CN101861386A - 人胚胎干细胞的分化 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了促进多能干细胞分化的方法。具体地讲，本发明提供了形成胰腺内胚层、胰腺激素表达细胞以及胰腺激素分泌细胞的改进方法。本发明还提供了在不使用饲养细胞层的情况下促进多能干细胞分化的方法。

Description

人胚胎干细胞的分化
技术领域
本专利申请是2007年4月18日提交的美国专利申请No.11/736,908的部分继续申请，其要求2006年4月28日提交的美国临时申请No.60/745,899、2006年9月30日提交的美国临时申请No.60/827,695以及2006年12月29日提交的美国临时申请No.60/882,670的优先权，这些临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。
本发明提供促进多能干细胞分化的方法。具体地讲，本发明提供形成胰腺内胚层、胰腺激素表达细胞和胰腺激素分泌细胞的改进方法。本发明还提供在不使用饲养细胞层的情况下促进多能干细胞分化的方法。
背景技术
由于I型糖尿病细胞替代疗法的进步和可移植胰岛数量的不足，人们已重点关注于开发适于移植的胰岛素生成细胞或β细胞来源。一种方法是从多能干细胞(例如为胚胎干细胞)产生功能性β细胞。
在脊椎动物胚胎发育中，多能细胞在已知为原肠胚形成的过程中产生一群包括三胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞。例如为甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏组织将由内胚层经过中间阶段发育而成。这一过程中的中间阶段是定形内胚层的形成。定形内胚层细胞表达多种标志物，例如HNF-3β、GATA4、Mixl1、CXCR4和Sox-17。
由定形内胚层分化成的胰腺内胚层形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰十二指肠同源盒基因Pdx1。在不存在Pdx1的情况下，胰腺不能超越腹胰芽和背胰芽的形成而发育。因此，Pdx1的表达标志着胰腺器官形成中的关键步骤。除了其他类型的细胞以外，成熟胰腺还包含外分泌组织和内分泌组织。外分泌组织和内分泌组织由胰腺内胚层分化形成。
据报道，具有胰岛细胞特征的细胞衍生自小鼠胚胎细胞。例如，Lumelsky等人(Science 292：1389，2001)记录了小鼠胚胎干细胞分化出类似于胰岛细胞的胰岛素分泌结构。Soria等人(Diabetes 49：157，2000)记录了衍生自小鼠胚胎干细胞的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠血糖正常化。
在一个实例中，Hori等人(PNAS 99：16105，2002)公开了用磷脂酰肌醇3-激酶(LY294002)的抑制剂处理小鼠胚胎干细胞得到类似b细胞的细胞。
又如，Blyszczuk等人(PNAS 100：998，2003)记录了从组成性表达Pax4的小鼠胚胎干细胞产生胰岛素生成细胞。
Micallef等人记录了视黄酸可以调控胚胎干细胞的定型以形成Pdx1阳性胰腺内胚层细胞。在胚胎干细胞分化的第4天(对应于胚胎中的原肠胚形成末期)将视黄酸添加到培养基中，此时视黄酸诱导Pdx1表达最有效(Diabetes 54：301，2005)。
Miyazaki等人记录了过量表达Pdx1的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果表明外源Pdx1的表达明显增强了所得分化细胞中胰岛素、生长抑素、葡糖激酶、神经元素3、P48、Pax6和HNF6基因的表达(Diabetes 53：1030，2004)。
Skoudy等人记录了激活素A(TGFβ超家族的成员)上调了小鼠胚胎干细胞中的外分泌胰腺基因(p48和淀粉酶基因)和内分泌基因(Pdx1、胰岛素和高血糖素)的表达。使用1nM激活素A时观察到最大效应。他们也观察到胰岛素和Pdx1 mRNA的表达水平不受视黄酸影响；然而，3nMFGF7处理导致Pdx1的转录水平提高(Biochem.J.379：749，2004)。
Shiraki等人研究了特别地增强胚胎干细胞分化为Pdx1阳性细胞的生长因子的效应。他们观察到TGFβ2可再现地得出较高比例的Pdx1阳性细胞(Genes Cells.2005-6；10(6)：503-16.)。
Gordon等人证实了在不存在血清的情况下和在存在激活素连同Wnt信号抑制剂的情况下，从小鼠胚胎干细胞诱导brachyury+/HNF-3β+内胚层细胞(US 2006/0003446A1)。
Gordon等人(PNAS，Vol 103，page 16806，2006(国家科学院院刊，第103卷，第16806页，2006年))提出“前原条的形成需要同时伴有Wnt和TGF-β/nodal/激活素信号”。
然而，小鼠胚胎干细胞发育模型未必能准确模拟高等哺乳动物(例如为人类)的发育程序。
Thomson等人从人囊胚中分离出胚胎干细胞(Science 282：114，1998)。同时，Gearhart及其同事从胎儿性腺组织衍生人胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998)。与小鼠胚胎干细胞不同(其只是通过采用白血病抑制因子(LIF)进行培养便可抑制分化)，人胚胎干细胞必须在十分特殊的条件下培养(美国专利No.6,200,806；WO 99/20741；WO 01/51616)。
D’Amour等人描述了在存在高浓度激活素和低血清的情况下，制备由人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞的增菌培养基(D’Amour KA等人，2005年)。将这些细胞移植到小鼠肾被膜下导致了分化为具有某些内胚层器官特征的更为成熟的细胞。在添加FGF-10之后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞可以进一步分化成Pdx1阳性细胞(US 2005/0266554A1)。
D’Amour等人(Nature Biotechnology(《自然生物技术》)-24，1392-1401(2006))声称：“我们已开发出将人胚胎干细胞(hES)转化成能合成胰腺激素胰岛素、高血糖素、生长抑素、胰多肽和生长激素释放肽的内分泌细胞的分化方法。该方法通过引导细胞经过类似于定形内胚层、肠管内胚层、胰腺内胚层和内分泌前体的阶段转变为表达内分泌激素的细胞来模拟体内胰腺器官发生。”
又如，Fisk等人记录了用于从人胚胎干细胞制备胰岛细胞的体系(US2006/0040387A1)。在这种情况下，分化途径划分为三个阶段。首先，使用正丁酸盐和激活素A的组合，使人胚胎干细胞分化为内胚层。然后，与EGF或β细胞素结合采用TGFβ拮抗剂(例如Noggin)培养细胞，以生成Pdx1阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。
在一个实例中，Benvenistry等人声称：“我们得出如下结论：Pdx1的过量表达增强了胰富集基因的表达，胰岛素表达的诱导可能需要仅存在于体内的额外的信号。”(Benvenistry等人，Stem Cells 2006；24：1923-1930)。
因此，仍然非常需要开发用于建立可被扩增以满足当前临床需要的多能干细胞系的条件，同时保持分化为胰腺内分泌细胞、胰腺激素表达细胞或胰腺激素分泌细胞的潜能。我们已采用替代方法，以提高使人胚胎干细胞朝胰腺内分泌细胞分化的效率。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供了用于分化多能干细胞的方法，该方法包括如下步骤：
a.培养多能干细胞；以及
b.使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞；
c.使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达所述胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞；以及
d.使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
在一个实施例中，通过如下方法中的任何一种处理多能干细胞，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞从多能干细胞分化而成：
a.在不存在血清的情况下，在含有激活素A的培养基中培养多能干细胞，然后用激活素A和血清培养细胞，再用激活素A和不同浓度的血清培养细胞；或
b.在不存在血清的情况下，在含有激活素A的培养基中培养多能干细胞，然后用激活素A和另一个浓度的血清培养细胞；或
c.在不存在血清的情况下，在含有激活素A和Wnt配体的培养基中培养多能干细胞，然后清除Wnt配体，再用激活素A和血清培养细胞；或
d.在涂布有细胞外基质的组织培养基质上培养多能干细胞，并用激活素A和Wnt配体培养多能干细胞；或
e.在涂布有细胞外基质的组织培养基质上培养多能干细胞，然后在具有激活素A和Wnt配体的含有血清的第一培养基中培养多能干细胞，再在具有激活素A的含有血清的第二培养基中培养多能干细胞；或
f.在涂布有细胞外基质的组织培养基质上培养多能干细胞，然后在具有激活素A和Wnt配体的含有血清的第一培养基中培养多能干细胞，再在具有激活素A和Wnt配体的含有不同浓度血清的第二培养基中培养多能干细胞；或
g.在补充有B27并含有Wnt配体和激活素A的培养基中培养多能干细胞；或
h.在涂布有细胞外基质的组织培养基质上培养多能干细胞，培养基补充有B27，并含有激活素A。
在一个实施例中，通过如下方法中的任何一种处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，使表达胰腺内胚层细胞特征性标志物的细胞由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化而成：
a.用成纤维细胞生长因子和刺猬蛋白信号通道抑制剂处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后清除含有成纤维细胞生长因子和刺猬蛋白信号通道抑制剂的培养基，随后在含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和刺猬蛋白信号通道抑制剂的培养基中培养细胞；或
b.用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞；或
c.用视黄酸处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后清除视黄酸，随后用至少一种成纤维细胞生长因子处理细胞。
在一个实施例中，通过如下方法中的任何一种处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞由表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化而成：
a.在含有DAPT和exendin 4(肠促胰岛素类似物)的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后清除含有DAPT和exendin4的培养基，随后在含有exendin 1、IGF-1和HGF的培养基中培养细胞；或
b.在含有exendin 4的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后清除含有exendin 4的培养基，随后在含有exendin 1、IGF-1和HGF的培养基中培养细胞；或
c.在含有DAPT和exendin 4的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞；或
d.在含有exendin 4的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞；或
e.用抑制Notch信号通道的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在一个实施例中，本发明提供了治疗糖尿病患者的方法，该方法包括如下步骤：
a.培养多能干细胞；
b.使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞；
c.使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞；
d.使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化为β细胞谱系的细胞；以及
e.将β细胞谱系的细胞移植到患者体内。
附图说明
图1中，屏面a示出在用100ng/ml激活素A进行处理两天、五天和八天后，定形内胚层标志物CXCR4、GATA4、HNF-3β、Mixl1、Sox-17在人胚胎干细胞系H9中的表达。定形内胚层标志物的表达在mRNA水平上被分析，并归一化到未处理的人胚胎干细胞中的表达水平。屏面b示出在用100ng/ml激活素A进行处理三天和五天后，前内胚层标志物Cerberus、Otx-1和Hex基因在人胚胎干细胞系H9中的表达。
图2示出在用100ng/ml激活素A进行处理五天后，定形内胚层标志物在人胚胎干细胞系H9中的表达。通过免疫组织化学方法检测定形内胚层标志物的表达。屏面(a)示出Sox-17的表达。屏面(b)示出HNF-3β的表达。屏面(c)示出Oct3/4的表达。
图3示出在执行步进式分化方案后，定形内胚层标志物在人胚胎干细胞系H9中的表达。定形内胚层标志物的表达在mRNA水平上被分析，并归一化到未处理的人胚胎干细胞中的表达水平。屏面(a)示出GATA4的表达。屏面(b)示出Sox-17的表达。屏面(c)示出HNF-3β的表达。屏面(d)示出Mixl1的表达。标记为“AA”的数据点表示激活素A处理时间为一天(1d)、三天(3d)、五天(5d)或七天(7d)。标记为“UT”的数据点表示培养了一天(1d)、三天(3d)、五天(5d)或七天(7d)的空白对照。
图4示出在执行步进式分化方案后，胚外内胚层标志物在人胚胎干细胞系H9中的表达。胚外内胚层标志物的表达在mRNA水平上被分析，并归一化到未处理的人胚胎干细胞中的表达水平。屏面(a)示出100ng/ml激活素A对AFP表达的影响。屏面(b)示出100ng/ml激活素A对Sox7表达的影响。标记为“AA”的数据点表示激活素A处理时间为一天(1d)、三天(3d)、五天(5d)或七天(7d)。标记为“UT”的数据点表示培养了一天(1d)、三天(3d)、五天(5d)或七天(7d)的空白对照。
图5示出在执行步进式分化方案后，中胚层和外胚层标志物在人胚胎干细胞系H9中的表达。中胚层和外胚层标志物的表达在mRNA水平上被分析，并归一化到未处理的人胚胎干细胞中的表达水平。屏面(a)示出100ng/ml激活素A对Brachyury表达的影响。屏面(b)示出100ng/ml激活素A对Zic1表达的影响。标记为“AA”的数据点表示激活素A处理时间为一天(1d)、三天(3d)、五天(5d)或七天(7d)。标记为“UT”的数据点表示培养了一天(1d)、三天(3d)、五天(5d)或七天(7d)的空白对照。
图6示出在用100ng/ml激活素A处理一天、三天、五天和七天后，定形内胚层标志物Brachyury(屏面a)、CXCR4(屏面b)、Mixl1(屏面c)、Sox17(屏面d)、HNF-3β(屏面e)、Oct4(屏面f)在人胚胎干细胞系H7中的表达。定形内胚层标志物的表达在mRNA水平被分析，并归一化到未处理的人胚胎干细胞中的表达水平。
图7示出在应用分化方案后，定形内胚层标志物在人胚胎干细胞系H9中的表达。通过免疫组织化学方法检测定形内胚层标志物的表达。屏面(a)和屏面(b)示出Sox-17的表达。屏面(c)和屏面(d)示出HNF-3β的表达。屏面(e)和屏面(f)示出GATA4的表达。屏面(b)、屏面(d)和屏面(f)示出采用DAPI进行的细胞核复染法。标记为“处理过”的柱形图表示激活素A(100ng/ml)处理时间为五天。标记为“未处理”的柱形图表示空白对照。
图8示出在应用第二种分化方案后，胰腺内胚层标志物在人胚胎干细胞系H9中的表达。胰腺内胚层标志物的表达通过PCR分析，并归一化到用激活素A处理的人胚胎干细胞中的表达水平。屏面(a)示出Pdx1的表达。屏面(b)示出GLUT-2的表达。屏面(c)示出PTF1a的表达。
图9示出在应用第二种分化方案后，胰腺内胚层标志物在人胚胎干细胞系H9中的表达。通过免疫组织化学方法检测胰腺内胚层标志物的表达。屏面(a)示出空白对照中Pdx1的表达，而屏面(b)示出采用步进式分化方案培养的细胞中Pdx1的表达。
图10示出在应用第三种分化方案后，胰腺内分泌标志物在人胚胎干细胞系H9中的表达。胰腺内分泌标志物的表达通过PCR分析，并归一化到用激活素A处理的人胚胎干细胞中的表达水平。屏面(a)示出NeuroD1的表达。屏面(b)示出Ngn3的表达。屏面(c)示出胰岛素的表达。屏面(d)示出Hes-1的表达，表达水平归一化到胰腺内胚层细胞的表达水平。
图11示出在应用分化方案后，胰腺内胚层标志物在人胚胎干细胞系H9中的表达。胰腺内胚层标志物的表达通过PCR分析，并归一化到用激活素A处理的人胚胎干细胞中的表达水平。屏面(a)示出Nkx2.2的表达。屏面(b)示出Pdx1的表达。
图12示出培养基中每一传代(P0、P1和P2)细胞的PDX-1表达。PDX-1的表达通过PCR分析，并归一化到用激活素A处理的人胚胎干细胞H9中的表达水平。
图13示出在应用第三种分化方案后，肝细胞标志物在人胚胎干细胞系H9中的表达。肝细胞标志物的表达通过PCR分析，并归一化到用激活素A处理的人胚胎干细胞中的表达水平。屏面(a)示出AFP的表达。屏面(b)示出白蛋白的表达。
图14示出多能标志物在人胚胎干细胞系H9中的表达。通过免疫组织化学方法分析多能标志物的表达。屏面(a)示出Oct-4的表达。屏面(b)示出碱性磷酸酶的表达。
图15示出人胚胎细胞系H9的染色体核型。确定了小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养的、传代数为P36的细胞的染色体核型。
图16描绘本发明分化方案的概要，其中人胚胎干细胞在无饲养层的体系中分化成定形内胚层。
图17描绘传代数为44的人胚胎干细胞系H9的FACS图，在浓度变化的MATRIGEL上进行培养，并采用低血清(0.5-2％)和高激活素A(100ng/ml)处理5天。定形内胚层标志物CXCR4(CD184)的表达在Y轴上示出，胚胎干细胞标志物CD9的表达在X轴上示出。
图18示出定形内胚层标志物的实时PCR结果，标志物来自于传代数为44的人胚胎干细胞系H9的培养物，培养体系分别是稀释度为1∶10的MATRIGEL(■)、稀释度为1∶20的MATRIGEL(■)或稀释度为1∶30的MATRIGEL(□)，采用实例14中公开的分化方案进行处理。诱导倍数是相对于传代数为44的人胚胎干细胞系H9的未分化细胞的诱导倍数，该细胞系在使用小鼠胚胎成纤维细胞调节过的培养基中培养。
图19示出未分化多能干细胞和从分化多能干细胞获得的定形内胚层细胞的全基因表达散点图。所示数据来自小鼠胚胎成纤维细胞上培养的、传代数为44的人胚胎干细胞系H9的培养物(右屏面)和MATRIGEL上培养的、传代数为83的人胚胎干细胞系H9的培养物(左屏面)。
图20示出用实例4中公开的定形内胚层分化方案进行处理并在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养至第5天时人胚胎干细胞系H1(屏面a)、人胚胎干细胞系H7(屏面b)和人胚胎干细胞系H9(屏面c)中CXCR4的表达，通过FACS进行测定。
图21示出小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养的人胚胎干细胞系H7(屏面a)和人胚胎干细胞系H9(屏面b)的培养物中，指定定形内胚层标志物表达的实时PCR结果。结果以相对于未分化细胞的增加倍数表示。
图22示出用实例4中公开的定形内胚层分化方案处理并且在MATRIGEL(1∶30稀释度)上培养至第5天时人胚胎干细胞系H1(屏面a)、人胚胎干细胞系H7(屏面b)和人胚胎干细胞系H9(屏面c)中CXCR4的表达，通过FACS进行测定。
图23示出在人胚胎干细胞系H7(屏面a)、人胚胎干细胞系H9(屏面b)和人胚胎干细胞系H1(屏面c)的培养物中，指定定形内胚层标志物表达的实时PCR结果。结果以相对于未分化细胞的增加倍数表示。根据实例4中公开的方法处理细胞。
图24示出在存在100ng/ml激活素A(屏面a)或100ng/ml激活素A+20ng/ml的Wnt-3a(屏面b)的情况下的培养基中、传代数为46的人胚胎干细胞系H9培养物的相差图。细胞处理五天。
图25示出在根据实例4中公开的方法进行处理后，通过FACS测定的传代数为44的人胚胎干细胞系H7(屏面a和屏面b)和传代数为46的人胚胎干细胞系H9(屏面c和屏面d)培养物中CXCR4的表达。屏面b和屏面d示出20ng/ml的Wnt-3a对CXCR4表达的影响。屏面a和屏面c示出在不存在Wnt-3a的情况下CXCR4的表达。在处理完成5天后获得结果。
图26示出人胚胎干细胞系H7(屏面a)和H9(屏面b)培养物中指定基因的表达的实时PCR数据。培养物用实例4中公开的分化方案处理。另外检测了Wnt激动剂Wnt-3a(20ng/ml)、Wnt-5a(20ng/ml)和Wnt-7a(20ng/ml)的作用，如屏面所示。细胞处理5天。结果以相对于未分化细胞的增加倍数表示。
图27示出处理完成五天后，通过FACS测定的传代数为46的人胚胎干细胞系H9培养物中CXCR4的表达。屏面(a)示出在不存在Wnt-3a的情况下CXCR4的表达。屏面(b)示出在用10ng/ml的Wnt-3a处理后CXCR4的表达。屏面(c)示出在用20ng/ml的Wnt-3a处理后CXCR4的表达，而屏面(d)示出在用50ng/ml的Wnt-3a处理后CXCR4的表达。
图28示出处理5天后，人胚胎干细胞系H9培养物中指定定形标志物的表达。结果示出为相对于未处理细胞表达水平的增加倍数，通过实时PCR测定。屏面(a)示出10、20和50ng/ml的Wnt-3a对指定定形内胚层标志物基因表达的影响。屏面(b)示出在处理完成两天(2d)和5天(5d)后，1、5或10ng/ml的Wnt-3a(x轴标签：10、5、1)对goosecoid(■)和CXCR4(□)表达的影响。屏面(c)示出在两天(□)或5天(■)后1、5或10ng/ml的Wnt-3a对细胞数量的影响。
图29示出在用实例4中公开的分化方案处理5天后，通过FACS测定的人胚胎干细胞系H9培养物中CXCR4的表达。细胞在不存在Wnt-3a或GSK-3B抑制剂(屏面a)的情况下培养、整个5天使用20ng/ml的Wnt-3a(屏面b)、整个5天使用1000nM的GSK-3B抑制剂IX(屏面c)、整个5天使用500nM的GSK-3B抑制剂IX(屏面d)、整个5天使用100nM的GSK-3B抑制剂IX(屏面e)、整个5天使用10nM的GSK-3B抑制剂IX(屏面f)、第1-2天使用100nM的GSK-3B抑制剂IX(屏面g)、第1-2天使用10nM的GSK-3B抑制剂IX(屏面h)。
图30示出通过实时PCR测定的定形内胚层标志物的基因表达。结果以相对于未处理细胞的增加倍数表示。屏面(a)示出得自传代数为48的人胚胎干细胞系H9的数据，根据实例4中公开的定形内胚层方案进行处理，包含在指定浓度和时间的条件下的Wnt-3a或GSK-3B抑制剂。屏面(b)示出得自传代数为46的人胚胎干细胞系H9的数据，根据实例4中公开的定形内胚层方案进行处理，包含在指定浓度和时间的条件下的Wnt-3a或GSK-3B抑制剂。
图31示出通过FACS测定的本发明所用胚胎干细胞系中CXCR4的表达。屏面(a-d)示出得自传代数为49的人胚胎干细胞系H9的数据。屏面(e-f)示出得自传代数为46的人胚胎干细胞系H1的数据。数据在处理完成5天后获取。细胞处理条件如下：屏面(a)：使用10ng/ml激活素A处理整个五天，在最初两天加入20ng/ml的Wnt-3a；屏面(b)：使用100ng/ml激活素A处理整个五天，在最初两天加入20ng/ml的Wnt-3a；屏面(c)：使用100ng/ml激活素A处理整个五天，在最初两天加入100nM的GSK-3B抑制剂IX；屏面(d)：使用10ng/ml激活素A处理整个五天，在最初两天加入100nM的GSK-3B抑制剂IX；屏面(e)：使用100ng/ml激活素A处理整个五天，在最初两天加入20ng/ml的Wnt-3a；以及屏面(f)：使用10ng/ml激活素A处理整个五天，在最初两天加入20ng/ml的Wnt-3a。
图32示出通过实时PCR测定的传代数为49的人胚胎干细胞系H9培养物中定形内胚层标志物的基因表达；细胞用10、50、或100ng/ml激活素A加入20ng/ml的Wnt-3a处理：屏面(a)：AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF-3B和POU5F(Oct-4)的表达；屏面(b)：SOX-17和GATA4的表达。结果表示为相对于未处理细胞的增加倍数。
图33示出通过FACS测定的传代数为53的胚胎干细胞系H9中CXCR4的表达。数据在处理完成5天后获取。细胞处理条件如下：屏面(a)：使用100ng/ml激活素A处理整个五天，在最初两天加入20ng/ml的Wnt-3a，第3-5天加入25ng/ml的BMP-4；屏面(b)：使用100ng/ml激活素A处理整个五天，在最初两天加入20ng/ml的Wnt-3a；屏面(c)：使用100ng/ml激活素A处理整个五天，在最初两天加入100nM的GSK-3B抑制剂IX；屏面(d)：使用20ng/ml的Wnt-3a+25ng/ml的BMP-4处理整个五天；屏面(e)：使用100ng/ml激活素A处理整个五天，在最初两天加入20ng/ml的Wnt-3a+100nM的GSK-3B抑制剂IX；以及屏面(f)：使用100ng/ml激活素A+25ng/ml的BMP-4处理整个五天。就所有屏面而言，X轴都表示CD9的表达，Y轴都表示CXCR4(CD184)的表达。
图34示出通过实时PCR测定的传代数为46的人胚胎干细胞系H1培养物中定形内胚层标志物的基因表达；细胞用10或100ng/ml激活素A和20ng/ml的Wnt-3a或100nM的GSK-3B抑制剂处理；屏面(a)：AFP、Bry、CXCR4、GSC和POU5F(Oct-4)的表达；屏面(b)：SOX-17、HNF-3B和GATA4的表达。结果以相对于未处理细胞的增加倍数表示。
图35示出通过实时PCR测定的传代数为49的人胚胎干细胞系H9培养物中定形内胚层标志物的基因表达；细胞用50或100ng/ml激活素A和10或100nM的GSK-3B抑制剂处理；屏面(a)：AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF-3B和POU5F(Oct-4)的表达；屏面(b)：SOX-17和GATA4的表达。结果以相对于未处理细胞的增加倍数表示。
图36示出通过实时PCR测定的传代数为53的人胚胎干细胞系H9培养物中定形内胚层标志物的基因表达；细胞用激活素A、Wnt-3a、GSK-3抑制剂和BMP-4的组合处理五天；屏面(a)：AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF-3B和SOX7的表达；屏面(b)：SOX-17、HNF-3B和GATA4的表达。
图37示出通过FACS测定的、用实例22中所列条件处理的人胚胎干细胞系H9培养物中CXCR4的表达百分比。
图38示出通过FACS测定的、纤粘蛋白(屏面a)或MATRIGELTM(屏面b)上培养的人胚胎干细胞系H9培养物中定形内胚层标志物的表达。
图39示出通过实时PCR测定的、纤粘蛋白(□)或稀释度为1∶10的生长因子减少的MATRIGEL(■)上培养的人胚胎干细胞系H9培养物中定形内胚层标志物的表达。
图40示出在存在低血清、100ng/ml激活素A和20ng/ml的Wnt-3a的情况下，多种浓度的MATRIGEL如何影响人胚胎干细胞向定形内胚层的分化。根据实例4中公开的方法处理细胞。所示结果是通过实时PCR测定的指定基因的表达水平。
图41示出Wnt-3a在通过人胚胎干细胞形成定形内胚层中的作用，人胚胎干细胞在MATRIGEL上培养，但在小鼠胚胎成纤维细胞上分化。屏面(a-d)示出指定基因的实时PCR数据。屏面(e-g)示出指定条件下的FACS数据。
图42示出在用Wnt抑制剂DKK-1处理后，在涂布有MATRIGELTM的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞分化成定形内胚层。所示结果是通过实时PCR测定的H9细胞中指定基因的表达，该细胞在存在20ng/ml的Wnt-3a和100ng/ml的DKK1(DE+DKK1)的情况下或在不存在DKK1(DE)的情况下，根据实例4中公开的方法进行处理。
图43示出人胚胎干细胞系H9培养物中定形内胚层标志物的免疫荧光染色，该细胞在涂布有MATRIGEL的组织培养基质上培养，并且在没有(屏面a)或具有(屏面b)20ng/ml的Wnt-3a的条件下，在加入100ng/ml激活素A的低血清环境中分化。Ecad＝上皮细胞钙粘蛋白，NCAM＝神经性钙粘蛋白。
图44示出传代数为38的人胚胎干细胞系SA002分化成定形内胚层。以指定条件处理细胞五天后，通过实时PCR测定屏面中指定基因的表达。
图45示出在用100ng/ml激活素A(屏面a)、100ng/ml激活素A+20ng/ml的Wnt-3a(屏面b)、或100ng/ml激活素A+100nM的GSK-3B抑制剂IX(屏面c)进行处理后，通过FACS测定的传代数为38的人胚胎干细胞系SA002中CXCR4的表达。细胞处理时间为五天。
图46示出传代数为55的人胚胎干细胞系H1在涂布有人血清的组织培养基质上分化成定形内胚层。细胞用指定条件处理，通过实时PCR测定屏面中指定基因的表达。
图47示出在涂布有MATRIGELTM的组织培养基质上的传代数为54的人胚胎干细胞系H1培养物分化成定形内胚层。按照五天DE方案检测多种GSK-B抑制剂的作用。在最初两天的处理中，检测浓度为100nM的下列GSK-3B抑制剂的作用：GSK-3B VIII、IX、XI、和XII。
图48示出传代数为49的人胚胎干细胞系H9培养物中AFP(屏面a)、Pdx-1(屏面b)、Cdx-2和Glut-2(屏面c)、以及HNF-3β、HNF-6和生长抑素(屏面d)的表达，该细胞根据实例4中公开的方法，在处理的最初两天，在存在20ng/ml的Wnt-3a的情况下进行培养和处理。在该处理后，细胞用2％胎牛血清加入1mM视黄酸、0.1至1mM的TTNPB(4-[(E)-2-(5，6，7，8-四氢-5，5，8，8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯基]苯甲酸芳维甲酸)、或0.1至10mM的AM-580(4-[(5，6，7，8-四氢-5，5，8，8-四甲基-2-萘基)甲酰胺基]苯甲酸)处理额外的三天。下一步，细胞在2％胎牛血清加入20ng/ml的bFGF中处理额外的三天。
图49示出人胚胎干细胞系H1培养物中屏面a和屏面b中指定的定形内胚层标志物表达的实时PCR结果，该细胞用激活素A和Wnt-1在指定时间和浓度条件下进行处理。
图50示出将EXPRES01、BGO1V和H1 P50细胞系暴露于限定分化培养基中或低血清分化培养基中在第4-5天时通过FACS测定的CXCR4和CD9的表达。
图51显示用低血清或限定培养基+激活素A+WNT3A处理的EXPRES01、BGO1V和H1培养物在第4-5天时的实时PCR数据。
图52描绘用1％的b27+DM-F12+激活素A+WNT3A+GSK03B抑制剂处理五天后，EXPRES 01 P49细胞分化成DE的免疫荧光图。
图53示出暴露于不是低血清+激活素A就是限定培养基+激活素A的H1细胞在第1-5天的实时PCR数据。
具体实施方式
为使公开清楚明了、并且并非通过限制的方法，将本发明的具体实施方式分为以下几个小节：描述或图解本发明的某些特征、实施例或应用。
定义
干细胞是由它们在单细胞水平上自我更新和分化以产生后代细胞的能力定义的未分化细胞，这些后代细胞包括自我更新的祖细胞、非更新的祖细胞以及终末分化的细胞。干细胞的特征还在于它们能够在体外分化成多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的多种细胞谱系的功能细胞，以及在移植后产生多种胚层组织，并在注射进囊胚后形成基本上大部分(如果不是全部)组织。
干细胞根据其发育潜能分为：(1)全能，指能够产生所有的胚胎和胚胎外细胞类型；(2)多能，指能够产生所有的胚胎细胞类型；(3)多能，指能够产生细胞谱系的亚群，但在特定组织、器官或生理***内能产生所有的细胞(例如造血干细胞(HSC)可产生的后代细胞包括：HSC(自我更新)、局限于血细胞的寡能祖细胞以及作为血液正常组分的所有细胞类型和成分(如血小板))；(4)寡能，指能够产生比多能干细胞更具限制性的细胞谱系亚群；以及(5)单能，指能够产生单一细胞谱系(如生精干细胞)。
分化是非特化(“未定型的”)或较少特化的细胞获得特化细胞(例如为神经细胞或肌肉细胞)特征的过程。分化的或分化诱导的细胞是在细胞谱系内占据更特化(“定型的”)位置的细胞。当用于分化过程时，术语“定型的”是指如下所述的细胞：该细胞在分化途径中进行到某个点，它在正常环境下会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型的亚群，并且在正常环境下不能分化成不同的细胞类型或者退回到少分化的细胞类型。去分化是指细胞返回到细胞谱系中较少特化的(或定型的)位置的过程。如本文所用，细胞谱系定义细胞的遗传性，即源于何种细胞以及会产生什么细胞。细胞谱系将细胞置于发育和分化的遗传图内。谱系特异性标志物是指与关注的谱系细胞的表型特异性相关的特征，其可用于评估未定型的细胞向关注的谱系的分化。
如本文所用，“AFP”或“α-甲胎蛋白”是指在肝脏发育开始时产生的抗原。AFP另外可以在胚胎外细胞中表达。
“白蛋白”是可溶性单体蛋白，其构成成人中所有血清蛋白的约一半。
“β-细胞谱系”是指具有用于转录因子PDX-1和下列转录因子中的至少一种的阳性基因表达的细胞：NGN-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3β、MAFA、Pax4和Pax6。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞包括β细胞。
如本文所用，“Brachyury”是T-box基因家族成员。它是原条和中胚层细胞的标志物。
如本文所用，“表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞”是指表达下列标志物中的至少一种的细胞：SOX-17、GATA-4、HNF-3β、GSC、Cer1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4、CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA-6、CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。
“c-Kit”和“CD117”均指具有Genbank登录号X06182中所公开的序列或其天然存在的变体序列(如等位变体)的细胞表面受体酪氨酸激酶。
如本文所用，“CD99”是指由登录号为NM_002414的基因编码的蛋白。
如本文所用，“表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞”是指表达下列标志物中的至少一种的细胞：PDX-1、HNF-1β、PTF-1α、HNF-6或HB9。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内胚层细胞。
如本文所用，“表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞”是指表达下列标志物中的至少一种的细胞：NGN-3、NeuroD、Islet-1、PDX-1、NKX6.1、Pax-4、Ngn-3或PTF-1α。表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内分泌细胞、胰腺激素表达细胞、胰腺激素分泌细胞和β-细胞谱系的细胞。
如本文所用，“Cer1”或“Cerebrus”是半胱氨酸结蛋白质超家族的成员。
如本文所用，“CXCR4”是指基质细胞衍生因子1(SDF-1)受体，也称为“LESTR”或“融合素”。在形成原肠胚的小鼠胚胎中，CXCR4在定形内胚层和中胚层中表达，但不在胚外内胚层中表达。
如本文所用，“定形内胚层”是指下述细胞：在原肠胚形成期间具有来源于上胚层的细胞的特征，并形成胃肠道及其衍生物。定形内胚层细胞表达下列标志物：HNF-3β、GATA-4、SOX-17、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99和Mixl1。
如本文所用，“胚外内胚层”是指表达下列标志物中的至少一种的细胞群：SOX-7、AFP和SPARC。
如本文所用，“FGF-2”、“FGF-4”、“FGF-8”、“FGF-10”和“FGF-17”是成纤维细胞生长因子家族的成员。
“GATA-4”和“GATA-6”是GATA转录因子家族的成员。该转录因子家族由TGF-β信号诱导，并有助于早期内胚层标志物的维护。
如本文所用，“GLUT-2”是指葡萄糖转运分子，其在许多胎儿组织和成人组织(包括胰腺、肝脏、肠、脑和肾)中表达。
如本文所用，“Goosecoid”或“GSC”是指在胚孔背唇中表达的同源结构域转录因子。
如本文所用，“HB9”是指同源盒基因9。
“HNF-1α”、“HNF-1β”、“HNF-3β”和“HNF-6”属于转录因子的肝脏核因子家族，其特征在于高度保守的DNA结合域和两个短羧基端结构域。
如本文所用，“Islet-1”或“Isl-1”是转录因子的LIM/同源结构域家族的成员，并在发育中的胰腺中表达。
如本文所用，“MafA”是在胰腺中表达的转录因子，并控制胰岛素生物合成和分泌中涉及的基因的表达。
如本文所用，“标志物”是在关注的细胞中差异表达的核酸分子或多肽分子。在上下文中，差异表达意指对于阳性标志物来说水平增加，对于阴性标志物来说水平降低。与其他细胞相比，在关注的细胞中核酸或多肽标志物的可测水平充分地较高或较低，使得可使用本领域已知的多种方法中的任何一种辨别关注的细胞并将其与其他细胞区分开。
如本文所用，“中内胚层细胞”是指表达下列标志物中的至少一种的细胞：CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、SOX-17、DKK4、HNF-3β、GSC、FGF17、GATA-6。
如本文所用，“Mixl1”是指同源盒基因，其为原条、中胚层和内胚层中的细胞的标志物。
如本文所用，“NeuroD”是神经形成中牵涉的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子。
如本文所用，“NGN-3”是碱性环-螺旋-环转录因子神经元素家族的成员。
如本文所用，“Nkx-2.2”和“Nkx-6.1”是Nkx转录因子家族的成员。
如本文所用，“Nodal”是TGFβ蛋白质超家族的成员。
“Oct-4”是POU结构域转录因子的成员，并被广泛认为是多能干细胞的标志。Oct-4与多能干细胞的关系由其对未分化的多能干细胞的严格局限的表达所指出。分化到体细胞谱系时，Oct-4的表达很快消失。
如本文所用，“胰腺内分泌细胞”或“胰腺激素表达细胞”是指能够表达下列激素中的至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰腺多肽。
如本文所用，“胰腺激素分泌细胞”是指能够分泌下列激素中的至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰腺多肽。
如本文所用，“Pax-4”和“Pax-6”是胰岛发育中牵涉的胰腺b细胞特异性转录因子。
如本文所用，“PDX-1”是指胰腺发育中牵涉的同源结构域转录因子。
如本文所用，“前原条细胞”是指表达下列标志物中的至少一种的细胞：Nodal或FGF8
如本文所用，“原条细胞”是指表达下列标志物中的至少一种的细胞：Brachyury、Mix样同源盒蛋白或FGF4。
如本文所用，“PTF-1α”是指48kD的碱性螺旋-环-螺旋蛋白质，其为三聚胰腺转录因子-1(PTF1)的序列特异性DNA结合亚基。
如本文所用，“SOX-1”、“SOX-2”、“SOX-7”和“SOX-17”是SOX转录因子家族的成员，并在胚胎形成中被牵涉。
如本文所用，“SPARC”也称为“富含半胱氨酸酸性分泌蛋白”。
“SSEA-1”(阶段特异性胚胎抗原-1)是在鼠畸胎癌干细胞(EC)、鼠和人胚胎生殖细胞(EG)和鼠胚胎干细胞(ES)的表面上存在的糖脂表面抗原。
“SSEA-3”(阶段特异性胚胎抗原-3)是在人畸胎癌干细胞(EC)、人胚胎生殖细胞(EG)和人胚胎干细胞(ES)的表面上存在的糖脂表面抗原。
“SSEA-4”(阶段特异性胚胎抗原-4)是在人畸胎癌干细胞(EC)、人胚胎生殖细胞(EG)和人胚胎干细胞(ES)的表面上存在的糖脂表面抗原。
“TRA1-60”是在人畸胎癌干细胞(EC)、人胚胎生殖细胞(EG)和人胚胎干细胞(ES)的表面上表达的硫酸角蛋白相关抗原。
“TRA1-81”是在人畸胎癌干细胞(EC)、人胚胎生殖细胞(EG)和人胚胎干细胞(ES)的表面上表达的硫酸角蛋白相关抗原。
“TRA2-49”是在人畸胎癌干细胞(EC)和人胚胎干细胞(ES)的表面上表达的碱性磷酸酶同工酶。
如本文所用，“UTF-1”是指在多能胚胎干细胞和胚胎外细胞中表达的转录辅激活因子。
如本文所用，“Zic1”是Zic转录因子家族的成员。Zic1调控神经基因和神经嵴特异性基因的表达，其在背神经管和迁移前(premigratory)神经嵴的细胞中表达。
多能干细胞的分离、扩增和培养
多能干细胞的表征
多能干细胞可表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4中的一种或多种和可使用称为Tra-1-60和Tra-1-81(Thomson等人，Science 282：1145，1998)的抗体检测的标志物。多能干细胞的体外分化导致SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81(如果存在)的缺失以及SSEA-1表达的增加。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，其可通过用4％的多聚甲醛固定细胞然后用Vector Red作为基质进行显影来检测，如制造商(VectorLaboratories(Burlingame Calif.))所述。未分化的多能干细胞通常还表达Oct-4和TER，如通过RT-PCR所检测。
增殖的多能干细胞的另一种可取表型是分化成以下所有三种胚层细胞的潜能：内胚层、中胚层和外胚层。可通过(例如)以下方法来确认多能干细胞的多能性：将细胞注入严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的体内，使用4％的多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后用组织学方法检查来自三种胚层的细胞类型的证据。或者，可以通过形成胚状体并评估胚状体是否存在与三种胚层相关的标志物来确定多能性。
可以使用标准的G显带技术对增殖的多能干细胞系进行核型分析，并与公布的相应灵长类物种的核型进行比较。希望获得具有“正常核型”(指细胞是整倍体的)的细胞，其中所有人染色体都存在并且无明显的改变。
多能干细胞的来源
可以使用的多能干细胞的类型包括衍生自妊娠后形成的组织的已建立的多能细胞系，这些组织包括在妊娠期任意时间采集的胚胎前期组织(例如为囊胚)、胚胎组织或胎儿组织，所述时间通常(但不必须)在妊娠的前大约10-12周。非限制性实例为已建立的人胚胎干细胞系或人胚胎生殖细胞系，例如为人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCell)。另外还设想了本公开的组合在这种细胞的初步建立或稳定期间的用途，在此情况下，源细胞可以为直接取自源组织的原代多能细胞。取自在不存在饲养细胞的情况下已经培养的多能干细胞群的细胞也是合适的。突变人胚胎干细胞系也是合适的，例如为BGO1v(BresaGen，Athens，GA)。
在一个实施例中，人胚胎干细胞如Thomson等人(美国专利No.5,843,780；Science 282：1145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38：133ff.，1998；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：7844，1995)所述进行制备。
多能干细胞的培养
在一个实施例中，多能干细胞通常在以多种方式支持多能干细胞的饲养细胞层上培养。或者，多能干细胞在下述培养体系中培养：其基本上不含饲养细胞，但仍支持多能干细胞在不发生明显分化的情况下增殖。使用此前培养了另一种细胞的条件培养基，来支持多能干细胞在无饲养层培养体系中不分化的生长。或者，使用化学成分确知培养基来支持多能干细胞在无饲养层培养体系中不分化的生长。在一个实施例中，使用由补充有B27的培养基组成的化学成分确知培养基支持多能干细胞在无饲养层培养体系中不分化的生长。
例如，Reubinoff等人(Nature Biotechnology(《自然生物技术》)18：399-404(2000))和Thompson等人(Science 6 November 1998：Vol.282.no.5391，pp.1145-1147(《科学》，1998年11月6日，第282卷，第5391号，第1145-1147页))公开了使用小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层培养来自人囊胚的多能干细胞系。
Richards等人(Stem Cells 21：546-556，2003)评价了一组11种不同的人成体、胎儿和新生儿饲养细胞层在支持人多能干细胞培养方面的能力。Richards等人指出：“在成人皮肤成纤维细胞饲养层上培养的人胚胎干细胞系可保持人胚胎干细胞形态并保留多能性”。
US20020072117公开了可产生支持灵长类多能干细胞在无饲养层培养体系中生长的培养基的细胞系。所用的细胞系为间充质和成纤维细胞样细胞系，它们得自胚胎组织或者从胚胎干细胞分化而来。US20020072117还公开了所述细胞系作为原代饲养细胞层的用途。
又如，Wang等人(Stem Cells 23：1221-1227，2005)公开了使人多能干细胞在衍生自人胚胎干细胞的饲养细胞层上长期生长的方法。
又如，Stojkovic等人(Stem Cells 2005 23：306-314，2005)公开了衍生自人胚胎干细胞自发分化的饲养细胞体系。
在其它实例中，Miyamoto等人(Stem Cells 22：433-440，2004)公开了得自人胎盘的饲养细胞来源。
Amit等人(Biol.Reprod 68：2150-2156，2003)公开了衍生自人***的饲养细胞层。
又如，Inzunza等人(Stem Cells 23：544-549，2005)公开了来自人出生后***成纤维细胞的饲养细胞层。
US6642048公开了支持灵长类多能干细胞(pPS)在无饲养层培养体系中生长的培养基，以及可用于产生此类培养基的细胞系。US6642048指出：“本发明包括得自胚胎组织或由胚胎干细胞分化而来的间充质和成纤维细胞样细胞系。本公开将描述和说明衍生此类细胞系、处理培养基以及使用条件培养基培养干细胞的方法。”
又如，WO2005014799公开了用于维持、增殖和分化哺乳动物细胞的条件培养基。WO2005014799指出：“根据本发明产生的培养基通过小鼠细胞的细胞分泌活性进行调整，特别是那些分化的和无限增殖化的转基因肝细胞，称为MMH(Me t小鼠肝细胞)。”
又如，Xu等人(Stem Cells 22：972-980，2004)公开了得自人胚胎干细胞衍生物(经过遗传修饰以过表达人端粒酶逆转录酶)的条件培养基。
又如，US20070010011公开了用于维持多能干细胞的化学成分确知培养基。
一种替代性培养体系采用补充有能够促进胚胎干细胞增殖的生长因子的无血清培养基。例如，Cheon等人(BioReprodDOI：10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公开了无饲养层、无血清的培养体系，其中胚胎干细胞在使用血清替代品(SR)的非条件培养基(补充有能够触发胚胎干细胞自我更新的不同生长因子)中维持。
又如，Levenstein等人(Stem Cells 24：568-574，2006)公开了在无成纤维细胞或条件培养基的情况下使用补充有bFGF的培养基长期培养人胚胎干细胞的方法。
又如，US20050148070公开了在无血清、无成纤维细胞饲养层的限定培养基中培养人胚胎干细胞的方法，该方法包括：在含有白蛋白、氨基酸、维生素、矿物质、至少一种转铁蛋白或转铁蛋白替代物、至少一种胰岛素或胰岛素替代物的培养基中培养干细胞，所述培养基基本上不含哺乳动物胎儿血清，并含有至少约100ng/ml的能够活化成纤维细胞生长因子信号受体的成纤维细胞生长因子，其中所述生长因子并非仅来自成纤维细胞饲养层，所述培养基支持在无饲养细胞或条件培养基的情况下干细胞在不分化的状态下增殖。
又如，US20050233446公开了可用于培养干细胞(包括未分化的灵长类原始干细胞)的限定培养基。在溶液中，与被培养的干细胞相比，所述培养基基本上为等渗的。在给定的培养中，具体的培养基包含基础培养基和支持原始干细胞基本上不分化生长必需的一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸中的每一个。
又如，US6800480指出：“在一个实施例中，提供了用于在基本上不分化的状态下培养灵长类来源的原始干细胞的细胞培养基，其包含有效支持灵长类来源的原始干细胞生长的低渗透压、低内毒素基础培养基。基础培养基与营养血清和基质相结合，所述营养血清有效支持灵长类来源的原始干细胞的生长，所述基质选自由饲养细胞和衍生自饲养细胞的细胞外基质成分组成的组。所述培养基还包含非必需氨基酸、抗氧化剂和选自由核苷和丙酮酸盐组成的组的第一生长因子。”
又如，US20050244962指出：“在一个方面，本发明提供培养灵长类胚胎干细胞的方法。一种方法在基本上不含哺乳动物胎儿血清(还优选地基本上不含任何动物血清)、存在成纤维细胞生长因子(并非仅来自成纤维细胞饲养层)的培养体系中培养干细胞。在一个优选的形式中，通过加入足够的成纤维细胞生长因子，使得此前支持干细胞培养所需的成纤维细胞饲养层不再是必需的。”
在其它实例中，WO2005065354公开了限定、等渗培养基，其基本上不含饲养层和血清，而含：a.基础培养基；b.一定量的足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长的bFGF；c.一定量的足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长的胰岛素；以及d.一定量的足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长的抗坏血酸。
又如，WO2005086845公开了维持未分化干细胞的方法，所述方法包括使干细胞暴露于足量的以将细胞维持在未分化状态的转化生长因子β(TGFβ)蛋白质家族成员、成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白质家族成员或烟酰胺(NIC)，并维持足够的时间以实现所需的结果。
可以将多能干细胞平铺到合适的培养基质上。在一个实施例中，合适的培养基质为细胞外基质成分，例如为衍生自基底膜或可以形成粘附分子受体-配体偶联之部分的那些。在一个实施例中，所述合适的培养基质为
Figure GPA00001061332300231
(Becton Dickenson)。
Figure GPA00001061332300232
是来自于Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂，其在室温下会发生胶化从而形成重组基底膜。
其他细胞外基质组分和组分混合物适于用作替代物。根据待增殖的细胞类型，这可以包括层粘连蛋白、纤粘蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等等，它们可以单独使用或多种组合使用。
在存在促进细胞存活、增殖和保持所需特性的培养基的情况下，可以将多能干细胞以合适的分布平铺到基质上。所有这些特征得益于密切注意接种分布，并可由本领域的技术人员轻易地确定。
合适的培养基可以由下列组分制成，例如为：达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)，Gibco#11965-092；Knockout达尔伯克改良伊格尔培养基(KO DMEM)，Gibco#10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基础培养基；200mM的L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050；β-巯基乙醇，Sigma#M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco#13256-029。
多能干细胞向表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的分化
适用于本发明的多能干细胞包括(例如)人胚胎干细胞系H9(NIH代码：WA09)、人胚胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)、人胚胎干细胞系H7(NIH代码：WA07)和人胚胎干细胞系SA002(Cellartis，Sweden)。表达下列多能细胞特征性标志物中的至少一种的细胞也适用于本发明：ABCG2、cripto、CD9、FoxD3、Connexin43、Connexin45、Oct4、Sox2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、Tra1-81。
定形内胚层谱系特征性标志物选自由下列组成的组：SOX-17、GATA4、Hnf-3β、GSC、Cer1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4、CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99和OTX2。表达定形内胚层谱系特征性标志物中的至少一种的细胞适用于本发明。在本发明的一个方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞为原条前体细胞。在一个替代方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞为中内胚层细胞。在一个替代方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞为定形内胚层细胞。
胰腺内胚层谱系特征性标志物选自由下列组成的组：Pdx1、HNF-1β、PTF1a、HNF-6、HB9和PROX1。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物中的至少一种的细胞适用于本发明。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞为胰腺内胚层细胞。
胰腺内分泌谱系特征性标志物选自由下列组成的组：NGN-3、NeuroD、Islet-1、Pdx-1、NKX6.1、Pax-4、Ngn-3和PTF-1α。在一个实施例中，胰腺内分泌细胞能够表达下列激素中的至少一种：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰腺多肽。表达胰腺内分泌谱系特征性标志物中的至少一种的细胞适用于本发明。在本发明的一个方面，表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞为胰腺内分泌细胞。胰腺内分泌细胞可以是胰腺激素表达细胞。或者，胰腺内分泌细胞可以是胰腺激素分泌细胞。
在本发明的一个方面，胰腺内分泌细胞是表达β细胞谱系特征性标志物的细胞。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞表达Pdx1和下列转录因子中的至少一种：NGN-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3β、MAFA、Pax4和Pax6。在本发明的一个方面，表达β细胞谱系特征性标志物的细胞是β细胞。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成
可以通过本领域的任何方法或本发明中提出的任何方法，将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可以根据D’Amour等人在Nature Biotechnology(《自然生物技术》)23，1534-1541(2005)中公开的方法，将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可以根据Shinozaki等人在Development 131，1651-1662(2004)中公开的方法，将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可以根据McLean等人在Stem Cells 25，29-38(2007)中公开的方法，将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可以根据D’Amour等人在Nature Biotechnology(《自然生物技术》)24，1392-1401(2006)中公开的方法，将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可以通过以下方法，将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞：在不存在血清的情况下，在含激活素A的培养基中培养多能干细胞，然后将细胞与激活素A和血清一起培养，随后将细胞与激活素A和不同浓度的血清一起培养。此方法的一个实例在NatureBiotechnology(《自然生物技术》)23，1534-1541(2005)中有所公开。
例如，可以通过以下方法，将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞：在不存在血清的情况下，在含激活素A的培养基中培养多能干细胞，然后将细胞与激活素A和另一浓度的血清一起培养。此方法的一个实例在D’Amour等人的Nature Biotechnology(《自然生物技术》)，2005中有所公开。
例如，可以通过以下方法，将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞：在不存在血清的情况下，在含激活素A和Wnt配体的培养基中培养多能干细胞，然后移除Wnt配体，再将细胞与激活素A和血清一起培养。此方法的一个实例在Nature Biotechnology(《自然生物技术》)24，1392-1401(2006)中有所公开。
在本发明的一个方面，可以通过如下方法，将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞：将多能干细胞平铺在涂布有细胞外基质的组织培养基质上，然后在含血清的第一培养基中将多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起培养一段时间，然后在含更高浓度血清的第二培养基中将多能干细胞与激活素A一起培养约另一段时间。
上文公开的第一培养基中的血清浓度可以为约0至约0.5％，培养时间可以从约一天至约三天。上文公开的第二培养基中的血清浓度可以为约0.5％至约2％，培养时间可以从约一天至约四天。
在本发明的一个替代实施例中，可以通过如下方法，将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞：将多能干细胞铺在涂布有细胞外基质的组织培养基质上，然后在含血清的第一培养基中将多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起培养约一段时间，然后在含更高浓度血清的第二培养基中将多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起培养另一段时间。
上文公开的第一培养基中的血清浓度可以为约0至约0.5％，培养时间可以从约一天至约三天。上文公开的第二培养基中的血清浓度可以为约0.5％至约2％，培养时间可以从约一天至约四天。
在一个实施例中，本发明提供了分化表达定形内胚层谱系特征性标志物的多能干细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a.将多能干细胞平铺在涂布有细胞外基质的组织培养基质上，以及
b.将多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起培养。
将多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起培养可以在单一培养基中进行。单一培养基可以是补充有血清的培养基。或者，单一培养基可以是化学成分确知培养基，包括补充有B27的培养基。或者，将多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起培养可以在不止一种培养基中独立地或一起进行。在一个实施例中，将多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起培养在两种培养基中进行。所述不止一种培养基可以是补充有血清的培养基。或者，所述不止一种培养基可以是化学成分确知培养基，包括补充有B27的培养基。
细胞外基质
在本发明的一个方面，多能干细胞在涂布有细胞外基质的组织培养基质上培养和分化。细胞外基质可以是从小鼠恶性毒瘤细胞提取的可溶性基质膜制备物(其以商品名MATRIGEL由BD Biosciences出售)。或者，细胞外基质可以是生长因子减少的MATRIGEL。或者，细胞外基质可以是纤粘蛋白。在替代实施例中，在用人血清涂布的组织培养基质上培养和分化多能干细胞。
细胞外基质可以在涂布到组织培养基质之前进行稀释。稀释细胞外基质以及涂布组织培养基质的合适方法的实例可见于Kleinman，H.K.etal.，Biochemistry 25：312(1986)和Hadley，M.A.等人.，J.Cell.Biol.101：1511(1985)。
在一个实施例中，细胞外基质为MATRIGEL。在一个实施例中，使用按1∶10进行稀释的MATRIGEL涂布组织培养基质。在替代实施例中，使用按1∶15进行稀释的MATRIGEL涂布组织培养基质。在替代实施例中，使用按1∶30进行稀释的MATRIGEL涂布组织培养基质。在替代实施例中，使用按1∶60进行稀释的MATRIGEL涂布组织培养基质。
在一个实施例中，细胞外基质为生长因子减少的MATRIGEL。在一个实施例中，使用按1∶10进行稀释的生长因子减少的MATRIGEL涂布组织培养基质。在替代实施例中，使用按1∶15进行稀释的生长因子减少的MATRIGEL涂布组织培养基质。在替代实施例中，使用按1∶30进行稀释的生长因子减少的MATRIGEL涂布组织培养基质。在替代实施例中，使用按1∶60进行稀释的生长因子减少的MATRIGEL涂布组织培养基质。
使用单一培养基在细胞外基质上将多能干细胞分化成表达定形内胚层 谱系特征性标志物的细胞
当使用单一培养基时，其应含有足够低浓度的某些因子以允许多能干细胞分化成定形内胚层，这些因子例如为胰岛素和IGF(如WO2006020919中所公开)。这可以通过降低血清浓度来实现，或作为另外一种选择，可以通过使用无胰岛素和IGF的化学成分确知培养基来实现。化学成分确知培养基的实例在Wiles等人(Exp Cell Res.2/25/1999；247(1)：241-8.)中有所公开。
所述培养基可以具有在约0％至约10％范围内的血清浓度。在替代实施例中，该浓度可以在约0％至约5％的范围内。在替代实施例中，该浓度可以在约0％至约2％的范围内。在替代实施例中，该浓度可以为约2％。
或者，培养基可以添加约0.5％至约1％的B27。
与激活素A和Wnt配体一起培养的时间可以在约1天至约7天的范围内。在替代实施例中，所述培养时间可以在约1天至约3天的范围内。在替代实施例中，所述培养时间可以为约3天。
激活素A可以任何适于引起多能干细胞分化的浓度使用。该浓度可以从约1pg/ml至约100μg/ml。在替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约1μg/ml。在另一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约100ng/ml。在另一个替代实施例中，该浓度可以为约50ng/ml至约100ng/ml。在另一个替代实施例中，该浓度可以为约100ng/ml。
可优化Wnt配体的选择以提高分化过程的效率。Wnt配体可选自由下列组成的组：Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-5a和Wnt-7a。在一个实施例中，Wnt配体为Wnt-1。在替代实施例中，Wnt配体为Wnt-3a。
Wnt配体的浓度可以为约1ng/ml至约1000ng/ml。在替代实施例中，所述浓度可以为约10ng/ml至约100ng/ml。
单一培养基也可以包含GSK-3B抑制剂。GSK-3B抑制剂可选自由下列组成的组：GSK-3B抑制剂IX和GSK-3B抑制剂XI。在一个实施例中，GSK-3B抑制剂为GSK-3B抑制剂IX。本人没有看到IX和XI抑制剂的定义，本人在原来的WNT专利申请中确实有这些。
当使用GSK-3B抑制剂培养多能干细胞时，GSK-3B抑制剂的浓度可以从约1nM至约1000nM。在替代实施例中，使用浓度为约10nM至约100nM的GSK-3B抑制剂培养多能干细胞。
单一培养基也可以包含至少一种其他额外的因子，其可以增强从多能干细胞形成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。或者，所述至少一种其他额外的因子可以增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的增殖。所述至少一种其他额外的因子还可以增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞形成其他类型细胞的能力，或提高任何其他额外的分化步骤的效率。
所述至少一种额外的因子可以是(例如)烟酰胺，TGF-β家族的成员，包括TGF-β1、2和3，血清白蛋白，成纤维细胞生长因子家族的成员，血小板衍生生长因子-AA和-BB，富血小板血浆，胰岛素生长因子(IGF-I、II)，生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、11)，胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)，GLP-1和GLP-2拟似体，Exendin-4，视黄酸，甲状旁腺素，胰岛素，孕酮，抑酶肽，氢化可的松，胆胺，β巯基乙醇，表皮生长因子(EGF)，胃泌素I和II，铜螯合剂(例如为三亚乙基五胺)，毛喉素，丁酸钠，激活素，β细胞素，ITS，noggin，神经突生长因子，nodal，丙戊酸，曲古霉素A，丁酸钠，肝细胞生长因子(HGF)，鞘氨醇1，VEGF，MG132(EMD，CA)，N2和B27添加剂(Gibco，CA)，甾体类生物碱(例如为环巴胺(EMD，CA))，角化细胞生长因子(KGF)，Dickkopf蛋白质家族，牛垂体提取物，胰岛再生相关蛋白(INGAP)，印度刺猬因子，音猬因子，蛋白酶体抑制剂，notch通道抑制剂，音猬因子抑制剂，或其组合。
所述至少一种其他额外的因子可以由条件培养基提供，所述培养基得自胰腺细胞系，例如为PANC-1(ATCC No：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997)；肝细胞系，例如为HepG2(ATCC No：HTB-8065)；肠细胞系，例如为FHs 74(ATCC No：CCL-241)，以及原代或转化的内皮细胞。
使用两种培养基在细胞外基质上将多能干细胞分化成表达定形内胚层 谱系特征性标志物的细胞
可以通过两种培养基将多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起培养来实现多能干细胞向定形内胚层谱系的细胞分化。因此，可以按照如下方法完成多能干细胞的分化：
a.将多能干细胞平铺在涂布有细胞外基质的组织培养基质上，
b.将多能干细胞与激活素A和Wnt配体在第一培养基中一起培养，以及
c.将多能干细胞与激活素A在第二培养基中一起培养。
第一培养基可以包含低浓度的血清，第二培养基可以包含比第一培养基浓度更高的血清。
第二培养基可以包含Wnt配体。
第一培养基：第一培养基应含有足够低浓度的某些因子以允许多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，这些因子例如为胰岛素和IGF(如WO2006020919中所公开)。这可以通过降低血清浓度来实现，或作为另外一种选择，可以通过使用无胰岛素和IGF的化学成分确知培养基来实现。化学成分确知培养基的实例在Wiles等人(Exp Cell Res.2/25/1999；247(1)：241-8.)中有所公开。
在第一培养基中，可存在比第二培养基中浓度更低的血清。增加第二培养基中的血清浓度可增加细胞存活率，或作为另外一种选择，可增强细胞的增殖。第一培养基的血清浓度可以在约0％至约10％的范围内。或者，第一培养基的血清浓度可以在约0％至约2％的范围内。或者，第一培养基的血清浓度可以在约0％至约1％的范围内。或者，第一培养基的血清浓度可以为约0.5％。
当使用至少两种培养基将多能干细胞与激活素A和Wnt配体一起培养时，在第一培养基中的培养时间可以在约1天至约3天的范围内。
可使用适于引起多能干细胞分化的任何浓度的激活素A。该浓度可以从约1pg/ml至约100μg/ml。在替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约1μg/ml。在另一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约100ng/ml。在另一个替代实施例中，该浓度可以为约50ng/ml至约100ng/ml。在另一个替代实施例中，该浓度可以为约100ng/ml。
可优化Wnt配体的选择以提高分化过程的效率。Wnt配体可选自由下列组成的组：Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-5a和Wnt-7a。在一个实施例中，Wnt配体为Wnt-1。在替代实施例中，Wnt配体为Wnt-3a。
Wnt配体的浓度可以为约1ng/ml至约1000ng/ml。在替代实施例中，该浓度可以为约10ng/ml至约100ng/ml。
第一培养基也可以含有GSK-3B抑制剂。可将GSK-3B抑制剂添加到第一培养基中，添加到第二培养基中，或既添加到第一培养基中、又添加到第二培养基中。
GSK-3B抑制剂可选自由下列组成的组：GSK-3B抑制剂IX和GSK-3B抑制剂XI。在一个实施例中，GSK-3B抑制剂为GSK-3B抑制剂IX。
当将多能干细胞与GSK-3B抑制剂一起培养时，GSK-3B抑制剂的浓度可以为从约1nM至约1000nM。在替代实施例中，将多能干细胞与约10nM至约100nM浓度的GSK-3B抑制剂一起培养。
第一培养基也可以含有至少一种其他额外的因子，其可增强从多能干细胞形成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。或者，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞形成其他类型细胞的能力，或提高任何其他额外的分化步骤的效率。
所述至少一种额外的因子可以是(例如)烟酰胺，TGF-β家族的成员，包括TGF-β1、2和3，血清白蛋白，成纤维细胞生长因子家族的成员，血小板衍生生长因子-AA和-BB，富血小板血浆，胰岛素生长因子(IGF-I、II)，生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、11)，胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)，GLP-1和GLP-2拟似体，Exendin-4，视黄酸，甲状旁腺素，胰岛素，孕酮，抑酶肽，氢化可的松，胆胺，β巯基乙醇，表皮生长因子(EGF)，胃泌素I和II，铜螯合剂(例如为三亚乙基五胺)，毛喉素，丁酸钠，激活素，β细胞素，ITS，noggin，神经突生长因子，nodal，丙戊酸，曲古霉素A，丁酸钠，肝细胞生长因子(HGF)，鞘氨醇1，VEGF，MG132(EMD，CA)，N2和B27添加剂(Gibco，CA)，甾体类生物碱(例如为环巴胺(EMD，CA))，角化细胞生长因子(KGF)，Dickkopf蛋白质家族，牛垂体提取物，胰岛再生相关蛋白(INGAP)，印度刺猬因子，音猬因子，蛋白酶体抑制剂，notch通道抑制剂，音猬因子抑制剂，或其组合。
所述至少一种其他额外的因子可以由条件培养基提供，所述培养基得自胰腺细胞系，例如为PANC-1(ATCC No：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997)；肝细胞系，例如为HepG2(ATCC No：HTB-8065)；以及肠细胞系，例如为FHs 74(ATCC No：CCL-241)。
第二培养基：第二培养基应含有某些因子，例如为胰岛素和IGF(如WO2006020919中所公开)，其浓度足以促进培养细胞的存活。这可以通过增加血清浓度来实现，或作为另外一种选择，可以通过使用其中胰岛素和IGF的浓度相对第一培养基有所增加的化学成分确知培养基来实现。化学成分确知培养基的实例在Wiles等人(Exp Cell Res.2/25/1999；247(1)：241-8.)中有所公开。
在具有更高浓度血清的第二培养基中，第二培养基的血清浓度可以在约0.5％至约10％的范围内。或者，第二培养基的血清浓度可以在约0.5％至约5％的范围内。或者，第二培养基的血清浓度可以在约0.5％至约2％的范围内。或者，第二培养基的血清浓度可以为约2％。当将多能干细胞与第二培养基一起培养时，培养时间可以为约1天至约4天。
与第一培养基类似，可使用适于引起多能干细胞分化的任何浓度的激活素A。该浓度可以为约1pg/ml至约100μg/ml。在替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约1μg/ml。在另一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约100ng/ml。在另一个替代实施例中，该浓度可以为约50ng/ml至约100ng/ml。在另一个替代实施例中，该浓度可以为约100ng/ml。
Wnt配体的浓度可以为约1ng/ml至约1000ng/ml。在替代实施例中，所述浓度可以为约10ng/ml至约100ng/ml。
Wnt配体可选自由下列组成的组：Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-5a和Wnt-7a。在一个实施例中，Wnt配体为Wnt-1。在替代实施例中，Wnt配体为Wnt-3a。
第二培养基也可以包含GSK-3B抑制剂。可将GSK-3B抑制剂添加到第一培养基中，添加到第二培养基中，或既添加到第一培养基中、又添加到第二培养基中。
GSK-3B抑制剂可选自由下列组成的组：GSK-3B抑制剂IX和GSK-3B抑制剂XI。在一个实施例中，GSK-3B抑制剂为GSK-3B抑制剂IX。
当将多能干细胞与GSK-3B抑制剂一起培养时，GSK-3B抑制剂的浓度可以为从约1nM至约1000nM。在替代实施例中，将多能干细胞与浓度为约10nM至约100nM的GSK-3B抑制剂一起培养。
与第一培养基类似，第二培养基也可以包含至少一种其他额外的因子，其可以增强从多能干细胞形成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。或者，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞形成其他类型细胞的能力，或提高任何其他额外的分化步骤的效率。
所述至少一种额外的因子可以是(例如)烟酰胺，TGF-β家族的成员，包括TGF-β1、2和3，血清白蛋白，成纤维细胞生长因子家族的成员，血小板衍生生长因子-AA和-BB，富血小板血浆，胰岛素生长因子(IGF-I、II)，生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、11)，胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)，GLP-1和GLP-2拟似体，Exendin-4，视黄酸，甲状旁腺素，胰岛素，孕酮，抑酶肽，氢化可的松，胆胺，β巯基乙醇，表皮生长因子(EGF)，胃泌素I和II，铜螯合剂(例如为三亚乙基五胺)，毛喉素，丁酸钠，激活素，β细胞素，ITS，noggin，神经突生长因子，nodal，丙戊酸，曲古霉素A，丁酸钠，肝细胞生长因子(HGF)，鞘氨醇1，VEGF，MG132(EMD，CA)，N2和B27添加剂(Gibco，CA)，甾体类生物碱(例如为环巴胺(EMD，CA))，角化细胞生长因子(KGF)，Dickkopf蛋白质家族，牛垂体提取物，胰岛再生相关蛋白(INGAP)，印度刺猬因子，音猬因子，蛋白酶体抑制剂，notch通道抑制剂，音猬因子抑制剂，或其组合。
所述至少一种其他额外的因子可以由条件培养基提供，所述培养基得自胰腺细胞系，例如为PANC-1(ATCC No：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997)；肝细胞系，例如为HepG2(ATCC No：HTB-8065)；和肠细胞系，例如为FHs 74(ATCC No：CCL-241)。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的检测
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成可以通过在特定方案前后检测标志物的存在情况来确定。多能干细胞通常不表达这些标志物。因此，多能细胞的分化在细胞开始表达这些标志物时被检测。
可以通过以下方法测定分化效率：将处理过的细胞群暴露于特别地识别蛋白质标志物的试剂(例如抗体)中，所述蛋白质标志物由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达。
评估培养或分离细胞中蛋白质和核酸标志物表达的方法是本领域的标准。这些方法包括定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、Northern印迹、原位杂交(参见如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubelet al.，eds.2001 supplement)(《最新分子生物学实验方法汇编》，Ausubel等人编辑，2001补遗本))、免疫分析(例如切片材料的免疫组化分析)、Western印迹，以及对于完好细胞中可触及的标志物的流式细胞计量术(FACS)(参见如Harlow and Lane，Using Antibodies：ALaboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998)(Harlow和Lane，《使用抗体：实验室手册》，New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1998))。
可用于检测某些蛋白质标志物的抗体的实例列于表IA中。应该指出的是，涉及由表IA所列抗体识别的相同标志物的替代抗体是可用、或易于开发的。这种替代抗体也可用于评估根据本发明分离的细胞中的标志物的表达。
例如，多能干细胞的特征是本领域技术人员熟知的，并且其他特征有待继续辨别。多能干细胞标志物包括(例如)下列中的一种或多种的表达：ABCG2、cripto、FoxD3、Connexin43、Connexin45、Oct4、Sox2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、Tra1-81。
在用本发明的方法处理多能干细胞后，可以通过以下方法纯化分化的细胞：将处理过的细胞群暴露于特别地识别蛋白质标志物(例如CXCR4)的试剂(例如抗体)中，所述蛋白质标志物由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达。
表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成
可以通过本领域的任何方法或本发明提出的任何方法，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可以根据D’Amour等人在Nature Biotechnology(《自然生物技术》)24，1392-1401(2006)中公开的方法，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，还通过下述方法，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞：用成纤维细胞生长因子和刺猬蛋白信号通道抑制剂KAAD-环巴胺处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除含有成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基，随后将细胞在含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基中进行培养。此方法的一个实例在Nature Biotechnology(《自然生物技术》)24，1392-1401(2006)中有所公开。
在本发明的一个方面，还通过下述方法，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞：用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞一段时间。这段时间可以为约一天至约六天。
在本发明的替代方面，还通过下述方法，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞：用视黄酸处理细胞一段时间。该段时间可以为约一天至约三天。随后移除视黄酸，并且用至少一种成纤维细胞生长因子处理细胞另一段时间。该段时间可以为约一天至约三天。
在一个实施例中，本发明提供了将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a.培养表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，以及
b.用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
任何表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞均适用于使用本方法分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。可以在化学成分确知培养基中处理细胞，包括补充有B27的培养基。或者，可以在无血清培养基中处理细胞。或者，可以在补充有血清的培养基中处理细胞。
在一个实施例中，用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层特征性标志物的细胞约一天至约六天。在一个实施例中，用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层特征性标志物的细胞约六天。
所述至少一种成纤维细胞生长因子选自由FGF-2、FGF-4和FGF-10组成的组。
任何表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞均适于使用本方法分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。可以在化学成分确知培养基中处理细胞，包括补充有B27的培养基。或者，可以在无血清培养基中处理细胞。或者，可以在补充有血清的培养基中处理细胞。
在替代实施例中，本发明提供了将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a.培养表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
b.用视黄酸处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，以及
c.移除视黄酸，随后用至少一种成纤维细胞生长因子处理细胞。
任何表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞均适于使用本方法分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。可以在化学成分确知培养基中处理细胞，包括补充有B27的培养基。或者，可以在无血清培养基中处理细胞。或者，可以在补充有血清的培养基中处理细胞。
在一个实施例中，用视黄酸处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞约一天至约三天。在一个实施例中，用视黄酸处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞约三天。在一个实施例中，用至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞约一天至约三天。在一个实施例中，用至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞约三天。
所述至少一种成纤维细胞生长因子选自由FGF-2、FGF-4和FGF-10组成的组。
任何表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞均适于使用本方法分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。可以在化学成分确知培养基中处理细胞，包括补充有B27的培养基。或者，可以在无血清培养基中处理细胞。或者，可以在补充有血清的培养基中处理细胞。
在一个实施例中，用视黄酸处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。或者，用FGF-2或FGF-4或FGF-10处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在替代实施例中，用下列因子中的至少一种处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞：视黄酸、FGF-2、FGF-4或FGF-10。在替代实施例中，用视黄酸和下列成纤维细胞生长因子中的至少一种处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞：FGF-2、FGF-4或FGF-10。在一个实施例中，用视黄酸和FGF-2处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在另一个实施例中，用视黄酸和FGF-4处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在另一个实施例中，用视黄酸和FGF-10处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
视黄酸可以约1nM至约1mM的浓度使用。在一个实施例中，视黄酸以1μM的浓度使用。
FGF-2可以约50pg/ml至约50μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，FGF-2以50ng/ml的浓度使用。
FGF-4可以约50pg/ml至约50μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，FGF-4以50ng/ml的浓度使用。
FGF-10可以约50pg/ml至约50μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，FGF-10以50ng/ml的浓度使用。
可用至少一种其他额外的因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，该因子可增强表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成。或者，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞形成其他类型细胞的能力，或提高任何其他额外的分化步骤的效率。
所述至少一种额外的因子可以是(例如)烟酰胺，TGF-β家族的成员，包括TGF-β1、2和3，血清白蛋白，成纤维细胞生长因子家族的成员，血小板衍生生长因子-AA和-BB，富血小板血浆，胰岛素生长因子(IGF-I、II)，生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、11)，胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)，GLP-1和GLP-2拟似体，Exendin-4，视黄酸，甲状旁腺素，胰岛素，孕酮，抑酶肽，氢化可的松，胆胺，β巯基乙醇，表皮生长因子(EGF)，胃泌素I和II，铜螯合剂(例如为三亚乙基五胺)，毛喉素，丁酸钠，激活素，β细胞素，ITS，noggin，神经突生长因子，nodal，丙戊酸，曲古霉素A，丁酸钠，肝细胞生长因子(HGF)，鞘氨醇1，VEGF，MG132(EMD，CA)，N2和B27添加剂(Gibco，CA)，甾体类生物碱(例如为环巴胺(EMD，CA))，角化细胞生长因子(KGF)，Dickkopf蛋白质家族，牛垂体提取物，胰岛再生相关蛋白(INGAP)，印度刺猬因子，音猬因子，蛋白酶体抑制剂，notch通道抑制剂，音猬因子抑制剂，或其组合。
所述至少一种其他额外的因子可以由条件培养基提供，所述培养基得自胰腺细胞系，例如为PANC-1(ATCC No：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997)；肝细胞系，例如为HepG2(ATCC No：HTB-8065)；和肠细胞系，例如为FHs 74(ATCC No：CCL-241)。
表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的检测
胰腺内胚层谱系特征性标志物是本领域技术人员熟知的，并且其他的胰腺内胚层谱系特征性标志物有待继续辨别。这些标志物可用于确认根据本发明处理的细胞已分化，以获得胰腺内胚层谱系的特征性的性质。胰腺内胚层谱系特异性标志物包括一种或多种转录因子的表达，这些因子例如为Hlxb9、PTF-1a、PDX-1、HNF-6、HNF-1β。
可以通过将处理过的细胞群暴露于特别地识别蛋白质标志物(由表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞表达)的试剂(例如抗体)来测定分化效率。
评估培养或分离细胞中蛋白质和核酸标志物表达的方法是本领域的标准。这些方法包括定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、Northern印迹、原位杂交(参见如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubelet al.，eds.2001 supplement)(《最新分子生物学实验方法汇编》，Ausubel等人编辑，2001补遗本))、免疫分析(例如切片材料的免疫组化分析)、Western印迹，以及对于完好细胞中可触及的标志物的流式细胞计量术(FACS)(参见如Harlow and Lane，Using Antibodies：ALaboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998)(Harlow和Lane，《使用抗体：实验室手册》，New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1998))。
可用于检测某些蛋白质标志物的抗体的实例列于表IA中。应该指出的是，涉及由表IA所列抗体识别的相同标志物的替代抗体是可用、或易于开发的。这种替代抗体也可用于评估根据本发明分离的细胞中的标志物的表达。
表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的形成：
可以通过本领域的任何方法或本发明公开的任何方法，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据D’Amour等人在Nature Biotechnology(《自然生物技术》)24，1392-1401(2006)中公开的方法，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，还通过下述方法，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞：在含有DAPT和exendin4的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除含有DAPT和exendin 4的培养基，随后在含有exendin 1、IGF-1和HGF的培养基中培养细胞。此方法的一个实例在Nature Biotechnology(《自然生物技术》)24，1392-1401(2006)中有所公开。
例如，还通过下述方法，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞：在含有exendin 4的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除含有exendin 4的培养基，随后在含有exendin 1、IGF-1和HGF的培养基中培养细胞。此方法的一个实例在D’Amour等人的Nature Biotechnology(《自然生物技术》，2006年)中有所公开。
例如，还通过下述方法，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞：在含有DAPT和exendin4的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个实例在D’Amour等人的Nature Biotechnology(《自然生物技术》，2006年)中有所公开。
例如，还通过下述方法，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞：在含有exendin 4的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个实例在D’Amour等人的Nature Biotechnology(《自然生物技术》，2006年)中有所公开。
在本发明的一个方面，还通过下述方法，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞：用抑制Notch信号通道的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。抑制Notch信号通道的因子可以是Notch细胞外受体的拮抗剂。或者，所述因子可抑制Notch受体的生物活性。或者，所述因子可在细胞内抑制Notch信号转导通道中的元件或者是其拮抗剂。可以在化学成分确知培养基中处理细胞，包括补充有B27的培养基。或者，可以在无血清培养基中处理细胞。或者，可在补充有血清的培养基中处理细胞。
在一个实施例中，抑制Notch信号通道的因子是γ-分泌酶抑制剂。在一个实施例中，γ-分泌酶抑制剂为1S苄基-4R-[1-(1S-氨基甲酰基-2-苯乙基氨基甲酰基)-1S-3-甲基丁基氨基甲酰基]-5 2R羟基-5苯基戊基]氨基甲酸叔丁酯，也称为L-685,458。
L-685,458可以约0.1μM至约100μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458以约90μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458以约80μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458以约70μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458以约60μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458以约50μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458以约40μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458以约30μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458以约20μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458以约10μM的浓度使用。
在一个实施例中，本发明提供了将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a.培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，以及
b.用抑制Notch信号通道的因子处理细胞。
任何表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞均适于使用本方法分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。可以在化学成分确知培养基中处理细胞，包括补充有B27的培养基。或者，可以在无血清培养基中处理细胞。或者，可以在补充有血清的培养基中处理细胞。
在一个实施例中，抑制Notch信号通道的因子是γ-分泌酶抑制剂。在一个实施例中，γ-分泌酶抑制剂为1S-苄基-4R-[1-(1S-氨基甲酰基-2-苯乙基氨基甲酰基)-1S-3-甲基丁基氨基甲酰基]-2R-羟基-5-苯基戊基]氨基甲酸叔丁酯，也称为L-685,458。
用抑制Notch信号通道的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞约一天至约五天。或者，用抑制Notch信号通道的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞约三天至约五天。或者，用抑制Notch信号通道的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞约五天。
在一个实施例中，抑制Notch信号通道的因子是γ-分泌酶抑制剂。在一个实施例中，γ-分泌酶抑制剂为1S-苄基-4R-[1-(1S-氨基甲酰基-2-苯乙基氨基甲酰基)-1S-3-甲基丁基氨基甲酰基]-2R-羟基-5-苯基戊基]氨基甲酸叔丁酯，也称为L-685,458。
L-685,458可以约0.1μM至约100μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458以约90μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458以约80μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458以约70μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458以约60μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458以约50μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458以约40μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458以约30μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458以约20μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685,458以约10μM的浓度使用。
可用至少一种其他额外的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，该因子可增强表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的形成。或者，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞形成其他类型细胞的能力，或提高任何其他额外的分化步骤的效率。
所述至少一种额外的因子可以是(例如)烟酰胺，TGF-β家族的成员，包括TGF-β1、2和3，血清白蛋白，成纤维细胞生长因子家族的成员，血小板衍生生长因子-AA和-BB，富血小板血浆，胰岛素生长因子(IGF-I、II)，生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、11)，胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)，GLP-1和GLP-2拟似体，Exendin-4，视黄酸，甲状旁腺素，胰岛素，孕酮，抑酶肽，氢化可的松，胆胺，β巯基乙醇，表皮生长因子(EGF)，胃泌素I和II，铜螯合剂(例如为三亚乙基五胺)，毛喉素，丁酸钠，激活素，β细胞素，ITS，noggin，神经突生长因子，nodal，丙戊酸，曲古霉素A，丁酸钠，肝细胞生长因子(HGF)，鞘氨醇1，VEGF，MG132(EMD，CA)，N2和B27添加剂(Gibco，CA)，甾体类生物碱(例如为环巴胺(EMD，CA))，角化细胞生长因子(KGF)，Dickkopf蛋白质家族，牛垂体提取物，胰岛再生相关蛋白(INGAP)，印度刺猬因子，音猬因子，蛋白酶体抑制剂，notch通道抑制剂，音猬因子抑制剂，或其组合。
所述至少一种其他额外的因子可以由条件培养基提供，所述培养基得自胰腺细胞系，例如为PANC-1(ATCC No：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997)；肝细胞系，例如为HepG2(ATCC No：HTB-8065)；以及肠细胞系，例如为FHs 74(ATCC No：CCL-241)。
表达胰腺内公泌谱系特征性标志物的细胞的检测
胰腺内分泌谱系特征性标志物是本领域技术人员熟知的，并且其他的胰腺内分泌谱系特征性标志物有待继续辨别。这些标志物可用于确认根据本发明处理的细胞已分化，以获得胰腺内分泌谱系的特征性的性质。胰腺内分泌谱系特异性标志物包括一种或多种转录因子的表达，这些因子例如为NGN-3、NeuroD、Islet-1。
β细胞谱系特征性标志物是本领域技术人员熟知的，并且其他的β细胞谱系特征性标志物有待继续辨别。这些标志物可用于确认根据本发明处理的细胞已分化，以获得β-细胞谱系特征性的性质。除了别的以外，β细胞谱系特异性特征包括一种或多种转录因子的表达，这些因子例如为Pdx1(胰腺和十二指肠同源盒基因-1)、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1、Pax6、Pax4、NeuroD、Hnf1b、Hnf-6、Hnf-3β和MafA。这些转录因子用于鉴定内分泌细胞在本领域中已被广为接受。参见如Edlund(Nature ReviewsGenetics 3：524-632(2002))。
可通过将处理过的细胞群暴露于特别地识别蛋白质标志物(由表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞表达)的试剂(例如抗体)来测定分化效率。或者，可以通过将处理过的细胞群暴露于特别地识别以下蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来测定分化效率，该标志物由表达β细胞谱系特征性标志物的细胞表达。
评估培养或分离细胞中蛋白质和核酸标志物表达的方法是本领域的标准。这些方法包括定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、Northern印迹、原位杂交(参见如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubelet al.，eds.2001 supplement)(《最新分子生物学实验方法汇编》，Ausubel等人编辑，2001补遗本))、免疫分析(例如切片材料的免疫组化分析)、Western印迹，以及对于完好细胞中可触及的标志物的流式细胞计量术(FACS)(参见如Harlow and Lane，Using Antibodies：ALaboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998)(Harlow和Lane，《使用抗体：实验室手册》，New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1998))。
可用于检测某些蛋白质标志物的抗体的实例列于表IA中。应该指出的是，涉及由表IA所列抗体识别的相同标志物的替代抗体是可用、或易于开发的。这种替代抗体也可用于评估根据本发明分离的细胞中的标志物的表达。
治疗
在一个方面，本发明提供了一种治疗患有1型糖尿病或具有发生1型糖尿病风险的患者的方法。此方法涉及：培养多能干细胞，在体外将多能干细胞分化成β-细胞谱系，以及将β-细胞谱系的细胞植入患者体内。
在另一个方面，本发明提供了治疗患有2型糖尿病或具有发生2型糖尿病风险的患者的方法。此方法涉及：培养多能干细胞，在体外将多能干细胞分化成β-细胞谱系，以及将β-细胞谱系的细胞植入患者体内。
在适当时，还可使用促进移植细胞存活和发挥功能的药剂或生物活性剂治疗患者。除了别的以外，这些药剂可以包括(例如)胰岛素，TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)，骨形态发生蛋白(BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12和-13)，成纤维细胞生长因子-1和-2，血小板衍生生长因子-AA和-BB，富血小板血浆，胰岛素生长因子(IGF-I、II)，生长分化因子(GDF-5、-6、-7、-8、-10、-15)，血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)，多效生长因子，内皮素。其他的药物化合物可以包括(例如)烟酰胺、胰高血糖素样肽-I(GLP-1)和II、GLP-1和2拟似体、Exendin-4、视黄酸、甲状旁腺激素、MAPK抑制剂，例如已公布的美国专利申请2004/0209901和已公布的美国专利申请2004/0132729中所公开的化合物。
在移植到受体中之前，可将多能干细胞分化成胰岛素生成细胞。在一个具体实施例中，在移植到受体中之前，将多能干细胞完全分化成β-细胞。或者，可以未分化或部分分化的状态将多能干细胞移植到受体中。进一步的分化可在受体中发生。
定形内胚层细胞或者胰腺内胚层细胞或者b细胞可作为分散细胞或形成集落，通过输注到肝门静脉中植入。或者，可以在生物相容性可降解的聚合物支承体、多孔非降解的器械中提供细胞，或者可以包封细胞以避免宿主免疫应答。可将细胞植入受体的合适部位。植入部位包括(例如)肝脏、天然胰腺、肾包膜下空间、网膜、腹膜、浆膜下空间、肠、胃或皮下袋。
为了增强进一步的分化，增强移植细胞的存活或活性，可在给予细胞之前、与之同时或者之后给予其他因子，例如生长因子、抗氧化剂或抗炎剂。在某些实施例中，利用生长因子使给予的细胞在体内分化。这些因子可由内源细胞分泌，并原位暴露于所给予的细胞。可通过本领域已知的内源性及外源性生长因子的任何组合来诱导移植细胞的分化。
移植中所用的细胞数量取决于多种不同的因素(包括患者的症状以及对治疗的应答)，并可由本领域的技术人员确定。
在一个方面，本发明提供了治疗患有糖尿病或具有发生糖尿病风险的患者的方法。本方法涉及：培养多能干细胞，在体外将培养的细胞分化成β-细胞谱系，以及将细胞并入三维支承体中。在植入患者体内之前，可将细胞在体外维持在此支承体上。或者，可将含细胞的支承体直接植入患者体内，而不进行另外的体外培养。支承体可任选地含有至少一种药剂，该药剂有助于移植细胞的存活及发挥功能。
适用于本发明的支承体材料包括可用于组织修复的组织模板、导管、屏障和容器。具体地讲，已在体外和体内用于重建或再生生物组织以及递送趋化剂以诱导组织生长的泡沫、海绵、凝胶、水凝胶、织物和非织造结构形式的合成和天然材料适用于实施本发明的方法。参见，例如美国专利5,770,417、美国专利6,022,743、美国专利5,567,612、美国专利5,759,830、美国专利6,626,950、美国专利6,534,084、美国专利6,306,424、美国专利6,365,149、美国专利6,599,323、美国专利6,656,488、已公布的美国专利申请2004/0062753 A1、美国专利4,557,264和美国专利6,333,029中所公开的材料。
为了形成含有药剂的支承体，可在形成支承体前将药剂与聚合物溶液混合。或者，可将药剂涂布在经加工的支承体上，优选地在存在药物载体的情况下进行。药剂可以液体、细分固体或者任何其他合适的物理形式存在。或者，可将赋形剂添加到支承体上以改变药剂的释放速率。在替代实施例中，支承体含有至少一种为抗炎化合物的药物化合物，例如美国专利6,509,369中所公开的化合物。
支承体可含有至少一种为抗凋亡化合物的药物化合物，例如美国专利6,793,945中所公开的化合物。
支承体可含有至少一种为纤维变性抑制剂的药物化合物，例如美国专利6,331,298中所公开的化合物。
支承体可含有至少一种能够增强血管生成的药物化合物，例如已公布的美国专利申请2004/0220393和已公布的美国专利申请2004/0209901中所公开的化合物。
支承体也可以含有至少一种为免疫抑制化合物的药物化合物，例如已公布的美国专利申请2004/0171623中所公开的化合物。
除了别的以外，支承体也可以含有至少一种为生长因子的药物化合物，例如TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12和-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA和-BB、富血小板血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效生长因子、内皮素。其他药物化合物可包括(例如)烟酰胺、缺氧诱导因子1-α、胰高血糖素样肽-I(GLP-1)、GLP-1和2拟似体、和II、Exendin-4、nodal、noggin、NGF、视黄酸、甲状旁腺激素、肌腱蛋白C、原弹性蛋白、凝血酶衍生肽、导管素/抗菌肽(Cathelicidin)、防御素、层粘连蛋白、含粘附细胞外基质蛋白的细胞结合域和肝素结合域的生物肽(例如纤粘蛋白和玻连蛋白)、MAPK抑制剂(例如为已公布的美国专利申请2004/0209901和已公布的美国专利申请2004/0132729中公开的化合物)。
将本发明的细胞并入支架中可只需将细胞沉积在支架上即可。细胞可通过单纯扩散进入支架(J.Pediatr.Surg.23(1 Pt 2)：3-9(1988))。已经开发了若干其他方法来提高细胞接种的效率。例如，已把转瓶用于将软骨细胞接种到聚乙醇酸支架上(Biotechnol.Prog.14(2)：193-202(1998))。另一种接种细胞的方法是使用离心作用，其对接种细胞产生的应力最小，并可提高接种效率。例如，Yang等人开发了一种细胞接种方法(J.Biomed.Mater.Res.55(3)：379-86(2001))，这种方法称为离心细胞固定法(CCI)。
本发明通过下述实例进一步说明，但并不受其限制。
实例
实例1
人胚胎干细胞培养
人胚胎干细胞系H1、H7和H9得自WiCell Research Institute，Inc.，(Madison，WI)并根据来源机构提供的说明进行培养。简而言之，在ES细胞培养基中，在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养细胞，所述培养基由补充有20％的Knockout血清替代品、100nM的MEM非必需氨基酸、0.5mM的β-巯基乙醇、2mM的L-谷氨酰胺和4ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(全部得自Invitrogen/GIBCO)的DMEM/F12(Invitrogen/GIBCO)组成。衍生自E13至13.5小鼠胚胎的MEF细胞购自Charles River。MEF细胞在补充有10％的FBS(Hyclone)、2mM谷氨酰胺和100mM的MEM非必需氨基酸的DMEM培养基中扩增。用10mg/ml丝裂霉素C(Sigma(St.Louis，MO))处理亚融汇态MEF细胞培养物3小时，以阻止细胞***，然后用胰蛋白酶处理并以2×104/cm2的密度平铺在用0.1％牛明胶涂布的培养皿上。将二至四传代的MEF细胞用作饲养层。将铺在MEF细胞饲养层上的人胚胎干细胞在润湿的组织培养箱(37℃，含5％的CO2的大气)中培养。当融汇时(铺板后大约5-7天)，用1mg/ml胶原酶IV型(Invitrogen/GIBCO)处理人胚胎干细胞5-10分钟，然后使用5ml吸量管轻轻刮去表面。以900rpm的转速将细胞旋转5分钟，在新鲜培养基中将粒料重悬并以1∶3至1∶4的细胞比率重新铺板。
实例2
定形内胚层的形成
检测激活素A对定形内胚层标志物表达的影响。将激活素A(100ng/ml)加到在小鼠胚胎成纤维细胞上培养的人胚胎干细胞群中。在存在激活素A的情况下连续培养细胞，并在所示时间收获细胞。通过PCR(图1)、FACS(结果汇总于表II)以及免疫组织化学(图2)检测定形内胚层标志物的表达水平。
激活素A在H9细胞系中引起CXCR4、GATA4、HNF-3β、Mixl1和Sox-17mRNA表达的时间依赖性增加(图1，屏面a)。也观察到前内胚层标志物Cerberus、Otx-1和Hex基因的显著上调(图1，屏面b)。在用激活素A处理后，通过FACS分析观察到了CXCR4蛋白的增加。在用激活素A处理后，上皮细胞钙粘蛋白和神经性钙粘蛋白的表达并未改变(表IIA)。CXCR4阳性细胞也为C-kit、EPCAM、CD99高度阳性，并为CD9阴性。这些标志物的表达模式在所检测的全部三种hES细胞系中一致(H7结果见表IIB，H1结果见表IIC)。对用激活素A处理了五天的细胞进行的免疫组织化学分析表明，在经处理的培养中，30-40％的细胞为Sox17和HNF-3β阳性。同时，几乎100％的分化细胞仍为Oct4阳性(图2)。随着多能性表面标志物表达的降低，结合定形内胚层标志物表达的增加，这些数据表明激活素A促进人胚胎干细胞向定形内胚层分化。
实例3
胰腺内胚层的形成
将已知可诱导人胚胎干细胞分化成胰腺内胚层的生长因子加入细胞培养物中。具体地讲，将已知可诱导胰腺内胚层形成的激活素A、bFGF和视黄酸加入细胞培养物中。
在第一系列实验中，将激活素A加入人胚胎干细胞群中，这些干细胞在补充有0％至2％血清和激活素A(100ng/ml)的DMEM/F12中，在小鼠胚胎成纤维细胞上培养长达七天。在图3所示的时间点收获细胞，并通过PCR分析所示基因的表达(图3、图4和图5)。在图3中，PCR分析表明用激活素处理的细胞表达了广谱的与内胚层发育相关的基因，包括GATA4(图3，屏面a)、Sox-17(图3，屏面b)、HNF-3β(图3，屏面c)和Mixl-1(图3，屏面d)。然而，未观察到Pdx1基因的表达。在用激活素处理的H7细胞中观察到了相同的内胚层谱系标志物表达模式(图6，屏面a至屏面f)。在此阶段，Oct4的表达无明显降低。
激活素A引起了胚外内胚层标志物Sox7(图4，屏面a)和AFP(图4，屏面b)表达的时间依赖性降低。激活素A降低了Brachyury(图5，屏面a)的表达，但对神经元标志物Zic1(图5，屏面b)的表达没有影响。
综上所述，这些数据表明，对应于响应激活素A处理而形成定形内胚层，Sox-17、Mixl1、Gata4和HNF-3β的表达增加，连同前内胚层标志物Otx1、Cer1和Hex基因上调。对定形内胚层标志物的免疫组织化学分析表明，这些基因的蛋白质表达也反映了mRNA表达中观察到的趋势。HNF-3β、Sox-17和GATA4的表达水平在未处理的细胞中较低，大约占全部细胞的10％至20％。而用激活素A(100ng/ml)处理五天，则将HNF-3β、Sox-17和GATA4的表达增加到占所有细胞的大约50％至90％(图7)。
在第二系列实验中，根据实例1所述的方法，将人胚胎干细胞培养物在未分化的培养条件下维持2-3天。在细胞融汇率达到70-80％后，将培养基变为添加了100ng/ml激活素A且含0至2％的FBS的DMEM/F12，并在激活素A存在下培养三天、五天或七天。在此时间间隔后，用视黄酸和bFGF的组合进一步处理细胞五至六天，如图8所示。收获培养物，并收集mRNA样品用于分析。也包括由单独地采用激活素A处理五天的细胞组成的对照培养物。
基因表达分析表明，单独的激活素A或视黄酸没有诱导Pdx 1的表达。对于在激活素A存在下用视黄酸与FGF联合处理的细胞培养物，也观察到类似结果(图8，屏面a)。然而，在不存在激活素A下用视黄酸和FGF处理细胞，则更进一步增加了Pdx1的表达(图8，屏面a)。用激活素A处理细胞三天，然后在不存在激活素A的情况下用1μM视黄酸和50ng/ml的bFGF(也称为FGF-2)处理5天，结果显示Pdx 1的表达水平大约为单独地采用激活素A处理5天的样品中观察到的表达水平高3500倍(图8，屏面a)。免疫细胞化学分析显示，所有细胞中的5％至20％表达了Pdx1(图9)。
在不存在激活素A的情况下用1μM视黄酸和bFGF处理也导致了GLUT-2和PTF1a(图8，屏面c)表达的增加，这在单独存在激活素A的情况下处理的细胞中未观察到。在用1mM视黄酸和50ng/ml的bFGF处理的细胞中观察到了最大的GLUT-2和PTF1a表达增加。综上所述，这些数据表明，在定形内胚层形成之后，从细胞培养物中移除激活素A进一步增强了胰腺内胚层的形成。
实例4
胰腺内分泌细胞的形成
根据实例1所述的方法，将人胚胎干细胞培养物在未分化的培养条件下维持3-4天。在细胞融汇率达到50-60％后，将培养基变为含100ng/ml激活素A无FBS的DMEM/F12，然后在此培养基中将细胞培养一天。在此为期一天的培养后，移除培养基，换为含0.5％的FBS和100ng/ml激活素A的培养基，并且将细胞培养一天。在此第二个为期一天的培养后，移除培养基，换为含2％的FBS和100ng/ml激活素A的培养基，并且将细胞培养一天。在此时间间隔后，如实例2中概述，用视黄酸和FGF的组合处理细胞六天，然后移除培养基，换为含2％的FBS和γ-分泌酶抑制剂L-685,458(10mM)的DMEM/F12培养基培养三天。收获培养物，并收集mRNA样品用于分析。也包括由单独地采用激活素A处理五天的细胞组成的对照培养物。
基因表达分析表明，单独的激活素A或视黄酸与FGF的组合没有诱导Ngn3或胰岛素的表达(图10，屏面a、屏面c)。在用L-685,458处理后也观察到了Hes-1表达的降低。处理后第三天观察到了最大抑制(图10，屏面d)。然而，用L-685,458处理细胞诱导了Ngn 3的表达，其水平大约比单独用激活素A或者用视黄酸和FGF的组合处理的样品中观察到的水平高50倍。在用γ-分泌酶抑制剂处理的样品中观察到胰岛素表达增加了70倍。L-685,458处理也进一步增加了NeuroD1的表达(图10，屏面a)。综上所述，这些数据表明，在胰腺内胚层形成后，从细胞培养物中移除视黄酸和FGF并加入γ-分泌酶抑制剂进一步增强了内分泌细胞的形成。
实例5
表达Nkx2.2的胰腺内分泌细胞的形成
将根据实例2中所述的方法获得的定形内胚层细胞进行如下处理：在基础培养基中将细胞培养3到5天，所述培养基包含：DMEM/F12、2％的FBS、50ng/ml激活素A、50ng/ml碱性FGF和1μM视黄酸。在单独地含1mM视黄酸或还含有bFGF的基础培养基中将细胞再连续培养3到5天。在此过程的多个时间点从细胞中收获RNA样品，以帮助评价细胞的定向分化。此外，在整个分化方案中定期移除和补充培养基及因子。加入激活素A显示，与无激活素A的样品相比，Nkx2.2的表达增加了约35倍。在培养的前三天，对于用激活素A处理的样品，其Pdx1表达维持在类似于不含激活素A的样品的水平上(图11)。综上所述，这些数据表明，向视黄酸和bFGF处理的前三天添加激活素A进一步增强了胰腺内分泌标志物Nkx2.2的表达。
实例6
培养中胰腺内胚层细胞的传代和扩增
本实例证明，本文衍生自人胚胎干细胞的胰腺内胚层细胞可在细胞培养中维持并传代，而不发生进一步分化。胰腺内胚层细胞在存在100ng/ml激活素A的情况下的低血清DMEM/F12中分化。低血清DMEM/F12在第1天含0％(v/v)胎牛血清(FBS)，在第二天含0.5％(v/v)的FBS，在之后的每天含2％(v/v)的FBS。分化四天后，在含有2％(v/v)的FBS、1mM视黄酸和50ng/ml的bFGF的低血清DMEM/F12中将细胞再培养共六天。分化六天后，将细胞在存在50ng/ml的FGF10的情况下含2％(v/v)的FBS的低血清DMEM/F12中共维持6天。在这六天的培养期中，将胰腺内胚层细胞传代两次，在这6天培养中细胞群体倍增时间为约36至48小时。在培养的第0天、第3天和第6天，使用Q-PCR测定表征胰腺内胚层的标志物基因的表达。图12示出在存在50ng/ml的FGF10的情况下，生长的细胞在其衍生后的六天培养期内维持了胰腺内胚层标志物Pdx1的表达。
实例7
由人胚胎干细胞衍生肝细胞
根据实例1中所述的方法，将人胚胎干细胞培养物在未分化的培养条件下维持2-3天。在细胞融汇率达到70-80％后，将培养基变为含2％的FBS和100ng/ml激活素A的DMEM/F12，在存在激活素A的情况下将细胞培养七天。用激活素A处理7天后，用图13所示的条件将细胞处理五天。之后，收获细胞，并采集mRNA样品用于分析。
在不存在激活素A的情况下培养的细胞中，观察到了a-甲胎蛋白(AFP)和白蛋白的表达增加(图13，屏面a)。视黄酸和FGF-4使其进一步增加(图13，屏面b)。综上所述，这些数据表明，人胚胎干细胞的培养物在经过上述处理后能够表达肝细胞标志物。此外，人胚胎干细胞能够分化成表达肝细胞特征性标志物的细胞。
实例8
H9人胚胎干细胞系的表征
通过评价由未分化的ES细胞表达的几种标志物的表达来监测H9细胞随时间而变化的品质(Carpenter等人，2001；Reubinoff等人，2000；Thomson等人，1998a)。H9细胞表现出阶段特异性胚胎抗原的交互表达(表III)。H9细胞对SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81、AP和CD9抗原具有较强的免疫反应性，所有这些抗原均为未分化的人胚胎干细胞的特征性。
通过RT-PCR评估了胚胎干细胞特征性基因的表达，例如OCT3/4、SOX-2、UTF-1、REX-1、Cx43、Cx45、ABCG-2和TERT，从而确定本实例中生长的细胞看起来类似于此前所述的未分化胚胎干细胞(表III)。通过免疫染色确定OCT3/4蛋白的表达和碱性磷酸酶的活性(Chemicon)。大部分H9细胞为OCT3/4和AP阳性(图14)。综上所述，这些结果表明：本实例中所用的H9细胞在形态、抗原免疫染色或多能标志物表达方面与其他实验室的记录相比并无明显差异。
实例9
荧光激活细胞分选(FACS)分析
通过与TrypLETM Express溶液(Invitrogen，CA)一起培育五分钟，将贴壁细胞从培养板上移除。将释放下来的细胞重悬于人胚胎干细胞培养基中，通过离心作用回收，然后洗涤并将细胞重悬于染色缓冲液中，该缓冲液由PBS(Sigma，MO)中的2％的BSA、0.05％叠氮化钠组成。根据需要，使用0.1％的γ-球蛋白(Sigma)溶液封闭细胞的Fc受体15分钟。将等分试样(大约105个细胞)要么与藻红蛋白(PE)标记的、要么与别藻蓝素(APC)标记的单克隆抗体(5μl抗体/106个细胞)一起培育，如表I所指出的那样，要么与未标记的一抗一起培育。对照包括相应的同型匹配抗体、未染色的细胞以及仅用标记的二抗染色的细胞。所有与抗体一起进行的培育均在4℃下进行30分钟，之后用染色缓冲液洗涤细胞。将用未标记的一抗染色的样品与PE或APC标记的二抗在4℃下再培育30分钟。所用二抗的列表参见表I。粒化洗涤后的细胞，并在染色缓冲液中重悬，使用FACSArray(BD Biosciences)仪器鉴定细胞表面分子，采集至少10,000个事件。
实例10
免疫细胞化学
用4％的多聚甲醛在室温下将接种在用0.1％的Matrigel(BD)涂布的平皿上的细胞固定20分钟。在室温下用PBS/0.1％的BSA/10％正常鸡血清/0.5％的Triton X-100将固定细胞封闭1小时，然后在PBS/0.1％的BSA/10％正常鸡血清中与一抗在4℃下培育过夜。一抗及其工作稀释度的列表示于表IB中。在PBS/0.1％的BSA中洗涤三次后，将在PBS中以1∶100稀释的荧光二抗与细胞在室温下培育一小时，使之结合。对照样品包括下列反应：省略一抗，或一抗被相同浓度的对应匹配阴性对照免疫球蛋白替代。漂洗染色后的样品；向每一个样品中加入一滴含二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)的
Figure GPA00001061332300531
(Invitrogen，CA)以复染细胞核并用作抗褪色剂。使用Nikon Confocal Eclipse C-1倒置显微镜(Nikon，Japan)和10-60X物镜采集图像。
实例11
未分化细胞的PCR分析
RNA提取、纯化和cDNA合成。RNA样品通过以下方法纯化：在存在含乙醇的高盐缓冲液的情况下结合到硅胶膜(Rneasy Mini Kit，Qiagen，CA)，然后洗涤以移除杂质。使用TURBO DNA-free试剂盒(Ambion，INC)进一步纯化RNA，然后在水中洗提高质量RNA。通过分光光度计上的A260和A280读数评估收率和纯度。使用ABI(ABI，CA)大容量cDNA库试剂盒由纯化的RNA制成cDNA拷贝。
实时PCR扩增和定量分析。除非另外指明，否则所有试剂均购自Applied Biosystems。使用ABI
Figure GPA00001061332300541
7900序列检测***进行实时PCR反应。使用
Figure GPA00001061332300542
UNIVERSAL PCR MASTER
Figure GPA00001061332300543
(ABI，CA)和20ng反转录RNA，使反应总体积为20ml。每一个cDNA样品以一式两份运行，以修正移液误差。引物和FAM标记的
Figure GPA00001061332300544
探针以200nM的浓度使用。使用此前由Applied Biosystem开发的人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)内源性对照对每一个目标基因的表达水平进行归一化。引物和探针组列举如下：Oct3/4(Hs00742896)、SOX-2(Hs00602736)、UTF-1(Hs00747497)、Rex-1(Hs00399279)、Connexin 43(Hs00748445)、Connexin 45(Hs00271416)、ABCG2(Hs00184979)、Tert  (Hs 00162669)、HNF 3b(Hs00232764)、GATA-4(Hs00171403)、Mixl1(Hs00430824)、Sox7(Hs00846731)、AFP(Hs00173490)、Brachyury(Hs00610080)、GSC(Hs00418279_m1)、Pdx-1(Hs00426216)、PTF1a(Hs00603586)、Ngn3(Hs00360700)、NeuroD1(Hs00159598)、胰岛素(Hs00355773)和Glu2(Hs00165775)。使用PRIMERS程序(ABI，CA)设计Sox17引物，序列如下，Sox17：TGGCGCAGCAGATACCA(序列标识号1)、AGCGCCTTCCACGACTTG(序列标识号2)和CCAGCATCTTGCTCAACTCGGCG(序列标识号3)。先在50℃下培育2分钟，然后在95℃下培育10分钟，样品按以下两个阶段循环40轮：变性步骤，95℃下15秒；退火/延伸步骤，60℃下1分钟。使用
Figure GPA00001061332300545
7000序列检测***软件进行数据分析。对于每一组引物/探针，Ct值确定为荧光强度达到扩增指数区中间特定值时的循环数。使用比较性Ct法计算相对基因表达水平。简而言之，对于每一个cDNA样品，从关注的基因的Ct值减去内源对照的Ct值，得到ΔCt值(DCt)。根据2-ΔCt计算归一化的目标量，假定扩增率为100％。最终的数据相对于校准样品进行表示。
实例12
核型分析
通过标准G显带核型分析确定H9细胞的核型。评价总共100个中期染色体涂片(Applied Genetics Laboratories，Inc.)。在分析的100个细胞中未发现染色体畸变。细胞遗传学分析表明，细胞具有正常数量的常染色体，染色体数为46。图15示出得自人胚胎干细胞系H9的典型核型。
实例13
在涂布有细胞外基质的组织培养基质上的人胚胎干细胞培养
人胚胎干细胞系H1、H7和H9得自WiCell Research Institute，Inc.，(Madison，WI)，并根据来源机构所提供的说明进行培养。简而言之，在ES细胞培养基中，在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养细胞，所述培养基由补充有20％的Knockout血清替代品、100nM的MEM非必需氨基酸、0.5mM的β巯基乙醇、2mM的L-谷氨酰胺以及4ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的DMEM/F12(Invitrogen/GIBCO)组成。衍生自E13至13.5小鼠胚胎的MEF细胞购自Charles River。MEF细胞在补充有10％的FBS(Hyclone)、2mM谷氨酰胺和100mM的MEM非必需氨基酸的DMEM培养基中扩增。用10μg/ml丝裂霉素C(Sigma(St.Louis，MO))处理亚融汇的MEF细胞培养物3小时，以阻止细胞***，然后用胰蛋白酶处理，并以2×104/cm2的密度铺在0.1％牛明胶涂布的平皿上。使用二至四传代的MEF细胞作为饲养层。将铺在MEF细胞饲养层上的人胚胎干细胞在潮湿的组织培养箱(37℃，含5％的CO2的大气)中培养。当融汇时(铺板后大约5至7天)，用1mg/ml胶原酶IV型(Invitrogen/GIBCO)处理人胚胎干细胞5至10分钟，然后用5ml玻璃吸量管轻轻刮下表面。将细胞以900rpm的转速离心处理5分钟，重悬粒料，以1∶3至1∶4的细胞比率重新铺在涂布有生长因子减少的MATRIGELTM(BD Biosciences)(1∶30的稀释液)的平板上。然后，在补充有8ng/ml的bFGF的MEF条件培养基中培养细胞，并在MATRI GEL涂布的平板上用胶原酶传代至少五传代。在MATRIGELTM上培养的细胞用胶原酶IV(Invitrogen/GIBCO)、分散酶(BDBiosciences)或Liberase酶(Roche，IN)进行常规地传代。
实例14
在涂布有细胞外基质的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内 胚层分化
如此前在Nature Biotechnology(《自然生物技术》)23，1534-1541(2005年12月)中所述进行胚胎干细胞向定形内胚层的分化。简而言之，将大约60至70％融汇率的H9培养物暴露于补充有0.5％的FBS和100ng/ml激活素A的DMEM：/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基再处理三天。H9细胞在用生长因子减少的MATRIGEL(1∶30至1∶10的稀释液)涂布的平板上，或在常规MATRIGEL(1∶30至1∶10的稀释液)上培养。将平板用MATRIGEL在室温下涂布1小时。
在第5天，通过FACS分析培养物的CXCR4、上皮细胞钙粘蛋白、CD9和神经性钙粘蛋白表达，通过实时PCR分析SOX-17、SOX-7、α-甲胎蛋白(AFP)、CXCR4、Brychyury(Bry)、gooscecoid(GSC)、HNF-3β和GATA4。AFP和SOX-7被认为是内脏内胚层标志物，而GATA4、HNF-3β和SOX-17则代表定形内胚层标志物，GSC、Bry和CXCR4代表原条标志物。图17示出FACS检测的CXCR4表达。与较低浓度的MATRIGEL相比，对于在用1∶10稀释的MATRIGEL涂布的平板上培养的细胞，其CXCR4表达存在明显的增加。此外，与常规MATRIGEL相比，生长因子减少的MATRIGEL在定形内胚层细胞形成上并非那么有效。
图18示出实时PCR的结果，其证实了与1∶30稀释的MATRIGEL上培养的细胞相比，在用1∶10稀释的MATRIGEL涂布的平板上培养的细胞表现出定形内胚层标志物的明显上调。
实例15
在形成定形内胚层后胚胎干细胞中基因表达改变的微阵列分析
使用RNeasy微量提取试剂盒(Qiagen)从下列人胚胎干细胞培养物中分离总RNA：H9P83细胞在MATRIGEL涂布的平板上培养，并且暴露于补充有0.5％的FBS和100ng/ml激活素A的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基再处理三天；H9P44细胞在MEF上培养，并且暴露于补充有0.5％的FBS和100ng/ml激活素A的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS和100ng/ml激活素A的DMEM/F12培养基再处理三天。每一个组的对照包括铺在MATRIGEL涂布的平皿上并在MEF条件培养基中培养的细胞，或铺在MEF上并在ES培养基中培养的细胞。
根据Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array进行样品制备、杂交和图像分析。在归一化和对数转换后，使用软件(MA)和GENESIFTER(VizXLabs，WA)进行数据分析。使用Pearson相关系数比较每一个处理内以及不同处理间的差异。在不同处理之间基因表达谱的差异连同细胞系之间的相关系数在图19中示出。使用方差分析和F检验评价样品之间基因表达的显著性差异，其具有≤0.05的调整后P值(Benjamini和Hochberg校正)。分析中仅包括当前调用的基因。表IV列出了多个样品之间差异至少达5倍的差异表达基因。列出了显著表达的基因的归一化强度值连同每一个基因的均值标准差(SEM)。
实例16
在用MATRIGEL TM 涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内 胚层的分化
如此前在Nature Biotechnology(《自然生物技术》)23，1534-1541(2005年12月)中所述进行胚胎干细胞向定形内胚层的分化。简而言之，将接种于生长因子减少的MATRIGELTM(1∶30的稀释液)培养基上的H9、H7或H1细胞在约60％至70％融汇率时暴露于补充有0.5％的FBS和100ng/ml激活素A(R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基再处理三天。在所有后续的实例中，除非另外指明，否则此处理方案均称为定形内胚层(DE)方案。同时，将在MEF饲养层上培养的H9、H7或H1细胞也暴露于上述同一DE方案。
在第5天，通过FACS分析培养物的CXCR4、上皮细胞钙粘蛋白、CD9、CD99和神经性钙粘蛋白(CD56)的表达，通过实时PCR分析SOX-17、SOX-7、α-甲胎蛋白(AFP)、CXCR4、Brychyury(Bry)、gooscecoid(GSC)、HNF-3β和GATA4。AFP和SOX-7被认为是内脏内胚层标志物，而GATA4、HNF-3β和SOX-17则代表定形内胚层标志物，GSC、Bry和CXCR4代表原条标志物。
将H细胞系在小鼠饲养细胞上培养并暴露于DE方案，通过FACS发现稳定表达了DE标志物，并表达了CXCR4(图20)。在用DE方案处理后，上皮细胞钙粘蛋白表达存在显著的降低。最后，CXCR4+细胞群也为CD117染色阳性。图21示出相比于未处理的H7(图21，屏面a)和H9细胞(图21，屏面b)，定形内胚层标志物显著上调。
不同于在MEF饲养层上培养的H细胞系，在MATRIGELTM(1∶30的稀释液)上培养并用定形内胚层方案处理的H细胞系未表现出定形内胚层标志物的稳定表达。具体地讲，通过FACS和实时PCR分析发现，与在小鼠胚胎成纤维细胞上培养的细胞相比，在MATRIGELTM上培养的细胞的CXCR4表达明显更低。定形内胚层标志物的表达遵循一般的反应模式，即H1大于H9大于H7(图22和图23)。与H7和H9细胞系相比，H1细胞从图22示出明显的CXCR4表达增加。应注意在所有的情况中，与在小鼠胚胎成纤维细胞上培养的细胞相比，在MATRIGELTM(1∶30的稀释液)上培养的细胞的CXCR4表达较低。图23(屏面a-c)示出实时PCR结果，其显示在H7(图23，屏面a)和H9(图23，屏面b)细胞系中定形内胚层标志物的上调存在适度的提高。然而，与H7和H9细胞系相比，H1(图23，屏面c)细胞系示出定形内胚层标志物更稳定的上调。
实例17
在用MATRIGEL TM 涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内 胚层(DE)的分化-Wnt配体的作用
将H7P44和H9P46胚胎干细胞在MATRIGELTM(1∶10的稀释液)涂布的平皿上培养，并暴露于补充有0.5％的FBS和100ng/ml激活素A(R&DSystems，MN)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基再处理三天。在一些培养中，在整个五天处理期内补充有20ng/ml的Wnt-3a(目录#1324-WN-002，R&DSystems，MN)、20ng/ml的Wnt-5a(目录#654-WN-010，R&D Systems，MN)、25ng/ml的Wnt-7a(目录#3008-WN-025，R&D Systems，MN)或25ng/ml的Wnt-5b(目录#3006-WN-025，R&D Systems，MN)。图24示出H9P46定形内胚层培养物在高浓度(a)AA或(b)AA+20ng/ml的Wnt-3a的情况下的相差图。图25示出对于在MATRIGELTM(1∶30的稀释液)上培养并暴露于DE方案+Wnt-3a(图25，屏面b和屏面d)和-Wnt-3a(图25，屏面a和屏面c)的H7P44和H9P46细胞系在第5天通过FACS检测的CXCR4表达。与用低血清加高浓度AA处理的DE培养物相比，DE培养物中存在Wnt-3a导致了CXCR4(CD184)的稳定表达。图26示出用低血清+AA±Wnt配体处理的a)H7和b)H9培养物的实时PCR数据。对于两H细胞系，添加WNT-3a导致了定形内胚层标志物的显著上调。相比之下，Wnt5a、Wnt-5b和Wnt-7a对定形内胚层标志物的表达影响甚微。
实例18
在用MATRIGEL TM 涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内 胚层的分化：Wnt-3a的有效剂量
将H9P46胚胎干细胞在MATRIGELTM(1∶10的稀释液)涂布的平皿上培养，并暴露于补充有0.5％的FBS、100ng/ml激活素A(AA)和10-50ng/ml的Wnt-3a(R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS、100ng/ml激活素A(AA)和10-50ng/ml的Wnt-3a的DMEM/F12培养基再处理三天。对照培养物不用Wnt-3a处理。图27屏面示出a)在不存在Wnt-3a、b)含10ng/ml的Wnt-3a、c)含20ng/ml的Wnt-3a和d)含50ng/ml的Wnt-3a的情况下在第5天通过FACS检测的CXCR4表达。在不存在Wnt-3a的情况下，CXCR4的表达非常低。相比之下，添加10-50ng/ml的Wnt-3a明显增加了CXCR4阳性细胞的数量。此外，添加10ng/ml的Wnt-3a与添加50ng/ml的Wnt-3a一样有效。实时PCR结果(图28，屏面a)也证实了这一发现。
在一项单独的研究中，将H9p52细胞平铺在1∶30低生长因子MATRIGELTM上。在DE方案的最初两天，使用了一系列的Wnt3A剂量：10ng/ml、5ng/ml和1ng/ml。图28屏面b示出处理5天后DE标志物的PCR分析。实验结束时的细胞数在图28屏面c中示出。这表明在使用高剂量Wnt-3a时细胞发生增殖。将Wnt3a处理延长到5天(5D)，通过PCR分析发现其对DE标志物几乎没有影响，并且未显著增加细胞数(图28，屏面c)。这些数据表明，用10ng/ml的Wnt3a处理两天即足以达到最优的细胞扩增和定形内胚层分化。
实例19
在用MATRIGEL TM 涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内 胚层(DE)的分化-GSK-3B抑制剂的作用
为了确认Wnt-3a是通过Wnt通道发挥作用的，使用GSK-3抑制剂活化Wnt的下游靶标，例如β-连锁蛋白。将H9P46-P48胚胎干细胞在MATRIGELTM涂布(1∶10的稀释液)的平皿上培养，并暴露于补充有0.5％的FBS、100ng/ml激活素-A(AA)和10-1000nM的GSK-3B抑制剂IX(目录#361550，Calbiochem，CA)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS、100ng/ml激活素A(AA)和0-1000nM的GSK-3B抑制剂IX(目录#361550，Calbiochem，CA)的DMEM/F12培养基再处理三天。用低血清加高剂量激活素A±Wnt-3a处理对照培养物。图29，屏面a示出在以下情况下于第5天通过FACS检测的CXCR4表达：无Wnt-3a或GSK-3B抑制剂；b)+20ng/ml的Wnt-3a；c)+1000nM的GSK-3B抑制剂IX；d)+500nM的GSK-3B抑制剂IX；e)+100nM的GSK-3B抑制剂IX；f)+10nM的GSK-3B抑制剂IX；g)+100nM的GSK-3B抑制剂IX，第1-2天；以及h)+10nM的GSK-3B抑制剂IX，第1-2天。
在不存在Wnt-3a的情况下或存在10nM的GSK-3B抑制剂时，CXCR4的表达极低。相比之下，添加20ng/ml的Wnt-3a或100-1000nM的GSK-3B抑制剂明显增加了CXCR4阳性细胞数。此外，在第1-2天添加100nM的GSK-3B抑制剂与整个五天都添加100nM的GSK-3B抑制剂一样有效。图30示出(屏面a)H9P48细胞和(屏面b)H9P46细胞的定形内胚层标志物基因表达。
图16示出本发明中分化方案的概要，其中在无饲养层体系中将胚胎干细胞分化成定形内胚层。
实例20
在用MATRIGEL TM 涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内 胚层(DE)的分化-在存在GSK-3B抑制剂或Wnt-3A的情况下激活素A的有 效剂量
将H9P49和H1P46胚胎干细胞在MATRIGELTM涂布(1∶10的稀释液)的平皿上培养，并暴露于补充有0.5％的FBS、10-100ng/ml激活素A(AA)和100nM的GSK-3B抑制剂IX(目录#361550，Calbiochem，CA)或20ng/ml的Wnt-3a的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS、10-100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基再处理三天。用低血清加100ng/ml激活素A处理对照培养物。图31示出在以下处理情况下于第5天通过FACS检测的H9P49和H1P46的CXCR4表达：a)在整个五天±10ng/ml激活素A，以及在最初两天使用20ng/ml的Wnt-3a；b)在整个五天±100ng/ml激活素A，以及在最初两天使用20ng/ml的Wnt-3a；c)在整个五天±100ng/ml激活素A，以及在最初两天使用100nM的GSK-3B抑制剂IX；d)在整个五天±10ng/ml激活素A，以及在最初两天使用100nM的GSK-3B抑制剂IX；e)在整个五天±100ng/ml激活素A，以及在最初两天使用20ng/ml的Wnt-3a；f)在整个五天±10ng/ml激活素A，以及在最初两天使用20ng/ml的Wnt-3a。图31的屏面a-d针对H9P49细胞，而屏面e-f则针对H1P46细胞。图32示出用10、50或100ng/ml激活素A加20ng/ml的Wnt-3a处理的H9P49培养物的定形内胚层标志物的基因表达：屏面a：AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF-3B和POU5F(Oct-4)的表达；以及屏面b：SOX-17和GATA4的表达。这并非合计，可能有附图数字问题或为剪切和粘贴问题。看来可通过使用50ng/ml的AA+20ng/ml的Wnt-3a或100nM的GSK-3B抑制剂IX获得定形内胚层标志物的稳定表达。较低剂量的激活素A导致了胚外内胚层的形成。
实例21
在用MATRIGEL TM 涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内 胚层(DE)的分化-Wnt-3a和GSK-3B抑制剂的组合
将H9P53胚胎干细胞在MATRIGELTM涂布(1∶30的稀释液)的平皿上培养，并暴露于补充有0.5％的FBS、100ng/ml激活素A(AA)和100nM的GSK-3B抑制剂IX(目录#361550，Calbiochem，CA)±20ng/ml的Wnt-3a的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS、10-100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基再处理三天。同时，用25ng/ml的BMP-4(目录#314-BP-010，R&D Systems，MN)±20ng/ml的Wnt-3a±100ng/ml激活素A处理H9P53培养物。用低血清加100ng/ml激活素A处理对照培养物。图33示出在以下处理情况下于第五天通过FACS检测的CXCR4表达：a)在整个五天使用100ng/ml激活素A，在最初两天使用20ng/ml的Wnt-3a，以及在第3-5天使用25ng/ml的BMP-4；b)在整个五天使用100ng/ml激活素A，以及在最初两天使用20ng/ml的Wnt-3a；c)在整个五天使用100ng/ml激活素A，以及在最初两天使用100nM的GSK-3B抑制剂IX；d)在整个五天使用20ng/ml的Wnt-3a+25ng/ml的BMP-4；e)在整个五天使用100ng/ml激活素A，以及在最初两天使用20ng/ml的Wnt-3a+100nM的GSK-3B抑制剂IX；f)在整个五天使用100ng/ml激活素A+25ng/ml的BMP-4。图34示出，对于用10或100ng/ml激活素A加20ng/ml的Wnt-3a或100nM的GSK-3B抑制剂处理的人胚胎干细胞系H1的培养物在第46传代时，通过实时PCR测定的定形内胚层标志物的基因表达：屏面(a)：AFP、Bry、CXCR4、GSC和POU5F(Oc t-4)的表达；屏面(b)：SOX-17、HNF-3B和GATA4。结果以相对于未处理的细胞的增加倍数表示。图35示出，对于用50或100ng/ml激活素A加10或100nM的GSK-3B抑制剂处理的人胚胎干细胞系H9在第49传代时，通过实时PCR测定的定形内胚层标志物的基因表达：屏面(a)：AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF-3B和POU5F(Oct-4)的表达；屏面(b)：SOX-17和GATA4。结果以相对于未处理的细胞的增加倍数表示。图36示出用激活素A、Wnt-3a、GSK-3抑制剂和BMP-4的组合处理的H9P53培养物的定形内胚层标志物的基因表达：a)AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF-3B和SOX7的表达；b)SOX-17、HNF-3B和GATA4。将BMP-4加入DE方案似乎诱导了中胚层标志物BRY的形成，在存在激活素A的情况下，与添加每一种试剂本身相比，Wnt-3A和GSK-4B抑制剂的组合不导致定形内胚层标志物显著上调。
实例22
在MEF上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层(DE)的分化-低血清中 Wnt-3a、激活素A、Wnt-5a、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、IL-4和SDF- 1的组合
将H9P44细胞平铺在此前经丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)涂布的6孔板上。在ES细胞培养基中让细胞生长到70％至80％的融汇率，该培养基由补充有20％的Knockout血清替代品、100nM的MEM非必需氨基酸、0.5mM的β-巯基乙醇、2mM的L-谷氨酰胺(均得自Invitrogen/GIBCO)和8ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(R&DSystems)的DMEM/F12(Invitrogen/GIBCO)组成。
对于DE的形成，除了下面详述的其他生长因子外，还在存在或不存在激活素A(100ng/ml)的情况下处理细胞。如下述方案所示，将生长因子加到浓度递增的FBS中：
第0天：DMEM/F12中0％的FBS
第1天：DMEM/F12中0.5％的FBS
第2天：DMEM/F12中2％的FBS
第3天：收获细胞以用于FACS和RT-PCR分析。
所有生长因子均购自R&D Systems，MN。每一个处理组中生长因子的详细说明和浓度如下所示。
1.对照-不添加生长因子
2.激活素A(100ng/ml)
3.激活素A(100ng/ml)+Wnt-3a(10ng/ml)+Wnt5a(10ng/ml)
4.激活素A(100ng/ml)+Wnt-3a(10ng/ml)+Wnt5a(10ng/ml)+
BMP2(100ng/ml)
5.激活素A(100ng/ml)+BMP-4(100ng/ml)
6.激活素A(100ng/ml)+BMP-6(100ng/ml)
7.激活素A(100ng/ml)+BMP-7(100ng/ml)
8.激活素A(100ng/ml)+BMP-4(100ng/ml)+BMP-6(100ng/ml)+BMP-7(100ng/ml)
9.IL-4(10ng/ml)
10.SDFla(20ng/ml)
11.激活素A(100ng/ml)+IL-4(10ng/ml)+SDFla(20ng/ml)
12.BMP2(100ng/ml)+BMP-4(100ng/ml)+BMP-6(100ng/ml)+BMP-7(100ng/ml)
13.激活素A(100ng/ml)BMP-2(100ng/ml)+BMP-4(100ng/ml)+BMP-6(100ng/ml)+BMP-7(100ng/ml)
14.激活素A(100ng/ml)+IL-4(10ng/ml)
15.激活素A(100ng/ml)+(SDFla(20ng/ml)
16.激活素A(100ng/ml)+Wnt-3a(10ng/ml)+Wnt-5a(10ng/ml)+Wnt-7a(10ng/ml)
17.激活素A(100ng/ml)+IL-4(10ng/ml)+SDF1a(20ng/ml)+BMP-4(100ng/ml)
结果：
在DE方案处理的第3天收获细胞。为了分析，将经处理的细胞的等分试样用于制备RNA以进行RT-PCR，剩下的细胞则用于FACS分析。CXCR4的频率(％)在图37中示出。添加上述生长因子并未使CXCR4的表达增加到高于含100ng/ml的AA的低血清处理。
对于RT-PCR分析，分析细胞的所选组的定形内胚层标志物的表达。所示结果相对于在基础培养基中生长、但未用激活素A或其他生长因子中的任何因子处理的细胞进行了校正。与FACS数据相符，表V示出，将生长因子(例如Wnt-3a)加入用低血清、高剂量激活素A处理的培养物中没有显著上调定形内胚层标志物。这与此前的实例相比之下，此前的实例显示在存在激活素A、WNT3A和低血清的情况下在无饲养层条件下培养的ES细胞的DE标志物显著增加。
实例23
在用MATRIGEL TM 或人纤粘蛋白涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干 细胞向定形内胚层(DE)的分化
H9P55细胞在人纤粘蛋白或常规生长因子MATRIGELTM(BDBiosciences)上生长和分化。向6孔组织培养处理板中的每一个孔中加入1ml含1ug/ml人纤粘蛋白(R&D systems，MN)的DMEM/F12(Invitrogen/GIBCO)。或者，将常规生长因子MATRIGELTM在DMEM/F12中1∶10的稀释液，向6孔组织培养处理板中的每一个孔中加入1ml经稀释的MATRIGELTM。用胶原酶进行细胞传代。在细胞达到80％融汇率之后，进行如下处理：用含有10ng/ml小鼠重组Wnt3a(R&D)和100ng/ml激活素A(R&D)的0.5％的FBS处理两天。然后用2％的FBS加100ng/ml激活素A处理3天。图38屏面a-b分别示出在纤粘蛋白和MATRIGEL上培养的胚胎干细胞的CXCR4表达。实时PCR结果(图39)证实了在纤粘蛋白和MATRIGELTM涂布的平板上定形内胚层的形成相当。
实例24
在用不同浓度的MATRIGEL TM 涂布的组织培养基质上人胚胎干细胞向定 形内胚层的分化
将大约60％至70％融汇率的H9培养物暴露于补充有0.5％的FBS、20ng/ml的Wnt-3a和100ng/ml激活素A的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS、20ng/ml的Wnt-3a和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基再处理三天。在用常规MATRIGEL(1∶60至1∶10的稀释液)涂布的平板上培养H9细胞。用MATRIGEL在室温下涂布平板1小时。
实时PCR结果在图40中示出。用低血清、激活素A和Wnt3a处理人胚胎干细胞导致了CXCR4、GATA4、Goosecoid、HNF-3β和SOX-17基因的表达，提示细胞正在向定形内胚层阶段分化。然而，在存在Wnt-3A的情况下，MATRIGELTM涂层的浓度在分化中似乎并不起重要作用。
实例25
在涂布有细胞外基质的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞的分化以 及随后在MEF上培养并向定形内胚层分化-wnt-3a的作用
将得自在MATRIGELTM上培养至少五传代的人胚胎干细胞系H9的细胞接种到ES培养基中的MEF饲养层上。当细胞达到60％至70％融汇率时，将它们暴露于补充有0.5％的FBS和100ng/ml激活素A的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基再处理三天。附加的处理组包括用20ng/ml的Wnt-3a处理(整个五天)以及用10-100ng/ml的激活素A处理。
在第3天和第5天，通过实时PCR分析培养物的SOX-17、SOX-7、α-甲胎蛋白(AFP)、CXCR4、Brychyury(Bry)、gooscecoid(GSC)、HNF-3β、GATA4、hTERT和Oct4。AFP和SOX-7被认为是内脏内胚层标志物，而GATA4、HNF-3β和SOX-17则代表定形内胚层标志物，GSC、Bry和CXCR4代表原条标志物。hTERT和Oct-4分别是自我更新和多能性标志物。实时PCR结果在图41屏面a-d中示出。在第3天和第5天还进行了FACS分析。分析CXCR-4和CD9的表达水平，并记录在图41屏面e中。
在不存在Wnt3a的情况下，在100ng/ml激活素A中培养的细胞的AFP表达水平与未处理对照中所见相似。然而，向在100ng/ml激活素A中培养的细胞添加Wnt3a增加了AFP的表达(随时间而增加)。当使用较低浓度的激活素A时，AFP表达非常高，不论是否存在Wnt3a(图41，屏面a)。这表明高浓度的激活素A是避免细胞分化成胚胎外组织所必需的。
通过FACS分析发现，在第3天，CXCR4阳性细胞在用高浓度激活素A处理但不用Wnt3a处理的样品中占细胞群的32-42％，相比之下，在用高浓度的激活素A和Wnt 3a处理的样品中则占细胞群的23-33％(图41，屏面e)。到处理的第5天，在用高浓度激活素A处理但不用Wnt3a处理的细胞中有28-32％表达CXCR4，相比之下，用高浓度的激活素A和Wnt3a处理的细胞则有43-51％表达CXCR4(图41，屏面f)。在用低浓度激活素A处理的细胞中，与Wnt-3a处理组(3％至4％)相比，不用Wnt3a的处理组中存在更多的CXCR4阳性细胞(11％至20％)(图41，屏面g)。综上所述，对于在MEF上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分化，Wnt-3a似乎并不发挥重要作用。这表明饲养层可能会分泌足够的Wnt-3a或类似配体以增强激活素A诱导的定形内胚层形成。
实例26
用Wnt抑制剂DKK-1处理后在涂布有细胞外基质的组织培养基质上培 养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分化
为了确定加入Wnt-3a是否会造成分化增加，将Wnt-3信号抑制剂加入培养物。将大约60％至70％融汇率的H9培养物暴露于补充有0.5％的FBS、20ng/ml的Wnt3a、100ng/ml的Dikkopf-1(DKK-1)和100ng/ml激活素A的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基再处理三天。在用生长因子减少的MATRIGEL(1∶30的稀释液)涂布的平板上培养H9细胞。用MATRIGEL在室温下涂布平板1小时。
在第5天，通过实时PCR分析培养物的SOX-17、SOX-7、α-甲胎蛋白(AFP)、CXCR4、Brychyury(Bry)、gooscecoid(GSC)、HNF-3β、GATA4、hTERT和Oct4。AFP和SOX-7被认为是内脏内胚层标志物，而GATA4、HNF-3β和SOX-17则代表定形内胚层标志物，GSC、Bry和CXCR4代表原条标志物。hTERT和Oct-4分别是自我更新和多能性标志物。结果示于图42中。
在存在Wnt3a的情况下，细胞表达了CXCR4、GATA4、HNF-3β和SOX17，即所有的定形内胚层标志物。也测得原条形成的标志物(如goosecoid)的水平高于未处理对照中测得的水平。在加入DKK1的条件下，上述分化标志物的表达水平大大降低到类似于未经处理的细胞的水平。
实例27
在MATRIGEL涂布的组织培养基质上培养以及在低血清加激活素a和 ±Wnt-3a中分化的H9胚胎干细胞的DE标志物的免疫荧光染色
在第5天，根据实例10将H9细胞的DE培养物针对SOX-17、HNF-3B、GATA-4、神经性钙粘蛋白和上皮细胞钙粘蛋白进行染色。所有细胞核均用DAPI进行复染。与在不存在Wnt-3a的情况下分化的培养物相比，20ng/ml的Wnt-3a导致SOX-17、HNF-3β和GATA-4染色阳性的细胞核数量明显更高。此外，加入Wnt-3a还导致了上皮细胞钙粘蛋白表达的显著缺失，以及神经性钙粘蛋白表达的提高(图43屏面a和图43屏面b)。
实例28
在MEF上与在MATRIGEL TM 上相比，定形内胚层形成后胚胎干细胞中基 因表达变化的微阵列分析
使用RNeasy微量提取试剂盒(Qiagen)从下述胚胎干细胞培养物中分离总RNA：A)H9P33细胞，其在MATRIGELTM(1∶30的稀释液)涂布的平板上培养并暴露于补充有0.5％的FBS和100ng/ml激活素A的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基再处理三天；B)H9P44细胞，其在MEF上培养并暴露于补充有0.5％的FBS和100ng/ml激活素A的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS和100ng/ml激活素A的DMEM/F12培养基再处理三天；和C)H9P48细胞，其在MATRIGELTM(1∶30的稀释液)涂布的平板上培养并暴露于补充有0.5％的FBS和100ng/ml激活素A加20ng/ml的Wnt-3a的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基再处理三天。每一个组的对照包括铺在MATRIGEL涂布的平皿上并培养于MEF条件培养基中的细胞，或铺在MEF上并培养于ES培养基中的细胞。所有组均含有三个生物学复制，每一个生物学复制在两个独立的基因芯片上重复。
根据Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array进行样品制备、杂交和图像分析。在归一化和对数转换之后，使用
Figure GPA00001061332300681
软件(MA)和GENESIFTER(VizXLabs，WA)进行数据分析。使用方差分析和F检验评价样品间基因表达的显著差异，其具有≤0.05的调整后P值(Benjamini和Hochberg校正)。分析中仅包括当前调用的基因(在至少一组中)。表IV列出了A组、B组和C组之间差异至少5倍的基因的平均归一化对数转换信号强度，以及每一个基因的调整后P值。
实例29
在用MATRIGEL TM 涂布的组织培养基质上培养的SA002 ES细胞系向定 形内胚层(DE)的分化
将此前在补充有8ng/ml的bFGF的MEF-CM中，在MATRIGEL(1∶30的稀释液)涂布的平板上培养了至少三传代的SA002P38细胞(Cellartis，Sweden)暴露于补充有0.5％的FBS和100ng/ml激活素A(R&D Systems，MN)±20ng/ml的Wnt-3a或100nM的GSK-3B IX抑制剂的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基再处理三天。实时PCR结果示于图44，屏面a和屏面b中。类似于H1、H7和H9细胞系，SA002细胞系也需要加入Wnt-3A才能稳定表达DE标志物。CXCR4的表达在图45中显示：a)AA处理；b)AA+Wnt-3a；c)AA+GSK-3B抑制剂。
实例30
在用人血清涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层 (DE)的分化
使第55传代人胚胎干细胞系H1的培养物在人血清(Sigma，#H1388，MO)涂布的平板上生长和分化。将0.5ml人血清加入6孔组织培养处理板中的每一个孔中，室温培育1小时，然后在加入人胚胎干细胞前将其吸出。在细胞达到80％融汇率后，进行如下处理：用含10ng/ml小鼠重组Wnt3a(R&D)或100nM的GSK-3B抑制剂IX(目录#361550，Calbiochem，CA)和100ng/ml激活素A(R&D)的0.5％的FBS处理两天。接下来用2％的FBS加100ng/ml激活素A处理3天。然后通过实时PCR分析培养物(图46屏面a和屏面b)。我们注意到，用激活素A+GSK-3B抑制剂或Wnt-3A处理的细胞相比仅用激活素A处理的细胞稳定表达了定形内胚层标志物。这些发现与我们对在MATRIGELTM或人纤粘蛋白涂布的平板上培养的人胚胎干细胞的发现一致。
实例31
在用MATRIGEL TM 涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内 胚层(DE)的分化-评价多种GSK-3B抑制剂
评价多种市售GSK-3B抑制剂在人胚胎干细胞形成DE中的有效性。评价了下列GSK-3B抑制剂(100nM)：GSK-3B抑制剂VIII(目录#361549，Calbiochem，CA)、GSK-3B抑制剂IX(目录#361550，Calbiochem，CA)、GSK-3B抑制剂XI(目录#361553，Calbiochem，CA)、GSK-3B抑制剂XII(目录#361554，Calbiochem，CA)。将H1P54ES细胞在MATRIGELTM(1∶30的稀释液)涂布的平皿上培养并暴露于补充有0.5％的FBS、100ng/ml激活素A(AA)+/-多种GSK-3B抑制剂的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS、100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基再处理三天。用低血清加高剂量AA处理对照培养物。图47屏面a和屏面b示出在第5天时定形内胚层标志物的基因表达。相比GSK-3B抑制剂VIII和XII，GSK-3B抑制剂IX和XI对诱导DE的形成均有效。
实例32
在无饲养层条件下培养的人胚胎干细胞形成胰腺内胚层-评价视黄酸 类似物
将H9P49胚胎干细胞在MATRIGELTM(1∶30的稀释液)涂布的平皿上培养并暴露于补充有0.5％的FBS、20ng/ml的Wnt-3a(目录#1324-WN-002，R&D Systems，MN)和100ng/ml激活素A(R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基再处理三天。在第5天，收集细胞用于通过FACS和实时PCR进行评价。如此前实例所示，此方案导致定形内胚层标志物(例如CXCR4和SOX-17)稳定上调。将在第5天所得的定形内胚层细胞暴露于下述培养基条件以诱导胰腺内胚层的形成：在补充有2％的FBS和1mM全反视黄酸(RA)(目录#R2625，Sigma，MO))或0.1-10mM的AM-580(4-[(5，6，7，8-四氢-5，5，8，8-四甲基-2-萘基)甲酰胺基]苯甲酸，目录#A8843，Sigma，MO)或0.1-1mM的TTNPB(4-[(E)-2-(5，6，7，8-四氢-5，5，8，8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯基]苯甲酸芳维A酸，目录#T3757，Sigma，MO)的DMEM/F12培养基中培养3天。AM-580和TTNPB为视黄酸类似物，其对视黄酸受体具有亲和性。RA处理后，在补充有2％的FBS和20-50ng/ml的bFGF(目录#F0291，Sigma，MO)的DMEM/F12培养基中再处理三天。收获培养物，并采集mRNA样品用于分析。
基因表达分析表明(图48屏面a-d)添加1mM RA然后暴露于bFGF显著上调了胰腺内胚层标志物，例如PDX-1。此外，此方案导致前肠内胚层标志物(例如CDX-2和AFP)稳定表达。在1mM的浓度下，添加RA类似物导致相当的胰腺内胚层和前肠标志物。然而，与全反视黄酸相比，添加1mM的RA类似物导致了更稳定的AFP表达。然而，添加10mM的AM-580抑制了AFP和CDX-2的表达，但维持了PDX-1的高表达。
实例34
Wnt-3a处理对人胚胎干细胞中细胞因子表达的影响
使用蛋白质芯片分析Wnt-3a处理对细胞因子表达的影响。根据实例15中所述的方法培养人胚胎干细胞系H9的细胞。在第54传代，细胞在存在100ng/ml激活素A±10ng/ml的Wnt3a的情况下，在0.5％的FBSDMEM/F12中分化两天。然后在100ng/ml激活素A和2％的FBS DMEM/F12中再培养三天。在第5天结束时，通过FACS测定每一个处理组的CXCR4表达。在仅用激活素A处理的细胞中，有1％的细胞表达CXCR4。在用激活素A和Wnt3a处理的细胞中，有73％的细胞为CXCR4表达阳性。
使用哺乳动物细胞裂解试剂盒(Sigma-Aldrich，MO)由每一个处理组的细胞制备细胞溶胞产物。从每一个处理组收集条件培养基并浓缩。使用RayBiotech，GA(http://www.raybiotech.com/)提供的细胞因子芯片板完成细胞因子芯片分析。表VII列出了数据归一化和背景减除后的细胞因子、生长因子和受体表达。对于每一个板，也包括阳性对照和阴性对照。所示数据为每个细胞处理组的两个独立样品(1、2)。
在Wnt3处理的细胞条件培养基中发现了血管生成素、IGFBP-1和EGF的明显上调。在Wnt3a处理的细胞溶胞产物中许多蛋白上调，包括IGFBP-1、TGFβ-1和TGFβ-3。可将这些上调的蛋白回加到分化培养基中，以替代或增强Wnt3a对定形内胚层形成的作用。
实例35
在用MATRIGEL TM 涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内 胚层的分化：Wnt1的作用
将H1P55ES细胞在MATRIGELTM(1∶30的稀释液)涂布的平皿上培养并暴露于补充有0.5％的FBS和100ng/ml激活素A±10-20ng/ml的Wnt-1(PeproTech，NJ，目录#120-17)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS、100ng/ml激活素A(AA)和±10或20ng/ml的Wnt-1的DMEM/F12培养基再处理三天。测试下列WNT1+AA组合：
a)第1-2天：0.5％的FBS+DM-F12中20ng/ml的Wnt 1+100ng/ml的AA，然后第三天：2％的FBS+DM-F12+100ng/ml的AA；b)第1-2天：0.5％的FBS+DM-F12中20ng/ml的Wnt1+100ng/ml的AA，然后第3-5天：2％的FBS+DM-F12+100ng/ml的AA；c)第1-2天：0.5％的FBS+DM-F12中10ng/ml的Wnt1+100ng/ml的AA，然后第三天：2％的FBS+DM-F12+100ng/ml的AA；d)第1-2天：0.5％的FBS+DM-F12中10ng/ml的Wnt1+100ng/ml的AA，然后第3-5天：2％的FBS+DM-F12+100ng/ml的AA；e)第1-2天：0.5％的FBS+DM-F12中20ng/ml的Wnt1+100ng/ml的AA，然后第三天：2％的FBS+DM-F12+100ng/ml的AA+20ng/ml的Wnt1；f)第1-2天：0.5％的FBS+DM-F12中20ng/ml的Wnt1+100ng/ml的AA，然后第3-5天：2％的FBS+DM-F12+100ng/ml的AA+20ng/ml的Wnt1。图49屏面a和屏面b示出在用低血清、AA和Wnt-1处理H1细胞后定形内胚层标志物的实时PCR数据。在100ng/ml的AA存在下添加20ng/ml的Wnt1导致了定形内胚层标志物(Bry、CXCR4、GSC、SOX17、HNF-3B和GATA-4)的明显上调。
实例36
在限定培养基中，在组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚 层的分化
将在缺氧条件下(大约3％的O2)培养并铺在MATRIGELTM(1∶30的稀释液)涂布的平皿上的H1胚胎干细胞在MEF条件培养基中培养至大约60％至70％的融汇率，然后暴露于补充有0.5％的FBS、20ng/ml的Wnt-3a(目录#1324-WN-002，R&D Systems，MN)和100ng/ml激活素A(R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基两天，接着用补充有2％的FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基再处理3至4天。同时，将在MATRIGEL上培养的H1细胞暴露于补充有0.5-1％的B27(Invitrogen，Ca)+20g/ml的WNT-3a+100ng/ml激活素A±GSK-3B抑制剂IX(目录#361550，Calbiochem，CA)的DMEM-F12或DMEM-LG中4-5天。在一些培养物中，使用1％的N2添加剂(Invitrogen，Ca)代替1％的B27。
此外，将从称为“EXPRES”细胞(可扩增的前原条细胞)的母H9 ES细胞系分离的细胞系也暴露于上述相同的培养基配方中，以诱导定形内胚层(DE)的形成。EXPRES细胞的性质此前已在美国专利申请60/913,475中有所公开。最后，将从Invitrogen获得的并在MATRIGEL涂布的平板上于MEF条件培养基+8ng/ml的bFGF中培养的BGO1V系的细胞暴露于上述分化培养基中，以诱导DE的形成。图50示出，对于暴露到限定分化培养基或低血清分化培养基的EXPRES01、BGO1V和H1 P50细胞系，在第4-5天通过FACS检测的CXCR4和CD9表达。对于所有的供试细胞系，当使用基于1％的B27添加剂的限定培养基时，与基于FBS的培养相比，CXCR4的表达相当。此外，1％的N2添加剂不能诱导DE的形成，可能是由于N2添加剂中存在高浓度的胰岛素(8.6mM)。图51示出用低血清或限定培养基+AA+WNT3A处理的EXPRES01、BGO1V和H1培养物在第4-5天时的实时PCR数据。此方案导致了DE标志物的显著上调。图52示出通过1％的B27+DM-F12+激活素A+WNT3A+GSK03B抑制剂处理五天将EXPRES 01 P49细胞分化成DE的免疫荧光图像。大多数细胞为GATA-4、SOX-17和HNF-3B染色阳性，少数细胞为OCT-4、SOX-2和Nanog染色阳性。
实例37
在限定培养基中，在MEF上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分化
将H1细胞平铺在此前用丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)接种的6孔板上。让细胞在ES细胞培养基中生长到70-80％的融汇率，ES细胞培养基由补充有20％的Knockout血清替代品、100nM的MEM非必需氨基酸、0.5mM的β-巯基乙醇、2mM的L-谷氨酰胺(均得自Invitrogen/GIBCO)和8ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(R&DSystems)的DMEM/F12(Invitrogen/GIBCO)组成。
对于DE的形成，除了下面详述的其他生长因子之外，还在存在或不存在激活素A(100ng/ml)的情况下处理细胞。如下列方案所示，将生长因子加入浓度递增的FBS：
第0天：在DMEM-LG或RPMI中0％的FBS或1％的B27
第1天：在DMEM/F12或RPMI中0.5％的FBS或1％的B27
第2-5天：在DMEM/F12或RPMI中2％的FBS或1％的B27
或者，在HESGro培养基(Chemicon，Ca)+100nM的LY化合物(EMD，CA)+100ng/ml的AA中将细胞处理1-5天。
在第1-5天，收获细胞用于FACS和RT-PCR分析。所有生长因子均购自R&D Systems，MN。图53示出暴露于低血清+激活素A或限定培养基+激活素A的H1细胞在第1-5天时的实时PCR数据。表达水平的倍数改变相对于第1天的值进行归一化。
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表IA：用于FACS和免疫染色分析的一抗列表
  抗体   供应商   同型   克隆号
  SSEA-1   Chemicon(CA)   小鼠IgM   MC-480
  SSEA-3   Chemicon(CA)   小鼠IgG3   MC-631
  SSEA-4   Chemicon(CA)   大鼠IgM   MC-813-70
  TRA 1-60   Chemicon(CA)   小鼠IgM   TRA 1-60
  TRA 1-81   Chemicon(CA)   小鼠IgM   TRA 1-81
  TRA 1-85   Chemicon(CA)   小鼠IgG1   TRA 1-85
  AP   R&D Systems   小鼠IgG1   B4-78
  HNF3b   R&D Systems   山羊IgG
  PDX1   Santa CruzBiotechnology，INC   山羊IgG   A-17
  GATA4   R&D Systems   山羊IgG
  Sox 17   R&D Systems   山羊IgG
  CD 9   BD   小鼠IgG1   M-L13
表IB：用于FACS和免疫染色分析的标记二抗列表
  标记二抗   供应商   稀释度
  APC标记的山羊抗小鼠IgG   Jackson ImmunoResearch(PA)   1∶200
  PE标记的山羊抗小鼠IgG   Jackson ImmunoResearch(PA)   1∶200
  PE或APC标记的驴抗兔   Jackson ImmunoResearch(PA)   1∶200
  PE或APC标记的驴抗山羊   Jackson ImmunoResearch(PA)   1∶200
  PE标记的山羊抗小鼠IgM   SouthernBiotech(AL)   1∶200
  PE标记的山羊抗大鼠IgM   SouthernBiotech(AL)   1∶200
  PE标记的山羊抗小鼠IgG3   SouthernBiotech(AL)   1∶200
表IIA：在激活素A处理后的人胚胎干细胞蛋白表达随时间的变化
  0-天   2-天   5-天   8-天
  SSEA-3   98.67％   92.14％   42.9％   22.05％
  CD9   92.64％   29.42％   7.27％   4.1％
  ECAM   61.23％   20.87％   14.17％   1.02％
  NCAM   7.33％   5.04％   21.1％   8.86％
  CXCR4   8.53％   20.2％   55.26％   56.92％
表IIB：在激活素A处理后的人胚胎干细胞蛋白表达随时间的变化
表IIC：在激活素A处理后的人胚胎干细胞蛋白表达随时间的变化
  第5天AA处理
  CXCR4+   92.78％
  CXCR4+/C-kit+   92.90％
  CXCR4+/EPCAM   87.99％
  CXCR4+/CD99+   88.78％
  CXCR4+/CD9+   7.03％
表III：本发明所用胚胎干细胞的多能性标志物表达谱
Figure GPA00001061332300751
表IV：经过5天的处理之后，在MATRIGEL(TM)或小鼠胚胎成纤维细胞 上培养的未分化胚胎干细胞和定形内胚层期细胞之间的基因的差异表达
Figure GPA00001061332300752
Figure GPA00001061332300781
Figure GPA00001061332300791
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Figure GPA00001061332301491
Figure GPA00001061332301511
表V：在实例10中概述条件下定形内胚层标志物的相对表达。所有值 都相对于第1组(对照)进行归一化。
  Sox17   CXCR4   Goosecoid   HNF-3B   SOX-2   Oct-4
  第1组-对照   1   1   1   1   1   1
  第2组   45   19.5   2.8   0.64   0.91   1.1
  第3组   45   30   2.9   0.74   0.70   0.76
  第4组   8   14   2.7   1.11   0.18   0.36
  第5组   23   16   3.1   1.76   0.16   0.41
  第6组   41   5.8   3.0   1.87   0.61   0.57
  第7组   25   19.5   2.7   0.62   0.34   0.48
  第8组   6   15.9   2.9   2.0   0.13   0.43
  第9组   1   1.4   0.9   0.89   1.2   0.85
  第10组   22   1.5   1.4   1.20   1.36   0.68
  第11组   54   23   2.5   0.71   0.66   0.65
  第12组   68   0.7   0.9   1.51   0.02   0.30
  Sox17   CXCR4   Goosecoid   HNF-3B   SOX-2   Oct-4
  第13组   13.9   12.7   3.0   2.1   0.11   0.30
  第14组   52.6   20.6   2.9   0.82   0.69   0.70
  第15组   68   27.7   2.9   0.68   0.68   0.85
  第16组   13.9   21   2.4   0.79   0.46   0.72
  第17组   52   14.9   3.5   2.12   0.22   0.44
表VI：H9胚胎干细胞衍生的定形内胚层期细胞(在MATRIGEL TM 或MEFS +/-Wnt-3A上培养)基因的平均归一化强度值(以对数格式表示)。
Figure GPA00001061332301521
Figure GPA00001061332301531
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Figure GPA00001061332302021
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表VII：wnt-3a处理对源于人胚胎干细胞系h9的细胞群中细胞因子 表达的影响
Figure GPA00001061332302042
Figure GPA00001061332302051

Claims (32)

1.一种将多能干细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a.培养所述多能干细胞，
b.通过在化学成分确知培养基中培养所述多能干细胞以及用激活素A处理所述多能干细胞将所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，所述化学成分确知培养基包括补充有B27的培养基，
c.通过用至少一种成纤维细胞生长因子或用视黄酸与至少一种成纤维细胞生长因子处理所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，将所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，以及
d.通过用γ-分泌酶抑制剂处理所述表达所述胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，将所述表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述B27以约0.5％至约1％的浓度使用。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述B27以约1％的浓度使用。
4.根据权利要求1所述的方法，其中将所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的所述步骤通过包括以下步骤的方法来实现：
a.将所述多能干细胞平铺在涂布有细胞外基质的组织培养基质上，以及
b.在化学成分确知培养基中培养所述多能干细胞，所述化学成分确知培养基包括补充有B27的培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述B27以约0.5％至约1％的浓度使用。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述B27以约1％的浓度使用。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述B27以约0.5％至约1％的浓度使用。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述B27以约1％的浓度使用。
9.根据权利要求1所述的方法，其中将所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的所述步骤通过包括以下步骤的方法来实现：
a.将所述多能干细胞平铺在涂布有细胞外基质的组织培养基质上，
b.在第一培养基中用激活素A和Wnt配体培养所述多能干细胞，以及
c.在第二培养基中用激活素A培养所述多能干细胞。
10.根据权利要求1所述的方法，其中将所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的所述步骤通过还包括将所述多能干细胞平铺在成纤维细胞饲养层上的方法来实现。
11.根据权利要求4所述的方法，其中所述多能干细胞在化学成分确知培养基中培养，所述化学成分确知培养基包括补充有B27、Wnt配体和激活素A的DMEM-F12。
12.根据权利要求4所述的方法，其中所述多能干细胞在化学成分确知培养基中培养，所述化学成分确知培养基包括补充有B27、Wnt配体和激活素A的DMEM-LG。
13.一种将多能干细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a.在包括补充有B27的培养基的化学成分确知培养基中培养所述多能干细胞，
b.通过用激活素A处理所述多能干细胞将所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，以及
c.通过用至少一种成纤维细胞生长因子或用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，将所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述B27以约0.5％至约1％的浓度使用。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述B27以约1％的浓度使用。
16.根据权利要求13所述的方法，其中将所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的所述步骤通过还包括将所述多能干细胞平铺在成纤维细胞饲养层上的方法来实现。
17.一种将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a.将所述多能干细胞平铺在涂布有细胞外基质的组织培养基质上，以及
b.在包括补充有B27的培养基的化学成分确知培养基中培养所述多能干细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述B27以约0.5％至约1％的浓度使用。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述B27以约1％的浓度使用。
20.根据权利要求17所述的方法，其中将所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的所述步骤通过还包括将所述多能干细胞平铺在成纤维细胞饲养层上的方法来实现。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述多能干细胞在化学成分确知培养基中培养，所述化学成分确知培养基包括补充有B27、Wnt配体和激活素A的DMEM-F12。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述B27以约0.5％至约1％的浓度使用。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述B27以约1％的浓度使用。
24.根据权利要求17所述的方法，其中所述多能干细胞在化学成分确知培养基中培养，所述化学成分确知培养基包括补充有B27、Wnt配体和激活素A的DMEM-LG。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述B27以约0.5％至约1％的浓度使用。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述B27以约1％的浓度使用。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能干细胞在化学成分确知培养基中培养，所述化学成分确知培养基包括补充有B27和激活素A的DMEM-F12。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述B27以约0.5％至约1％的浓度使用。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述B27以约1％的浓度使用。
30.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能干细胞在化学成分确知培养基中培养，所述化学成分确知培养基包括补充有B27和激活素A的DMEM-F12。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述B27以约0.5％至约1％的浓度使用。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述B27以约1％的浓度使用。
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