JP2011504753A - ヒト胚性幹細胞の分化 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、多能性幹細胞の分化を促進するための方法、及びこうした方法に関連する、又はこうした方法で得られる生成物を提供する。より詳細には、本発明は、膵臓ホルモン発現細胞、及び膵臓ホルモン分泌細胞を形成するための改良された方法を提供する。本発明は更に、フィーダー細胞層を使用することなく多能性幹細胞の分化を促進する方法、及びこうした方法に関連する、又はこうした方法で得られる生成物を提供する。本発明は更に、多能性幹細胞から誘導されたインスリン産生細胞においてグルコース刺激インスリン分泌を促進する方法を提供する。
1型糖尿病の細胞置換療法における進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足のため、生着に適したインスリン産生細胞すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。1つの手法として、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成することがある。
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞からグルコース刺激インスリン分泌能を有する細胞を生成するための方法を提供し、この方法は、
a.多能性幹細胞を培養する工程と、
b.多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
c.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
d.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む。
a.多能性幹細胞を培養する工程と、
b.多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
c.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
d.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む。
a.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、線維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤で処理し、次いで線維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤を含む培地を取り除いた後、レチノイン酸、線維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で細胞を培養するか、
b.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸及び少なくとも1種類の線維芽細胞増殖因子で処理するか、
c.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ソニックヘッジホッグ阻害剤、少なくとも1種類の線維芽細胞増殖因子、及び少なくとも1種類のBMPを阻害可能な因子で処理するか、
d.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ソニックヘッジホッグ阻害剤、少なくとも1種類の線維芽細胞増殖因子、及びネトリンで処理するか、
e.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ソニックヘッジホッグ阻害剤、少なくとも1種類の線維芽細胞増殖因子、少なくとも1種類のBMPを阻害可能な因子、及びネトリンで処理するか、
f.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、少なくとも1種類の線維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ阻害剤で処理し、次いで前記1種類の線維芽細胞増殖因子及び前記ソニックヘッジホッグ阻害剤を除去した後、細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、少なくとも1種類の線維芽細胞増殖因子、及びレチノイン酸で処理するか、
g.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、少なくとも1種類の線維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ阻害剤で処理し、次いで前記1種類の線維芽細胞増殖因子及び前記ソニックヘッジホッグ阻害剤を除去した後、細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、少なくとも1種類の線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸、及び少なくとも1種類のBMPを阻害可能な因子で処理するか、
h.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、少なくとも1種類の線維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ阻害剤で処理し、次いで前記1種類の線維芽細胞増殖因子及び前記ソニックヘッジホッグ阻害剤を除去した後、細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、少なくとも1種類の線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸、及びネトリンで処理するか、
i.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、少なくとも1種類の線維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ阻害剤で処理し、次いで前記少なくとも1種類の線維芽細胞増殖因子及び前記ソニックヘッジホッグ阻害剤を除去した後、細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、少なくとも1種類の線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸、少なくとも1種類のBMPを阻害可能な因子、及びネトリンで処理する、ことである。
a.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γ−セクレターゼ阻害剤及びGLP−1アゴニストを含む培地中で培養し、次いでγ−セクレターゼ阻害剤及びGLP−1アゴニストを含む培地を取り除いた後、細胞をGLP−1アゴニスト、IGF−1及びHGFを含む培地中で培養するか、
b.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、GLP−1アゴニストを含む培地中で培養し、次いでGLP−1アゴニストを含む培地を取り除いた後、細胞をGLP−1アゴニスト、IGF−1及びHGFを含む培地中で培養するか、
c.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γ−セクレターゼ阻害剤及びGLP−1アゴニストを含む培地中で培養するか、
d.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、GLP−1アゴニストを含む培地中で培養するか、
e.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、Notchシグナル伝達経路を阻害する因子で処理するか、
f.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、TGF−βR−1経路を阻害する因子で処理するか、
g.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びTGF−βR−1経路を阻害する因子で処理するか、
h.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約10mM〜約20mMのグルコース及びGLP−1アゴニストを含む培地中で培養する、ことである。
幹細胞とは、1個の細胞レベルで自己再生し、かつ、自己再生性の前駆細胞、非自己再生性の前駆細胞、及び最終分化細胞のような後代細胞を生ずるように分化する能力によって定義される未分化細胞のことである。幹細胞はまた、複数の胚細胞層(内胚葉、中胚葉及び外胚葉)から異なる細胞系の機能性細胞へとインビトロで分化する能力、並びに、移植後に複数の胚細胞層の組織を生ずる能力、及び胚盤胞への注入後にすべての組織とまではいかないにしても、ほぼ大部分の組織に分化する能力によっても特徴付けられる。
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、発生段階特異的胚性抗原(SSEA)3及び4の1つ以上、並びにTra−1−60及びTra−1−81と呼ばれる抗体を用いて検出可能なマーカーを発現しうる(Thomson et al.,Science 282:1145,1998)。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、SSEA−4、Tra−1−60、及びTra−1−81の発現が消失し(存在する場合)、SSEA−1の発現が増大する。未分化の多能性幹細胞は通常アルカリホスファターゼ活性を有し、これは、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者(ベクターラボラトリーズ社(Vector Laboratories)、カリフォルニア州バーリンゲーム(Burlingame)所在)によって述べられるようにVectorRedを基質として現像することによって検出することができる。未分化多能性幹細胞はまた、RT−PCRで検出されるように、一般にOct−4及びTERTも発現している。
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期(必ずしもではないが、通常は妊娠約10〜12週よりも前)に採取した前胚性組織(例えば胚盤胞など)、胚性組織、又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の株化細胞系が含まれる。非限定的な例としては、例えばヒト胚性幹細胞系H1、H7及びH9(WiCell)などのヒト胚性幹細胞又はヒト胚性生殖細胞の株化細胞系がある。更に、こうした細胞の初期の株化又は安定化の際に本開示の組成物を使用することも考えられるが、その場合は、供給源となる細胞は供給源組織から直接採取される1次多能性細胞である。フィーダー細胞の非存在下で既に培養された多能性幹細胞集団から得られる細胞も好適である。例えば、BG01v(ブレサジェン社(BresaGen)、ジョージア州アセンズ所在)などの変異型ヒト胚性幹細胞系も好適である。
一実施形態では、通常、多能性幹細胞を、様々な方法で多能性幹細胞を支持するフィーダー細胞の層上で培養する。あるいは、多能性幹細胞を、フィーダー細胞を基本的に含まないにも関わらず、細胞を大きく分化させることなく多能性幹細胞の増殖を支持する培養システム中で培養する。分化をともなわない無フィーダー培養中での多能性幹細胞の増殖は、別の細胞型と予め培養することによって調整した培地を用いることで支持される。また、分化をともなわない無フィーダー培養中での多能性幹細胞の増殖は、合成培地を用いることによっても支持される。
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞からグルコース刺激インスリン分泌能を有する細胞を生成するための方法を提供し、この方法は、
a.前記多能性幹細胞を培養する工程と、
b.前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
c.前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
d.前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む。
a.前記多能性幹細胞を培養する工程と、
b.前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
c.前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
d.前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む。
多能性幹細胞は、当該技術分野のいかなる方法、又は本発明で提案されるいかなる方法によって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させてもよい。
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成は、特定のプロトコールの前後に、マーカーの存在について試験することにより判定することができる。多能性幹細胞は、一般にこうしたマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がこうしたマーカーを発現し始める際に検出される。
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、当該技術分野におけるいずれかの方法又は本発明において開示されるいずれかの方法によって膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
a.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を培養する工程と、
b.前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害物質、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で処理する工程と、を含む。
a.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を培養する工程と、
b.前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で処理する工程と、
c.レチノイン酸及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択される前記少なくとも1種類の因子を除去し、次いでソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、線維芽細胞増殖因子、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で細胞を処理する工程と、を含む。
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは当業者にはよく知られたものであり、膵臓内胚葉系統に特徴的な更なるマーカーも引き続き特定されている。これらのマーカーを用いて、本発明に基づいて処理を行った細胞が、膵臓内胚葉系統に特徴的な性質を獲得するように分化したことを確認することが可能である。膵臓内胚葉系統に特異的なマーカーとしては、例えば、Hlxb9、PTF−1a、PDX−1、HNF−6、HNF−1βなどの1以上の転写因子の発現が挙げられる。
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、当該技術分野におけるいずれかの方法又は本発明において開示されるいずれかの方法によって膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
a.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を培養する工程と、
b.ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びTGF−βR−1シグナル伝達経路を阻害する因子で前記細胞を処理する工程と、を含む。
膵臓内分泌系統の細胞に特徴的なマーカーは当業者にはよく知られたものであり、膵臓内分泌系統に特徴的な更なるマーカーも引き続き特定されている。これらのマーカーを用いて、本発明に基づいて処理を行った細胞が膵臓内分泌系統に特徴的な性質を獲得するように分化したことを確認することが可能である。膵臓内分泌系統に特異的なマーカーとしては、例えば、NGN−3、ニューロD(NeuroD)、Islet−1などの1以上の転写因子の発現が挙げられる。
1pg当たり約1000ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約900ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約800ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約700ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約600ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約500ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約400ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約500ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約400ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約300ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約200ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約100ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約90ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約80ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約70ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約60ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約50ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約40ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約30ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約20ngのC−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、DNA 1pg当たり約10ngのC−ペプチドを産生する。
一態様において、本発明は、1型糖尿病を罹患しているかあるいは発症するリスクを有する患者を治療するための方法を提供する。この方法では、多能性幹細胞を培養し、その多能性幹細胞をインビトロでβ細胞系統に分化させ、そのβ細胞系統の細胞を患者に移植することを含む。
(実施例1)
ヒト胚性幹細胞の培養
ヒト胚性幹細胞系H1、H7及びH9をウィセル・リサーチ・インスティテュート社(WiCell Research Institute, Inc.)(ウイスコンシン州マディソン所在)より入手し、当該供給元機関によって与えられる指示に従って培養した。簡単に述べると、20%のノックアウト血清リプレースメント、100nMのMEM非必須アミノ酸、0.5mMのβメルカプトエタノール、2mMのL−グルタミンと4ng/mLのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)(すべてインビトロジェン/ギブコ社(Invitrogen/GIBCO)より入手)を添加したDMEM/F12(インビトロジェン/ギブコ社(Invitrogen/GIBCO))からなるES細胞培地中、マウス胚線維芽細胞(MEF)フィーダー細胞上で細胞を培養した。MEF細胞はE13〜13.5のマウス胚から得られたものをチャールズリバー社(Charles River)より購入した。MEF細胞は、10%のFBS(ハイクローン社(Hyclone))、2mMのグルタミン、及び100mMのMEM非必須アミノ酸を添加したDMEM培地で増殖させた。サブコンフルエンスに達したMEF細胞培養を、10μg/mlのマイトマイシンC(シグマ社(Sigma)ミズーリ州セントルイス所在)で3時間処理して細胞***を停止させた後、トリプシン処理し、0.1%ウシゼラチンコートディッシュに2×104/cm2で播いた。継代数2〜4からのMEF細胞をフィーダー層として使用した。MEF細胞のフィーダー層に播いたヒト胚性幹細胞を、加湿した組織培養インキュベーター内で、5%CO2雰囲気中37℃で培養した。コンフルエンスに達した時点(播種後約5〜7日後)で、ヒト胚性幹細胞を1mg/mlのIV型コラゲナーゼ(インビトロジェン/ギブコ社(Invitrogen/GIBCO))で5〜10分間処理した後、5mlピペットを用いて表面から静かに掻き取った。細胞を900rpmで5分間遠心し、得られたペレットを再懸濁して新鮮な培地に1:3〜1:4の細胞比で再び播いた。
MATRIGEL(商標)でコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化
継代数45のヒト胚性幹細胞系H1の細胞を、MATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:30)上で培養し、0.5%のFBS及び100ng/mlのアクチビンA(R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)を添加し、更に20ng/mlのWnt−3a(カタログ番号:1324−WN−002、R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)を加えたDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%のFBS及び100ng/mlのアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。次に培養を、DMEM/F12+2%のFBS+20ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD(#239804、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州)で3日間処理した後、DMEM/F12+1%のB27(インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州)+20ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD+2μmのレチノイン酸(RA)(シグマ社(Sigma)、ミズーリ州)中で4日間インキュベートした。
図1aに概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞における、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーの発現に対する異なる化合物の影響。
継代数51のヒト胚性幹細胞系H1の細胞を、MATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:30)上で培養し、0.5%のFBS及び100ng/mlのアクチビンA(R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)、更に20ng/mlのWnt−3a(カタログ番号:1324−WN−002、R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)を添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%のFBS及び100ng/mlのアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に2日間処理した。次に培養を、DMEM/F12+2%のFBS+20ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD(#239804、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州)で3日間処理した後、DMEM/F12+1%のB27(インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州)+20ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD+2μmのレチノイン酸(RA)(シグマ社(Sigma)、ミズーリ州)中で4日間インキュベートした。
図1aに概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞における、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーの発現に対するTGF−β受容体Iキナーゼ阻害剤の添加の影響。
継代数44のヒト胚性幹細胞系H1の細胞を、MATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:30)上で培養し、0.5%のFBS及び100ng/mlのアクチビンA(R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)、更に20ng/mlのWnt−3a(カタログ番号:1324−WN−002、R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)を添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%のFBS及び100ng/mlのアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に2日間処理した。次に培養を、DMEM/F12+2%のFBS+20ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD(#239804、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州)で3日間処理した後、DMEM/F12+1%のB27(インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州)+20ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD+2μmのレチノイン酸(RA)(シグマ社(Sigma)、ミズーリ州)中で4日間インキュベートした。
図1aに概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞における、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーの発現に対する異なるTGF−β受容体Iキナーゼ阻害剤の影響。
継代数41のヒト胚性幹細胞系H1の細胞を、MATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:30)上で培養し、0.5%のFBS及び100ng/mlのアクチビンA(R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)、更に20ng/mlのWnt−3a(カタログ番号:1324−WN−002、R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)を添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%のFBS及び100ng/mlのアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に2日間処理した。次に培養を、DMEM/F12+2%のFBS+20ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD(#239804、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州)で3日間処理した後、DMEM/F12+1%のB27(インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州)+20ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD+2μmのレチノイン酸(RA)(シグマ社(Sigma)、ミズーリ州)中で4日間インキュベートした。
図1aに概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞における、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーの発現に対するノギン及びALK5阻害剤の影響。
継代数41のヒト胚性幹細胞系H1の細胞を、MATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:30)上で培養し、0.5%のFBS及び100ng/mlのアクチビンA(R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)、更に20ng/mlのWnt−3a(カタログ番号:1324−WN−002、R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)を添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%のFBS及び100ng/mlのアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に2日間処理した。次に培養を、DMEM/F12+2%のFBS+20ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD(#239804、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州)で3日間処理した後、DMEM/F12+1%のB27(インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州)+20ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD+2μmのレチノイン酸(RA)(シグマ社(Sigma)、ミズーリ州)+0〜500ng/mlのノギン(R&Dシステムズ社(R&D Systems)、ミネソタ州)中で4日間インキュベートした。
図1に概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞における、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーの発現に対するステージ3におけるノギンの添加及びステージ4及び5におけるALK5阻害剤の添加の影響。
継代数44のヒト胚性幹細胞系H1の細胞を、MATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:30)上で培養し、0.5%のFBS及び100ng/mlのアクチビンA(R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)、更に20ng/mlのWnt−3a(カタログ番号:1324−WN−002、R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)を添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%のFBS及び100ng/mlのアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に2日間処理した。次に培養を、DMEM/F12+2%のFBS+20ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD(#239804、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州)で3日間処理した後、DMEM/F12+1%のB27(インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州)+20ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD+2μmのレチノイン酸(RA)(シグマ社(Sigma)、ミズーリ州)+100ng/mlのノギン(R&Dシステムズ社(R&D Systems)、ミネソタ州)中で4日間インキュベートした。
図1に概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞における、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーの発現に対するステージ3〜4におけるノギン、ステージ4におけるネトリン、及びステージ4におけるALK5阻害剤の添加の影響。
継代数48のヒト胚性幹細胞系H1の細胞を、MATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:30)上で培養し、2%の脂肪酸BSA及び100ng/mlのアクチビンA(R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)、更に20ng/mlのWnt−3a(カタログ番号:1324−WN−002、R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)を添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%のBSA及び100ng/mlのアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に2日間処理した。次に培養を、DMEM/F12+2%のFBS+20ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD(#239804、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州)で3日間処理した後、DMEM/F12+1%のB27(インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州)+20ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD+2μmのレチノイン酸(RA)(シグマ社(Sigma)、ミズーリ州)+100ng/mlのノギン(R&Dシステムズ社(R&D Systems)、ミネソタ州)中で4日間インキュベートした。
図1bに概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞による、インビトロでのグルコース刺激インスリン分泌(GSIS)。
継代数48のヒト胚性幹細胞系H1の細胞を、MATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:30)上で培養し、2%の脂肪酸BSA及び100ng/mlのアクチビンA(R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)、更に20ng/mlのWnt−3a(カタログ番号:1324−WN−002、R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)を添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%のBSA及び100ng/mlのアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に2日間処理した。次に培養を、DMEM/F12+2%のFBS+20ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD(#239804、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州)で3日間処理した後、DMEM/F12+1%のB27(インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州)+20ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD+2μmのレチノイン酸(RA)(シグマ社(Sigma)、ミズーリ州)+100ng/mlのノギン(R&Dシステムズ社(R&D Systems)、ミネソタ州)中で4日間インキュベートした。
図1bに概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞における、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーの発現に対するネトリン−1又はネトリン−2の添加の影響。
継代数44のヒト胚性幹細胞系H1の細胞を、MATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:30)上で培養し、0.5%のFBS及び100ng/mlのアクチビンA(R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)、更に20ng/mlのWnt−3a(カタログ番号:1324−WN−002、R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)を添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%のFBS及び100ng/mlのアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に2日間処理した。次に培養を、DMEM/F12+2%のFBS+20ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD(#239804、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州)で3日間処理した後、DMEM/F12+1%のB27(インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州)+20ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD+2μmのレチノイン酸(RA)(シグマ社(Sigma)、ミズーリ州)中で4日間インキュベートした。
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーの発現を誘導するための別法。
継代数48のヒト胚性幹細胞系H1の細胞を、MATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:30)上で培養し、下記のいずれかによって胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させた。
a.1%のB27サプリメント(インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州)及び50ng/mlのアクチビンA(R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)、更に1mMの酪酸ナトリウム(シグマ社(Sigma)、ミズーリ州)を添加したRPMI培地で1日間培養した後、1%のB27サプリメント(インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州)及び50ng/mlのアクチビンA(R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)、更に0.5mMの酪酸ナトリウム(シグマ社(Sigma)、ミズーリ州)を添加したRPMI培地で更に3日間処理するか、
b.0.5%のFBS及び100ng/mlのアクチビンA(R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)、更に20ng/mlのWnt−3a(カタログ番号:1324−WN−002、R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)を添加したDMEM/F12培地で2日間培養した後、2%のFBS及び100ng/mlのアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に2日間処理する。
血清の非存在下、MATRIGEL(商標)でコーティングした組織培養基質上で培養したヒト胚性幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化。
継代数52のヒト胚性幹細胞系H1の細胞を、MATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:30)上で培養し、2%のBSA(カタログ番号152401、MPバイオメディカル社(MP Biomedical)オハイオ州)及び100ng/mlのアクチビンA(R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)、更に20ng/mlのWnt−3a(カタログ番号:1324−WN−002、R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)、更に8ng/mlのbFGF(カタログ番号100−18B、ペプロテック社(PeproTech)、ニュージャージー州)を添加したRPMI培地に1日間曝露した後、2%のBSA及び100ng/mlのアクチビンA、更に8ng/mlのbFGFを添加したRPMI培地で更に2日間処理した。次に培養を、DMEM/F12+2%のBSA+50ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD(#239804、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州)で2日間処理した後、DMEM/F12+1%のB27(インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州)+50ng/mlのFGF7+0.25μmのシクロパミン−KAAD+2μMのレチノイン酸(RA)(シグマ社(Sigma)、ミズーリ州)+100ng/mlのノギン(R&Dシステムズ社(R&D Systems)、ミネソタ州)中で4日間インキュベートした。次に細胞を、DMEM/F12+1%のB27(インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州)+100ng/mlのノギン+1μmのDAPT(カタログ番号565784、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州)+1μmのALK5阻害剤(カタログ番号616452、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州)+100ng/mlのネトリン−4(R&Dシステムズ社(R&Dsystems)、ミネソタ州)中で3日間インキュベートした後、DMEM/F12+1%のB27(インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州)+1μmのALK5阻害剤II(カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州)中で更に7日間インキュベートした。DMEM/F12+1%のB27(インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州)中での7日間の処理からなる、最後のステージを追加することによって内分泌細胞の培養を更に成熟させた。最後のステージを除き、他のすべてのステージでは毎日培地を交換した。この手順の概要を図1cに示す。各ステージにおいて血球計数器を用いて細胞数を計算し、PCR分析用にRNAを採取した。試料はすべて3重に採取した。
図1cに概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞中のC−ペプチド及びプロインスリンの含量。
継代数42のヒト胚性幹細胞系H1の細胞を、MATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:30)上で培養し、上記実施例12で述べたような、図1cに概要を示すプロトコールに従って分化させた。
図1cに概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞中のFACS分析。
ヒト胚性幹細胞系H1の細胞を、MATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:30)上で培養し、上記実施例12で述べたような、図1cに概要を示すプロトコールに従って分化させた。TrypLE EXPRESS(インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州カールスバッド)を使用して細胞を単層培養から単一の細胞に分離し、冷たいPBS中で洗浄した。固定のため、細胞を200〜300μlのCytofix/Cytoperm緩衝液(BD554722、BD社、カリフォルニア州)中に再懸濁し、4℃で30分間インキュベートした。細胞を1mlのPerm/Wash緩衝液(BD554723)で2回洗浄し、Perm/Wash緩衝液中、2%正常ヤギ血清を含む100μlの染色/ブロッキング溶液に再懸濁した。フローサイトメトリー分析のため、細胞を以下の一次抗体で染色した:抗インスリン(ウサギmAb、セルシグナリング社(Cell Signaling)No.C27C9;希釈率1:100)、抗グルカゴン(マウスMab、シグマ社(Sigma)No.G2654、1:100);抗シナプトフィジン(ウサギポリクローナル抗体、ダコ・サイトメーション社(DakoCytomation)No A0010、1:50)。細胞を4℃で30分間インキュベートした後、Perm/Wash緩衝液中で2回洗浄し、以下の適当な二次抗体中で更に30分間インキュベートした:ヤギ抗ウサギAlexa 647(インビトロジェン社(Invitrogen)No.A21246)又はヤギ抗マウス647(インビトロジェン社(Invitrogen)No.A21235);ヤギ抗ウサギR−PE(バイオソース社(BioSource)、No.ALI4407)。二次抗体はすべて1:200の希釈率で使用した。細胞は、少なくとも1回Perm/Wash緩衝液中で洗浄し、BD FACSアレイを使用して分析した。少なくとも10000事象を分析のために取得した。コントロールとして、未分化のH1細胞及びb−TC(ATCC、バージニア州)細胞株を使用した。図20a〜cは、ステージ6の培養におけるインスリン陽性及びシナプトフィジン陽性細胞の比率を示す。
図1cに概要を示す分化プロトコールのステージ3及び4においてコーディンを添加することにより、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーの発現が上昇する。
継代数52のヒト胚性幹細胞系H1の細胞を、MATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:30)上で培養し、ステージ3〜4にノギンの代わりに50〜100ng/mlのコーディン(R&Dシステムズ社(R&D systems)、ミネソタ州)を加えた以外は図1cに概要を示すプロトコールに従って分化させた。ノギンと同様、コーディンもBMPシグナル伝達の阻害剤として知られている。FACS(図21a〜b)によるステージ6の培養の分析により、ステージ3〜4でノギンを加えた場合に見られたものと極めてよく似たインスリン及びシナプトフィジンの発現が示された。
血清の非存在下、MATRIGEL(商標)でコーティングした組織培養基質上で培養したヒト胚性幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化。
継代数39のヒト胚性幹細胞系H9の細胞を、MATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:30)上で培養し、上記実施例12で述べたような、図1cに概要を示すプロトコールに従って分化させた。RNAをステージ1〜6の終わりに採取した。図22a〜lは、ステージ3〜6の終わりに採取した細胞の主要な膵臓及び内分泌マーカーについてリアルタイムPCRのデータを示す。H1系で観察された結果と同様、H9細胞は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する能力を有していた。
多能性幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化能に対する培地サプリメントの影響。
継代数39のヒト胚性幹細胞系H1の細胞を、MATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:30)上で培養し、一部の培養において、DMEF/F12基礎培地に0.25〜1%のB27又は1%のN2(インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州)+2%のBSAを添加した以外は図1cに概要を示すプロトコールに従って分化させた。分化プロトコールの他のすべての要素は、実施例12に概要を示したとおりとした。ステージ3、5及び6の終わりに試料を3重に採取し、リアルタイムPCRにより分析した。図23a〜dは、ステージ3、5及び6の終わりに採取した細胞の主要な膵臓及び内分泌マーカーについてリアルタイムPCRのデータを示す。B27の代わりにN2/BSAを使用することによって、主要な膵臓内分泌マーカーの極めてよく似た発現が認められた。更に、主要な膵臓内分泌マーカーの発現に大きな影響を及ぼすことなく、B27の濃度を0.25%にまで低下させることができた。
(1) 多能性幹細胞からグルコース刺激インスリン分泌能を有する細胞を生成するための方法において、
a.前記多能性幹細胞を培養する工程と、
b.前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
c.前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
d.前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法。
(2) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で処理することによって行われる、実施態様1に記載の方法。
(3) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約6日間処理する、実施態様2に記載の方法。
(4) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約6日間処理する、実施態様2に記載の方法。
(5) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約3日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びにFGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約4日間処理する、実施態様2に記載の方法。
(6) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約3日間処理する、実施態様5に記載の方法。
(7) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約4日間処理する、実施態様5に記載の方法。
(8) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約3日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約4日間処理する、実施態様2に記載の方法。
(9) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約3日間処理する、実施態様8に記載の方法。
(10) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約4日間処理する、実施態様8に記載の方法。
(12) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約3日間処理する、実施態様11に記載の方法。
(13) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、ネトリン、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約4日間処理する、実施態様11に記載の方法。
(14) FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される前記因子が、FGF−7である、実施態様2に記載の方法。
(15) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約50pg/ml〜約50μg/mlの濃度のFGF−7で処理する、実施態様14に記載の方法。
(16) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、20ng/mlの濃度のFGF−7で処理する、実施態様14に記載の方法。
(17) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約1nM〜約1mMの濃度のレチノイン酸で処理する、実施態様2に記載の方法。
(18) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、1μMの濃度のレチノイン酸で処理する、実施態様2に記載の方法。
(19) 前記ソニックヘッジホッグ阻害剤がシクロパミンである、実施態様2に記載の方法。
(20) シクロパミンを約0.1μM〜約10μMの濃度で使用する、実施態様19に記載の方法。
(22) 前記BMPを阻害可能な因子がBMP4阻害剤である、実施態様2に記載の方法。
(23) 前記BMP4阻害剤がノギンである、実施態様22に記載の方法。
(24) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約500ng/ml〜約100μg/mlの濃度のノギンで処理する、実施態様22に記載の方法。
(25) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、100ng/mlの濃度のノギンで処理する、実施態様22に記載の方法。
(26) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約500ng/ml〜約100μg/mlの濃度のネトリンで処理する、実施態様2に記載の方法。
(27) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を100ng/mlの濃度のネトリンで処理する、実施態様2に記載の方法。
(28) 前記ネトリンが、ネトリン1、ネトリン2、及びネトリン4からなる群から選択される、実施態様2に記載の方法。
(29) 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、TGF−βR−1経路を阻害する因子で処理することによって行われる、実施態様1に記載の方法。
(30) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、TGF−βR−1経路を阻害する因子で約1〜約12日間処理する、実施態様29に記載の方法。
(32) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、TGF−βR−1経路を阻害する因子で約12日間処理する、実施態様29に記載の方法。
(33) 前記TGF−βR−1経路を阻害する因子が、TGF−βR−1キナーゼの阻害剤である、実施態様29に記載の方法。
(34) 前記TGF−βR−1シグナル伝達経路を阻害する因子が、TGF−βR−1キナーゼの阻害剤である、実施態様33に記載の方法。
(35) 前記TGF−βR−1キナーゼを、約0.1μM〜約100μMの濃度で使用する、実施態様34に記載の方法。
(36) 前記TGF−βR−1キナーゼの阻害剤が、2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジンである、実施態様34に記載の方法。
(37) 前記TGF−βR−1キナーゼの阻害剤が、[3−(ピリジン−2−イル)−4−(4−キノニル)]−1H−ピラゾールである、実施態様34に記載の方法。
(38) 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、BMPを阻害可能な因子及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で更に処理する、実施態様29に記載の方法。
(39) 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子、及びTGF−βR−1経路を阻害する因子で処理することによって行われる、実施態様1に記載の方法。
(40) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びTGF−βR−1経路を阻害する因子で約1〜約12日間処理する、実施態様39に記載の方法。
(42) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びTGF−βR−1経路を阻害する因子で約12日間処理する、実施態様39に記載の方法。
(43) 前記ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子が、γ−セクレターゼ阻害剤である、実施態様39に記載の方法。
(44) 前記γ−セクレターゼ阻害剤がL−685,458である、実施態様43に記載の方法。
(45) L−685,458を約0.1μM〜約100μMの濃度で使用する、実施態様43に記載の方法。
(46) 前記TGF−βR−1経路を阻害する因子が、TGF−βR−1キナーゼの阻害剤である、実施態様39に記載の方法。
(47) 前記TGF−βR−1シグナル伝達経路を阻害する因子が、TGF−βR−1キナーゼの阻害剤である、実施態様46に記載の方法。
(48) 前記TGF−βR−1キナーゼを、約0.1μM〜約100μMの濃度で使用する、実施態様47に記載の方法。
(49) 前記TGF−βR−1キナーゼの阻害剤が、2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジンである、実施態様47に記載の方法。
(50) 前記TGF−βR−1キナーゼの阻害剤が、[3−(ピリジン−2−イル)−4−(4−キノニル)]−1H−ピラゾールである、実施態様47に記載の方法。
(52) 多能性幹細胞からグルコース刺激インスリン分泌能を有する細胞を生成するための方法において、
a.前記多能性幹細胞を培養する工程と、
b.前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
c.前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
d.前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法。
(53) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で処理することによって行われる、実施態様52に記載の方法。
(54) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約6日間処理する、実施態様53に記載の方法。
(55) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約6日間処理する、実施態様53に記載の方法。
(56) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約3日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びにFGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約4日間処理する、実施態様53に記載の方法。
(57) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約3日間処理する、実施態様56に記載の方法。
(58) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約4日間処理する、実施態様56に記載の方法。
(59) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約3日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約4日間処理する、実施態様53に記載の方法。
(60) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約3日間処理する、実施態様59に記載の方法。
(62) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約3日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、ネトリン、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約4日間処理する、実施態様53に記載の方法。
(63) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約3日間処理する、実施態様62に記載の方法。
(64) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、ネトリン、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約4日間処理する、実施態様62に記載の方法。
(65) FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される前記因子が、FGF−7である、実施態様53に記載の方法。
(66) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約50pg/ml〜約50μg/mlの濃度のFGF−7で処理する、実施態様65に記載の方法。
(67) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、20ng/mlの濃度のFGF−7で処理する、実施態様65に記載の方法。
(68) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約1nM〜約1mMの濃度のレチノイン酸で処理する、実施態様53に記載の方法。
(69) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、1μMの濃度のレチノイン酸で処理する、実施態様53に記載の方法。
(70) 前記ソニックヘッジホッグ阻害剤がシクロパミンである、実施態様53に記載の方法。
(72) シクロパミンを0.25μMの濃度で使用する、実施態様70に記載の方法。
(73) 前記BMPを阻害可能な因子がBMP4阻害剤である、実施態様53に記載の方法。
(74) 前記BMP4阻害剤がノギンである、実施態様73に記載の方法。
(75) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約500ng/ml〜約100μg/mlの濃度のノギンで処理する、実施態様73に記載の方法。
(76) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、100ng/mlの濃度のノギンで処理する、実施態様73に記載の方法。
(77) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約500ng/ml〜約100μg/mlの濃度のネトリンで処理する、実施態様53に記載の方法。
(78) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を100ng/mlの濃度のネトリンで処理する、実施態様53に記載の方法。
(79) 前記ネトリンが、ネトリン1、ネトリン2、及びネトリン4からなる群から選択される、実施態様53に記載の方法。
(80) 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、TGF−βR−1経路を阻害する因子で処理することによって行われる、実施態様52に記載の方法。
(82) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、TGF−βR−1経路を阻害する因子で約5〜約12日間処理する、実施態様80に記載の方法。
(83) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、TGF−βR−1経路を阻害する因子で約12日間処理する、実施態様80に記載の方法。
(84) 前記TGF−βR−1経路を阻害する因子が、TGF−βR−1キナーゼの阻害剤である、実施態様80に記載の方法。
(85) 前記TGF−βR−1シグナル伝達経路を阻害する因子が、TGF−βR−1キナーゼの阻害剤である、実施態様84に記載の方法。
(86) 前記TGF−βR−1キナーゼを、約0.1μM〜約100μMの濃度で使用する、実施態様85に記載の方法。
(87) 前記TGF−βR−1キナーゼの阻害剤が、2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジンである、実施態様85に記載の方法。
(88) 前記TGF−βR−1キナーゼの阻害剤が、[3−(ピリジン−2−イル)−4−(4−キノニル)]−1H−ピラゾールである、実施態様85に記載の方法。
(89) 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、BMPを阻害可能な因子及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で更に処理する、実施態様80に記載の方法。
(90) 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子、及びTGF−βR−1経路を阻害する因子で処理することによって行われる、実施態様52に記載の方法。
(92) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びTGF−βR−1経路を阻害する因子で約5〜約12日間処理する、実施態様90に記載の方法。
(93) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びTGF−βR−1経路を阻害する因子で約12日間処理する、実施態様90に記載の方法。
(94) 前記ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子が、γ−セクレターゼ阻害剤である、実施態様90に記載の方法。
(95) 前記γ−セクレターゼ阻害剤がL−685,458である、実施態様94に記載の方法。
(96) L−685,458を約0.1μM〜約100μMの濃度で使用する、実施態様94に記載の方法。
(97) 前記TGF−βR−1経路を阻害する因子が、TGF−βR−1キナーゼの阻害剤である、実施態様90に記載の方法。
(98) 前記TGF−βR−1シグナル伝達経路を阻害する因子が、TGF−βR−1キナーゼの阻害剤である、実施態様97に記載の方法。
(99) 前記TGF−βR−1キナーゼを、約0.1μM〜約100μMの濃度で使用する、実施態様98に記載の方法。
(100) 前記TGF−βR−1キナーゼの阻害剤が、2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジンである、実施態様98に記載の方法。
(102) 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、BMPを阻害可能な因子及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で更に処理する、実施態様90に記載の方法。
(103) 膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を生成する方法において、
a.多能性幹細胞を培養する工程と、
b.前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
c.前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法。
(104) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で処理することによって行われる、実施態様103に記載の方法。
(105) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約6日間処理する、実施態様104に記載の方法。
(106) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約6日間処理する、実施態様104に記載の方法。
(107) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約3日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びにFGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約4日間処理する、実施態様104に記載の方法。
(108) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約3日間処理する、実施態様107に記載の方法。
(109) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約4日間処理する、実施態様107に記載の方法。
(110) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約3日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約4日間処理する、実施態様104に記載の方法。
(112) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約4日間処理する、実施態様110に記載の方法。
(113) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約3日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、ネトリン、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約4日間処理する、実施態様104に記載の方法。
(114) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約3日間処理する、実施態様113に記載の方法。
(115) 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、ネトリン、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約4日間処理する、実施態様113に記載の方法。
(116) FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される前記因子が、FGF−7である、実施態様104に記載の方法。
(117) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約50pg/ml〜約50μg/mlの濃度のFGF−7で処理する、実施態様116に記載の方法。
(118) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、20ng/mlの濃度のFGF−7で処理する、実施態様116に記載の方法。
(119) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約1nM〜約1mMの濃度のレチノイン酸で処理する、実施態様104に記載の方法。
(120) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、1μMの濃度のレチノイン酸で処理する、実施態様104に記載の方法。
(122) シクロパミンを約0.1μM〜約10μMの濃度で使用する、実施態様121に記載の方法。
(123) シクロパミンを0.25μMの濃度で使用する、実施態様121に記載の方法。
(124) 前記BMPを阻害可能な因子がBMP4阻害剤である、実施態様104に記載の方法。
(125) 前記BMP4阻害剤がノギンである、実施態様124に記載の方法。
(126) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約500ng/ml〜約100μg/mlの濃度のノギンで処理する、実施態様124に記載の方法。
(127) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、100ng/mlの濃度のノギンで処理する、実施態様124に記載の方法。
(128) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約500ng/ml〜約100μg/mlの濃度のネトリンで処理する、実施態様104に記載の方法。
(129) 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を100ng/mlの濃度のネトリンで処理する、実施態様104に記載の方法。
(130) 前記ネトリンが、ネトリン1、ネトリン2、及びネトリン4からなる群から選択される、実施態様104に記載の方法。
Claims (130)
- 多能性幹細胞からグルコース刺激インスリン分泌能を有する細胞を生成するための方法において、
a.前記多能性幹細胞を培養する工程と、
b.前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
c.前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
d.前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法。 - 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で処理することによって行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約6日間処理する、請求項2に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約6日間処理する、請求項2に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約3日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びにFGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約4日間処理する、請求項2に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約3日間処理する、請求項5に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約4日間処理する、請求項5に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約3日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約4日間処理する、請求項2に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約3日間処理する、請求項8に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約4日間処理する、請求項8に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約3日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、ネトリン、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約4日間処理する、請求項2に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約3日間処理する、請求項11に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、ネトリン、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約4日間処理する、請求項11に記載の方法。
- FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される前記因子が、FGF−7である、請求項2に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約50pg/ml〜約50μg/mlの濃度のFGF−7で処理する、請求項14に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、20ng/mlの濃度のFGF−7で処理する、請求項14に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約1nM〜約1mMの濃度のレチノイン酸で処理する、請求項2に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、1μMの濃度のレチノイン酸で処理する、請求項2に記載の方法。
- 前記ソニックヘッジホッグ阻害剤がシクロパミンである、請求項2に記載の方法。
- シクロパミンを約0.1μM〜約10μMの濃度で使用する、請求項19に記載の方法。
- シクロパミンを0.25μMの濃度で使用する、請求項19に記載の方法。
- 前記BMPを阻害可能な因子がBMP4阻害剤である、請求項2に記載の方法。
- 前記BMP4阻害剤がノギンである、請求項22に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約500ng/ml〜約100μg/mlの濃度のノギンで処理する、請求項22に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、100ng/mlの濃度のノギンで処理する、請求項22に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約500ng/ml〜約100μg/mlの濃度のネトリンで処理する、請求項2に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を100ng/mlの濃度のネトリンで処理する、請求項2に記載の方法。
- 前記ネトリンが、ネトリン1、ネトリン2、及びネトリン4からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、TGF−βR−1経路を阻害する因子で処理することによって行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、TGF−βR−1経路を阻害する因子で約1〜約12日間処理する、請求項29に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、TGF−βR−1経路を阻害する因子で約5〜約12日間処理する、請求項29に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、TGF−βR−1経路を阻害する因子で約12日間処理する、請求項29に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1経路を阻害する因子が、TGF−βR−1キナーゼの阻害剤である、請求項29に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1シグナル伝達経路を阻害する因子が、TGF−βR−1キナーゼの阻害剤である、請求項33に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1キナーゼを、約0.1μM〜約100μMの濃度で使用する、請求項34に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1キナーゼの阻害剤が、2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジンである、請求項34に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1キナーゼの阻害剤が、[3−(ピリジン−2−イル)−4−(4−キノニル)]−1H−ピラゾールである、請求項34に記載の方法。
- 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、BMPを阻害可能な因子及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で更に処理する、請求項29に記載の方法。
- 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子、及びTGF−βR−1経路を阻害する因子で処理することによって行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びTGF−βR−1経路を阻害する因子で約1〜約12日間処理する、請求項39に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びTGF−βR−1経路を阻害する因子で約5〜約12日間処理する、請求項39に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びTGF−βR−1経路を阻害する因子で約12日間処理する、請求項39に記載の方法。
- 前記ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子が、γ−セクレターゼ阻害剤である、請求項39に記載の方法。
- 前記γ−セクレターゼ阻害剤がL−685,458である、請求項43に記載の方法。
- L−685,458を約0.1μM〜約100μMの濃度で使用する、請求項43に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1経路を阻害する因子が、TGF−βR−1キナーゼの阻害剤である、請求項39に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1シグナル伝達経路を阻害する因子が、TGF−βR−1キナーゼの阻害剤である、請求項46に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1キナーゼを、約0.1μM〜約100μMの濃度で使用する、請求項47に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1キナーゼの阻害剤が、2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジンである、請求項47に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1キナーゼの阻害剤が、[3−(ピリジン−2−イル)−4−(4−キノニル)]−1H−ピラゾールである、請求項47に記載の方法。
- 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、BMPを阻害可能な因子及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で更に処理する、請求項29に記載の方法。
- 多能性幹細胞からグルコース刺激インスリン分泌能を有する細胞を生成するための方法において、
a.前記多能性幹細胞を培養する工程と、
b.前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
c.前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
d.前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法。 - 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で処理することによって行われる、請求項52に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約6日間処理する、請求項53に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約6日間処理する、請求項53に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約3日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びにFGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約4日間処理する、請求項53に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約3日間処理する、請求項56に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約4日間処理する、請求項56に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約3日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約4日間処理する、請求項53に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約3日間処理する、請求項59に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約4日間処理する、請求項59に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約3日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、ネトリン、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約4日間処理する、請求項53に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約3日間処理する、請求項62に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、ネトリン、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約4日間処理する、請求項62に記載の方法。
- FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される前記因子が、FGF−7である、請求項53に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約50pg/ml〜約50μg/mlの濃度のFGF−7で処理する、請求項65に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、20ng/mlの濃度のFGF−7で処理する、請求項65に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約1nM〜約1mMの濃度のレチノイン酸で処理する、請求項53に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、1μMの濃度のレチノイン酸で処理する、請求項53に記載の方法。
- 前記ソニックヘッジホッグ阻害剤がシクロパミンである、請求項53に記載の方法。
- シクロパミンを約0.1μM〜約10μMの濃度で使用する、請求項70に記載の方法。
- シクロパミンを0.25μMの濃度で使用する、請求項70に記載の方法。
- 前記BMPを阻害可能な因子がBMP4阻害剤である、請求項53に記載の方法。
- 前記BMP4阻害剤がノギンである、請求項73に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約500ng/ml〜約100μg/mlの濃度のノギンで処理する、請求項73に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、100ng/mlの濃度のノギンで処理する、請求項73に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約500ng/ml〜約100μg/mlの濃度のネトリンで処理する、請求項53に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を100ng/mlの濃度のネトリンで処理する、請求項53に記載の方法。
- 前記ネトリンが、ネトリン1、ネトリン2、及びネトリン4からなる群から選択される、請求項53に記載の方法。
- 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、TGF−βR−1経路を阻害する因子で処理することによって行われる、請求項52に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、TGF−βR−1経路を阻害する因子で約1〜約12日間処理する、請求項80に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、TGF−βR−1経路を阻害する因子で約5〜約12日間処理する、請求項80に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、TGF−βR−1経路を阻害する因子で約12日間処理する、請求項80に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1経路を阻害する因子が、TGF−βR−1キナーゼの阻害剤である、請求項80に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1シグナル伝達経路を阻害する因子が、TGF−βR−1キナーゼの阻害剤である、請求項84に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1キナーゼを、約0.1μM〜約100μMの濃度で使用する、請求項85に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1キナーゼの阻害剤が、2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジンである、請求項85に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1キナーゼの阻害剤が、[3−(ピリジン−2−イル)−4−(4−キノニル)]−1H−ピラゾールである、請求項85に記載の方法。
- 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、BMPを阻害可能な因子及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で更に処理する、請求項80に記載の方法。
- 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子、及びTGF−βR−1経路を阻害する因子で処理することによって行われる、請求項52に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びTGF−βR−1経路を阻害する因子で約1〜約12日間処理する、請求項90に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びTGF−βR−1経路を阻害する因子で約5〜約12日間処理する、請求項90に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びTGF−βR−1経路を阻害する因子で約12日間処理する、請求項90に記載の方法。
- 前記ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子が、γ−セクレターゼ阻害剤である、請求項90に記載の方法。
- 前記γ−セクレターゼ阻害剤がL−685,458である、請求項94に記載の方法。
- L−685,458を約0.1μM〜約100μMの濃度で使用する、請求項94に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1経路を阻害する因子が、TGF−βR−1キナーゼの阻害剤である、請求項90に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1シグナル伝達経路を阻害する因子が、TGF−βR−1キナーゼの阻害剤である、請求項97に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1キナーゼを、約0.1μM〜約100μMの濃度で使用する、請求項98に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1キナーゼの阻害剤が、2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジンである、請求項98に記載の方法。
- 前記TGF−βR−1キナーゼの阻害剤が、[3−(ピリジン−2−イル)−4−(4−キノニル)]−1H−ピラゾールである、請求項98に記載の方法。
- 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、BMPを阻害可能な因子及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で更に処理する、請求項90に記載の方法。
- 膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を生成する方法において、
a.多能性幹細胞を培養する工程と、
b.前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
c.前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法。 - 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で処理することによって行われる、請求項103に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約6日間処理する、請求項104に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、FGF−2、FGF−4、FGF−7、FGF−10、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約6日間処理する、請求項104に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約3日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びにFGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約4日間処理する、請求項104に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約3日間処理する、請求項107に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約4日間処理する、請求項107に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約3日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約4日間処理する、請求項104に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約3日間処理する、請求項110に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約4日間処理する、請求項110に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約3日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、ネトリン、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約1〜約4日間処理する、請求項104に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約3日間処理する、請求項113に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、BMPを阻害可能な因子、ネトリン、レチノイン酸、並びに、FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される少なくとも1種類の因子で約4日間処理する、請求項113に記載の方法。
- FGF−2、FGF−4、FGF−7、及びFGF−10からなる群から選択される前記因子が、FGF−7である、請求項104に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約50pg/ml〜約50μg/mlの濃度のFGF−7で処理する、請求項116に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、20ng/mlの濃度のFGF−7で処理する、請求項116に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約1nM〜約1mMの濃度のレチノイン酸で処理する、請求項104に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、1μMの濃度のレチノイン酸で処理する、請求項104に記載の方法。
- 前記ソニックヘッジホッグ阻害剤がシクロパミンである、請求項104に記載の方法。
- シクロパミンを約0.1μM〜約10μMの濃度で使用する、請求項121に記載の方法。
- シクロパミンを0.25μMの濃度で使用する、請求項121に記載の方法。
- 前記BMPを阻害可能な因子がBMP4阻害剤である、請求項104に記載の方法。
- 前記BMP4阻害剤がノギンである、請求項124に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約500ng/ml〜約100μg/mlの濃度のノギンで処理する、請求項124に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、100ng/mlの濃度のノギンで処理する、請求項124に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約500ng/ml〜約100μg/mlの濃度のネトリンで処理する、請求項104に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を100ng/mlの濃度のネトリンで処理する、請求項104に記載の方法。
- 前記ネトリンが、ネトリン1、ネトリン2、及びネトリン4からなる群から選択される、請求項104に記載の方法。
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