CN108348554A - 上胚层球状体向肾脏类器官的三维分化模拟阶段特异性上皮生理、形态发生和疾病 - Google Patents
上胚层球状体向肾脏类器官的三维分化模拟阶段特异性上皮生理、形态发生和疾病 Download PDFInfo
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Abstract
人类多能干细胞(hPSC)作为微生理实验室模型和再生疗法具有双重价值。hPSC是上皮细胞,但是对于hPSC和子代上皮细胞可以重建谱系特异性功能的了解程度仍然甚少。本文中,本发明人示出了三维培养物中的hPSC及其分化的子代可以功能性地重演组织特异性上皮形态发生、生理和疾病。
Description
技术领域
人类干细胞能够在三维培养基中培养并且重演组织特异性上皮形态发生、生理和疾病。
背景技术
未分化的干细胞和终末分化的体细胞均形成上皮细胞。这些上皮细胞可以在胚胎中建立分化轴,或者在成体器官如肾脏中执行屏障和运输作用。体外3D细胞培养是研究上皮形态发生、生理和疾病的有力工具,易于通过显微检查、化学处理和实验操作获得。例如,Madin-Darby犬肾(MOCK)细胞等上皮细胞系的研究显示出极性和细胞凋亡途径在机理上对内腔形成有贡献。然而,常规的上皮细胞系是谱系限制性的并且缺乏遗传多样性。结果,产生的3D结构相对简单,并且对具有相同遗传背景的不同上皮细胞或具有不同遗传背景的相同上皮细胞进行受控比较是有挑战性的。尽管有这些限制,人们对细胞微环境和3D培养体系、尤其是对于干细胞应用的兴趣一直在稳步增长。目前对精确重建组织特异性上皮细胞功能的遗传多样性细胞培养平台有显著需求,特别是在物种特异性毒理学和疾病病理生理学具有显著的生物医学相关性的人类中。
人类多能干细胞(hPSC)具有广泛的自我更新能力,并可分化为所有体细胞类型。因此它们代表了用于实验室研究和再生的多种人类上皮细胞的可重复来源。包括胚胎来源的胚胎干细胞(ESC)和患者来源的诱导性多能干细胞(iPSC)在内的hPSC是遗传多样性的,生产出数千种代表特定患者群体或基因靶向敲除突变体的细胞系。未分化的hPSC是极化的上皮细胞,并且通常作为贴壁单层培养物中的扁平集落或3D悬浮液中的致密聚集体培养。这些上皮培养物被打算用来模拟植入阶段的上胚层上皮细胞。相比之下,小鼠(m)ESC在培养中采用紧凑的簇状形态,类似于内细胞团(ICM)(在发育上先于上胚层出现的结构)。
最近,被基质胶细胞外基质(ECM)包围的mESC显示出形成了具有小管腔的极化的玫瑰花结,这暗示了体外模拟羊膜腔形成的可能性。然而,因为这些实验是在不会维持多能性的条件下培养的mESC进行的,目前仍不清楚所观察到的玫瑰花结是代表ICM、上胚层还是分化亚型,这些也可以形成球状体。为了解决这个问题并建立上胚层腔化(cavitation)的人类模型,需要使用上胚层阶段的hPSC在多能性维持培养基中进行的实验。
本文描述了如下发现,三维培养物中的hPSC及其分化的子代可以功能性地重演组织特异性上皮的形态发生、生理和疾病。未分化的hPSC形成围绕中空的羊膜样腔体的球状体集落,模拟了胚胎上胚层。球状体经过两步方案分化成为具有肾脏肾元(包括近端小管、足细胞和内皮细胞)的发育和结构特征的卷绕的管状类器官(organoids)。肾小管和上胚层腔差异化地累积荧光物质并对肾毒性化学损伤作出应答。
发明内容
本文描述的是产生人类类器官的方法,该方法包括提供一批量的人多能干细胞(hPSC),在培养用培养基(culture medium)中对hPSC进行培养以形成上胚层球状体,以及在分化培养基中使上胚层球状体分化,其中,分化培养基包含能够将上胚层球状体分化成类器官的一种或多种试剂。在各种实施方式中,在形成上胚层球状体之前在不存在白血病抑制因子(LIF)和多西环素的情况下,对hPSC进行培养。在各种实施方式中,在形成上胚层球状体之前在存在Y27632的情况下,对hPSC进行培养。在各种实施方式中,所述培养用培养基包含基质胶。在各种实施方式中,所述培养用培养基包含胶原蛋白I。在各种实施方式中,对hPSC进行培养包括在表面上沉积第一层培养用培养基,将hPSC置于所述沉积的培养用培养基上,以及在hPSC上添加第二层培养用培养基。在各种实施方式中,在培养用培养基中对hPSC进行培养包括约1天、2天或更多天。在各种实施方式中,所述一种或多种试剂包括CHIR99021。在各种实施方式中,所述一种或多种试剂包括B27。在各种实施方式中,使所述上胚层球状体分化包括约7天、8天、9天、10天、11天、12天或13天或更多天。在各种实施方式中,所述上胚层球状体表达足细胞标记蛋白(PODXL)、紧密连接蛋白(ZO-1)和β-连环蛋白中的一种或多种。在各种实施方式中,所述上胚层球状体是腔化的。在各种实施方式中,所述类器官是管状的。在各种实施方式中,所述类器官是肾脏类器官。在各种实施方式中,所述类器官表达足细胞标记蛋白(PODXL)、紧密连接蛋白(ZO-1)和翅荚百脉根凝集素(lotustetragonolobus lectin,LTL)中的一种或多种。例如,在诸如用于hLR5iPSC的hESC条件培养基(CM)+白血病抑制因子(LIF)+dox或mTeSR1培养基中,可以将hPSC在约3%ReducedGrowth Factor GeiTrex上保持无饲养(feeder-free)状态至少一次传代。在各种实施方式中,通过撤除LIF和多西环素来活化(prime)hPSC。在各种实施方式中,LIF和多西环素的撤除包括用FGF2取代。在各种实施方式中,将细胞以相对于培养表面和培养基体积而言的特定的密度接种。
本文还描述了通过产生人类类器官的方法制备的一批量的类器官,该方法包括提供一批量的人类多能干细胞(hPSC),在培养用培养基中培养hPSC以形成上胚层球状体,以及在分化培养基中使上胚层球状体分化,其中,分化培养基包含能够将上胚层球状体分化成类器官的一种或多种试剂。在各种实施方式中,在形成上胚层球状体之前在不存在白血病抑制因子(LIF)和多西环素的情况下,对hPSC进行培养。在各种实施方式中,在形成上胚层球状体之前在存在Y27632的情况下,对hPSC进行培养。在各种实施方式中,所述培养用培养基包含基质胶。在各种实施方式中,所述培养用培养基包含胶原蛋白I。在各种实施方式中,对hPSC进行培养包括在表面上沉积第一层培养用培养基,将hPSC置于所述沉积的培养用培养基上,以及在hPSC上添加第二层培养用培养基。在各种实施方式中,在培养用培养基中对hPSC进行培养包括约1天、2天或更多天。在各种实施方式中,所述一种或多种试剂包括CHIR99021。在各种实施方式中,所述一种或多种试剂包括B27。在各种实施方式中,使所述上胚层球状体分化包括约7天、8天、9天、10天、11天、12天或13天或更多天。在各种实施方式中,所述上胚层球状体表达足细胞标记蛋白(PODXL)、紧密连接蛋白(ZO-1)和β-连环蛋白中的一种或多种。在各种实施方式中,所述上胚层球状体是腔化的。在各种实施方式中,所述类器官是管状的。在各种实施方式中,所述类器官是肾脏类器官。在各种实施方式中,所述类器官表达足细胞标记蛋白(PODXL)、紧密连接蛋白(ZO-1)和翅荚百脉根凝集素(LTL)中的一种或多种。在各种实施方式中,使用基因组编辑(例如CRISPR)对hPSC进行遗传修饰。
本文进一步描述的是产生管状类器官的方法,该方法包括提供一批量的上胚层球状体,以及在分化培养基中使上胚层球状体分化,其中,分化培养基包含能够将上胚层球状体分化成类器官的一种或多种试剂。在各种实施方式中,所述一种或多种试剂包括CHIR99021。在各种实施方式中,所述一种或多种试剂包括B27。在各种实施方式中,使所述上胚层球状体分化包括约7天、8天、9天、10天、11天、12天或13天或更多天。在各种实施方式中,所述管状类器官是肾脏类器官。在各种实施方式中,所述肾脏类器官表达足细胞标记蛋白(PODXL)、紧密连接蛋白(ZO-1)和翅荚百脉根凝集素(LTL)中的一种或多种。在各种实施方式中,将所述上胚层球状体分化成肾脏类器官包括在包含RPMI和B27的第二分化培养基中进一步培养。在各种实施方式中,将所述上胚层球状体分化成肾脏类器官包括在包含CHIR99021、RPMI和B27的第二分化培养基中进一步培养约24小时,用包含CHIR99021、RPMI、B27和胰岛素的第三分化培养基替代第二分化培养基并另外培养约48小时,加入IWP2并继续培养约48小时,以及另外用第二分化培养基替代第三分化培养基。
本文还描述的是一种筛选对管状类器官起作用的化合物的方法,该方法包括提供一批量的管状类器官,向管状类器官添加一种或多种化合物,确定管状类器官的表型或活性的改变,以及将这些改变与化合物对管状类器官的作用相关联,从而筛选对管状类器官起作用的一种或多种化合物。
在各种实施方式中,确定表型或活性的改变包括检测所述管状类器官中的一种或多种标志物。在各种实施方式中,所述一种或多种标志物包括肾损伤分子(KIM-1)。在各种实施方式中,KIM-1表达的增高与化合物的毒性作用相关。在各种实施方式中,所述管状类器官是肾脏类器官。
附图说明
图1连续3D培养物中的hPSC及子代细胞的上皮形态发生。球状体至类器官的培养方案的示意图(a)和相差时间推移图像(b)。红色箭头标出上皮细胞。虚线的黑色箭头连接了示意图和图像。(c)显示出如下的共聚焦光学切片,贯穿代表性的夹心化的2-细胞hPSC聚集体的足细胞标记蛋白(PODXL)、ZO-1和β-连环蛋白(βCAT)的免疫荧光;(d)小的球状体;(e)具有空腔的大的球状体;以及(f)单层集落。图左侧标注了从顶部行到底部行的垂直距离。高倍数图像在图13中示出。(g)低倍数宽视场图像和(h-i)高倍数共聚焦光学视图显示了管状类器官中的上皮极性标志物的免疫荧光,用LTL复染。比例尺,100μm(a-b、g-i)或者20μm(c-f)。
图2腔化的球状体代表上胚层。(a)连续传代实验的示意图。(b)解离(着色方框)和传代(匹配着色箭头)的3D培养物中的hPSC的代表性的明视场图像。虚线箭头表示在3D条件中连续传代。较下面的行表示从来自各代的分离的球状体接种入2D培养物中的细胞。(c)hPSC连续3D传代第3代、第6代和第9代产生的畸胎瘤的苏木精-伊红染色切片显示了色素上皮(外胚层)、软骨(中胚层)和腺上皮(内胚层)。(d)接种72小时后的2D和3D培养物中的细胞数量(各时间点二重复计数的平均值,或者所有时间点的平均值)。(e)示出OCT4和SOX2的代表性的免疫荧光图像;以及(f)定位于第3代和第7代连续夹心hPSC中的TRA-1-60和NANOG。(g)3D培养物中的原始的和活化的(primed)的hLR5形态以及相应的ZO-1和足细胞标记蛋白免疫荧光。相比于单独的mTeSR1中的对照,在添加CHIR的mTeSR1中培养的hPSC集落的形态学(h)和定量(i)(n=3)。显示了用在mTeSR1中的增高的CHIR处理的3D培养物中的OCT4和BRY的DAPI归一化的免疫荧光的代表性图像(j)和点状图(k)。每个点代表单个的hESC或者hiPSC(汇合,n>6000个细胞每个条件)。比例尺,50μm。误差棒,s.e.m.。
图3管状类器官重演了肾脏的发育和结构。(a)应用至2D和3D培养物的心肌细胞的定量(n=3)。(b)第19天时,全部24个孔的管状分化,具有放大的方框区域。(c-d)管状类器官中的肾元祖细胞标志物(SIX2、LHX1、PAX2)和近端小管标志物(LTL、LRP2/megalin、CUBN)的共聚焦免疫荧光。放大显示了白色方框区域。(e)两个代表性的小管的电子显微图像,着色方框中的区域的逐步放大标出了微绒毛(三角)和紧密连接(箭头)。(f)宽视场图像显示了用E-钙粘蛋白(ECAD,顶部,高倍数)和CD31(底部,低倍数)进行的LTL+和PODXL的定位。(g)共聚焦光学切片显示了管状类器官中的SYNPO和CD31簇的共同定位(三角)。宽视场免疫荧光显示了核WT1和SYNPO(h)、以及CD31和vWF(i)在管状类器官中的共同定位。比例尺,10μm(e)或100μm。误差棒,s.e.m.。
图4管状类器官的长期存活和模拟肾脏生理学。(a)具有来源于hiPSC的肾脏样图案结构的大的肾脏类器官。(b)来源于从三个不同患者重编程的hESC或hiPSC的类器官,显示出了管状区室、足细胞样区室和内皮区室(白色三角)之间的相互作用。白色虚线轮廓标出了代表性的管状末端。(c)培养120天(d120)后,小管中的LTL免疫荧光和相差时程。(d)原代(1°)小管与在解离和连续传代后产生的子代小管(2°和3°)的相差图相(箭头)。(e)2°小管中的SIX2和LTL免疫荧光。(f)KIM-1和LTL或者(g)第二KIM-1抗体(KIM1ab2)的共同定位。(h)肾毒性化学品处理后表达KIM-1的类器官的定量(n=3)。(i)96孔板的全部孔显示出肾脏类器官。在发育的小鼠肾脏中生长3周后,表达LTL(j)或(k)SIX2祖细胞(progenitor)的源自类器官的生长(HNN)的共聚焦图像。比例尺,100μm或者50μm(d-e、g)。误差棒,s.e.m.。
图5相对于肾小管的上胚层球状体中的荧光物质的差异化累积。(a)实验示意图和共聚焦时间推移图像显示出hPSC球状体与LY和RD一起孵育。(b)显微注射RD后的hPSC球状体空腔宽视场时程图像和实验示意图。未检测到自发荧光(GFP通道)。(c)hPSC与分子染料孵育4小时后的时程,之后更换培养液(清洗)。(d)清洗之后立即拍照的空腔衬里细胞。下部的图显示了方框区域的放大图。(e)管状类器官与RD和LY孵育并接着清洗(脉冲)、孵育(追踪)、固定以及与LTL共定位的代表性的时程。(f-g)具有或不具有2μM LatB的管状类器官累积RD的定量(n=3)。清洗1小时和18小时后的荧光素-MTX和RD在两个代表性的活体类器官中的分布(h)或紧接在清洗后的hPSC球状体(i)。比例尺,50μm(a-d)或者100μm(e-i)。误差棒,s.e.m.。
图6在上胚层球状体中足细胞标记蛋白促进管腔发生。(a)用pCas9-GFP和PODXLgRNA质粒转染的H9ESC的代表性的FACS图。方框区域的紫色事件是为克隆扩增而接种。(b)流式分选1天后的荧光显微图片。(c)作为野生型(wt)和两个不同的足细胞标记蛋白突变体(m1和m2)测序的CRISPR/Cas9克隆的比对色谱图。粉色星号标记了gRNA序列的起始位置。(d)突变体m1的色谱图解析,显示了与野生型序列比对的分开的等位基因(A1和A2)。(e)与CRISPR/Cas9未突变克隆(wt)或者经受加扰(scrambled,scr)或足细胞标记蛋白(pod)siRNA敲低的细胞相比,代表性的PODXL-/-·hPSC突变体(m1和m2)中的足细胞标记蛋白的免疫印迹。(f)来自野生型或者PODXL-/--hPSC的畸胎瘤显示了外胚层的色素上皮(p)、中胚层的软骨(c)和内胚层的肠样上皮(g)。(g)每个上胚层球状体集落的总面积(AVG从≥7个实验/SO集落汇合)。(h)以2D培养的PODXL-/-hPSC和逃脱体(escapee)0/VT中生长7天的解离细胞的数量(AVG从≥14个实验汇合)。各实验归一化至野生型。(i)与突变体或WT CRISPR/Cas9克隆相比的夹心的亲代ESC的明视场图像。(j)腔化球状体占全部集落的百分比。将来自WT或突变细胞系的数据汇合来决定组平均值(AVG,n≥9)和p值。(k)管腔面积占具有空腔的集落总面积的百分比(AVG从≥9个实验/40个集落汇合)。(l)未分化的hPSC的共聚焦z切片(z-section)显示出未修饰的0/VT或PODXL-/-集落中的ZO-1和P-连环蛋白的定位。(m)两个未分化的WT或者PODXL-/-克隆中的肌动蛋白和闭合蛋白(OCLN)的免疫荧光。(n)WT或者PODXL-/--单层中的平均TEER测量结果(n≥3)。比例尺,50μm或(l-m)20μm。误差棒,s.e.m.。
图7将连接复合体在源自hPSC的PODXL-/--足细胞中破坏。(a)在源自PODXL-/--hPSC或者同基因型的未修饰的对照的管状类器官的紧密连接(ZO-1)、近端小管(LTL)以及足细胞(PODXL、SYNPO)的免疫荧光。在对照中,足细胞标记蛋白在足细胞(箭头)中强烈地表达,而在小管中却微弱地表达(三角)。(b)野生型和PODXL-/-hPSC中的小管直径(AVG从≥4个实验/25个小管汇合)。(c)代表性的PODXL-/-肾小管中的正常的(鹅卵石状)ZO-1免疫荧光。(d)成年人肾脏的共聚焦光学切片。足细胞标记蛋白在足细胞和管周毛细血管网中表达,但是在小管中不存在(三角)。(e)共聚焦光学切片显示了ZO-1和足细胞标记蛋白或者SYNPO和WT1在源自hPSC的足细胞簇中的分布。三角标出了足细胞之间的连接复合体的轨迹。(f)管状类器官中的野生型或者PODXL-/-hPSC足细胞簇的共聚焦切片。(g)这些细胞中的相邻的足细胞核之间的轨迹的间隙宽度(n≥100个汇合自两个实验的间隙)。比例尺,50μm或(c)20μm。误差棒,s.e.m.。
图8PKD-/-和PKD-/-对于多能性和上胚层球状体的形态发生是非必需的。(a-b)对照(CTRL)和PKD hPSC的色谱图。底纹标记了gRNA的3'端。箭头指示了编码序列中的碱基对数量。PKD2敲低被示出用于比较。(c-d)免疫印迹显示了与同基因的对照相比,PKD hPSC中的全长PC1或者PC2的减少。(e)WT和PKD hPSC的传代中的细胞数量。(f)畸胎瘤显示了外胚层的色素上皮(p)、中胚层的软骨(c)和内胚层的肠样上皮(g)。(g)上胚层球状体的形态和相对于全部的球状体的管腔面积的比例的定量(n≥90个球状体,从≥5个实验汇合),以及(h)WT和PKD hPSC中的类器官分化效率。p<0.01。
图9PKD hPSC模拟谱系特异性的囊肿形成。(a)培养第58天时的代表性的PKD囊肿。(b)作为平均值的每个24孔板的囊肿数量的定量(n>10个实验)或者PKD敲除的类器官和同基因型的WT对照的散点图。(c)宽视场落射荧光图像和(d)共聚焦光学切片显示了囊肿中的LTL的反应性。代表性的z切片显示了囊肿的中空中心和相关的管状类器官(箭头)。放大图为红色方框区域。(e)WT和PKD细胞系中的RD和MTX的累积。虚线描绘了PKD囊肿。比例尺,100μm。误差,s.e.m.*,p<0.01。
图10源自hPSC的上皮细胞的模型。(a)hPSC管腔发生的模型。ICM阶段的hPSC缺少极化的紧密连接,导致随机的聚集体形成。上胚层阶段的hPSC被极化具有连续的紧密连接,因此可以组织成单细胞上皮。在3D生长中,足细胞标记蛋白在顶端膜的极化累积导致电荷排斥(负电荷),促进细胞的分离以形成管腔。紧密连接分开了顶端膜与环境成分,允许小分子(绿色)进入但排斥大分子(红色),其在细胞间的空隙中积聚。(b)肾脏样类器官中的近端小管的结构。细长的近端小管形成了简单的柱状上皮,其在顶面上结合LTL(绿色)。周围的足细胞样细胞表达高水平的足细胞标记蛋白并且在小管末端形成了组织性较差的聚集体结构。ZO-1受到足细胞标记蛋白的限制,在亚顶端的位置表达。内皮细胞与小管和足细胞样区室均密切相互影响。衰退的背景结构(background structure)将在体外形成的上皮结构放置在其推荐的体内环境中。
图11hPSC形成3D培养物中的球状体。在夹心(3D)或单层(2D)培养物中生长的hESC或者iPSC的代表性的示意图(a)以及高对比度和低对比度明视场图像(b)。示出了连续的天数,dO指出紧接在夹心化之前的时间点。(c)扁平相比于腔化的集落的百分比以及(d)夹心化后第2天和第4天时的20和3D培养物中的丝状肌动蛋白和OCT4的共定位。(e)明视场时程显示了夹心化0小时、24小时和48小时后的完整的hESC集落。(f)夹心化24小时和48小时后的hESC和MOCK细胞。比例尺,50μm。误差棒,s.e.m.。
图12hPSC球状体空腔形成的3D培养要求。(a)1:1基质胶:胶原蛋白厚凝胶中的hPSC球状体形成的示意性的时程。(b)hPSC或者MOCK细胞在厚凝胶中7天后的代表性的明视场图像。(c)厚凝胶中的hPSC生长的代表性的时程。(d)对于在1:1基质胶:胶原蛋白中培养6天的hESC和iPSC而言,腔化球状体/96孔板的孔的定量。(e)悬浮培养物中的囊肿形成的示意图。(f)来自两名患者的hESC或者iPSC的代表性的悬浮培养的囊肿。比例尺,20μm。误差棒,标准误差。
图13hPSC和管状类器官中的上皮细胞标志物表达。(a)共聚焦的z轴堆叠(z-stack)显示出贯穿代表性的hPSC单层集落的足细胞标记蛋白、ZO-1和β-连环蛋白的免疫荧光。显示了从顶端侧到底端侧贯穿单集落的三个光学切片。因为在最顶端的光学切片中显示,所以足细胞标记蛋白是最顶端的标志物,甚至可以在ZO-1不明显的集落区域观察到。在中间的光学切片中,ZO-1以鹅卵石的形状出现在细胞-细胞接触点。在最底外侧的切片中,只能看到β-连环蛋白。切片伴随有整个z堆叠的正交3D重建图,显示了ZO-1在细胞-细胞接触区域强烈地集中。从顶端行到底端行的垂直距离在左侧显示。(b)共聚焦光学切片显示了上胚层球状体(Epi)和肾脏类器官(Kid)共培养物中的OCT4和LTL的共定位。挑选肾脏类器官并转移至来自相同的iPSC系的球状体的培养物,并在固定并进行免疫荧光前,允许贴壁过夜。(c)在三个不同的hPSC克隆中的具有β-肌动蛋白作为内参的Na,K-ATPase免疫印迹。将未分化的hPSC的2D和3D培养物相同地接种。将肾脏类器官人工分离并消化。比例尺,50μm。
图14空腔的形成被限制于上胚层阶段的PSC。(a)时程显示了原始的hLR5iPSC向活化的LD-hLR5的转变。20和3D培养物中的(b)原始和活化的hLR5形态以及相应的(c)ZO-1和足细胞标记蛋白的免疫荧光。(d)mESC或者EpiSC在薄凝胶中夹心化48小时后的明视场形态。红色箭头指出起始管腔发生的结构。时间点(24、48等)代表夹心化后的小时数,并显示出不同的集落。(e)mESC集落在基质胶、缓冲胶原蛋白或者二者的1:1混合物(1:1)的厚凝胶中从单细胞生长。从三个分开的mESC系获得了相似的结果。(f)接种120小时后的在厚凝胶中的小鼠EpiSC。(g)mESC和EpiSC中的ZO-1和PODXL的免疫荧光,比例相同。(h)原始和活化的hLR5iPSC中的OCT4和SOX2的免疫荧光。比例尺,50μm。
图15上胚层阶段hPSC经历极化的管腔发生。接种到96孔板(顶部)或24孔单层(底部)中并用μM的CDC42抑制剂ML141或赋形剂对照处理的hPSC中的空腔的明视场图像(a)和定量(b)。(c)代表性的免疫荧光;(d)表达活化型半胱天冬酶3(ccasp3)的细胞的百分比;以及(e)用50μM半胱天冬酶抑制剂ZVAD(氟代甲基酮)或者赋形剂对照处理的hPSC球状体中的空腔计数。比例尺,50μm。误差棒,s.e.m.。
图16 3D培养物中的肾脏样管状类器官的产生。(a)所得到的2D单层和3D球状体中的hPSC的层次聚类(hierarchicial clustering)和RNA-Seq实验的示意图。两个细胞系(A和B)用两种不同的天数(1和2)表示。图中的样品根据最高相关性(如进一步通过右侧的***树图所证实的)排布。热图网格显示了相关性的范围并且由相应的RA2值组成。(b)随机分化方案的示意图和来自两个hPSC系的21天后的代表性图像。ZO-1+细胞定量在右侧显示。(c)最初的2D心肌细胞分化方案和应用至3D球状体的示意图。(d)第22天结构代表用所述的心肌细胞分化方案(对照组)或者下述变化(从左侧起)处理的相同接种的hPSC球状体,所述变化为:使用包含胰岛素的827补充物、无IWP2处理、无夹心化、CHIR处理后夹心化、IWP2处理后夹心化。(e)第22天结构代表用具有经标记的变化的处于RPMI中的CHIR处理的相同接种的培养物。(f)用不同剂量的CHIR处理且相同接种的3D培养物中获得的每24孔的搏动细胞簇(beating cluster)。误差棒,s.e.m.(n≥3个分开的实验)。比例尺,20μm(b)或者100μm(d-e)。
图17肾脏类器官分化的定量。(a)代表性的类器官中的肾元祖细胞标志物的表达。(b)肾脏类器官细胞中结合的LTL(作为占细胞群的百分比)的流式细胞术分析。将肾脏类器官的相同地接种的孔与LTL孵育或不与LTL孵育作为修正对照(comp)。然后,将细胞解离并使之经受流式细胞分析。(c)通过FACS得到的LTL+细胞占所有细胞的百分比。(d)具有可检测的管状CUBN的LTL+类器官的百分比。(e)共表达CUBN的LTL+小管长度的比例。误差棒,s.e.m.(n≥分开的实验,且每个实验检测约90个类器官)。
图18肾脏类器官分化的定量。(a)源自hPSC的肾脏类器官(左侧)和人类肾脏组织(右侧)中的Crumbs 3的表达。(b)与CD31+和PODXL+细胞类型相关的LTL+类器官的百分比。(c)类器官培养物的时程(行代表培养的天数)显示了不存在与肠标志物CDX2共染色的LTL。(d)在这些培养物中,神经(TUJ1+)簇相对于肾脏(LTL+)类器官的平均比例。(e)在低倍数下,宽视场低分辨率图像显示了神经簇。误差棒,s.e.m.(n≥3个分开的实验,且每个实验检测约30个类器官)。
图19hPSC向肾小管类器官分化的时程。(a-b)对于如下而言的阶段特异性发育标志物的时序性表达的免疫荧光或者(b)定量RT-PCR时程:多能性(OCT4)、原条(primitivestreak,BRY)、间介中胚层(PAX2)、肾元祖细胞(PAX2、SIX2、LHX1、WT1)和足细胞(WT1)。d2代表临在CHIR处理之前在夹心化后的第2天的上胚层球状体。类器官培养物(行指示培养天数)的时程显示了与SIX2和ZO-1共染色的LTL(c)或者与PODXL和WT1共染色的LTL(d)。(e)与使用本文描述的方案以3D生产的管状类器官相比,使用已发表的用于肾脏分化的20方案得到的管状类器官中的标志物表达。在分化的同一天,将细胞相同地接种并同时进行免疫荧光。(f)与ESC相比,iPSC中的管状类器官形成。比例尺,50μm(a)或者100μm(c-e)。误差棒,s.e.m.(n=3)。
图20上胚层球状体不表达KIM-1。(a)用顺铂或庆大霉素滴定处理的上胚层球状体中的活细胞的相差、或者KIM-1和NANOG的免疫荧光。在约5mM的庆大霉素剂量下未观察到KIM-1的表达,该浓度足以诱导肾脏类器官中的KIM-1。比例尺,50μm。
图21体内肾脏谱系的产生。(a)用来自管状类器官的细胞新移植并生长4周的肾脏的共聚焦切片。人类PODXL抗体不与小鼠足细胞标记蛋白反应。比例尺,50μm。
图22不表达LRP2的小管片段中的RD累积。(a)时程显示了在RD累积(O小时)、以及随后的EDTA处理和RD重新累积后的小管。紧接在清洗后可以看到气泡。(b)左侧:被固定并处理用于LRP2免疫荧光的相同类器官。为了定量荧光强度,垂直于包含RD(绿色点线)或不包含RD(橙色点线)的小管片段进行线扫描。右侧:包含RD(顶部)和不包含RD(底部)的小管区域的线扫描中的RD和LRP2的平均荧光强度,具有黑色的误差棒(n=14个小管每个条件)。比例尺,100JJm,误差棒,s.e.m.。
图23未分化的hPSC中的足细胞标记蛋白和TRA-1-60/81的特征。(a)hPSC单层(2D)和球状体(3D)的足细胞标记蛋白免疫印迹。(b)免疫印迹显示了TRA-1-60和TRA-1-81(多个条带>250kDa),以β-肌动蛋白作为内参。(c)条带强度的定量,归一化至β-肌动蛋白,从野生型或者PODXL-/-hPSC的3-4个克隆取平均值。(d-e)代表性的野生型和敲除克隆的标志物的免疫荧光。比例尺,50μm,误差棒,s.e.m.。
图24足细胞标记蛋白对于hPSC紧密连接组织而言是非必需的。(a)2D和3D培养物中的CRISPR/Cas9克隆的ZO-1、足细胞标记蛋白和NANOG免疫荧光图像。在PODXL-/-hPSC的3D聚集体(白色虚线)中观察到了小的管腔样结构。(b)野生型或者PODXL-/-球状体与RD和LY孵育4小时后的代表性的图像(左侧)和相应的定量(右侧)。从外侧到内侧代表汇合自约2个hESC系的25个野生型或者PODXL-/-球状体的线扫描(图像中有边的白色矩形)被取平均值并绘制。(c)来自转染了针对PODXL(pod)、OCT4(oct)和加扰的对照序列(scr)的siRNA的hPSC的蛋白裂解液中的PODXL、OCT4和内参(~ACT)的免疫印迹(左侧)和相应的条带定量(右侧)。将来自hPSC裂解液的免疫印迹强度归一化至它们的内参并取平均值(n=2)。转染这些siRNA并在单层(2D)和夹心(3D)条件下培养的hPSC的免疫荧光图像(d)和表达ZO-1的集落表面面积(e)。(f)形成具有明视场管腔的空腔的集落的百分比。(g)经受了具有β-肌动蛋白内参对照的siRNA的hPSC中的ZO-1的免疫印迹。(h)这些培养物中的代表性的NANOG免疫荧光。图像处于相同的比例。(i)从夹心化时起(PS)、夹心化后第二天(PS d2)用8μg/ml硫酸鱼精蛋白处理的hPSC或者未处理的对照的明视场图像(左侧)和定量(右侧)。(j)用PS处理的hPSC中的PODXL的定位。比例尺,50μm。
图25hPSC在3D培养物中形成腔化球状体。(a)从球状体到类器官培养方案的示意图。(b)夹心(3D)或单层(2D)培养物中的ESC的相差图像。示出了连续的天数,d0表示紧接在夹心化之前的时间点。(c)共聚焦光学切片显示贯穿具有空腔的代表性的球状体的PODXL、ZO-1和βCAT的免疫荧光。从顶端行到底端行的垂直距离显示在左侧。(d)在经解离(着色框)和传代(匹配着色箭头)的3D培养物中的hPSC的代表性的明视场图像。虚线箭头代表3D条件下的连续传代。较下部的行显示出从来自各传代的解离的球状体接种到2D培养物中的细胞。(e)由hPSC连续3D传代p3、p6和p9产生的畸胎瘤的苏木精和伊红染色切片示出了色素上皮(外胚层)、软骨(中胚层)和腺上皮(内胚层)。(f)接种72小时后的2D和3D培养物中的细胞数(各时间点的二重复计数的平均值,或在最后一列中显示的所有五个时间点的AVG)。(g)代表性的免疫荧光图像显示了在p3和p7连续夹心化的hPSC中的OCT4和性别决定区Y框蛋白-2(SOX2)或肿瘤排斥抗原1-60(TRA-1-60)和NANOG的定位。比例尺,100μm。误差棒,s.e.m.。
图26管状类器官重演肾的发育和结构。(a)球状体分化成管状类器官的相差图像。红色三角标示了上皮。共聚焦光学切片显示了在管状类器官中的具有肾元祖细胞标志物Sine oculis homeobox homolog 2(SIX2)、Lin11-Isl1-Mec3(LIM)同源异型盒1(LHX1)、配对盒基因2(PAX2)的LTL(b)以及近端小管标志物低密度脂蛋白相关蛋白2/megalin和cubilin(c)。(d)代表性肾小管的电子显微照片,对着色框中的区域的逐步放大标示了顶端微绒毛(三角)和紧密连接(箭头)。(e)显示出从E-钙粘蛋白(ECAD)+到LTL+再到PODXL+类器官片段的小管解剖进程的宽视场图像。(f)具有交错的小管和外周PODXL+聚集体(左侧)的类器官低放大倍数图像和显示出类器官足细胞样细胞中的synaptopodin(SYNPO)和肾母细胞瘤蛋白(WT1)的共定位的高放大倍数共聚焦光学切片。(g)显示出CD31与血管假性血友病因子(vWF,左侧)或者与来源于hESC和iPSC的小管类器官中的肾元标志物(右侧)的共定位的宽视场免疫荧光。白色三角显示出小管区室、足细胞样区室和内皮区室之间的相互作用。白色虚线轮廓标示了代表性的小管末端。图像代表来自不同患者的一个hESC系和三个iPSC系。(h)在hESC和iPSC的培养物中每单位表面积形成的管状类器官的数量(左侧)以及与类器官内的CD31+和PODXL+细胞类型相关的这些LTL+类器官的百分比(右侧)。(i)在发育的小鼠肾皮质(m)内生长3周后具有LTL反应性的来源于类器官的人类小管(H)的共聚焦图像。比例尺,100μm。误差棒,标准误差(n≥3个实验)。
图27管状类器官为肾脏肾毒性研究创造了微生理模型。(a)KIM-1抗体AKG7与LTL或(b)与第二KIM-1抗体(KIM1ab2)的共定位。(c)与经赋形剂处理的对照(n=3个/条件,>50个类器官/实验)相比,用50μM顺铂(Cispl.)或5mM庆大霉素(Gent.)处理后表达KIM-1的类器官的定量。(d)用顺铂和庆大霉素滴定处理的上胚层球状体中的活细胞的相差或KIM-1和NANOG免疫荧光。在包括5mM庆大霉素(该浓度足以诱导肾脏类器官中的KIM-1上调)在内的任何剂量下均未观察到KIM-1表达。顺铂在>1μM的浓度时对球状体有毒性。(e)培养物中的小管的相差时程。培养120天后(d120),将小管固定并对LTL染色。(f)显示出肾脏类器官的96孔板的所有孔。比例尺,50μm。误差棒,s.e.m.。
图28上胚层球状体相对于肾脏类器官小管中的荧光物质的差异化积累。(a)显示出用荧光黄(LY)和罗丹明缀合的右旋糖酐(RD)孵育的hPSC球状体的实验示意图和共聚焦时间推移图像。(b)显微注射RD后的hPSC球状体空腔的实验示意图和宽视场时程。没有检测到自体荧光(绿色荧光蛋白通道)。(c)在冲洗后立即用荧光素甲氨蝶呤处理4小时的hPSC球状体。(d)用LY或RD分子染料孵育hPSC球状体4小时,随后用没有染料的培养基替换培养基(洗出)的时程。(e)用RD和LY孵育4小时(脉冲)的管状类器官,之后在没有染料的新鲜培养基中孵育(追踪),固定并与LTL共定位的代表性时程。(f,g)在具有或没有2μM拉春库林B(n=3)的情况下,累积RD的管状类器官的定量。(h)在冲洗1小时和18小时后,在两种代表性的活的类器官中的荧光素甲氨蝶呤和RD分布。比例尺,50μm(a-d)或100μm(e-h)。误差棒,s.e.m.。
图29足细胞标记蛋白促进上胚层球状体中的管腔发生。(a)与CRISPR/Cas9未突变的野生型克隆(WT)或者经受加扰(scr)或足细胞标记蛋白(pod)siRNA敲低的细胞相比,两个代表性的PODXL-/-hPSC突变克隆(m1和m2)的足细胞标记蛋白的免疫印迹。(b)与两个突变体或两个WT CRISPR/Cas9克隆相比的夹心化的亲代ESC的明视场图像。(c)腔化的球状体占全部集落的百分比。将来自突变细胞系或者WT的池的数据进行平均来确定组平均值(AVG,n≥9)和P值。(d)原始的和活化的hLR5hPSC或者(e)mESC和EpiSC中的足细胞标记蛋白和ZO-1免疫荧光。(f)显示出ZO-1和βCAT在未修饰(WT)或PODXL-/-集落中的定位的未分化hPSC的共聚焦z切片。(g)未分化的WT或者PODXL-/-克隆中的丝状肌动蛋白(f-actin)和闭合蛋白(OCLN)的免疫荧光。(h)WT或者PODXL-/-单层中的平均的TEER测量值(n≥3)。比例尺,50μm或者(f,g)20μm。误差棒,s.e.m.。
图30将连接复合体在源自hPSC的PODXL-/-足细胞样细胞中破坏。(a)成年人肾脏的共聚焦光学切片。足细胞标记蛋白在足细胞和管周毛细血管中表达,但不存在于小管中(白色虚线)。Auto,自发荧光。(b)源自hPSC的肾脏类器官(共聚焦红色通道)和人肾脏组织(最右侧,免疫组化)中的Crumbs3的表达。显示出ZO-1与足细胞标记蛋白(c)或βCAT(d)在源自hPSC的足细胞样细胞簇中的分布的共聚焦光学切片。三角标示了足细胞样细胞之间的连接复合体的轨迹。(e)管状类器官中的野生型或PODXL-/-足细胞样细胞簇的共聚焦切片。(f)这些细胞系中的相邻的足细胞样细胞核之间的间隙宽度(汇合自两个实验的n≥100个间隙)。比例尺,50μm。误差棒,s.e.m.。
图31PKD hPSC模拟谱系特异性的囊肿形成。与同基因的对照相比,显示出经CRISPR产生的PKD1-/-hPSC中的全长的多囊蛋白-1(PC1)(a)或PKD2-/-hPSC中的多囊蛋白-2(PC2)(b)的减少的免疫印迹。示出PKD2敲低作为对照。(c)代表性的PKD敲除hPSC和对照中的上胚层球状体形态学。(d)PKD2肾脏类器官中培养第58天的代表性的囊肿。(e)PKD敲除的类器官和等基因的WT对照中的作为所有实验的平均值(n>10)的囊肿形成速率的定量,或作为单个实验的散点图。显示出囊肿中的LTL反应性的宽视场落射荧光图像(f)和共聚焦光学切片(g)。代表性的z-切片显示了囊肿和相关的管状类器官的中空中心(箭头)。红色框区域显示出放大图。比例尺,100μm。误差棒,s.e.m.*P<0.01。
图32球状体类似于单层的hPSC。(a)共聚焦的z堆叠显示了贯穿代表性的hPSC单层集落的足细胞标记蛋白、ZO-1和β-连环蛋白的免疫荧光。从顶端侧到底端侧显示了贯穿单层集落的三个光学切片。因为在最顶端的光学切片中显示,所以足细胞标记蛋白是最顶端的标志物,甚至可以在ZO-1不明显的集落区域观察到。在中间的光学切片中,ZO-1以鹅卵石的图案形状出现在细胞-细胞接触点。在最底外侧切片中,只能看到β-连环蛋白。切片伴随有整个z堆叠的正交3D重建物,显示了ZO-1在细胞-细胞接触的区域强烈地集中。从顶部行到底部行的垂直距离在左侧显示。(b)2D单层和3D球状体中的hPSC的层次聚类以及RNA-Seq实验的示意图。两种细胞系(A和B)用两种不同的天数(1和2)示出。图中的样品根据最高相关性(如进一步通过右侧的***树图所证实的)排布。热图网格显示了相关性的范围并且由相应的RA2值组成。***树图中的着色框与示意图中的分组相匹配。比例尺,50μm。
图33空腔的形成局限于上胚层阶段。(a)显示出原始的hLR5iPSC向活化的LO-hLR5的转变的时程。(b)2D和3D培养物中的原始的和活化的hLR5的形态学。(c)原始的和活化的hLR5iPSC中的OCT4和SOX2免疫荧光。(d)mESC(J1、R1和v6细胞系)或者EpiSC在薄凝胶中夹心化48小时后的明视场形态学。红色箭头指出了起始管腔发生的结构。时间点(24、48等)代表夹心化后的小时数,并且显示了不同的集落。(e)从处于100%基质胶、100%缓冲胶原蛋白或者二者的1:1混合物(1:1)的厚凝胶中的单个细胞生长的mESC集落。从三个分开的mESC系得到了相似的结果。(f)在接种后处于厚凝胶中120小时的小鼠EpiSC。比例尺,50μm。
图34在3D培养物中产生肾脏样管状类器官。(a)原始2D心肌细胞分化方案和应用于3D球状体的示意图。(b)用这一方案相同处理的2D和3D培养物中产生的搏动的心肌细胞和管状类器官的定量。(c)代表用具有如下变化(从左侧起)的所述心肌细胞分化方案处理的相同接种的hPSC球状体的第22天的结构:原始方案(对照)、使用包含胰岛素的827补充物、无IWP2处理、无夹心化、CHIR处理后的夹心化、IWP2处理后的夹心化。(d)代表用处于具有标记的变化的RPMI中的CHIR处理的相同接种的培养物的第22天的结构。(e)显示出OCT4和LTL在上胚层球状体(Epi)和肾脏类器官(Kid)共培养物中的共定位的共聚焦光学切片。挑取肾脏类器官,将其转移至来自相同iPSC系的球状体培养物中,并在固定和免疫荧光处理之前使其粘附过夜。误差棒,s.e.m.(n≥3个分开的实验)。比例尺,100μm。
图35肾脏类器官分化。(a)肾脏类器官细胞中结合的LTL占群体的百分比的流式细胞术分析。将肾脏类器官的相同接种的孔与LTL或无LTL的修正对照(camp)孵育。然后使细胞解离并经受流式细胞术。显示了通过FACS的LTL+的所有细胞的百分比(来自3个分开的实验的平均值)。(b)类器官培养物中的时程(行表示培养的天数)显示出与肠道标志物CDX2共染色的LTL的缺失。(c)显示出这些培养物中的神经(TUJ1+)簇和肾脏(LTL+)类器官的宽视场低分辨率图像。(d)神经簇与肾脏类器官的比率。(e)多能性(OCT4)、原条(BRY)、中间中胚层(PAX2)、肾元祖细胞(PAX2、SIX2、LHX1、WT1)和足细胞(WT1)的阶段特异性发育标志物的时序性表达的免疫荧光和定量RT-PCR的时程。d2表示临在CHIR处理之前于夹心化后第2天的上胚层球状体。误差棒,s.e.m.(n≥3个分开的实验,且每个实验检测约30个类器官)。
图36PODxcl-hPSC的产生和表征。(a)代表性的CRISPR/Cas9足细胞标记蛋白突变体克隆的色谱图。粉红色星号标记了gRNA序列的起始。标注显示出与野生型序列比对的分离的等位基因(A1和A2)。(b)显示出TRA-1-60和TRA-1-81(多条带>250kDa)的免疫印迹,具有β-肌动蛋白内参对照。右侧,归一化至β-肌动蛋白的条带强度的定量,从野生型或PODXL-1-hPSC的3-4个克隆求平均值。(c)来自显示出外胚层色素上皮(p)、中胚层软骨(c)和内胚层肠样上皮(g)的PODXL-1-hPSC或野生型的畸胎瘤。(d)每个上胚层球状体集落的总面积(从≥7个实验/SO集落汇合的AVG)。(e)在2D培养物的逃脱体(escapee,WT)和PODXL-/-hPSC中生长7天后的解离的细胞数(从≥14个实验汇合的AVG)。将各实验归一化至野生型。比例尺,50μm。误差棒,s.e.m.。
图37足细胞标记蛋白对于hPSC紧密连接组织是非必要的。(a)在2D和3D培养物中的CRISPR/Cas9克隆的ZO-1、足细胞标记蛋白和NANOG免疫荧光图像。在PODXL-/-hPSC 3D聚集体(白色虚线)中观察到小的管腔样结构。(b)在与RD和LY孵育4小时后的野生型或PODXL-/-球状体的代表性图像(左侧)和相应的定量(右侧)。将代表从≥2个hESC系汇合的25个野生型或PODXL-/-球状体的从外部到内部的线扫描(图像中以白色矩形为边框)取平均值并绘图。(c)未处理的对照或者夹心化开始时(PS)、夹心化后第二天(PS d2)用8μg/ml硫酸鱼精蛋白处理的hPSC的明视场图像(左侧)和定量(右侧)。(d)用PS处理的hPSC中的PODXL的定位。比例尺,50μm。
图38PKD1-/-和PKD2-/-hPSC的产生和表征。对照(CTRL)和PKD1-/-hPSC(a)或PKD2-/-hPSC(b)的色谱图(左侧)和全长免疫印迹(右侧)。阴影标记了gRNA的3'末端。箭头标示了编码序列中的碱基对数。将等位基因1(A1)和等位基因2(A2)的标注与野生型共有序列(WT)进行比较。将多聚PC2缩写为PC2mt。(c)显示出外胚层色素上皮(p)、中胚层软骨(c)和内胚层肠样上皮(g)的畸胎瘤。比例尺,100μm。(d)相对于所有的球状体的管腔面积的比例的定量以及(e)WT和PKD hPSC中的类器官分化效率(n为~5次实验)。p<0.01。
具体实施方式
本文中引用的所有参考文献都以引用的方式整体并入本文进行充分阐述。除非另外定义,否则本文使用的科技术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。Allen等,Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版,Pharmaceutical Press(2012年9月15日);Hornyak等,Introduction to Nanoscience andNanotechnology,CRC Press(2008);Singleton和Sainsbury,Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology,第3版,修订版,J.Wiley&Sons(New York,NY2006);Smith,March’s Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms andStructure,第7版,J.Wiley&Sons(New York,NY 2013);Singleton,Dictionary of DNAand Genome Technology,第3版,Wiley-Blackwell(2012年11月28日);以及Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold Spring HarborLaboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2012),为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的通用指导。关于如何制备抗体的参考文献,参见Greenfield,Antibodies ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor NY,2013);和Milstein,Derivation of specific antibody-producing tissue cultureand tumor lines by cell fusion,Eur.J.Immunol.1976年7月,6(7):511-9;Queen和Selick,Humanized immunoglobulins,美国专利号5,585,089(1996年12月);以及Riechmann等,Reshaping human antibodies for therapy,Nature,1988年3月24日,332(6162):323-7。
本领域技术人员将认识到可用于本发明的实践中、与本文描述的方法和材料类似或等同的许多方法和材料。实际上,本发明并不限于所描述的方法和材料。出于本发明的目的,对以下术语进行定义如下。
如本文说明书以及随后的权利要求书中所使用的,除非上下文另外明确指出,否则“一(a/an)”和“该/所述(the)”的含义包括复数的指示对象。而且,如本文说明书中所使用的,除非上下文另外明确指出,否则“在...中/内”的含义包括“在...中/内”和“在...上”。
如所述的,人类多能干细胞(hPSC)具有作为微生理实验室模型和再生治疗的双重价值。hPSC是上皮细胞,但是对于hPSC和子代上皮细胞可以重建谱系特异性功能的程度仍然知之甚少。本文中,本发明人示出了三维培养物中的hPSC及其分化的子代可以功能性地重演组织特异性上皮形态发生、生理和疾病。
未分化的hPSC形成围绕中空的羊膜样空腔的球状体集落,模拟了胚胎上胚层。两步方案将球状体分化成为具有肾脏肾元的(包括近端小管、足细胞和内皮细胞)发育和结构特征的卷绕的管状类器官。肾小管和上胚层空腔差异化地累积荧光物质并对肾毒性化学损伤作出反应。
足细胞标记蛋白或多囊性肾病基因的CRISPR/Cas9敲除在肾脏类器官中产生与疾病相关的组织特异性表型,这与在上胚层球状体中的效果不同。本发明人的发现为人类微生理学、疾病建模和再生医学应用建立了可再现和多功能的三维框架。
肾脏是再生医学领域最感兴趣的器官。肾脏上皮细胞高度特化,并且特定细胞类型的功能障碍会导致多种临床紊乱。例如,多囊性肾病(PKD)的特点是来自管状上皮细胞的囊性扩增,然而肾小球病涉及足细胞上皮的损伤,血浆通过该损伤渗入肾小管。在使用hPSC模拟肾脏疾病的原理论证中,本发明人描述了未分化的iPSC和来自PKD患者的子代上皮细胞中的纤毛表型。最近,hPSC已经在体外被定向分化成管状上皮细胞,该上皮细胞能够表达肾元祖细胞、近端小管和足细胞的典型的标志物。
然而,这些研究中使用的标志物并不是肾脏独有的,并且至今没有研究展示出在源自hPSC的肾细胞中与疾病相关的表型。因此,源自hPSC的肾细胞中的肾特异性形态发生、微生理和损伤/疾病状态的重建对于更确切地鉴定这些上皮细胞并推进它们的转化应用是重要的。
在本文中,本发明人建立了贴壁的3D生长条件,用于重建两种不同的上皮结构(上胚层球状体和肾小管类器官),这两种结构在hPSC的单一连续培养物中相继出现。使用小分子处理和基因组编辑的hPSC,本发明人证明了这些结构能够重建组织特异性的上皮细胞转运、毒性反应和疾病表型。本发明人的结果揭示了hPSC和子代上皮细胞中常见和组织特异性的特征都与人类微生理学、病理生理学和再生医学的功能研究相关。
本文描述的是产生人类类器官的方法,该方法包括提供一批量的人多能干细胞(hPSC),在培养用培养基中对hPSC进行培养以形成上胚层球状体,以及在分化培养基中使上胚层球状体分化,其中,分化培养基包含能够将上胚层球状体分化成类器官的一种或多种试剂。在各种实施方式中,在形成上胚层球状体之前在不存在白血病抑制因子(LIF)和多西环素的情况下,对hPSC进行培养。在各种实施方式中,在形成上胚层球状体之前在存在Y27632的情况下,对hPSC进行培养。在各种实施方式中,所述培养用培养基包含基质胶。在各种实施方式中,所述培养用培养基包含胶原蛋白I。在各种实施方式中,对hPSC进行培养包括在表面上沉积第一层培养用培养基,将hPSC置于所述沉积的培养用培养基上,以及在hPSC上添加第二层培养用培养基。在各种实施方式中,在培养用培养基中对hPSC进行培养包括约1天、2天或更多天。在各种实施方式中,所述一种或多种试剂包括CHIR99021。在各种实施方式中,所述一种或多种试剂包括B27。在各种实施方式中,使所述上胚层球状体分化包括约7天、8天、9天、10天、11天、12天或13天或更多天。在各种实施方式中,所述上胚层球状体表达足细胞标记蛋白(PODXL)、紧密连接蛋白(ZO-1)和β-连环蛋白中的一种或多种。在各种实施方式中,所述上胚层球状体是腔化的。在各种实施方式中,所述类器官是管状的。在各种实施方式中,所述类器官是肾脏类器官。在各种实施方式中,所述类器官表达足细胞标记蛋白(PODXL)、紧密连接蛋白(ZO-1)和翅荚百脉根凝集素(LTL)中的一种或多种。
例如,在诸如用于hLR5iPSC的hESC条件培养基(CM)+白血病抑制因子(LIF)+dox或mTeSR1培养基中,可以将hPSC在约3%Reduced Growth Factor GeiTrex上保持无饲养状态至少一次传代。在各种实施方式中,通过撤除LIF和多西环素来活化hPSC。在各种实施方式中,LIF和多西环素的撤除包括用FGF2取代。在各种实施方式中,将细胞以相对于培养表面和培养基体积而言的特定的密度接种。例如,用处于补充有10μM Rho激酶抑制剂Y27632的培养基中的GeiTrex预包被约30-60,000个细胞/孔的24孔板或4孔腔室载玻片。在另一实例中,将96孔板的约5-20,000个细胞重悬于75μl的缓冲胶原蛋白I(含有10mM HEPES和1XDMEM)、低生长因子基质胶(reduced growth factor matrigel,BD Biosciences)或二者的1:1的混合物中在37度下孵育45分钟,然后用100μl附加Y27632的培养基覆盖。
例如,在培养用培养基的“夹心”层中3-D培养48小时后,将hPSC上胚层球状体在包含浓度为例如约12μM CHIR的CHIR990021的分化培养基中分化约36小时的时间段。在肾细胞分化的另一实例中,将分化培养基更换为RB(Advanced RPMI+Glutamax+B27补充物)并在此后每三天更换一次。在另一实施方式中,将上胚层球状体在包含浓度为例如约12μM CHIR的CHIR990021的分化培养基和没有胰岛素的RB培养基(RBNI)中分化约24小时的时间段,在RBNI中分化48小时,添加5μM IWP2分化48小时,在RBNI中分化48小时,以及其后每三天更换RB。
本文还描述了通过产生人类类器官的方法制备的一批量的类器官,该方法包括提供一批量的人类多能干细胞(hPSC),在培养用培养基中对hPSC进行培养以形成上胚层球状体,以及在分化培养基中使上胚层球状体分化,其中,分化培养基包含能够将上胚层球状体分化成类器官的一种或多种试剂。在各种实施方式中,在形成上胚层球状体之前在不存在白血病抑制因子(LIF)和多西环素的情况下,对hPSC进行培养。在各种实施方式中,在形成上胚层球状体之前在存在Y27632的情况下,对hPSC进行培养。在各种实施方式中,所述培养用培养基包含基质胶。在各种实施方式中,所述培养用培养基包含胶原蛋白I。在各种实施方式中,对hPSC进行培养包括在表面上沉积第一层培养用培养基,将hPSC置于所述沉积的培养用培养基上,以及在hPSC上添加第二层培养用培养基。在各种实施方式中,在培养用培养基中对hPSC进行培养包括约1天、2或更多天。在各种实施方式中,所述一种或多种试剂包括CHIR99021。在各种实施方式中,所述一种或多种试剂包括B27。在各种实施方式中,使所述上胚层球状体分化包括约7天、8天、9天、10天、11天、12天或13天或更多天。在各种实施方式中,所述上胚层球状体表达足细胞标记蛋白(PODXL)、紧密连接蛋白(ZO-1)和β-连环蛋白中的一种或多种。在各种实施方式中,所述上胚层球状体是腔化的。在各种实施方式中,所述类器官是管状的。在各种实施方式中,所述类器官是肾脏类器官。在各种实施方式中,所述类器官表达足细胞标记蛋白(PODXL)、紧密连接蛋白(ZO-1)和翅荚百脉根凝集素(LTL)中的一种或多种。在各种实施方式中,使用基因组编辑(例如CRISPR)对hPSC进行遗传修饰。
本文还描述了产生管状类器官的方法,该方法包括提供一批量的上胚层球状体,以及在分化培养基中使上胚层球状体分化,其中,分化培养基包含能够将上胚层球状体分化成类器官的一种或多种试剂。在各种实施方式中,所述一种或多种试剂包括CHIR99021。在各种实施方式中,所述一种或多种试剂包括B27。在各种实施方式中,使所述上胚层球状体分化包括约7天、8天、9天、10天、11天、12天或13天或更多天。在各种实施方式中,所述管状类器官是肾脏类器官。在各种实施方式中,所述肾脏类器官表达足细胞标记蛋白(PODXL)、紧密连接蛋白(ZO-1)和翅荚百脉根凝集素(LTL)中的一种或多种。在各种实施方式中,使所述上胚层球状体分化成肾脏类器官包括在包含RPMI和B27的第二分化培养基中进一步培养。在各种实施方式中,使所述上胚层球状体分化成肾脏类器官包括在包含CHIR99021、RPMI和B27的第二分化培养基中进一步培养约24小时,用包含CHIR99021、RPMI、B27和胰岛素的第三分化培养基代替第二分化培养基并另外培养约48小时,加入IWP2并继续培养约48小时,以及另外用第二分化培养基替代第三分化培养基。
本文还描述的是筛选对管状类器官起作用的化合物的方法,该方法包括提供一批量的管状类器官,向管状类器官中添加一种或多种化合物,确定管状类器官的表型或活性的改变,以及将这些改变与化合物对管状类器官的作用相关联,从而筛选对管状类器官起作用的一种或多种化合物。
在各种实施方式中,确定表型或活性的改变包括检测所述管状类器官中的一种或多种标志物。在各种实施方式中,所述一种或多种标志物包括肾损伤分子(KIM-1)。在各种实施方式中,KIM-1表达的增高与化合物的毒性作用相关。在各种实施方式中,所述管状类器官是肾脏类器官。
实施例
实施例1
3D培养
细胞系包括H9(WA09)、BJ、HDFn、hLR5、hfib2-iPS4、hfib2-iPS5(人)和J1、R1以及v6(小鼠)。在培养基(用于hPSC的mTeSR1;用于mESC的N2/827补充物+2i;用于hLR5iPSC的hESC条件培养基(CM)+白血病抑制因子(LIF)+dox)中,将细胞在3%Reduced GrowthFactor GeiTrex(Life Technologies)上保持无饲养状态至少1次传代,并用Accutase或者TrypLE解离。通过撤除LIF和多西环素并用FGF2进行代替,从原生的hLR5iPSC中得出LD-iPSC。对于薄凝胶夹心集落,在用处于补充有10μM的Rho-激酶抑制剂Y27632(StemGent)的培养基中的GeiTrex预包被的24孔板或4孔腔室载玻片中,将细胞以60000个(活化的)细胞/孔或者30000个(原生的)细胞/孔进行接种。第二天,将培养基替换为处于mTeSR1中的500μL1.5%GeiTrex。24小时后更换培养基。对于厚凝胶培养物,将96孔板的每孔的20000个(上胚层阶段)细胞或者6000个(narve)细胞重悬于75μl的缓冲胶原蛋白I(含有10mM HEPES和1×DMEM)、低生长因子基质胶(BD Biosciences)或者二者1:1的混合物中,在37度孵育45分钟,然后用100μl附加Y27632的培养基覆盖。对于薄凝胶内的连续传代,将3D培养物中的具有管腔的集落在接种后72小时解离,并以300000个细胞/孔的密度重新接种到6孔板,并在2D或3D条件下培养72个小时,随后解离、细胞计数和重新接种。对于悬浮液,将20000个解离的hPSC接种到处于低粘附6孔板的一个孔中的mTeSR1培养基中。对于所有的细胞,每天更换培养基。
实施例2
管状类器官的分化
接种60000-120000个H9hPSC,足以产生分散的、隔离开的球状体集落。夹心化48小时后,将hPSC用12μM CHIR处理36个小时,然后替换为RB(Advanced RPMI+Glutamax+B27补充物),并且之后每三天更换一次。或者,如同关于2D心肌细胞分化所述的,将球状体用处于没有胰岛素的RB(RBNI)中的12μM CHIR处理24h,RBNI处理48小时,5μM IWP2处理48小时,RBNI处理48小时,然后每三天更换RB。对于2D肾脏分化,将细胞接种过夜,然后用处于APEL培养基(StemCell Technologies)中的8μM CHIR处理48-72小时,用处于APEL培养基中的30ng/ml FGF2+1μg/ml肝素处理96小时,并随后在APEL培养基中培养10-15天。对于随机分化,将2D或3D培养物中的hPSC用处于DMEM+P/S中的10%胎牛血清(FBS)处理并观察19天。
免疫荧光和电子显微镜术
为了固定并维持3D构造,向培养基添加等体积的8%多聚甲醛(终浓度为4%)在室温下孵育15分钟。固定之后,将样品在PBS中进行清洗,在5%驴血清(Millipore)/0.3%Triton-X-100/PBS中封闭,在具有一抗的3%牛血清白蛋白/PBS中孵育过夜,清洗,用Alexa-Fiuor二抗(Invitrogen)孵育,清洗,并用DAPI染色或在Vectashield H-1000中进行封片。一抗包括:OCT4(sc-5279;Santa Cruz)、NANOG(RCAB0004PF;Cosmobio)、brachyury(sc-17745;Santa Cruz)、TRA-1-60(MAB4360,Millipore)、TRA-1-81(MAB4381;Millipore)、乙酰化的o-微管蛋白(051M4770;Sigma)、ZO-1(339100;Invitrogen)、足细胞标记蛋白(AF1658和AF1556;R&D)、CDX2(-88,Biogenex)、AQP1(AB2219;Millipore)、WT-1(sc-192;Santa Cruz)、LHX1(Developmental Studies Hybridoma Bank)、mPODXL(AF1556;R&D)、hPODXL(AF1658,R&D)、HNA(MAB1281,Millipore)、LTL(FL-1321,Vector Labs)、SYNPO(sc-21537;Santa Cruz)CD31(555444;BD)、crumbs 3(HPA013835,Sigma)、Na,K-ATPase(ab7671,Abeam)以及活化型半胱天冬酶-3(MAB835;R&D)。用Nikon epifluorescence 90-1(正置)、Eclipse Ti(倒置)或者confocal C1microscopes采集荧光图像。对于电子显微镜术,在固定5分钟后,将结构从培养板中刮出,在300g下成球团4分钟,通过吸取入含有4%甲醛和2%戊二醛的二甲基胂酸盐缓冲液中将球团轻柔地释出,用四氧化锇进行后固定,在系列乙醇中脱水,并包埋入环氧树脂中。将半薄切片以1mm切出并用甲苯胺蓝进行染色以通过光镜检查鉴别出具有明显的管腔的管状结构。将超薄切片(75nm)切出,安装于200目的铜载网上,用乙酸双氧铀和柠檬酸铅进行复染,并在JEOL JEM-1010透射电子显微镜下检查。
实施例3
渗透性分析
为了测试渗透性,将培养基补充附加了荧光黄卡巴肼钾盐(Invitrogen,38μM)和罗丹明-8异硫氰酸酯右旋糖酐(Sigma,0.5μM)的20mM HEPES,并用共聚焦显微镜成像。对于显微注射,将处于mTeSR1中的5μM罗丹明缀合的右旋糖酐溶液与酚红溶液(0.5%,Sigma)1:1稀释用于可视化。在Nanoject-2显微操作器上通过拉拔的玻璃毛细管微针显微注射2nl,并通过宽视场落射荧光显微镜实时监测。对于TEER,将50,000个hPSC接种在用稀释的基质胶预包被的24孔transwell板(Corning)上。将培养基轻柔地更换10天,直到细胞完全融合。将TEER使用EVOM 2设备(World Precision Instruments)进行测量。
实施例4
KIM-1诱导
用增高浓度的庆大霉素和顺铂处理24孔板的相同接种的孔中的类器官36-48小时,固定,并用KIM-1抗体AKG7.9(Bonventre laboratory)或1400(Biogen)进行免疫荧光处理。在中度的亚毒性剂量下观察到KIM-1的免疫荧光,该剂量不会引起严重的肾小管崩解。
实施例5
RNA干扰
接种16小时后,用针对处于无抗生素的mTeSR1中的加扰对照或PODXL、OCT4的Dharmacon Smartpool siRNA转染hPSC。十小时后,更换培养基并将细胞以2D培养或夹心化用于3D培养。
实施例6
Cas9/CRISPR诱变
将编码绿色荧光蛋白(GFP)标记的Cas9的构建体(Addgene 44719)以及靶向PODXL的第二外显子(GCTACACCTTCACAAGCCCGGGG)[SEQ ID NO:1]、PKD2的第一外显子(GCGTGGAGCCGCGATAACCCCGG)[SEQ ID NO:2]或者PKD1的第36外显子(GTGGGTGCGAGCTTCCCCCCGGG)[SEQ ID NO:3]的向导RNA(Addgene 64711)瞬时转染到H9hESC中,并且将表达GFP的细胞通过流式细胞分选术分离出来,克隆扩增,并筛选带有双等位基因功能缺失***缺失(indels)的克隆。将约200000个经分选的hESC接种于6孔板的每一个孔的附加Y27632的hESC条件培养基mTeSR1中。次日上午,更换为不含Y27632的培养基,使细胞克隆扩增,并且通过PCR扩增PODXL gRNA区域。手动分析色谱图序列,并通过免疫印迹和免疫荧光来确认突变。
实施例7
转录组分析
使用RNEasy Mini Kit(Qiagen)并行地准备以2D或者3D接种的hPSC。将样品在Agilent Bioanalyzer上进行QC’d,以核实高完整度的样品。然后,使用TruSeq strandedmRNA library kit(lllumina)准备合格的样品。测序在lllumina NextSeq500 75×75paired end high output run上进行。使用Tophat2将样品与hg19参考序列比对,并使用Cuffdiff计算差异化表达。
实施例8
RT-PCR
在分化时程期间于接种后的第2天、第10天、第14天和第21天,使用RNeasy MiniKit(Qiagen)制备RNA。使用M-MLV Reverse Transcription System(Promega)将来自所有时间点的RNA并行地反转录。使用eDNA(1:10稀释)、300nM引物和iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)用iQ5Multi-Color Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad)以二重复进行定量RT-PCR反应,使用P-肌动蛋白作为管家基因。
实施例9
定量和统计分析
对于荧光强度定量,图像是在相同的曝光和相同的处理下于单个拍摄场景中拍摄。将腔化的集落(具有管腔的椭圆体)数量和扁平的集落(非椭圆体或无管腔)数量以活细胞的相差图像手动打分,其中,比起在固定样品中更容易分辨管腔。对于细胞凋亡,将活化型半胱天冬酶-3的表达进行手动打分,通过细胞核浓染(nuclear condensation)确认,并除以每个宽视场落射荧光图像的细胞核总数。对于ZO-1面积,对表达ZO-1的单独的集落或者亚区域进行手动示踪,并使用NIS Elements(Nikon)计算表面积。对于各集落,将总计的表达ZO-1的面积表示为占总表面积的百分比,然后进行平均。为了定量强度,通过随机选取的用相同曝光拍摄的结构绘制等长的线扫描以获取NIS Elements软件(Nikon)中的原始荧光值。平均的线扫描值用误差棒绘出。对于CHIR诱导的分化,使用Cell Profiler 2.0在低放大倍数的免疫荧光图像中识别出约6000个单个的细胞,然后自动测量荧光强度。具有不等方差(异方差)的两个样品的统计比较采用双尾I检验。免疫印迹使用ImageJ GelAnalyzer进行定量。
实施例10
在hPSC的连续的3D培养物中的空腔和小管形态发生
为了从未分化的hPSC及其子代体细胞重构人类上皮细胞,本发明人开发了用于hPSC的贴壁的3D培养***,该***首先产生中空的球状体,并随后产生小管(图1a-b)。将解离的未分化的hPSC在两层稀释的基质胶(0.2mg/mL)之间夹心化,形成紧密的球样的集落。经过48小时,这些集落形成了内部空腔(图1b和图11a-b)。球状体空腔的形成是高度动态的过程,以集落融合事件和旋转运动为特征,并且对孵育时间和集落大小敏感(图11a-e)。在相似的稀释凝胶条件下,在MOCK球状体中并未观察到空腔(图11f)。hPSC在未稀释的基质胶、基质胶:胶原蛋白混合物以及悬浮培养物中也形成腔化球状体,但在单独的胶原蛋白中却未形成(图12a-f)。成熟的球状体由围绕中空管腔的简单柱状上皮细胞构成,伴随有β-连环蛋白向原代的(primarily)基底外侧膜、紧密连接蛋白(ZO-1)向顶端细胞-细胞连接以及足细胞标记蛋白向管腔表面的极化定位(图1c-e)。在未分化的hPSC的单层集落中观察到了类似的顶面底侧极化模式(图1f和图13a)。为了从相同的hPSC产生子代上皮细胞,用糖原合成酶激酶-3β抑制剂CHIR99021(CHIR)对腔化的球状体处理36个小时,并随后在限定的生长培养基中孵育(图1a-b)。CHIR处理之后,球状体细胞经历上皮-间充质转化(EMT)来形成融合单层,到第10天聚集成褶皱(fold)并开始间充质-上皮转化(MET),形成卷绕的半透明的管状类器官(图1a-b)。小管与翅荚百脉根凝集素(LTL)强烈反应,这是某些成体上皮细胞比如肾近端小管的特性,然而,并行检查的上胚层球状体对LTL具有可以忽略的亲和力(图1g和图13b)。广泛表达的上皮标志物—Na,KATPase在上胚层球状体和管状类器官中均表达(图13c)。共聚焦显微镜术显示出,LTL+小管表达管腔ZO-1和处于鹅卵石形状的基底膜外侧β-连环蛋白,以及微弱的顶端足细胞标记蛋白(图1g-h)。邻近小管的第二ZO-1+上皮细胞群形成成簇的聚集体,这些聚集体强烈地表达足细胞标记蛋白,但是并不结合LTL(图1g)。这些LTL阴性聚集体的共聚焦分析显示出了圆形的细胞形态,并且在细胞层之间的拉链样结构中的ZO-1和β-连环蛋白的强的共定位,没有明显的管腔发生(图1i)。因此,这一方法使得能够产生不同的上皮细胞群,并且在分化的hPSC的单一贴壁培养物中组建结构。
实施例11
腔化的球状体代表未分化的上胚层
本发明人测试了hPSC球状体的多能性和自我更新能力,这是未分化的hPSC的主要功能特征。将腔化的球状体反复地解离、重新接种和夹心化(图2a)。在9次连续传代中,解离的空腔-衬里细胞在夹心化后产生新的腔化的球状体,或者当最后一次传代形成单层状态时产生扁平的集落(图2b)。甚至在大量连续传代至3D培养物或者从3D培养物大量连续传代后,将空腔-衬里细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内高效地产生源自全部三个胚胎胚层的畸胎瘤组织(图2c)。2D和3D培养物显示出了类似的生长率,并且多能性标志物(包括八聚体结合转录因子(OCT4)、性别决定区Y框蛋白2(SOX2)、NANOG和TRA-160)被持续地在连续地夹心化的细胞中以相同的模式表达(图2d-f)。因此,球状体代表了未分化的、自我更新的多潜能细胞,而不是已分化的亚型。
本发明人假设hPSC球状体模拟了形成人类和灵长类着床期胚胎中的早期羊膜腔的上胚层上皮细胞团。相反地,类似于更原始的ICM的hPSC则预期不能成腔。实际上,形成类似于小鼠(m)ESC的紧密的、ICM样集落的原始的hLR5iPSC甚至在5天的生长后在3D培养物中也不会形成管腔,这与低的足细胞标记蛋白表达和不连续的ZO-1定位有关(图2g和图14a-c)。相比之下,类似于上胚层阶段hPSC的来源于活化的hLR5的(LO-)iPSC在夹心培养物中高效地形成空腔,并且以极化的连续分布的模式强烈地表达足细胞标记蛋白和ZO-1(图2g和图14a-c)。类似地,类似于ICM的原始的mESC在各种3D培养条件下不会形成空腔,但是上胚层阶段的mEpiSC形成围绕着ZO-1+PODXL+管腔的玫瑰花结(图14d-g)。原始的和活化的hPSC在2D和3D培养物中均持续地表达核OCT4和SOX2(图14h)。细胞***控制蛋白42同系物(CDC42)的化学抑制显著减少了hPSC中的空腔形成,但是半胱天冬酶的抑制却无影响,这与已知的上胚层的特性一致(图15a-e)。为了测试分化对球状体形成的作用,用CHIR(鼠短尾突变体表型(BRY)表达和中内胚层(mesendodermal)分化的强力且快速的诱导物)处理hPSC。
在夹心化时添加的CHIR以剂量依赖的方式抑制球状体的形成,伴随着分化的细胞经历EMT并且从其初始的集落向外扩散(图2h-j)。这些实验确定上胚层阶段是hPSC球状体管腔发生的临界窗口,而原始的(ICM阶段)或者CHIR分化的hPSC不能形成管腔。
实施例12
CHIR处理使球状体分化为管状类器官
在之前的实验中,本发明人观察到比起在并行地接种的2D培养物中,5~M CHIR在3D培养物中诱导更高水平的BRY表达(图2j-k)。在CHIR处理之前,在多潜能-维持培养基(mTeSR1)中的2D集落和3D球状体具有几乎相同的全基因表达谱,表明单独的3D培养不会引起自发的分化(图16a)。为了更深入地研究CHIR对3D培养物的影响,本发明人应用了最初为来自2D培养物的心肌细胞生成而设计的定向的分化方案。明显地,在3D培养物中,所得到的间充质上皮化成为卷绕的管状类器官,而不是有收缩性的心肌细胞(图3a-b;参见图1a-b)。为了测试这些影响是否对CHIR处理而言是特异性的,本发明人用血清使2D和3D培养物随机分化。此类培养物产生了ZO-1+LTL-上皮细胞的融合单层,但是不会产生小管或心肌细胞,表明CHIR处理对诱导这些细胞命运是必需的(图16b)。这一方案随后的优化显示出,球状体的形成、CHIR处理和随后的在827-补充的培养基中的孵育对于诱导小管分化而言是足够的,而胰岛素和Wnt抑制步骤是非必需的(图16c-e;优化的方案示于图1a中)。相反地,用较低浓度的CHIR处理上胚层球状体导致了有收缩性的心肌细胞的分化,类似于在较高的CHIR浓度下于2D培养物中观察到的那些(图16l)。这些结果表明CHIR剂量-响应性在3D培养物中是不同的,这导致了分化从心肌细胞转向了管状类器官。
实施例13
管状类器官重演了肾脏的发育和构造
采用新的方案,以H9(WA09)hESC起始,本发明人获得的产量为24孔板的每个孔中接近90个管状聚集体(图3a-b)。肾脏近端小管的标志物LTL与管状结构剧烈反应,并且在小管的管腔中富集出现(图3c-d)。因为LTL不仅与肾小管剧烈反应,而且与其它上皮细胞也是如此,所以本发明人实施了具有肾脏和其它器官标志物的这些类器官的更彻底的表征。小管或者邻近的间充质表达肾元祖细胞和肾囊标志物,包括sine oculis homeobox homolog2(SIX2)、LIM同源异型盒1(LHX1)、神经细胞粘附分子1(NCAM)和配对盒基因2(PAX2)(图3c和图17a)。内吞受体低密度脂蛋白相关蛋白2(LRP2/megalin)和cubilin在顶端共同表达,并与LTL共定位在小管片段中(图3d)。通过共定位和流式细胞术进行的定量表明,LTL+细胞占全部培养物的约25%,在沿约60%小管长度的约70%的LTL+小管中检测到cubilin(图17b-e)。另外,通过电子显微镜术在小管中观察到了顶端微绒毛和紧密连接(图3e)。本发明人还检测了这些结构的远端小管肾元片段的标志物E-钙粘蛋白(EGAD)的表达。
本发明人观察到EGAD+远端小管向LTL+近端小管再向包含PODXL+细胞(推断为足细胞)的胶囊样结构的进展,这与肾元的分段一致(图3f)。因为足细胞标记蛋白不仅限于足细胞,所以本发明人进一步检测了这些类器官的足细胞和内皮细胞的额外的标志物。PODXL+细胞展示出了球形的且紧密成簇的形态,不与LTL反应,并且共表达肾脏足细胞的额外的标志物(肾母细胞瘤蛋白(WT1)和synaptopodin;以及Crumbs3,在肾小球中高表达而在肾小管中处于较低水平的连接组分)(图3g-h和图18a-b;另外参见图1d)。表达CD31和血管假性血友病因子(vWF)的内皮索也在类器官中出现,并与小管和足细胞群均接触(图3f-i)。约80%的LTL+类器官包含内皮细胞群和足细胞群(图18b)。在类器官中不存在神经外胚层的标志物TUJ1和肠标志物CDX2,说明小管并不存在这些谱系(图18c-e);然而,在培养物中却观察到了分开的TUJ1+细胞的簇,其与肾脏类器官的比例为1:2,并且向小管伸出轴突样突起(图18c-e)。这些神经元可能是在不存在输尿管芽的情况下能够代表肾小管分化的诱导信号来源。分化时程期间的RNA和蛋白分析显示出了表征中内胚层、肾元祖细胞以及最终的近端小管和足细胞的标志物的顺序诱导(图19a-d)。使用用于肾脏分化的2D方案得到了相似的谱系,尽管LTL+结构表现的更广阔且更弥散(图19e)。本发明人推断管状类器官最可能代表肾脏谱系。
实施例14
管状类器官长期存活和模拟肾脏生理
使用这一方案,H9hESC和三个不同的hiPSC系以肾脏样排布产生并入了近端小管、内皮细胞和足细胞的类器官,hESC显示出了最高的分化效率(图4a-b以及图19f)。在扩大的培养物中,LTL+小管保持至少120天的稳定(图4c)。通过用荧光LTL和抗CD31标记活的类器官,能够实时监控小管和内皮区室的动力学。当类器官被解离并且在夹心条件中重新接种时,小于初始小管的新的LTL+上皮细胞会在一周之后在紧挨着SIX2+肾元祖细胞膜片处出现(图4d-e)。移种(subcultivation)被限制为大约为三次传代,与肾元祖细胞自我更新的受限的能力一致。当用肾毒性药物顺二氯二氨铂(II)(顺铂)或者庆大霉素处理时,小管表达顶端的肾损伤分子1(KIM-1,近端小管损伤的临床生物标志物)(图4f-g)。处理后在约80%的类器官中检测到了KIM-1免疫荧光,并且使用两个不同的抗体进行了确认(图4g-h)。相比之下,尽管上胚层球状体对顺铂和庆大霉素展示出了剂量依赖性的灵敏度,但处理之后并未上调KIM-1,说明这一特征对肾脏类器官是特异性的(图11Oa)。类器官培养物也可以被小型化至96孔板形式(易于进行高通量实验)(图4i)。管状类器官培养物进一步被解离并移植到新生的免疫缺陷小鼠的肾脏中。3周之后,本发明人在小鼠肾脏皮质中鉴定出了人核抗原阳性(HNA+)上皮结构,LTL强度与邻近的小鼠小管相当(图4j)。尽管本发明人并未观察到血管化的肾小球的形成,但还观察到了人PODXL+、vwF和SIX2+细胞(图4k和图21a)。综合来说,这些结果证明了球状类器官可以被用于与肾小管微生理和移植相关的体内和体外研究。
实施例15
肾小管与上胚层空腔中的不同的渗透性
为了测试多能性子代上皮细胞的屏障功能,本发明人使用不同大小的荧光化合物开发实时分析法以使分子进出管腔的扩散动力学可视化。在上胚层球状体中,添加到培养基中的荧光黄(LY,521Da)在2-4小时内逐渐在空腔内累积,但是罗丹明缀合的右旋糖酐(RD,10000Da)被从管腔排出,并取而代之在顶端的细胞间区域中累积,并形成围绕管腔的明亮的光环(图5a)。相应地,将RD显微注射到空腔内数小时后仍能检测到(图5b)。当将荧光化合物与球状体孵育多个小时并随后进行洗出时,这些化合物在最初保持其分布,但强度随着时间衰减,说明这些荧光物质仍然是动态的而不是被固定在定位处(图5c-d)。这些发现揭示了在上胚层球状体上皮细胞的顶端细胞间连接处的功能性的尺寸选择性的大分子渗透屏障。本发明人进行了平行的实验来评估荧光大分子在分化的管状类器官中的运输。与上胚层球状体相比,在孵育2-4小时后,RD定位至处于约80%的类器官中的管状管腔,并且在24小时的冲洗追踪期间仍然结合,无相应的LY的富集(图5e-f)。与拉春库林(Lat)B(肌动蛋白聚合和内吞作用的抑制剂)的共同孵育显著减少了RD的累积(图5g)。与RD相似,转运物荧光素甲氨蝶呤(MTX,979Da)也在肾小管中鲜明地累积,但看起来在清洗后比RD更加动态化(图5h)。MTX在hPSC球状体空腔内未被类似地富集(图5i)。当用0.5mM EDTA处理荷载了RD的类器官1小时来破坏紧密连接时,管腔RD信号强度减弱,表明RO仍然是可移动的(图22a)。48小时后,新添加的RO定位至处于起始的分布模式的相同的小管(图22a)。固定和共定位显示出,RO在缺乏LRP2/megalin的小管片段中富集,而不在邻近的LRP2/megalin+段中富集,表明了定位的LRP2/megalin介导的再吸收(图22b)。因此,管状类器官显示出了典型的近端小管的运输特征,并且与上胚层球状体的特征不同。
实施例16
足细胞标记蛋白调节上胚层和足细胞的形态发生
本发明人进一步应用该***来阐明足细胞标记蛋白(被认为用于在上胚层和肾脏中调节上皮细胞分化、极性和管腔形态发生的顶端唾液黏蛋白)的作用。使用规律成簇的间隔短回文序列(CRISPR)/Cas9基因组编辑***生成足细胞标记蛋白基因敲除(PODXL-/-.)的hPSC,并通过色谱分析选取克隆(图6a-d)。足细胞标记蛋白的免疫印迹显示出在PODXL-/-.hPSC中完全缺失的约220和80kOa的两个主要条带(图6e和图23a)。在敲除细胞中,与足细胞标记蛋白相关的两个多潜能标志物TRA-1-60和TRA-1-81减少了约40%(图23b-e)。PODXL-/-.hPSC显示出与同基因型的未修饰的hPSC难以区分的畸胎瘤的形成、生长率和集落大小,说明其保持着多能性和自我更新能力(图6f-h)。引人注意的是,与具有另外的相同的遗传背景的未修饰的对照相比,3D夹心培养物中的PODXL-/-.hPSC在其产生中空管腔的能力方面显示出约85%的猛烈下降,通过相差显微镜术发现其取而代之为实心的球状体(图6i-j)。在PODXL-/-.球状体形成可见管腔的少数情况中,管腔在直径方面减少了约70%(图6k)。这些结果表明足细胞标记蛋白在维持多能性方面是非必需的,但是对于上胚层球状体管腔发生而言是需要的。
先前显示了通过RNA干扰(RNAi)敲低足细胞标记蛋白破坏了紧密连接组织。然而,在PODXL-/-hESC中,连接组分ZO-1、闭合蛋白和丝状肌动蛋白看起来被适当定位,并且跨上皮电阻(TEER)与野生型对照并无区别(图6l-n)。免疫荧光进一步揭示了PODXL-/-.hESC球状体中的小的压紧的管腔与顶端极化的ZO-1一致(图24a)。与野生型细胞相似,添加至培养基的LY在这些小的管腔中累积,但是RD却从管腔中排出并在细胞间灶点中累积(图24b)。
与PODXL-/-hESC中的这些发现相反,通过RNA沉默(siPODXL)敲低约90%足细胞标记蛋白导致ZO-1错误定位于残留的足细胞标记蛋白的小膜片,从而使ZO-1限制于其正常表面积的约50%(图24c-e)。在siPDOXL hPSC中,空腔的形成被抑制了约50%,而ZO-1、OCT4和NANOG的总表达水平未受影响(图24f-h)。为了研究足细胞标记蛋白是否可能通过分子间电荷斥力直接有助于管腔的扩张,用低浓度(8μg/ml)的硫酸鱼精蛋白(PS)(带正电荷的聚阳离子,中和带负电荷的唾液酸化的足细胞标记蛋白的胞外域)处理hPSC。PS强烈地抑制了3D空腔形成,引起足细胞标记蛋白错误定位于分散的膜片(图24i-j)。综上,这些结果揭示了足细胞标记蛋白促进了上胚层管腔发生(不依赖其与紧密连接的关系,很可能通过直接的电荷介导的机制)。
本发明人接下来研究了足细胞标记蛋白在人类肾脏细胞类型中的作用。PODXL-/-hPSC高效地分化为以小管(ZO-1+LTL+)和足细胞(ZO-1.SYNPO+)为特征的肾脏类器官,而不论这些细胞类型的足细胞标记蛋白表达的完全缺失(图7a)。PODXL-/-类器官显示出类似于野生型hPSC的小管形态和直径,表明足细胞标记蛋白对于全部的管状类器官形态发生而言是非必需的(图7a-b)。在从PODXL-/-hESC分化的LTL+小管中ZO-1的表达类似地未改变,而且采用了鹅卵石外形(图7c)。显著地,在来自成年人类肾脏的组织切片中,足细胞标记蛋白在肾小球中高表达,但在小管中却未检测到(图7d)。因此,本发明人通过共聚焦显微镜术更严密地检查了源自hPSC的足细胞。在未修饰的足细胞中,足细胞标记蛋白鲜明地包被在足细胞聚集体的外表面上的质膜,而ZO-1、SYNPO和β-连环蛋白以与足细胞标记蛋白互反的模式共定位,在聚集体内的相邻的细胞间形成不同的内部轨迹(图7e;见图1i)。相比之下,在PODXL-/-类器官中,此类线性的轨迹的出现明显减少,连接标志物采取更弥散的表达模式(图7f)。与同基因型的对照相比,PODXL-/-类器官中的这些轨迹的消失与邻近的足细胞之间的间隙宽度减小有关(图7g)。本发明人推断足细胞标记蛋白调节肾脏足细胞(但并非小管或上胚层细胞)中的连接组织。
实施例17
基因组修饰的肾脏类器官形成PKD特异性的囊肿
最后,本发明人研究了肾脏类器官用于功能性地模拟多囊性肾病(PKD)的潜能,该病以肾小管扩张形成囊肿为特征。提出PKD1或PKD2中的双等位基因功能缺失突变强烈地有助于PKD囊肿形成。因此,本发明人应用CRISPR/Cas9基因组编辑***以在hPSC中引入PKD1或PKD2中的双等位基因截短突变(图8a-b)。色谱分析和免疫印迹确认了在目标位点处的移码突变并证实了相应的全长蛋白的缺失(图8e-d)。PKD hPSC表现出与同基因型对照相当的自我更新和畸胎瘤形成能力(图8e-f)。PKD hPSC形成了腔化的上胚层球状体,该球状体具有与对照相似的形态和管腔直径(图8g)。这些球状体以相当的效率进一步分化为管状类器官(图8h)。这些实验揭示了PKD1和PKD2对于维持多能性是非必需的,而且不会明显地影响上胚层球状体的空腔化或形态发生。
为了测试这些细胞系是否可能在肾脏谱系中产生与PKD相关的表型,本发明人将源自PKD hPSC的类器官与同基因型的未修饰的对照并行地培养数周。显著地,在PKD hPSC培养物中,本发明人观察到了大的半透明的囊肿样结构在管状类器官的旁边形成(图9a)。与相邻的管状类器官(保持固定在接近培养皿表面的位置)相比之下,这些结构保持栓系至下层的基质,但是响应于震动(vibration)而自由地移动。这些囊肿以低的比率(肾脏类器官的约5%)被检测到(图9b)。重要地,在这些条件下,并行接种和分化的同基因型的对照hPSC组并未形成囊肿(图9b)。在最初的接种后约35天PKD囊肿开始变得引人注目的,并在培养期间持续扩增。囊肿表现出与邻近小管相当的对LTL的强的亲和力(图9c),并且在时间推移的影像中被观察到从管状结构中出现。共聚焦显微镜术示出了囊肿-衬里上皮细胞围绕着没有细胞的中空内部区室(图9d)。与相邻的管状结构相比之下,囊肿没有明显地累积荧光物质(图9e)。与上胚层球状体相比之下,这些发现表明PKD突变导致异常的来自管状类器官的囊肿形成。
实施例18
讨论
对hPSC及其衍生的体细胞谱系的上皮特性的了解极少。未分化的hPSC及其分化的子代中的上皮生理及形态发生的重构对于推进其作为人类实验室模型和再生治疗的潜能是重要的。所述的培养***和分析建立了用于以三维产生并功能性地描述未分化的hPSC及其子代上皮细胞的框架。hPSC是良好表征的同源且遗传多样性的细胞类型,包括患者特异性免疫相容性的iPSC。运转良好的上皮细胞可因此适用于再生医学。
本发明人首次证明了未分化的上胚层阶段的hPSC在3D培养物中形成了腔化的球状体,与新近源自mESC的玫瑰花结相似,但具有扩大的管腔。重要地,球状体在未分化的条件下形成并保持完全的多能性,排除了其表示分化的谱系的可能性(14)。球状体的形成进一步被限制至上胚层阶段,但不具有ICM阶段hPSC或者mESC的特征。灵长类动物的上胚层在体内是扩展的盘状的上皮细胞团,围绕着高度动态的早期羊膜腔。
因为伦理和法律障碍在现阶段限制了人类胚胎的研究和培养,hPSC球状体为上胚层空腔化和随后的分化提供了伦理上可接受且实验上易行的3D模型。原理上,上胚层球状体中的管腔形态发生通过顶端-底侧极化出现,类似于MOCK细胞。比起现有的上皮细胞模型,hPSC的广泛的谱系灵活性和遗传多样性是主要的优势,使得来自不同的组织和遗传背景的人类上皮细胞能够直接比较。使用遗传学上修饰的hPSC,本发明人鉴别出足细胞标记蛋白是上胚层球状体管腔发生的主要调节物,其发挥作用与这一细胞中的紧密连接无关。
本发明人的结果表明籍以组合顶端-底侧极化、紧密连接组织和足细胞标记蛋白表达的分子模型将上胚层阶段的hPSC与ICM阶段的祖细胞相区分,并且促进了早期羊膜腔的形成(图10a)。相应地,在体外形成管腔的能力将活化的hPSC与其原始的对应物相区分。通过将2D培养物和3D培养物直接进行对比,本发明人的研究揭示出在上胚层阶段的球状体形成可显著地影响随后的细胞命运决定,产生管状类器官而非心肌细胞。这些类器官重演了在体外的肾脏发育和生理学的主要特征,这对使用原代成体或者胚胎肾细胞构建模型而言是有挑战性的。与先前的从hPSC定向分化成肾脏的方案相比之下,本发明人的简单的两步程序(形成球状体,随后在低生长因子的基质胶中进行CHIR处理)不需要外源性地补充成纤维细胞生长因子2(FGF2)、激活素或者骨形态发生蛋白。管状结构被处于在贴附的微板形式的稀释的ECM围绕,这在实验上易行、可扩展且潜在地高通量。这些结构表现出与传统的肾脏细胞系和类器官不同的谱系复杂性。在肾脏样构造的各单独的类器官中,发育出近端肾元的所有重要组件(小管细胞、内皮细胞、肾元祖细胞和足细胞)都被再现(represent)(图10b)。近端小管以特征性的方式运输荧光物质,与其来源的多潜能球状体上皮细胞不同。当受到损伤时,小管表达出临床生物标志物KIM-1(在体内的近端小管的高度特征性的应答,但在去分化的原代培养物中却不存在)。这可为预测近端小管的肾毒性(药物开发中最常见的失败原因)提供可量化的人类标准。PKD是最常见的单基因疾病之一,并且临床医生和细胞生物学家对PKD很感兴趣。现有的细胞***报道了在简单的球状体的形成或归因于PKD基因表达缺陷的囊肿的形成之间的定量差异。
然而,在这些***中甚至野生型的细胞也时常会形成囊肿。因此,用于PKD特异性的从小管进行的囊肿形成的可再现性的***是该领域的重要目标,尤其是在对物种特异性的病理生理学与治疗具有临床兴趣的人类中。本发明人发现,功能缺失的PKD基因突变导致从hPSC衍生的小管细胞形成囊肿,而在同基因型的对照中未观察到。这一发现表明从小管进行的PKD特异性的囊肿发生是细胞固有的现象,可以在体外最小的***中进行模拟。因为PKD1和PKD2突变均能观察到囊肿发生,而且对肾脏类器官而言是特异性的,但对上胚层球状体而言并非如此,因此该表型在这一***中的是基因特异性和谱系特异性的。囊肿以相对较低的频率出现,这与遍及PKD患者和小鼠模型的肾脏的囊肿的局灶性外观一致。需要进一步的研究来确定该***中的囊肿发生的细胞基础,并且确定来自PKD患者的iPSC(具有杂合突变和多变的遗传背景)是否也产生了囊肿。因为囊肿是相对少见的现象,所以可能需要iPSC分化效率的改进以进行此类实验。除了小管细胞,hPSC***产生在形态与功能上均异于肾小管的足细胞。hPSC衍生的足细胞形成了分隔开连接组分(比如CRB3和ZO-1)的极化结构域,这与在体内的足细胞的生物化学和显微分析一致。这些蛋白与足细胞标记蛋白、synaptopodin和WT1的组合除了在肾脏足细胞中共同表达外,在其它任何群中均不知晓其共同表达,在其它器官中也预期不到此类细胞出现在LTL+小管细胞旁边。本发明人使用CRISPR敲除细胞系证明了足细胞标记蛋白在这些细胞中用于在基底外侧分隔开的连接复合体,这与啮齿类动物肾发生期间和Podxr1小鼠中的发现类似。
因为足细胞标记蛋白表达中的改变是人类肾小球疾病状态的特征,所以对PODXL-/-足细胞的进一步研究可能产生对细胞病理生理和治疗的理解。hPSC***确实具有局限性。例如,本发明人目前尚未观察到从hPSC足细胞及邻近的内皮细胞进行的血管化肾小球的形成。为了更加推进的疾病建模和治疗应用,需要涉及在体内的组织微环境和体液流动的专门研究来进一步使该***发育成完全功能性的肾元。总之,本发明人开发了3D培养***,该***重构了功能性的结构化的上皮细胞(代表上胚层、肾小管细胞和足细胞)。这些多潜能的和子代的上皮细胞共享一些关键的结构特征,但是尽管如此它们能够重演阶段特异性的运输特征和形态发生机制。这提供了精准的可再现性的平台,在其中模拟人类不同发育阶段的微观生理学、损伤和疾病。基因组修饰的管状类器官功能性地重演了肾脏疾病的表型,加强了对这些结构作为用于在体外研究人类肾脏生理学和病理生理学建立的创新的细胞***和肾脏的认识。上述的方法学可广泛地适用并且适合于多种组织和遗传学上多样化的背景,并且可以立即用来在实验上研究与人类上皮疾病相关的分子通路。从长远来看,在再生移植给予之前,该***可以为在体外优化和测试患者来源的上皮细胞的功能提供有用的装置。
实施例19
3D培养
细胞系包括H9(WA09)、BJ、HDF、hLR5、hfib2-iPS4、以及hfib2-iPS5(人)和J1、R1和v6(小鼠)。将细胞在培养基(用于hPSC的mTeSR1;用于mESC的N2/B27补充物+2i;用于hLR5iPSC的hESC条件培养基(CM)+白血病抑制因子(LIF)+dox)中于3%Reduced GrowthFactor GelTrex(Life Technologies)上维持无饲养状态至少1次传代,并用Accutase或者TrypLE进行分离。通过撤除LIF和多西环素并用FGF2替代,从原始的hLR5iPSC衍生出LD-iPSC。对于薄凝胶夹心集落,在用处于补充有10μM Rho-激酶抑制剂Y27632(StemGent)的培养基中的GelTrex预包被的24孔板或4孔腔室载玻片中,将细胞以60000个(活化的)细胞/孔或者30000个(原生的)细胞/孔接种。第二天,将培养基替换为处于mTeSR1中的500μl 1.5%GelTrex。24小时后更换培养基。对于厚凝胶培养物,将96孔板的每孔的20000个(上胚层阶段)或者6000个(原始的)细胞重悬于75μl的缓冲胶原蛋白I(含有10mM HEPES和1×DMEM)、低生长因子基质胶(BD Biosciences)或者二者1:1混合物中,在37度下孵育45分钟,然后用100μl附加Y27632的培养基覆盖。对于薄凝胶内的连续传代,3D培养物中的具有管腔的集落在接种后72小时被解离,并以300000个细胞/孔重接种到6孔板中,并以2D或者3D条件培养72小时,再进行解离、细胞计数和重新接种。对于悬浮液,将20000个解离的hPSC接种到处于低粘附6孔板的一个孔中的mTeSR1培养基中。对于所有的细胞,每天更换培养基。
实施例20
管状类器官的分化
接种60000-120000个H9hPSC,足以产生分散的独立的球状体集落。夹心化48小时后,将hPSC球状体用12μM CHIR处理36个小时,然后更换为RB(Advanced RPMI+Glutamax+B27补充物),并且之后每三天更换一次。或者,如同对2D心肌细胞分化所述的一样,将球状体用处于没有胰岛素的RB(RBNI)中的12μM CHIR处理24h,用RBNI处理48小时,用5μM IWP2处理48小时,用RBNI处理48小时,然后每三天更换RB。对于2D肾脏分化,将细胞接种过夜并随后用处于APEL培养基(StemCell Technologies)中的8μM CHIR处理48-72小时,用处于APEL培养基中的30ng/ml FGF2+1μg/ml肝素处理96小时,并随后在APEL培养基中培养10-15天。对于随机分化,将2D或3D培养物中的hPSC用处于DMEM+P/S中的10%胎牛血清(FBS)处理并观察19天。
实施例21
免疫荧光和电子显微镜术
为了在维持3D构造的同时进行固定,向培养基添加等体积的8%多聚甲醛(终浓度为4%),在室温下进行15分钟。固定之后,将样品在PBS中进行清洗,在5%驴血清(Millipore)/0.3%Triton-X-100/PBS中封闭,在具有一抗的3%牛血清白蛋白/PBS中孵育过夜,清洗,用Alexa-Fluor二抗(Invitrogen)孵育,清洗并用DAPI染色或者在VectashieldH-1000中封片。一抗包括:OCT4(sc-5279;Santa Cruz)、NANOG(RCAB0004PF;Cosmobio)、brachyury(sc-17745;Santa Cruz)、TRA-1-60(MAB4360,Millipore)、TRA-1-81(MAB4381;Millipore)、乙酰化的-微管蛋白(051M4770;Sigma)、ZO-1(339100;Invitrogen)、足细胞标记蛋白(AF1658和AF1556;R&D)、CDX2(-88,Biogenex)、AQP1(AB2219;Millipore)、WT-1(sc-192;Santa Cruz)、LHX1(Developmental Studies Hybridoma Bank)、mPODXL(AF1556;R&D)、hPODXL(AF1658,R&D)、HNA(MAB1281,Millipore)、LTL(FL-1321,Vector Labs)、SYNPO(sc-21537;Santa Cruz)CD31(555444;BD)、crumbs 3(HPA013835,Sigma)、Na,K-ATPase(ab7671,Abeam)以及活化型天冬半胱酶-3(MAB835;R&D)。用Nikon epifluorescence 90-I(正置)、Eclipse Ti(倒置)或者confocal C1microscopes采集荧光图像。对于电子显微镜术,在固定5分钟后,将结构从培养板中刮出,在300g下成球团4分钟,通过吸取入含有4%甲醛和2%戊二醛的二甲基胂酸盐缓冲液中将球团轻柔地释出,用四氧化锇进行后固定,在系列乙醇中脱水,并包埋入环氧树脂中。将半薄切片以1mm切出并用甲苯胺蓝进行染色以通过光镜检查鉴别出具有明显的管腔的管状结构。将超薄切片(75nm)切出,安装于200目的铜载网上,用乙酸双氧铀和柠檬酸铅进行复染,并在JEOL JEM-1010透射电子显微镜下检查。
实施例22
渗透性分析
为了测试渗透性,将培养基补充附加了荧光黄卡巴肼钾盐(Invitrogen,38μM)和罗丹明-B异硫氰酸酯右旋糖酐(Sigma,0.5μM)的20mM HEPES,并用共聚焦显微镜成像。对于显微注射,将处于mTeSR1中的5μM罗丹明缀合的右旋糖酐溶液与酚红溶液(0.5%,Sigma)1:1稀释用于可视化。在Nanoject-2显微操作器上通过拉拔的玻璃毛细管微针显微注射2nl,并通过宽视场落射荧光显微镜实时监测。对于TEER,将50,000个hPSC接种在用稀释的基质胶预包被的24孔transwell板(Corning)上。将培养基轻柔地更换10天,直到细胞完全融合。将TEER使用EVOM 2设备(World Precision Instruments)进行测量。
实施例23
KIM-1诱导
用增高浓度的庆大霉素和顺铂处理24孔板的相同接种的孔中的类器官36-48小时,固定,并用KIM-1抗体AKG7.9(Bonventre laboratory)或1400(Biogen)进行免疫荧光处理。在中度的亚毒性剂量下观察到KIM-1的免疫荧光,该剂量不会引起严重的肾小管崩解。
实施例24
RNA干扰
接种16小时后,用针对处于无抗生素的mTeSR1中的加扰对照或PODXL、OCT4的Dharmacon Smartpool siRNA转染hPSC。十小时后,更换培养基并将细胞以2D培养或夹心化用于3D培养。
实施例25
Cas9/CRISPR诱变
将编码绿色荧光蛋白(GFP)标记的Cas9的构建体(Addgene 44719)以及靶向PODXL的第二外显子(GCTACACCTTCACAAGCCCGGGG)[SEQ ID NO:1]、PKD2的第一外显子(GCGTGGAGCCGCGATAACCCCGG)[SEQ ID NO:2]或者PKD1的第36外显子(GTGGGTGCGAGCTTCCCCCCGGG)[SEQ ID NO:3]的向导RNA(Addgene 64711)瞬时转染到H9hESC中,并且将表达GFP的细胞通过流式细胞分选技术分离出来,克隆扩增,并筛选带有双等位基因功能缺失***缺失(indels)的克隆。将约200000个经分选的hESC接种于6孔板的每一个孔的附加Y27632的hESC条件培养基mTeSR1中。次日上午,更换为不含Y27632的培养基,使细胞克隆扩增,并且通过PCR扩增PODXL gRNA区域。手动分析色谱图序列,并通过免疫印迹和免疫荧光来确认突变。
实施例26
转录组分析
使用RNEasy Mini Kit(Qiagen)并行地准备以2D或者3D接种的hPSC。将样品在Agilent Bioanalyzer上进行QC’d,以核实高完整度的样品。然后,使用TruSeq strandedmRNA library kit((lllumina)准备合格的样品。测序在lllumina NextSeq500 75×75paired end high output run上进行。使用Tophat2将样品与hg19参考序列比对,并使用Cuffdiff计算差异化表达。
实施例27
RT-PCR
在分化时程期间于接种后的第2天、第10天、第14天和第21天,使用RNeasy MiniKit(Qiagen)制备RNA。使用M-MLV Reverse Transcription System(Promega)将来自所有时间点的RNA并行地反转录。使用cDNA(1:10稀释)、300nM引物和iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)用iQ5Multi-Color Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad)以二重复进行定量RT-PCR反应,使用P-肌动蛋白作为管家基因。
实施例28
定量和统计分析
对于荧光强度定量,图像是在相同的曝光和相同的处理下于单个拍摄场景中拍摄。将腔化的集落(具有管腔的椭圆体)数量和扁平的集落(非椭圆体或无管腔)数量以活细胞的相差图像手动打分,其中,比起在固定样品中更容易分辨管腔。对于细胞凋亡,将活化型半胱天冬酶-3的表达进行手动打分,通过细胞核浓染确认,并除以每个宽视场落射荧光图像的细胞核总数。对于ZO-1面积,对表达ZO-1的单独的集落或者亚区域进行手动示踪,并使用NIS Elements(Nikon)计算表面积。对于各集落,将总计的表达ZO-1的面积表示为占总表面积的百分比,然后进行平均。为了定量强度,通过随机选取的用相同曝光拍摄的结构绘制等长的线扫描以获取NIS Elements软件(Nikon)中的原始荧光值。平均的线扫描值用误差棒绘出。对于CHIR诱导的分化,使用Cell Profiler 2.0在低放大倍数的免疫荧光图像中识别出约6000个单个的细胞,然后自动测量荧光强度。具有不等方差(异方差)的两个样品的统计比较采用双尾t检验。免疫印迹使用ImageJ Gel Analyzer进行定量。
实施例29
在3D培养物中hPSC形成腔化的球状体
为了评价未分化的hPSC和子代hPSC-KC的组织特异性功能,本发明人开发了用于hPSC的贴壁的3D培养***,在该***中hPSC首先产生上胚层球状体并随后产生肾小管(图25a)。将解离的未分化的hPSC在两层稀释的基质胶(0.2mg/mL)之间夹心化,形成紧密的球样的集落;经过48小时,这些集落形成内部空腔(图25b)。成熟的球状体由围绕中空管腔的简单柱状上皮细胞构成(图25b-c)。球状体细胞表现出了从足细胞标记蛋白(PODXL)向管腔表面、从紧密连接蛋白(ZO-1)向顶端细胞-细胞连接以及从β-连环蛋白向原代的基底外侧膜的极化定位(图25c)。在单层hPSC中也观察到了类似的顶面底侧极化模式(图32a)。
本发明人进一步测试了hPSC球状体的多能性和自我更新能力,这是未分化的hPSC的主要功能特征。在9次连续传代中,解离的空腔-衬里细胞在夹心化后产生新的腔化的球状体,或者当最后一次传代形成单层状态时产生扁平的集落(图25d)。甚至在大量连续传代至3D培养物或者从3D培养物大量连续传代后,将空腔-衬里细胞植入免疫缺陷小鼠体内高效地产生源自全部三个胚胎胚层的畸胎瘤组织(图25e)。2D和3D培养物显示出了类似的生长率,并且多能性标志物(包括八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定区Y框蛋白-2(SOX2)、NANOG和TRA-1-60)被持续地在连续地夹心化的细胞中以相同的模式表达(图25f-g)。处于多能性维持(mTeSR1)培养基中的2D集落和3D球状体也具有几乎相同的全基因表达谱(图32b)。因此,球状体代表未分化的、自我更新的多潜能干细胞而不是已分化的亚型。
在人类和许多其它哺乳动物的发育过程中,早期胚胎的ICM分化成作为所有体细胞来源的上胚层。本发明人假设hPSC球状体模拟了上胚层上皮细胞团,其形成围绕人类和灵长类着床期胚胎中的早期羊膜腔的柱状上皮。相反地,类似于更原始的ICM的hPSC则预期不会成腔。实际上,形成类似于小鼠(m)ESC的紧密的ICM样集落的“原始的”hLR5iPSC甚至在五天的生长后在3D培养物中也不会形成管腔,而类似于上胚层阶段hPSC的来源于“活化的”hLR5的(LD-)iPSC在夹心培养物中高效地形成空腔(图33a-b)。原始的和活化的hPSC在2D和3D培养物中均持续地表达核OCT4和SOX2(图33c)。类似地,类似于ICM的原始的mESC在各种3D培养条件下不会形成空腔,但是上胚层阶段的mEpiSC形成围绕小管腔的玫瑰花结(图33d-f)。这些实验确定了上胚层阶段是hPSC球状体管腔发生的临界窗口,而原始的(ICM阶段)hPSC不能形成管腔。
实施例30
GSK3β抑制作用使球状体分化成管状类器官
为了使上胚层球状体分化成子代上皮细胞,本发明人应用了最初为来自2D培养物的心肌细胞生成而设计的定向分化方案,其涉及糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)和Wingless相关整合位点(WNT)信号传导的顺序抑制。引人注目的是,球状体细胞经历了上皮-间充质转化(EMT)形成融合单层而非形成心肌细胞,到第10天聚集成褶皱并且开始间充质-上皮转化(MET),形成卷绕的半透明的管状类器官(图26a,图34a-b)。这一新方案的优化揭示了球状体的形成、用糖原合成酶激酶-3β抑制剂CHIR99021处理以及随后的在补充有B27的培养基中的孵育足以诱导管状分化,而胰岛素和WNT抑制步骤是非必需的(图34c-d;将优化的方案在图265a中示出)。
本发明人检查了这些管状类器官的肾脏标志物的表达。作为肾脏近端小管标志物的翅荚百脉根凝集素(LTL)与管状结构强烈反应,并且在管状管腔中富集出现(图26b-c)。通过对比,与小管并行检查的上胚层球状体对LTL具有微弱的亲和力(图34e)。由于LTL与肾小管强烈反应,同时也与一些其它上皮细胞强烈反应,本发明人用肾脏以及其它器官的标志物对这些类器官实施了更彻底的表征。小管表达肾元祖细胞/肾囊的标志物LIM同源异型盒1(LHX1)和配对盒基因2(PAX2)(图26b)。Sine oculis homeobox homolog 2(SIX2)在邻近小管的间充质中表达,但不在小管本身中表达,这与该标志物对后肾间充质的发育限制一致(图26b)。内吞受体低密度脂蛋白相关蛋白2(LRP2/megalin)和cubilin在顶端共同表达,并与LTL共定位在小管片段中(图26c)。通过电子显微镜术在小管中观察到顶端微绒毛和紧密连接(图26d)。本发明人还观察到从表达E-钙粘蛋白(ECAD)(远端小管标志物)的片段到LTL+片段(近端小管)到包含PODXL+足细胞样细胞的囊样结构的小管的解剖进程(图26e)。这些PODXL+细胞聚集在小管末端,处于类器官周围(图26f)。它们表现出球状且紧密成簇的形态,缺乏LTL反应性,并共表达肾脏足细胞的额外的标志物(包括肾母细胞瘤蛋白(WT1)和synaptopodin)(图26f-g)。表达CD31和血管假性血友病因子(vWF)的内皮索也在类器官中出现,与小管和足细胞样细胞群均接触(图26g)。这些结果表明管状类器官含有能够进行肾元样分段和成血管结构的自组织hPSC-KC亚群。
使用该方案,H9hESC和三种不同的hiPSC系以肾脏样分段排布产生并入了具有近端小管、内皮细胞和足细胞的特征的细胞和结构的类器官(图26g)。hESC显示出最高的分化效率,每1.9cm2产生约90个类器官,LTL+细胞占总培养物的约25%(图26h和图35a)。约80%的LTL+类器官包括内皮细胞(CD31+)和足细胞样细胞(PODXL+)群(图26h)。神经外胚层(TUJ1)或肠(CDX2)的标志物在类器官中不存在;然而,在培养物中观察到TUJ1+细胞的分离开的簇与肾脏类器官的比率为约1:2,并且向小管投射出轴突样的进程(图35b-d)。分化的时程期间的RNA和蛋白质分析揭示了表征中内胚层、肾元祖细胞以及最后的近端小管以及近端小管样细胞的标志物的顺序诱导(图35e)。为了评估它们在体内的植入潜能,将管状类器官培养物解离并植入新生免疫缺陷小鼠的肾脏中。三周后,本发明人鉴定了小鼠肾皮质内的人核抗原阳性(HNA+)上皮结构,其LTL强度与邻近的小鼠小管相当(图26i)。本发明人推断出管状类器官最有可能代表肾脏谱系。
实施例31
肾脏类器官重演组织特异性损伤和运输
在hPSC-KCs中尚未被证实组织特异性功能或疾病表型。因此,本发明人研究了肾脏类器官上调肾脏损伤分子-1(KIM-1)的潜力,KIM-1是近端小管损伤的临床生物标志物。当用肾毒性药物顺二氯二氨铂(II)(顺铂)或庆大霉素处理时,在~80%类器官中的小管的管腔表面检测到KIM-1免疫荧光,并使用两个不同的抗体进行了确证(图27a-c)。相比之下,虽然上胚层球状体对顺铂和庆大霉素都表现出剂量依赖性的灵敏度,但是它们在经过处理后不会上调KIM-1,说明这种反应对肾脏类器官是特异性的(图27d)。值得注意的是,在扩大的培养物中LTL+小管保持稳定至少120天,并且培养物也可被小型化至96孔形式(图27e-f)。因此,肾脏类器官可能提供长期的高通量模型***来评估人类肾毒性。
为了测试上胚层球状体和肾小管是否表现出组织特异性屏障功能,本发明人使用不同大小的荧光化合物开发了实时分析法以使进出管腔的分子扩散动力学可视化。在上胚层球状体中,添加到培养基的荧光黄(LY,521Da)在2-4小时内逐渐在空腔内累积,而罗丹明缀合的右旋糖酐(RD,10,000Da)被从管腔排出,并取而代之在顶端的细胞间区域中累积,并形成围绕管腔的明亮的光环(图28a)。相应地,将RD显微注射到空腔中数小时后仍能被检测到(图28b)。另一小分子荧光素甲氨蝶呤(MTX,979Da)不在hPSC管腔中累积(图28c)。当将荧光化合物与球状体孵育多个小时并随后进行洗出时,这些化合物在最初保持它们的分布,但强度随着时间衰减,说明这些化合物仍然是动态的而不是被固定在定位处(图28d)。本发明人进行了平行的实验以评估荧光大分子在分化的管状类器官中的运输。与上胚层球状体相比,在孵育2-4小时后,RD定位于约80%的类器官中的管状管腔,并且在24小时的冲洗追踪期间仍然结合,无相应的LY的富集(图28e-f)。与拉春库林(Lat)B(肌动蛋白聚合和内吞作用的抑制剂)的共同孵育显著减少了RD的累积(图28g)。与RD相似,MTX也在肾小管中累积,但看起来在清洗后比RD更加动态化(图28h)。因此,管状类器官表现出典型的近端小管的运输特征,并且与上胚层球状体的特征不同。
实施例32
足细胞标记蛋白促进独立于紧密连接之外的上胚层腔化
足细胞标记蛋白是在上胚层和肾脏足细胞中都高度表达的顶端唾液黏蛋白。为了研究足细胞标记蛋白在这些细胞类型中的功能,使用规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因组编辑***生成足细胞标记蛋白敲除(PODXL-/-)的hPSC(图36a)。足细胞标记蛋白的免疫印迹显示出在PODXL-/-hPSC中完全缺失的~220和80kDa的两个主要条带(图29a)。在敲除细胞中,与足细胞标记蛋白相关的两个多潜能标志物TRA-1-60和TRA-1-81减少约40%(图36b)。PODXL-/-hPSC表现出与同基因型的未修饰的hPSC难以区分的畸胎瘤的形成、生长率和3D集落大小,说明它们保持了多能性和自我更新能力(图36c-e)。引人注目的是,与具有另外的相同的遗传背景的未修饰的对照相比,3D夹心培养物中的PODXL-/-hPSC在其产生中空管腔能力方面显示出约85%的猛烈下降,通过相差显微镜术发现其取而代之为实心的球状体(图29b-c)。此外,在形成足细胞标记蛋白衬里空腔的上胚层阶段hPSC和mEpiSC中,足细胞标记蛋白的表达比不形成空腔的ICM阶段的细胞高(图29d-e)。这些结果表明足细胞标记蛋白对于维持多能性是非必需的,但是对于上胚层球状体管腔发生而言是必需的。
足细胞标记蛋白被认为通过紧密连接组织来调节管腔发生。然而,在PODXL-/-hPSC中,连接组分ZO-1、闭合蛋白和丝状肌动蛋白看起来被适当定位,并且跨上皮细胞电阻(TEER)与野生型对照并无区别(图29f-h)。尽管通过相差显微镜术仅很少在活细胞中观察到管腔,但固定的培养物中的免疫荧光显示出在PODXL-/-hPSC球状体内的小的压紧的管腔,内衬着顶端极化的ZO-1(图37a)。类似于野生型细胞,添加到培养基的LY在这些小管腔中累积,而RD却从管腔中排出并在细胞间灶点中累积(图37b)。这些实验证明,足细胞标记蛋白不需要在hPSC中建立极化的功能性的紧密连接。为了研究足细胞标记蛋白是否可能通过分子间电荷斥力直接有助于管腔的扩张,用低浓度(8μg/ml)的硫酸鱼精蛋白(PS)(带正电荷的聚阳离子,中和带负电荷的唾液酸化的足细胞标记蛋白的细胞外结构域)处理hPSC。PS强烈地抑制3D空腔的形成,引起足细胞标记蛋白错误定位于分散的膜片(图37c-d)。总的来说,这些结果揭示了足细胞标记蛋白可促进上胚层管腔发生(不依赖其与紧密连接的关系,很可能通过直接的电荷介导的机制)。
实施例33
足细胞标记蛋白调节足细胞样细胞中的连接
本发明人接下来研究了足细胞标记蛋白在人类肾脏细胞类型中的功能。在来自成年人类肾脏的组织切片中,足细胞标记蛋白在肾小球中高度表达,但在小管中却未检测到(图30a)。类似地,在hPSC衍生的肾脏类器官中,只有足细胞样细胞表达高水平的足细胞标记蛋白(图30b)。本发明人通过共聚焦显微镜术确定了这些细胞中的足细胞标记蛋白和连接标志物的定位模式。足细胞标记蛋白和另一足细胞标记物Crumbs3明显地包被在足细胞样聚集体外表面上的质膜,而ZO-1、SYNPO和β-连环蛋白以互反的模式共定位,在相邻的细胞层之间形成内部拉链样迹迹(图30c-d)。并不知晓PODXL、Crumbs3、ZO-1、SYNPO、β-连环蛋白和WT1的联合表达在除肾脏足细胞以外的任何群中出现(参见图26f),在其它器官中也预期不到此类细胞出现在LTL+小管细胞旁边。这些结果进一步揭示了hPSC-KC足细胞样细胞形成极化的结构域以使连接组分(如Crumbs3)与ZO-1分离开,这与在体内的足细胞的生物化学和显微镜分析一致。
为了研究人类足细胞样细胞中的足细胞标记蛋白的功能,本发明人从PODXL-/-hPSC产生了肾脏类器官。与野生型类器官相比之下,在PODXL-/-类器官中,线性的ZO1+SYNPO+轨迹的出现大大减少,并且连接标志物采取更弥散的表达模式(图30e)。与同基因型的对照相比,PODXL-/-类器官中的这些轨迹的消失与邻近的足细胞样细胞之间的间隙宽度的减少有关(图30f)。足细胞标记蛋白的缺乏不影响hPSC-KC向小管(ZO-1+LTL+)或足细胞(ZO-1+SYNPO+)分化的效率(图38a)。表达很少至不可检测的足细胞标记蛋白的小管在其形态、直径以及PODXL-/-类器官中的LTL或ZO-1表达模式方面没有表现出缺陷(图38a-c)。本发明人推断足细胞标记蛋白对于肾脏类器官分化是非必需的,但是在足细胞样细胞中用于适当的连接组织特别需要。
实施例34
基因组修饰的肾脏类器官形成PKD特异性囊肿
最后,本发明人研究了肾脏类器官用于功能性地模拟多囊性肾病(PKD)的潜能,其特征在于肾小管扩张形成囊肿。提出PKD1或PKD2中的双等位基因的功能缺失突变强烈地有助于PKD囊肿形成。因此,本发明人应用CRISPR/Cas9基因组编辑***以在hPSC(‘PKDhPSCs’)中引入PKD1或PKD2中的双等位基因截短突变。色谱分析和免疫印迹确认了在目标位点处的移码突变并证实了相应的全长蛋白质的缺失(图31a-b)。PKD hPSC分化成类似于同基因型的对照的畸胎瘤,并形成具有相似大小的管腔的上胚层球状体(图31c)。这些实验揭示了PKD1和PKD2对于维持多能性是非必需的,而且不会明显地影响上胚层球状体的空腔化或形态发生。
为了测试这些细胞系是否可能在肾脏谱系中产生与PKD相关的表型,本发明人将源自PKD hPSC的肾脏类器官与同基因型的未修饰的对照并行培养数周。引人注目的是,在PKD hPSC培养物中,本发明人观察到大的半透明的囊肿样结构在管状类器官的旁边形成(图31d)。与相邻的管状类器官(保持固定在接近培养皿表面的位置)相比之下,这些结构保持栓系至下层的基质,但是响应于震动而自由地移动。这些囊肿以低的比率(肾脏类器官的约6%)被检测到(图31e)。重要的是,在这些条件下,并行接种和分化的同基因型的对照hPSC并未形成囊肿(图31e)。类器官分化的总体效率在PKD hPSC和对照之间没有观察到差异。在最初的接种后的约35天PKD囊肿开始变得引人注目的,并在培养期间持续扩增。囊肿表现出与邻近的肾小管相当的对LTL的强的亲和力(图31f),并且在时间推移影像中被观察到从管状结构中出现。共聚焦显微镜术示出了囊肿-衬里上皮细胞围绕着没有细胞的中空内部区室(图31g)。与上胚层球状体相比之下,这些发现表明PKD突变导致异常的来自管状器官的囊肿形成。
实施例35
讨论
对hPSC及其衍生的肾脏细胞的上皮特征的了解甚少。这些细胞类型中的上皮生理学和形态发生的重构对于推进其作为人类实验室模型和再生疗法的潜能是重要的。所述的培养***和分析建立了用于以三维产生并功能性地描述未分化的hPSC和其子代hPSC-KC的框架。hPSC是良好表征的同源且遗传多样性的细胞类型,包括患者特异性的免疫相容性iPSC。因此,运转良好的衍生自hPSC的上皮细胞可适用于再生医学。
本发明人首次证明了未分化的上胚层阶段的hPSC在3D培养物中形成了腔化的球状体,与新近源自mESC的玫瑰花结相似,但具有扩大的管腔。通过将2D培养物和3D培养物直接进行对比,本发明人的研究揭示出在上胚层阶段的球状体形成可显著地影响随后的细胞命运决定,产生管状类器官而非心肌细胞。这些类器官重演了在体外的肾脏发育和生理学的主要特征,这对使用原代成体或胚胎肾细胞构建模型而言是有挑战性的。与先前的从hPSC定向分化成肾脏的方案相比之下,本发明人的简单的两步程序(形成球状体,随后在低生长因子的基质胶中进行GSK3β抑制)不需要外源性地补充成纤维细胞生长因子2(FGF2)、激活素或骨形态发生蛋白。管状结构被处于贴附的微板形式的稀释的ECM围绕,这在实验上易行、可扩展且潜在地高通量。这些结构表现出与传统的肾脏细胞系和类器官不同的谱系复杂性。在肾脏样构造的各单独的类器官中,发育出近端肾元的所有重要组件(小管细胞、内皮细胞、肾元祖细胞和足细胞样细胞)都被再现。近端小管以特征性的方式运输荧光物质,与其来源的多潜能球状体上皮细胞不同。当受到损伤时,小管表达出临床生物标志物KIM-1(在体内的近端小管的高度特征性的应答,但在去分化的原代培养物中却不存在)。这可为预测近端肾小管的肾毒性(药物开发中最常见的失败原因)提供可量化的人类标准。
正如本发明人对PODXL-/-hPSC的研究所阐述的,这种高级分化***可以与CRISPR/Cas9基因组编辑相结合,以确定在同基因型的遗传背景下的特定基因在不同的人类细胞类型中的功能。本发明人的结果表明籍以组合顶端-底侧极化、紧密连接组织和足细胞标记蛋白表达的分子模型将上胚层阶段的hPSC与ICM阶段的祖细胞相区分,并促进了早期羊膜腔的形成(图8a)。虽然足细胞标记蛋白上调和紧密连接组织同时出现,但在hPSC中紧密连接可不依赖于足细胞标记蛋白进行组织和发挥功能。相比之下,在足细胞样细胞中,足细胞标记蛋白在接头的组织和相邻细胞的分隔中起主导作用,这与啮齿动物肾小球发生期间和MDCK细胞中的紧密连接表型的报道一致。因此,尽管足细胞标记蛋白在上胚层和足细胞中都起到抗粘附作用,但其对细胞极性和紧密连接的作用仅限于足细胞。需要进行进一步的调查来确定构成这些细胞类型特异性的差异的基础的精确的分子机制,这表明了共同调节因子存在于一种细胞类型中,但不存在于其它细胞类型中。由于足细胞标记蛋白表达和足细胞细胞骨架方面的改变是充分描述的人类肾小球疾病状态的特征,所以这些研究可以为病理生理学和治疗提供新的见解。
PKD是最常见的单基因疾病之一,并且临床医生和细胞生物学家对PKD很感兴趣。现有的细胞***报道了在简单的球状体的形成或归因于PKD基因表达缺陷的“囊肿”的形成之间的定量差异。然而,在这些***中甚至野生型的细胞也经常形成囊肿。因此,用于PKD特异性的从小管进行的囊肿形成的可再现性的***是该领域的重要目标,特别是在对物种特异性的病理生理学和治疗具有临床兴趣的人类中。本发明人发现,功能缺失的PKD基因突变导致从hPSC衍生的小管细胞形成囊肿,而在同基因型的对照中未观察到。这一发现表明从小管进行的PKD特异性的囊肿发生是细胞故有的现象,可以在体外最小的***中进行模拟。由于PKD1和PKD2突变均能观察到囊肿发生,而且对肾脏类器官而言是特异性的,但对上胚层球状体而言并非如此,因此该表型在这一***中是基因特异性和谱系特异性的。需要进行进一步的研究来确定该***中的囊肿发生的细胞基础,并且确定来自PKD患者的iPSC(具有杂合突变和多变的遗传背景)是否也产生囊肿。由于囊肿是相对少见的现象,因此可能需要iPSC分化效率的改进以进行此类实验。
所述hPSC***确实有局限性。例如,本发明人尚未观察到从hPSC足细胞样细胞和邻近的内皮细胞进行的血管化肾小球的形成。小管也不含有完整的刷状边界。尽管邻近管状细胞观察到SIX2+间充质,但本发明人并未在这些小管中观察到输尿管芽标志物的证据。相反,肾小管具有源自SIX2+间充质的近端小管的特征,其通过非发育途径被诱导分化。类似于胚胎脊髓,这些培养物中的神经元是丰富的,并且可能代表在不存在输尿管芽的情况下用于肾小管分化的诱导信号的来源。这种基于hPSC的***的进一步的限制是缺乏用于进行谱系追踪实验的广泛可用的荧光报道基因细胞系。用于这一问题的一个可能的方案是使该方案适用于小鼠EpiSC,在表型方面类似于hPSC。例如,来自SIX2-TdTomato报告基因小鼠的EpiSC可被用于以更大的确定性确定本发明人的***中的所有小管细胞是否都源自SIX2+间充质,使用来自该小鼠的发育中的肾脏作为阳性对照。总的来说,本发明人的发现表明虽然肾脏分化确实是从hPSC发生的,但在体外的这一过程并不能完全重演发育性的肾脏发生。需要涉及体内的组织微环境和体液流动的专门的研究,以进一步使此***发育成完全功能化的肾元,用于更高级的疾病建模和治疗应用。
总之,本发明人开发了3D培养***,该***重建功能性的结构化上皮细胞模拟了上胚层、肾小管细胞和足细胞样细胞。这些多潜能的和子代的上皮细胞共享一些关键的结构特征,但尽管如此它们能够重演阶段特异性运输特征和形态发生机制。这提供了精准的可再现性的平台,在其中模拟人类不同发育阶段的微观生理学、损伤和疾病。基因组修饰的管状类器官功能性地重演了肾脏疾病的表型,增强了将这些结构认定为肾脏的程度,并建立了用于在体外研究人类肾脏生理和病理生理的创新的细胞***。所述方法学可广泛地适用并且适合于多种组织和遗传学上多样化的背景,并可以立即用于在实验上研究与人类上皮疾病相关的分子通路。从长远来看,在再生移植给予之前,这个***可以为在体外优化和测试患者来源的上皮细胞的功能提供有用的装置。
上述多种方法和技术提供了实施本发明的多种方式。当然,将理解的是,根据本文所述的任何特定实施方式,并非所述的所有目标和优点均必需实现。因此,例如,本领域技术人员将认识到,可通过实现或优化如本文教导的一个优点或一组优点而不必实现如本文教导或暗示的其它目标或优点的方式来实施本方法。本文提及了多种有利和不太有利的替代方式。将理解的是,一些优选的实施方式具体包括一种、其它或多种有利的特征,而其它的实施方式则具体地排除一种、其它或多种不利的特征,然而还有其它实施方式通过包括一种、其它或多种有利特征而特定地缓和当前的不太有利的特征。
此外,技术人员将认识到来自不同实施方式的多种特征的适用性。相似地,本领域的普通技术人员能够将上述公开的多种要素、特征和步骤以及各此类要素、特征或步骤各自的其它已知等同物混合并匹配,以根据本文所述的原理实施方法。在多种要素、特征和步骤之中,一些将被具体地包括在不同的实施方式之中,而其它的则被具体地排除在不同的实施方式之外。
虽然本发明已在一些实施方式和实施例的上下文中进行了公开,但是本领域的技术人员将会理解的是,本发明的实施方式延伸到具体公开的实施方式之外,并延伸至其它替代性实施方式和/或用途、以及其修改物和等同物。
在本发明的实施方式中已经公开了许多变化和替代性要素。进一步的变化和替代性要素对于本领域技术人员来说将是显而易见的。其中,这些变化为但不限于类器官、球状体的来源;生成、表征和产生此类细胞产物的方法;以及通过本发明的教导制造的产物的具体用途。本发明的各种实施方式可特定地包括或排除这些变化或要素中的任一者。
在一些实施方式中,用于描述和请求保护本发明的一些实施方式的表示成分、特性(如浓度、反应条件等)的量的数字将被理解为在一些示例中通过术语“约”修饰。因此,在一些实施方式中,在书面描述和所附的权利要求中阐述的数值参数是近似值,其可根据具体实施方式所寻求获得的期望特性而变化。在一些实施方式中,数值参数应当根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管阐述本发明的一些实施方式的宽范围的数值范围和参数是近似值,但是在特定实施例中尽可能精确地报道了所阐述的数值。在本发明的一些实施方式中呈现的数值可能包含一些误差,该误差必然地由它们各自的测试测量中发现的标准偏差产生。
在一些实施方式中,在描述本发明特定实施方式的上下文中(尤其是在如下的一些权利要求的上下文中)使用的术语“一”、“一个”、“所述/该”和类似的提法可被解释为涵盖单数和复数。本文列举的值的范围仅意在用作单独提及的落在该范围内的各单独值的速记方法。除非本文另外指明,否则每个单独的值均被并入本说明书,就像在本文中单独列举一样。除非本文另外指明或上下文明显冲突,否则本文所述的所有方法可以按任何合适的顺序实施。关于本文的一些实施方式提供的任何和所有实例或示例性语言(例如,“诸如”)的使用仅意在更好地阐明本发明,并不对本发明另外保护的范围造成限制。本说明书中的语言不应解释为是表示实践本发明所必需的任何未请求保护的要素。
本文所公开的本发明的替代性要素或实施方式的分组不应解释为限制。各组成员可单独或者与本文出现的该组的其它成员或其它要素任意组合而被提及和请求保护。出于方便和/或可专利性的原因,组的一个或多个成员可被包含在组中或从组中删除。当任何此类包含或删除发生时,认为本文的说明书包含经修饰的组,从而实现所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
本文对这一发明的优选实施方式进行了描述,包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在本领域的普通技术人员阅读上述说明时,这些优选实施方式的变型将变得显而易见。在考虑之列的是,技术人员可在适当时采用此类变型,并且本发明可按本文具体描述之外的方式加以实践。因此,如可适用的法律所允许的,这一发明的许多实施方式包括所附权利要求书中列出的主题的所有修改物和等同物。此外,除非在本文中另外指明,或除非与上下文明显冲突,本发明涵盖上述要素在其所有可能的变型中的任何组合。
此外,在贯穿这一说明书中对专利和印刷出版物进行了许多参考。以引用的方式将上述引用的参考文献和印刷出版物中的各自以其整体并入本文。
最后,将理解的是,本文所公开的发明的实施方式是对本发明的原理的说明。可采用的其它修改形式可在本发明的范围内。因此,举例来说,而非加以限制,本发明的实施方式的替代构造可根据本文的教导而使用。因此,本发明的实施方式不限于如精确地示出和描述的内容。
序列表
<110> 布里格姆及妇女医院股份有限公司(THE BRIGHAM AND WOMEN'S HOSPITAL,INC.)
<120> 上胚层球状体向肾脏类器官的三维分化模拟阶段特异性上皮生理、
形态发生和疾病
<130> 043214-085701
<150> 62/213,740
<151> 2015-09-03
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PODXL
<400> 1
gctacacctt cacaagcccg ggg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Exon 1 PKD2 Exon1
<400> 2
gcgtggagcc gcgataaccc cgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKD1 Exon 36
<400> 3
gtgggtgcga gcttcccccc ggg 23
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PODXL WT
<400> 4
tccctggcta caccttcaca agcccgggga tgaccaccac cct 43
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PODXL A1
<400> 5
tccctggcta caccttcaca agccccgggg atgaccacca ccc 43
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PODXL A1
<400> 6
tccctggcta caccttcaca agccggatga ccaccaccc 39
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKD1 WT
<400> 7
tgtgccccgc gtacggccac c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKD1 Al
<400> 8
tgtgccccgg tacggccacc c 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKD1 A2
<400> 9
tgtgccccgc cgtacggcca c 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKD2 WT
<400> 10
gccgcgataa ccccggcttc g 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKD2 Al
<400> 11
gccgcgataa ccccggcttc a 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKD2 A2
<400> 12
gccgcgatac cccggcttcg a 21
Claims (28)
1.一种产生人类类器官的方法,所述方法包括:
提供一批量的人多能干细胞(hPSC);
在培养用培养基中对所述hPSC进行培养以形成上胚层球状体;以及
在分化培养基中使上胚层球状体分化,其中,所述分化培养基包含能够将所述上胚层球状体分化成类器官的一种或多种试剂。
2.如权利要求1所述的方法,其中,在形成上胚层球状体之前在不存在白血病抑制因子(LIF)和多西环素的情况下,对所述hPSC进行培养。
3.如权利要求1所述的方法,其中,在形成上胚层球状体之前在存在Y27632的情况下,对所述hPSC进行培养。
4.如权利要求1所述的方法,其中,所述培养用培养基包含基质胶。
5.如权利要求4所述的方法,其中,所述培养用培养基包含胶原蛋白I。
6.如权利要求4所述的方法,其中,对所述hPSC进行培养包括在表面上沉积第一层培养用培养基,将所述hPSC置于所述沉积的培养用培养基上,并且在所述hPSC上添加第二层培养基。
7.如权利要求1所述的方法,其中,在培养用培养基中对所述hPSC培养包括约1天、2天或更多天。
8.如权利要求1所述的方法,其中,所述一种或多种试剂包括CHIR99021。
9.如权利要求1所述的方法,其中,所述一种或多种试剂包括B27。
10.如权利要求1所述的方法,其中,使所述上胚层球状体分化包括约7天、8天、9天、10天、11天、12天或13天或更多天。
11.如权利要求1所述的方法,其中,所述上胚层球状体表达足细胞标记蛋白(PODXL)、紧密连接蛋白(ZO-1)和β-连环蛋白中的一种或多种。
12.如权利要求1所述的方法,其中,所述上胚层球状体是腔化的。
13.如权利要求1所述的方法,其中,所述类器官是管状的。
14.如权利要求1所述的方法,其中,所述类器官是肾脏类器官。
15.如权利要求1所述的方法,其中,所述类器官表达足细胞标记蛋白(PODXL)、紧密连接蛋白(ZO-1)和翅荚百脉根凝集素(LTL)中的一种或多种。
16.通过权利要求1所述的方法制备的一批量的类器官。
17.一种生成管状类器官的方法,所述方法包括:
提供一批量的上胚层球状体;以及
在分化培养基中使所述上胚层球状体分化,其中,所述分化培养基包含能够将所述上胚层球状体分化成类器官的一种或多种试剂。
18.如权利要求17所述的方法,其中,所述一种或多种试剂包括CHIR99021。
19.如权利要求17所述的方法,其中,所述一种或多种试剂包括B27。
20.如权利要求17所述的方法,其中,所述管状类器官是肾脏类器官。
21.如权利要求20所述的方法,其中,所述肾脏类器官表达足细胞标记蛋白(PODXL)、紧密连接蛋白(ZO-1)和翅荚百脉根凝集素(LTL)中的一种或多种。
22.如权利要求20所述的方法,其中,将所述上胚层球状体分化成肾脏类器官包括在包含RPMI和B27的第二分化培养基中进一步培养。
23.如权利要求20所述的方法,其中,将所述上胚层球状体分化成肾脏类器官包括:
在包含CHIR99021、RPMI和B27的第二分化培养基中进一步培养约24小时;
用包含CHIR99021、RPMI、B27和胰岛素的第三分化培养基替代所述第二分化培养基并另外培养约48小时;
加入IWP2并继续培养约48小时;以及
另外用所述第二分化培养基替代所述第三分化培养基。
24.一种筛选对管状类器官起作用的化合物的方法,所述方法包括:
提供一批量的管状类器官;
向所述管状类器官添加一种或多种化合物;
确定所述管状类器官的表型或活性的改变;以及
将所述改变与所述化合物对管状类器官的作用相关联,从而筛选对管状类器官起作用的一种或多种化合物。
25.如权利要求24所述的方法,其中,确定表型或活性的改变包括检测所述管状类器官中的一种或多种标志物。
26.如权利要求25所述的方法,其中,所述一种或多种标志物包括肾损伤分子(KIM-1)。
27.如权利要求26所述的方法,其中,KIM-1表达的增高与所述化合物的毒性作用相关。
28.如权利要求24所述的方法,其中,所述管状类器官是肾脏类器官。
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