los procedimientos de la presente invención producen células aproximadamente un 90% positivas en insulina en un cultivo dado. En un aspecto alternativo, los procedimientos de la presente invención producen células aproximadamente un 80% positivas en insulina en un cultivo dado. En un aspecto alternativo, los procedimientos de la presente invención producen células aproximadamente un 70% positivas en insulina en un cultivo dado. En un aspecto alternativo, los procedimientos de la presente invención producen células aproximadamente un 60% positivas en insulina en un cultivo dado. En un aspecto alternativo, los procedimientos de la presente invención producen células aproximadamente un 50% positivas en insulina en un cultivo dado. En un aspecto alternativo, los procedimientos de la presente invención producen células aproximadamente un 40% positivas en insulina en un cultivo dado. En un aspecto alternativo, los procedimientos de la presente invención
55 E08855258 28-10-2011
producen células aproximadamente un 30% positivas en insulina en un cultivo dado. En un aspecto alternativo, los procedimientos de la presente invención producen células aproximadamente un 20% positivas en insulina en un cultivo dado. En un aspecto alternativo, los procedimientos de la presente invención producen células aproximadamente un 10% positivas en insulina en un cultivo dado. En un aspecto alternativo, los procedimientos de la presente invención producen células aproximadamente un 5% positivas en insulina en un cultivo dado.
En un aspecto de la presente invención, se determina la eficacia de la diferenciación midiendo la secreción de insulina estimulada por glucosa, según lo detectado mediante la medición de la cantidad de péptido C liberado por las células. En una realización, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 1.000 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 900 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 800 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 700 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 600 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 500 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 400 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 500 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 400 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 300 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 200 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 100 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 90 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 80 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 70 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 60 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 50 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 40 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 30 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 20 ng de péptido C/pg de ADN. En una realización alternativa, las células producidas mediante los procedimientos de la presente invención producen aproximadamente 10 ng de péptido C/pg de ADN.
Terapias
En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar a una persona que padece o que está en riesgo de desarrollar diabetes de tipo 1. Este procedimiento implica cultivar células madre pluripotentes, diferenciar las células madre pluripotentes in vitro en un linaje de células e implantar las células de un linaje de células en un paciente.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar a una persona que padece o que está en riesgo de desarrollar diabetes de tipo 2. Este procedimiento implica cultivar células madre pluripotentes, diferenciar las células cultivadas in vitro en un linaje de células e implantar las células de un linaje de células en el paciente.
Si es apropiado, también se puede tratar el paciente con agentes farmacéuticos o bioactivos que faciliten la supervivencia y la función de las células transplantadas. Estos agentes pueden incluir, por ejemplo, insulina, miembros de la familia de los TGF– , incluyendo TGF– 1, 2 y 3, proteínas morfogénicas óseas (BMP–2, –3, –4, – 5, 6, –7, –11, –12 y –13), factores de crecimiento fibroblástico 1 y 2, factor de crecimiento derivado de plaquetas AA y BB, plasma rico en plaquetas, factor de crecimiento de insulina (IGF–I, II), factor de diferenciación del crecimiento (GDF–5, –6, –7, –8, – 10, –15), factor de crecimiento derivado de células endoteliales vasculares (VEGF), pleyotrofina, endotelina, entre otros. Otros compuestos farmacéuticos pueden incluir, por ejemplo, nicotinamida, péptido I (GLP–1) y II de tipo glucagón, mimético de GLP–1 y 2 , exendina–4, ácido retinoico, hormona paratiroidea, inhibidores de MAPK, tales como, por ejemplo, los compuestos revelados en la solicitud estadounidense publicada 2004/0209901 y la solicitud estadounidense publicada 2004/0132729.
50 E08855258 28-10-2011
Las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células productoras de insulina antes de ser transplantadas a un receptor. En una realización específica, las células madre pluripotentes se diferencian completamente en células antes de ser transplantadas a un receptor. Alternativamente, las células madre pluripotentes se pueden transplantar a un receptor en un estado no diferenciado o parcialmente diferenciado. En el receptor, puede tener lugar otra diferenciación.
Es posible implantar células de endodermo definitivo o, alternativamente, células de endodermo pancreático o, alternativamente, células en forma de células dispersadas o formadas en grupos que se pueden infundir en la vena portal hepática. Alternativamente, es posible proporcionar células en soportes poliméricos degradables biocompatibles, dispositivos no degradables porosos o encapsuladas para protegerlas de la respuesta inmune del huésped. Las células se pueden implantar en una zona apropiada de un receptor. Las zonas de implantación incluyen, por ejemplo, hígado, páncreas natural, espacio subcapsular renal, omento, peritoneo, espacio subserosal, intestino, estómago o bolsillo subcutáneo.
Para potenciar una mayor diferenciación, la supervivencia o la actividad de las células implantadas, se pueden administrar factores adicionales, tales como factores de crecimiento, antioxidantes o agentes antiinflamatorios, antes, simultáneamente a o después de la administración de las células. En ciertas realizaciones, se utilizan factores de crecimiento para diferenciar las células administradas in vivo. Estos factores pueden ser secretados por células endógenas y ser expuestos a las células administradas in situ. Es posible inducir la diferenciación de las células implantadas mediante cualquier combinación de factores de crecimiento administrados endógena o exógenamente conocidos en la técnica.
La cantidad de células usada en la implantación depende de una serie de diversos factores que incluyen el estado del paciente y la respuesta a la terapia, y cualquier experto en la técnica la puede determinar.
En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar a una persona que padece o está en riesgo de desarrollar diabetes. Este procedimiento implica cultivar células madre pluripotentes, diferenciar las células cultivadas in vitro en un linaje de células e incorporar las células a un soporte tridimensional. Es posible mantener las células in vitro sobre este soporte antes de implantarlas en el paciente. Alternativamente, es posible implantar directamente el soporte que contiene las células en el paciente sin la necesidad de un cultivo in vitro adicional. Opcionalmente, el soporte se puede incorporar con al menos un agente farmacéutico que facilite la supervivencia y la función de las células transplantadas.
Los materiales de soporte adecuados para su uso a los efectos de la presente invención incluyen moldes de tejidos, conductos, barreras y reservorios útiles para la reparación de tejidos. En concreto, para poner en práctica los procedimientos de la presente invención, son adecuados materiales sintéticos y naturales en forma de espumas, esponjas, geles, hidrogeles, tejidos y estructuras no tejidas, que se han usado in vitro e in vivo para reconstruir o regenerar tejido biológico, así como para administrar agentes quimiotácticos para inducir el crecimiento de tejidos. Véanse, por ejemplo, los materiales revelados en la patente estadounidense n.º 5.770.417, la patente estadounidense n.º 6.022.743, la patente estadounidense n.º 5.567.612, la patente estadounidense n.º 5.759.830, la patente estadounidense n.º 6.626.950, la patente estadounidense n.º 6.534.084, la patente estadounidense n.º 6.306.424, la patente estadounidense n.º 6.365.149, la patente estadounidense n.º 6.599.323, la patente estadounidense n.º 6.656.488, la solicitud de patente estadounidense n.º 2004/0062753 A1, la patente estadounidense n.º 4.557.264 y la patente estadounidense n.º 6.333.029.
Para formar un soporte incorporado con un agente farmacéutico, el agente farmacéutico se puede mezclar con la solución polimérica antes de formar el soporte. Alternativamente, es posible revestir un soporte fabricado con un agente farmacéutico, preferiblemente, en presencia de un vehículo farmacéutico. El agente farmacéutico puede estar presente en forma de líquido, de sólido finamente dividido o en cualquier otra forma física apropiada. Alternativamente, se pueden añadir excipientes al soporte para modificar la velocidad de liberación del agente farmacéutico. En una realización alternativa, el soporte se incorpora con al menos un compuesto farmacéutico, que es un compuesto antiinflamatorio, tal como, por ejemplo, los compuestos revelados en la patente estadounidense n.º 6.509.369.
EL soporte se puede incorporar con al menos un compuesto farmacéutico, que sea un compuesto antiapoptótico, tal como, por ejemplo, los compuestos revelados en la patente estadounidense n.º 6.793.945.
EL soporte también se puede incorporar con al menos un compuesto farmacéutico, que sea un inhibidor de la fibrosis, tal como, por ejemplo, los compuestos revelados en la patente estadounidense n.º 6.331.298.
EL soporte también se puede incorporar con al menos un compuesto farmacéutico, que sea capaz de potenciar la angiogénesis, tales como, por ejemplo, los compuestos revelados en la solicitud estadounidense publicada 2004/0220393 y la solicitud estadounidense publicada 2004/0209901.
50 E08855258 28-10-2011
EL soporte también se puede incorporar con al menos un compuesto farmacéutico, que sea un compuesto inmunosupresor, tal como, por ejemplo, los compuestos revelados en la solicitud estadounidense publicada 2004/0171623.
El soporte también se puede incorporar con al menos un compuesto farmacéutico que sea un factor de crecimiento, tal como, por ejemplo, miembros de la familia de los TGF– , incluyendo TGF– 1, 2 y 3, proteínas morfogénicas óseas (BMP–2, –3, –4, –5, –6, –7, –11, –12 y –13), factores de crecimiento fibroblástico 1 y 2, factor de crecimiento derivado de plaquetas AA y BB, plasma rico en plaquetas, factor de crecimiento de insulina (IGF–I, II), factor de diferenciación del crecimiento (GDF–5, –6, –8, –10, –15), factor de crecimiento derivado de células endoteliales vasculares (VEGF), pleyotrofina, endotelina, entre otros. Otros compuestos farmacéuticos pueden incluir, por ejemplo, nicotinamida, factor 1 alfa inducible por hipoxia, péptido I de tipo glucagón (GLP–1), mimético de GLP–1 y GLP–2, y II, exendina–4, nogina, NGF, ácido retinoico, hormona paratiroidea, tenascina–C, tropoelastina, péptidos derivados de trombina, catelicidinas, defensinas, laminina, péptidos biológicos que contienen dominios de unión a células y heparina de proteínas de la matriz extracelular adhesiva, tales como fibronectina y vitronectina, inhibidores de MAPK, tales como, por ejemplo, los compuestos revelados en la solicitud estadounidense publicada 2004/0209901 y la solicitud estadounidense publicada 2004/0132729.
La incorporación de las células de la presente invención a un andamio se puede conseguir mediante el simple depósito de las células sobre el andamio. Las células pueden entrar en el andamio mediante una simple difusión (J. Pediatr. Surg. 23 (1 Pt 2): 3–9 (1988)). Se han desarrollado otros diversos enfoques para aumentar la eficacia del sembrado celular. Por ejemplo, se han usado matraces de agitación en el sembrado de condrocitos sobre andamios de ácido poliglicólico (Biotechnol. Prog. 14(2): 193–202 (1998)). Otro enfoque para sembrar células es el uso de centrifugación, lo que produce un estrés mínimo para las células sembradas y aumenta la eficacia del sembrado. Por ejemplo, Yang et al. desarrollaron un procedimiento de sembrado celular (J. Biomed. Mater. Res. 55(3): 379–86 (2001)), denominado inmovilización celular por centrifugación (CCI).
La presente invención se ilustra más detalladamente mediante los siguientes ejemplos no restrictivos.
Ejemplos
Ejemplo 1
Cultivo de células madre embrionarias humanas
Las líneas de células madre embrionarias humanas H1, H7 y H9 se obtuvieron en WiCell Research Institute, Inc., (Madison, WI) y se cultivaron según las instrucciones proporcionadas por el instituto de donde procedían. En síntesis, se cultivaron las células sobre células alimentadoras de fibroblastos embrionarios murinos (MEF) en medio de células ES que consistía en DMEM/F12 (Invitrogen/Gibco) complementado con remplazo de suero noqueado al 20%, aminoácidos no esenciales MEM 100nM, betamercaptoetanol 0,5mM, L–glutamina 2mM con 4 ng/ml de factor de crecimiento fibroblástico básico humano (bFGF) (todo de Invitrogen/Gibco). Las células MEF, derivadas de los embriones murinos E13 a 13.5, fueron adquiridas en Charles River. Se expandieron las células MEF en medio de DMEM complementado con SBF al 10% (Hyclone), glutamina 2mM y aminoácidos no esenciales MEM 100mM. Se trataron los cultivos de células MEF subconfluyentes con 10 1g/ml de mitomicina C (Sigma, St. Louis, MO) durante 3 h para detener la división celular, luego se tripsinizaron y se colocaron a 2 x 104/cm2 sobre placas revestidas de gelatina bovina al 0,1%. Como capas alimentadoras, se usaron células MEF del paso dos al cuatro. Se cultivaron las células madre embrionarias humanas colocadas sobre las capas alimentadoras de células MEF a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5% con una incubadora humidificada para cultivos tisulares. Cuando confluyeron (aproximadamente 5–7 días después de colocarlas sobre las placas), se trataron las células madre embrionarias humanas con 1 mg/ml de colagenasa de tipo IV (Invitrogen/Gibco) durante 5–10 min y luego se rasparon suavemente de la superficie usando una pipeta de 5 ml. Se centrifugaron las células a 900 rpm durante 5 min, y se volvieron a suspender los sedimentos y colocar sobre las placas a una proporción 1:3 a 1:4 de células en medio de cultivo recién preparado.
Ejemplo 2
Diferenciación de células madre embrionarias humanas cultivadas sobre sustrato de cultivo de tejidos revestido con MATRIGEL™ hacia células endocrinas pancreáticas
Se cultivaron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, en el paso 45, sobre placas revestidas de MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se expusieron a medio de DMEM/F12 complementado con SBF al 0,5% y 100 ng/ml de activina–A (R&D Systems, MN) más 20 ng/ml de WNT–3a (N.º de catálogo 1324–WN–002, R&D Systems, MN), durante dos días, tras lo que se trataron con medios de DMEM/F12 complementados con SBF al 2% y 100 ng/ml de activina–A (AA) durante tres días más. A continuación, se trataron los cultivos con DMEM/F12
+ SBF al 2% + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,251m (n.º 239804, Calbiochem, CA) durante tres días
50 E08855258 28-10-2011
seguidos por una incubación de cuatro días en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,251m + ácido retinoico 21m (AR) (Sigma, MO).
A continuación, se cultivaron las células en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml de exendina–4 (Sigma, MO) + DAPT 11m (Calbiochem, CA) durante seis días seguidos por otros tres días más de incubación en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml de exendina–4 (Sigma, MO) + 50 ng/ml de IGF (Peprotech, NJ)
+ 50 ng/ml de HGF (R&D Systems, MN). En la Figura 1a, se representa un esquema del procedimiento. Se recogieron muestras de ARN de cultivos en diversas etapas de diferenciación. La Figura 2 representa los datos de PCR en tiempo real obtenidos de células cosechadas en las etapas 3 a 5. Se produjo un aumento significativo de la expresión de los marcadores endocrinos, tales como la insulina y el glucagón, observado en las células de las etapas 4 y 5, junto con un aumento de la expresión de NeuroD.
Ejemplo 3
Efectos de diversos compuestos sobre la expresión de marcadores característicos del linaje endocrino pancreático en células madre pluripotentes tratadas según el protocolo de diferenciación representado en la Figura 1a.
Se cultivaron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, en el paso 51, sobre placas revestidas de MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se expusieron a medio de DMEM/F12 complementado con SBF al 0,5% y 100 ng/ml de activina–A (R&D Systems, MN) más 20 ng/ml de WNT–3a (N.º de catálogo 1324–WN–002, R&D Systems, MN) durante dos días, tras lo que se trataron con medios de DMEM/F12 complementados con SBF al 2% y 100 ng/ml de activina–A (AA) durante dos días más. A continuación, se trataron los cultivos con DMEM/F12
+
SBF al 2% + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm (n.º 239804, Calbiochem, CA) durante tres días seguidos por una incubación de cuatro días en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm + ácido retinoico 2µm (AR) (Sigma, MO).
A continuación, se cultivaron las células en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml de exendina–4 (Sigma, MO) + DAPT 1µm (Calbiochem, CA) durante seis días seguidos de otros tres días más de incubación en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml de exendina–4 (Sigma, MO) + 50 ng/ml de IGF (Peprotech, NJ)
+
50 ng/ml de HGF (R&D Systems, MN). Se trataron algunos de los cultivos con 1 1m de los siguientes compuestos bien en la etapa 3, la etapa 4 o las etapas 3 + 4: inhibidor de MEK/MAPK (2’–amino–3’–metoxiflavona) (PD98059, Calbiochem, CA), inhibidor de la quinasa de RAF (5–yodo–3–[(3,5–dibromo–4–hidroxifenil)metilen]–2–indolinona) (n.º 553008, Calbiochem, CA), inhibidor de SMAD3 (6,7–dimetil–2–((2E)–3–(1–metil–2–fenil–1H–pirrolo[2,3– b]piridin–3–il–prop–2–enoil))–1,2,3,4–tetrahidroisoquinolina) (n.º 566405, Calbiochem, CA), inhibidor de AKT (1L6– hidroximetil–quiroinositol–2–(R)–2–O–metil–3–O–octadecil–sn–glicerocarbonato) (n.º 124005, Calbiochem, CA), inhibidor de MEK (n.º 444937 Calbiochem, CA) e inhibidor del receptor de TGF– I (2–(3–(6–metilpiridin–2–il)–1H– pirazol–4–il)–1,5–naftiridina) (inhibe la quinasa de tipo receptor de activina 5, n.º 616452, Calbiochem, CA).
La Figura 3 a–e representa los datos de PCR en tiempo real obtenidos de células cosechadas al final de las etapas 3 a 5 tratadas con las condiciones indicadas. Cabe destacar que la adición del inhibidor de la quinasa del receptor de TGF– I (2–(3–(6–metilpiridin–2–il)–1H–pirazol–4–il)–1,5–naftiridina) a células en la etapa 4 o a células en las etapas 3 y 4 aumentó significativamente la expresión de insulina, glucagón, NeuroD y NKX2.2, afectando ligeramente a la expresión de PDX–1 al final de la etapa 5. La adición del inhibidor de la quinasa del receptor de TGF– I (2–(3–(6–metilpiridin–2–il)–1H–pirazol–4–il)–1,5–naftiridina) sólo a células en la etapa 3 suprarreguló ligeramente la expresión de marcadores endocrinos en las células al final de la etapa 5.
Ejemplo 4
Efectos de la adición de inhibidor de la quinasa del receptor de TGF–j I sobre la expresión de marcadores característicos del linaje endocrino pancreático en células madre pluripotentes tratadas según el protocolo de diferenciación representado en la Figura 1a
Se cultivaron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, en el paso 44, sobre placas revestidas de MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se expusieron a medio de DMEM/F12 complementado con SBF al 0,5% y 100 ng/ml de activina–A (R&D Systems, MN) más 20 ng/ml de WNT–3a (N.º de catálogo 1324–WN–002, R&D Systems, MN) durante dos días, tras lo que se trataron con medios DMEM/F12 complementados con SBF al 2% y 100 ng/ml de activina–A (AA) durante dos días más. A continuación, se trataron los cultivos con DMEM/F12 + SBF al 2% + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm (n.º 239804, Calbiochem, CA) durante tres días seguidos por una incubación de cuatro días en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm + ácido retinoico 2µm (AR) (Sigma, MO).
A continuación, se cultivaron las células en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml de exendina–4 (Sigma, MO) + DAPT 1µm (Calbiochem, CA) durante seis días seguidos por otros tres días más de incubación en
50 E08855258 28-10-2011
DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml de exendina–4 (Sigma, MO) + 50 ng/ml de IGF (Peprotech, NJ)
+ 50 ng/ml de HGF (R&D Systems, MN). Se trataron algunos de los cultivos con 1µm de inhibidor de la quinasa del receptor de TGF– I (2–(3–(6–metilpiridin–2–il)–1H–pirazol–4–il)–1,5–naftiridina) (un inhibidor de la quinasa de tipo receptor de activina 5, n.º 616452, Calbiochem, CA) en la etapa 4, etapa 5 o etapas 4 y 5.
La Figura 4 a–e representa los datos de PCR en tiempo real obtenidos de células cosechadas en las etapas 3 a 5 +/– inhibidor de quinasa en las etapas 4 a 5. Cabe destacar que la adición del inhibidor de la quinasa del receptor de TGF– I (2–(3–(6–metilpiridin–2–il)–1H–pirazol–4–il)–1,5–naftiridina) a células en la etapa 4 o etapas 4 y 5 aumentó significativamente la expresión de insulina, glucagón, NeuroD y NKX2.2, afectando ligeramente a la expresión de PDX–1 al final de la etapa 5. La adición del inhibidor de la quinasa del receptor de TGF– I (2–(3–(6– metilpiridin–2–il)–1H–pirazol–4–il)–1,5–naftiridina) sólo en la etapa 5 sobrerreguló ligeramente la expresión de marcadores endocrinos al final de la etapa 5.
Ejemplo 5
Efecto de diversos inhibidores de la quinasa del receptor de TGF–j I sobre la expresión de marcadores característicos del linaje endocrino pancreático en células madre pluripotentes tratadas según el protocolo de diferenciación representado en la Figura 1a
Se cultivaron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, en el paso 41, sobre placas revestidas de MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se expusieron a medio de DMEM/F12 complementado con SBF al 0,5% y 100 ng/ml de activina–A (R&D Systems, MN) más 20 ng/ml de WNT–3a (N.º de catálogo 1324–WN–002, R&D Systems, MN) durante dos días, tras lo que se trataron con medios de DMEM/F12 complementados con SBF al 2% y 100 ng/ml de activina–A (AA) durante dos días más. A continuación, se trataron los cultivos con DMEM/F12
+
SBF al 2% + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm (n.º 239804, Calbiochem, CA) durante tres días seguidos por una incubación de cuatro días en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm + ácido retinoico 2µm (AR) (Sigma, MO).
A continuación, se cultivaron las células en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml de exendina–4 (Sigma, MO) + DAPT 1µm (Calbiochem, CA) durante seis días seguidos por otros tres días más de incubación en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml de exendina–4 (Sigma, MO) + 50 ng/ml de IGF (Peprotech, NJ)
+
50 ng/ml de HGF (R&D Systems, MN). Se trataron algunos de los cultivos con 1–10 1m de inhibidor de la quinasa del receptor de TGF– I (inhibidor de ALK5 de tipo II) (2–(3–(6–metilpiridin–2–il)–1H–pirazol–4–il)–1,5–naftiridina) (un inhibidor de la quinasa 5 de tipo receptor de activina, n.º 616452, Calbiochem, CA) o inhibidor I del receptor de TGF– I (inhibidor de ALK5 de tipo I) ([3–(piridin–2–il)–4–(4–quinonil)]–1H–pirazol) (n.º 616451, Calbiochem, CA) en las etapas 4 y 5.
La Figura 5 a–e representa los datos de PCR en tiempo real de células cosechadas en las etapas 4–5 +/– inhibidor de ALK5 de tipo I o II. Cabe destacar que la adición del inhibidor de ALK5 de tipo I o II a 1–101M en las etapas 4 y 5 aumentó significativamente la expresión de insulina, glucagón, PDX–1 y NeuroD al final de las etapas 4 a 5 en comparación con los controles (tratamiento estándar). Todas las muestras se tomaron por triplicado.
Ejemplo 6
Efecto de la nogina y los inhibidores de ALK5 sobre la expresión de marcadores característicos del linaje endocrino pancreático en células madre pluripotentes tratadas según el protocolo de diferenciación representado en la Figura 1a
Se cultivaron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, en el paso 41, sobre placas revestidas de MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se expusieron a medio de DMEM/F12 complementado con SBF al 0,5% y 100 ng/ml de activina–A (R&D Systems, MN) más 20 ng/ml de WNT–3a (N.º de catálogo 1324–WN–002, R&D Systems, MN) durante dos días, tras lo que se trataron con medios de DMEM/F12 complementados con SBF al 2% y 100 ng/ml de activina–A (AA) durante dos días más. A continuación, se trataron los cultivos con DMEM/F12
+ SBF al 2% + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm (n.º 239804, Calbiochem, CA) durante tres días seguidos por una incubación de cuatro días en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm + ácido retinoico 2µm (AR) (Sigma, MO) + 0–500 ng/ml de nogina (R & D Systems, MN).
A continuación, se cultivaron las células en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml de exendina–4 (Sigma, MO) + DAPT 1µm (Calbiochem, CA) + inhibidor de ALK5 de tipo II 11m (Calbiochem, Ca) durante seis días seguidos por otros tres días más de incubación en DMEM/F12 al 1% (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml de exendina–4 (Sigma, MO) + 50 ng/ml de IGF (Peprotech, NJ) + 50 ng/ml de HGF (R&D Systems, MN) + inhibidor de ALK5 de tipo II 11m.
La Figura 6 a–g representa los datos de PCR en tiempo real de células cosechadas al final de las etapas 3–5 +/– 0– 100 ng/ml de nogina. La adición de los 100 ng/ml de nogina en la etapa 3 aumentó ligeramente la expresión de
50 E08855258 28-10-2011
insulina y glucagón al final de la etapa 4, mientras que inhibió significativamente la expresión de albúmina y CDX2 en comparación con las muestras no tratadas. La adición de 500 ng/ml de nogina no afectó a la expresión de PDX– 1, pero sí disminuyó significativamente la expresión de marcadores endocrinos junto con la albúmina y CDX2. La albúmina es un marcador para las células precursoras del hígado, mientras que CDX2 es un marcador para las células intestinales.
Ejemplo 7
Efecto de la adición de nogina en la etapa 3 y de inhibidores de ALK5 en las etapas 4 y 5 sobre la expresión de marcadores característicos del linaje endocrino pancreático en células madre pluripotentes tratadas según el protocolo de diferenciación representado en la Figura 1
Se cultivaron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, en el paso 44, sobre placas revestidas de MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se expusieron a medio de DMEM/F12 complementado con SBF al 0,5% y 100 ng/ml de activina–A (R&D Systems, MN) más 20 ng/ml de WNT–3a (N.º de catálogo 1324–WN–002, R&D Systems, MN) durante dos días, tras lo que se trataron con medios de DMEM/F12 complementados con SBF al 2% y 100 ng/ml de activina–A (AA) durante dos días más. A continuación, se trataron los cultivos con DMEM/F12
+
SBF al 2% + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm (n.º 239804, Calbiochem, CA) durante tres días seguidos por una incubación de cuatro días en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm + ácido retinoico 2µm (AR) (Sigma, MO) + 100 ng/ml de nogina (R & D Systems, MN).
A continuación, se cultivaron las células en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml de exendina–4 (Sigma, MO) + DAPT 1µm (Calbiochem, CA) + inhibidor de ALK5 de tipo II 1µm (Calbiochem, Ca) +/– 100 ng/ml de nogina durante seis días seguidos de otros tres días más de incubación en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA)
+
50 ng/ml de exendina–4 (Sigma, MO) + 50 ng/ml de IGF (Peprotech, NJ) + 50 ng/ml de HGF (R&D Systems, MN)
+
inhibidor de ALK5 de tipo II 1µm.
La Figura 7 a–f muestra los datos de PCR en tiempo real de células cosechadas al final de las etapas 4 a 5 +/– 100 ng/ml de nogina. La adición de los 100 ng/ml de nogina en la etapa 3+4 más la adición de inhibidor de ALK5 de tipo II aumentó de manera espectacular la expresión de insulina y glucagones en las etapas 4–5. En concreto, la adición de nogina en ambas etapas 3 y 4 aumentó significativamente la expresión de NGN3, un marcador precursor endocrino, mientras que inhibió significativamente la expresión de albúmina y CDX2 en comparación con las muestras sin tratar.
La Figura 8 a–d representa una imagen de contraste de fases de los cultivos según el protocolo anterior. En algunos de los cultivos, se amplió la etapa 5 de 3 a 21 días. En los días 10–12 del cultivo en los medios de la etapa 5, había grupos distintos de células semejantes a islotes humanos presentes por la placa de cultivo. Las imágenes a y b muestran cultivos del día 6 en la etapa 5, mientras que las c–d son imágenes de los cultivos del día 12 en la etapa 5. Se retiraron manualmente algunos de los grupos y se colocaron sobre placas revestidas de MATRIGEL
(1:30) en medios en la etapa 5. Tras 2 días de incubación, se tiñeron los grupos para la insulina y el glucagón. La mayoría de las células de los grupos mostrados en la Figura 9 a–b dieron positivo en insulina humana. Para optimizar más la dosis del inhibidor de BMP, nogina, se trataron los cultivos en la etapa 2–4 con 0, 10, 50 ó 100 ng/ml de nogina. La Figura 10 representa la expresión de NGN3 en la etapa 4 para los cultivos tratados con diversas dosis de nogina en las etapas 2–4. Parece que los 50–100 ng/ml de nogina producen una expresión máxima de NGN3 en la etapa 4.
Ejemplo 8
Efecto de la adición de nogina en la etapa 3–4, netrina en la etapa 4 e inhibidores de ALK5 en la etapa 4 sobre la expresión de marcadores característicos del linaje endocrino pancreático en células madre pluripotentes tratadas según el protocolo de diferenciación representado en la Figura 1
Se cultivaron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, en el paso 48, sobre placas revestidas de MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se expusieron a medio de DMEM/F12 complementado con SBF de ácidos grasos al 2% y 100 ng/ml de activina–A (R&D Systems, MN) más 20 ng/ml de WNT–3a (N.º de catálogo 1324–WN–002, R&D Systems, MN) durante dos días, tras lo que se trataron con medios de DMEM/F12 complementados con SBF al 2% y 100 ng/ml de activina–A (AA) durante dos días más. A continuación, se trataron los cultivos con DMEM/F12 + SBF al 2% + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm (n.º 239804, Calbiochem, CA) durante tres días seguidos por una incubación de cuatro días en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm + ácido retinoico 2µm (AR) (Sigma, MO) + 100 ng/ml de nogina (R & D Systems, MN).
A continuación, se cultivaron las células en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml de exendina–4 (Sigma, MO) + DAPT 1µm (Calbiochem, CA) + inhibidor de ALK5 de tipo II 1µm (Calbiochem, Ca) +/– 100 ng/ml de
50 E08855258 28-10-2011
nogina + 100 ng/ml de netrina–4 durante tres días.
La Figura 11 a–f muestra los datos de PCR en tiempo real de células cosechadas al final de las etapas 4 +/– 100 ng/ml de netrina–4 en la etapa 4. La adición de los 100 ng/ml de nogina en la etapa 3 y 4 más la adición de inhibidor de ALK5 de tipo II y 100 ng/ml de netrina–4 en la etapa 4 aumentó de manera espectacular la expresión de NGN3, NeuroD y Pax4 en células cosechadas al final de la etapa 5.
En algunos de los cultivos de la fase 4, se omitió la nogina, mientras que se añadió netrina–4 más inhibidor de ALK5. La Figura 12 a–d muestra que la omisión de nogina en la etapa 4 redujo significativamente la expresión de NGN3, NKX2.2 y NeuroD, mientras que afectó moderadamente a la expresión de insulina y glucagón en células cosechadas al final de la etapa 5.
Ejemplo 9
Secreción de insulina estimulada por glucosa (SIEG) in vitro por parte de células madre pluripotentes tratadas según el protocolo de diferenciación representado en la Figura 1b
Se cultivaron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, en el paso 48, sobre placas revestidas de MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se expusieron a medio de DMEM/F12 complementado con SBF de ácidos grasos al 2% y 100 ng/ml de activina–A (R&D Systems, MN) más 20 ng/ml de WNT–3a (N.º de catálogo 1324–WN–002, R&D Systems, MN) durante dos días, tras lo que se trataron con medios de DMEM/F12 complementados con SBF al 2% y 100 ng/ml de activina–A (AA) durante dos días más. A continuación, se trataron los cultivos con DMEM/F12 + SBF al 2% + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm (n.º 239804, Calbiochem, CA) durante tres días seguidos por una incubación de cuatro días en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm + ácido retinoico 2µm (AR) (Sigma, MO) + 100 ng/ml de nogina (R & D Systems, MN).
A continuación, se cultivaron las células en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml de exendina–4 (Sigma, MO) + DAPT 1µm (Calbiochem, CA) + inhibidor de ALK5 de tipo II 1µm (Calbiochem, Ca) +/– 100 ng/ml de nogina + 100 ng/ml de netrina–4 durante seis días seguidos de otros 3–21 días más de incubación en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml de exendina–4 (Sigma, MO) + 50 ng/ml de IGF (Peprotech, NJ) + 50 ng/ml de HGF (R&D Systems, MN) + inhibidor de ALK5 de tipo II 1µm.
Se analizó la SIEG de cultivos en etapa 5 los días 6, 8, 12 y 20 mediante un lavado de 1 h en tampón de KREBS (solución de Krebs–Ringer: ASB al 0,1%, HEPES 10mM, NaHCO3 5mM, NaCl 129mM, KCl 4,8 mM, CaCl2 2,5mM, KH2PO4 1,2mM, MgSO4 1,2mM, NaHCO3 5mM) a 37°C, seguido por una incubación de 1 h en tampón de KREBS más D–glucosa 2mM y una incubación más de 1 h en tampón de KREBS más D–glucosa 20mM. Tras cada incubación, se retiró el sobrenadante y se congeló a –20°C para un análisis posterior. Se analizaron lo s niveles de péptido C secretado usando el ELISA de péptido C ultrasensible (Alpco Diagnostics, Suecia). La Figura 13 a–c representa los niveles de péptido C humano secretados como respuesta a un desafío in vitro con glucosa. Los períodos inicial e intermedio de la incubación de la etapa 5 no produjeron un índice de estimulación relevante (proporción de péptido C secretado en alto contenido de glucosa con respecto al secretado en bajo contenido de glucosa), mientras que las muestras incubadas en los medios de la etapa 5 durante 20 días mostraron una potente estimulación como respuesta a la glucosa. Esto indica que la exposición prolongada a los medios en etapa 5 da como resultado la maduración de los grupos, lo que demuestra la SIEG.
Ejemplo 10
Efecto de la adición de netrina–1 o netrina–2 sobre la expresión de marcadores característicos del linaje endocrino pancreático en células madre pluripotentes tratadas según el protocolo de diferenciación representado en la Figura 1b
Se cultivaron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, en el paso 44, sobre placas revestidas de MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se expusieron a medio de DMEM/F12 complementado con SBF al 0,5% y 100 ng/ml de activina–A (R&D Systems, MN) más 20 ng/ml de WNT–3a (N.º de catálogo 1324–WN–002, R&D Systems, MN) durante dos días, tras lo que se trataron con medios de DMEM/F12 complementados con SBF al 2% y 100 ng/ml de activina–A (AA) durante dos días más. A continuación, se trataron los cultivos con DMEM/F12
+
SBF al 2% + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm (n.º 239804, Calbiochem, CA) durante tres días seguidos por una incubación de cuatro días en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm + ácido retinoico 2µm (AR) (Sigma, MO).
A continuación, se cultivaron las células en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml de exendina–4 (Sigma, MO) + DAPT 1µm (Calbiochem, CA) durante seis días seguidos de otros tres días más de incubación en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml de exendina–4 (Sigma, MO) + 50 ng/ml de IGF (Peprotech, NJ)
+
50 ng/ml de HGF (R&D Systems, MN). En algunos de los cultivos, se añadieron 50 ng/ml de netrina–1 o netrina–2
50 E08855258 28-10-2011
(R&D Systems, MN) en la etapa 2–5. La Figura 14 muestra los datos de PCR en tiempo real de células cosechadas en la etapa 5 +/– 50 ng/ml de netrina–1 o netrina–2 en las etapas 2 a 5. La adición bien de netrina–1 o de netrina–2 sobrerreguló significativamente la expresión de glucagón e insulina en las células cosechadas al final de la etapa 5.
Ejemplo 11
Procedimiento alternativo para inducir la expresión de marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo
Se cultivaron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, en el paso 48, sobre placas revestidas de MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se diferenciaron en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo bien mediante:
a.
el cultivo en medio de RPMI complementado con complemento de B27 al 1% (Invitrogen, Ca) y 50 ng/ml de activina–A (R&D Systems, MN) más butirato de sodio 1mM (Sigma, MO) durante un día seguido por el tratamiento con medios de RPMI complementados con suplemento de B27 al 1% (Invitrogen, Ca) y 50 ng/ml de activina–A (R&D Systems, MN) más butirato de sodio 0,5mM (Sigma, MO) durante tres días más, o
b.
medio de DMEM/F12 complementado con SBF al 0,5% y 100 ng/ml de activina–A (R&D Systems, MN) más 20 ng/ml de WNT–3a (N.º de catálogo 1324–WN–002, R&D Systems, MN) durante dos días seguidos por el tratamiento con medios de DMEM/F12 complementados con SBF al 2% y 100 ng/ml de activina–A (AA) durante dos días más.
A continuación, se trataron los cultivos con DMEM/F12 + SBF al 2% + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm (n.º 239804, Calbiochem, CA) durante tres días seguidos por una incubación de cuatro días en DMEM/F12
+ B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 20 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm + ácido retinoico 2µm (AR) (Sigma, MO). A continuación, se incubaron las células en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml de exendina– 4 (Sigma, MO) + DAPT 1µm (Calbiochem, CA) + inhibidor de ALK5 de tipo II 1µm (Calbiochem, Ca) durante tres días.
La inducción de los cultivos en endodermo definitivo usando el procedimiento alternativo a) anterior dio como resultado una expresión del 78% de CXCR4 medida mediante FACS, en comparación con una expresión de CXCR4 del 56% obtenida mediante el procedimiento alternativo b) anterior. CXCR4 se considera un marcador de células de endodermo definitivo.
La Figura 15 a–f muestra los datos de PCR en tiempo real de células cosechadas al final de la etapa 5 bien con el procedimiento alternativo a) o con el procedimiento alternativo b). Parece que también es posible usar el procedimiento alternativo a) para inducir la expresión de marcadores endocrinos y endodérmicos pancreáticos.
Ejemplo 12
Diferenciación de células madre embrionarias humanas cultivadas en ausencia de suero sobre sustrato de cultivo de tejidos revestido de MATRIGEL® hacia células endocrinas pancreáticas
Se cultivaron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, en el paso 52, sobre placas revestidas de MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se expusieron a medio de RPMI complementado con SBF al 2% (N.º de catálogo 152401, MP Biomedical, Ohio) y 100 ng/ml de activina–A (R&D Systems, MN) más 20 ng/ml de WNT– 3a (N.º de catálogo 1324–WN–002, R&D Systems, MN) más 8 ng/ml de bFGF (N.º de catálogo 100–18B, PeproTech, NJ) durante un día, tras lo que se trataron con medios de RPMI complementados con SBF al 2% y 100 ng/ml de activina A más 8 ng/ml de bFGF durante dos días más. A continuación, se trataron los cultivos con DMEM/F12 + SBF al 2% + 50 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm (n.º 239804, Calbiochem, Ca) durante dos días seguidos por una incubación de cuatro días en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml de FGF7 + ciclopamina–KAAD 0,25µm + ácido retinoico 2µm (AR) (Sigma, MO) + 100 ng/ml de nogina (R & D Systems, MN). A continuación, se incubaron las células en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) +100 ng/ml de nogina + DAPT 11m (N.º de catálogo 565784, Calbiochem, CA) + inhibidor de ALK5 de tipo II 11m (N.º de catálogo 616452, Calbiochem, Ca) + 100 ng/ml de netrina–4 (R&D Systems, MN) durante tres días, seguidos por una incubación de siete días más en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA) + inhibidor de ALK5 de tipo II 11m (Calbiochem, Ca). Se añadió una última etapa para seguir madurando los cultivos endocrinos, que consistió en un tratamiento de siete días en DMEM/F12 + B27 al 1% (Invitrogen, CA). A excepción de la última etapa, el resto de las etapas incluyó el cambio diario de los medios. En la Figura 1c, se representa un esquema del procedimiento. En cada etapa, se calculó el número de células usando un hemocitómetro, y se recogió el ARN para un análisis de PCR. Todas las muestras se tomaron por triplicado.
La Figura 16 a–b muestra la expresión de CXCR4 medida mediante FACS y los datos PCR de tiempo real para la etapa 1 el día 3. Se muestra el cambio en la expresión en relación con las células ES H1 no diferenciadas. La
50 E08855258 28-10-2011
Figura 16 c–n representa los datos de PCR en tiempo real de marcadores pancreáticos y endocrinos clave en células cosechadas al final de las etapas 2–6. La Figura 17 representa el número de células al final de las etapas 1–6.
Ejemplo 13
Contenido de péptido C y proinsulina en células madre pluripotentes tratadas según el protocolo de diferenciación representado en la Figura 1c
Se cultivaron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, en el paso 42, sobre placas revestidas de MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se diferenciaron según el protocolo representado en la Figura 1c, como se describe en el Ejemplo 12 anterior.
Se lavaron las células en tampón de Krebs–Ringer (NaCl 129mM, KCl 4,8mM, NaH2PO4 1,2mM, MgSO4 1,2mM, CaCl2 2,5mM, NaHCO3 5mM, HEPES 10mM, ASB al 0,3% (p/v)) y se incubaron con tampón de Krebs durante 15 min seguidos por una incubación de 45 min en tampón de Krebs al que se añadió D–glucosa 2mM a 37ºC, CO2 al 5%, aire al 95%. Se recogieron 0,5 ml de sobrenadante y se aspiró el medio restante para remplazarlo con tampón de Krebs al que se añadió uno de los siguientes estímulos: D–glucosa 20mM (HG), KCl 30mM, tolbutamida 1001M (tol), IBMX 100mM, BAY K8644 21M o ácido quetoisocaproico 10mM (KIC) durante 45 min a 37ºC, CO2 al 5%, aire al 95%. Se recogieron 0,5 ml de sobrenadante y se desechó el resto del medio. Se analizó el contenido de péptido C humano de los sobrenadantes usando un kit de ELISA para péptido C (N.º de catálogo 80–CPTHU–E01, Alpco Diagnostics, NH). Hubo que diluir las muestras de la manera habitual 5–10 veces para que pertenecieran al intervalo lineal de patrones proporcionado en el kit.
La Figura 18 muestra la liberación de péptido C tras la estimulación con diversos estímulos. En la gráfica, también se muestra el índice de estimulación (concentración de péptido C en el sobrenadante de estimulación dividida entre la concentración de péptido C en el sobrenadante de referencia que contiene glucosa 2mM) para cada agente.
Para medir el contenido de péptido C, proinsulina y ADN de los cultivos de la etapa 6, se trataron placas de 6 pocillos que contenían cultivos en la etapa 6 con 500 1l de tampón de lisis celular por pocillo (Tris–HCl 10mM + EDTA 1mM, pH 7,5) seguidos por un tratamiento de ultrasonidos de 30 s. Se midió el contenido de péptido C y de proinsulina usando un kit de ELISA para péptido C (N.º de catálogo 80–CPTHU–E01, Alpco Diagnostics, NH) y un kit de ELISA para proinsulina (N.º de catálogo11–1118–01, Alpco Diagnostics, NH), respectivamente. Se cuantificó el contenido de ADN de los lisados usando un kit de ADN Quant–IT™ (N.º de catálogo P7589, Invitrogen, CA). Hubo que diluir las muestras de la manera habitual de 500–1.000 veces para que pertenecieran al intervalo lineal de patrones proporcionado en los kits. La Figura 19 muestra el contenido de péptido C y el contenido de proinsulina normalizados con respecto al ADN para tres pocillos diferentes de una placa de 6 pocillos que contenía cultivos en la etapa 6. A modo comparativo, también se midieron los contenidos de péptido C y proinsulina de tres muestras de islotes de cadáver humano adulto diferentes. Cabe destacar que los datos reflejan el contenido de insulina de todo el cultivo y no sólo de los grupos presentes en el cultivo.
Ejemplo 14
Análisis FACS de células madre pluripotentes tratadas según el protocolo de diferenciación representado en la Figura 1c
Se cultivaron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 sobre placas revestidas de MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se diferenciaron según el protocolo representado en la Figura 1c, como se describe en el Ejemplo 12 anterior. Se disociaron las células en células simples de cultivos de monocapas usando TrypLE Express (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se lavaron en PBS frío. Para la fijación, se volvieron a suspender las células en tampón Cytofix/Cytoperm 200–3001l (BD 554722, BD, CA) y se incubaron durante 30 min a 4°C. Se lavaron dos veces las células en 1 ml de solución de tampón Perm/Wash (BD 554723) y se volvieron a suspender en 100 1l de solución colorante/bloqueadora que contenía suero de cabra normal al 2% en tampón Perm/Wash. Para el análisis citométrico de flujo, se tiñeron las células con los siguientes anticuerpos primarios: anti–insulina (Acm de conejo, Cell Signaling n.º C27C9; dilución 1:100), anti–glucagón (Acm de ratón, Sigma N.º G2654, 1:100); anti–sinaptofisina (anticuerpo policlonal de conejo, DakoCytomation N.º A0010, 1:50); se incubaron las células durante 30 min a 4ºC, tras lo que se lavaron dos veces en tampón Perm/Wash y se incubaron durante 30 min más en los siguientes anticuerpos secundarios apropiados: Alexa 647 de cabra anti–conejo (Invitrogen N.º A21246) o 647 de cabra anti– ratón (Invitrogen N.º A21235); R–PE de cabra anti–conejo (BioSource N.º ALI4407). Todos los anticuerpos secundarios se usaron a una dilución de 1:200. Las células se lavaron al menos una vez en tampón Perm/Wash y se analizaron con el bioanalizador BD FACSArray. Se adquirieron al menos 10.000 eventos por análisis. Los controles indujeron células H1 no diferenciadas y la línea celular b–TC (ATCC, VA). La Figura 20 a–c muestra el porcentaje de células positivas en insulina y en sinaptofisina de los cultivos de la etapa 6.
35 E08855258 28-10-2011
Ejemplo 15
La adición de cordina en las etapas 3 y 4 del protocolo de diferenciación representado en la Figura 1c sobrerregula la expresión de marcadores característicos del linaje endocrino pancreático
Se cultivaron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, en el paso 52, sobre placas revestidas de MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se diferenciaron según el protocolo representado en la Figura 1c, a excepción de que se añadieron 50–100 ng/ml de cordina (R&D Systems, MN) en las etapas 3–4 en lugar de nogina. Al igual que la nogina, la cordina es un conocido inhibidor de la señalización de BMP. El análisis de los cultivos de la etapa 6 mediante FACS (Figura 21 a–b) reveló una expresión de insulina y sinaptofisina muy similar a la observada con la adición de nogina en las etapas 3–4.
Ejemplo 16
Diferenciación de células madre embrionarias humanas cultivadas en ausencia de suero sobre sustrato de cultivo de tejidos revestido de MATRIGEL® hacia células endocrinas pancreáticas
Se cultivaron células de la línea de células madre embrionarias humanas H9, en el paso 39, sobre placas revestidas de MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se diferenciaron según el protocolo representado en la Figura 1c, como se describe en el Ejemplo 12 anterior. El ARN se recogió al final de las etapas 1–6. La Figura 22 a–l representa los datos de PCR en tiempo real de marcadores pancreáticos y endocrinos clave cosechados al final de las etapas 3–6. Al igual que los resultados obtenidos con la línea H1, las células H9 fueron capaces de expresar marcadores característicos del linaje endocrino pancreático.
Ejemplo 17
Efecto de los complementos de los medios sobre la capacidad de células madre pluripotentes para diferenciarse en células endocrinas pancreáticas
Se cultivaron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, en el paso 39, sobre placas revestidas de MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se diferenciaron según el protocolo representado en la Figura 1c, a excepción de que en algunos cultivos, los medios de DMEM/F12 de referencia fueron complementado con B27 al 0,25–1% o N2 al 1% (Invitrogen, Ca) + ASB al 2%. El resto de los componentes del protocolo de diferenciación se mantuvieron como se explica en el Ejemplo 12. Se recogieron muestras por triplicado al final de las etapas 3, 5 y 6, y se analizaron mediante PCR en tiempo real. La Figura 23 a–d representa los datos de PCR en tiempo real de marcadores pancreáticos y endocrinos clave de células cosechadas al final de las etapas 3, 5 y 6. El uso de N2/ASB como sustituto del B27 produjo una expresión muy similar de marcadores endocrinos pancreáticos clave. Además, se pudo disminuir la concentración de B27 hasta 0,25% sin que ello afectara significativamente a la expresión de los marcadores endocrinos pancreáticos clave.
Todas las publicaciones citadas en el presente documento están incorporadas por referencia en su totalidad. Aunque se hayan ilustrado los diversos aspectos de la invención con referencia a los ejemplos y las realizaciones preferidas, ha de reconocerse que el ámbito de la invención no está definido por la anterior descripción, sino por las siguientes reivindicaciones redactadas adecuadamente según los principios de la ley de patentes.
50 E08855258 28-10-2011

Claims (31)

  1. REIVINDICACIONES
    1.– Un procedimiento para producir células capaces de secretar insulina mediante estimulación con glucosa a partir de células madre pluripotentes, que comprende las etapas de:
    a.
    cultivar las células madre pluripotentes,
    b.
    diferenciar las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo,
    c.
    diferenciar células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático mediante el tratamiento de las células con una netrina, y
    d.
    diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático.
  2. 2.– El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se consigue mediante el tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con al menos un factor adicional seleccionado del grupo que consiste en ácido retinoico, FGF–2, FGF–4, FGF–7, FGF–10, un inhibidor de Sonic Hedgehog y un factor capaz de inhibir a BMP.
  3. 3.– El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con una netrina y, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en ácido retinoico, FGF–2, FGF–4, FGF–7, FGF–10, un inhibidor de Sonic Hedgehog y un factor capaz de inhibir a BMP durante de aproximadamente uno a aproximadamente seis días o durante aproximadamente seis días.
  4. 4.– El procedimiento de la reivindicación 2, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con un inhibidor de Sonic Hedgehog y, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en FGF–2, FGF–4, FGF–7 y FGF–10 durante de aproximadamente uno a aproximadamente tres días, tras lo cual las células se tratan con un inhibidor de Sonic Hedgehog, ácido retinoico y, al menos, uno de los factores seleccionado del grupo que consiste en FGF–2, FGF–4, FGF–7 y FGF–10 durante aproximadamente uno a aproximadamente cuatro días.
  5. 5.– El procedimiento de la reivindicación 4, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con un inhibidor de Sonic Hedgehog y, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en FGF–2, FGF–4, FGF–7 y FGF–10 durante aproximadamente tres días.
  6. 6.– El procedimiento de la reivindicación 4, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con un inhibidor de Sonic Hedgehog, ácido retinoico y, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en FGF–2, FGF–4, FGF–7 y FGF–10 durante aproximadamente cuatro días.
  7. 7.– El procedimiento de la reivindicación 2, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con un inhibidor de Sonic Hedgehog y, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en FGF–2, FGF–4, FGF–7 y FGF–10 durante de aproximadamente uno a aproximadamente tres días, tras lo cual las células se tratan con un inhibidor de Sonic Hedgehog, un factor capaz de inhibir a BMP, ácido retinoico y, al menos, uno de los factores seleccionado del grupo que consiste en FGF–2, FGF–4, FGF–7 y FGF–10 durante de aproximadamente uno a aproximadamente cuatro días.
  8. 8.– El procedimiento de la reivindicación 7, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con (a) un inhibidor de Sonic Hedgehog y, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en FGF–2, FGF–4, FGF–7 y FGF–10 durante aproximadamente tres días o (b) un inhibidor de Sonic Hedgehog, un factor capaz de inhibir a BMP, ácido retinoico y, al menos, uno de los factores seleccionado del grupo que consiste en FGF–2, FGF–4, FGF–7 y FGF–10 durante aproximadamente cuatro días.
  9. 9.– El procedimiento de la reivindicación 2, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con un inhibidor de Sonic Hedgehog y, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en FGF–2, FGF–4, FGF–7 y FGF–10 durante de aproximadamente uno a aproximadamente tres días, tras lo cual se tratan las células con un inhibidor de Sonic Hedgehog, un factor capaz de inhibir a BMP, una netrina, ácido retinoico y, al menos, uno de los factores seleccionado del grupo que consiste en FGF–2, FGF–4, FGF–7 y FGF–10 durante de aproximadamente uno a aproximadamente cuatro días.
  10. 10.– El procedimiento de la reivindicación 9, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con (a) un inhibidor de Sonic Hedgehog y, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en FGF–2, FGF–4, FGF–7 y FGF–10 durante aproximadamente tres días o (b) un inhibidor de Sonic Hedgehog, un factor capaz de inhibir a BMP, una netrina, ácido retinoico y, al menos, uno de los factores seleccionado del grupo que consiste en FGF–2, FGF–4, FGF–7 y FGF–10 durante aproximadamente cuatro días.
  11. 11.– El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el factor se selecciona del grupo que consiste en FGF–2, FGF–4, FGF–7 y FGF–10.
  12. 12.– El procedimiento de la reivindicación 10(b), en el que las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con HGF–7 a una concentración de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 50 1g/ml o a una concentración de 20 ng/ml.
  13. 13.– El procedimiento de la reivindicación 2, en el que las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con ácido retinoico a una concentración de aproximadamente 1nM a aproximadamente 1mM o a una concentración de 11M.
  14. 14.– El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el inhibidor de Sonic Hedgehog es ciclopamina.
  15. 15.– El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la ciclopamina se usa a una concentración de aproximadamente 0,11M a aproximadamente 101M o a una concentración de 0,25µM.
  16. 16.– El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el factor capaz de inhibir a BMP es un inhibidor de BMP4.
  17. 17.– El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el inhibidor de BMP4 es nogina.
  18. 18.– El procedimiento de la reivindicación 16, en el que las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con nogina a una concentración de aproximadamente 500 ng/ml a 100 1g/ml o a una concentración de 100 ng/ml.
  19. 19.– El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con la netrina a una concentración de aproximadamente 500 ng/ml a aproximadamente 100 1g/ml o a una concentración de 100 ng/ml.
  20. 20.– El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la netrina se selecciona del grupo que consiste en netrina 1, netrina 2 y netrina 4.
  21. 21.– El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se realiza mediante el tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con un factor que inhibe la ruta del TGF– R–1.
  22. 22.– El procedimiento de la reivindicación 21, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se tratan con un factor que inhibe la ruta de TGF– R–1 durante de aproximadamente uno a aproximadamente doce días, durante de aproximadamente cinco a aproximadamente doce días o durante aproximadamente doce días.
  23. 23.– El procedimiento de la reivindicación 21, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se tratan además con al menos un factor seleccionado del grupo que consiste en un factor capaz de inhibir a BMP y una netrina.
  24. 24.– El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se realiza mediante el tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con un factor que inhibe la ruta de señalización Notch y un factor que inhibe la ruta de TGF– R–1.
  25. 25.– El procedimiento de la reivindicación 24, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se tratan con un factor que inhibe la ruta de señalización Notch y un factor que inhibe la ruta de TGF– R–1 durante de aproximadamente uno a aproximadamente doce días, durante de aproximadamente cinco a aproximadamente doce días o durante aproximadamente doce días.
  26. 26.– El procedimiento de la reivindicación 24, en el que el factor que inhibe la ruta de señalización Notch es un inhibidor de la y–secretasa.
  27. 27.– El procedimiento de la reivindicación 26, en el que el inhibidor de la y–secretasa es L–685.458.
  28. 28.– El procedimiento de la reivindicación 26, en el que L–685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 0,1µM a aproximadamente 100µM.
  29. 29.– El procedimiento de la reivindicación 19 o la reivindicación 22, en el que el factor que inhibe la ruta de TGF– R–1 o la ruta de señalización de TGF– R–1 es un inhibidor de la quinasa de TGF– R–1.
  30. 30.– El procedimiento de la reivindicación 29, en el que el inhibidor de la quinasa de TGF– R–1 se usa a una concentración de aproximadamente 0,1µM a aproximadamente 100µM.
  31. 31.– El procedimiento de la reivindicación 29, en el que el inhibidor de la quinasa de TGF– R–1 es 2–(3–(6– metilpiridin–2–il)–1H–pirazol– 4–il)–1,5–naftiridina o [3–(piridin–2–il)–4–(4–quinonil)]–1H–pirazol.
ES08855258T 2007-11-27 2008-11-25 Diferenciación de células madre embrionarias humanas. Active ES2372463T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US99052907P 2007-11-27 2007-11-27
US990529P 2007-11-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2372463T3 true ES2372463T3 (es) 2012-01-20

Family

ID=40350230

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES08855258T Active ES2372463T3 (es) 2007-11-27 2008-11-25 Diferenciación de células madre embrionarias humanas.

Country Status (13)

Country Link
US (5) US9062290B2 (es)
EP (1) EP2229434B1 (es)
JP (2) JP5710264B2 (es)
KR (2) KR101592182B1 (es)
CN (2) CN107574142B (es)
AT (1) ATE523585T1 (es)
BR (1) BRPI0819609A2 (es)
CA (3) CA2706560C (es)
ES (1) ES2372463T3 (es)
HK (1) HK1147521A1 (es)
MX (1) MX2010005805A (es)
RU (1) RU2473684C2 (es)
WO (1) WO2009070592A2 (es)

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8017395B2 (en) 2004-12-17 2011-09-13 Lifescan, Inc. Seeding cells on porous supports
US8012751B2 (en) * 2005-03-31 2011-09-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Differentiation of pluripotent embryonic stem cells
JP2009500297A (ja) 2005-06-08 2009-01-08 セントカー・インコーポレーテツド 眼の変性についての細胞療法
US8741643B2 (en) * 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
RU2473685C2 (ru) 2007-07-31 2013-01-27 Лайфскен, Инк. Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
RU2473684C2 (ru) 2007-11-27 2013-01-27 Лайфскен, Инк. Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
KR102026622B1 (ko) 2008-02-21 2019-09-30 얀센 바이오테크 인코포레이티드 세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
WO2010002846A1 (en) 2008-06-30 2010-01-07 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
US20120021519A1 (en) * 2008-09-19 2012-01-26 Presidents And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
CN102272291B (zh) 2008-10-31 2018-01-16 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化
EP2350265B1 (en) * 2008-10-31 2019-04-17 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
EP2366022B1 (en) 2008-11-20 2016-04-27 Janssen Biotech, Inc. Methods and compositions for cell attachment and cultivation on planar substrates
MX356756B (es) 2008-11-20 2018-06-11 Centocor Ortho Biotech Inc Células madre pluripotentes en microportadores.
AU2009322398A1 (en) 2008-12-03 2011-06-30 International Stem Cell Corporation Methods of deriving differentiated cells from stem cells
KR102058901B1 (ko) 2009-07-20 2019-12-24 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
MX340952B (es) 2009-07-20 2016-07-29 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas.
RU2540016C2 (ru) * 2009-07-20 2015-01-27 Янссен Байотек, Инк. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека
US9150833B2 (en) 2009-12-23 2015-10-06 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
KR101841271B1 (ko) 2009-12-23 2018-03-22 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
CA2785966C (en) 2009-12-29 2020-10-27 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method for manufacturing pancreatic-hormone-producing cells
JP6013196B2 (ja) * 2010-03-01 2016-10-25 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 多能性幹細胞から誘導した細胞を精製するための方法
EP2569419B1 (en) * 2010-05-12 2019-03-20 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
CA2807935C (en) * 2010-08-09 2018-09-18 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method of producing pancreatic hormone-producing cells
EP3981415A1 (en) * 2010-08-12 2022-04-13 Janssen Biotech, Inc. Treatment of diabetes with pancreatic endocrine precursor cells
AU2015213422A1 (en) * 2010-08-12 2015-09-10 Janssen Biotech, Inc. Treatment of diabetes with pancreatic endocrine precursor cells
BR112013004514A2 (pt) 2010-08-31 2016-06-07 Janssen Biotech Inc diferenciação das células-tronco embrionárias humanas
CA2809305C (en) 2010-08-31 2019-06-11 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
SG10201506855RA (en) 2010-08-31 2015-10-29 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells
KR102203056B1 (ko) * 2011-12-22 2021-01-14 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 단일 인슐린 호르몬 양성 세포로의 분화
WO2013134378A1 (en) 2012-03-07 2013-09-12 Janssen Biotech, Inc. Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells
CN108103006A (zh) * 2012-06-08 2018-06-01 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化
GB201216796D0 (en) * 2012-09-20 2012-11-07 Cambridge Entpr Ltd In vitro pancreatic differentiation
RU2658488C2 (ru) * 2012-12-31 2018-06-21 Янссен Байотек, Инк. Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток
EP4039798A1 (en) 2012-12-31 2022-08-10 Janssen Biotech, Inc. Suspension and clustering of human pluripotent cells
US10370644B2 (en) 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
KR101942769B1 (ko) * 2012-12-31 2019-01-28 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Hb9 조절제를 사용하는 인간 배아 줄기세포의 췌장 내분비 세포로의 분화
WO2014127219A1 (en) * 2013-02-14 2014-08-21 The Cleveland Clinic Foundation Methods for induction of cell fates from pluripotent cells
CN103194424A (zh) * 2013-03-28 2013-07-10 于涛 一种诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的方法
CA2910394A1 (en) * 2013-04-26 2014-10-30 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Cortical interneurons and other neuronal cells produced by the directed differentiation of pluripotent and multipotent cells
KR102580225B1 (ko) 2013-06-11 2023-09-20 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 SC-β 세포 및 조성물 그리고 그 생성 방법
US10114008B2 (en) 2014-01-21 2018-10-30 Empire Technology Development Llc Methods and devices for high throughput screening of conditions affecting stem cell differentiation
DK3143127T3 (da) 2014-05-16 2021-09-13 Janssen Biotech Inc Anvendelse af små molekyler til at forstærke mafa-ekspression i endokrine pankreasceller
US10457916B2 (en) * 2014-05-20 2019-10-29 Tokyo Institute Of Technology Method for inducing differentiation of insulin-producing cells
CN107614678B (zh) 2014-12-18 2021-04-30 哈佛学院校长同事会 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法
US10190096B2 (en) 2014-12-18 2019-01-29 President And Fellows Of Harvard College Methods for generating stem cell-derived β cells and uses thereof
US10443042B2 (en) 2014-12-18 2019-10-15 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof
US10772917B2 (en) 2015-03-11 2020-09-15 Ccs Ventures Limited Pancreatic endocrine progenitor cell therapies for the treatment of obesity and type 2 diabetes (T2D)
US20180327719A1 (en) * 2015-09-18 2018-11-15 Kyoto University Method for producing pancreatic bud cells
DK3368657T3 (da) 2015-10-30 2021-10-04 Biolamina Ab Fremgangsmåder til fremstilling af hepatocytter
MA45479A (fr) 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
MA45502A (fr) 2016-06-21 2019-04-24 Janssen Biotech Inc Génération de cellules bêta fonctionnelles dérivées de cellules souches pluripotentes humaines ayant une respiration mitochondriale glucose-dépendante et une réponse en sécrétion d'insuline en deux phases
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
US10391156B2 (en) 2017-07-12 2019-08-27 Viacyte, Inc. University donor cells and related methods
EP3710021A4 (en) 2017-11-15 2021-08-11 Semma Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR THE MANUFACTURE OF ISLAND CELLS AND METHODS OF USE
WO2019157329A1 (en) * 2018-02-09 2019-08-15 Seraxis, Inc. Pancreatic cells for treating diabetes and methods of generating the same
CA3108275A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Stem cell derived islet differentiation
US10724052B2 (en) 2018-09-07 2020-07-28 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
US20210363490A1 (en) * 2018-10-12 2021-11-25 Salk Institute For Biological Studies Cells, islets, and organoids that evade immune detection and autoimmunity, methods of production and use thereof
JP2022534545A (ja) 2019-05-31 2022-08-01 ダブリュ．エル．ゴア アンド アソシエイツ，インコーポレイティド 生体適合性メンブレン複合体
WO2020243668A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 W. L. Gore & Associates, Inc. Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances
AU2020282355B2 (en) 2019-05-31 2023-11-02 Viacyte, Inc. A biocompatible membrane composite
CN114206407A (zh) 2019-05-31 2022-03-18 W.L.戈尔及同仁股份有限公司 生物相容性膜复合材料
CN114375300A (zh) 2019-09-05 2022-04-19 克里斯珀医疗股份公司 通用供体细胞
CA3150233A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Alireza Rezania UNIVERSAL DONOR CELLS
CN113106054B (zh) * 2020-01-13 2022-10-14 青岛瑞思德生物科技有限公司 一种将间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞的诱导剂
CN111394311B (zh) * 2020-04-20 2022-07-01 青岛瑞思德生物科技有限公司 一种诱导间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的无血清完全培养基
AU2021414617A1 (en) 2020-12-31 2023-08-10 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells

Family Cites Families (237)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3209652A (en) * 1961-03-30 1965-10-05 Burgsmueller Karl Thread whirling method
AT326803B (de) * 1968-08-26 1975-12-29 Binder Fa G Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben
US3935067A (en) * 1974-11-22 1976-01-27 Wyo-Ben Products, Inc. Inorganic support for culture media
CA1201400A (en) 1982-04-16 1986-03-04 Joel L. Williams Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture
US4499802A (en) * 1982-09-29 1985-02-19 Container Graphics Corporation Rotary cutting die with scrap ejection
US4537773A (en) * 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
DE3401610A1 (de) * 1984-01-18 1985-07-18 Siemens AG, 1000 Berlin und 8000 München Integrierte halbleiterschaltung mit einem ringoszillator
US4557264A (en) * 1984-04-09 1985-12-10 Ethicon Inc. Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene
US5215893A (en) * 1985-10-03 1993-06-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5089396A (en) * 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US4737578A (en) * 1986-02-10 1988-04-12 The Salk Institute For Biological Studies Human inhibin
US5863531A (en) * 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
US5567612A (en) * 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
US5759830A (en) * 1986-11-20 1998-06-02 Massachusetts Institute Of Technology Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo
CA1340581C (en) * 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
NZ229354A (en) 1988-07-01 1990-09-26 Becton Dickinson Co Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface
EP0363125A3 (en) 1988-10-03 1990-08-16 Hana Biologics Inc. Proliferated pancreatic endocrine cell product and process
SU1602536A1 (ru) * 1988-11-28 1990-10-30 Украинский научно-исследовательский ветеринарный институт Способ определени целесообразности вакцинации против парвовирусной болезни свиней
US5837539A (en) * 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
ES2134212T3 (es) 1991-04-25 1999-10-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo humano reconstituido contra el receptor de la interleuquina 6 humano.
US5449383A (en) * 1992-03-18 1995-09-12 Chatelier; Ronald C. Cell growth substrates
GB9206861D0 (en) * 1992-03-28 1992-05-13 Univ Manchester Wound healing and treatment of fibrotic disorders
CA2114282A1 (en) * 1993-01-28 1994-07-29 Lothar Schilder Multi-layered implant
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
JP2813467B2 (ja) 1993-04-08 1998-10-22 ヒューマン・セル・カルチャーズ・インコーポレーテッド 細胞培養法および培地
US5523226A (en) * 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
GB9310557D0 (en) * 1993-05-21 1993-07-07 Smithkline Beecham Plc Novel process and apparatus
TW257671B (es) * 1993-11-19 1995-09-21 Ciba Geigy
US5834308A (en) * 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6001647A (en) * 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US6703017B1 (en) * 1994-04-28 2004-03-09 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6083903A (en) * 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
KR100252743B1 (ko) 1994-12-29 2000-09-01 나가야마 오사무 Il-6 안타고니스트를 함유하는 항종양제의 작용증강제
US5843780A (en) * 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5718922A (en) * 1995-05-31 1998-02-17 Schepens Eye Research Institute, Inc. Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation
US5908782A (en) * 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
EP1028954B1 (en) 1997-04-24 2003-07-02 Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. Substituted imidazoles useful in the treatment of inflammatory diseases
AU8476698A (en) * 1997-07-03 1999-01-25 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells from peripheral blood
US6670127B2 (en) * 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
AU9393398A (en) * 1997-09-16 1999-04-05 Egea Biosciences, Inc. Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes
CA2307807C (en) 1997-10-23 2008-09-02 Andrea G. Bodnar Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
ZA9811898B (en) * 1997-12-29 2000-06-28 Ortho Mcneil Pharm Inc Anti-Inflammatory Compounds.
AU755888B2 (en) * 1998-03-18 2003-01-02 Mesoblast International Sarl Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation
MY132496A (en) * 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
US6413773B1 (en) 1998-06-01 2002-07-02 The Regents Of The University Of California Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6610540B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 California Institute Of Technology Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells
US6413556B1 (en) * 1999-01-08 2002-07-02 Sky High, Llc Aqueous anti-apoptotic compositions
AU2515600A (en) * 1999-01-21 2000-08-07 Vitro Diagnostics, Inc. Immortalized cell lines and methods of making the same
US6815203B1 (en) * 1999-06-23 2004-11-09 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of making pancreatic islet cells
US6333029B1 (en) * 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
US6306424B1 (en) * 1999-06-30 2001-10-23 Ethicon, Inc. Foam composite for the repair or regeneration of tissue
CA2385628A1 (en) 1999-09-27 2001-04-05 Ammon B. Peck Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6685936B2 (en) * 1999-10-12 2004-02-03 Osiris Therapeutics, Inc. Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation
US20030082155A1 (en) 1999-12-06 2003-05-01 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
EP1240518A4 (en) * 1999-12-13 2006-05-17 Scripps Research Inst MARKERS FOR THE IDENTIFICATION AND INSULATION OF PRE-GENERIC CELLS OF A AND B PANCREAS ISOLATED CELLS
US7005252B1 (en) * 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US7439064B2 (en) 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US6436704B1 (en) * 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
WO2002000849A1 (fr) * 2000-06-26 2002-01-03 Renomedix Institute Inc. Fraction cellulaire contenant des cellules capables de se differencier en cellules du systeme nerveux
CA2426654C (en) * 2000-10-23 2010-12-21 Smithkline Beecham Corporation 2,4,8-trisubstituted-8h-pyrido[2,3-d}pyrimidin-7-one compounds
EP1345946B1 (en) 2000-12-08 2005-08-10 Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. Macroheterocylic compounds useful as kinase inhibitors
PT1362047E (pt) 2000-12-08 2006-09-29 Ortho Mcneil Pharm Inc Compostos de pirrolina substituidos com indazolilo como inibidores de cinase
US6599323B2 (en) * 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
US20040121460A1 (en) * 2001-01-24 2004-06-24 Lumelsky Nadya L Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells
EP3078667B1 (en) * 2001-01-25 2018-11-21 The United States of America, represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Formulation of boronic acid compounds
US6656488B2 (en) * 2001-04-11 2003-12-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering
DE10290025T1 (de) 2001-04-19 2003-10-09 Develogen Ag Verfahren zur Differenzierung von Stammzellen in Insulin-produzierende Zellen
ATE421991T1 (de) 2001-04-24 2009-02-15 Ajinomoto Kk Stammzellen und verfahren zu deren trennung
CA2447015A1 (en) 2001-05-15 2002-11-21 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Insulin producing cells derived from human embryonic stem cells
US6626950B2 (en) * 2001-06-28 2003-09-30 Ethicon, Inc. Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue
KR100418195B1 (ko) 2001-07-05 2004-02-11 주식회사 우리기술 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법
GB0117583D0 (en) * 2001-07-19 2001-09-12 Astrazeneca Ab Novel compounds
CA2456981C (en) * 2001-08-06 2012-02-28 Bresagen, Inc. Alternative compositions and methods for the culture of stem cells
US6617152B2 (en) * 2001-09-04 2003-09-09 Corning Inc Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate
EP1298201A1 (en) 2001-09-27 2003-04-02 Cardion AG Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state
US20030138951A1 (en) 2001-10-18 2003-07-24 Li Yin Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells
DE60233248D1 (de) 2001-11-15 2009-09-17 Childrens Medical Center Verfahren zur isolierung, expansion und differenzierung fötaler stammzellen aus chorionzotte, fruchtwasser und plazenta und therapeutische verwendungen davon
CN1630526B (zh) * 2001-12-07 2010-05-05 马克罗珀尔生物外科公司 用加工的脂肪抽吸细胞来治疗患者的***和方法
IL162131A0 (en) * 2001-12-07 2005-11-20 Geron Corp Islet cells from human embryonic stem cells
AU2002218893A1 (en) 2001-12-21 2003-07-09 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability
IL162663A0 (en) 2001-12-28 2005-11-20 Cellartis Ab A method for the establishment of apluripotent human blastocyst-derived stem cell line
US20030162290A1 (en) 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
AU2003231358A1 (en) * 2002-04-17 2003-10-27 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. METHOD OF FORMING PANCREATIC Beta CELLS FROM MESENCHYMAL CELLS
US20040161419A1 (en) * 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
WO2003095452A1 (en) 2002-05-08 2003-11-20 Janssen Pharmaceutica N.V. Substituted pyrroline kinase inhibitors
US20060003446A1 (en) * 2002-05-17 2006-01-05 Gordon Keller Mesoderm and definitive endoderm cell populations
AU2003273573A1 (en) 2002-05-28 2003-12-19 Becton, Dickinson And Company Expansion and transdifferentiation of human acinar cells
KR20050008787A (ko) * 2002-06-05 2005-01-21 얀센 파마슈티카 엔.브이. 키나제 저해제로서의 비스인돌릴-말레이미드 유도체
GB0212976D0 (en) 2002-06-06 2002-07-17 Tonejet Corp Pty Ltd Ejection method and apparatus
CN1171991C (zh) 2002-07-08 2004-10-20 徐如祥 人神经干细胞的培养方法
US6877147B2 (en) * 2002-07-22 2005-04-05 Broadcom Corporation Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison
US7838290B2 (en) * 2002-07-25 2010-11-23 The Scripps Research Institute Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith
EP1539930A4 (en) 2002-07-29 2006-08-09 Es Cell Int Pte Ltd METHOD IN MULTIPLE STAGES OF DIFFERENTIATION OF POSITIVE INSULIN-SENSITIVE CELLS, GLUCOSE
WO2004016747A2 (en) 2002-08-14 2004-02-26 University Of Florida Bone marrow cell differentiation
WO2004023100A2 (en) 2002-09-06 2004-03-18 Amcyte Inc. Cd56 positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells
US9969977B2 (en) * 2002-09-20 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20040062753A1 (en) * 2002-09-27 2004-04-01 Alireza Rezania Composite scaffolds seeded with mammalian cells
AU2003285172A1 (en) 2002-11-08 2004-06-03 The Johns Hopkins University Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same
US7144999B2 (en) * 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
EP1567639A4 (en) 2002-12-05 2005-12-21 Technion Res & Dev Foundation CULTURE OF HUMAN PANCREATIC ISLANDS AND USES THEREOF
CN100549163C (zh) 2002-12-16 2009-10-14 技术研究及发展基金有限公司 制备无饲养细胞、无异源的人胚胎干细胞的方法以及使用该方法制备的干细胞培养物
KR101114808B1 (ko) 2003-01-29 2012-02-15 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 피복 제제의 제조법
RU2359671C2 (ru) 2003-01-29 2009-06-27 Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед Способ получения препарата с покрытием
WO2005045001A2 (en) 2003-02-14 2005-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
US20070155661A1 (en) 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
US20070020242A1 (en) * 2003-03-27 2007-01-25 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway
US20060194315A1 (en) 2003-03-31 2006-08-31 Condie Brian G Compositions and methods for the control, differentiaton and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway
US20090203141A1 (en) 2003-05-15 2009-08-13 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents
CA2530533C (en) * 2003-06-27 2015-02-10 Ethicon, Incorporated Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making and using the same
IL161903A0 (en) 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
ITRM20030395A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero.
WO2005017117A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 Martin Haas Multipotent amniotic fetal stem cells (mafsc) and banking of same
US7157275B2 (en) 2003-08-15 2007-01-02 Becton, Dickinson And Company Peptides for enhanced cell attachment and growth
CA2536067A1 (en) 2003-08-27 2005-03-10 Stemcells California, Inc. Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for these populations
JP2007515433A (ja) 2003-12-17 2007-06-14 アラーガン　インコーポレイテッド Ｃｙｐ２６ａおよびｃｙｐ２６ｂの選択的阻害剤を使用するレチノイド反応性障害の処置方法
US20060030042A1 (en) * 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
US20050266554A1 (en) * 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
CN1946838A (zh) 2003-12-23 2007-04-11 赛瑟拉公司 定形内胚层
MX2009009225A (es) 2003-12-23 2009-09-28 Cythera Inc Endodermo definitivo.
US7625753B2 (en) 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
TWI334443B (en) * 2003-12-31 2010-12-11 Ind Tech Res Inst Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells
US20050233446A1 (en) * 2003-12-31 2005-10-20 Parsons Xuejun H Defined media for stem cell culture
US20080241107A1 (en) 2004-01-23 2008-10-02 Copland Iii John A Methods and Compositions For Preparing Pancreatic Insulin Secreting Cells
US7794704B2 (en) 2004-01-23 2010-09-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration
WO2005080551A2 (en) 2004-02-12 2005-09-01 University Of Newcastle Upon Tyne Stem cells
US7964401B2 (en) 2004-02-19 2011-06-21 Kyoto University Screening method for somatic cell nuclear reprogramming substance affecting ECAT2 and ECAT3
AU2005221095A1 (en) 2004-03-09 2005-09-22 John J. O'neil Methods for generating insulin-producing cells
CA2558486A1 (en) 2004-03-10 2005-09-22 Alberto Hayek Compositions and methods for growth of embryonic stem cells
WO2005097980A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Geron Corporation New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells
WO2005097977A2 (en) 2004-04-01 2005-10-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage
KR101278421B1 (ko) * 2004-04-27 2013-07-15 비아싸이트, 인크. Ｐｄｘ１ 발현 내배엽
CA2966883A1 (en) * 2004-07-09 2006-02-16 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
EP1791952A4 (en) 2004-08-13 2008-06-11 Univ Georgia Res Found COMPOSITIONS AND METHODS OF SELF-RENEWAL AND DIFFERENTIATION IN HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS
US20080268533A1 (en) 2004-08-25 2008-10-30 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods and Compositions Utilizing Myc and Gsk3Beta to Manipulate the Pluripotency of Embryonic Stem Cells
DE102004043256B4 (de) 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
AU2005282510B2 (en) 2004-09-08 2010-12-02 Wisconsin Alumni Research Foundation Medium and culture of embryonic stem cells
JP2008518585A (ja) 2004-09-08 2008-06-05 ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション ヒト胚幹細胞の培養
AU2006210955A1 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Es Cell International Pte Ltd. Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
SG160373A1 (en) 2005-03-04 2010-04-29 John Oaeneil Adult pancreatic derived stromal cells
GB0505970D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof
CN103361303B (zh) 2005-03-31 2015-09-30 斯丹姆涅恩有限公司 制备一种高度纯化来自羊膜的细胞群的方法
ATE553198T1 (de) 2005-04-15 2012-04-15 Geron Corp Behandlung von krebs durch die kombinierte hemmung der proteasom- und telomeraseaktivitäten
CN100425694C (zh) 2005-04-15 2008-10-15 北京大学 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法
US20080208351A1 (en) 2005-04-26 2008-08-28 Aarhus Universitet Biocompatible Material for Surgical Implants and Cell Guiding Tissue Culture Surfaces
CA2610598A1 (en) 2005-06-10 2006-12-21 Irm Llc Compounds that maintain pluripotency of embryonic stem cells
WO2006138433A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides
WO2006137787A1 (en) 2005-06-21 2006-12-28 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for cell culture
EP1910516B1 (en) 2005-06-22 2019-06-19 Asterias Biotherapeutics, Inc. Suspension culture of human embryonic stem cells
JP5345388B2 (ja) 2005-06-30 2013-11-20 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ 環式アニリノ−ピリジノトリアジン
GB2443370A (en) 2005-07-29 2008-04-30 Australian Stem Cell Ct Ltd Compositions and methods for growth of pluripotent cells
WO2007016485A2 (en) 2005-07-29 2007-02-08 Athersys, Inc. Use of a gsk-3 inhibitor to maintain potency of cultured cells
WO2007025234A2 (en) 2005-08-26 2007-03-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes
WO2007027156A1 (en) 2005-09-02 2007-03-08 Agency For Science, Technology And Research Method of deriving mesenchymal stem cells
WO2007030870A1 (en) 2005-09-12 2007-03-22 Es Cell International Pte Ltd Cardiomyocyte production
EP1941032A2 (en) 2005-10-14 2008-07-09 Regents Of The University Of Minnesota Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype
ES2743202T3 (es) 2005-10-27 2020-02-18 Viacyte Inc Endodermo de intestino proximal dorsal y ventral que expresa PDX1
EP4223769A3 (en) 2005-12-13 2023-11-01 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
WO2007082963A1 (es) 2006-01-18 2007-07-26 Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas
CN101410509B (zh) 2006-02-23 2016-05-18 维亚赛特公司 用于培养可分化细胞的组合物和方法
WO2007103282A2 (en) 2006-03-02 2007-09-13 Cythera, Inc. Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
US7695965B2 (en) 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
EP3527658A1 (en) 2006-04-28 2019-08-21 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US20070259423A1 (en) * 2006-05-02 2007-11-08 Jon Odorico Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage
US8685730B2 (en) 2006-05-02 2014-04-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage
US7964402B2 (en) 2006-05-25 2011-06-21 Sanford-Burnham Medical Research Institute Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells
CN101541953A (zh) 2006-06-02 2009-09-23 佐治亚大学研究基金会 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织
CA2654196A1 (en) 2006-06-02 2007-12-13 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pancreatic and liver endoderm cells and tissue by differentiation of definitive endoderm cells obtained from human embryonic stems
WO2007149182A2 (en) 2006-06-19 2007-12-27 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
CN100494359C (zh) 2006-06-23 2009-06-03 中日友好医院 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法
ES2610812T3 (es) 2006-06-26 2017-05-03 Lifescan, Inc. Cultivo de células madre pluripotentes
US20080003676A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Millipore Corporation Growth of embryonic stem cells
GB2454386B (en) 2006-07-06 2011-07-06 Es Cell Int Pte Ltd Method for embryonic stem cell culture on a positively charged support surface
WO2008013664A2 (en) 2006-07-26 2008-01-31 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
KR101331510B1 (ko) 2006-08-30 2013-11-20 재단법인서울대학교산학협력재단 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
WO2008039521A2 (en) 2006-09-26 2008-04-03 Nmt Medical, Inc. Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth
WO2008048647A1 (en) 2006-10-17 2008-04-24 Cythera, Inc. Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells
CN101611016B (zh) 2006-10-17 2012-01-25 斯蒂菲尔实验室公司 他拉罗唑代谢物
CA2666789C (en) 2006-10-18 2016-11-22 Yong Zhao Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
WO2008056779A1 (fr) 2006-11-09 2008-05-15 Japan As Represented By The President Of International Medical Center Of Japan Procédé destiné à la culture et au passage d'une cellule souche embryonnaire de primate, et procédé destiné à induire la différenciation de la cellule souche embryonnaire
WO2008086005A1 (en) 2007-01-09 2008-07-17 University Of South Florida Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof
CN101641436A (zh) 2007-01-30 2010-02-03 佐治亚大学研究基金会 用于产生内胚层和中胚层细胞系及多能游走细胞（mmc）的早期中胚层细胞即稳定的中内胚层细胞群
GB0703188D0 (en) 2007-02-19 2007-03-28 Roger Land Building Large scale production of stem cells
WO2008148105A1 (en) 2007-05-25 2008-12-04 Medistem Laboratories, Inc. Endometrial stem cells and methods of making and using same
KR101555824B1 (ko) 2007-07-18 2015-09-25 라이프스캔, 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
RU2010107181A (ru) 2007-07-31 2011-09-20 Лайфскен, Инк. (Us) Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток с использованием питающих клеток человека
RU2473685C2 (ru) 2007-07-31 2013-01-27 Лайфскен, Инк. Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
WO2009027644A2 (en) 2007-08-24 2009-03-05 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut Composition
WO2009061442A1 (en) 2007-11-06 2009-05-14 Children's Medical Center Corporation Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells form non-embryonic human cells
RU2473684C2 (ru) * 2007-11-27 2013-01-27 Лайфскен, Инк. Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
SG154367A1 (en) 2008-01-31 2009-08-28 Es Cell Int Pte Ltd Method of differentiating stem cells
WO2009096049A1 (ja) 2008-02-01 2009-08-06 Kyoto University 人工多能性幹細胞由来分化細胞
EP2250252A2 (en) 2008-02-11 2010-11-17 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
KR102026622B1 (ko) 2008-02-21 2019-09-30 얀센 바이오테크 인코포레이티드 세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물
WO2009110215A1 (ja) 2008-03-03 2009-09-11 独立行政法人 科学技術振興機構 繊毛細胞の分化誘導方法
WO2009116951A2 (en) 2008-03-17 2009-09-24 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
US8338170B2 (en) 2008-04-21 2012-12-25 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
DK2727998T3 (da) 2008-04-21 2019-08-26 Viacyte Inc Fremgangsmåder til oprensning af pancreatiske endodermceller afledt fra humane embryoniske stamceller
US8728812B2 (en) 2008-04-22 2014-05-20 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of PDX1+ pancreatic cells
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
US20090298178A1 (en) 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
DK2993226T3 (da) 2008-06-03 2021-02-22 Viacyte Inc Vækstfaktorer til fremstilling af en definitiv endoderm
WO2010002846A1 (en) 2008-06-30 2010-01-07 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
DE102008032236A1 (de) 2008-06-30 2010-04-01 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential
US20100028307A1 (en) * 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
EP2350265B1 (en) 2008-10-31 2019-04-17 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
CN102272291B (zh) 2008-10-31 2018-01-16 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化
WO2010053472A1 (en) 2008-11-04 2010-05-14 Novocell, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
EP2356227B1 (en) 2008-11-14 2018-03-28 Viacyte, Inc. Encapsulation of pancreatic cells derived from human pluripotent stem cells
MX356756B (es) 2008-11-20 2018-06-11 Centocor Ortho Biotech Inc Células madre pluripotentes en microportadores.
US20110229441A1 (en) 2008-12-05 2011-09-22 Association Francaise Contre Les Myopathies Method and Medium for Neural Differentiation of Pluripotent Cells
KR102058901B1 (ko) 2009-07-20 2019-12-24 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
RU2540016C2 (ru) * 2009-07-20 2015-01-27 Янссен Байотек, Инк. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека
FI20096288A0 (fi) 2009-12-04 2009-12-04 Kristiina Rajala Formulations and methods for culturing stem cells
US9150833B2 (en) 2009-12-23 2015-10-06 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US20120322152A1 (en) 2010-03-02 2012-12-20 Michael Raghunath Culture Additives To Boost Stem Cell Proliferation And Differentiation Response
CA2800498C (en) 2010-03-31 2021-11-16 The Scripps Research Institute Reprogramming cells
US9234170B2 (en) 2010-04-25 2016-01-12 Mount Sinai School Of Medicine Generation of anterior foregut endoderm from pluripotent cells
EP2569419B1 (en) 2010-05-12 2019-03-20 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
EP2601288B1 (en) 2010-08-05 2016-04-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Simplified basic media for human pluripotent cell culture
CA2807935C (en) 2010-08-09 2018-09-18 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method of producing pancreatic hormone-producing cells
CA2809305C (en) 2010-08-31 2019-06-11 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
MY177150A (en) 2011-02-28 2020-09-08 Stempeutics Res Malaysia Sdn Bhd Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof
WO2013055834A2 (en) 2011-10-11 2013-04-18 The New York Stem Cell Foundation Er stress relievers in beta cell protection
KR102203056B1 (ko) 2011-12-22 2021-01-14 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 단일 인슐린 호르몬 양성 세포로의 분화
US10519422B2 (en) 2012-02-29 2019-12-31 Riken Method of producing human retinal pigment epithelial cells
CN108103006A (zh) 2012-06-08 2018-06-01 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化
RU2658488C2 (ru) 2012-12-31 2018-06-21 Янссен Байотек, Инк. Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток
KR101942769B1 (ko) * 2012-12-31 2019-01-28 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Hb9 조절제를 사용하는 인간 배아 줄기세포의 췌장 내분비 세포로의 분화
TW201522637A (zh) 2013-03-15 2015-06-16 Jackson Lab 非胚胎幹細胞之單離及其用途
KR102580225B1 (ko) 2013-06-11 2023-09-20 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 SC-β 세포 및 조성물 그리고 그 생성 방법

Also Published As

Publication number Publication date
US20200024578A1 (en) 2020-01-23
BRPI0819609A2 (pt) 2014-10-14
JP6145117B2 (ja) 2017-06-07
RU2473684C2 (ru) 2013-01-27
CA2954431A1 (en) 2009-06-04
CN101878298B (zh) 2017-08-15
KR101592182B1 (ko) 2016-02-05
KR20150088338A (ko) 2015-07-31
US10494609B2 (en) 2019-12-03
US20230287353A1 (en) 2023-09-14
WO2009070592A2 (en) 2009-06-04
JP2015062437A (ja) 2015-04-09
CN101878298A (zh) 2010-11-03
US20180258402A1 (en) 2018-09-13
JP2011504753A (ja) 2011-02-17
JP5710264B2 (ja) 2015-04-30
EP2229434B1 (en) 2011-09-07
WO2009070592A3 (en) 2009-10-15
US9062290B2 (en) 2015-06-23
US20090170198A1 (en) 2009-07-02
CA2954431C (en) 2021-08-24
HK1147521A1 (en) 2011-08-12
RU2010126217A (ru) 2012-01-10
CA3123528A1 (en) 2009-06-04
KR20100101111A (ko) 2010-09-16
US11505783B2 (en) 2022-11-22
ATE523585T1 (de) 2011-09-15
MX2010005805A (es) 2010-06-09
US9969982B2 (en) 2018-05-15
EP2229434A2 (en) 2010-09-22
CA2706560C (en) 2017-02-28
KR101706928B1 (ko) 2017-02-27
CN107574142B (zh) 2021-07-06
US20150252327A1 (en) 2015-09-10
CN107574142A (zh) 2018-01-12
CA2706560A1 (en) 2009-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2372463T3 (es) Diferenciación de células madre embrionarias humanas.
ES2727950T3 (es) Diferenciación de células madre embrionarias humanas en linaje endocrino pancreático
ES2537578T3 (es) Diferenciación de las células madre de embriones humanos
CA2768720C (en) Differentiation of human embryonic stem cells
CA2768643C (en) Differentiation of human embryonic stem cells
ES2585028T3 (es) Diferenciación de células madre pluripotentes
AU2010276440B2 (en) Differentiation of human embryonic stem cells
CN103052393B (zh) 用胰腺内分泌前体细胞治疗糖尿病