CN101652389A - 抗robo4抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抗Robo4抗体，及包含这些抗体的组合物和使用这些抗体的方法，包括诊断和治疗方法。

Description

抗ROBO4抗体及其用途
相关申请
本申请要求2007年2月9日提交的美国临时专利申请No.60/889,214和2007年2月23日提交的美国临时专利申请No.60/891,475的权益，在此通过述及将其公开内容完整收入本文用于所有目的。
发明领域
一般而言，本发明涉及血管发生，及内皮细胞增殖和迁移的领域。更具体的说，本发明关注Robo4的调控剂，及此类调控剂的用途。
发明背景
Roundabout受体家族是应答与Slit蛋白的相互作用而调节轴突导向、神经元迁移和白细胞趋化性的分子指导分子(Suchting等，FASEB J.19：121-123(2005))。Roundabout受体分子在它们的胞外区中含有五个免疫球蛋白和三个纤连蛋白结构域。Magic Roundabout(即，Robo4或内皮细胞特异性分子4(ESCSM4))在结构上与其它Roundabout家族成员不同。人的MagicRoundabout(Robo4)包含两个免疫球蛋白和主要组织相容性复合物结构域(氨基酸46-116和151-209)、两个纤连蛋白III型结构域(氨基酸252-335和347-432)、跨膜区(468-490)、和富含脯氨酸区(氨基酸715-772)(参见Huminiecki等，Genomics 79(4)：547-552(2002)，及其中的图1)。小鼠和人的Robo4显示出75％核苷酸序列同一性(Huminiecki等，见上文(2002)).
Robo4表达分析指出了Robo4表达是高度受局限的，在胎盘和肿瘤中有强表达，包括脑、膀胱、和结肠肿瘤转移至肝，其中肿瘤表达局限于肿瘤脉管***(Huminiecki等，见上文(2002))。另外，Robo4表达与活跃血管发生位点有关，但是在神经元组织中没有检测到(Huminiecki，L.等，见上文(2002))。
作为有胞外结构域的膜结合受体，Robo4对于为了在血管发生期间抑制血管内皮细胞增殖而投递细胞毒性疗法而言是有用的靶物。Robo4对于投递可检测标志物至正在增殖的血管内皮细胞而言也是有用的靶物。靶向Robo4(也称作ECSM4)的抗体偶联物也已经被报道为潜在的治疗用化合物(在所述偶联物包含细胞毒素的情况中)和潜在的诊断用标志物(在所述偶联物包含可检测标记物的情况中)(参见，例如，WO 2002036771)。
抗体-药物偶联物在癌症治疗中用于局部投递细胞毒性或细胞抑制性药剂(即，杀死或抑制肿瘤细胞的药物)的用途(Syrigos和Epenetos，AnticancerRes.19：605-614(1999)；Niculescu-Duvaz和Springer，Adv.Drg Del.Rev.26：151-172(1997)；美国专利No.4,975,278)容许靶向投递药物模块至肿瘤，及药物的胞内积累。
已经或正在开发许多靶向其它分子的抗体-药物偶联物。例如，
Figure A20088001151400061
(ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec)是由通过硫脲接头-螯合剂相结合的针对正常和恶性B淋巴细胞表面上找到的CD20抗原的鼠IgG1 κ单克隆抗体与111In或90Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman等，Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77(2000)；Wiseman等，Blood99(12)：4336-42(2002)；Witzig等，J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63(2002)；Witzig等，J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69(2002))。虽然ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的活性，但是药物施用在大多数患者中导致严重且延长时间的血球减少。由huCD33抗体连接至加利车霉素构成的MYLOTARGTM(gemtuzumab ozogamicin，Wyeth Pharmaceuticals)在2000年被批准用于通过注射来治疗急性髓细胞性白血病(Drugs of the Future(2000)25(7)：686；美国专利No.4,970,198；5,079,233；5,585,089；5,606,040；5,693,762；5,739,116；5,767,285；5,773,001)。由huC242抗体经二硫化物接头SPP连接至美登木素生物碱药物模块DM1而构成的Cantuzumab mertansine(Immunogen，Inc.)正在开发用于表达CanAg抗原的癌症的治疗，所述癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌、和其它癌症。由抗***特异性膜抗原(PSMA)单克隆抗体连接至美登木素生物碱药物模块DM1而构成的MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologics，Immunogen Inc.)正在开发用于***肿瘤的潜在治疗。通过非二硫化物的、不可切割的接头SMCC将相同的美登木素生物碱药物模块DM1连接至小鼠的鼠单克隆抗体TA.1(Chari等，Cancer Res.52：127-131(1992))。此偶联物的效力据报道比相应的二硫化物接头偶联物低200倍。
已经将多拉司他汀的合成类似物，auristatin肽，即auristain E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)，偶联至：(i)cBR96，一种对癌瘤上的Lewis Y特异性的嵌合单克隆抗体；(ii)cAC10，其是对血液学恶性肿瘤上的CD30特异性的(Klussman等，Bioconjugate Chemistry 15(4)：765-773(2004)；Doronina等，Nature Biotech.21(7)：778-784(2003)；Francisco等，Blood 102(4)：1458-1465(2003)；美国专利公开文本No.2004/0018194)；(iii)抗CD20抗体，诸如
Figure A20088001151400071
(rituximab)(WO 04/032828)，用于治疗表达CD20的癌症和免疫病症；(iv)抗EphB2抗体2H9和抗IL-8，用于治疗结肠直肠癌(Mao等，Cancer Res.64(3)：781-788(2004))；(v)E-选择蛋白抗体(Bhaskar等，Cancer Res.63：6387-6394(2003))；和(vi)其它抗CD30抗体(WO 03/043583)。还已经将单甲基auristatin(MMAE)偶联至2H9，一种针对EphB2R的抗体，EphB2R是1型TM酪氨酸激酶受体，在小鼠与人类之间有密切同源性，而且在结肠直肠癌细胞中过表达(Mao等，Cancer Res.64：781-788(2004))。
单甲基auristatin MMAF(即在C末端具有苯丙氨酸的auristatin E(MMAE)变体(美国专利No.5,767,237和6,124,431))的效力据报道比MMAE低，但是在偶联至单克隆抗体时更有效力(Senter等，Proceedings of the AmericanAssociation for Cancer Research，卷45，摘要号623，呈现于2004年3月28日)。经苯二胺间隔物通过1F6的C末端将Auristatin F苯二胺(AFP)(即MMAE的苯丙氨酸变体)连接至抗CD70单抗1F6(Law等，Proceedings of the AmericanAssociation for Cancer Research，卷45，摘要号625，呈现于2004年3月28日)。
本领域存在对别的药物的需要，所述药物用来治疗与血管发生有关的疾病和病症，包括例如与依赖于内皮起源的脉管***的生长和增殖的癌症有关的异常血管发生。本领域还存在对别的靶向内皮细胞的抗Robo4抗体-药物偶联物的需要，所述偶联物用于对例如由血管过度增殖支持的或引起的癌症或眼病症中血管生长和增殖的检测和显像，以及用于对其它疾病或其它生理学状态(在该生理学状态中，监测血管生长在理解或治疗该生理学状态方面是有用的)中血管生长和增殖的检测和显像。本发明满足了这些和其它需要。
发明概述
本发明提供了特异性结合Robo4(包括例如灵长类和/或啮齿类Robo4，诸如人和/或小鼠Robo4)的抗体及使用此类抗体的诊断和治疗方法。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，所述抗体选自下组：完整抗体、抗体变体、和抗体衍生物、Fab、Fab′、(Fab′)2、和Fv。在一个实施方案中，本发明提供了对人Robo4和任选对鼠Robo4具有亲和力和特异性的抗Robo4抗体，该抗体包含如图1A、1B、2A、和2B(SEQ ID NO：1-8，17-71)中所描绘的轻链和重链可变域(区)序列的高变区(HVR)，或由其组成，或基本上由其组成。在另一个实施方案中，本发明提供了对人Robo4和任选对鼠Robo4具有亲和力和特异性的抗Robo4抗体，该抗体包含如图1A、1B、2A、2B、3A、3B、4A、和4B(SEQ ID NO：9-16，SEQ ID NO：12，其中V被M替换，和SEQ ID NO：99-139)中所描绘的轻链和重链可变域(区)序列的框架区(FR)，或由其组成，或基本上由其组成。在另一个实施方案中，本发明提供了对人Robo4和任选对鼠Robo4具有亲和力和特异性的抗Robo4抗体，该抗体包含如图1A和1B(SEQ ID NO：72-97)及图2A和2B(SEQ ID NO：140-165)中所描绘的轻链和重链可变域(区)序列，或由其组成，或基本上由其组成。
在一个实施方案中，本发明提供了抗Robo4抗体，其包含：至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下组的高变区(HVR)序列：
(i)包含序列A1-A11的HVR-L1，其中A1-A11为RASQDVSTAVA(SEQ IDNO：1)
(ii)包含序列B 1-B7的HVR-L2，其中B1-B7为SASFLYS(SEQ ID NO：2)
(iii)包含序列C1-C9的HVR-L3，其中C1-C9为QQSYTTPPT(SEQ ID NO：3)
(iv)包含序列D1-D10的HVR-H1，其中D1-D10为GFTINGYYIH(SEQ IDNO：17)
(v)包含序列E1-E18的HVR-H2，其中E1-E18为GFIYPAGGDTDYADSVKG(SEQ ID NO：18)；
(vi)包含序列F1-F17的HVR-H3，其中F1-F17为ARLIGNKFGWSSYGMDY(SEQ ID NO：19)；和
(vii)至少一种变体HVR，其中所述变体HVR在SEQ ID NO：1，2，3，17，18或19中所描绘的序列中包含至少一个氨基酸残基的***、删除、或替代。
在另一个实施方案中，本发明提供了抗Robo4抗体，其包含：至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的高变区(HVR)序列：
(i)包含序列A1-A11的HVR-L1，其中A1-A11为RASQDVSTAVA(SEQ IDNO：1)
(ii)包含序列B1-B7的HVR-L2，其中B1-B7为SASFLYS(SEQ ID NO：2)
(iii)包含序列C1-C9的HVR-L3，其中C1-C9为QQSYTTPPT(SEQ ID NO：3)
(iv)包含序列D1-D10的HVR-H1，其中D1-D10为GFTISGSWIH(SEQ IDNO：4)
(v)包含序列E1-E18的HVR-H2，其中E1-E18为AVITPAGGYTYYADSVKG(SEQ ID NO：5)和
(vi)包含序列F1-F16的HVR-H3，其中F1-F16为SNRYSGQFVPAYAMDY(SEQ ID NO：6)。
在一个实施方案中，本发明抗体的HVR-L1包含SEQ ID NO：1的序列。在一个实施方案中，本发明抗体的HVR-L2包含SEQ ID NO：2的序列。在一个实施方案中，本发明抗体的HVR-L3包含SEQ ID NO：3的序列。在一个实施方案中，本发明抗体的HVR-H1包含SEQ ID NO：4的序列。在一个实施方案中，本发明抗体的HVR-H2包含SEQ ID NO：5的序列。在一个实施方案中，本发明抗体的HVR-H3包含SEQ ID NO：6的序列。在一个实施方案中，HVR-L1包含RASQSISSYLA(SEQ ID NO：7)或RASQDGARSLA(SEQ ID NO：39)或RASQDGAIYLA(SEQ ID NO：40)。在一个实施方案中，HVR-L2包含GASSRAS(SEQ ID NO：8)或SASFLAS(SEQ ID NO：41)或SASLES(SEQ IDNO：42)或SATLAS(SEQ ID NO：43)或SASFLAS(SEQ ID NO：44)或SASNLAS(SEQ ID NO：45)或SASTLAS(SEQ ID NO：46)。在一个实施方案中，包含这些序列(以如本文中所描述的组合)的本发明抗体是人源化抗体或人抗体。
一方面，本发明提供了包含一种、两种、三种、四种、五种或六种HVR的抗体，其中每种HVR包含选自下组的序列，或由其组成，或基本上由其组成：SEQ ID NO：1，2，3，4，5，6，7，和8，且其中SEQ ID NO：1或7对应于HVR-L1，SEQ ID NO：2或8对应于HVR-L2，SEQ ID NO：3对应于HVR-L3，SEQ ID NO：4对应于HVR-H1，SEQ ID NO：5对应于HVR-H2，而SEQ ID NO：6对应于HVR-H3。在一个实施方案中，本发明的抗体包含：包含SEQ ID NO：7的HVR-L1，包含SEQ ID NO：2的HVR-L2，包含SEQ ID NO：3的HVR-L3，包含SEQ ID NO：4的HVR-H1，包含SEQ ID NO：5的HVR-H2，和包含SEQ IDNO：6的HVR-H3。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含：包含SEQ IDNO：1的HVR-L1，包含SEQ ID NO：8的HVR-L2，包含SEQ ID NO：3的HVR-L3，包含SEQ ID NO：4的HVR-H1，包含SEQ ID NO：5的HVR-H2，和包含SEQ IDNO：6的HVR-H3。在一个实施方案中，本发明的抗体包含：包含SEQ ID NO：1的HVR-L1，包含SEQ ID NO：2的HVR-L2，包含SEQ ID NO：3的HVR-L3，包含SEQ ID NO：4的HVR-H1，包含SEQ ID NO：5的HVR-H2，和包含SEQ IDNO：6的HVR-H3。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含：包含SEQ IDNO：1的HVR-L1，包含SEQ ID NO：2的HVR-L2，包含SEQ ID NO：20的HVR-L3，包含SEQ ID NO：17的HVR-H1，包含SEQ ID NO：18的HVR-H2，和包含SEQ ID NO：19的HVR-H3。
本发明抗体中的变体HVR可以在HVR内具有一个或多个残基的修饰。在一个实施方案中，HVR-L1变体包含SEQ ID NO：1，其中A1-11以如下位置的任意组合包含1-6(1，2，3，4，5或6)处替代：A5(S)，A6(I或G)，A7(A)，A8(S，R或I)，A9(Y或S)，和A10(L)。在一个实施方案中，HVR-L2变体包含SEQ IDNO：2，其中B1-7以如下位置的任意组合包含1-6(1，2，3，4，5或6)处替代：B1(G)，B3(T)，B4(S，L，N或T)，B5(R，E或A)，B6(A或S)，和B7(Y)。在一个实施方案中，HVR-L3变体包含SEQ ID NO：3，其中C1-9以如下位置的任意组合包含1-6(1，2，3，4，5或6)处替代：C3(Y，P，T，F或G)，C4(W，F，R或N)，C5(S，N，A，D，F，H，V或G)，C6(Y，S，A，D，N，L，I，M，Y或G)，C7(L，H或T)，和C8(L，F，A，M或S)。在一个实施方案中，HVR-H1变体包含SEQ ID NO：4，其中D1-10以如下位置的任意组合包含1-9(1，2，3，4，5，6，7，8或9)处替代：D2(Y)，D3(S)，D4(F或L)，D5(N，T，Y，D或K)，D6(N或S)，D7(Y，N或R)，D8(Y或A)，D9(M，F，L或N)，和D10(S，E或Q)。在一个实施方案中，HVR-H2变体包含SEQID NO：5，其中E1-18以如下位置的任意组合包含1-10(1，2，3，4，5，6，7，8，9或10)处替代：E1(G或S)，E2(F，G，I，T或R)，E4(Y或S)，E5(G或S)，E6(T，Y或M)，E7(D或L)，E8(S)，E9(D，S，T，H，K，A或V)，E10(I)，和E11(D，N，A，E或I)。在一个实施方案中，HVR-H3变体包含SEQ ID NO：6，其中F1-18以如下位置的任意组合包含1-17(1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16或17)处替代：F2(S)，F3(L，G，D，M或W)，F4(I，G，V或S)，F5(G，Y或N)，F6(N，S或V)，F7(K，Y，W或M)，F8(F，S，P或删除)，F9(G，A，S，Y或删除)，F10(W，R，P，E，G或删除)，F11(S，W，G，H或删除)，F12(S，W，H或删除)，F13(Y，D，G，V或删除)，F14(G或删除)，F15(V或删除)，F16(L或F)，F17(a)，和F18(V)。每个位置后面的括号中的字母指出了例示性的替代(即，置换)氨基酸，或者(在指出的位置处)氨基酸删除。在一个实施方案中，HVR-L1包含SEQ ID NO：1的序列；HVR-L2包含SEQ ID NO：2；HVR-L3变体包含SEQ ID NO：3，其中C4，C5，C6，和C6分别是R，S，D，和H；HVR-H1包含SEQ ID NO：17；HVR-H2包含SEQ ID NO：18；而HVR-H3包含SEQ ID NO：19或包含SEQ ID NO：19的HVR-H3变体。在这些抗体的一个实施方案中，这些抗体进一步包含人κI轻链框架共有序列。在一个实施方案中，轻链(LC-FR4)(Kabat编号方式)的框架区4中的第104位是V。在一个实施方案中，LC-FR4的第104位是M。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H1SEQ ID NO：4，编号D1-D10，其中1-6处替代选自以下：D2(Y)，D3(S)，D4(F或L)，D5(S，T，Y，D或K)，D6(N或S)，D7(S，N或R)，D8(W或A)，D9(M，F，L或N)，和D10(S，E或Q)。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H1，其包含SEQ ID NO：24，25，26，27或28。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H2 SEQID NO：5，编号E1-E18，其中1-7处替代选自以下：E1(A或S)，E2(V，G，I，T或R)，E4(T或S)，E5(G或S)，E6(T，Y或M)，E7(D或L)，E8(S)，E9(Y，S，T，H，K，A或V)，E10(I)，和E11(Y，N，A，E或I)。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H2，其包含SEQ ID NO：29，30，31，32或33。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6，编号F1-F16，其中1-15处替代选自以下：F1(S，G，D，M或W)，F2(N，G，V或S)，F3(R，Y或N)，F4(Y，S或V)，F5(S，Y，W或M)，F6(G，S，P或删除)，F7(Q，A，S，Y或删除)，F8(F，R，P，E，G或删除)，F9(V，W，G，H或删除)，F10(P，W，H或删除)，F11(A，D，G，V或删除)，F12(Y或删除)，F13(A或V)，F14(L或F)，和F15(V)。依照本发明，给定序列中的氨基酸替代可涵盖氨基酸删除。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H3，其包含SEQ ID NO：34，35，36，37或38。在这些抗体的一个实施方案中，框架共有序列在第71，73和/或78位处包含替代。在这些抗体的一些实施方案中，第71位是A，第73位是T，和/或第78位是A。在这些抗体的一个实施方案中，这些抗体进一步包含人亚组III重链框架共有序列。
一方面，本发明提供了抗Robo4抗体，其包含图1、2、3，和(SEQ ID NO：1-8，17-71)中所描绘的一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种HVR序列。
在一个实施方案中，本发明提供了人源化抗Robo4抗体。本发明的人源化抗Robo4抗体在其重链和/或轻链可变域(区)中可包含一种或多种人和/或人共有非高变区(例如框架)序列。在一些实施方案中，人和/或人共有非高变区序列内存在一处或多处别的修饰。在一个实施方案中，本发明抗体的重链可变域(区)包含人共有框架序列，其在一个实施方案中是亚组III共有框架序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含在至少一个氨基酸位置处被修饰的变体亚组III共有框架序列。例如，在一个实施方案中，变体亚组III共有框架序列在第71，73和/或78位中一或多处可包含替代。在一个实施方案中，所述替代是任意组合的R71A、N73T和/或N78A和/或L/78A。在一个实施方案中，本发明抗体的轻链可变域(区)包含人共有框架序列，其在一个实施方案中是亚组κI共有框架序列。在一个实施方案中，轻链共有框架序列在一个或多个位置处被修饰。在一个实施方案中，轻链共有序列在第104位处具有氨基酸V。在一个实施方案中，轻链共有序列在依照Kabat编号***的第104位处被修饰，其中第104位是M。
一方面，本发明提供了抗体，其包含1-4种或所有轻链FR序列LC-FR1(SEQ ID NO：9)、LC-FR2(SEQ ID NO：10)、LC-FR3(SEQ ID NO：11)、和LC-FR4(SEQ ID NO：12)。在一个实施方案中，LC-FR4(SEQ ID NO：12)是变体，其中第104位是M。
一方面，本发明提供了抗体，其包含1-4种或所有重链FR序列HC-FR1(SEQ ID NO：13)、HC-FR2(SEQ ID NO：14)、HC-FR3(SEQ ID NO：15)、和HC-FR4(SEQ ID NO：16)。
在一个实施方案中，本发明提供了在宿主受试者中使用的治疗剂，在所述受试者中引发很少的或不引发针对该药剂的免疫原性应答。例如，在一个实施方案中，本发明提供了与针对人Robo4的鼠抗体相比在宿主受试者中以显著降低的水平引发和/或预期引发人抗小鼠抗体应答(HAMA)的人源化抗体。在另一个例子中，本发明提供了引发和/或预期引发最低程度的或不引发人抗小鼠抗体应答(HAMA)的人源化抗体。在一个例子中，本发明的抗体引发处于或低于临床可接受水平的抗小鼠抗体应答。
本发明还提供了如本文中下文所描述的在杂合高变位置中包含修饰的抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体包含在一个或多个杂合高变位置处有修饰的变体人亚组共有框架序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域(区)，该重链可变域(区)包含在第26-35，49-65，95-102，和94位中的一或多处有修饰的变体人亚组III共有框架序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域(区)，该轻链可变域(区)包含在第24-34，50-56，和39-97位中的一或多处有修饰的变体人κ亚组I共有框架序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含人κ轻链的框架序列的至少一部分(或全部)。在一个实施方案中，本发明的抗体包含人κ亚组I框架共有序列的至少一部分(或全部)。在一个实施方案中，本发明的抗体包含如图3A和3B中所显示的框架序列。
本发明的抗体可包含任何合适的人或人共有重链框架序列，倘若该抗体展现出期望的生物学特征(例如，期望的结合亲和力)的话。在一个实施方案中，本发明的抗体包含人亚组III重链的框架序列的至少一部分(或全部)。在一个实施方案中，本发明的抗体包含如图4A和4B中所显示的框架序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链和/或轻链可变域(区)，该重链和/或轻链可变域(区)包含SEQ ID NO：72-137(图1A，1B，2A，2B，3A，3B，4A和4B)中所描绘的框架序列。
一方面，本发明的抗体是结合人Robo4血管内皮细胞标志物的人源化抗Robo4抗体。例如，在一个实施方案中，本发明的抗体以小于1000nM、小于500nM、小于200nM、小于100nM、小于50nM、小于30nM、小于20nM小于10nM、小于5nM、小于3nM、小于1nM、小于0.1nM或小于0.01nM的IC50值结合人Robo4。抑制配体结合其受体的能力的比较可依照本领域已知的多种方法来实施，包括如下文实施例中所描述的。
一方面，本发明的抗体是偶联至细胞毒性模块的抗Robo4抗体(抗Robo4抗体药物偶联物，也称作抗Robo4 ADC)，其中所述抗Robo4 ADC在表达Robo4的细胞中抑制Robo4依赖性细胞增殖。表达Robo4的细胞包括但不限于内皮细胞，诸如血管内皮细胞。本文中公开了例示性的抗Robo4 ADC。在一个实施方案中，抗Robo4抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗Robo4抗体是人抗体。在一个实施方案中，抗Robo4抗体衍生自噬菌体展示诱变和选择。
一方面，本发明的抗体是比未偶联至细胞毒剂的参比抗Robo4抗体更好地抑制Robo4依赖性细胞增殖的抗Robo4抗体ADC。例如，在一个实施方案中，本发明的抗Robo4ADC抗体以小于未偶联至细胞毒剂的参比抗Robo4抗体的大约一半的IC50值抑制细胞增殖。在一个实施方案中，本发明的ADC抗体的IC50值是非ADC参比抗体的大约0.001、0.01、0.1、0.2、0.3或0.4。抑制细胞增殖的能力的比较可依照本领域已知的多种方法来实施，包括如下文实施例中所描述的。在一个实施方案中，IC50值是在大约0.01nM至大约100nM的抗体浓度范围间测定的。
在一个实施方案中，人源化抗体和嵌合抗体都是单价的。在一个实施方案中，人源化抗体和嵌合抗体都包含连接至Fc区的单一Fab区。在一个实施方案中，参比嵌合抗体包含连接至人Fc区的、图7(SEQ ID NO：9和10)中所描绘的序列的可变域(区)序列。在一个实施方案中，人Fc区是IgG(例如IgG1，2，3或4)的Fc区。
一方面，本发明的抗体包含Fc区。在一个实施方案中，Fc区是IgG1，2，3或4的Fc区。在一个实施方案中，IgG是天然IgG。在一个实施方案中，所述Fc区，相对于天然IgG1，2，3或4野生型抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性，展现出增强的ADCC。在一个实施方案中，IgG是自天然IgG改变的Fc区，使得改变的Fc区展现出相对于天然Fc区增强的ADCC活性。
一方面，本发明的抗体是偶联至可检测模块(诸如成像剂)的抗Robo4抗体。一方面，本发明的抗体可偶联有任何能通过反应性模块、活化的模块或反应性半胱氨酸硫醇基团偶联附着至抗体的标记物模块(Singh等，Anal.Biochem.304：147-15(2002)；Harlow E.和Lane，D.(1999)Using Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Lundblad R.L.(1991)Chemical Reagents for Protein Modification，第2版CRC Press，Boca Raton，FL)。所附着的标记物可发挥以下功能：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记物相互作用以调控由第一或第二标记物提供的可检测信号，例如用以给出FRET(荧光共振能量转移)；(iii)稳定与抗原或配体的相互作用或提高与抗原或配体的结合亲和力；(iv)通过电荷、疏水性、形状或其它物理参数来影响迁移率，例如电泳迁移率(泳动率)或细胞渗透率，或(v)提供捕捉模块，用以调控配体亲和力、抗体/抗原结合或离子络合。本文中进一步公开了经过标记的本发明抗体。
在一个实施方案中，可检测标记物是在体外或在体内可检测的水不溶性微粒。在一个实施方案中，所述微粒是磁性的或金属的微粒。金属微粒是通过诸如磁共振成像(MRI)、单微粒或单分子示踪、免疫细胞化学、具有暗场发光的等离振子频率(plasmon frequency with dark-field illumination)、微分干扰差和视频增强(differential interference contrast and video enhancement)、全反射(total internal reflection)、和光热干扰差(photothermal interference contrast，PIC)技术的方法可检测的(参见例如PNAS USA 100(20)：11350-11355(2003)；Sheetz等，Nature 340：284-288(1989)；Baschong等，Histochemistry 83：409-411(1985)；Slot和Geuze，Eur.J.Cell Biol.38：87-93(1935)；Frey和Frey，J.Struct.Biol.127：94-100(1999)；Hainfeld和Powell，J.Histochem.Cytochem.48：471-480(2000)；Schultz等，PNAS USA 97：996-1001(2000)；Gelles等，Nature331：450-453(1988)；Sonnichsen等，Appl.Phys.Lett.77：2949-2951(2000)；Boyer等，Science 297：1160-1163(2002))。本发明的纳米微粒剂也可包括但不限于微泡(microbubble)(参见Ellegala等，Circulation 108：336-341(2003))(也称作声学活性脂球体(acoustically active liposphere，AAL))(参见Tartis等，Ultrasound Med.Biol.32(11)：1771-80(2006))、超顺磁剂、脂质体、全氟化碳纳米微粒乳剂(WO 2005104051)、和树状聚体(dendrimer)(参见Caruthers等，Methods in Molecular Medicine，124：387-400(2006)及其中引用的参考文献，在此通过述及将所有参考文献完整收入本文)。
一方面，本发明提供了包含重链可变域(区)的抗体，该重链可变域(区)包含图1B和2B中所描绘的HVR-H1、HVR-H2和/或HVR-H3序列。在一个实施方案中，该可变域(区)包含图1B、2B、4A和4B中所描绘的HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3和/或HC-FR4序列。在一个实施方案中，该抗体包含CH1和/或Fc序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域(区)，该重链可变域(区)包含图1B、2B、4A、和4B中所描绘的HVR-H1、HVR-H2和/或HVR-H3序列，及HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3和/或HC-FR4序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域(区)，该重链可变域(区)包含图1B、2B、4A和4B中所描绘的HVR1-HC、HVR2-HC和/或HVR3-HC序列，及CH1和/或Fc序列。
一方面，本发明提供了包含轻链可变域(区)的抗体，该轻链可变域(区)包含图1A或2A中所描绘的HVR1-LC、HVR2-LC和/或HVR3-LC序列。在一个实施方案中，该可变域(区)包含图3A和3B中所描绘的FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC和/或FR4-LC序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含如前两段中所描述的轻链和重链可变域(区)。在一个实施方案中，该抗体是单价的且包含Fc区。在一个实施方案中，该Fc区包含至少一个突起(结)和至少一个空腔(穴)，其中突起和空穴的存在增强包含突起的Fc多肽与包含空穴的Fc多肽之间复合物的形成，例如如WO 2005/063816中所记载的。在一个实施方案中，本发明抗体的Fc区包含第一和第二Fc多肽，其中所述第一和第二多肽各自相对于野生型人Fc包含一处或多处突变。在一个实施方案中，空腔突变是T366S、L368A和/或Y407V。在一个实施方案中，突起突变是T366W。在一个实施方案中，第一多肽包含图13中所描绘的Fc序列，而第二多肽包含图14中所描绘的Fc序列。
在一个实施方案中，本发明提供了通过给受试者例如哺乳动物受试者，诸如人施用抗Robo4抗体来调控Robo4相关效应(例如Robo4活化、下游分子信号传导(例如丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)磷酸化)、细胞增殖、细胞迁移、细胞存活、细胞形态发生和血管发生)的一个或多个方面的方法。在一些实施方案中，抗Robo4抗体破坏配体结合至Robo4(例如通过结合至Robo4胞外结构域内的序列，并由此抑制所述被结合的结构域与其结合配偶(诸如配体分子)相互作用)。在其它实施方案中，Robo4抗体结合至不在Robo4配体结合位点内的序列，其中所述结合导致对Robo4与其结合配偶相互作用的能力的破坏。
在本发明的一个实施方案中，抗体对Robo4的结合抑制Robo4相关内皮细胞增殖。在本发明Robo4抗体的另一个实施方案中，抗体对细胞中Robo4的结合抑制该细胞的增殖、存活、发散(scattering)、形态发生和/或活动性。在另一个实施方案中，所述细胞是内皮细胞，诸如但不限于血管内皮细胞。
在一个实施方案中，本发明的Robo4抗体特异性结合图5(SEQ IDNO：138)中所显示的Robo4的至少一部分或其变体。在一个实施方案中，本发明的抗体特异性结合至缺少前导序列(即缺少图5中由虚线下划线所标示的区域)的全长Robo4氨基酸序列之内。在一个实施方案中，本发明的抗体特异性结合图5中所显示的胞外结构域序列(图5中由实线下划线标示的)。在一个实施方案中，本发明的抗体特异性结合由部分或整个Robo4胞外结构域形成的构象表位。在一个实施方案中，本发明的抗体特异性结合与图5(SEQID NO：138)中所显示的序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％序列同一性或相似性的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的抗体特异性与缺少前导序列(即缺少图5中由虚线下划线所标示的区域)的Robo4全长氨基酸序列的序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％序列同一性或相似性的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的抗体特异性结合与Robo4胞外结构域(图5中由实线下划线标示的区域)的序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％序列同一性或相似性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体特异性结合第一动物物种的Robo4，且不特异性结合第二动物物种的Robo4。在一个实施方案中，第一动物物种是人和/或灵长类(例如猕猴)，而第二动物物种是大鼠(ratus，e.g.，rat)、小鼠(murine，e.g.，mouse)和/或犬科动物。在一个实施方案中，第一动物物种是人。在一个实施方案中，第一动物物种是灵长类，例如猕猴。在一个实施方案中，第二动物物种是鼠，例如小鼠。在一个实施方案中，第二动物物种是犬科动物。在一个实施方案中，本发明的抗体特异性结合至少两个物种的Robo4。在一个实施方案中，第一动物物种是人和/或灵长类(例如猕猴)，而第二动物物种是鼠(例如小鼠)。结合一种以上物种的本发明抗体可用于治疗剂或诊断剂的动物建模研究。
一方面，本发明提供了检测哺乳动物血清中的Robo4的方法，其中血清中的Robo4浓度高于正常Robo4水平指示该哺乳动物中存在血管发生。依照本发明的方法，使可检测的或经过可检测标记的本发明抗Robo4抗体接触来自测试哺乳动物(包括但不限于人)的血清样品。经可检测标记物直接地检测抗Robo4抗体，或者，通过例如接触经过可检测标记的或可检测的二抗间接地检测抗Robo4抗体。测试哺乳动物中抗Robo4的血清浓度(水平)高于来自正常哺乳动物的抗Robo4血清浓度指示该测试哺乳动物中的血管发生。正常哺乳动物指已知不是正在经历血管发生的哺乳动物或不是正在经历血管发生的哺乳动物群体。在一个实施方案中，所述测试的和正常的哺乳动物或哺乳动物群体是同一物种的，包括但不限于人。已经在具有晚期的非小细胞肺癌的人类患者中检测到Robo4蛋白的血清水平(Gorn等，Lung Cancer49：71-76(2005))。血清抗Robo4水平对于与癌症有关的血管发生的诊断和预后是有用的。
一方面，本发明提供了包含一种或多种本发明抗体和载体的组合物。在一个实施方案中，所述载体是药学可接受的。
一方面，本发明提供了编码本发明Robo4抗体的核酸，包含所述核酸的载体，和包含所述核酸和/或载体的宿主细胞(例如大肠杆菌或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)，包含本发明核酸或载体的细胞。载体可以是任何类型的，例如重组载体，诸如表达载体。可使用多种宿主细胞之任一种。在一个实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
一方面，本发明提供了用于制备抗Robo4的方法。例如，本发明提供了制备Robo4抗体的方法，该方法包括在合适的宿主细胞中表达编码所述抗体(或其片段)的本发明重组载体，并回收所述抗体。
一方面，本发明提供了制品，其包括：容器；和装在该容器内的组合物，其中所述组合物包含一种或多种本发明的抗Robo4抗体。在一个实施方案中，所述组合物包含本发明的核酸。在一个实施方案中，包含抗体的组合物进一步包含载体，其在一些实施方案中是药学可接受的。在一个实施方案中，本发明的制品进一步包含关于给受试者施用所述组合物(例如抗体)的说明书。
一方面，本发明提供了试剂盒，其包括装有本发明组合物的第一容器，该组合物包括一种或多种本发明的抗Robo4抗体；和装有缓冲剂的第二容器。在一个实施方案中，所述缓冲剂是药学可接受的。在一个实施方案中，包含抗体的组合物进一步包含载体，其在一些实施方案中是药学可接受的。在一个实施方案中，试剂盒进一步包含关于给受试者施用所述组合物(例如抗体)的说明书。
一方面，本发明提供了本发明的Robo4抗体在制备药物中的用途，所述药物用于诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫(诸如自身免疫)病症和/或血管发生相关病症的疾病的治疗和/或预防。
一方面，本发明提供了本发明的核酸在制备药物中的用途，所述药物用于诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫(诸如自身免疫)病症和/或血管发生相关病症的疾病的治疗和/或预防。
一方面，本发明提供了本发明的表达载体在制备药物中的用途，所述药物用于诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫(诸如自身免疫)病症和/或血管发生相关病症的疾病的治疗和/或预防。
一方面，本发明提供了本发明的宿主细胞在制备药物中的用途，所述药物用于诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫病症(例如自身免疫病症，诸如例如类风湿性关节炎)和/或血管发生相关病症的疾病的治疗和/或预防。
一方面，本发明提供了本发明的制品在制备药物中的用途，所述药物用于诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫病症(例如自身免疫病症，诸如例如类风湿性关节炎)和/或血管发生相关病症的疾病的治疗和/或预防。
一方面，本发明提供了本发明的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫(诸如自身免疫)病症和/或血管发生相关病症的疾病的治疗和/或预防。
本发明提供了对于调控与Robo4信号传导轴的失调有关的疾病状态有用的方法和组合物。Robo4信号传导途径涉及多种生物学和生理学功能，包括例如细胞增殖和血管发生，如此，一方面，本发明提供了一种方法，其包括对受试者施用本发明的抗体。
一方面，本发明提供了抑制Robo4活化的细胞增殖的方法，所述方法包括使细胞或组织接触有效量的本发明抗体，由此与Robo4活化有关的细胞增殖受到抑制。
一方面，本发明提供了治疗受试者中与Robo4活化失调有关的病理疾患的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的本发明抗体，由此所述疾患得到治疗。
一方面，本发明提供了抑制表达Robo4的细胞生长的方法，所述方法包括使所述细胞接触本发明的抗体或本发明的抗体药物偶联物，由此引起对所述细胞生长的抑制。
一方面，本发明提供了治疗性处理具有癌性肿瘤(所述癌性肿瘤包含表达Robo4的细胞)的哺乳动物的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用有效量的本发明的抗体或本发明的抗体药物偶联物，由此有效处理所述哺乳动物。
一方面，本发明提供了用于治疗或预防与Robo4的表达或活性升高有关的细胞增殖性病症的方法，所述方法包括对需要此类治疗的受试者施用有效量的本发明的抗体或本发明的抗体药物偶联物，由此有效治疗或预防所述细胞增殖性病症。在一个实施方案中，所述增殖性病症是与异常的或不想要的内皮细胞增殖有关的病理疾患，所述异常的或不想要的内皮细胞增殖诸如以下病症中的异常的或不想要的血管细胞增殖：所述病症包括但不限于癌症，与实体瘤和转移(solid tumors and metastasis)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、晶状体后纤维组织增生(retrolental fibroplasia)、血管瘤(hemangiomas)、慢性炎症(chronic inflammation，)、眼内新血管疾病(intraocular neovascular diseases)诸如增殖性视网膜病(proliferative retinopathies)例如糖尿病性视网膜病(diabetic retinopathy)、与年龄相关的黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)、新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)、对移植的角膜组织和其它组织的免疫排斥(immune rejection of transplanted corneal tissue and othertissues)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、和银屑病(psoriasis)有关(例如被正在经历该病症的组织内的内皮细胞增殖所增强)的病症和血管发生。
另一方面，本发明提供了治疗性处理哺乳动物中的肿瘤的方法，其中所述肿瘤的生长至少部分依赖于内皮细胞(包括但不限于血管内皮细胞)中所表达的Robo4的生长增强效应，该方法包括使所述细胞接触有效量的本发明的抗体或本发明的抗体药物偶联物，由此抑制例如与肿瘤有关的血管发生中的内皮细胞的生长，并由此有效治疗所述肿瘤。
本发明的又一个实施方案提供了通过使细胞或组织接触有效量的本文中所描述的抗Robo4抗体来调控血管发生的方法。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含细胞毒剂。在一些实施方案中，所述血管发生受到抑制。在一些实施方案中，所述血管发生受到增强。在一些实施方案中，所述血管发生与选自下组的病症有关：癌症、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管疾病、增殖性视网膜病、糖尿病性视网膜病、与年龄相关的黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、对移植的角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、银屑病、及其组合。在一些实施方案中，所述血管发生与癌症有关。在一些实施方案中，所述癌症选自下组：肉瘤(sarcomas)包括骨肉瘤(osteogenic sarcomas)和血管肉瘤(angiosarcomas)、鳞状细胞癌(squamous cell cancer)、肺癌(lung cancer)、腹膜癌(cancer of theperitoneum)、肝细胞癌(hepatocellular cancer)、胃癌(gastric or stomach cancer)包括胃肠癌(gastrointestinal cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、***(cervical cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、肝癌(livercancer)、膀胱癌(bladder cancer)、尿道癌(cancer of the urinary tract)、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌(breast cancer)、结肠癌(colon cancer)、直肠癌(rectalcancer)、结肠直肠癌(colorectal cancer)、子宫内膜或子宫癌瘤(endometrial oruterine carcinoma)、唾液腺癌瘤(salivary gland carcinoma)、肾癌(kidney or renalcancer)、***癌(prostate cancer)、外阴癌(vulval cancer)、甲状腺癌(thyroidcancer)、肝癌瘤(hepatic carcinoma)、***癌瘤(anal carcinoma)、***癌瘤(penile carcinoma)、黑素瘤(melanoma)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)和B细胞淋巴瘤(B-cell lymphoma)、脑癌(brain cancer)、头颈癌(head and neckcancer)、及相关转移、及其组合。在一些实施方案中，所述细胞或组织在哺乳动物中。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使细胞接触选自下组的药剂：抗肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、抗血管发生剂、及其组合。在一些实施方案中，所述药剂是抗VEGF抗体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使细胞接触选自下组的第二、第三或第四药剂：抗肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、抗血管发生剂、及其组合。在一些实施方案中，所述第二、第三或第四药剂是抗VEGF抗体。
本发明的方法可用于影响任何合适的病理状态，例如，与Robo4表达上调有关的细胞和/或组织。在一个实施方案中，本发明的方法中所靶向的细胞是肿瘤内正在增殖的内皮细胞或血管内皮细胞，所述肿瘤包括例如乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、***状癌瘤(papillary carcinoma)(例如甲状腺的)、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、***、中枢神经***癌症、骨肉瘤、肾癌瘤、肝细胞癌瘤、膀胱癌、胃癌瘤、头颈鳞癌(head and neck squamous carcinoma)、黑素瘤和白血病、或肉瘤(例如骨肉瘤或血管肉瘤)或任何其生长受到血管发生中的内皮细胞增殖支持的癌症。在一个实施方案中，所述病理疾患与异常的或不想要的内皮细胞增殖有关。在一些实施方案中，本发明的抗Robo4抗体或抗体药物偶联物的靶物包括以下病症中的异常的或不想要的血管细胞增殖，所述病症包括但不限于癌症(包括例如实体瘤和转移)、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管疾病诸如增殖性视网膜病例如糖尿病性视网膜病、与年龄相关的黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、对移植的角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、银屑病、和与血管发生有关的病症(包括例如被正在经历该病症的组织内的内皮细胞组织所增强的病症)。
本发明的方法可进一步包括别的治疗步骤。例如，在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括以下步骤，其中使靶细胞和/或组织(例如癌细胞)暴露于放射治疗或化疗剂。
在本发明方法的一个实施方案中，被靶向的细胞(例如肿瘤组织或视网膜的内皮细胞)是其中Robo4表达与同一组织起源的正常组织中的内皮细胞相比升高的细胞。在一个实施方案中，本发明的方法引起被靶向的细胞死亡。例如，与本发明抗Robo4抗体的接触，包括与本发明抗体药物偶联物的接触，导致对细胞毒性模块(其引起细胞死亡)的摄取。或者，与偶联有细胞毒性化合物的本发明抗Robo4抗体的接触可导致该细胞毒性化合物(其导致细胞死亡)的内在化。在另一个备选实施方案中，与偶联有可检测模块的本发明抗Robo4抗体的接触致使例如组织(例如肿瘤组织或视网膜)的血管结构例如内皮细胞被检测到，诸如通过相关领域公知的成像技术。
本发明的另一个方面提供了通过给哺乳动物施用本文中所描述的抗Robo4抗体来体内成像的方法。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述哺乳动物被怀疑具有选自下组的疾病或病症：癌症、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管疾病、增殖性视网膜病、糖尿病性视网膜病、与年龄相关的黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、对移植的角膜组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、银屑病、及其组合。
本发明的另一实施方案提供了通过使细胞接触本文中所描述的抗Robo4抗体来检测表达Robo4的细胞的方法。在一些实施方案中，所述细胞是血管内皮细胞。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物中的。在一些实施方案中，所述哺乳动物被怀疑具有选自下组的疾病或病症：癌症、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管疾病、增殖性视网膜病、糖尿病性视网膜病、与年龄相关的黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、对移植的角膜组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、银屑病、及其组合。在一些实施方案中，所述哺乳动物被怀疑具有选自下组的癌症：鳞状细胞癌、肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌瘤、唾液腺癌瘤、肾癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌瘤、***癌瘤、***癌瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤、脑癌、头颈癌、及相关转移、及其组合。
附图简述
图1A和1B描绘了本发明的各种抗Robo4克隆的轻链和重链(分别为图1A和1B)可变区氨基酸序列的比对。轻链和重链的高变区(HVR)以加框的互补决定区(CDR)标示。在图1A中，轻链HVR-L1、L2、和L3分别是Kabat第24-34、50-56、和89-102位。在图1B中，重链HVR-H1、H2、和H3分别是Kabat第26-35、49-65、和93-102位。通过如实施例中所公开的噬菌体展示制备各克隆并测序。
图2A和2B描绘了自具有各自随机化HVR的文库选择的的亲和力成熟抗体的轻链和重链(分别为图2A和2B)可变区氨基酸序列。图2A和2B中的HVR与图1A和1B中所描绘的位置相同。
图3A、3B、4A和4B描绘了供实施本发明时使用的例示性的受体人共有框架序列，其具有如下序列标识符：
可变轻链(VL)共有框架区减Kabat HVR(图3A和3B)
人VLκ亚组I共有框架1-4(SEQ ID NO：9，10，99，100)
人VLκ亚组I’共有框架1-4(SEQ ID NO：9，101，99，100)
人VLκ亚组II共有框架1-4(SEQ ID NO：102，103，104，100)
人VLκ亚组III共有框架1-4(SEQ ID NO：105，106，107，100)
人VLκ亚组IV共有框架1-4(SEQ ID NO：108，109，110，100)
Kabat HVR L1、L2、和L3在框架序列内的位置以阴影框描绘。
可变重链(VH)共有框架区减Kabat HVR(图4A和4B)
人VH亚组I共有框架1-4减Kabat HVR(亚组IA，SEQ ID NO：111，112，113，16)和(亚组IB，SEQ ID NO：114，115，113，16)
人VH亚组I共有框架1-4减延伸的HVR(亚组IC，SEQ ID NO：114，115，116，16)和(亚组ID，SEQ ID NO：114，115，117，16)
人VH亚组II共有框架1-4减Kabat HVR(亚组IIA，SEQ ID NO：118，119，120，16)，(亚组IIB，SEQ ID NO：121，122，120，16)
人VH亚组II共有框架1-4减延伸的HVR(亚组IIC，SEQ ID NO：121，122，123，16)，(亚组IID，SEQ ID NO：121，122，124，16)
人VH亚组III共有框架1-4减Kabat HVR(亚组IIIA，SEQ ID NO：125，126，127，16)，(亚组IIIB，SEQ ID NO：128，129，127，16)
人VH亚组III共有框架1-4减延伸的HVR(亚组IIIC，SEQ ID NO：128，129，130，16)，(亚组IIID，SEQ ID NO：128，129，131，16)
人VH受体1框架1-4减Kabat HVR(亚组受体1A，SEQ ID NO：132，126，133，16)和(亚组受体1B，SEQ ID NO：128，129，133，16)
人VH受体1框架1-4减延伸的HVR(亚组受体1C，SEQ ID NO：128，129，134，16)
人VH受体2框架1-4减Kabat HVR(亚组受体2A，SEQ ID NO：132，126，135，16)和(亚组受体2B，SEQ ID NO：128，129，135，16)
人VH受体2框架1-4减延伸的HVR(亚组受体2C，SEQ ID NO：128，129，136，16)和(亚组受体2D，SEQ ID NO：128，129，137，16)。
图5A描绘了Robo4多肽的全长氨基酸序列。潜在的信号序列以虚线下划线标示。胞外结构域的一部分以实线下划线标示。图5B描绘了例如本文中所公开的抗Robo4 Fab噬菌体展示实验中所使用的带His标签的可溶性Robo4胞外结构域片段的序列(SEQ ID NO：171)。Robo4胞外结构域连接至组氨酸标签，以易于回收或检测。
图6A描绘了抗Robo4抗体YW71.22重链的全长序列(SEQ ID NO：169)。以粗体和下划线显示的丙氨酸是进行半胱氨酸替代以生成thioMAb自位置。图6B描绘了抗Robo4抗体YW71.22轻链的全长序列(SEQ ID NO：170)。
图7描绘了鼠Robo4胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：172)，其包含潜在的信号序列且具有附着于第H232位的组氨酸标签RRA(H)5。虚线下划线指示在哺乳动物细胞中表达期间被切割的潜在的信号序列。
图8是使用Robo4构建体进行的HUVEC迁移测定法的结果的柱形图。
图9显示了BiaCore测定法的结果，指明了Robo4不结合Slit2。
图10显示了BiaCore测定法的结果，指明了Robo4与UNC5B相互作用。
图11是ISH测定法的照片，显示了Robo4在胎小鼠内皮中表达。
图12A和12B显示了人HM-7结肠癌小鼠异种移植物肿瘤模型中的Robo4表达。图12C和12D显示了人MDA-MB-175乳腺癌肿瘤小鼠异种移植物模型中的Robo4表达。
图13A-D显示了人恶性黑素瘤中的Robo4表达。
图14A-D显示了小细胞肺癌中的Robo4表达。图14E-H显示了结肠癌中的Robo4表达。
图15A-15C描绘了小鼠MS1细胞对抗Robo4抗体71.22的内在化(图15A和15B)，及小鼠MS1细胞对亲和成熟的抗Robo4抗体71.22.S1.16的内在化(图15C)。
图16是显示内皮细胞迁移测定法的结果的柱形图。抗Robo4抗体不阻断VEGF所诱导的EC迁移。
图17是服用对照、抗VEGF、抗Robo4(YW71.22)、和抗Robo4加抗VEGF抗体的异种移植物小鼠模型中肿瘤体积中值变化作为时间的函数的图。裸Robo4抗体在这些实验中不抑制肿瘤生长。
图18A和18B显示了FACS图的结果，指明了亲和成熟的抗Robo4克隆71.22.S1.16和71.22.S1.21结合在HUVEC细胞上内源表达的Robo4。图18C和18D显示了FACS图的结果，指明了相同的亲和成熟的抗Robo4抗体克隆结合在鼠MS1细胞上内源表达的鼠Robo4。这些图还显示了亲本抗体71.22也与人和鼠Robo4交叉反应。
图19A和19B显示了如实施例12中所描述的，抗Robo4抗体71.22在注射入小鼠后与血管结合。
图20A和20B描绘了珠向外生长测定法的结果，指明了抗Robo4抗体71.22抑制HUVEC管延长。图20A显示了管的总数目和长度在用71.22处理HUVEC后与无关对照抗体(抗豚草E25)相比降低了。使用抗VEGF作为阳性对照抗体。图20B显示了在100、200和300μm处画出同心圆的代表性例子。
发明详述
I.引言
[00085]本发明提供了结合Robo4或其一部分的组合物、包含此类组合物的试剂盒和制品、及使用此类组合物的方法，包括例如用于调控配体对Robo4受体的结合和用于调控与配体对Robo4受体的结合有关的生物学/生理学活性的方法。本发明部分地基于多种结合Robo4受体的抗Robo4抗体的鉴定，Robo4受体是作为治疗性和诊断性(例如体内、体外或离体(ex vivo)成像)靶物有用的受体。本发明的抗Robo4抗体可方便地用作治疗剂和诊断剂，供靶向与异常的或不想要的内皮细胞增殖有关的病理疾患中使用，所述异常的或不想要的内皮细胞增殖诸如以下病症(包括但不限于)中的异常的或不想要的内皮细胞增殖：癌症、失调的血管发生和与正在经历该病症的组织内的内皮细胞增殖有关(例如被其所增强)的病症、实体瘤和转移、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管疾病诸如增殖性视网膜病例如糖尿病性视网膜病、与年龄相关的黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、对移植的角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、和银屑病。本发明的抗Robo4抗体可单独使用，或联合别的药剂(包括抗肿瘤组合物、化疗剂、细胞毒剂、生长抑制剂)。在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定和/或使用Robo4靶向抗体来阻断Robo4功能、投递细胞毒剂至表达Robo4的细胞(例如在细胞表面上)、和/或投递成像剂至在细胞表面上表达Robo4的细胞的方法。例如，在一些实施方案中，可检测标记的抗Robo4抗体可方便地用作成像剂，用于其中血管形成增强是有害的疾病状态(例如癌症和黄斑变性)或用于其中内皮细胞增殖、血管细胞增殖、和/或血管发生是期望的状况(诸如在例如伤口愈合中)的生理状况。
II.定义
如本文中所使用的，以下术语具有下文归于它们的含义，除非另有规定。
术语“Robo4”或“Magic Roundabout”、“内皮细胞特异性分子4”或“ECSM4”如本文中所使用的指任何包含图5中所显示的氨基酸序列的天然Robo4多肽或变体(无论是天然的或合成的)Robo4多肽、本发明抗体特异性结合的Robo4多肽变体或子序列，包括例如Robo4的胞外结构域或其任何子序列。术语“野生型Robo4”一般指包含天然存在Robo4蛋白的氨基酸序列的多肽。术语“野生型Robo4序列”一般指在天然存在Robo4中发现的氨基酸序列。本发明的Robo4多肽是哺乳动物Robo4多肽，诸如但不限于人、马、牛、猪、犬科动物、猫科、啮齿类Robo4。“Robo4”、“Magic Roundabout”、“内皮细胞特异性分子4”、或“ECSM4”还指如下的核酸和多肽多态性变体、等位基因(等位基因产物)、突变体、和物种间同系物：(1)具有这样的氨基酸序列，该氨基酸序列与由Robo4核酸编码的氨基酸序列(人Robo4多肽序列参见例如图5和7及SEQ ID NO：138和171；鼠Robo4多肽序列参见例如SEQID NO：172)优选在至少约25、50、100、200、500、1000或更多个氨基酸的区域上具有大于大约60％氨基酸序列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大氨基酸序列同一性；(2)结合这样的抗体，该抗体例如为针对包含Robo4蛋白及其保守修饰变体的氨基酸序列的免疫原生成的抗体，例如多克隆抗体和/或单克隆抗体；(3)在严格杂交条件下与对应于编码Robo4蛋白及其保守修饰变体的核酸序列的反义链特异性杂交；(4)具有这样的核酸序列，该核酸序列与Robo4核酸(例如，编码图5和7及SEQ ID NO：138，171或172所示多肽的核酸)优选在至少大约25、50、100、200、500、1000或更多个核苷酸的区域上具有大于大约95％、优选大于大约96％、97％、98％、99％或更高核苷酸序列同一性。优选的是，Robo4核酸与编码SEQ ID NO：138，171或172的核酸序列优选在至少大约25、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500、600.、700、800、900或1000或更多个核苷酸的区域上具有大于80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
术语“抗Robo4抗体”或“结合Robo4的抗体”指能够以足够亲和力结合Robo4的抗体，使得该抗体作为靶向Robo4中的诊断剂和/或治疗剂是有用的。优选的是，根据例如放射免疫测定法(RIA)的测量，抗Robo4抗体对不相关的非Robo4蛋白的结合程度小于该抗体对Robo4的结合的大约10％。在某些实施方案中，结合Robo4的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗Robo4抗体结合在来自不同物种的Robo4间保守的Robo4表位。在其它实施方案中，抗Robo4抗体结合在来自不同物种的Robo4间不保守的Robo4表位。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。
“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在有些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据例如Lowry法的测定，抗体重量超过95％，而在有些实施方案中，重量超过99％，(2)足以通过使用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变域(区)(VH)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(区)(VL)，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域(区)与重链的可变域(区)排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域(区)之间形成界面。
抗体的“可变区”或“可变域(区)”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变域(区)可以称为“VH”。轻链的可变域(区)可以称为“VL”。这些结构域一般是抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。
术语“可变的”指可变域(区)中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域(区)。它集中于轻链和重链可变域(区)中称作高变区(HVR)的三个区段。可变域(区)中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域(区)各自包含四个FR区，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞中抗体的参与。
根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般性描述于例如Abbas et al.，Cellular and Mol.Immunology，4th ed.(W.B.Saunders，Co.，2000)。抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价关联而形成的更大融合分子的一部分。
术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体而非如下文所定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。
“裸抗体(裸露的抗体)”为本发明目的指未偶联细胞毒生模块或放射性标记物的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密、非共价结合的一个重链可变域(区)和一个轻链可变域(区)的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变域(区)和一个轻链可变域(区)可以通过柔性肽接头共价相连，使得轻链和重链在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，各可变域(区)的三个HVR相互作用而在VH-VL二聚体表面上确定了一个抗原结合位点。六个HVR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(区)(或只包含对抗原特异的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
Fab片段包含重链可变域(区)和轻链可变域(区)，而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为在成对Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联形式。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见例如Plückthun，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，1994，第269-315页。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变域(区)(VH)和轻链可变域(区)(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097；WO1993/01161；Hudson et al.，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger et al.，PNAS USA 90：6444-6448(1993)。三抗体(Triabody)和四抗体(tetrabody)也记载于Hudson et al.，Nat.Med.9：129-134(2003)。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的突变，例如天然存在的突变。如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是分立的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。
修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler and Milstein，Nature，256：495-97(1975)；Hongo et al.，Hybridoma，14(3)：253-260(1995)，Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring HarborLaboratory Press，第2版1988)；Hammerling et al.，于：Monoclonal Antibodiesand T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981))、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.，Nature352：624-628(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu et al.，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee et al.，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，PNAS USA 101(34)：12467-12472(2004)；Lee et al.，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits et al.，PNAS USA 90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature362：255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year in Immuno.7：33(1993)；美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Markset al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-813(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnol.14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.14：826(1996)；Lonberg andHuszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison et al.，PNAS USA 81：6851-6855(1984))。嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用感兴趣抗原免疫猕猴而生成的抗体。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域(区)，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还可参见以下综述及其引用的参考文献：Vaswani andHamilton，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle and Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581(1991))。还可用于制备人单克隆抗体的是以下文献中记载的方法：Cole et al.，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner et al.，J.Immunol.147(1)：86-95(1991)。还可参见van Dijk and van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5：368-74(2001)。可通过给已经修饰以应答抗原攻击而生成人抗体但其内源基因座已经失去能力的转基因动物例如经过免疫的异种小鼠(xenomice)施用抗原来制备人抗体(参见例如6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSETM技术)。还可参见例如Li et al.，PNAS USA，103：3557-3562(2006)，关于经人B-细胞杂交瘤技术生成的人抗体。
“抗原”指抗体可选择性结合的预定抗原(例如Robo4序列)。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。优选的是，所述靶抗原是多肽。
就本文目的而言，“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL或VH框架之氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与之相同的氨基酸序列，或者可包含预先存在的氨基酸序列变化。在有些实施方案中，预先存在的氨基酸变化的数目是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少。当VH中存在预先存在的氨基酸变化时，优选那些变化只存在于71H、73H和78H中的三个、两个或一个位置；例如，位于那些位置的氨基酸残基可以是71A、73T和/或78A。在一个实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。若VH中存在预先存在的氨基酸变化，则优选的是那些变化只位于第71H、73H和78H位中的三个、两个或一个；例如，位于那些位置的氨基酸残基可以是71A、73T和/或78A。在一个实施方案中，VL受体人框架在序列方面与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变区序列亚型。通常，序列亚型是如Kabat等人的亚型。在一个实施方案中，对于VL，亚型是如Kabat等人的亚型κI。在一个实施方案中，对于VH，亚型是如Kabat等人的亚型III。
“VH亚型III共有框架”包含从Kabat等人的可变重链亚型III中的氨基酸序列获得的共有序列。在一个实施方案中，VH亚型III共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整个全部：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：128)-H1-WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：129)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO：131)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：16)。在另一个实施方案中，VH亚组III共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整个全部：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：128)-H1-WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：129)-H2-RFTISADTSKNTAYLQMNSLRLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO：137)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：16)。
“VL亚型I共有框架”包含从Kabat等人的可变轻链κ亚型I中的氨基酸序列获得的共有序列。在一个实施方案中，VL亚型I共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整个：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ IDNO：9)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：10)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：99)-L3-FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：100)。
“未修饰的人框架”指与受体人框架具有相同氨基酸序列的人框架，例如在受体人框架中缺少人到非人的氨基酸替代。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域(区)中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个高变区：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的且是最常用的HVR(Kabat et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”高变区是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。
环    Kabat          AbM            Chothia        接触
---   -----------    -----------    -----------    ----------
L1    L24-L34        L24-L34        L26-L32        L30-L36
L2    L50-L56        L50-L56        L50-L52        L46-L55
L3    L89-L97        L89-L97        L91-L96        L89-L96
H1    H31-H35B       H26-H35B       H26-H32        H30-H35B
      (Kabat编号)
H1    H31-H35        H26-H35        H26-H32        H30-H35
      (Chothia编号)
H2    H50-H65        H50-H58        H53-H55        H47-H58
H3    H95-H102       H95-H102       H96-H101       H93-H101
描述抗体高变区的氨基酸位置/边界可以有所变化，这取决于本领域中已知的背景和各种定义(如下文所述的)。可变域(区)内的有些位置可以看作杂合高变位置，因为这些位置在一组标准下可认为在高变区内，而在不同的一组标准下被认为在高变区外。在延伸的高变区中也能找到这些位置中的一处或多处。在一个实施方案中，这些杂合高变位置包括重链可变域(区)中位置26-30、26-35、33-35B、47-49、49-65、57-65、95-102、93、94和102中的一处或多处。在一个实施方案中，这些杂合高变位置包括轻链可变域(区)中位置24-29、24-34、35-36、46-49、50-56、89-97、56和97中的一处或多处。
如本文中所使用的，轻链的HVR可互换地称作HVR-L1、-L2或-L3或HVR1-LC、HVR2-LC或HVR3-LC或其它类似的指明提及轻链HVR的称谓。如本文中所使用的，重链的HVR可互换地称作HVR-H1、-H2或-H3或HVR1-HC、HVR2-HC或HVR3-HC或其它类似的指明提及重链HVR的称谓。
高变区可包括如下“延伸的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变区残基是依照Kabat等，见上文编号的。
“改变的高变区”就本文目的而言指其中包含一处或多处(例如1处至约16处)氨基酸替代的高变区。
“未修饰的高变区”就本文目的而言指具有与衍生它的非人抗体相同的氨基酸序列的高变区，即其中缺少一处或多处氨基酸替代的高变区。
“框架”或“FR”残基指可变域(区)中除如本文中所定义的高变区残基以外的那些残基。如本文中所使用的，LC-FR1至LC-FR4或FR1-LC至FR4-LC或类似称谓可互换使用，指轻链的框架区。如本文中所使用的，HC-FR1至HC-FR4或FR1-HC至FR4-HC或类似称谓可互换使用，指重链的框架区。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。优选的亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas et al.，PNASUSA 91：3809-3813(1994)；Schier et al.，Gene 169：147-155(1995)；Yelton et al.，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al.，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。例如，阻断性抗体或拮抗性抗Robo4抗体通过结合Robo4而基本上或完全抑制血管发生。
术语“如Kabat中的可变域(区)残基编号方式”或“如Kabat中的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat等，《(Sequences of Proteins ofImmunological Interest》，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)中用于抗体重链可变域(区)或轻链可变域(区)编辑的编号***。使用此编号***，实际的线性氨基酸序列可以包含较少的或另外的氨基酸，对应于可变域(区)FR或CDR的缩短或***。例如，重链可变域(区)可以包含H2残基52后的单一氨基酸***(依照Kabat的残基52a)和重链FR残基82后的***残基(例如依照Kabat的残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号可以通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。
短语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时表示两个数值(通常一个涉及本发明的抗体而另一个涉及参照/比较抗体)之间足够高的相似程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作为参照/比较抗体数值的函数，所述两个数值之间的差异优选小于约50％，优选小于约40％，优选小于约30％，优选小于约20％，优选小于约10％。
“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速地结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的示例性实施方案。
在一个实施方案中，“Kd”、“KD”、或“Kd值”、是通过如下测定法所述使用Fab型式的目的抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的：通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的125I标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen，et al.，J Mol Biol 293：865-881(1999))。为了确定测定条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc #269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的目的Fab(例如如Presta et al.，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中所记载的Fab-12)混合。然后将目的Fab保温过夜；不过，保温可持续更长时间(例如65个小时)以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以进行室温保温(例如1小时)。然后除去溶液，并用含0.1％
Figure A20088001151400361
20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MicroScint-20；Packard)，然后在Topcount伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％
Figure A20088001151400371
20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(RIAcore Evaluation Softwareversion 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen，Y.，et al.，J MolBiol 293：865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1S-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flow equippedspectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AmincoTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
短语“实质性(基本上)降低”或“实质性(基本上)不同”在用于本文时表示两个数值(通常一个涉及本发明的抗体而另一个涉及参照/比较抗体)之间足够高的差异程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值、HAMA反应)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有统计学显著性。作为参照/比较抗体数值的函数，所述两个数值之间的差异优选大于约10％，优选大于约20％，优选大于约30％，优选大于约40％，优选大于约50％。
关于肽或多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTARTM)软件。本领域技术人员可决定用于测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，而且所示源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office，Washington D.C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech公司(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作***，优选数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y 乘100
其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。
除非另有具体说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“重组载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有附加模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体或半固体支持物。5′和3′末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖等糖的类似物形式，包括例如2′-氧-甲基、2′-氧-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如***糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S(“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate))、(O)NR2(“酰胺酯”(amidate))、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“甲缩醛”(formacetal))替代，其中R或R′各自独立为H或者取代或未取代的烷基(1-20个C)，任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是合成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。
“病症”或“疾病”指将受益于本发明物质/分子或方法的治疗的任何状况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括恶性和良性肿瘤；非白血病和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔的病症；及炎性的、免疫学的和其它血管发生相关的病症。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症是血管发生。
“肿瘤”在用于本文时指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric orstomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney or renalcancer)、***癌、外阴癌、甲状腺癌、及各种类型的头和颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性NHL、贮积病(bulky disease)NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。
术语“抗肿瘤组合物”或“抗癌组合物”或“抗癌剂”指可用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种活性治疗剂，例如“抗癌剂”。治疗剂(抗癌剂)的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它用于治疗癌症的药剂诸如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如erlotinib(TarcevaTM)、血小板衍生生长因子抑制剂(例如GleevecTM(Imatinib Mesylate))、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))、干扰素、细胞因子、能与ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA、VEGF、或VEGF受体中的一种或多种靶物结合的拮抗剂(例如中和性抗体)、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有机化学剂等。本发明还包括它们的组合。
“血管发生因子”或“血管发生剂”指刺激血管发育，例如促进血管发生(angiogenesis)、内皮细胞生长、血管稳定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生长因子。例如，血管发生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成员、PlGF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)、TIE配体(血管生成素)、ephrin、Del-1、酸性(aFGF)和碱性(bFGF)成纤维细胞生长因子、卵泡抑素(Follistatin)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)/分散因子(scatter factor，SF)、白介素-8(IL-8)、Leptin、Midkine、胎盘生长因子、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生生长因子尤其是PDGF-BB或PDGFR-β、Pleiotrophin(PTN)、Progranulin、Proliferin、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)/血管通透性因子(VPF)等。它还包括加速伤口愈合的因子，诸如生长激素、***-I(IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF及其家族的成员、及TGF-α和TGF-β。参见例如Klagsbrun andD’Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53：217-39；Streit and Detmar(2003)Oncogene 22：3172-3179；Ferrara & Alitalo(1999)Nature Medicine5(12)：1359-1364；Tonini等(2003)Oncogene 22：6549-6556(例如列举已知血管发生因子的表1)；Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8：200-206。
术语“VEGF”在用于本文时指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Leung等(1989)Science 246：1306和Houck等(1991)Mol.Endocrin，5：1806所述，及其天然存在等位基因形式和加工形式。术语“VEGF”还指来自非人物种诸如小鼠、大鼠或灵长类动物的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF，等等。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申请中可能通过例如“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF165”来鉴别任何此类形式VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。依照一个优选的实施方案，所述VEGF是人VEGF。
“VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性，包括其与VEGF或一种或多种VEGF受体或编码它们的核酸结合的分子。优选的是，所述VEGF拮抗剂结合VEGF或VEGF受体。VEGF拮抗剂包括抗VEGF抗体及其抗原结合片段、结合VEGF和VEGF受体并阻断配体-受体相互作用的多肽(例如免疫粘附素、肽体)、抗VEGF受体抗体和VEGF受体拮抗剂诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂、结合VEGF的适体和在严格条件下与编码VEGF或VEGF受体杂交的核酸(例如RNAi)。依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂结合VEGF并抑制VEGF诱导的体外内皮细胞增殖。依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂以大于非VEGF或非VEGF受体的亲和力结合VEGF或VEGF受体。依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂以介于1uM和1pM之间的Kd结合VEGF或VEGF受体。依照另一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂以介于500nM和1pM之间的Kd结合VEGF或VEGF受体。
依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂选自下组：多肽诸如抗体、肽体、免疫粘附素、小分子或适体。在一个优选的实施方案中，所述抗体是抗VEGF抗体(诸如抗体)或抗VEGF受体抗体(诸如抗VEGFR2或抗VEGFR3抗体)。VEGF拮抗剂的其它例子包括：VEGF-Trap、Mucagen、PTK787、SU11248、AG-013736、Bay 439006(sorafenib)、ZD-6474、CP632、CP-547632、AZD-2171、CDP-171、SU-14813、CHIR-258、AEE-788、SB786034、BAY579352、CDP-791、EG-3306、GW-786034、RWJ-417975/CT6758和KRN-633。
“抗VEGF抗体”指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。优选的是，本发明的抗VEGF抗体可在靶向和干预其中涉及VEGF活性的疾病或疾患时用作治疗剂。抗VEGF抗体通常不结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不结合其它生长因子，诸如PlGF、PDGF或bFGF。一种优选的抗VEGF抗体是与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体。更优选的是，抗VEGF抗体是依照Presta等，Cancer Res.57：4593-4599(1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于称为bevacizumab(贝伐单抗；BV；
Figure A20088001151400431
)的抗体。依照另一个实施方案，可以使用的抗VEGF抗体包括但不限于WO 2005/012359中披露的抗体。依照一个实施方案，所述抗VEGF抗体包含WO 2005/012359的图24、25、26、27和29中披露的任一抗体(例如G6、G6-23、G6-31、G6-23.1、G6-23.2、B20、B20-4和B20.4.1)的重链可变区和轻链可变区。在另一个优选的实施方案中，称为ranibizumab的抗VEGF抗体是为了眼病诸如糖尿病神经病变和AMD而施用的VEGF拮抗剂。
抗VEGF抗体“贝伐单抗”(bevacizumab，BV)，也称为“rhuMAb VEGF”或
Figure A20088001151400432
是依照Presta et al.，Cancer Res.57：4593-4599(1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体。它包含突变的人IgG1框架区和来自阻断人VEGF结合其受体的鼠抗hVEGF单克隆抗体A4.6.1的抗原结合互补决定区。贝伐单抗大约93％的氨基酸序列，包括大部分框架区，衍生自人IgG1，而大约7％的序列衍生自鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量，而且是糖基化的。其它抗VEGF抗体包括美国专利No.6884879和WO2005/044853中披露的抗体。
抗VEGF抗体Ranibizumab或
Figure A20088001151400433
抗体或rhuFab V2是人源化的、亲和力成熟的抗人VEGF Fab片段。Ranibizumab是通过标准重组技术在大肠杆菌表达载体和细菌发酵中生成的。Ranibizumab是未糖基化的且分子量为约48,000道尔顿。参见WO98/45331和US20030190317。
血管发生失调可导致异常血管发生，即疾病状态中的或引起疾病状态的新血管生长过度或不当(例如从医学观点看不良的血管发生位置、时间或启动)时。过度的、不当的或失控的血管发生发生于有促成疾病状态恶化或引起疾病状态的新血管生长时。新血管可供应患病组织，破坏正常组织，而且，在癌症的情况中，新血管可容许肿瘤细胞逃入循环并停留在其它器官(肿瘤转移)中。涉及异常血管发生的疾病状况包括非肿瘤性的和肿瘤性的疾患，包括例如癌症，尤其是血管化实体瘤和转移瘤(包括结肠癌、乳腺癌、肺癌(尤其是小细胞肺癌)、或***癌)、不想要的或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病或IBD(克罗恩氏(Crohn)病和溃疡性结肠炎)银屑病、银屑病斑块、结节病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性和其它增殖性视网膜病包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生、年龄相关黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、视网膜/脉络膜新血管形成、虹膜前面的新血管形成(发红)、眼新血管疾病、血管再狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑脊膜瘤、血管瘤、血管纤维瘤、甲状腺增生(包括格雷夫斯氏(Graves)病)、慢性炎症、肺炎、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压、恶性肺积液(malignantpulmonary effusion)、脑水肿(例如与急性中风/闭合性头部外伤/创伤有关的)、滑液炎症、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨关节炎(OA)、顽固性腹水、多囊卵巢病、子宫内膜异位症、第三空间流体病(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎、间隔综合征、烧伤、肠病)、子宫纤维瘤(uterine fibroids)、早产、慢性炎症诸如IBD、肾同种异体移植物排斥、炎性肠病、肾病综合征、不想要的或异常的组织块生长(非癌性的)、血友病性关节、肥厚性瘢痕、毛发生长的抑制、奥-韦二氏(Osler-Weber)综合征、脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、先兆子痫、腹水、心包积液(诸如与心包炎有关的)和胸腔积液。
在用于本文时，“治疗”或“处理”指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的抗体可用于延迟疾病或病症的发生/发展。
“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。
本发明的物质/分子、拮抗剂或激动剂的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。术语“治疗有效量”指在哺乳动物(患者)中有效“治疗”疾病或紊乱的本发明抗体、多肽、或拮抗剂的数量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞数；缩小肿瘤体积或重量；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻与癌症有关的一种或多种症状。就药物可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的。在一个实施方案中，治疗有效量是生长抑制量。在另一个实施方案中，治疗有效量是延长患者存活的量。在另一个实施方案中，治疗有效量是改进患者无进展存活的量。
“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量低于治疗有效量。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和
Figure A20088001151400451
环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢***酚(tetrahydrocannabinol)(屈***酚(dronabinol)，
Figure A20088001151400461
)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)(
Figure A20088001151400462
)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，
Figure A20088001151400463
)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、
Figure A20088001151400464
多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure A20088001151400471
多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)( )；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如
Figure A20088001151400481
紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和
Figure A20088001151400482
多西他塞(doxetaxel)(-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)(
Figure A20088001151400484
)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)(
Figure A20088001151400485
)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)(
Figure A20088001151400486
)；奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine)(
Figure A20088001151400487
)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)(
Figure A20088001151400488
)；任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和***龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。别的化疗剂包括作为抗体药物偶联物有用的细胞毒剂，诸如例如美登木素生物碱(例如DM1)和auristatins MMAE和MMAF。
“化疗剂”还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的“抗激素剂”，且常常是***或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。实例包括抗***类和选择性***受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括
Figure A20088001151400489
他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和
Figure A200880011514004811
托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮类；***受体下调剂类(ERD)；功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如和醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节***生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、
Figure A20088001151400491
醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、
Figure A20088001151400492
依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、
Figure A20088001151400493
伏罗唑(vorozole)、
Figure A20088001151400494
来曲唑(letrozole)和
Figure A20088001151400495
阿那曲唑(anastrozole)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如
Figure A20088001151400496
或
Figure A20088001151400497
)、
Figure A20088001151400498
依替膦酸钠(etidronate)、NE-58095、
Figure A20088001151400499
唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)、阿伦膦酸盐(alendronate)、
Figure A200880011514004911
帕米膦酸盐(pamidronate)、
Figure A200880011514004912
替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如
Figure A200880011514004914
疫苗和基因疗法疫苗，例如疫苗、
Figure A200880011514004916
疫苗和
Figure A200880011514004917
疫苗；
Figure A200880011514004918
拓扑异构酶1抑制剂；
Figure A200880011514004919
rmRH；lapatinib ditosylate(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。
“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞(例如表达Robo4的细胞)生长和/或增殖的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的表达Robo4的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长***类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、***(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见《TheMolecular Basis of Cancer》，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycleregulation，oncogenes，and antieioplastic drugs”，Murakaini等人，WB Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。紫杉烷类(紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(
Figure A20088001151400502
Bristol-MyersSquibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝***的抑制。
“多柔比星(Doxorubicin)”是蒽环类抗生素。多柔比星的完整化学名是(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘二酮，即(8S-cis)-10-[(3-amino-2，3，6-trideoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7，8，9，10-tetrahydro-6，8，11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5，12-naphthacenedione。
III.抗Robo4抗体
一方面，本发明提供了结合Robo4的抗体。在一个实施方案中，抗Robo4抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，抗Robo4抗体是抗体片段，例如Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)2片段。在一个实施方案中，抗Robo4抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗Robo4抗体是纯化的抗体。
在本发明的另一个方面，提供了编码抗Robo4抗体的多核苷酸。在某些实施方案中，提供了包含编码抗Robo4抗体的多核苷酸的载体。在某些实施方案中，提供了包含此类载体的宿主细胞。在本发明的另一个方面，提供了包含抗Robo4抗体或编码抗Robo4抗体的多核苷酸的组合物。在某些实施方案中，组合物是药物配制剂，其用于治疗疾病和病症，包括例如癌症、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管疾病、增殖性视网膜病、糖尿病性视网膜病、与年龄相关的黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、对移植的角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、银屑病、及其组合。
本文中提供了且下文实施例中描述了自噬菌体文库衍生的例示性单克隆抗体。那些抗体称作YW71.6、YW71.1、YW71.22、YW71.89、YW79.1、YW79.8、和YW79.11。那些抗体经历了亲和力成熟生成YW71.22.S1.2、YW71.22S1.8、YW71.22S1.16、YW71.22S1.23、YW71.22S1.24、YW71.22S1.27、YW71.22S1.31、YW71.22S1.38、YW71.22S1.77YW71.22.S2.21、YW71.22.S2.79、YW71.22.H1.2、YW71.22.H1.9、YW71.22.H1.46、YW71.22.H1.77、YW71.22.H1.91、和YW71.22.H2.31。图1和图2列出了抗体重链和轻链可变域(区)的序列。
本发明的抗体可包含任何合适的人或人共有轻链框架序列，前提是该抗体展现出期望的生物学特征(例如期望的结合亲和力)。
在一个实施方案中，本文中的人共有框架来自或衍生自VH亚组III(参见图4A和4B)和/或VLκ亚组I(参见图3A和3B)共有框架序列。
如此，VH受体人框架可包含一种、两种、三种或所有四种以下框架序列：
包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：13)的FR1，
包含WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：14)的FR2，
包含RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO：15)的FR3，
包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：16)的FR4。
在其它实施方案中，VH共有框架包括：
人VH亚组I共有框架1-4减Kabat CDR(SEQ ID NO：111，112，113，16)；
人VH亚组I共有框架1-4减延伸的高变区(SEQ ID NO：114，115，113，16或SEQ ID NO：114，115，116，16或SEQ ID NO：114，115，117，16)；
人VH亚组II共有框架1-4减Kabat CDR(SEQ ID NO：118，119，120，16)；
人VH亚组II共有框架1-4减延伸的高变区(SEQ ID NO：121，122，120，16或SEQ ID NO：121，122，123，16或SEQ ID NO：121，122，124，16)；
人VH亚组III共有框架1-4减Kabat CDR(SEQ ID NO：125，126，127，16)；
人VH亚组III共有框架1-4减延伸的高变区(SEQ ID NO：128，129，127，16或SEQ ID NO：128，129，130，16或SEQ ID NO：128，129，131，16)；
人VH受体1框架1-4减Kabat CDR(SEQ ID NO：132，126，133，16)；
人VH受体1框架1-4减延伸的高变区(SEQ ID NO：128，129，133，16或SEQ IDNO：128，129，134，16)；
人VH受体2框架1-4减Kabat CDR(SEQ ID NO：132，126，135，16)；或
人VH受体2框架1-4减延伸的高变区(SEQ ID NO：128，126，135，16或SEQ IDNO：128，126，136，16或SEQ ID NO：128，126，137，16)。
在一个实施方案中，VH受体人框架区4(H-FR4)包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：45)。
VL受体人框架可包含一种、两种、三种或四种以下框架序列：
包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：9)的FR1，
包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：10)的FR2，
包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：11)的FR3，
包含FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：173)或FGQGTKMEIKR(SEQ ID NO：139)的FR4。
在另一个实施方案中，VL共有框架包括：
人VLκ亚组I共有框架1-4(SEQ ID NO：9，10，99，100)；
人VLκ亚组I共有框架1-4(SEQ ID NO：9，101，99，100)；
人VLκ亚组II共有框架1-4(SEQ ID NO：102，103，104，100)；
人VLκ亚组III共有框架1-4(SEQ ID NO：105，106，107，100)；或
人VLκ亚组IV共有框架1-4(SEQ ID NO：108，109，110，100)。
虽然受体可在序列上与选定的人框架序列相同，无论它是来自人免疫球蛋白或人共有框架，在本发明中，受体序列可包含相对于人免疫球蛋白序列或人共有框架序列而言预先存在的氨基酸替代。这些预先存在的替代优选是最小限度的，通常相对于人免疫球蛋白序列或共有框架序列而言的仅四处、三处、两处或一处氨基酸差异。
将非人抗体的高变区残基掺入VL和/或VH受体人框架。例如，可掺入对应于Kabat CDR残基、Chothia高变环残基、AbM残基、和/或接触残基的残基。任选的是，掺入如下延伸的高变区残基：24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。
虽然本文中讨论了高变区残基的“掺入”，但是应当领会这可以各种方式实现，例如编码期望氨基酸序列的核酸可通过突变编码小鼠可变域(区)序列的核酸使得其框架残基改变成受体人框架残基，或者通过突变编码人可变域(区)序列的核酸使得高变域残基改变成非人残基，或者通过合成编码期望序列的核酸等等而产生。
在本文中的例子中，使用每一个高变区的分开的寡核苷酸通过编码人受体序列的核酸的Kunkel诱变来产生高变区嫁接(graft)变体。Kunkel等，Methods Enzymol.154：367-382(1987)。可利用常规技术在框架和/或高变区内引入合适的改变以纠正和重建适当的高变区-抗原相互作用。
A.抗体片段
本发明涵盖抗体片段。抗体片段可以通过传统手段来生成，诸如酶促消化，或者通过重组技术来生成。在某些情况中，使用抗体片段，而不是完整抗体，有优势。片段的较小尺寸容许快速清除，而且可导致更易于到达实体瘤。某些抗体片段的综述参见Hudson等(2003)Nat.Med.9：129-134。
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24：107-117(1992)；及Brennan等，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和由大肠杆菌分泌，如此容许容易地生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员会是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；及5,587,458。Fv和scFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；如此，它们可能适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建scFv融合蛋白以生成效应器蛋白质在scFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering，Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。
B.人源化抗体
本发明涵盖人源化抗体。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体可具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域(区)。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化(Jones等(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等(1988)Science 239：1534-1536)，即用高变区序列替代人抗体的对应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中显著少于完整的人可变域(区)用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。
用于制备人源化抗体的人轻链和重链二者可变域(区)的选择对于降低抗原性可能是重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变域(区)序列对已知人可变域(区)序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(参见例如Sims等(1993)J.Immunol.151：2296；Chothia等(1987)J.Mol.Biol.196：901)。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于数种不同的人源化抗体(参见例如Carter等(1992)PNAS USA 89：4285；Presta等(1993)J.Immunol.151：2623)。
一般还希望的是，抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质地涉及对抗原结合的影响。
在一些实施方案中，本发明提供了经人源化使得HAMA应答降低或消除的抗体。HAMA应答降低或消除是合适治疗剂的临床开发的一个重要方面。参见例如Khaxzaeli et al.，J.Natl.Cancer Inst.(1988)，80：937；Jaffers et al.，Transplantation(1986)，41：572；Shawler et al.，J.Immunol.(1985)，135：1530；Sears et al.，J.Biol.Response Mod.(1984)，3：138；Miller et al.，Blood(1983)，62：988；Hakimi et al.，J.Immunol.(1991)，147：1352；Reichmann et al.，Nature(1988)，332：323；Junghans et al.，Cancer Res.(1990)，50：1495。这些抗体的变体还可使用本领域已知的常规方法获得，其中有些在下文中有进一步描述。
例如，来自本文所述抗体的氨基酸序列可充当框架和/或高变序列多样化的起始(亲本)序列。起始高变序列所连接的选定框架序列在本文中称为受体人框架。尽管受体人框架可来自或衍生自人免疫球蛋白(其VL和/或VH区)，优选受体人框架来自或衍生自人共有框架序列，因为这样的框架已证实在人类患者中具有最小免疫原性或者没有免疫原性。
当受体衍生自人免疫球蛋白时，可任选根据它与供体框架序列的同源性来选择人框架序列，即将供体框架序列与人框架序列集合中的各种人框架序列比对，并选择最具同源性的框架序列作为受体。
C.人抗体
本发明的人抗体可以通过如上所述联合选自人衍生噬菌体展示库的Fv克隆可变域(区)序列与已知的人恒定域序列来构建。或者，可以通过杂交瘤方法来生成本发明的人单克隆抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有记载(例如Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；及Boerner等，J.Immunol.，147；86(1991))。
例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因会导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等，PNAS USA 90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature 362：255(1993)；Bruggermann等，Year in Immunol.7：33(1993)。
基因改组也可用于自非人(例如啮齿类)抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为“表位印记”(epitope imprinting)，如本文所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变域(区)用人V结构域基因全集替换，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择导致如下非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链在一级噬菌体展示克隆中消除相应的非人链后恢复了抗原结合位点，即表位决定(印记，imprint)人链配偶的选择。在重复该过程以替换剩余非人链时，得到人抗体(参见PCT WO 93/06213，公布于1993年4月1日)。与传统的通过CDR嫁接进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它们不含非人起源的FR或CDR残基。
D.抗体变体
在有些实施方案中，涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以是通过将适宜的变化引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或***和/或替代。可进行任何删除、***和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体的氨基酸序列。
可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的方法有“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science 244：1081-1085中所述。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如arg、asp、his、lys、和glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲对替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达的免疫球蛋白筛选期望的活性。
氨基酸序列***包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围由一个残基至包含一百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的例子包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它***变体包括将抗体的N或C端与酶(例如用于ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽融合。
在某些实施方案中，本发明的抗体发生了改变以提高或降低抗体糖基化的程度。多肽的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这些三肽序列中的任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向抗体中添加或删除糖基化位点可通过改变氨基酸序列从而创建或消除一个或多个上述三肽序列而便利地完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通过向原始抗体的序列中添加、删除、或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。
若抗体包含Fc区，则可改变附着其上的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体典型地包含分支的、双触角的寡糖，其一般通过N-连接附着于Fc区CH2结构域的Asn297(参见例如Wright等(1997)TIBTECH 15：26-32)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附着至双触角寡糖结构“主干”中GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善特性的抗体变体。
例如，提供了有缺乏岩藻糖的碳水化合物结构(直接地或间接地)附着于Fc区的抗体变体。此类变体具有改善的ADCC功能(参见例如美国专利申请号US 2003/0157108(Presta，L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd))。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺乏型”抗体变体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能够生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1，Presta，L；及WO 2004/056312A1，Adams等，尤其是实施例11)和敲除细胞系，诸如α-1，6-岩藻糖转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda，Y.等，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
进一步提供了具有等分寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc等分。此类抗体变体可具有降低的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)；及US 2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju，S.)；及WO 1999/22764(Raju，S.)。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一处或多处进一步改善ADCC的氨基酸替代的Fc区，例如Fc区第298、333、和/或334位(EU残基编号方式)处的替代。此类替代可以与任何上文所述变异组合存在。
在某些实施方案中，本发明涵盖了如下抗体变体，其具有一些但非所有效应器功能，这使之成为其中抗体体内半衰期是重要的但某些效应器功能(诸如补体和ADCC)不是必需的或有害的许多应用的期望候选物。在某些实施方案中，测量抗体的Fc活性以确保只保留了期望的特性。可进行体外和/或体内细胞毒性测定法来证实CDC和/或ADCC活性的降低/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法来确认抗体缺乏FcγR结合(从此有可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。美国专利No.5,500,362中记载了评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例(还可参见Hellstrom，I.，et al.PNAS USA 83：7059-7063(1986)；Hellstrom，I et al.，PNAS USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337；Bruggemann，M.et al.，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如ACTITM非放射性细胞毒性测定法，其用于流式细胞术(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)；和CytoTox
Figure A20088001151400581
非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI))。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。还可以进行Clq结合测定法来证实抗体不能结合Clq及从此缺乏CDC活性。为了评估补体激活，可进行CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg，M.S.etal.，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood103：2738-2743(2004))。还可以使用本领域知道的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova，S.B.et al.，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
提供了另一类具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。进行替代诱变的感兴趣位点包括高变区，但是也涵盖FR改变。表1中“优选替代”栏显示了保守替代。表1中提供了称为“例示替代”的更实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步描述的。可以将氨基酸替代掺入感兴趣抗体，并筛选产物，例如筛选期望的活性，诸如改善的抗原结合、降低的免疫原性、改善的ADCC或CDC、等等。
表1
  原始残基  例示替代   优选替代
  Ala(A)  Val；Leu；Ile   Val
  Arg(R)  Lys；Gln；Asn   Lys
  Asn(N)  Gln；His；Asp，Lys；Arg   Gln
  Asp(D)  Glu；Asn   Glu
  Cys(C)  Ser；Ala   Ser
  Gln(Q)  Asn；Glu   Asn
  Glu(E)  Asp；Gln   Asp
  Gly(G)  Ala   Ala
  His(H)  Asn；Gln；Lys；Arg   Arg
  Ile(I)  Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸   Leu
  Leu(L)  正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe   Ile
  Lys(K)  Arg；Gln；Asn   Arg
  Met(M)  Leu；Phe；Ile   Leu
  Phe(F)  Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr   Tyr
  Pro(P)  Ala   Ala
  Ser(S)  Thr   Thr
  Thr(T)  Val；Ser   Ser
  Trp(W)  Tyr；Phe   Tyr
  Tyr(Y)  Trp；Phe；Thr；Ser   Phe
  Val(V)  Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸   Leu
对抗体生物学特性的修饰可通过选择对影响以下方面的替代来实现：(a)替代区域中多肽主链的结构，例如(折叠)片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性，可将氨基酸如下分组(A.L.Lehninger，于Biochemistry，第2版，pp.73-75，WorthPublishers，New York(1975))：
(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电荷的、极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者，根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守替代需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。此类替代残基还可以导入保守替代位点，或导入剩余(非保守)位点。
一类替代变体涉及替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体会具有改变的(例如改进的)生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术而便利地生成。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此生成的抗体展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的噬菌体外壳蛋白(例如M13基因III产物)至少一部分的融合物。然后对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行扫描诱变(例如丙氨酸扫描)以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本领域已知的技术(包括本文详述的技术)进行替代的候选位点。一旦产生这样的变体，使用本领域已知的技术(包括本文所述的技术)对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的变体用于进一步的开发。
编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对较早制备的变体或非变体型式的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
可能希望在本发明抗体的Fc区中引入一处或多处氨基酸修饰，由此生成Fc区变体。Fc区变体可包括在一个或多个氨基酸位置(包括铰链半胱氨酸的位置)包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
依照此描述和本领域的教导，涵盖在有些实施方案中，本发明的抗体与野生型对应抗体相比可包含一处或多处改变(在例如Fc区中)。与它们的野生型对应物相比，这些抗体仍会基本上保留治疗功效所需要的相同特性。例如，认为可以在Fc区中进行会导致Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即或是增强或是削弱)的某些改变，例如WO99/51642中所述。还可参见关注Fc区变体其它例子的Duncan和Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO94/29351。WO00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Shields等J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。半衰期延长且对新生儿Fc受体(FcRn)(它负责将母体IgG转移给胎儿)(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等，J.Immunol.24：249(1994))的结合改良的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)。这些抗体包含具有一处或多处改进Fc区与FcRn结合的替代的Fc区。具有改变的Fc区氨基酸序列且Clq结合能力升高或降低的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551B1，WO99/51642。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Idusogie等J.Immunol.164：4178-4184(2000)。
另一方面，本发明提供了在构成Fc区的Fc多肽的界面中包含修饰的抗体，其中所述修饰便于和/或促进异二聚化。这些修饰包括在第一Fc多肽中导入***(protuberance)和在第二Fc多肽中导入空腔(cavity)，其中所述***可位于所述空腔中，从而促进第一与第二Fc多肽的复合。生成具有这些修饰的抗体的方法是本领域已知的，例如记载于美国专利No.5,731,168。
又一方面，可能期望创建半胱氨酸改造抗体，例如“thioMAb”和“thioFab”，其中用半胱氨酸残基替代抗体的一个或多个残基。在具体的实施方案中，被替代的残基位于抗体的可及位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，由此将反应性硫醇基团定位于抗体的可及位点，并可用于将抗体与其它模块(诸如药物模块或接头-药物模块)偶联，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代一个或多个以下残基：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。在一个优选的实施方案中，将重链的A118(EU编号方式)替代成半胱氨酸。本文中下文进一步详细描述了半胱氨酸改造thioMab和thioFab。
E.抗体衍生物
可进一步修饰本发明的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。优选的是，适于抗体衍生化的模块是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中，提供了抗体与可通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质性质模块的偶联物。在一个实施方案中，该非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等，PNAS 102：11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，包括但不限于对普通细胞无害但将非蛋白质性质模块加热至接近抗体-非蛋白质性质模块的细胞被杀死的温度的波长。
IV.生成抗体的方法
A.生成噬菌体衍生的抗体
本发明的抗体可通过噬菌体(噬菌粒)展示技术来制备，如Lee et al.，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93)中所披露的。噬菌体(噬菌粒)容许构建大型蛋白质变体文库，可从中快速分拣以高亲和力与靶分子结合的那些序列。通常将编码变体多肽的核酸与编码病毒外壳蛋白诸如基因III蛋白或基因VIII蛋白的核酸序列融合。已经开发出了其中编码蛋白质或多肽的核酸序列与编码基因III蛋白一部分的核酸序列融合的单价噬菌粒展示***(Bass，S.，Proteins，8：309(1990)；Lowman和Wells，Methods：A Companion to Methods inEnzymology，3：205(1991))。在单价噬菌粒展示***中，基因融合物以低水平表达，而且野生型基因III蛋白也表达，从而保留了粒子的侵染性。许多专利中已经公开了构建肽库和筛选那些文库的方法(例如美国专利No.5,723,286；美国专利No.5,432,018；美国专利No.5,580,717；美国专利No.5,427,908；和美国专利No.5,498,530)。
已经以许多方式制备了抗体或抗原结合多肽的文库，包括通过***随机DNA序列或通过克隆一族相关基因来改变单个基因。利用噬菌体(噬菌粒)展示来展示抗体或抗原结合片段的方法记载于美国专利No.5,750,373、5,733,743、5,837,242、5,969,108、6,172,197、5,580,717和5,658,727。然后对文库筛选具期望特性的抗体或抗原结合蛋白的表达。
本领域已经建立了将所选择的氨基酸替代入模板核酸中的方法，本文中描述了其中的一些。例如，可使用Kunkel方法来替代高变区残基(参见例如Kunkel et al.，Methods Enzymol.154：367-382(1987))。
寡核苷酸序列包含待改变高变区残基的一个或多个期望密码子集合。密码子集合是用于编码期望变体氨基酸的不同核苷酸三联体序列的集合。密码子集合可用如下所示依照IUB密码指定特定核苷酸或等摩尔核苷酸混合物的符号来表示。
IUB代码
G    鸟嘌呤
A    腺嘌呤
T    胸腺嘧啶
C    胞嘧啶
R    (A或G)
Y    (C或T)
M    (A或C)
K    (G或T)
S    (C或G)
W    (A或T)
H    (A或C或T)
B    (C或G或T)
V    (A或C或G)
D    (A或G或T)
N    (A或C或G或T)
例如，在密码子集合DVK中，D可以是核苷酸A或G或T；V可以是A或G或C；而K可以是G或T。此密码子集合可代表18种不同的密码子，而且可编码氨基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly和Cys。
寡核苷酸或引物集合可用标准方法合成。可通过例如固相合成来合成包含如下序列的一套寡核苷酸，所述序列代表密码子集合所提供的核苷酸三联体所有可能组合且会编码期望氨基酸集合。在某些位置具有选定核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是本领域众所周知的。具有某些密码子集合的此类核苷酸集合可使用商品化核酸合成仪(可从例如Applied Biosystems，FosterCity，CA购买)来合成，或者可通过商业途径获得(例如Life Technologies，Rockville，MD)。因此，具有特定密码子集合的合成寡核苷酸集合会通常包括具有不同序列的众多寡核苷酸，所述差异由整个序列内的密码子集合确定。如依照本发明所使用的，寡核苷酸具有容许与可变域(区)核酸模板杂交的序列且还可包含用于克隆目的的限制酶位点。
在一种方法中，可通过寡核苷酸介导的诱变来产生编码变体氨基酸的核酸序列。此技术是本领域众所周知的，如Zoller等，Nucleic Acids Res.10：6487-6504(1987)中所述。简单的说，编码变体氨基酸的核酸序列是如下产生的，将编码期望密码子集合的寡核苷酸集合与DNA模板杂交，其中模板是包含可变区核酸模板序列的单链形式质粒。杂交后，用DNA聚合酶合成模板的完整第二条互补链，其由此会掺入寡核苷酸引物，并会含有寡核苷酸集合所提供的密码子集合。
通常使用长度为至少25个核苷酸的寡核苷酸。最佳寡核苷酸会有12至15个核苷酸与编码突变的核苷酸任一侧的模板完全互补。这确保了寡核苷酸会与单链DNA模板分子正确杂交。寡核苷酸易于使用本领域已知的技术合成，诸如Crea等，PNAS USA，75：5765(1978)中所记载的。
DNA模板是由衍生自噬菌体M13载体(商品化M13mp18和M13mp19载体是合适的)的那些载体或如Viera等，Meth.Enzymol.，153：3(1987)中所述包含单链噬菌体复制起点的那些载体产生的。如此，为了产生单链模板，可将待突变的DNA***这些载体之一。Sambrook等(见上文)在第4.21-4.41节中记载了单链模板的产生。
为了改变天然DNA序列，在合适的杂交条件下将寡核苷酸与单链模板杂交。然后加入DNA聚合酶，通常是T7 DNA聚合酶或DNA聚合酶I的Klenow片段，以所述寡核苷酸作为合成的引物合成所述模板的互补链。由此形成异源双链体分子，其中DNA的一条链编码基因1的突变形式，另一条链(最初的模板)编码天然的、未改变的基因1序列。然后将此异源双链体分子转化到合适的宿主细胞中，通常是原核生物，诸如大肠杆菌JM101。培养细胞后，将它们涂布到琼脂糖平板上，并用32-磷酸盐放射性标记的寡核苷酸引物进行筛选，以鉴定包含突变DNA的细菌菌落。
可修改上文刚刚描述的方法，以便产生其中质粒的两条链均包含突变的同源双链体分子。修改如下：如上所述将单链寡核苷酸与单链模板退火。将三种脱氧核糖核苷酸：脱氧核糖腺苷酸(dATP)、脱氧核糖鸟苷酸(dGTP)和脱氧核糖胸苷酸(dTT)的混合物与称为dCTP-(aS)(可从Amersham购买)的修饰硫代脱氧核糖胞苷酸混合。将此混合物加入模板-寡核苷酸复合物中。向此混合物中添加DNA聚合酶后，产生了除突变碱基外与模板相同的一条DNA链。此外，这条新的DNA链会包含dCTP-(aS)替代dCTP，这用于保护它不受限制性内切核酸酶的消化。在用恰当的限制酶对双链异源双链体的模板链造成缺刻后，可用ExoIII核酸酶或其它适当的核酸酶消化模板链，越过包含待诱变位点的区域。然后终止反应，剩下只有部分是单链的分子。然后在存在所有四种脱氧核糖核苷三磷酸、ATP和DNA连接酶的条件下用DNA聚合酶形成完整的双链DNA同源双链体。然后可将此同源双链体分子转化到合适的宿主细胞中。
正如先前所指出的，寡核苷酸集合的序列在长度上足以与模板核酸杂交，而且还可以，但不是必须的，包含限制性位点。可由衍生自噬菌体M13载体或如Viera等，Meth.Enzymol.，153：3(1987)中所述包含单链噬菌体复制起点的载体的那些载体生成DNA模板。因此，为了生成单链模板，必须将待突变DNA***这些载体之一。Sambrook等人(见上文)在第4.21-4.41节中记载了单链模板的产生。
依照另一种方法，可如下构建文库，即提供上游和下游寡核苷酸集合，每个集合含有具有不同序列的众多寡核苷酸，即由寡核苷酸序列内所提供的密码子集合所确定的不同序列。上游和下游寡核苷酸集合，与可变域(区)模板核酸序列一起，可用于聚合酶链式反应，以产生PCR产物“文库”。PCR产物可称为“核酸盒”，因为利用已建立的分子生物学技术，可将它们与其它相关或无关的核酸序列，例如病毒外壳蛋白和二聚化结构域融合。
PCR引物序列包含高变区中溶剂可及的且高度多样的位置的一个或多个设计密码子集合。如上所述，密码子集合是用于编码期望变体氨基酸的不同核苷酸三联体序列的集合。
通过适当的筛选/选择步骤选定的符合预期标准的抗体选出物(selectant)可使用标准重组技术进行分离和克隆。
一方面，HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3序列通过保持特定位置的氨基酸恒定并改变其它位置的氨基酸而有所变化。
一方面，本发明提供了包含至少一种、至少两种或所有三种如下序列的抗体：
(i)包含序列SEQ ID NO：1的HVR-L1序列；
(ii)包含序列SEQ ID NO：2的HVR-L2序列；
(iii)包含序列SEQ ID NO：3的HVR-L3序列。
SEQ ID NO：1，2，和3的氨基酸序列关于各个HVR(即，L1、L2或L3)进行了编号，如图1A(分别为第24-34位、第50-56位、和第89-97位)和2A(分别为第24-34位、第50-56位、和第89-97位)中所标示的，编号方式与下文所描述的Kabat编号***一致。
一方面，本发明提供了包含至少一种、至少两种或所有三种如下序列的抗体：
(i)包含序列SEQ ID NO：4的HVR-H1序列；
(ii)包含序列SEQ ID NO：5的HVR-H2序列；
(iii)包含序列SEQ ID NO：6的HVR-H3序列。
SEQ ID NO：4，5，和6的氨基酸序列关于各个HVR(即，H1、H2或H3)进行了编号，如图1B(分别为第26-35位、第49-65位、和第93-102位)和2B(分别为第26-35位、第49-65位、和第93-102位)中所标示的，编号方式与下文所描述的Kabat编号***一致。
一方面，本发明提供了包含图1A和2A中所描绘的轻链HVR序列的抗体。
一方面，本发明提供了包含图1B和2B中所描绘的重链HVR序列的抗体。
本发明抗体的有些实施方案包含人源化4D5抗体(huMAb4D5-8)(
Figure A20088001151400671
抗HER2抗体，Genentech，Inc.，South San Francisco，CA，USA)(在美国专利No.6,407,213和Lee等，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93中也有提及)的轻链可变域(区)，如下文SEQ ID NO：98所描绘的。
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val
Figure A20088001151400672
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser GlyVal Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile SerSer Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
Figure A20088001151400673
Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO：98)(HVR残基以下划线标示)
在一个实施方案中，huMAb4D5-8轻链可变域(区)序列在第30、66和91位(分别为Asn、Arg和His，以粗体/斜体标示)中的一或多处有修饰。在一个实施方案中，经修饰的huMAb4D5-8序列包含第30位Ser、第66位Gly和/或第91位Ser。因而，在一个实施方案中，本发明的抗体包含如下轻链可变域(区)，其包含下文SEQ ID NO：167所描述的序列：
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr Ile Thr Cys Arg Ala Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser GlyVal Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile SerSer Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
Figure A20088001151400675
Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO：167)(HVR残基以下划线标示)
相对于huMAb4D5-8被替代的残基在上文中以粗体/斜体标示。
本发明的抗体可包含任何合适的框架可变域(区)序列，前提是对Robo4的结合活性得到实质性(基本上)保留，诸如相对于本文中所公开的本发明抗体的至少1％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或更大的结合活性。例如，在一些实施方案中，本发明的抗体包含人亚组III重链框架共有序列。在这些抗体的一个实施方案中，框架共有序列包含第71、73和/或78位替代。在这些抗体的一些实施方案中，第71位是A，第73位是T，和/或第78位是A。在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8(
Figure A20088001151400681
Genentech，Inc.，South San Francisco，CA，USA)(在美国专利No.6,407,213和5,821,337及Lee等，J.Mol.Biol.340(5)：1073-93(2004)中也有提及)的重链可变域(区)框架序列。在一个实施方案中，这些抗体进一步包含人κI轻链框架共有序列。在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8的轻链HVR序列，如美国专利No.6,407,213和5,821,337中所记载的。在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8(
Figure A20088001151400682
抗HER2抗体，Genentech，Inc.，South SanFrancisco，CA，USA)(在美国专利No.6,407,213和5,821,337及Lee等，J.Mol.Biol.340(5)：1073-93(2004)中也有提及)的轻链可变域(区)序列(SEQ ID NO：98或167)。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含huMAb4D5-8轻链和重链的框架区序列，如下文中所提供的(SEQ ID NO：9，10，168，12(轻链)和SEQ IDNO：13，14，15，16(重链))。上标/粗体的数值标示依照Kabat的氨基酸位置。
huMAb4D5-8轻链的框架序列
LC-FR1 1Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly AspArg Val Thr Ile Thr Cys23(SEQ ID NO：9)
LC-FR2 35Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr49(SEQID NO：10)
LC-FR3 57Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe ThrLeu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys88(SEQ IDNO：168)
LC-FR4 98Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys107(SEQ ID NO：12)
huMAb4D5-8重链的框架序列
HC-FR1 1Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlySer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser25(SEQ ID NO：13)
HC-FR2 36Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val48(SEQ IDNO：14)
HC-FR3 66Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu GlnMet Asn82a Ser82b Leu82c Arg83 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys92(SEQID NO：15)
HC-FR4 103Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser113(SEQ ID NO：16)
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含huMAb4D5-8轻链和重链的的经过修饰的/变体框架区序列，如下文中所提供的(SEQ ID NO：9，10，11，12(轻链)和SEQ ID NO：13，14，15，16(重链))。上标/粗体的数值标示依照Kabat的氨基酸位置。
第66位(下划线)有修饰的huMAb4D5-8轻链框架序列
LC-FR1 1Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly AspArg Val Thr Ile Thr Cys23(SEQ ID NO：9)
LC-FR2 35Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr49(SEQID NO：10)
LC-FR3 57Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe ThrLeu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys88(SEQ IDNO：11)
LC-FR4 98Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys107(SEQ ID NO：12)
第71，73和78位(下划线)有修饰的huMAb4D5-8重链框架序列
HC-FR1 1Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlySer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser25(SEQ ID NO：13)
HC-FR2 36Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val48(SEQ IDNO：14)
HC-FR3 66Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu GlnMet Asn82a Ser82b Leu82c Arg83 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys92(SEQID NO：15)
HC-FR4 103Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser113(SEQ ID NO：16)
在一个实施方案中，本发明的抗体经历亲和力成熟以获得期望的靶物结合亲和力。在一个例子中，本发明的亲和力成熟抗体在如下轻链氨基酸位置处包含替代。在一个实施方案中，变体HVR-L1 A1-A11(Kabat位置24-34)为RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：1)，其在以下位置的任意组合具有1，2，3，4或5处替代：A6(G)，A7(A)，A8(R或I)，A9(S或Y)，和A10(L)。在一个实施方案中，变体HVR-L2B1-B7(Kabat位置50-56)为SASFLYS(SEQ ID NO：2)，其在以下位置的任意组合具有1，2，3，4或5处替代：B3(T)，B4(L，N或T)，B5(E或A)，B6(A或S)，和B7(Y或删除)。在一个实施方案中，变体HVR-L3 C1-C9(Kabat位置89-97)为QQSYTTPPT(SEQ ID NO：3)，其在以下位置的任意组合具有1，2，3，4，5或6处替代：C3(P，T，F或G)，C4(F，R或N)，C5(A，S，D，F，H，N，V或G)，C6(A，D，N，L，I，M，Y或G)，C7(L，H或T)，和C8(A，M，F或S)。
在一个实施方案中，本发明的亲和力成熟抗体在如下重链氨基酸位置处包含替代。在一个实施方案中，变体HVR-H1 D1-D10(Kabat位置26-35)为GFTINGYYIH(SEQ ID NO：17)，其在以下位置的任意组合具有1，2，3，4或5处替代：D3(S)，D4(L)，D5(Y，D或K)，D9(F，L或N)，和D10(E或Q)。在一个实施方案中，变体HVR-H2 E1-E18(Kabat位置49-65)为GFIYPAGGDTDYADSVKG(SEQ ID NO：18)，其在以下位置的任意组合具有1，2，3，4或5处替代：E2(R)，E5(S)，E7(L)，E9(H，K，A或V)，和E11(A，E或I)。在一个实施方案中，HVR-H3 F1-F18(Kabat位置93-102)为ARLIGNKFGWSSYG*MDY(SEQ ID NO：19)，其中氨基酸序列中的“*”表示第F15位(Kabat位置100)删除。
在一个实施方案中，本发明的亲和力成熟抗体包含图2A中所描绘的一种、两种或三种HVR(L1、L2、和/或L3)。在一个实施方案中，本发明的亲和力成熟抗体包含图2B中所描绘的一种、两种或三种HVR(H1、H2、和/或H3)。在一个实施方案中，本发明的亲和力成熟抗体包含选自图2A和2B中所描述的HVR的一种、两种、三种、四种、五种或所有六种HVR。
在一个实施方案中，本发明的亲和力成熟抗体包含图2A中所描绘的任何序列的轻链可变区序列。在一个实施方案中，本发明的亲和力成熟抗体包含图2B中所描绘的任何序列的重链可变区序列。
在一个实施方案中，本发明的亲和力成熟抗体包含图2A中所示轻链可变区序列(包含框架序列和HVR序列)和图2B中所示相应抗体的重链可变区序列(包含框架序列和HVR序列)。
一方面，本发明提供了与上文所述任何抗体竞争与Robo4的结合的抗体。一方面，本发明提供了与上文所述任何抗体结合Robo4上相同表位的抗体。
B.基于杂交瘤的方法
本发明的单克隆抗体也可使用杂交瘤方法来制备，该方法首先记载于Kohler等，Nature，256：495(1975)，且进一步记载于例如Hongo等，Hybridoma，14(3)：253-260(1995)；Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，第2版1988)；Hammerling等，于MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981)；及Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：265-268(2006)，关于人-人杂交瘤。别的方法包括例如美国专利No.7,189,826(关于自杂交瘤细胞系生成单克隆人天然IgM抗体)中所记载的。人杂交瘤技术(Trioma技术)记载于Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)及Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology，27(3)：185-91(2005)。其它杂交瘤技术参见例如US 2006/258841；US 2006/183887(完全人抗体)；US 2006/059575；US 2005/287149；US 2005/100546；US 2005/026229；及美国专利No.7,078,492和7,153,507。
C.载体、宿主细胞、和重组方法
也可以使用重组方法来生成抗体。为了重组生产抗Robo4抗体，分离编码抗体的核酸，并将其***可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规规程容易的分离编码抗体的DNA并测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。
1.信号序列构件
本发明的抗体不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽优选是成熟蛋白质或多肽的N-末端处的信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别并加工(即受到信号肽酶切割)的。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代。为了酵母分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括糖酵母属和克鲁维氏酵母属α因子前导序列)、酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序列、或WO 90/13646中记载的信号取代。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。
2.复制起点构件
表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是能够使载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌、酵母和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子)。
3.选择基因构件
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予抗生素或其它毒素抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四环素；(b)补足营养缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是能够鉴定有能力摄取抗体编码核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、谷氨酰胺合酶(GS)、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，通过将转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR基因转化的细胞。在这些条件下，DHFR基因与任何其它共转化的核酸一起扩增。可使用内源DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。
或者，通过将转化子在含有L-甲硫氨酸亚砜亚胺(Msx)(L-methioninesulfoximine)(GS的一种抑制剂)的培养基中进行培养来鉴定经GS基因转化的细胞。在这些条件下，GS基因与任何其它共转化的核酸一起扩增。可以与上文描述的DHFR选择/扩增***组合地使用GS选择/扩增***。
或者，可以通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素、或G418的培养基中的细胞增殖来选择经编码感兴趣抗体、野生型DHFR基因、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利4,965,199。
适用于酵母的选择基因为存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb et al.，Nature 282：39(1979))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标志。Jones，Genetics 85：12(1977).酵母宿主细胞基因组中存在trp1损害随之提供了用于通过在不存在色氨酸下生长来检测转化的有效环境。类似的，用携带Leu2基因的已知质粒补足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20，622或38，626)。
此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维氏酵母属酵母。或者，报导了用于在乳酸克鲁维氏酵母中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达***。Van den Berg，Bio/Technology 8：135(1990)。还披露了适用于通过克鲁维氏酵母属的工业菌株分泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer et al.，Bio/Technology 9：968-975(1991)。
4.启动子构件
表达和克隆载体一般包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与编码抗体的核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子***、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子***、和杂合启动子诸如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌***的启动子还将包含与编码抗体的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列合适地***真核表达载体。
适用于酵母宿主的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP 73,657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。
抗体在哺乳动物宿主细胞中自载体的转录可通过例如从病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛***瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、猿猴病毒40(SV40)基因组，或从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，及从热休克启动子获得的启动子来控制，倘若此类启动子与宿主细胞***相容的话。
方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中披露了使用牛***瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的***。美国专利No.4,601,978中记载了该***的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes et al.，Nature 297：598-601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
5.增强子元件构件
常常通过将增强子序列***载体来提高高等真核细胞对编码本发明抗体的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv，Nature297：17-18(1982)。可以将增强子剪接到载体中，位于抗体编码序列的5′或3′位置，但是优选位于启动子的5′位点。
6.转录终止构件
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO 94/11026及其中披露的表达载体。
7.宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31，446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31，537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27，325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。
可以在细菌中生产全长抗体、抗体融合蛋白、和抗体片段，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时，诸如在将治疗性抗体偶联至自身在肿瘤细胞破坏方面显示出效力的细胞毒剂(例如毒素)时。全长抗体在循环中具有较长的半衰期。大肠杆菌中的生成是较快的且较合算的。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如U.S.5,648,237(Carter et.al.)，U.S.5,789,199(Joly etal.)，U.S.5,840,523(Simmons et al.)，其描述了使表达和分泌优化的翻译起始区(TIR)和信号序列。还可参见Charlton，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，pp.245-254，其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段。表达后，可以在可溶性级分中自大肠杆菌细胞浆液分离抗体，并可以通过例如蛋白A或G柱(取决于同种型)来纯化抗体。可以实施最终的纯化，其类似于用于纯化在例如CHO细胞中表达的抗体的工艺。
在原核生物以外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。啤酒糖酵母或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或常用的面包酵母在最常用的低等真核宿主微生物之中。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12，424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16，045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24，178)、K.waltii(ATCC 56，500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36，906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和***克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如Schwanniomyces occidentalis；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。关于讨论酵母和丝状真菌用于生产治疗性蛋白质的用途的综述参见例如Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)。
可选择如下的某些真菌和酵母株，其中糖基化途径已经“人源化”，导致具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的生成。参见例如Li et al.，Nat.Biotech.24：210-215(2006)(记载了巴斯德毕赤氏酵母中糖基化途径的人源化)；及Gerngross et al.，见上文。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖Autographa californica NPV的L-1变体和家蚕Bombyx mori NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。
还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、浮萍(Lemnaceae)、苜蓿(M.truncatula)、和烟草的植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利No.5,959,177；6,040,498；6,420,548；7,125,978；和6,417,429(描述用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
可使用脊椎动物细胞作为宿主，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规规程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham et al.，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub et al.，PNAS USA 77：4216(1980))；和骨髓瘤细胞细胞系，诸如NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参阅例如Yazaki and Wu，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编，HumanaPress，Totowa，NJ，2003)，pp.255-268。
用上文所述用于生产抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。
8.培养宿主细胞
可以在多种培养基中培养用于生产本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes et al.，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件(诸如温度、pH等)就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
9.抗体的纯化
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter et al.，Bio/Technology10：163-167(1992)记载了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的规程。简单的说，在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么一般首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达***的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析、疏水相互作用层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，其中亲和层析是优选的纯化步骤之一。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark etal.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.，EMBO J.5：1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHLAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。
在任何预备性纯化步骤后，包含目的抗体和污染物的混合物可进行低pH疏水相互作用层析，使用pH大约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度进行(例如大约0-0.25M盐)。
一般而言，用于制备供研究、测试、和临床中使用的抗体的各种方法学是本领域完善建立的，与上文所述方法学一致，和/或是本领域技术人员认为适合于特定的感兴趣抗体的。
V.免疫偶联物
本发明还提供了包含偶联有一种或多种细胞毒剂的本发明任何抗Robo4抗体的免疫偶联物(可互换的称为“抗体-药物偶联物”或“ADC”)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。本文涵盖抗体与一个或多个小分子毒素(诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱(maytansinoids)、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的衍生物的偶联物。
在某些实施方案中，免疫偶联物包含抗Robo4抗体和化疗剂或其它毒素。本文中(上文)描述了可用于生成免疫偶联物的化疗剂。也可使用酶活性毒素及其片段，这些酶活性毒素及其片段已在说明书中描述。
在某些实施方案中，免疫偶联物包含抗Robo4抗体和一种或多种小分子毒素，包括但不限于小分子药物，诸如加利车霉素、美登木素生物碱、多拉司他汀(dolastatin)、auristatin、单端孢霉素和CC1065及这些药物具有细胞毒活性的衍生物。此类免疫偶联物的例子在下文中有更为详细的讨论。
A.例示性的免疫偶联物
本发明的免疫偶联物(或“抗体-药物偶联物”(“ADC”))可以是下文通式I，其中抗Robo4抗体经任选的接头(L)与一个或多个药物模块(D)偶联(即共价附着)。
Ab-(L-D)p    通式I
因而，抗Robo4抗体可直接地或经接头地偶联至药物。在通式I中，p是每个抗体的平均药物模块数，其范围可以是例如每个抗体约1个到约20个药物模块，在某些实施方案中是每个抗体1个到约8个药物模块。
B.例示性的接头
本文中及美国专利申请No.20050238649A1；20050276812A1；和20070092940A1中披露了例示性的接头和药物模块。接头可以包含一种或多种接头构件。例示性的接头构件包括6-马来酰亚氨基己酰基(“MC”)、马来酰亚氨基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1羧酸酯(“SMCC”)、和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)、N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(参见例如Carlsson et al.，Biochem.J.，173，723-737(1978))、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)(参见例如美国专利4,563,304)、N-琥珀酰亚氨基4-甲基-4-[2-(5-硝基-吡啶基)-二硫代]戊酸酯(SMNP)、和聚乙二醇衍生物、甲氧基-聚氧化乙烯(mPEO)。本领域知道多种接头构件，下文也描述了一些。
接头可以是便于在细胞中释放药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
在有些实施方案中，接头构件可以包含将抗体连接至另一接头构件或药物模块的“延伸物单元”(stretcher unit)。例示性的延伸物单元显示于下文(其中波形线指示共价附着至抗体、另一接头构件或药物模块的位点)：
Figure A20088001151400811
在有些实施方案中，接头构件可以包含氨基酸单元。在一个这样的实施方案中，氨基酸单元容许蛋白酶切割接头，由此便于在暴露于胞内蛋白酶(诸如溶酶体酶)后从免疫偶联物释放药物。参见例如Doronina等(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784。例示性的氨基酸单元包括但不限于二肽、三肽、四肽、和五肽。例示性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)；丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)；或N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。例示性的三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可以包含天然存在的氨基酸残基，以及次要氨基酸(minor amino acid)和非天然存在氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸单元可以在它们对特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或血浆蛋白酶)的酶促切割的选择性方面进行设计和优化。
在有些实施方案中，接头构件可以包含将抗体连接(或是直接的或是通过延伸物单元和/或氨基酸单元)至药物模块的“间隔物”单元。间隔物单元可以是“自我牺牲的”(self-immolative)或“非自我牺牲的”。“非自我牺牲的”间隔物单元指间隔物单元的部分或整体在ADC的酶促(蛋白水解)切割后保持结合于药物模块的间隔物单元。非自我牺牲的间隔物单元的例子包括但不限于甘氨酸间隔物单元和甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。还涵盖对序列特异性酶促切割敏感的肽间隔物的其它组合。例如，肿瘤细胞相关蛋白酶对含甘氨酸-甘氨酸间隔物单元的ADC的酶促切割将导致甘氨酸-甘氨酸-药物模块从ADC的剩余部分释放。在一个这样的实施方案中，甘氨酸-甘氨酸-药物模块然后在肿瘤细胞中进行分开的水解步骤，如此从药物模块切割甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。
“自我牺牲的”间隔物单元容许释放药物模块而没有分开的水解步骤。在某些实施方案中，接头的间隔物单元包含对氨基苄基单元。在一个这样的实施方案中，将对氨基苯甲醇经酰胺键附着至氨基酸单元，并且在苯甲醇与细胞毒剂之间生成氨基甲酸酯、甲基氨基甲酸酯、或碳酸酯。参见例如Hamann等(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15：1087-1103。在一个实施方案中，间隔物单元是对氨基苄氧羰基(PAB)。在某些实施方案中，对氨基苄基单元的亚苯基部分是用Qm取代的，其中Q是-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-卤素、-硝基、或-氰基；而m是范围为0-4的整数。自我牺牲的间隔物单元的例子进一步包括但不限于在电子上与对氨基苯甲醇相似的芳香族化合物(参见例如US 2005/0256030A1)，诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)和邻位或对位氨基苄基乙缩醛。可以使用在酰胺键水解后发生环化的间隔物，诸如取代的和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等，Chemistry Biology，1995，2，223)；适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环体系(Storm，等，J.Amer.Chem.Soc.，1972，94，5815)；及2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等，J.Org.Chem.，1990，55，5867)。消除在甘氨酸a位取代的含胺药物(Kingsbury等，J.Med.Chem.，1984，27，1447)也是可用于ADC的自我牺牲的间隔物的例子。
在一个实施方案中，间隔物单元是下文所示分支的双(羟甲基)苯乙烯(BHMS)单元，其可用于掺入和释放多个药物。
Figure A20088001151400831
其中Q是-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-卤素、硝基、或氰基；m是范围为0-4的整数；n是0或1；而p的范围是1到约20。
接头可以包含任何一种或多种上述接头化合物。在某些实施方案中，接头在下述ADC通式II中显示在方括号内
Ab-([Aa-Ww-Yy]-D)p    通式II
其中A是延伸物单元，而a是0到1的整数；W是氨基酸单元，而w是0到12的整数；Y是间隔物单元，而y是0、1、或2；且Ab、D、和p如上文通式I的定义。此类接头的例示性实施方案记载于US 2005-0238649A1，明确收入本文作为参考。
显示了下文通式II的ADC背景中的例示性接头构件及其组合：
Figure A20088001151400832
Figure A20088001151400841
接头构件，包括延伸物、间隔物、和氨基酸单元，可以通过本领域已知方法合成，诸如US 2005-0238649A1中所记载的。
C.例示性的药物模块
1.美登素和美登木素生物碱
在有些实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个美登木素生物碱分子的本发明抗体。美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝***抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利No.3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533，通过述及将其公开内容明确收入本文。
美登素化合物通过抑制有丝***过程中的微管蛋白形成抑制细胞增殖，所述的抑制有丝***过程中的微管蛋白形成通过抑制微管蛋白，即微管素的聚合来进行(Remillard等(1975)Science 189：1002-1005；US 5208020)。美登素和美登木素生物碱具有高度细胞毒性，但其在癌症疗法中的临床应用因其主要由于对肿瘤的选择性差导致的严重的全身副作用而非常有限。因对中枢神经***和胃肠***的严重不良作用而已中断了使用美登素的临床试验((Issel等，(1978)Can.Treatment.Rev.5：199-207)。
美登木素生物碱药物模块在抗体-药物偶联物中是有吸引力的药物模块，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰或衍生化来制备；(ii)易于用适于通过非二硫化物接头偶联至抗体的官能团衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。
适于用作美登木素生物碱药物模块的美登素化合物是本领域公知的，而且可以依照已知方法从天然来源分离，或是使用遗传工程技术生产(参见Yu等(2002)PNAS 99：7968-7973)。美登醇和美登醇类似物也可以依照已知方法合成制备。美登木素生物碱药物模块的例示性实施方案包括：DM1；DM3；和DM4，正如本文中下文所公开的。
正如其它药物部分一样，对本发明的化合物而言，关注美登木素生物碱药物部分的所有立体异构体，即在D的手性碳上的R和S构型的任意组合。在一个实施方案中，美登木素生物碱药物部分(D)具有下列立体化学：
Figure A20088001151400851
美登木素生物碱药物部分的典型实施方案包括：DM1，(CR2)m＝CH2CH2；DM3，(CR2)m＝CH2CH2CH(CH3)；和DM4，(CR2)m＝CH2CH2C(CH3)2，它们具有如下结构：
Figure A20088001151400861
在改善靶向抗体的治疗指数的尝试中，已经将美登素和美登木素生物碱偶联至特异性结合肿瘤细胞抗原的抗体。例如下列专利公开了包含美登木素生物碱的免疫偶联物及其治疗用途：美国专利No.5,208,020；5,416,064；及欧洲专利EP 0 425 235B1，明确将其公开内容收入本文作为参考。Liu等，PNASUSA 93：8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示出抗肿瘤活性。Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳腺癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3x105个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了程度与游离美登木素生物碱药物相似的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子所偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低***性细胞毒性。
抗体-美登木素生物碱偶联物通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接来制备，这没有显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性方面显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管甚至每个抗体偶联一分子毒素也会较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利No.5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱。优选的美登木素生物碱是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。
本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利No.5,208,020；或欧洲专利0 425 235B1；及Chari等，CancerResearch 52：127-131(1992)。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，其中二硫化物和硫醚基团是优选的。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173：723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫化物连接。
根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成连接。
2.Auristatin，多拉司他汀
在有些实施方案中，免疫偶联物包含与多拉司他汀(dolastatin)或多拉司他汀肽类似物或衍生物(例如auristatin)(美国专利No.5,635,483；5,780,588)偶联的本发明抗体。多拉司他汀和auristatin已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞***(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)且具有抗癌(美国专利No.5663149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物模块可经由肽药物模块的N(氨基)末端或C(羧基)末端附着于抗体(WO02/088172)。
例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin(monomethylauristatin)药物模块DE和DF，披露于Senter等，Proceedings of the American Association for Cancer Research，卷45，摘要号623，2004年3月28日，明确将其公开内容完整收入本文作为参考。
肽药物模块可以选自下文通式DE和DF：
Figure A20088001151400881
其中DE和DF的波形线指示抗体或抗体-接头构件的共价附着位点，且每个位置是独立的：
R2选自H和C1-C8烃基；
R3选自H、C1-C8烃基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烃基-芳基、C1-C8烃基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烃基-(C3-C8杂环)；
R4选自H、C1-C8烃基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烃基-芳基、C1-C8烃基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烃基-(C3-C8杂环)；
R5选自H和甲基；
或者R4与R5一起形成碳环且具有通式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb独立地选自H、C1-C8烃基和C3-C8碳环，而n选自2、3、4、5和6；
R6选自H和C1-C8烃基；
R7选自H、C1-C8烃基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烃基-芳基、C1-C8烃基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烃基-(C3-C8杂环)；
每个R8独立地选自H、OH、C1-C8烃基、C3-C8碳环和O-(C1-C8烃基)；
R9选自H和C1-C8烃基；
R10选自芳基或C3-C8杂环；
Z为O、S、NH或NR12，其中R12为C1-C8烃基；
R11选自H、C1-C20烃基、芳基、C3-C8杂环、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；
m是范围为1-1000的整数；
R13为C2-C8烃基；
R14为H或C1-C8烃基；
R15每次出现独立为H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烃基；
R16每次出现独立为H、C1-C8烃基或-(CH2)n-COOH；
R18选自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8杂环)和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳环)；且
n是范围为0到6的整数。
在一个实施方案中，R3、R4和R7独立为异丙基或仲丁基，而R5为-H或甲基。在一个例示性的实施方案中，R3和R4各自为异丙基，R5为-H，而R7为仲丁基。
在又一个实施方案中，R2和R6各自为甲基，而R9为-H。
在又一个实施方案中，R8每次出现为-OCH3。
在一个例示性的实施方案中，R3和R4各自为异丙基，R2和R6各自为甲基，R5为-H，R7为仲丁基，R8每次出现为-OCH3，而R9为-H。
在一个实施方案中，Z为-O-或-NH-。
在一个实施方案中，R10为芳基。
在一个例示性的实施方案中，R10为-苯基。
在一个例示性的实施方案中，若Z为-O-，则R11为-H、甲基或叔丁基。
在一个实施方案中，若Z为-NH，则R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-N(R16)2，而R16为-C1-C8烃基或-(CH2)n-COOH。
在另一个实施方案中，若Z为-NH，则R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-SO3H。
通式DE的一种例示性auristatin实施方案是MMAE，其中波形线指示共价附着至抗体-药物偶联物的接头(L)：
Figure A20088001151400901
通式DF的一种例示性auristatin实施方案是MMAF，其中波形线指示共价附着至抗体-药物偶联物的接头(L)(参见US 2005/0238649及Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124)：
其它药物模块包括以下MMAF衍生物，其中波形线指示共价附着至抗体-药物偶联物的接头(L)：
Figure A20088001151400921
一方面，可以将亲水性基团在R11处附着于药物模块，所述亲水性基团包括但不限于三乙二醇酯(triethylene glycol ester，TEG)，如上所述。不限于任何特定理论，所述亲水性基团有助于药物模块的内在化和不聚集(non-agglomeration)。
包含auristatin/多拉司他汀或其衍生物的通式I ADC的例示性实施方案记载于US 2005-0238649A1及Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124，明确收入本文作为参考。包含MMAE或MMAF及各种接头构件的通式I ADC的例示性实施方案具有如下结构和缩写(其中“Ab”是抗体；p是1到约8；“Val-Cit”是缬氨酸-瓜氨酸二肽；而“S”是硫原子)：
Figure A20088001151400931
包含MMAF及各种接头构件的通式I ADC的例示性实施方案进一步包括Ab-MC-PAB-MMAF和Ab-PAB-MMAF。有趣的是，包含经不可蛋白水解切割的接头附着于抗体的MMAF的免疫偶联物显示出具有与包含经可蛋白水解切割的接头附着于抗体的MMAF的免疫偶联物相当的活性。参见Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124。在这种情况中，认为药物释放是由细胞中的抗体降解来实现的。同上。
典型的是，基于肽的药物模块可通过在两个或更多氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备(参见E.和K.Lübke，“The Peptides”，卷1，pp 76-136，1965，Academic Press)。auristatin/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方法来制备：US 2005-0238649A1；美国专利No.5635483；美国专利No.5780588；Pettit等(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit等(1998)Anti-CancerDrug Design 13：243-277；Pettit，G.R.等，Synthesis，1996，719-725；Pettit等(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15：859-863；及Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7)：778-784。
具体而言，通式DE的auristatin/多拉司他汀药物模块诸如MMAF及其衍生物可以使用US 2005-0238649A1及Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124中记载的方法来制备。通式DE的auristatin/多拉司他汀药物模块诸如MMAE及其衍生物可以使用Doronina等(2003)Nat.Biotech.21：778-784中记载的方法来制备。可以通过常规方法方便地合成药物-接头模块MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF、和MC-vc-PAB-MMAE，例如Doronina等(2003)Nat.Biotech.21：778-784及美国专利公开文本No.2005/0238649A1中所记载的，然后将它们偶联至感兴趣的抗体。
3.加利车霉素
另一种感兴趣的免疫偶联物包含与一个或多个加利车霉素分子偶联的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利No.5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；5,877,296(都属于美国Cyanamid公司)。可使用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θI 1(Hinman et al.，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode et al.，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可以与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些药剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒性效果。
4.其它细胞毒剂
可与本发明抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利5,053,394、5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利5,877,296)。
可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。
本发明还设想了抗体和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。
为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。
可以已知方式将放射性或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用涉及例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc99m或I123、Re186、Re188和In111。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57(1978))可用于掺入碘-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》(Chatal，CRC Press，1989)详细记载了其它方法。
可以将本发明的抗Robo4抗体偶联至纳米微粒剂，继而可以将其偶联至细胞毒性模块。合适的纳米微粒剂包括但不限于微泡(参见Ellegala等，Circulation 108：336-341(2003))(也称作声学活性脂球体(AAL))(参见Tartis等，Ultrasound Med.Biol.32(11)：1771-80(2006))、超顺磁剂、脂质体、全氟化碳纳米微粒乳剂(WO 2005104051)、和树状聚体(参见Caruthers等，Methods inMolecular Medicine，124：387-400(2006)及其中引用的参考文献，在此通过述及将所有参考文献完整收入本文)。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利5,208,020)。
本发明的化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC：商品化(如购自Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。见2003-2004年度应用手册和产品目录(Applications Handbookand Catalog)第467-498页。
5.药物载荷
药物载荷(loading)由p表示，即通式I、Ia、Ia’或II的分子中每个抗体的平均药物模块数。药物载荷的范围可以为每个抗体1-20个药物模块(D)。通式I的ADC包括偶联有一定范围(1-20个)药物模块的抗体的集合。来自偶联反应的ADC制备物中每个抗体的平均药物模块数可以通过常规手段来表征，诸如质谱、ELISA测定法、和HPLC。还可以测定ADC在p方面的定量分布。在有些情况中，将p为某数值时的同质ADC从具有其它药物载荷的ADC中分离、纯化、和表征可以通过诸如反相HPLC或电泳的手段来实现。
对于有些抗体-药物偶联物，p可能受到抗体上附着位点数目的限制。例如，若附着是半胱氨酸硫醇，正如上文例示性实施方案中的那样，则抗体可能只有一个或数个半胱氨酸硫醇基，或者可能只有一个或数个有足够反应性的硫醇基，可附着接头。在某些实施方案中，较高的药物载荷，例如p＞5，可引起某些抗体-药物偶联物的聚集、不溶性、毒性、或丧失细胞通透性。在某些实施方案中，本发明ADC的药物载荷的范围为1到约8；约2到约6；约3到约5；约3到约4；约3.1到约3.9；约3.2到约3.8；约3.2到约3.7；约3.2到约3.6；约3.3到约3.8；或约3.3到约3.7。事实上，对于某些ADC已经显示了每个抗体的药物模块的最佳比率可以为小于8，可以为约2到约5。参见US2005-0238649A1(完整收入本文作为参考)。
在某些实施方案中，在偶联反应中少于理论最大值的药物模块偶联至抗体。抗体可包含例如赖氨酸残基，其不与药物-接头中间物或接头试剂起反应，如下文所讨论的。一般而言，抗体不包含许多游离的和反应性的半胱氨酸硫醇基，其可连接药物模块；事实上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇基以二硫桥形式存在。在某些实施方案中，可以在部分或完全还原性条件下用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)还原抗体以产生反应性半胱氨酸硫醇基。在某些实施方案中，将抗体置于变性条件以暴露反应性亲核基团，诸如赖氨酸或半胱氨酸。
ADC的载荷(药物/抗体比率)可以以不同方式来控制，例如通过：(i)限制药物-接头中间物或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制偶联反应的时间或温度，(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原性条件，(iv)通过重组技术对抗体的氨基酸序列进行工程改造，使得半胱氨酸残基的数目和位置为了控制接头-药物附着的数目和/或位置而进行改变(诸如如本文中和WO2006/034488(完整收入本文作为参考)中所述而制备的thioMab或thioFab)。在本发明的一个实施方案中，本发明抗体的氨基酸残基被半胱氨酸残基替代。在一个实施方案中，抗体重链Fc区的第118位氨基酸是半胱氨酸或被半胱氨酸残基替代(其中118指依照EU编号方式的抗体Fc区氨基酸位置，参见Kabat，E.A.et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest(U.S.Dept.of Health and Hum.Serv.，Bethesda(1991))。在一个实施方案中，抗体Fc区第118位半胱氨酸残基(EU编号方式)共价附着于药物模块或可检测标记物，诸如本文中所公开的药物模块或可检测标记物。在图6A中，重链Fc区中以粗体和下划线标示的丙氨酸就是用半胱氨酸替代以生成thioMAb的位置。
应当理解，若超过一个亲核基团与药物-接头中间物或者与接头试剂和接下来的药物模块试剂起反应，则所得产物是具有一个或多个药物模块附着于抗体之分布的ADC化合物混合物。可以通过对抗体特异性的和对药物特异性的双重ELISA抗体测定法自混合物计算每个抗体的平均药物数。混合物中的各种ADC分子可以通过质谱来鉴定，并通过HPLC来分离，例如疏水相互作用层析(参见例如Hamblett，K.J.等，“Effect of drug loading on thepharmacology，pharmacokinetics，and toxicity of an anti-CD30 antibody-drugconjugate，”摘要号624，American Association for Cancer Research，2004Annual Meeting，2004年3月27-31日，Proceedings of the AACR，卷45，March2004；Alley，S.C.等，“Controlling the location of drug attachment inantibody-drug conjugates，”摘要号627，American Association for CancerResearch，2004 Annual Meeting，2004年3月27-31日，Proceedings of the AACR，卷45，March 2004)。在某些实施方案中，可以通过电泳或层析从偶联混合物中分离具有均一载荷值的同质ADC。
D.抗体-药物偶联物的代谢物
本文中所描述的ADC化合物的体内代谢产物也落在本发明的范围内，就此类产物相对于现有技术是新颖的且非显而易见的而言。此类产物可源自例如所施用化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化、酶促切割、诸如此类。因而，本发明包括由如下过程生成的新颖的且非显而易见的化合物，所述过程包括使本发明的化合物接触哺乳动物一段时间，其足以产生本发明化合物的代谢产物。
代谢产物典型地是如下制备的，即制备放射性标记的(例如14C或3H)ADC，以可检测剂量(例如大于大约0.5mg/kg)将其胃肠外施用于哺乳动物，诸如大鼠、小鼠、豚鼠、猴或人，容许足够时间让代谢发生(典型的是大约30秒至30小时)，并自尿液、血液或其它生物学样品分离它的转化产物。这些产物是易于分离的，因为它们是带标记物的(其它的通过使用能够结合代谢物中幸存的结合表位的抗体来分离)。代谢物结构以常规方式来测定，例如通过MS、LC/MS或NMR分析。一般而言，代谢物的分析是以与本领域技术人员公知的常规药物代谢研究相同的方式进行的。转化产物在用于本发明ADC化合物的治疗性剂量给药的诊断测定法中是有用的，只要没有在体内在其它情况中找到它们。
VI.制备免疫偶联物的方法
在本发明的抗体-药物偶联物(ADC)中，抗体(Ab)经接头(L)偶联有一个或多个药物模块(D)，例如大约1个到大约20个药物模块每个抗体。可以采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I、Ia、Ia’、或II的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应形成Ab-L，接着与药物模块D反应；和(2)药物模块的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应形成D-L，接着与抗体的亲核基团反应。经后一种路径制备通式I的ADC的例示性方法记载于美国专利申请No.20050238649A1，明确收入本文作为参考。
抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基；(ii)侧链胺基，例如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。胺、硫醇、和羟基是亲核的，能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt脂、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫化物，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)处理使抗体完全或部分还原，从而具有与接头试剂偶联的反应性。每个半胱氨酸桥理论上会形成两个反应性硫醇亲核体。或者，可经由赖氨酸残基的修饰将别的亲核基团引入抗体，例如通过使赖氨酸残基与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)起反应，导致胺转变为硫醇。可以通过导入一个、两个、三个、四个、或更多个半胱氨酸残基(例如通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的变体抗体)而将反应性硫醇基导入抗体。
还可通过抗体上的亲电子基团(诸如醛或酮羰基)与接头试剂或药物上的亲核基团之间的反应来生成本发明的抗体-药物偶联物。接头试剂上的有用亲核基团包括但不限于酰肼(hydrazide)、肟(oxime)、氨基(amino)、肼(hydrazine)、缩氨基硫脲(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯(hydrazine carboxylate)、和芳基酰肼(arylhydrazide)。在一个实施方案中，修饰抗体以导入能够与接头试剂或药物上的亲核取代基起反应的亲电子模块。在另一个实施方案中，可以用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物模块的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的连接，或者可以用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以在抗体中生成羰基(醛基和酮基)，它可与药物上的适宜基团反应(Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，包含N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体可以与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan和Stroh，(1992)Bioconjugate Chem.3：138-146；US 5362852)。这样的醛可与药物模块或接头亲核体反应。
药物模块上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基、和马来酰亚胺基团。
本发明的化合物明确涵盖但不限于用如下交联试剂制备的ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们可通过商业途径获得(例如Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A；参见2003-2004年度应用手册和产品目录(2003-2004Applications Handbook and Catalog)第467-498页)。
还可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备包含抗体和细胞毒剂的免疫偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。
或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。重组DNA分子可以包含各自编码偶联物的抗体和细胞毒部分的区域，彼此或是毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。
本发明的化合物包括半胱氨酸改造的抗体，其中亲代抗体的一种或多种氨基酸被游离半胱氨酸氨基酸替代。半胱氨酸改造的抗体包含一个或多个具有0.6-1.0范围的巯基反应值(thiol reactivity value)的游离半胱氨酸氨基酸。游离半胱氨酸氨基酸为已经被改造进入亲代抗体中并且不为二硫键的组成部分的半胱氨酸残基。
在一个方面中，通过包括下列步骤的方法制备半胱氨酸改造的抗体：
(a)用半胱氨酸替代亲代抗体的一种或多种氨基酸残基；和
(b)通过使半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应试剂反应测定半胱氨酸改造的抗体的巯基反应性(thiol reactivity)。
半胱氨酸改造的抗体可以比亲代抗体更具与巯基-反应试剂的反应性。
游离半胱氨酸氨基酸残基可以位于重链或轻链中或恒定域或可变域(区)中。还可以通过用一个或多个半胱氨酸氨基酸替代抗体片段的氨基酸来改造抗体片段，例如Fab，以便形成半胱氨酸改造的抗体片段。
本发明的另一个方面提供了制备半胱氨酸改造的抗体的方法，包括：
(a)将一个或多个半胱氨酸氨基酸引入亲代抗体以便生成半胱氨酸改造的抗体；和
(b)测定半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应试剂的巯基反应性；
其中半胱氨酸改造的抗体比亲代抗体更具与巯基-反应试剂的反应性。
制备半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(a)可以包含：
(i)诱变编码半胱氨酸改造的抗体的核酸序列；
(ii)表达半胱氨酸改造的抗体；和
(iii)分离和纯化半胱氨酸改造的抗体。
制备半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)可以包含表达选自噬菌体或噬菌粒颗粒的病毒颗粒上的半胱氨酸改造的抗体。
制备半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)还可以包含：
(i)使半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应性亲和试剂反应而生成亲和标记的半胱氨酸改造的抗体；和
(ii)测定亲和标记的半胱氨酸改造的抗体与俘获介质的结合。
本发明的另一个方面为筛选带有高反应性的未配对的半胱氨酸氨基酸的半胱氨酸改造的抗体的巯基反应性的方法，包含：
(a)将一个或多个半胱氨酸氨基酸导入亲代抗体以便产生半胱氨酸改造的抗体；
(b)使半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应性亲和试剂反应而生成亲和标记的半胱氨酸改造的抗体；和
(c)测定亲和标记的半胱氨酸改造的抗体与俘获介质的结合；和
(d)测定半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应试剂的巯基反应性。
筛选半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(a)可以包含：
(i)诱变编码半胱氨酸改造的抗体的核酸序列；
(ii)表达半胱氨酸改造的抗体；和
(iii)分离和纯化半胱氨酸改造的抗体。
筛选半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)可以包含表达选自噬菌体或噬菌粒颗粒的病毒颗粒上的半胱氨酸改造的抗体。
筛选半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)还可以包含：
(i)使半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应性亲和试剂反应而生成亲和标记的半胱氨酸改造的抗体；和
(ii)测定亲和标记的半胱氨酸改造的抗体与俘获介质的结合。
半胱氨酸改造的抗体可以用于治疗癌症并且包括对细胞表面和跨膜受体和肿瘤相关抗原(TAA)具有特异性的各种抗体。这样的抗体可以用作裸抗体(未与药物或标记部分偶联)或用作式I、Ia、Ia’或II抗体-药物偶联物(ADC)。
制备和筛选半胱氨酸改造的抗体的方法的实施方案包括：其中亲代抗体为抗体片段，诸如hu4D5Fabv8。亲代抗体还可以为包含清蛋白-结合肽序列(albumin-binding peptide)(ABP)的融合蛋白。
本发明的半胱氨酸改造的抗体可以以位点特异性和有效的方式与巯基-反应试剂偶联。巯基-反应试剂可以为多官能连接基试剂(multifunctionallinker reagent)、俘获标记试剂(capture label reagent)、荧光团试剂(fluorophorereagent)或药物-连接基中间体(drug-linker intermediate)。
可以用可检测标记来标记半胱氨酸改造的抗体，使其固定在固相支持体上和/或与药物部分偶联。
本发明的另一个方面在于包含半胱氨酸改造的抗体(cysteine engineeredantibody)(Ab)和药物部分(drug moiety)(D)的抗体-药物偶联物化合物，其中半胱氨酸改造的抗体通过一个或多个游离半胱氨酸氨基酸经连接基部分(linker moiety)(L)与D结合；所述化合物即具有式Ia的化合物：
Ab(LD)p    Ia
其中p为1、2、3或4；且其中所述的半胱氨酸改造的抗体是通过包含用一个或多个游离半胱氨酸氨基酸替代亲代抗体的一种或多种氨基酸残基的方法制备的。药物部分包括，但不限于美登木素生物碱、auristatin、多拉司他汀、单端孢霉烯(trichothecene)、CC1065、加利车霉素(calicheamicin)和其它烯二炔类抗生素、紫杉烷(taxane)、蒽环类抗生素(anthracycline)和它们的立体异构体、同电子排列体(isostere)、类似物或衍生物。例示性的药物部分包括DM1、MMAE和MMAF。例示性的抗体-药物偶联物列于美国专利申请No.20070092940A1。
式Ia的抗体-药物偶联物可以进一步包含清蛋白-结合肽(albumin-bindingpeptide)(ABP)序列；该组合物具有式Ia’：
ABPAb(LD)p    Ia’
构成含ABP序列的融合蛋白的本发明抗体教导于：(i)Dennis等(2002)JBiol Chem.277：35035-35043，表III和表IV，第35038页；(ii)US 20040001827，第[0076]段，SEQ ID NO：9-22；和(iii)WO 01/45746，第12-13页，SEQ ID NO：z1-z14，并且将它们全部收入本文作为参考。
VII.半胱氨酸改造的抗体(ThioMAb和ThioFab)
本发明的化合物包括半胱氨酸改造的抗体，其中野生型或亲代抗体中的一种或多种氨基酸被半胱氨酸氨基酸替代。由此可以改造任意形式的抗体，即使其突变。例如，可以将亲代Fab抗体片段改造成半胱氨酸改造的Fab，在本文中称作“ThioFab”。类似地，可以将亲代单克隆抗体改造成“ThioMab”。应注意单一位点突变在ThioFab中产生单一改造的半胱氨酸残基(singleengineered cysteine residue)，而单一位点突变在ThioMab中产生两个改造的半胱氨酸残基，这是因IgG抗体的二聚化特性所致。评价被半胱氨酸(Cys)残基替代的(“改造的”)突变体的新引入的改造的半胱氨酸巯基反应性。巯基反应值为0-1.0范围内的相对数值范围并且可以测定任意半胱氨酸改造的抗体的该值。本发明半胱氨酸改造的抗体的巯基反应值在0.6-1.0；0.7-1.0；或0.8-1.0的范围。
本发明的设计、选择和制备方法能够使半胱氨酸改造的抗体能够与亲电子官能基(functionability)反应。这些方法进一步能够使抗体偶联物化合物，诸如抗体-药物偶联物(ADC)化合物与药物分子在指定、设计、选择的位点上反应。抗体表面上的反应性半胱氨酸残基能够通过巯基反应基，诸如马来酰亚胺或卤代乙酰基特异性地偶联药物部分。Cys残基的巯基官能基与马来酰亚胺基的亲核反应性约高于蛋白质中任意其它氨基酸官能基，诸如赖氨酸残基的氨基或N-末端氨基约1000倍。碘乙酰试剂和马来酰亚胺试剂中的巯基特异性官能基可以与胺基反应，但需要更高的pH(＞9.0)和更长的反应时间(Garman，1997，Non-Radioactive Labelling：A Practical Approach，AcademicPress，London)。
本发明半胱氨酸改造的抗体优选保持其野生型亲代抗体对应物的抗原结合能力。因此，半胱氨酸改造的抗体能够结合，优选特异性结合抗原。这类抗原包括：例如肿瘤-相关抗原(TAA)、细胞表面受体蛋白和其它细胞表面分子、跨膜蛋白、信号传导蛋白、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与组织发育或分化相关(例如，已知或怀疑在功能上相关)的分子、淋巴因子、细胞因子、涉及细胞周期调节的分子、涉及血管发生的分子和与血管发生相关(例如，已知或怀疑在功能上相关)的分子。肿瘤-相关抗原可以为分化簇因子(即CD蛋白)。能够结合半胱氨酸改造的抗体的抗原可以为上述类型之一的亚组中的成员，其中所述类型中另一亚组包含具有不同特性的其它分子/抗原(就所关注的抗原而言)。
亲代抗体还可以是人或人源化抗Robo4抗体或Fab，其具有任何一种、两种、三种、四种、五种或六种本文中所公开的HVR序列。本发明的半胱氨酸改造的抗体可以位点-特异性和有效地与巯基-反应试剂偶联。巯基-反应试剂可以为多官能连接基试剂(multifunctional linker reagent)；俘获物，即亲和、标记试剂(例如生物素-连接基试剂)；检测试剂(例如荧光团试剂)；固相固定化试剂(例如SEPHAROSETM、聚苯乙烯或玻璃)或药物-连接基中间体(drug-linker intermediate)。巯基-反应试剂的一个实例为N-乙基马来酰亚胺(NEM)。在一个典型的实施方案中，ThioFab与生物素-连接基试剂反应得到生物素化的ThioFab，通过这种方式可以检测和测定改造的半胱氨酸残基的存在和反应性。ThioFab与多官能连接基试剂反应得到带有可以与药物模块(moiety)试剂或其它标记进一步反应的官能化连接基的ThioFab。ThioFab与药物-连接基中间体反应得到ThioFab药物偶联物。
这类手段可以应用于偶联其它巯基反应试剂，其中反应基为例如马来酰亚胺、碘乙酰胺、吡啶基二硫化物或其它巯基反应偶联配偶体(Haugland，2003，Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，Molecular Probes，Inc.；Brinkley，1992，Bioconjugate Chem.3：2；Garman，1997，Non-Radioactive Labelling：A Practical Approach，Academic Press，London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1：2；Hermanson，G.in BioconjugateTechniques(1996)Academic Press，San Diego，pp.40-55，643-671)。所述的配偶体可以为细胞毒性剂(例如毒素，诸如多柔比星(doxorubicin)或百日咳毒素)；荧光团，诸如荧光染料类荧光素或若丹明；用于成像的螯合剂或放射性治疗金属；肽基或非-肽基标记或检测标记；或清除-改进剂(clearance-modifyingagent)，诸如聚乙二醇的不同异构体；结合第三种成分的肽或另一种碳水化合物或亲脂性试剂。
在例示性抗体片段上鉴定的位点主要位于抗体的恒定域中，其在所有抗体种类之间为充分保守的。这些位点可广泛适用于其它抗体，而无需进一步进行结构设计或有关特异性抗体结构的知识，并且不会干扰对抗体可变域(区)而言固有的抗原结合特性。
PHESELECTOR测定法(用于选择反应性硫醇的噬菌体ELISA，披露于WO2006/034488，完整收入本文作为参考)容许以ELISA噬菌体形式检测抗体中反应性半胱氨酸基团。WO2006/034488中详述了如下过程，在孔表面上包被感兴趣的蛋白质(例如抗体)，随后与噬菌体颗粒一起温育，添加HRP标记的二抗，并检测吸光度。可以以快速、有力和高流通量方式筛选噬菌体上展示的突变蛋白。可以使用与从抗体或其它蛋白的随机蛋白质-噬菌体文库鉴定游离Cys掺入的适当反应性位点相同的方法生成半胱氨酸改造抗体的文库并且进行结合选择。这项技术包括使噬菌体上展示的半胱氨酸突变蛋白与也为硫醇反应性的亲和试剂或报告基团反应。
可以用于治疗癌症的半胱氨酸改造的抗体包括，但不限于针对细胞表面受体和肿瘤-相关抗原(TAA)的抗体。这类抗体可以用作裸抗体(未与药物或标记部分偶联)或用作式I、Ia、Ia’、或II抗体-药物偶联物(ADC)。肿瘤-相关抗原为本领域中公知的并且可以制备它们以便用于使用本领域众所周知的方法和信息生产抗体。在发现用于癌症诊断和疗法的有效细胞靶标的尝试中，研究人员寻求鉴定与一种或多种正常非癌细胞相比在一种或多种特定类型的癌细胞表面上特异性表达的或与与癌症无关的非内皮细胞相比在血管发生性细胞(诸如血管内皮细胞)表面上表达的跨膜多肽，或肿瘤相关多肽。与非癌性细胞或非血管发生性细胞相比，通常这类肿瘤-相关多肽更大量地在癌细胞或血管发生性细胞表面上表达。对这类肿瘤-相关细胞表面抗原多肽的鉴定已经使人们能够特异性靶向癌细胞或血管发生性细胞，通过基于抗体的疗法对其进行破坏。
在又一个实施方案中，可以将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如亲合素)。
VIII.使用抗Robo4抗体的治疗方法
本发明涵盖本发明的抗Robo4抗体(包括例如裸露的抗Robo4抗体和ADC)可用于治疗各种疾病或病症，例如以肿瘤或血管发生相关抗原(诸如Robo4)的过表达为特征的各种疾病或病症。高度增殖性病症的例示性疾患包括与异常的或不想要的内皮细胞增殖有关的病理状况，诸如以下病症中的异常的或不想要的血管细胞增殖，所述病症包括但不限于癌症、血管发生和与实体瘤和转移、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管疾病诸如增殖性视网膜病例如糖尿病性视网膜病、与年龄相关的黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、对移植的角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、和银屑病有关(例如被正在经历该病症的组织内的内皮细胞增殖所增强)的病症。
可以在携带肿瘤的高级灵长类和人体临床试验中进一步测试在动物模型和基于细胞的测定法中鉴定的抗Robo4抗体和ADC化合物。可以设计人体临床试验以测试本发明的抗Robo4单克隆抗体或免疫偶联物在经历细胞增殖性病症的患者中的功效，所述细胞增殖性病症包括但不限于与异常的或不想要的内皮细胞增殖有关的病理状况，诸如以下病症中的异常的或不想要的血管细胞增殖，所述病症包括但不限于癌症、血管发生和与实体瘤和转移、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管疾病诸如增殖性视网膜病例如糖尿病性视网膜病、与年龄相关的黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、对移植的角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、和银屑病有关(例如被正在经历该病症的组织内的内皮细胞增殖所增强)的病症。可以设计临床试验以评价抗Robo4抗体与已知治疗方案的组合的功效，所述的已知治疗方案诸如涉及已知化疗剂和/或细胞毒剂的化疗和/或放疗。
癌症可包含表达Robo4的细胞，使得本发明的抗Robo4抗体能够结合癌组织内表达Robo4的内皮细胞。为了测定癌症中的Robo4表达，可利用多种诊断/预后测定法。在一个实施方案中，可通过IHC来分析Robo4过表达。可以对来自肿瘤活检的石蜡包埋组织切片进行IHC测定法并根据染色程度和所检查肿瘤细胞中的比例而给予(accord)Robo4蛋白质染色强度标准。在一个实施方案中，可通过体内或体外检测与在体内表达Robo4的细胞接触的经可检测标记物标记的抗Robo4抗体来分析Robo4过表达。可检测标记物包括但不限于放射性同位素、荧光化合物、金属的和/或磁的纳米微粒、微泡、螯合配体、和其它可检测标志物，诸如本文中所公开的。
为了预防或治疗疾病，抗Robo4抗体的适宜剂量会取决于例如待治疗疾病的类型(如上文所定义的)、疾病的严重程度和进程，施用该分子是为了预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对抗体的响应、及主治医师的判断。将该分子恰当地一次性或通过一系列治疗施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，对患者施用的初始候选剂量是约1μg/kg-15mg/kg(优选0.1-20mg/kg)该分子，无论是例如通过一次或多次分开的施用，或是通过连续输注。典型日剂量的范围可以是约1μg/kg-100mg/kg或更多，取决于上文所述因素。要给患者使用的ADC例示性剂量的范围为约0.1-约10mg/kg患者体重。
对于持续数天或更长的重复施用，根据疾患，持续治疗直至出现期望的对疾病症状的遏制。一种例示性的剂量给药方案包括施用一剂大约4mg/kg的初始加载剂，继之以每周一剂的大约2mg/kg抗Robo4抗体的维持剂。其它剂量方案可能是有用的。在又一个实施方案中，剂量范围是275-375mg/m2。此疗法的进程易于通过常规技术和测定法监测。
A.抗Robo4抗体的施用
本发明的抗Robo4抗体(和辅助治疗剂)可以通过对于要治疗的疾患而言适宜的路径来施用，包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内，及损伤部位内施用(如果希望局部治疗的话)。典型地会胃肠外施用抗Robo4抗体，即输注、皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内、硬膜外、动脉内、和腹膜内。另外，通过脉冲输注来施用抗体是合适的，特别是使用递减剂量的所述抗体。剂量给药可以通过任何合适的路径来进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的还是长时间的。
为了治疗癌症或任何其中发生血管发生的疾病，经静脉内输注来施用抗Robo4抗体或抗体-药物偶联物。经输注施用的剂量在约1μg/m2至约10,000μg/m2每剂的范围内，一般是每周一剂，总共一剂、两剂、三剂或四剂。或者，剂量范围是约1μg/m2至约1000μg/m2、约1μg/m2至约800μg/m2、约1μg/m2至约600μg/m2、约1μg/m2至约400μg/m2、约10μg/m2至约500μg/m2、约10μg/m2至约300μg/m2、约10μg/m2至约200μg/m2或约1μg/m2至约200μg/m2。剂量施用可以每天一次、每周一次、每周多次但少于每天一次、每月多次但少于每天一次、每月多次但少于每周一次、每月一次或间歇地施用以减轻或缓解疾病的症状。施用可以以任何已公开的间隔持续进行，直至所治疗的疾病或病症的症状减轻、缓解或消除(例如如肿瘤缩小、淋巴瘤、白血病的症状的减轻或消除、在没有原发性肿瘤缩小的情况中对转移性扩散的抑制(即无进展存活)、对眼部新血管形成的抑制)。施用可以在实现症状消退或减轻后继续进行，其中所述消退或减轻因所述继续施用而延长。
本发明还提供了治疗癌症、和/或癌症的转移、和/或以血管内皮细胞增殖为特征的眼部病症的方法，包括对患有此类病症的患者施用治疗有效量的任一前述实施方案的抗Robo4抗体，该抗体没有偶联细胞毒性分子或可检测分子。典型地以约1μg/m2至约1000mg/m2的剂量范围来施用抗体。或者，剂量范围是约1μg/m2至约800μg/m2、约1μg/m2至约600μg/m2、约1μg/m2至约400μg/m2、约10μg/m2至约500μg/m2、约10μg/m2至约300μg/m2、约10μg/m2至约200μg/m2或约1μg/m2至约200μg/m2。
本发明还提供了治疗癌症、和/或癌症的转移、和/或以血管内皮细胞增殖为特征的眼部病症的方法，包括对患有此类病症的患者施用治疗有效量的任一前述实施方案的抗Robo4抗体，该抗体偶联有细胞毒性分子或可检测分子。典型地以约1μg/m2至约1000mg/m2的剂量范围来施用抗体。或者，剂量范围是约1μg/m2至约800μg/m2、约1μg/m2至约600μg/m2、约1μg/m2至约400μg/m2、约10μg/m2至约500μg/m2、约10μg/m2至约300μg/m2、约10μg/m2至约200μg/m2或约1μg/m2至约200μg/m2。
B.药用配制剂
一方面，本发明进一步提供了包含至少一种本发明的抗Robo4抗体和/或至少一种其免疫偶联物和/或至少一种本发明的抗Robo4抗体-药物偶联物的药物配制剂。在有些实施方案中，药用配制剂包含1)抗Robo4抗体和/或抗Robo4抗体-药物偶联物和/或其免疫偶联物，和2)制药学可接受的载体。在有些实施方案中，药用组合物包含1)抗Robo4抗体和/或其免疫偶联物，任选和2)至少一种别的治疗剂。
可通过将具有期望纯度的抗体或抗体-药物偶联物与任选的生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980)混合，以水溶液或冻干或其它干燥剂型的形式，制备包含本发明抗体或免疫偶联物或本发明的抗体-药物偶联物的药用配制剂供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递***中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明抗体或免疫偶联物的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体或免疫偶联物在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。
C.联合疗法
可以将本发明的抗Robo4抗体与至少一种具有抗癌特性的别的化合物在药物组合配制剂中或作为联合疗法通过给药方案联合。药物组合配制剂或给药方案中的至少一种别的化合物优选具有对抗Robo4抗体组合物的补充活性，使得它们彼此不会产生不利影响。
所述至少一种别的化合物可以为化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂及其组合。此类分子以对指定目的有效的量适当地联合存在。含有本发明抗Robo4抗体的药物组合物还可以包含治疗有效量的化疗剂，诸如微管蛋白形成抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA结合剂。
一方面，所述第一化合物是本发明的抗Robo4ADC，而所述至少一种别的化合物是不同于抗Robo4的治疗性抗体(或是裸抗体或是ADC)。在一个实施方案中，所述至少一种别的化合物是结合癌细胞表面标志物的抗体。在一个实施方案中，所述至少一种别的化合物是抗HER2抗体，trastuzumab(例如
Figure A20088001151401101
Genentech，Inc.，South San Francisco，CA)。在一个实施方案中，所述至少一种别的化合物是抗HER2抗体，pertuzumab(OmnitargTM，Genentech，Inc.，South San Francisco，CA，参见US6949245)。在一个实施方案中，所述至少一种别的化合物是抗VEGF抗体(例如
Figure A20088001151401102
Genentech，Inc.)。在一个实施方案中，所述至少一种别的化合物是抗体(或是裸抗体或是ADC)，且所述别的抗体是第二种、第三种、第四种、第五种、第六种抗体或更多种抗体，使得此类第二种、第三种、第四种、第五种、第六种、或更多种抗体(或是裸抗体或是ADC)的组合有效治疗表达Robo4的组织中的细胞增殖性病症。
可以将其它治疗方案与依照本发明所鉴定的抗癌药施用联合，包括但不限于放疗和/或骨髓和外周血移植物、和/或细胞毒剂、化疗剂、或生长抑制剂。在这样的一个实施方案中，化疗剂是诸如例如下列药剂或药剂组合：环磷酰胺、羟基柔红霉素、阿霉素、多柔比星(doxorubincin)、长春新碱(ONCOVINTM)、***龙、CHOP、CVP、或COP、或免疫治疗剂诸如抗PSCA、抗HER2(例如
Figure A20088001151401111
OMNITARGTM)或抗VEGF(例如
Figure A20088001151401112
)。联合疗法可以作为同时或序贯方案施用。当序贯施用时，可以以两次或更多次施用来施用所述组合。联合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用，和任意次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有活性剂同时发挥其生物学活性。
在一个实施方案中，使用抗Robo4抗体的治疗涉及联合施用本文中所鉴定的抗癌药和一种或多种化疗剂或生长抑制剂，包括共施用不同化疗剂的鸡尾酒样混合物。化疗剂包括紫杉烷类(诸如帕利他塞(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))和/或蒽环类抗生素。熟练从业人员可以按照制造商的说明书或凭经验确定地使用此类化疗剂的制备和剂量给药方案。此类化疗剂的制备和剂量给药方案还记载于“Chemotherapy Service”，(1992)M.C.Perry编，Williams & Wilkins，Baltimore，Md。
任何上述共施用的药剂的合适剂量就是那些当前使用的剂量，而且可以由于新鉴定的药剂和其它化疗剂或治疗的联合作用(协同作用)而降低。
联合疗法可以提供“协同作用”并且证实是“协同性”的，即当一起使用活性组分时所实现的效果大于分开使用所述化合物时所产生的效果之和。当活性组分为如下情况时可以获得协同效应：(1)共同配制和施用或在合并的单位剂量配制剂中同时投递；(2)作为分开的配制剂交替或平行投递；或(3)通过一些其它方案。当在交替疗法中投递时，在序贯施用或投递所述化合物时，例如通过不同注射器中的不同注射，可以获得协同效应。一般而言，在交替疗法中，序贯地，即依序地施用每种活性组分的有效剂量，而在联合疗法中，一起施用两种或更多活性组分的有效剂量。
为了预防或治疗疾病，本发明抗体(在单独地或与其它药剂诸如化疗剂组合地使用时)的适当剂量会取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和进程、施用所述抗体是为了预防还是为了治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对抗体的应答、及主治医师的判断。一次性地或在一系列治疗中将所述抗体适当施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，对患者施用的初始候选剂量为大约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体，例如，或是通过一次或多次分开的施用，或是通过连续输注。一种典型的每日剂量范围可以为大约1μg/kg至100mg/kg或更大，这取决于上文所述因素。对于持续数天或更长时间的反复施用，根据状况，持续治疗，直至发生对疾病症状的期望抑制。一种例示性的抗体剂量会在大约0.05mg/kg至大约10mg/kg的范围内。如此，可以对患者使用大约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一剂或多剂。此类剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2剂至约20剂，或例如约6剂抗体)。可施用一剂较高的初始加载剂量，后续一剂或多剂较低剂量。例示性剂量给药方案包括施用约4mg/kg抗体的初始加载剂量，后续每周约2mg/kg抗体的维持剂量。然而，其它剂量方案也可能是有用的。这种疗法的进程易于通过常规技术和测定法来监测。
IX.经过标记的抗体及其用途
本发明还提供了经过标记的抗Robo4抗体。经过标记的抗体可用于诊断测定法，例如体外、离体(ex vivo)或体内测定法，用于检测Robo4在特定细胞或组织中的表达(例如用以对血管发生、新血管形成、和/或肿瘤血管***成像)。在一些实施方案中，经过标记的抗体用于体内成像测定法。本发明的抗Robo4抗体可以偶联任何能共价附着至抗体的标记物模块。在一些实施方案中，本发明的抗Robo4抗体(包括例如半胱氨酸改造的抗Robo4抗体)经抗体上的反应性基团(诸如反应性赖氨酸或半胱氨酸残基)附着至抗体。经由反应性半胱氨酸硫醇基的共价附着披露于Singh等，Anal.Biochem.304：147-15(2002)；Harlow E.和Lane，D.(1999)Using Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Springs Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Lundblad R.L.(1991)Chemical Reagents for Protein Modification，第2版CRCPress，Boca Raton，FL。
所附着的标记物可以发挥下列功能：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记物相互作用以修饰由第一或第二标记物所提供的可检测信号，例如以给出FRET(荧光共振能量转移)；(iii)稳定与抗原或配体的相互作用或提高与抗原或配体结合的亲和力；(iv)通过电荷、疏水性、形状、或其它物理参数来影响迁移率，例如电泳迁移率或细胞通透性；或(v)提供捕获模块以调控配体亲和力、抗体/抗原结合、或离子络合。
为了诊断应用，典型地用可检测模块标记抗体。许多标记物是可获得的，一般可将它们分组成下列种类：
(a)在一些实施方案中，用放射性同位素(放射性核素)，诸如3H、11C、14C、18F、19F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、99Tc、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At、或213Bi标记抗Robo4抗体。放射性同位素标记的抗Robo4抗体可用于表达Robo4的细胞的受体靶向成像(例如用于本发明的诊断用途，诸如肿瘤内皮细胞、肿瘤血管***、血管发生、和新血管形成的体内成像)。
(b)在一些实施方案中，使用Current Protocols in Immunology，卷1和2，Coligen等编，Wiley-Interscience，New York，NY，Pubs.(1991)中记载的技术，用结合、螯合或以其它方式络合放射性同位素金属的配体试剂来标记抗Robo4抗体，其中该试剂与该抗体的改造的半胱氨酸硫醇具有反应性。可以络合金属离子的螯合配体包括DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA和TETA(Macrocyclics，Dallas，TX)。螯合接头试剂，诸如DOTA-马来酰亚胺(4-马来酰亚氨基丁酰氨基苄基-DOTA)(4-maleimidobutyramidobenzyl-DOTA)可以通过氨基苄基-DOTA与用氯甲酸异丙酯(isopropylchloroformate)(Aldrich)活化的4-马来酰亚氨基丁酸(Fluka)反应来制备，其遵循Axworthy等(2000)PNAS USA97(4)：1802-1807的规程。DOTA-马来酰亚胺试剂与半胱氨酸改造抗体的游离半胱氨酸氨基酸起反应，并在该抗体上提供金属络合配体(Lewis等，Bioconj.Chem.9：72-86(1998))。螯合接头标记试剂，诸如DOTA-NHS(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯))(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7，10-tetraacetic acid mono(N-hydroxysuccinimideester))是商品化的(Macrocyclics，Dallas，TX)。可以经与本发明抗体-药物偶联物的络合作用使放射性核素具有靶向(Wu等，Nature Biotech.23(9)：1137-1146(2005))。用放射性核素标记的抗体进行的受体靶物成像可以通过检测和定量抗体在肿瘤组织中的逐渐积累来提供升高的靶物表达的标志(Albert等，Bioorg.Med.Chem.Lett.8：1207-1210(1998))。在溶酶体降解后，所偶联的放射性金属可以保留在细胞内。
适合作为用于成像实验的抗体标记物的金属-螯合剂复合体披露于：US5342606；US 5428155；US 5316757；US 5480990；US 5462725；US 5428139；US 5385893；US 5739294；US 5750660；US 5834456；Hnatowich等(1983)J.Immunol.Methods 65：147-157；Meares等，Anal.Biochem.142：68-78(1984)；Mirzadeh等，Bioconjugate Chem.1：59-65(1990)；Meares等，J.Cancer，Suppl.10：21-26(1990)；Izard等，Bioconjugate Chem.3：346-350(1992)；Nikula等，Nucl.Med.Biol.22：387-90(1995)；Camera等，Nucl.Med.Biol.20：955-62(1993)；Kukis等，J.Nucl.Med.39：2105-2110(1998)；Verel等，J.Nucl.Med.44：1663-1670(2003)；Camera等，J.Nucl.Med.21：640-646(1994)；Ruegg等，Cancer Res.50：4221-4226(1990)；Verel等，J.Nucl.Med.44：1663-1670(2003)；Lee等，Cancer Res.61：4474-4482(2001)；Mitchell，等，J.Nucl.Med.44：1105-1112(2003)；Kobayashi等，Bioconjugate Chem.10：103-111(1999)；Miederer等，J.Nucl.Med.45：129-137(2004)；DeNardo等，Clinical CancerResearch 4：2483-90(1998)；Blend等，Cancer Biotherapy &Radiopharmaceuticals 18：355-363(2003)；Nikula等，J.Nucl.Med.40：166-76(1999)；Kobayashi等，J.Nucl.Med.39：829-36(1998)；Mardirossian等，Nucl.Med.Biol.20：65-74(1993)；Roselli等，Cancer Biotherapy &Radiopharmaceuticals，14：209-20(1999)。
(c)在一些实施方案中，用荧光标记物标记抗Robo4抗体，诸如稀土螯合物(铕螯合物)；荧光素类，包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明类，包括TAMRA；丹酰(dansyl)；丽丝胺(Lissamine)；花青(cyanines)；藻红蛋白；德克萨斯红(Texas Red)；和它们的类似物。使用例如CurrentProtocols in Immunology(见上文)中披露的技术，可以将荧光标记物偶联至抗体。荧光染料和荧光标记物试剂包括那些可购自Invitrogen/MolecularProbes(Eugene，OR)和Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，IL)的。
(d)在一些实施方案中，用各种酶-底物标记物标记抗Robo4抗体，各种酶-底物标记物是可获得的或有披露的(美国专利No.4,275,149)。该酶一般催化显色底物的化学改变，其可以使用各种技术来测量。例如，该酶可以催化底物的颜色变化，其可以用分光光度法来测量。或者，该酶可以改变底物的荧光或化学发光。用于定量荧光变化的技术在上文有描述。化学发光底物通过化学反应而成为电子激发的，然后可以发射可测量的光(例如使用化学发光计)或给荧光受体贡献能量。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶偶联至抗体的技术披露于：O′Sullivan等(1981)“Methods for the Preparation ofEnzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay”，于Methods inEnzym.(J.Langone和H.Van Vunakis编)，Academic Press，New York，73：147-166。
酶-底物组合的例子包括例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRP)与作为底物的过氧化氢，其中该过氧化氢氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；
(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的对硝基苯基磷酸酯；和
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与显色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷)或荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷)。
许多其它的酶-底物组合对本领域技术人员而言是可获得的。一般综述参见US 4275149和US 4318980。
标记物可以间接地与抗Robo4抗体(包括例如半胱氨酸改造抗Robo4抗体)偶联。例如，抗Robo4抗体可以与生物素偶联，并且任何上述三大类标记物可以与亲合素或链霉亲合素偶联，反之亦然。生物素选择性结合链霉亲合素，如此，标记物可以以该间接方式与抗Robo4抗体偶联。或者，为了实现标记物与抗Robo4抗体的间接偶联，抗Robo4抗体与小的半抗原(例如地高辛)偶联，并且上述不同类型的标记物之一与抗半抗原多肽变体(例如抗地高辛抗体)偶联。如此，可以实现标记物与抗Robo4抗体的间接偶联(Hermanson，G.(1996)于Bioconjugate Techniques Academic Press，SanDiego)。
可以在任何已知的测定方法中使用本发明的抗Robo4抗体，诸如ELISA、竞争性结合测定法、直接和间接三明治式(或夹心式)测定法、和免疫沉淀测定法(Zola，(1987)Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，pp.147-158，CRC Press，Inc.)。
经过标记的本发明抗Robo4抗体可检测细胞表面受体，及用于对内皮细胞(例如肿瘤内皮细胞)、血管发生位点、新血管形成位点、和/或肿瘤血管***进行定位、显现、和定量。经过可检测标记的抗体的另一种用途是基于珠子的免疫捕获方法，其包括使珠子与荧光标记的抗体偶联，和在配体结合后检测荧光信号。类似的结合检测方法学利用表面等离振子共振(SPR)效应来测量和检测抗体-抗原相互作用。可以在任何已知的测定方法中使用可检测标记的本发明抗Robo4抗体，所述方法诸如ELISA、竞争性结合测定法、直接和间接三明治式测定法、和免疫沉淀测定法(Zola，(1987)MonoclonalAntibodies：A Manual of Techniques，pp.147-158，CRC Press，Inc.)。
检测标记物(诸如荧光染料和化学发光染料)(Briggs等，J.Chem.Soc.，Perkin-Trans.1：1051-1058(1997))提供可检测的信号，并且一般可用于标记抗体，优选具有下列性质：(i)经过标记的抗体应产生很高的信号但低的背景，使得在无细胞测定法和基于细胞的测定法中都能灵敏地检测出少量的抗体；和(ii)经过标记的抗体应是光稳定的，使得可以观察、监测、和记录到荧光信号，但没有显著的光漂白。对于涉及经标记抗体对膜或细胞表面(尤其是活细胞)的细胞表面结合的应用，标记物优选地(iii)具有优秀的水溶性以实现有效的偶联物浓度和检测灵敏度，和(iv)对活细胞是无毒性的，免得破坏细胞的正常代谢过程或引起过早的细胞死亡。
可以在用活细胞或珠子自动实施混合和读取(mix-and-read)、非放射性测定法的***(
Figure A20088001151401161
8100 HTS System，Applied Biosystems，Foster City，Calif.)上进行细胞荧光强度的直接定量和荧光标记事件(例如肽-染料偶联物的细胞表面结合)的点查(Miraglia，″Homogeneous cell-and bead-based assays forhigh throughput screening using fluorometric microvolume assay technology″，(1999)J.of Biomolecular Screening 4：193-204)。经过标记的抗体的用途还包括细胞表面受体结合测定法、免疫捕获测定法、荧光连接的免疫吸附测定法(FLISA)、胱天蛋白酶切割(Zheng，″Caspase-3 controls both cytoplasmic andnuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo″，(1998)PNASUSA 95：618-23；美国专利No.6,372,907)、凋亡(Vermes，J.Immunol.Methods184：39-51(1995))和细胞毒性测定法。可以使用荧光计量微体积测定法(fluorometric microvolume assay)技术鉴定由靶向细胞表面的分子所引起的上调或下调(Swartzman，Anal.Biochem.271：143-51(1999))。
经过标记的本发明半胱氨酸改造抗体可通过生物医学和分子成像的各种方法和技术用作成像生物标志物和探针，诸如：(i)MRI(磁共振成像)；(ii)X射线计算机化断层成像；(iii)SPECT(单光子发射计算机化断层成像)；(iv)PET(正电子发射断层成像)Chen等(2004)Bioconjugate Chem.15：41-49；(v)生物发光；(vi)荧光；和(vii)超声。免疫闪烁成像是一种成像规程，其中给动物或人患者施用用放射性物质标记的抗体，并拍摄身体中该抗体定位的部位(例如肿瘤，包括肿瘤血管***或其转移)的照片(US 6528624)。可以将成像生物标志物作为正常生物学过程、致病过程、或对治疗性干涉的药理学应答的指示客观地测量并评估。生物标志物可以是数种类型：类型0是疾病的天然历史标志物，并与已知临床指标纵向相关，例如类风湿性关节炎中滑膜炎症的MRI评估；类型I标志物捕获干预的依照作用机制的效应，即使该机制可能与临床结果无关；类型II标志物发挥代用终点(surrogate endpoint)的功能，其中该生物标志物的改变或来自该生物标志物的信号预示临床益处以“证实”靶向应答，诸如通过平面X射线、MRI或CT在类风湿性关节炎中测量到的骨侵蚀。如此，成像生物标志物可以提供关于下列各项的药效学(PD)治疗信息：(i)靶蛋白的表达，(ii)治疗剂对靶蛋白的结合，即选择性，和(iii)清除和半衰期药动学数据。体内成像生物标志物相对于基于实验室的生物标志物的优点包括：非侵入性处理，可定量，全身评估，重复定量给药和评估(即多个时间点)，及从临床前结果(小动物)至临床结果(人)的潜在可转换效应。对于一些应用，生物成像代替或最少化临床前研究中动物实验的数目。
肽标记方法是公知的。参见Haugland，2003，Molecular Probes Handbookof Fluorescent Probes and Research Chemicals，Molecular Probes，Inc.；Brinkley，1992，Bioconjugate Chem.3：2；Garman，(1997)Non-Radioactive Labelling：APractical Approach，Academic Press，London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1：2；Glazer等(1975)Chemical Modification of Proteins.Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology(T.S.Work和E.Work，编)AmericanElsevier Publishing Co.，New York；Lundblad，R.L.和Noyes，C.M.(1984)Chemical Reagents for Protein Modification，卷I和II，CRC Press，New York；Pfleiderer，G.(1985)“Chemical Modification of Proteins”，Modern Methods inProtein Chemistry，H.Tschesche，编，Walter DeGryter，Berlin和New York；及Wong(1991)Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking，CRC Press，Boca Raton，Fla.)；De Leon-Rodriguez等(2004)Chem.Eur.J.10：1149-1155；Lewis等(2001)Bioconjugate Chem.12：320-324；Li等(2002)BioconjugateChem.13：110-115；Mier等(2005)Bioconjugate Chem.16：240-237。
用两种模块即荧光报道物和淬灭剂标记的肽和蛋白质在足够接近时经历荧光共振能量转移(FRET)。报道物基团典型地是荧光染料，其由某个波长的光激发并转移能量给受体或淬灭剂基团，这具有合适的斯托克司频移(Stokes shift)以在最高亮度发光。荧光染料包括具有扩展芳香性(extendedaromaticity)的分子，诸如荧光素和罗丹明及其衍生物。荧光报道物可以由完整肽中的淬灭剂模块部分地或显著地淬灭。在肽酶或蛋白酶切割肽后，可以测量可检测的荧光增加(Knight，C.(1995)“Fluorimetric Assays of ProteolyticEnzymes”，Methods in Enzymology，Academic Press，248：18-34)。
经过标记的本发明抗Robo4抗体还可以用作亲和纯化剂。在该方法中，使用本领域公知的方法将经过标记的抗体固定化在固相(诸如Sephadex树脂或滤纸)上。使固定化的抗体与含有待纯化抗原的样品接触，其后用合适的溶剂清洗支持物，这会清除该样品中除待纯化抗原(其结合至固定化的抗体)以外的基本上所有材料。最后，用另一种合适的溶剂(诸如甘氨酸缓冲液，pH 5.0)清洗支持物，这会从抗体中释放抗原。
标记试剂典型地携带反应性官能度(reactive functionality)，其可以(i)与半胱氨酸改造抗体的半胱氨酸硫醇直接反应以形成经过标记的抗体，(ii)与接头试剂反应以形成接头-标记物中间体，或(iii)与接头抗体反应以形成经过标记的抗体。标记试剂的反应性官能度包括：马来酰亚胺、卤乙酰基、碘乙酰胺琥珀酰亚氨基酯(例如NHS，N-羟基琥珀酰亚胺)、异硫氰酸盐/酯、磺酰氯、2，6-二氯三嗪基、五氟苯基酯、和亚磷酰胺，尽管还可以使用其它官能团。
例示性的反应性官能团是可检测标记物(例如生物素或荧光染料)的羧基取代基的N-羟基琥珀酰亚氨基酯(NHS)。可以预制、分离、纯化、和/或表征该标记物的NHS酯，或者可以使其原位形成并与抗体的亲核基团起反应。典型地，将羧基形式的标记物通过与碳二亚胺试剂(例如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺)、或脲阳离子试剂(例如TSTU(O-(N-琥珀酰亚氨基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸盐/酯)、HBTU((O-苯并***-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐/酯)、或HATU((O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐/酯)、活化剂(诸如1-羟基苯并***(HOBt))、和N-羟基琥珀酰亚胺的一些组合起反应而活化以给出该标记物的NHS酯。在一些情况中，可以通过标记物的原位活化和与抗体反应来偶联标记物和抗体以在一个步骤中形成标记物-抗体偶联物。其它活化和偶联试剂包括TBTU(2-(1H-苯并***-1-基)-1-1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐/酯)、TFFH(N，N’，N”，N’”-四甲基脲2-氟-六氟磷酸盐/酯)、PyBOP(苯并***-1-基-氧-三吡咯烷膦六氟磷酸盐/酯)、EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢-喹啉)、DCC(二环己基碳二亚胺)、DIPCDI(二异丙基碳二亚胺)、MSNT(1-(均三甲基苯-2-磺酰)-3-硝基-1H-1，2，4-***、和芳基磺酰卤化物(例如三异丙基苯磺酰氯)。
可检测标记的本发明抗体可通过连接至(包括共价偶联至)磁性颗粒或纳米微粒或金属微粒或纳米微粒而变得可检测。金属微粒可通过诸如磁共振成像(MRI)、单颗粒或单分子示踪、免疫细胞化学、具有暗场照明的等离振子频率、微分干扰差和视频增强、全反射、和光热干涉差(PIC)技术等方法是可检测的(参见例如PNAS USA 100(20)：11350-11355(2003)；Sheetz等，Nature340：284-288(1989)；Baschong等，Histochemistry 83：409-411(1985)；Slot和Geuze，Eur.J.Cell Biol.38：87-93(1935)；Frey和Frey，J.Struct.Biol.127：94-100(1999)；Hainfeld和Powell，J.Histochem.Cytochem.48：471-480(2000)；Schultz等，PNAS USA 97：996-1001(2000)；Gelles等，Nature 331：450-453(1988)；Sonnichsen等，Appl.Phys.Lett.77：2949-2951(2000)；Boyer，D.等，Science297：1160-1163(2002))。本发明的抗Robo4抗体可包含纳米颗粒剂，包括但不限于微泡(参见Ellegala等，Circulation 108：336-341(2003))，也称作声学活性脂球体(AAL)(参见Tartis等，Ultrasound Med.Biol.32(11)：1771-80(2006))、超顺磁剂、脂质体、全氟化碳纳米微粒乳剂(WO2005014051)、和树状聚体(参见Caruthers等，Methods in Molecular Medicine，124：387-400(2006)及其中引用的参考文献，在此通过述及将所有参考文献完整收入本文)。
当经过标记的抗Robo4抗体用于检测时(例如闪烁研究)，标记物可包含用于核磁共振(NMR)成像(也称作磁共振成像(mri))的放射性原子(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)自旋标记物，诸如Tc99m、123I、111In、131I、19F、1H、14N、15N、17O、23Na、31P或13C、钆、锰、铁或铁氧化物(例如超顺磁铁氧化物颗粒(SPIL)或超小顺磁铁氧化物颗粒(USPIL))或其它NMR观察剂。
X.制品
在本发明的另一个方面，提供了包含可用于治疗、预防和/或诊断上文所述紊乱的物质的制品。制品包括容器和贴在所述容器上或与其相连的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可用各种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器中装有其自身或在联合其它组合物时有效治疗、预防和/或诊断疾患的组合物，而且可具有无菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的疾患，诸如癌症。此外，所述制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其它细胞毒剂。本发明此实施方案中的制品还可包括指示第一和第二抗体组合物可用于治疗特定疾患如癌症的包装插页。或者/另外，制品还可包括第二(或第三)容器，其中装有制药学可接受的缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它还可包括商业和用户立场上所需的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
下面是本发明方法和组合物的实施例。应当理解，根据上文提供的一般描述，可实施各种其它实施方案。
实施例
抗体氨基酸序列内的氨基酸残基是依照Kabat(Kabat等，Sequences ofproteins of immunological interest，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991))编号的。使用单字母氨基酸缩写。使用IUB代码代表DNA简并性(N＝A/C/G/T，D＝A/G/T，V＝A/C/G，B＝C/G/T，H＝A/C/T，K＝G/T，M＝A/C，R＝A/G，S＝G/C，W＝A/T，Y＝C/T)。
实施例1：自编码起始抗体的高变区的噬菌体衍生的抗体
使用
Figure A20088001151401201
抗HER2抗体rhuMAB 4D5-8(Genentech，Inc.)的VL和VH域的核酸序列作为作为起始序列，用于HVR的诱变和对人Robo4带His标签抗原(如图5B中所显示的)或人Rob4-Fc融合蛋白的结合的噬菌体选择。抗体4D5是对称作Her-2(erbB2)的癌症相关抗原特异性的人源化抗体。该抗体包括具有共有框架区的可变域(区)；少数位置在提高人源化抗体的亲和力的过程中被回复成小鼠序列。人源化抗体4D5的序列和晶体结构已经记载于美国专利No.6,054,297，Carter等，PNAS USA 89：4285(1992)，晶体结构显示于J.Mol.Biol.229：969(1993)和在线www/ncbi/nih/gov/structure/mmdb(MMDB#s-990-992)。
Figure A20088001151401211
VL和VH域分别包含共有人κI VL域和人亚组III共有VH域变体。变体VH域具有3处相对于人共有的变化：R71A，N73T和L78A。
用于此项工作的噬菌粒是具有2个在phoA启动子控制下的可读框的单价Fab-g3展示载体(pV0350-2B)，基本上如Lee等，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93中所记载的。第一个可读框由融合至受体轻链VL和CH1域的stII信号序列组成，而第二个由融合至受体重链VH和CH1域及接着的截短型次要噬菌体外壳蛋白P3的stII信号序列组成。参见Lee等，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93。
实施例2：通过重链HVR诱变生成的抗体
通过huMAb 4D5-8(
Figure A20088001151401212
抗HER2抗体，Genentech，Inc.)重链HVR-H1、H2、和H3的诱变及针对人Robo4带His标签的抗原融合蛋白的选择生成了Fab克隆YW71.6、YW71.1、YW71.22、和YW71.89。在HVR-H1中，Kabat位置26(G)、27(F)、28(T)、29(I)、34(I)、和35(H)保持不变，而第30-33位氨基酸被改变。在HVR-H2中，Kabat位置51(I)、52a(P)、55(G)、57(T)、59(Y)、60(A)、61(D)、62(S)、63(V)、64(K)、和65(G)保持不变，而第49、50、52、53、54、56、和58位被改变。在HVR-H3中，Kabat位置93(A)和102(Y)保持不变，而第94-100、100a-h、和101位被改变。YW71.22轻链是经过修饰的huMAb 4D5-8序列(第30、66和91位有修饰，得到SEQ ID NO：168，其包含SEQ ID NO：1、2、和3，分别作为HVR-L1、L2、和L3)，它的HVR在噬菌体选择期间没有被改变。使用标准诱变技术，通过选定氨基酸位置的诱变，将序列多样性导入每一个高变区。
噬菌体文库的生成-将为每一个高变区设计的随机化寡核苷酸池在六个20μl反应中于37℃分别磷酸化1小时，所述20μl反应含有660ng寡核苷酸、50mM Tris pH 7.5、10mM MgCl2、1mM ATP、20mM DTT、和5U多核苷酸激酶。然后将这六个磷酸化寡核苷酸池与20μg Kunkel模板在50mM Tris pH7.5、10mM MgCl2中组合，总体积500μl，导致寡核苷酸对模板的比为3。将混合物退火，即90℃4分钟，50℃5分钟，然后在冰上冷却。使用为了防止退火DNA的过度变性而改良的方案，用QIAQUICKTM PCR纯化柱(Qiagen试剂盒28106)清除过量的未退火寡核苷酸。向500μl退火混合物中添加150μl PB，并将混合物在2个硅土柱之间拆分。用750μl PE清洗每一个柱并额外离心以干燥柱之后，用110μl 10mM Tris、1mM EDTA pH 8洗脱每一个柱。然后如下将退后和清洁后的模板(220μl)补平，即通过添加1μl 100mM ATP、10μl 25mMdNTP(25mM每一种dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、15μl 100mM DTT、25μl10X TM缓冲液(0.5M Tris pH 7.5、0.1M MgCl2)、2400U T4连接酶、和30U T7聚合酶，于室温3小时。
在Tris-乙酸盐-EDTA/琼脂糖凝胶上分析补平产物(Sidhu等，Methods inEnzymology 328：333-363(2000))。通常能看到三条带：底部的带是正确补平和连接的产物，中间的带是补平但未连接的产物，而顶部的带是链置换产物。顶部的带是由T7聚合酶的内在副活性生成的，而且是难以避免的(Lechner等，J.Biol.Chem.258：11174-11184(1983))；然而，此带的转化效率比底部的带低30倍，而且通常对文库的贡献很小。中间的带是由于用于最终连接反应的5’磷酸的缺失；此带高效转化且主要产生野生型序列。
然后将补平产物纯化，电穿孔入SS320细胞，并在存在M13/KO7辅助噬菌体的情况中繁殖，如Sidhu等，Methods in Enzymology 328：333-363(2000)所记载的。文库大小范围为1-2x109个独立克隆。对来自初始文库的随机克隆测序以评估文库质量。
噬菌体选择-使用人Robo4-Fc和Robo4-带His标签的蛋白作为选择抗原。在MaxiSorp微量滴定板(Nunc)上在PBS中以10μg/ml包被人Robo4-Fc和Robo4-His，并于4℃温育过夜。对于第一轮选择，使用12孔靶物。使用噬菌体封闭缓冲液(1％BSA、.05％
Figure A20088001151401221
20、PBS)将孔于室温封闭1小时。自冷冻甘油原种PEG沉淀噬菌体文库，重悬于噬菌体封闭缓冲液，并于室温温育1小时。然后将噬菌体文库添加至经过封闭的抗原板，于室温温育过夜。过夜结合后，通过清洗缓冲液(PBS、05％
Figure A20088001151401222
20)清洗，清除未结合的或非特异性结合的噬菌体。通过将孔与50mM HCl、0.5M KCl一起温育30分钟，洗脱结合的噬菌体。使用XL-1 Blue细胞和M13/KO7辅助噬菌体扩增噬菌体，并在2YT、50μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素中于30℃培养36小时。然后使用改良的PEG沉淀方案(Clackson & Lowman2004)回收扩增的噬菌体。将自靶物结合孔洗脱的噬菌体的滴度与自非靶物包被的孔回收的噬菌体的滴度进行比较，以评估富集情况。用数目递减的靶物孔(第2轮4个孔，第3轮和第4轮2个孔)完成四轮噬菌体选择。使用酪蛋白封闭缓冲液(Pierce)作为第2-4轮抗原板和噬菌体的封闭试剂。第2-4轮选择使用3-4小时噬菌体-抗原结合期，并提高清洗严格性。选出了四个噬菌体克隆：YW71.6，YW7.1，YW71.22，和YW71.89。测定了轻链和重链各域的序列，并显示于图1A和1B。测定了Robo4结合特征，如本文下文所讨论的。
实施例3：通过HVR H1、H2、H3和L3的变异生成的抗体
通过huMAb 4D5-8(
Figure A20088001151401231
抗HER2抗体，Genentech，Inc.)重链可变域(区)和huMAb 4D5-8经修饰轻链可变域(区)，SEQ ID NO：168，的HVR-H1、H2、H3和L3的诱变，生成了克隆YW79.1、YW79.8、和YW79.11。在HVR-H1中，Kabat位置26(G)、28(T)、29(F)、30(S)、31(S)、和35(S)保持不变，而氨基酸第27、32-34位被改变。在HVR-H2中，Kabat位置49(S)、51(I)、55(G)、57(T)、59(Y)、60(A)、61(D)、62(S)、63(V)、64(K)、和65(G)保持不变，而第50、52、52a、53、54、56、和58位被改变。在HVR-H3中，Kabat位置93(A)、94(R)、100f-g(删除)保持不变，而第95-100、100a-e、100h、和102位被改变。在HVR-L3中，Kabat位置89(Q)、90(Q)、95(P)和97(T)保持不变，而第91-94和96位被改变。HVR-L1的序列保持不变，为RASQSISSYLA(SEQ ID NO：7)；而且HVR-L2的序列保持不变，为GASSRAS(SEQ ID NO：8)。使用标准诱变技术，通过选定氨基酸位置的诱变，将序列多样性导入每一个高变区。选出了抗Robo4抗体克隆YW79.1、YW79.8、和YW79.11并测序。轻链和重链可变区的序列显示于图1A和1B。
实施例4：可溶性Robo4和抗Robo4抗体的纯化
此实施例描述了在本发明的Robo4抗原和抗Robo4抗体的纯化中有用的方法。Robo4抗原是作为与组氨酸标签融合的可溶性Robo4胞外域纯化的，如图5B中所显示的。
Robo4抗原纯化
将人Robo4构建体(氨基酸M1至氨基酸L461和氨基酸M1至氨基酸Y231)克隆入真核表达载体pRK5，或是作为与人IgG1的Fc部分的融合物或是作为与C-末端组氨酸标签的融合物。将鼠Robo4(M1至H232)克隆入pRK5，仅作为与C-末端组氨酸标签的融合物。通过瞬时转染CHO细胞来生成所有蛋白质。使用用于Fc融合蛋白的蛋白A SepharoseTM(GE Healthcare)或用于组氨酸标签融合物的NiNTA SuperflowTM(Qiagen)，通过亲和层析将蛋白质纯化至＞90％纯度。如果必要，增加离子交换层析步骤(Q-或SP-SepharoseTM，GEHealthcare)和/或大小排阻层析步骤(SuperdexTM 75，GE Healthcare)。使用Edman降解法，通过N-末端测序来确认蛋白质的身份，通过BCA测定法和通过OD280吸光度测量来测定浓度，并通过大小排阻层析和SDS-PAGE来评估纯度。
抗体纯化
在CHO细胞中瞬时表达全长Robo4抗体，并通过使用蛋白A SepharoseTM(GE Healthcare)的亲和层析接着使用SP-SepharoseTM(GE Healthcare)的离子交换层析，纯化至＞95％纯度。如果必要，增加大小排阻层析步骤(SuperdexTM200，GE Healthcare)。通过BCA测定法依照制造商的指示(Pierce Chemical Co.)和通过OD280吸光度测量来测定抗体浓度，并通过大小排阻层析和SDS-PAGE来评估纯度。对于所有抗体纯化，通过激光散射测定的聚集体水平低于5％，通过蛋白A ELISA测定的蛋白A水平低于50ppm，而且通过鲎阿米巴样细胞溶胞物(LAL)显色内毒素测定法测定的内毒素水平低于0.5EU/mg。
实施例5：YW71.22的亲和力成熟
为了改善抗Robo4抗体YW71.22的亲和力，在YW71.22的背景中生成了三个噬菌体展示文库，每个文库以多个HVR作为软随机化诱变(softrandomization mutagenesis)的靶，如Lee等，J.Mol.Biol.340(5)：1073-93(2004)中所记载的。为了避免自模板的潜在高背景再次选出YW71.22，在生成每个文库前将终止密码子导入要突变的HVR。使用溶液分选法来增强基于亲和力的选择过程的效率。通过操作生物素化靶物浓度、降低噬菌体捕捉时间以降低背景、和添加未生物素化的靶物以消除具有更快解离速率的克隆，能熟练地选出高亲和力克隆。Lee等，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93。自第一轮选择，观察到富集(靶物依赖性噬菌体捕获)，提示每个文库中存在具有对人Robo4的相当高亲和力的大量克隆。在后续轮中提高选择严格性。在5轮选择后，分析来自每个文库的克隆。在靶向六个HVR中每一个的文库中都观察到新的序列(图2A和2B)。通过噬菌体ELISA筛选所选择的克隆，然后表达成IgG蛋白，并使用BiacoreTM结合分析表征它们的亲和力。
使用固体/溶液分选法分选亲和力成熟克隆的噬菌体文库。将人Robo4-His生物素化，即混合500μl PBS中的3.6mg/ml人Robo4-His和10μl 1M磷酸钾pH 8与20μl 4mM Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce)。对于第一轮选择，在MaxiSorp微量滴度板(Nunc)上在PBS中以10μg/ml包被生物素化的Robo4-His，并于4℃温育过夜。对于第一轮选择，使用16孔靶物。使用SuperBlock(Pierce)将孔于室温封闭1小时。将成熟噬菌体文库在SuperBlock缓冲液中稀释并于室温温育1小时。然后将噬菌体文库添加至经过封闭的抗原板，于室温温育2小时。结合后，通过清洗缓冲液(PBS、05％20)清洗，自抗原板清除未结合的和非特异性结合的噬菌体。通过将孔与50mMHCl、0.5M KCl一起温育30分钟，洗脱结合的噬菌体。使用XL-1 Blue细胞和M13/KO7辅助噬菌体扩增噬菌体，并在2YT、50μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素中于30℃培养36小时。然后使用改良的PEG沉淀方案(Clackson & Lowman 2004)回收扩增的噬菌体。将自靶物结合孔洗脱的噬菌体的滴度与自非靶物包被的孔回收的噬菌体的滴度进行比较，以评估富集情况。对于第2-5轮选择，实施溶液分选方案。将微量滴定孔用10μg/ml PBS中的中性亲合素(neutravidin)于4℃包被过夜，然后使用SuperBlock(Pierce)封闭1小时。将回收的噬菌体文库重悬于SuperBlock，并与50nM生物素化Robo4-His混合1小时。在中性亲合素包被的孔上捕捉结合至生物素化Robo4-His的噬菌体30分钟，并用清洗缓冲液洗去未结合的噬菌体。使用50mM HCl、500mM KCl洗脱噬菌体30分钟，中和，并在XL1 blue细胞(Stratagene)中在存在KO7辅助噬菌体(New England Biolabs)的情况中繁殖。类似地实施后续轮的分选，但有以下例外：在第2轮中，生物素化Robo4-His终浓度为50nM，在第3轮中，生物素化Robo4-His终浓度为25nM，在第4轮中，生物素化Robo4-His终浓度为5nM，而在第5轮中，生物素化Robo4-His终浓度为0.5nM，在中性亲合素上捕捉前1小时将50nM未生物素化的Robo4-His添加至混合物。
选出数个亲和力成熟的克隆用于结合人Robo4-His，并测序。通过克隆YW71.22的亲和力成熟衍生的抗体克隆的可变区序列显示于图2A(轻链可变区)和图2B(重链可变区)。
实施例6：选定抗Robo4抗体克隆的表征
噬菌体ELISA-实施噬菌体竞争结合测定法来测定噬菌体展示Fab对Robo4的大致结合亲和力(以噬菌体IC50测定)。所述测定法如下实施。简言之，使用如上所述改良的PEG沉淀方案自每种克隆生成纯化的噬菌体上清液。将纯化的噬菌体上清液在噬菌体封闭缓冲液中连续稀释，然后在经Robo4-His(1μg/ml)包被的板上温育15分钟。将板用清洗缓冲液清洗，并与辣根过氧化物酶/抗M13抗体偶联物(在PBS缓冲液中1∶5000稀释)(AmershamPharmacia Biotech)一起温育30分钟。将板清洗，用四甲基联苯胺(TMB)底物(Kirkegaard and Perry Laboratories)显色，并用0.1N H2SO4淬灭。以分光光度法于450nm测量吸光度以测定给出饱和信号约50％的噬菌体浓度。将固定的、亚饱和的浓度的噬菌体在含有两倍连续稀释的Robo4-His蛋白(350nM Robo4至5nM Robo4)的噬菌体封闭缓冲液中稀释。将混合物以温和摇动于室温温育1小时，转移至经Robo4-His(1μg/ml)包被的板，并将板温育20分钟。将板如上所述清洗和处理。以IC50值(定义为50％阻断噬菌体对固定化抗原的结合的抗原浓度)评估结合亲和力。七种克隆的IC50结果显示于表2。
表2：抗Robo4噬菌体竞争汇总
  克隆   噬菌体IC50对人Robo4
  YW71.6   15nM
  YW71.22   5nM
  YW71.1   15nM
  YW71.89   20nM
  YW79.1   15nM
  YW79.11   ＜5nM
  YW79.8   ＜5nM
Fab生成和亲和力测定-为了表达供亲和力测量用的Fab蛋白，将终止密码子导入噬菌体展示载体中重链和g3之间。将克隆转化入大肠杆菌34B8细胞并在AP5培养基中于30℃培养(Presta等，Cancer Res.57：4593-4599(1997))。通过离心收获细胞，重悬于10mM Tris、1mM EDTA pH 8，并使用微量流化仪(microfluidizer)破碎。用蛋白G亲和层析纯化Fab。
使用BIAcoreTM 2000***(BIAcore，Piscataway，NJ)通过表面等离振子共振实施亲和力测定。将Robo4-His在CM5芯片上固定化(约1000应答单位(RU))，并注射PBST中不同浓度的Fab(4-500nM)。每次注射后，使用100mMHCl再生芯片。
使用3000***(Biacore，Inc.，Piscataway，NJ)通过表面等离振子共振测量测定了三种噬菌体衍生抗Robo4抗体对可溶性Robo4胞外域(ECD)的结合亲和力。所测试的抗体包括YW71.6、YW71.22、和YW79.8。简言之，依照供应商的指示用N-乙基-N’-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BiacoreInc.)。用抗Robo Fab包被这些活化的芯片，即用10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5ug/ml，之后以5μl/min的流速注射以实现大约500应答单位(RU)的偶联抗体。接着，注射1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了动力学测量，以25μl/min的流速于25℃在含0.05％
Figure A20088001151401272
20的PBS中注射2倍连续稀释的人或小鼠-ECD-带His标签的可溶性抗原(大约500nM至大约7.8nM)。通过减去来自空白流动室的RU来校正结合应答。使用简单一对一Langmuir结合模型(3.2版BIAevaluation软件)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以k解离/k结合比来计算平衡解离常数(KD)。此实验的结果显示于下文表3。抗体YW71.22与人和小鼠Robo4起交叉反应。
表3：抗Robo4 BIAcoreTM结合分析汇总
Figure A20088001151401273
对自YW71.22衍生的亲和力成熟抗Robo4抗体克隆测试对HUVEC细胞中内源表达的人Robo4和对MS1细胞中内源表达的鼠Robo4的结合。FACS分析揭示了克隆YW71.22.S1.16和YW71.22.S1.21结合人和鼠Robo4二者，而且结合与YW71.22抗体相当(图18)。
实施例7：亲和力成熟的Robo4抗体的结合分析
使用亲和力成熟的YW71.22.S1.16来生成全长IgG1和Fab片段，二者都有依照EU编号方式的重链Fc区第118位Cys替代。所述Cys用于抗体对感兴趣标记物或药物的位点特异性偶联。
通过体外结合测量和通过放射性标记的细胞结合来测定全长YW71.22.S1.16(Mab)、带工程化Cys的全长YW71.22.S1.16(thioMab)、和带工程化Cys的YW71.22.S1.16的Fab片段(ThioFab)对人和小鼠Robo4的结合亲和力。
体外结合实验是于25℃在ProteOn XPR36仪器(Bio-Rad Laboratories，Inc.)上通过SPR测量而实施的。如制造商所描述的使用标准胺偶联过程将亲和力成熟的Robo4抗体(Mab、ThioMab和ThioFab)以500-1000RU的表面密度在活化的ProteOn GLC传感器芯片(Bio-Rad Laboratories，Inc.)上固定化。简言之，以20mM乙酸钠pH 4.5中10μg/ml的浓度和以30μl/min的流速注射抗体5分钟。通过注射1M乙醇胺来封闭未反应的基团。为了实施结合测定法，以30μl/min的流速注射样品。为了动力学测量，注射在含0.01％Tween-20的PBS中连续稀释的纯化的人或小鼠Robo4-His(大约25nM至0.8nM)，并记录结合和解离阶段的传感图。背景校正使用空白表面。不需要再生表面，因为ProteOn蛋白质相互作用阵列***容许在相同的表面上平行运行多至六个结合实验。使用简单一对一Longmuir结合模型(2.0版ProteOn Manager软件，Bio-Rad Laboratories，Inc.)计算结合速率(ka)和解离速率(kd)，并以kd/ka比计算平衡解离常数(KD)。结果总结于下文表4。
Figure A20088001151401281
在放射性标记细胞结合实验中使用内源表达Robo4蛋白的HUVEC和MS1细胞。
为了细胞结合实验，使用Iodogen法碘化抗Robo4 thioMab和thioFab抗体。使用NAP-5柱通过凝胶过滤自游离的125I-Na纯化每一种放射性标记的抗体；纯化的thioMab抗体具有6.96μCi/μg的比活，而纯化的thioFab抗体具有16.05μCi/μg的比活。将50μL含有固定浓度的碘化抗体和递减浓度的未标记抗体的竞争混合物置于96孔板中。在生长培养基中于37℃在5％CO2中培养MS1和HUVEC细胞，然后使用非酶细胞解离溶液(Sigma #C5914)使细胞脱离组织培养板，供后续结合研究用。用结合缓冲液(50∶50 DMEM/F12培养基，含有2％FBS、2mM叠氮化钠和50mM HEPES，pH 7.2)清洗细胞，并置于装有竞争混合物(0.2mL结合缓冲液中大约200,000个细胞)的96孔板中。每个与细胞的温育中碘化Mab抗体的终浓度为约150pM(约70,000cpm每0.25ml)，而且与细胞的温育中未标记抗体的终浓度以400nM开始并2倍连续稀释10个浓度。与细胞的温育中碘化Fab抗体的终浓度为约400pM(约150,000cpm每0.25ml)，而且与细胞的温育中未标记抗体的终浓度以1.0uM开始并2倍连续稀释10个浓度。一式三份地测定竞争反应。将竞争反应于室温温育2小时。然后将它们转移至Millipore Multiscreen滤板，并用结合缓冲液清洗三次以分开游离的与结合的碘化抗体。在Wallac Wizard 1470伽马计数器(PerkinElmer Life and Analytical Sciences Inc.Wellesley，MA)上对滤器计数。使用利用Munson和Robard，Anal.Biochem.107：220-39(1980)的拟合算法的NewLigand软件(Genentech)评估结合数据，以测定抗体的结合亲和力和每个孔的结合位点浓度。通过将总结合位点除以每个孔的细胞数目来测定每个细胞的结合位点的数目。
实施例8：抗Robo4抗体抑制HUVEC管延长
在珠向外生长测定法中抗Robo4抗体(YW71.22)显著抑制HUVEC管延长。与对照抗体E25相比，管的总数目和长度都降低了(图20)。例如，长度为300μm或更长的管的数目减少了60％。
为了珠向外生长测定法，将右旋糖苷包被的Cytodex 3微载体珠(Amersham)与HUVEC一起(400细胞每珠)在EGM-2中于37℃和5％CO2温育过夜。为了诱导凝结，将0.5ml含2.5μg/ml纤维蛋白原的PBS中的细胞包被的珠(200珠/ml)添加入24孔组织培养板装有0.625单位凝血酶的一个孔，并于室温温育5分钟，然后于37℃温育20分钟。将凝块在EGM-2中于37℃平衡30分钟。然后用含有皮肤成纤维细胞(Detroit 551，20,000细胞/ml)的EGM-2替换所述培养基。向每个孔添加抗体(50μg/ml)，并监测测定情况8天，隔天更换培养基。通过倒置显微镜捕捉珠的图像，并在每张图像中在珠的周围画出间隔100、200、和300μm的同心圆。对穿过每个圆圈的血管数目计数，每种条件使用10-12个珠进行定量(Nakatsu等，Microvascular Research 66：102-112(2003))。
实施例9：抗Robo4抗体和抗Robo4抗体药物偶联物作为治疗剂
通过将抗Robo4抗体偶联至药物-接头模块MCC-DM1、SPDB-DM4、和mPEO-DM1来生成抗Robo4 ADC。在偶联前，依照WO 2004/010957中所记载的方法学使用标准方法用TCEP部分还原抗体。依照Doronina等，Nat.Biotechnol.21：778-784(2003)和美国专利申请No.2005/0238649中所记载的方法学使用标准方法将部分还原的抗体偶联至上述药物-接头模块。简言之，将部分还原的抗体与药物接头模块组合，以容许模块与半胱氨酸残基(包括但不限于本文中所公开的thioMAb的半胱氨酸改造残基)的偶联。淬灭偶联反应，并纯化ADC。通过HPLC测定每种ADC的药物载荷(每个抗体的药物模块平均数)。使用例如包括spp-DM1、smcc-DM1、MC-vc-PAB-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF、MC-MMAE和MC-MMAF在内的药物接头模块制备别的抗Robo4ADC(参见例如WO 2004/010957和WO 2006/034488，完整收入本文作为参考)。
实施例10：体内肿瘤体积缩小测定
裸露的抗Robo4抗体：在人非小细胞肺癌瘤SK-MES-1的小鼠异种移植物模型中，肿瘤生长不受裸露的抗Robo4抗体YW71.22(未偶联细胞毒剂或其它药剂的抗体)抑制。为了此项研究，每只HRLN雌性裸鼠在体侧接受1mm3肿瘤碎片s.c.植入物。通过测径器测量每周两次监测肿瘤生长。当肿瘤达到80-120mm3的平均大小时，分拣小鼠来给出几乎相同的组均值肿瘤大小，并开始治疗(第1天)。每周两次给动物i.p.剂量给药10mg/kg抗Robo4和/或5mg/kg抗VEGF或对照抗体，持续5周。所有处理根据体重调整为0.2mg/20g。结果显示于图17。另外，在带MDA-MB-231乳腺癌异种移植物的Fo5小鼠模型中没有观察到肿瘤生长的降低。
所包含的Fc区具有增强的ADCC活性的抗Robo4抗体可用于抑制肿瘤生长。ADCC增强的抗Robo4抗体可以是裸露的抗体或抗体药物偶联物，如本文中所公开的。通过例如增强IgG1-FcγRIII相互作用来实现ADCC增强，这依赖于连接至抗体Fc区的碳水化合物模块。用于ADCC增强的非限制性、例示性方法包括通过在过表达GnTIII(其编码N-乙酰葡糖胺转移酶)的宿主细胞(Narishimhan，J.Biol.Chem.257：10235-10242(1982)和Umana等，NatureBiotech.17：176-180(1999))；FUT8(其编码α-1，6-岩藻糖基转移酶)表达不足或不表达的宿主细胞(Shinkawa等，J.Biol.Chem.278：3466-3473(2003))；或UDP-N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶不表达或表达不足的宿主细胞(诸如Lec3CHO细胞)(Hong和Stanley，J.Biol.Chem.278：53045-53054(2003))中表达抗Robo4来降低抗体岩藻糖基化。另外，通过Fc区中的氨基酸变化来增强ADCC(参见例如WO 2000042072和WO 2004029207)。如此，本发明的抗Robo4抗体是有用的，因为相对于展现出野生型FC ADCC活性的抗Robo4抗体，包括细胞毒剂的抗Robo4抗体展现出增强的ADCC功能。
抗Robo4抗体药物偶联物(抗Robo4 ADC)：为了测试偶联有毒素的抗Robo4ADC的功效，即在体内缩小肿瘤体积的能力，采用如下方案。
给每只SCID小鼠在体侧皮下接种人癌细胞系的细胞。人癌细胞系包括但不限于SK-MES-1人非小肺癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞。当肿瘤达到介于大约80-200mm3之间的均值肿瘤体积时，将小鼠分组，并通过静脉内注射偶联有毒素的抗体或未偶联抗体来处理。
抗Robo4美登素药物偶联物用于缩小实体瘤体积的用途
以0.2ml/20g小鼠体重的体积给SCID小鼠在体侧皮下注射人肿瘤细胞。将细胞重悬于HBSS。当均值肿瘤大小达到大约80-200mm3时，将小鼠随机分组，并给予偶联有美登素的抗Robo4ADC或对照抗体的单次或多次I.V.处理(经尾静脉)。
在抗体注射后的大约30天里监测每个处理组的均值肿瘤体积。可通过例如剩余萤光素酶的荧光检测来检测肿瘤，其中肿瘤细胞被改造成表达萤光素酶。通过与对照和未偶联抗体比较来测定偶联有毒素的抗CD22抗体的功效。
使用偶联至抗体的药物是auristatin的抗Robo4 ADC实施相同实验。
使用所包含的Fc区具有增强的ADCC活性的抗Robo4ADC重复相同实验。
实施例11：偶联至可检测标志物的抗Robo4抗体
如下制备了sDOTA标记的抗Robo4抗体。将DOTA-NHS-酯溶解于二甲基乙酰胺(DMA，Fluka Chemika，Switzerland)并制备成60-100mg/mL的浓度。典型的规程涉及将MAb的缓冲液更换成含2mM EDTA的PBS pH 7.2。以1分子MAb对4分子DOTA的比例(1∶4)实施反应并于25℃进行，同时在热混合仪板(Eppendorf，Westbury，NY)上轻轻搅动。在与作为非限制性例子的钇90Y、111In、177Lu等等结合时，DOTA标记的抗Robo4抗体作为体外或体内可检测标志物是有用的。如下用例如111In标记MAb偶联物，即通过将偶联物与111InCl3一起在0.25M乙酸铵中于43℃温育45分钟。添加EDTA至终浓度1mM，并将混合物于37℃温育15分钟。用90Y标记例如如下进行，即使用43℃的一小时温育，之后添加DTPA至终浓度1mM，并将混合物于37℃再温育15分钟。使用TosoHaas TSKgel G2000SW柱和生理盐水的流动相，通过大小排阻HPLC来纯化放射性金属标记的mAb偶联物。
实施例12：Robo4和抗Robo4抗体的别的表征
Robo4不阻断内皮细胞(EC)迁移。使用HUVEC迁移测定法和在存在或不存在VEGF的情况中，使Robo4-Fc和Robo4-His接触血管EC。图8显示了该测定法的结果。单独的Robo4-Fc或Robo4-His不诱导EC迁移，而且Robo4不增强VEGF诱导的EC迁移。
Robo4不结合Slit2。根据BiocoreTM分析，与Slit2接触的Robo4-Fc没有显示出结合，而Robol和Slit2在同一测定法中确实显示了结合(图9)。将Slit2-His(带组氨酸标签的全长Slit2)以高密度在CM5BiacoreTM芯片上固定化。注射每种分析物(Robo4-Fc或Robol-Fc融合蛋白)的5μl等分试样并容许在缓冲液(HEPES/EDTA/NaCl，pH7.5)中与固定化配体相互作用。
Robo4在体外与UNC5B(血管导向(vascular guidance)中所涉及的一种细胞表面受体)相互作用。已经显示了导蛋白结合未配位-5(uncoordinated-5，UNC5)受体家族的成员(UNC5A、B、C、和D)导致神经轴突遏制(Klagsbrun，M.和Eichmann，A.，Cytokine & Growth Factor Reviews 16(4-5)：535-548(2005))。已经将导蛋白-UNC5B相互作用与血管发生联系起来(Klagsbrun，M.和Eichmann，A.，见上文(2005)及Lu，X.等，Nature 432：179-186(2004))。通过SPR结合测量测定了Robo4与UNC5B在体外的相互作用，其中将UNC5B-Fc融合蛋白(UNC5B的胞外域与Fc区融合)在芯片上固定化，并容许可溶性Robo4-Fc或Robo4-His在不同浓度与其相互作用。SPR测量是如实施例7中所述实施的，而且相互作用结果显示于图10。
如使用Robo4特异性RNA探针的ISH测定所示(图11)，Robo4在胎小鼠内皮中表达。Robo4还在结肠肿瘤的小鼠肿瘤模型(人HM-7结肠肿瘤异种移植物，图12A和12B)中和在***肿瘤(人MDA-MB-175乳腺癌肿瘤异种移植物，图12C和12D)中表达。Robo4显示了在人肿瘤组织中相对于正常人组织升高的表达，如相对于图13B和3D正常组织，图13A和13C恶性黑素瘤中升高的表达所证明的。在人小细胞肺癌(图14A-D)、人结肠癌(图14G-H)、人***肿瘤、和小鼠血管肉瘤中也看到了Robo4表达。Robo4在结肠、非小细胞肺癌、肾细胞癌瘤(RCC)、移行细胞癌瘤(TCC，膀胱癌的一种常见形式)、乳腺癌、神经胶质瘤、和肉瘤中的肿瘤内皮细胞中表达。
抗Robo4抗体YW71.22被表达Robo4的小鼠微血管内皮MS1细胞在2小时的时间段里内在化。容许YW71.22抗体于0℃结合小鼠微血管内皮MS 1细胞上的Robo4达30分钟，于37℃温育0-2小时。隔一段时间将细胞固定和透化或不透化。使细胞表面上的或被细胞内在化的抗Robo4抗体与荧光标记的(Alexa标记的)抗人IgG二抗相互作用。结果显示于图15A和15B。通过同一方案内在化YW71.22.S1.16抗Robo4抗体，只是将抗Robo4在MS1细胞上于37℃温育0-4小时。将细胞如上透化和染色。结果显示于图15C。
抗Robo4抗体在使用人脐带血管内皮细胞(HUVEC)细胞迁移测定法的体外测定法中不阻断内皮细胞迁移。HUVEC内源表达人Robo4。如下实施该测定法。将HUVEC与VEGF一起预温育2小时。容许细胞迁移在存在抗Robo4抗体YW71.22、抗VEGF抗体或Robo4-Fc或Robo4-His的情况中持续16小时。抗Robo4和可溶性Robo4胞外域融合蛋白(Robo4-Fc和Robo4-His)在这些条件下都不阻断EC迁移(图16)。
抗Robo4抗体在体内结合血管***。经尾静脉注射50微克抗Robo4抗体71.22(图19A)或对照抗体(抗HER2，图19B)并容许循环10分钟。注射100微克FITC-Lycopersicum esculentum并容许循环5分钟。给小鼠灌注PBS中的1％PFA，将组织收集到30％蔗糖中并在0CT中冷冻。用Cy3山羊抗人IgG检测抗体。图19A显示了FITC-Lycopersicum esculentum染色在血管***中的定位与抗Robo4Cy3染色的定位交叠，这与迁移入周围组织中的对照抗体不同。
虽然出于清楚理解的目的已经通过举例说明的方式较为详细的描述了上述发明，说明书和实施例不应解释为限制发明范围。通过述及明确将本文中所引用的所有专利、专利申请、科学文献、和Genbank编号的公开内容完整收入本文用于所有目的，就像通过述及明确且单独的收录每一篇专利、专利申请、科学文献、和Genbank编号一样。
序列表
<110>健泰科生物技术公司(Genentech，Inc.)
     Peale Jr.，Franklin V.
     Watts，Ryan J.
     Koch，Alexander W.
     Wu，Yan
     Stawicki，Scott
     Carano，Richard
<120>抗ROBO4抗体及其用途
<130>P2275R1WO
<150>US 60/889,214
<151>2007-02-09
<150>US 60/891,475
<151>2007-02-23
<160>187
<210>1
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>1
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
                  5                  10
<210>2
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>2
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
                  5
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>3
Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
                  5
<210>4
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>4
Gly Phe Thr Ile Ser Gly Ser Trp Ile His
                  5                  10
<210>5
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>5
Ala Val Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
  1               5                  10                  15
Val Lys Gly
<210>6
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>6
Ala Arg Ser Ash Arg Tyr Ser Gly Gln Phe Val Pro Ala Tyr Ala
  1               5                  10                  15
Met Asp Tyr
<210>7
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>7
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala
                  5                  10
<210>8
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>8
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser
                  5
<210>9
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
                 20
<210>10
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>10
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
  1               5                  10                  15
<210>11
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>11
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
  1               5                  10                  15
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Thr
                 20                  25                  30
Tyr Cys
<210>12
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>12
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                  5                  10
<210>13
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
                 20                  25
<210>14
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>14
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
                  5                  10
<210>15
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>15
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
  1               5                  10                  15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 20                  25                  30
<210>16
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>16
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
                  5                  10
<210>17
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>17
Gly Phe Thr Ile Asn Gly Tyr Tyr Ile His
                  5                  10
<210>18
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>18
Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Ser
  1               5                  10                  15
Val Lys Gly
<210>19
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>19
Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly Trp Ser Ser Tyr Gly Met
  1               5                  10                  15
Asp Tyr
<210>20
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>20
Gln Gln Ser Arg Ser Asp His Pro Thr
                  5
<210>21
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>21
Gln Gln Ser Trp Ser Tyr Pro Leu Thr
                  5
<210>22
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>22
Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
                  5
<210>23
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>23
Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr
                  5
<210>24
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>24
Gly Phe Thr Ile Thr Asn Tyr Trp Ile His
                  5                  10
<210>25
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>25
Gly Phe Thr Ile Asn Asn Asn Tyr Ile His
                  5                  10
<210>26
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>26
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Ser
                  5                  10
<210>27
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>27
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Arg Tyr Met Ser
                  5                  10
<210>28
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>28
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
                  5                  10
<210>29
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>29
Gly Gly Ile Tyr Pro Ala Asp Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
  1               5                  10                  15
Val Lys Gly
<210>30
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>30
Ala Ile Ile Ser Pro Thr Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser
  1               5                  10                  15
Val Lys Gly
<210>31
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>31
Ser Thr Ile Tyr Gly Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser
  1               5                  10                  15
Val Lys Gly
<210>32
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>32
Ser Gly Ile Tyr Pro Met Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
  1               5                  10                  15
Val Lys Gly
<210>33
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>33
Ser Gly Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
  1               5                  10                  15
Val Lys Gly
<210>34
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>34
Ala Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Leu Ala Tyr
                  5                  10
<210>35
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>35
Ala Arg Asp Val Asn Val Tyr Ser Ala Arg Trp Trp Asp Tyr Val
  1               5                  10                  15
Met Asp Tyr
<210>36
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>36
Ala Arg Met Ser Tyr Asn Trp Ser Ser Pro Gly His Gly Met Asp
  1               5                  10                  15
Val
<210>37
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>37
Ala Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Ser Glu Phe Asp Tyr
                  5                  10
<210>38
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>38
Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Met Pro Tyr Gly His Pro Val Met Asp
  1               5                  10                  15
Val
<210>39
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>39
Arg Ala Ser Gln Asp Gly Ala Arg Ser Leu Ala
                  5                  10
<210>40
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>40
Arg Ala Ser Gln Asp Gly Ala Ile Tyr Leu Ala
                  5                  10
<210>41
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>41
Ser Ala Ser Phe Leu Ala Ser
                  5
<210>42
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>42
Ser Ala Ser Leu Glu Ser
                  5
<210>43
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>43
Ser Ala Thr Leu Ala Ser
                  5
<210>44
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>44
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Tyr
                  5
<210>45
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>45
Ser Ala Ser Asn Leu Ala Ser
                  5
<210>46
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>46
Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser
                  5
<210>47
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>47
Gln Gln Ser Phe Ala Thr Pro Ala Thr
                  5
<210>48
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>48
Gln Gln Ser Arg Ala Ala Leu Pro Thr
                  5
<210>49
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>49
Gln Gln Ser Arg Ala Asn Thr Pro Thr
                  5
<210>50
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>50
Gln Gln Ser Arg Thr Thr Pro Pro Thr
                  5
<210>51
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>51
Gln Gln Pro Phe Asp Leu Pro Met Thr
                  5
<210>52
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>52
Gln Gln Pro Asn Ser Thr Pro Phe Thr
                  5
<210>53
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>53
Gln Gln Ser Arg Phe Asp His Pro Thr
                  5
<210>54
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>54
Gln Gln Ser Tyr His Thr His Ser Thr
                  5
<210>55
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>55
Gln Gln Ser Arg Asp Ile Pro Pro Thr
                  5
<210>56
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>56
Gln Gln Ser Arg Asn Met Pro Ala Thr
                  5
<210>57
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>57
Gln Gln Thr Arg Val Met Pro Ala Thr
                  5
<210>58
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>58
Gln Gln Thr Tyr Thr Ile Pro Pro Thr
                  5
<210>59
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>59
Gln Gln Ser Tyr Ala Tyr Pro Phe Thr
                  5
<210>60
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>60
Gln Gln Ser Tyr Asp Leu Pro Phe Thr
                  5
<210>61
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>61
Gln Gln Ser Tyr Gly Gly Pro Phe Thr
                  5
<210>62
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>62
Gln Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr
                  5
<210>63
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>63
Gln Gln Phe Tyr Ser Asp Pro Phe Thr
                  5
<210>64
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>64
Gln Gln Gly Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr
                  5
<210>65
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>65
Gly Phe Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Phe Glu
                  5                  10
<210>66
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>66
Gly Phe Thr Leu Asp Gly Tyr Tyr Leu Gln
                  5                  10
<210>67
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>67
Gly Phe Ser Ile Asn Gly Tyr Tyr Asn Gln
                  5                  10
<210>68
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>68
Gly Arg Ile Tyr Ser Ala Gly Gly His Thr Ala Tyr Ara Asp Ser
  1               5                  10                  15
Val Lys Gly
<210>69
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>69
Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Lys Thr Glu Tyr Ala Asp Ser
  1               5                  10                  15
Val Lys Gly
<210>70
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>70
Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Ala Thr Ile Tyr Ala Asp Ser
  1               5                  10                  15
Val Lys Gly
<210>71
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<400>71
Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Leu Ser Val Ile Glu Tyr Ala Asp Ser
  1               5                  10                  15
Val Lys Gly
<210>72
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys AIa Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>73
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>73
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>74
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>74
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>75
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>75
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>76
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>76
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
                 20                  25                  30
Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Trp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>77
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>77
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
                 20                  25                  30
Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>78
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
                 20                  25                  30
Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>79
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>79
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Phe Ala Thr Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>80
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>80
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Arg Ala Ala Leu Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>81
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>81
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Arg Ser Asp His Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>82
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Arg Ala Asn Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>83
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>83
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Arg Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>84
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>84
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Pro Phe Asp Leu Pro Met Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>85
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>85
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Pro Ash Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>86
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>86
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Arg Phe Asp His Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Met Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>87
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>87
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Tyr Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Tyr His Thr His Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>88
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>88
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Arg Asp Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>89
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>89
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Arg Asn Met Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>90
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Thr Arg Val Met Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>91
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>91
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Tyr Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Thr Tyr Thr Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>92
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Tyr Ala Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>93
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>93
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg
                 50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                 65                  70                  75
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
                 80                  85                  90
Tyr Asp Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
                 95                 100                 105
Lys Arg
<210>94
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>94
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
                 50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                 65                  70                  75
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
                 80                  85                  90
Tyr Gly Gly Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
                 95                 100                 105
Lys Arg
<210>95
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>95
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>96
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>96
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Gly Ala
                 20                  25                  30
Arg Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Phe Tyr Ser Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>97
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>97
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Gly Ala
                 20                  25                  30
Ile Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Gly Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>98
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>98
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys
<210>99
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>99
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
  1               5                  10                  15
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
                 20                  25                  30
Tyr Cys
<210>100
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>100
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                  5                 10
<210>101
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>101
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
                  5                  10
<210>102
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>102
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
  1               5                  10                  15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys
                 20
<210>103
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>103
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
  1               5                  10                  15
<210>104
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>104
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
  1               5                  10                  15
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
                 20                  25                  30
Tyr Cys
<210>105
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>105
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro
  1               5                  10                  15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
                 20
<210>106
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>106
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
  1               5                  10                  15
<210>107
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>107
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
  1               5                  10                  15
Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr
                 20                  25                  30
Tyr Cys
<210>108
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>108
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu
  1               5                  10                  15
Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
                 20
<210>109
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>109
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
  1               5                  10                  15
<210>110
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>110
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
  1               5                  10                  15
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr
                 20                  25                  30
Tyr Cys
<210>111
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>111
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
  1               5                  10                  15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
<210>112
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>112
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
                  5                  10
<210>113
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>113
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
  1               5                  10                  15
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 20                  25                  30
Ala Arg
<210>114
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>114
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
  1               5                  10                  15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
                 20                  25
<210>115
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>115
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
                  5                  10
<210>116
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>116
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
  1               5                  10                  15
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  20                 25                  30
Ala
<210>117
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>117
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
  1               5                  10                  15
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 20                  25                  30
<210>118
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>118
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
  1               5                  10                  15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser
                 20                  25                  30
<210>119
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>119
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
                  5                  10
<210>120
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>120
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
  1               5                  10                  15
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 20                  25                  30
Ala Arg
<210>121
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>121
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
  1               5                  10                  15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser
                 20                  25
<210>122
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>122
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
                  5                  10
<210>123
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<22Q>
<223>抗体重链框架区
<400>123
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
  1               5                  10                  15
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 20                  25                  30
Ala
<210>124
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>124
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
  1               5                  10                  15
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 20                  25                  30
<210>125
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
                 20                  25                  30
<210>126
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>126
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
                  5                  10
<210>127
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>127
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
  1               5                  10                  15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 20                  25                  30
Ala Arg
<210>128
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>128
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
                 20                  25
<210>129
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>129
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
                  5                  10
<210>130
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>130
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
  1               5                  10                  15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 20                  25                  30
Ala
<210>131
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>131
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
  1               5                  10                  15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 20                  25                  30
<210>132
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>132
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
                 20                  25                  30
<210>133
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>133
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
  1               5                  10                  15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 20                  25                  30
Ser Arg
<210>134
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>134
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
  1               5                  10                  15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 20                  25                  30
Ser
<210>135
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>135
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
  1               5                  10                  15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 20                  25                  30
Ala Arg
<210>136
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>136
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
  1               5                  10                  15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 20                  25                  30
Ala
<210>137
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链框架区
<400>137
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
  1               5                  10                  15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 20                  25                  30
<210>138
<211>1007
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>138
Met Gly Ser Gly Gly Asp Ser Leu Leu Gly Gly Arg Gly Ser Leu
  1               5                  10                  15
Pro Leu Leu Leu Leu Leu Ile Met Gly Gly Met Ala Gln Asp Ser
                 20                  25                  30
Pro Pro Gln Ile Leu Val His Pro Gln Asp Gln Leu Phe Gln Gly
                 35                  40                  45
Pro Gly Pro Ala Arg Met Ser Cys Arg Ala Ser Gly Gln Pro Pro
                 50                  55                  60
Pro Thr Ile Arg Trp Leu Leu Asn Gly Gln Pro Leu Ser Met Val
                 65                  70                  75
Pro Pro Asp Pro His His Leu Leu Pro Asp Gly Thr Leu Leu Leu
                 80                  85                  90
Leu Gln Pro Pro Ala Arg Gly His Ala His Asp Gly Gln Ala Leu
                 95                 100                 105
Ser Thr Asp Leu Gly Val Tyr Thr Cys Glu Ala Ser Asn Arg Leu
                110                 115                 120
Gly Thr Ala Val Ser Arg Gly Ala Arg Leu Ser Val Ala Val Leu
                125                 130                 135
Arg Glu Asp Phe Gln Ile Gln Pro Arg Asp Met Val Ala Val Val
                140                 145                 150
Gly Glu Gln Phe Thr Leu Glu Cys Gly Pro Pro Trp Gly His Pro
                155                 160                 165
Glu Pro Thr Val Ser Trp Trp Lys Asp Gly Lys Pro Leu Ala Leu
                170                 175                 180
Gln Pro Gly Arg His Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Leu Met Ala
                185                 190                 195
Arg Ala Glu Lys Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Met Cys Val Ala Thr
                200                 205                 210
Asn Ser Ala Gly His Arg Glu Ser Arg Ala Ala Arg Val Ser Ile
                215                 220                 225
Gln Glu Pro Gln Asp Tyr Thr Glu Pro Val Glu Leu Leu Ala Val
                230                 235                 240
Arg Ile Gln Leu Glu Asn Val Thr Leu Leu Asn Pro Asp Pro Ala
                245                 250                 255
Glu Gly Pro Lys Pro Arg Pro Ala Val Trp Leu Ser Trp Lys Val
                260                 265                 270
Ser Gly Pro Ala Ala Pro Ala Gln Ser Tyr Thr Ala Leu Phe Arg
                275                 280                 285
Thr Gln Thr Ala Pro Gly Gly Gln Gly Ala Pro Trp Ala Glu Glu
                290                 295                 300
Leu Leu Ala Gly Trp Gln Ser Ala Glu Leu Gly Gly Leu His Trp
                305                 310                 315
Gly Gln Asp Tyr Glu Phe Lys Val Arg Pro Ser Ser Gly Arg Ala
                320                 325                 330
Arg Gly Pro Asp Ser Asn Val Leu Leu Leu Arg Leu Pro Glu Lys
                335                 340                 345
Val Pro Ser Ala Pro Pro Gln Glu Val Thr Leu Lys Pro Gly Asn
                350                 355                 360
Gly Thr Val Phe Val Ser Trp Val Pro Pro Pro Ala Glu Asn His
                365                 370                 375
Asn Gly Ile Ile Arg Gly Tyr Gln Val Trp Ser Leu Gly Asn Thr
                380                 385                 390
Ser Leu Pro Pro Ala Asn Trp Thr Val Val Gly Glu Gln Thr Gln
                395                 400                 405
Leu Glu Ile Ala Thr His Met Pro Gly Ser Tyr Cys Val Gln Val
                410                 415                 420
Ala Ala Val Thr Gly Ala Gly Ala Gly Glu Pro Ser Arg Pro Val
Cys Leu Leu Leu Glu Gln Ala Met Glu Arg Ala Thr Gln Glu Pro
                440                 445                 450
Ser Glu His Gly Pro Trp Thr Leu Glu Gln Leu Arg Ala Thr Leu
                455                 460                 465
Lys Arg Pro Glu Val Ile Ala Thr Cys Gly Val Ala Leu Trp Leu
                470                 475                 480
Leu Leu Leu Gly Thr Ala Val Cys Ile His Arg Arg Arg Arg Ala
                485                 490                 495
Arg Val His Leu Gly Pro Gly Leu Tyr Arg Tyr Thr Ser Glu Asp
                500                 505                 510
Ala Ile Leu Lys His Arg Met Asp His Ser Asp Ser Gln Trp Leu
                515                 520                 525
Ala Asp Thr Trp Arg Ser Thr Ser Gly Ser Arg Asp Leu Ser Ser
                530                 535                 540
Ser Ser Ser Leu Ser Ser Arg Leu Gly Ala Asp Ala Arg Asp Pro
                545                 550                 555
Leu Asp Cys Arg Arg Ser Leu Leu Ser Trp Asp Ser Arg Ser Pro
                560                 565                 570
Gly Val Pro Leu Leu Pro Asp Thr Ser Thr Phe Tyr Gly Ser Leu
                575                 580                 585
Ile Ala Glu Leu Pro Ser Ser Thr Pro Ala Arg Pro Ser Pro Gln
                590                 595                 600
Val Pro Ala Val Arg Arg Leu Pro Pro Gln Leu Ala Gln Leu Ser
                605                 610                 615
Ser Pro Cys Ser Ser Ser Asp Ser Leu Cys Ser Arg Arg Gly Leu
                620                 625                 630
Ser Ser Pro Arg Leu Ser Leu Ala Pro Ala Glu Ala Trp Lys Ala
                635                 640                 645
Lys Lys Lys Gln Glu Leu Gln His Ala Asn Ser Ser Pro Leu Leu
                650                 655                 660
Arg Gly Ser His Ser Leu Glu Leu Arg Ala Cys Glu Leu Gly Asn
                665                 670                 675
Arg Gly Ser Lys Asn Leu Ser Gln Ser Pro Gly Ala Val Pro Gln
                680                 685                 690
Ala Leu Val Ala Trp Arg Ala Leu Gly Pro Lys Leu Leu Ser Ser
                695                 700                 705
Ser Asn Glu Leu Val Thr Arg His Leu Pro Pro Ala Pro Leu Phe
                710                 715                 720
Pro His Glu Thr Pro Pro Thr Gln Ser Gln Gln Thr Gln Pro Pro
                725                 730                 735
Val Ala Pro Gln Ala Pro Ser Ser Ile Leu Leu Pro Ala Ala Pro
                740                 745                 750
Ile Pro Ile Leu Ser Pro Cys Ser Pro Pro Ser Pro Gln Ala Ser
                755                 760                 765
Ser Leu Ser Gly Pro Ser Pro Ala Ser Ser Arg Leu Ser Ser Ser
                770                 775                 780
Ser Leu Ser Ser Leu Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Leu Thr Pro
                785                 790                 795
Glu Glu Val Ala Leu Cys Leu Glu Leu Ser Glu Gly Glu Glu Thr
                800                 805                 810
Pro Arg Asn Ser Val Ser Pro Met Pro Arg Ala Pro Ser Pro Pro
                815                 820                 825
Thr Thr Tyr Gly Tyr Ile Ser Val Pro Thr Ala Ser Glu Phe Thr
                830                 835                 840
Asp Met Gly Arg Thr Gly Gly Gly Val Gly Pro Lys Gly Gly Val
                845                 850                 855
Leu Leu Cys Pro Pro Arg Pro Cys Leu Thr Pro Thr Pro Ser Glu
                860                 865                 870
Gly Ser Leu Ala Asn Gly Trp Gly Ser Ala Ser Glu Asp Asn Ala
                875                 880                 885
Ala Ser Ala Arg Ala Ser Leu Val Ser Ser Ser Asp Gly Ser Phe
                890                 895                 900
Leu Ala Asp Ala His Phe Ala Arg Ala Leu Ala Val Ala Val Asp
                905                 910                 915
Ser Phe Gly Phe Gly Leu Glu Pro Arg Glu Ala Asp Cys Val Phe
                920                 925                 930
Ile Asp Ala Ser Ser Pro Pro Ser Pro Arg Asp Glu Ile Phe Leu
                935                 940                 945
Thr Pro Asn Leu Ser Leu Pro Leu Trp Glu Trp Arg Pro Asp Trp
                950                 955                 960
Leu Glu Asp Met Glu Val Ser His Thr Gln Arg Leu Gly Arg Gly
                965                 970                 975
Met Pro Pro Trp Pro Pro Asp Ser Gln I le Ser Ser Gln Arg Ser
                980                 985                 990
Gln Leu His Cys Arg Met Pro Lys Ala Gly Ala Ser Pro Val Asp
                995                1000                1005
Tyr Ser
<210>139
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>139
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Met Glu Ile Lys Arg
                  5                  10
<210>140
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>140
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser
                 20                  25                  30
Gly Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Ala Val Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Gln
                 95                 100                 105
Phe Val Pro Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
                110                 115                 120
Val Thr Val Ser Ser
                125
<210>141
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>141
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr
                 20                  25                  30
Asn Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Gly Ile Tyr Pro Ala Asp Gly Tyr Thr Tyr Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Leu Ala
                 95                 100                 105
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
                110                 115
<210>142
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>142
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val Ser Ser
<210>143
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>143
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Asn Asn Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Ala Ile Ile Ser Pro Thr Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Val Asn Val Tyr Ser Ala
                 95                 100                 105
Arg Trp Trp Asp Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
                110                 115                 120
Val Thr Val Ser Ser
                125
<210>144
<211>123
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>144
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser
                 20                  25                  30
Ser Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Ser Thr Ile Tyr Gly Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Ser Tyr Asn Trp Ser Ser
                 95                 100                 105
Pro Gly His Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
                110                 115                 120
Val Ser Ser
<210>145
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>145
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
                 20                  25                  30
Ser Arg Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Ser Gly Ile Tyr Pro Met Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Ser
                 95                 100                 105
Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
                110                 115                 120
<210>146
<211>123
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>146
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
                 20                  25                  30
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Met Pro Tyr
                 95                 100                 105
Gly His Pro Val Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
                110                 115                 120
Val Ser Ser
<210>147
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>147
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Tyr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Tyr Phe Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Ser Ala Gly Gly His Thr Ala Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val Ser Ser
<210>148
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>148
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val Ser Ser
<210>149
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>149
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val Ser Ser
<210>150
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>150
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val Ser Ser
<210>151
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>151
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val Ser Ser
<210>152
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>152
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Leu Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Lys Thr Glu Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val Ser Ser
<210>153
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>153
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Asn Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Ala Thr Ile Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                1101                 15                 120
Thr Val  Ser Ser
<210>154
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>154
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val Ser Ser
<210>155
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>155
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Leu Ser Val Ile Glu Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val Ser Ser
<210>156
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>156
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val Ser Ser
<210>157
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>157
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val Ser Ser
<210>158
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>158
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val Ser Ser
<210>159
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>159
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Ash Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val  Ser Ser
<210>160
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>160
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val  Ser Ser
<210>161
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>161
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val Ser Ser
<210>162
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>162
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val Ser Ser
<210>163
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>163
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val Ser Ser
<210>164
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>164
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val Ser Ser
<210>165
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链可变区
<400>165
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val Ser Ser
<210>166
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>166
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Met Glu Ile Lys
                  5                  10
<210>167
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>167
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys
<210>168
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>168
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe
  1               5                  10                  15
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
                 20                  25                  30
Tyr Cys
<210>169
<211>454
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体重链
<400>169
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn
                 20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly
                 95                 100                 105
Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
                110                 115                 120
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
                125                 130                 135
Ala Pro Ser Ser Lys Ser ThrSer Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
                140                 145                 150
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
                155                 160                 165
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser GlV Val His Thr Phe Pro Ala Val
                170                 175                 180
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
                185                 190                 195
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
                200                 205                 210
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
                215                 220                 225
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
                230                 235                 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
                245                 250                 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
                260                 265                 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
                275                 280                 285
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                290                 295                 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
                305                 310                 315
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
                320                 325                 330
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                335                 340                 345
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
                350                 355                 360
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
                365                 370                 375
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
                380                 385                 390
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
                395                 400                 405
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
                410                 415                 420
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
                425                 430                 435
His Glu Ala Leu His Asn Hi s Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
                440                 445                 450
Ser Pro Gly Lys
<210>170
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链
<400>170
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Thr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
                110                 115                 120
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
                125                 130                 135
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
                140                 145                 150
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
                155                 160                 165
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
                170                 175                 180
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
                185                 190                 195
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
                200                 205                 210
Arg Gly Glu Cys
<210>171
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>带His标签的Robo4
<400>171
Gln Asp Ser Pro Pro Gln Ile Leu Val His Pro Gln Asp Gln Leu
  1               5                  10                  15
Phe Gln Gly Pro Gly Pro Ala Arg Met Ser Cys Gln Ala Ser Gly
                 20                  25                  30
Gln Pro Pro Pro Thr Ile Arg Trp Leu Leu Asn Gly Gln Pro Leu
                 35                  40                  45
Ser Met Val Pro Pro Asp Pro His His Leu Leu Pro Asp Gly Thr
                 50                  55                  60
Leu Leu Leu Leu Gln Pro Pro Ala Arg Gly His Ala His Asp Gly
                 65                  70                  75
Gln Ala Leu Ser Thr Asp Leu Gly Val Tyr Thr Cys Glu Ala Ser
                 80                  85                  90
Asn Arg Leu Gly Thr Ala Val Ser Arg Gly Ala Arg Leu Ser Val
                 95                 100                 105
Ala Val Leu Arg Glu Asp Phe Gln Ile Gln Pro Arg Asp Met Val
                110                 115                 120
Ala Val Val Gly Glu Gln Phe Thr Leu Glu Cys Gly Pro Pro Trp
                125                 130                 135
Gly His Pro Glu Pro Thr Val Ser Trp Trp Lys Asp Gly Lys Pro
                140                 145                 150
Leu Ala Leu Gln Pro Gly Arg His Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu
                155                 160                 165
Leu Met Ala Arg Ala Glu Lys Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Met Cys
                170                 175                 180
Val Ala Thr Asn Ser Ala Gly His Arg Glu Ser Arg Ala Ala Arg
                185                 190                 195
Val Ser Ile Gln Glu Pro Gln Asp Tyr Arg Ala His His His His
                200                 205                 210
His His His His
<210>172
<211>243
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>带His标签的Robo4
<400>172
Met Gly Ser Gly Gly Thr Gly Leu Leu Gly Thr Glu Trp Pro Leu
  1               5                  10                  15
Pro Leu Leu Leu Leu Phe Ile Met Gly Gly Glu Ala Leu Asp Ser
                 20                  25                  30
Pro Pro Gln Ile Leu Val His Pro Gln Asp Gln Leu Leu Gln Gly
                 35                  40                  45
Ser Gly Pro Ala Lys Met Arg Cys Arg Ser Ser Gly Gln Pro Pro
                 50                  55                  60
Pro Thr Ile Arg Trp Leu Leu Asn Gly Gln Pro Leu Ser Met Ala
                 65                  70                  75
Thr Pro Asp Leu His Tyr Leu Leu Pro Asp Gly Thr Leu Leu Leu
His Arg Pro Ser Val Gln Gly Arg Pro Gln Asp Asp Gln Asn Ile
                 95                 100                 105
Leu Ser Ala Ile Leu Gly Val Tyr Thr Cys Glu Ala Ser Asn Arg
                110                 115                 120
Leu Gly Thr Ala Val Ser Arg Gly Ala Arg Leu Ser Val Ala Val
                125                 130                 135
Leu Gln Glu Asp Phe Gln Ile Gln Pro Arg Asp Thr Val Ala Val
                140                 145                 150
Val Gly Glu Ser Leu Val Leu Glu Cys Gly Pro Pro Trp Gly Tyr
                155                 160                 165
Pro Lys Pro Ser Val Ser Trp Trp Lys Asp Gly Lys Pro Leu Val
                170                 175                 180
Leu Gln Pro Gly Arg Arg Thr Val Ser Gly Asp Ser Leu Met Val
                185                 190                 195
Ser Arg Ala Glu Lys Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Met Cys Met Ala
                200                 205                 210
Thr Asn Asn Ala Gly Gln Arg Glu Ser Arg Ala Ala Arg Val Ser
                215                 220                 225
Ile Gln Glu Ser Gln Asp His Arg Arg Ala His His His His His
                230                 235                 240
His His His
<210>173
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链框架区
<400>173
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
                  5                  10
<210>174
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<220>
<221>Xaa
<222>5
<223>X1是D或S
<220>
<221>Xaa
<222>6
<223>X2是V，I或G
<220>
<221>Xaa
<222>7
<223>X3是S或A
<220>
<221>Xaa
<222>8
<223>X4是T，S，R或I
<220>
<221>Xaa
<222>9
<223>X5是A，Y或S
<220>
<221>Xaa
<222>10
<223>X6是V或L
<400>174
Arg Ala Ser Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala
                  5                  10
<210>175
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<220>
<221>Xaa
<222>1
<223>X1是S或G
<220>
<221>Xaa
<222>3
<223>X2是T或S
<220>
<221>Xaa
<222>4
<223>X3是F，S，L，N或T
<220>
<221>Xaa
<222>5
<223>X4是L，R，E或A
<220>
<221>Xaa
<222>6
<223>X5是Y，A或S
<220>
<221>Xaa
<222>7
<223>X6是S或Y
<400>175
Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
                  5
<210>176
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<220>
<221>Xaa
<222>3
<223>X1是S，Y，P，T，F或G
<220>
<221>Xaa
<222>4
<223>X2是Y，W，F，R或N
<220>
<221>Xaa
<222>5
<223>X3是T，S，N，A，D，F，H，V或G
<220>
<221>Xaa
<222>6
<223>X4是T，Y，S，A，D，N，L，I，M，Y或G
<220>
<221>Xaa
<222>7
<223>X5是P，L，H或T
<220>
<221>Xaa
<222>8
<223>X6是P，L，F，A，M或S
<400>176
Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
                  5
<210>177
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<220>
<221>Xaa
<222>2
<223>X1是F或Y
<220>
<221>Xaa
<222>3
<223>X2是T或S
<220>
<221>Xaa
<222>4
<223>X3是I，F或L
<220>
<221>Xaa
<222>5
<223>X4是S，N，T，Y，D或K
<220>
<221>Xaa
<222>6
<223>X5是G，N或S
<220>
<221>Xaa
<222>7
<223>X6是S，Y，N或R
<220>
<221>Xaa
<222>8
<223>X7是W，Y或A
<220>
<221>Xaa
<222>9
<223>X8是I，M，F，L或N
<220>
<221>Xaa
<222>10
<223>X9是H，S，E或Q
<400>177
Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
                  5                  10
<210>178
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<220>
<221>Xaa
<222>1
<223>X1是A，G或S
<220>
<221>Xaa
<222>2
<223>X2是V，F，G，I，T或R
<220>
<221>Xaa
<222>4
<223>X3是T，Y或S
<220>
<221>Xaa
<222>5
<223>X4是P，G或S
<220>
<221>Xaa
<222>6
<223>X5是A，T，Y或M
<220>
<221>Xaa
<222>7
<223>X6是G，D或L
<220>
<221>Xaa
<222>8
<223>X7是G或S
<220>
<221>Xaa
<222>9
<223>X8是Y，D，S，T，H，K，A或V
<220>
<221>Xaa
<222>10
<223>X9是T或I
<220>
<221>Xaa
<222>11
<223>X10是Y，D，N，A，E或I
<400>178
Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Asp Ser
  1               5                  10                  15
Val Lys Gly
<210>179
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<220>
<221>Xaa
<222>2
<223>X1是R或S
<220>
<221>Xaa
<222>3
<223>X2是S，L，G，D，M或W
<220>
<221>Xaa
<222>4
<223>X3是N，I，G，V或S
<220>
<221>Xaa
<222>5
<223>X4是R，G，Y或N
<220>
<221>Xaa
<222>6
<223>X5是Y，N，S或V
<220>
<221>Xaa
<222>7
<223>X6是S，K，Y，W或M
<220>
<221>Xaa
<222>8
<223>X7是G，F，S，P或缺失
<220>
<221>Xaa
<222>9
<223>X8是Q，G，A，S，Y或缺失
<220>
<221>Xaa
<222>10
<223>X9是F，W，R，P，E，G或缺失
<220>
<221>Xaa
<222>11
<223>X10是V，S，W，G，H或缺失
<220>
<221>Xaa
<222>12
<223>X11是P，S，W，H或缺失
<220>
<221>Xaa
<222>13
<223>X12是A，Y，D，G，V或缺失
<220>
<221>Xaa
<222>14
<223>X13是Y，G或缺失
<220>
<221>Xaa
<222>15
<223>X14是A，V或缺失
<220>
<221>Xaa
<222>16
<223>X15是M，L或F
<220>
<221>Xaa
<222>17
<223>X16是D或A
<220>
<221>Xaa
<222>18
<223>X17是Y或V
<400>179
Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
  1               5                  10                  15
Xaa Xaa Xaa
<210>180
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<220>
<221>Xaa
<222>2
<223>X1是F或Y
<220>
<221>Xaa
<222>3
<223>X2是T或S
<220>
<221>Xaa
<222>4
<223>X3是I，F或L
<220>
<221>Xaa
<222>5
<223>X4是S，T，Y，D或K
<220>
<221>Xaa
<222>6
<223>X5是G，N或S
<220>
<221>Xaa
<222>7
<223>X6是S，N或R
<220>
<221>Xaa
<222>8
<223>X7是W或A
<220>
<221>Xaa
<222>9
<223>X8是I，M，F，L或N
<220>
<221>Xaa
<222>10
<223>X9是H，S，E或Q
<400>180
Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
                  5                  10
<210>181
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<220>
<221>Xaa
<222>1
<223>X1是A或S
<220>
<221>Xaa
<222>2
<223>X2是V，G，I，T或R
<220>
<221>Xaa
<222>4
<223>X3是T或S
<220>
<221>Xaa
<222>5
<223>X4是P，G或S
<220>
<221>Xaa
<222>6
<223>X5是A，T，Y或M
<220>
<221>Xaa
<222>7
<223>X6是G，D或L
<220>
<221>Xaa
<222>8
<223>X7是G或S
<220>
<221>Xaa
<222>9
<223>X8是Y，S，T，H，K，A或V
<220>
<221>Xaa
<222>10
<223>X9是T或I
<220>
<221>Xaa
<222>11
<223>X10是Y，N，A，E或I
<400>181
Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Asp Ser
  1               5                  10                  15
Val Lys Gly
<210>182
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<220>
<221>Xaa
<222>1
<223>X1是S，G，D，M或W
<220>
<221>Xaa
<222>2
<223>X2是N，G，V或S
<220>
<221>Xaa
<222>3
<223>X3是R，Y或N
<220>
<221>Xaa
<222>4
<223>X4是Y，S或V
<220>
<221>Xaa
<222>5
<223>X5是S，Y，W或M
<220>
<221>Xaa
<222>6
<223>X6是G，S，P或缺失
<220>
<221>Xaa
<222>7
<223>X7是Q，A，S，Y或缺失
<220>
<221>Xaa
<222>8
<223>X8是F，R，P，E，G或缺失
<220>
<221>Xaa
<222>9
<223>X9是V，W，G，H或缺失
<220>
<221>Xaa
<222>10
<223>X10是P，W，G，H或缺失
<220>
<221>Xaa
<222>11
<223>X11是A，D，G，V或缺失
<220>
<221>Xaa
<222>12
<223>X12是Y或缺失
<220>
<221>Xaa
<222>13
<223>X13是A或V
<220>
<221>Xaa
<222>14
<223>X14是M，L或F
<220>
<221>Xaa
<222>16
<223>X15是Y或V
<400>182
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp
  1               5                  10                  15
Xaa
<210>183
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<220>
<221>Xaa
<222>6
<223>X1是V或G
<220>
<221>Xaa
<222>7
<223>X2是S或A
<220>
<221>Xaa
<222>8
<223>X3是T，R或I
<220>
<221>Xaa
<222>9
<223>X4是A，S或Y
<220>
<221>Xaa
<222>10
<223>X5是V或L
<400>183
Arg Ala Ser Gln Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala
                  5                  10
<210>184
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<220>
<221>Xaa
<222>3
<223>X1是S或T
<220>
<221>Xaa
<222>4
<223>X2是F，L，N或T
<220>
<221>Xaa
<222>5
<223>X3是L，E或A
<220>
<221>Xaa
<222>6
<223>X4是Y，A或S
<220>
<221>Xaa
<222>7
<223>X5是S，Y或缺失
<400>184
Ser Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
                  5
<210>185
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<220>
<221>Xaa
<222>3
<223>X1是S，P，T，F或G
<220>
<221>Xaa
<222>4
<223>X2是Y，F，R或N
<220>
<221>Xaa
<222>5
<223>X3是T，A，S，D，F，H，N，V或G
<220>
<221>Xaa
<222>6
<223>X4是T，A，D，N，L，I，M，Y或G
<220>
<221>Xaa
<222>7
<223>X5是P，L，H或T
<220>
<221>Xaa
<222>8
<223>X6是P，A，M，F或S
<400>185
Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
                  5
<210>186
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<220>
<221>Xaa
<222>3
<223>X1是T或S
<220>
<221>Xaa
<222>4
<223>X2是I或L
<220>
<221>Xaa
<222>5
<223>X3是N，Y，D或K
<220>
<221>Xaa
<222>9
<223>X4是I，F，L或N
<220>
<221>Xaa
<222>10
<223>X5是H，E或Q
<400>186
Gly Phe Xaa Xaa Xaa Gly Tyr Tyr Xaa Xaa
                  5                  10
<210>187
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体高变区
<220>
<221>Xaa
<222>2
<223>X1是F或R
<220>
<221>Xaa
<222>5
<223>X2是P或S
<220>
<221>Xaa
<222>7
<223>X3是G或L
<220>
<221>Xaa
<222>9
<223>X4是D，H，K，A或V
<220>
<221>Xaa
<222>11
<223>X5是D，A，E或I
<400>187
Gly Xaa Ile Tyr Xaa Ala Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser
  1               5                  10                  15
Val Lys Gly

Claims (27)

1.一种抗Robo4抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下组的高变区(HVR)序列：
(i)包含序列A1-A11的HVR-L1，其中A1-A11为RASQDVSTAVA(SEQID NO：1)
(ii)包含序列B1-B7的HVR-L2，其中B1-B7为SASFLYS(SEQ ID NO：2)
(iii)包含序列C1-C9的HVR-L3，其中C1-C9为QQSYTTPPT(SEQ IDNO：3)
(iv)包含序列D1-D10的HVR-H1，其中D1-D10为GFTINGYYIH(SEQ IDNO：17)
(v)包含序列E1-E18的HVR-H2，其中E1-E18为GFIYPAGGDTDYADSVKG(SEQ ID NO：18)
(vi)包含序列F1-F17的HVR-H3，其中F1-F17为ARLIGNKFGWSSYGMDY(SEQ ID NO：19)；和
(vii)至少一种变体HVR，其中所述变体HVR在SEQ ID NO：1，2，3，17，18或19所描绘的序列中包含至少一个氨基酸残基的***、删除、或替代。
2.权利要求1的抗体，其包含轻链可变域(区)，该轻链可变域(区)包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：72-97，如图1A和2A中所示。
3.权利要求1的抗体，其包含重链可变域(区)，该重链可变域(区)包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：140-165，如图1B和2B中所示。
4.权利要求1的抗体，其包含轻链可变域(区)，该轻链可变域(区)包含：
包含SEQ ID NO：1的HVR-L1，
包含SEQ ID NO：2的HVR-L2，和
包含SEQ ID NO：20的HVR-L3。
5.权利要求1的抗体，其包含重链可变域(区)，该重链可变域(区)包含：
包含SEQ ID NO：17的HVR-H1，
包含SEQ ID NO：18的HVR-H2，和
包含SEQ ID NO：19的HVR-H3。
6.权利要求1的抗体，其包含
(i)轻链可变域(区)，该轻链可变域(区)包含：
包含SEQ ID NO：1的HVR-L1，
包含SEQ ID NO：2的HVR-L2，和
包含QQSRSDHPT(SEQ ID NO：20)的HVR-L3；和
(ii)重链可变域(区)，该重链可变域(区)包含：
包含SEQ ID NO：17的HVR-H1，
包含SEQ ID NO：18的HVR-H2，和
包含SEQ ID NO：19的HVR-H3。
7.权利要求1的抗体，其中所述抗体是人源化的。
8.权利要求1的抗体，其中所述抗体选自下组：Fab、Fab’、和(Fab’)2。
9.权利要求1的抗体，其进一步包含细胞毒剂。
10.权利要求9的抗体，其中所述细胞毒剂选自下组：N2′-脱乙酰基-N-2′(3-巯基-1-氧丙基)-美登素(DM1)、单甲基auristatin E(MMAE)、单甲基auristatin F(MMAF)、及其组合。
11.权利要求10的抗体，其进一步包含可检测标记物。
12.权利要求11的抗体，其中所述可检测标记物选自下组：生物素、荧光染料、放射性核素、螯合剂1，4，7，10-四氮环十二烷-N，N′，N″，N′″-四乙酸(DOTA)、微泡、全氟化碳纳米微粒乳剂、金属微粒、及其组合。
13.权利要求11的抗体，其中所述可检测标记物是在半胱氨酸残基处共价附着至抗体的。
14.权利要求13的抗体，其中所述半胱氨酸残基依照EU编号方式位于重链Fc区的第118位。
15.调控血管发生的方法，所述方法包括使细胞或组织接触有效量的权利要求1的抗体。
16.权利要求15的方法，其中所述抗体进一步包含细胞毒剂。
17.权利要求15的方法，其中所述血管发生受到抑制。
18.权利要求15的方法，其中所述血管发生与选自下组的病症有关：癌症、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管疾病、增殖性视网膜病、糖尿病性视网膜病、与年龄相关的黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、对移植的角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、及其组合。
19.权利要求15的方法，其中所述血管发生与癌症有关。
20.权利要求19的方法，其中所述癌症选自下组：鳞状细胞癌、肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌瘤、唾液腺癌瘤、肾癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌瘤、***癌瘤、***癌瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤、脑癌、头颈癌、骨肉瘤和血管肉瘤、及相关转移、及其组合。
21.权利要求15的方法，其中所述细胞或组织是在哺乳动物中的。
22.权利要求21的方法，其中所述哺乳动物是人类。
23.权利要求15的方法，进一步包括使所述细胞接触选自下组的药剂：抗肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、及其组合。
24.权利要求23的方法，其中所述药剂是抗VEGF抗体。
25.体内成像方法，所述方法包括给哺乳动物施用权利要求11的抗体。
26.权利要求25的方法，其中所述哺乳动物是人类。
27.权利要求25的方法，其中所述哺乳动物被怀疑具有选自下组的疾病或病症：癌症、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管疾病、增殖性视网膜病、糖尿病性视网膜病、与年龄相关的黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、对移植的角膜组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、银屑病、及上述疾病的组合。
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