CN111683963B - 半胱氨酸工程化的抗原结合分子 - Google Patents

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Abstract

一种特异性抗原结合成员(ABM)，包含特异性抗原结合部分和包含CH2结构域的抗体Fc区域，其经工程化在位置108和/或113处进行半胱氨酸取代，其中根据IMGT进行编号，并且其中抗体Fc区域不包含抗原结合CH3结构域的；以及一种ABM缀合物(ABMC)，包含ABM和在CH2结构域的位置108和113处共价缀合至半胱氨酸中的一个或两个的至少一个异源分子。

Description

半胱氨酸工程化的抗原结合分子
技术领域
本发明涉及抗原结合成员(ABM)，其包含半胱氨酸工程化的抗体Fc区域，和ABM缀合物，其中一个或多个异源分子，缀合至任何半胱氨酸。
背景技术
单克隆抗体已被广泛地用作治疗性抗原结合分子。本文将以完整的IgG1免疫球蛋白为例解释基本的抗体结构。
两个同一性重链(H)和两个同一性轻链(L)结合形成Y形抗体分子。重链各具有四个结构域。氨基末端可变结构域(VH)位于Y的尖端。接着是三个恒定结构域：CH1、CH2和羧基末端CH3，位于Y的茎的基部。一小段延伸、开关，将重链可变区域和恒定区域连接起来。铰链将CH2和CH3(Fc片段)连接至抗体的残余部分(Fab片段)。通过完整抗体分子中铰链的蛋白水解切割可以产生一个Fc和两个同一性Fab片段。轻链由可变的(VL)和恒定的(CL)两个结构域构成，两个结构域由开关隔开。
铰链区域中的二硫键连接两条重链。轻链通过另外的二硫键与重链偶联。取决于免疫球蛋白的种类，Asn连接的碳水化合物部分在恒定结构域的不同位置连接。对于IgG1，在Cys235和Cys238对之间的铰链区域中的两个二硫键将两条重链联合在一起。与在CL结构域中的Cys214(EU索引和Kabat编号)之间，轻链通过两个额外的二硫键与重链偶联，在CH1结构域中的Cys220(EU索引编号)或Cys233(根据Kabat进行编号)。碳水化合物部分连接到每个CH2的Asn306上，在Y的茎中产生明显的凸起。
这些特征具有深远的功能性后果。重链和轻链(VH)和(VL)的可变区域都位于N-末端区域，即Y的“尖端”，它们位于其中与抗原反应的位置。分子的这个尖端是氨基酸序列N-末端所在的一侧。Y的茎以某种方式凸出有效地介导效应子功能，例如补体的激活和与Fc受体，或ADCC和ADCP相互作用。其CH2和CH3结构域凸起，以促进与效应子蛋白的相互作用。氨基酸序列的C-末端位于尖端的相对侧，其可以被称为Y的“底部”。
在抗体中发现了两种类型的轻链，分别称为拉姆达(λ)和卡帕(κ)。给定的免疫球蛋白具有κ链或λ链，而不是每个仅具有一种。在具有λ或κ轻链的抗体之间未发现功能差异。
抗体分子中的每个结构域都具有相似的结构两个β片层，所述两个β片层在压缩的反平行β桶中彼此紧紧堆靠。这种保守的结构称为免疫球蛋白折叠。恒定结构域的免疫球蛋白折叠包含与4-链片层堆靠的3-链折叠。通过每个片层的β链之间的氢键，通过内部相对的片层的残基之间的疏水键，以及通过片层之间的二硫键，来稳定折叠。3-链片层包含链C、F和G，而4-链片层包含链A、B、E和D。字母A到G表示β链沿着免疫球蛋白折叠的氨基酸序列的顺序位置。
可变结构域的折叠具有布置成4和5链的两个片层的9个β链。5-链片层与恒定结构域的3-链片层在结构上是同源的，但是包含额外的链C'和C”。链的残余部分(A、B、C、D、E、F、G)在恒定结构域免疫球蛋白折叠中具有与它们的对应物相同的拓扑结构和相似的结构。如在恒定结构域中，二硫键连接相对片层中的链B和F。
轻和重免疫球蛋白链的可变结构域均包含三个高变环，或互补决定区域(CDR)。V结构域的三个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)在β桶的一端成簇。CDR是连接免疫球蛋白折叠的β链B-C、C'-C”和F-G的环。CDR中的残基从一个免疫球蛋白分子变化到下一个，从而为每个抗体赋予了抗原特异性。
抗体分子尖端处的VL和VH结构域紧密堆积，使得6个CDR(每个结构域上的3个)协同构建表面(或空腔)，以进行抗原特异性结合。因此，抗体的天然的抗原结合位点，由环组成，所述环连接轻链可变结构域的链B-C、C'-C”和F-G，和重链可变域的链B-C、C'-C”和F-G。
天然免疫球蛋白中不是CDR环的环，或不是通过CDR环和在CDR环区域内的可选相邻环所决定的抗原结合袋的一部分，没有抗原结合或表位结合特异性，但有助于校正整个免疫球蛋白分子和/或其效应子或其他功能的折叠，因此被称为结构环。因此，应通过以下方式理解根据本发明所述的“结构环”或“非CDR环”：免疫球蛋白由具有所谓的免疫球蛋白折叠的结构域组成。本质上，反平行的β片层通过环连接，以形成压缩的反平行的β桶。在可变区域中，结构域的一些环基本上有助于抗体的特异性，即与抗原的结合。这些环称为CDR环。抗体结构域的所有其他环，都相当地有助于分子的结构和/或效应子功能。这些环在本文中定义为结构环或非CDR环。
抗原结合Fc片段(也称为FcabTM[f-star公司；具有抗原结合位点的Fc片段(Wozniak-Knopp et al.,2010)]包含例如，修饰的IgG1的Fc结构域，其以高亲和力特异性地结合抗原，在例如WO 2009/132876 A1和WO 2009/000006 A1中所描述。
当前正在开发各种抗体构建体以提供抗体药物缀合物(ADC)。
ADC将抗体的特异性与药物的细胞毒性结合在一起，从而提高了两者的治疗效果。ADC通常地由抗体、接头和细胞毒素组成。抗体的作用是将药物靶向递送至细胞。在特定情况下，抗原-抗体复合物的有效的内在化，对于ADC作用机制至关重要。内在化之后，接头发生裂解，毒素以其活性形式释放。在释放之前，毒素由于缀合而失活，因此在循环中稳定且无害。
在ADC中，当前使用的细胞毒素可分为两类：通过抑制微管组装与微管相互作用的毒素(例如美登木素生物碱和澳瑞他汀)，以及与DNA小沟结合并通过诱导DNA链断裂导致细胞死亡的那些(例如，加利车霉素(calicheamicin))。(惠氏(Wyeth)，吉妥单抗)使用加利车霉素衍生物，并且是由美国食品药品监督管理局批准的首个ADC，用于治疗急性髓细胞性白血病。由于安全方面的考虑和对患者利益方面尚未满意，它于2010年退出市场。当前，在各种临床试验中有几个ADC。
通常地，使用在循环中稳定的接头，因为细胞毒素的早期释放，否则可能导致非特异性细胞杀伤。所选的接头易于在溶酶体中裂解，并在细胞内释放药物。当前，有四种不同类型的接头：对酸不稳定的接头，其在中性pH(例如血液)下稳定，并在酸性环境中进行水解；基于二硫键的接头，其由于谷胱甘肽的高细胞内浓度，在胞质溶胶中裂解；基于肽的接头，其通过肽键将药物与抗体缀合，并由于溶酶体蛋白酶而释放；含硫醚的不可裂解的接头，其更加稳定，并被认为可通过细胞内蛋白水解降解来释放药物。
可以通过部分地还原链间二硫键，或通过定点诱变引入新的表面半胱氨酸，以创建特异性的缀合位点来引入游离的硫醇(SH)-基团(Junutula,Bhakta,et al.,2008；Voynov et al.,2010)。由此具有反应性的硫醇基团的构建体，作为“前ADC”来提供。表面半胱氨酸在各个位置的工程化已在WO2013/070565A1、WO22014/124316A1、WO2015/157595A1和WO2017/112624A1中进行了描述。
需要在不改变Fc片段的基本特性的情况下改进抗体的半胱氨酸工程化。
发明内容
本发明的目的是提供改进的半胱氨酸工程化的ABM，其提供了易于与药物缀合的反应性的硫醇基。
所述目的通过本发明的主题实现。
根据本发明，提供了特异性抗原结合成员(ABM)，所述特异性抗原结合成员包含特异性抗原结合部分和包含CH2结构域的抗体Fc区域，所述抗体Fc区域被工程化(与野生型CH2结构域相比，理解为突变或以其他方式修饰)，以在位置108和/或113处进行半胱氨酸取代，其中根据IMGT进行编号。具体地，ABM包含特异性抗原结合部分和包含CH2结构域的抗体Fc区域，其中CH2结构域在位置108和/或113处包含半胱氨酸取代，其中根据IMGT进行编号。
具体地，通过用半胱氨酸取代天然存在的氨基酸的点突变，将一个或两个半胱氨酸工程化到CH2结构域的F-G环的预定位置。因此，一个或多个游离的硫醇基被工程化到ABM中。
在本文中游离的硫醇基理解为半胱氨酸残基的巯基(-SH)官能团，其与ABM的其他半胱氨酸残基不配对(未交联)，并且可以被化学实体(ABM除外)不封端或封端，例如通过半胱氨酸或谷胱甘肽，其在细胞培养物中表达ABM时，可存在于细胞培养介质中。具体地，将游离的(未配对的)半胱氨酸残基引入ABM中，以进行位点特异性标记和/或药物缀合。
当确定氨基酸残基的暴露与溶剂相互作用时，尽管被“隐藏”或“掩埋”，但所指示的位置却令人惊讶地非常适合。在现有技术中，位置的溶剂暴露指示了用于药物缀合的有利的可及性。
具体地，抗原结合部分包括抗体的抗原结合部分，或酶、粘附蛋白、受体的配体或配体结合部分中的任何一种的结合位点，该结合位点能够结合结合配偶体的同源结构。具体地，抗原结合部分由天然存在的受体的结合位点组成。
具体地，抗原结合部分包含一个或多个抗体可变结构域，特别是VH和VL结构域，其缔合以形成VH/VL结合位点，所述VH/VL结合位点包含三个VH-CDR区域和三个VL-CDR区域，或由三个VH-CDR区域和三个VL-CDR区域组成。
本文所述的特异性ABM包括CH3结构域，其包含抗原结合位点，例如，其中修饰了至少一个结构环区域中的一个或多个氨基酸序列，从而获得修饰的结构环区域，所述修饰的结构环区域与抗原表位特异性结合，例如，未修饰的CH3结构域未显著地结合的表面抗原。包含结构环中的抗原结合位点的抗原结合CH3结构域已经显示出在抗原结合Fc中或在抗体的抗原结合Fc部分中，或在包含此类Fc的任何其他ABM的抗原结合Fc部分中，具有有利的性质。
本文所述的特异性的ABM由抗原结合Fc组成或包括抗原结合Fc，其包括抗原结合位点，例如，其中至少一个结构环区域中的一个或多个氨基酸序列被修饰，从而获得了特异性结合于抗原表位的修饰的结构环区域，例如，表面抗原，如Her2，未经修饰的Fc未显著地与其结合。包含结构环中的抗原结合位点的抗原结合Fc已经显示出，作为Fcab或作为抗体的抗原结合Fc部分或包含此类Fc的任何其他ABM的抗原结合Fc部分，具有有利的性质。
本文所述的特异性ABM包括抗体，所述抗体包括抗原结合CH3结构域或Fc，例如全长抗体，例如那些具有IgG结构的，其包含一个或多个(例如仅2个)抗原结合CH3结构域，或其包含分别取代野生型CH3结构域和Fc的抗原结合Fc。示例性的结合成员是全长双特异性抗体，称为mAb2TM(f-star公司)。
根据一优选的实施方案，抗原结合部分选自由Fab、F(ab')2、scFv、Fd、Fv、抗原结合CH3、Fcab，和在CDR或非CDR(或结构)环中包含至少一个抗体结合位点的一个或多个抗体结构域组成的组。
具体地，
a)抗原结合部分与所述抗体CH2结构域的N-末端融合；和/或
b)抗原结合部分包含在CH3结构域和/或Fc区域中。
具体地，抗原结合部分包含于Fc区域的结构环中，特别是包含于Fc区域中的一个或两个CH3结构域的C-末端结构环中。
根据一具体的实施方案，抗原结合部分包含于抗原结合Fc中，或包含于包含抗原结合Fc的全长多价或双特异性抗体中。
具体地，抗原结合部分通过接头和/或铰链区域与CH2结构域的N-末端融合。具体地，铰链区域是由氨基酸序列组成的任何肽铰链区域，其是天然存在的免疫球蛋白的铰链区域。具体地，铰链区域是人类免疫球蛋白，例如，包含识别为SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由识别为SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成。
在本文所述的ABM中，抗体结构域的连接具体地是通过重组融合或化学连接。特异性连接可以通过将一个结构域的C-末端与另一结构域的N-末端连接来进行。例如，其中在末端区域中的一个或多个氨基酸残基被删除以缩短结构域尺寸，或被延伸以增加结构域的柔性。
具体地，可以使用缩短的结构域序列，其包括C末端和/或N末端区域的删除，例如删除至少1、2、3、4或5，最多6、7、8、9或10个氨基酸。
具体地，可以使用连接序列，其是免疫球蛋白的接头或铰链区域或铰链区域的至少一部分，例如由氨基酸序列组成的肽接头，例如，包括至少1、2、3、4或5个氨基酸，最多10、15或20个氨基酸。连接序列在本文中也称为“连接点”。结构域可以通过接头来延伸，例如通过氨基酸序列，所述氨基酸序列源自抗体结构域的N-或C-末端区域，所述抗体结构域的N-或C-末端区域天然地位于与结构域邻近，例如包括这些结构域之间的天然连接点。可替代地，接头可以包含源自铰链区域的氨基酸序列。但是，接头也可以是人工序列，例如，由连续的Gly和/或Ser氨基酸组成，优选地，长度为5至20个氨基酸，优选地，为8至15个氨基酸。
具体地，CH2结构域的C末端与CH3结构域的N末端融合，优选地，其中Fc区域包含于抗体Fc中，所述抗体Fc由抗体重链的二聚体组成。
具体地，Fc区域包含于抗体的Fc部分中(本文称为“抗体Fc”或“Fc”)，其由两个CH2结构域和两个CH3结构域组成，其中CH2结构域的第一链，与CH3结构域融合，从而形成二聚体，所述二聚体具有CH2结构域的第二链融合于CH3结构域。
Fc区域的具体的特征在于Fc链的二聚体，每个Fc链的特征在于包含CH2-CH3抗体结构域，该二聚体可以是同二聚体或异二聚体，例如，其中第一Fc链与第二Fc链的不同之处在于CH2和/或CH3结构域中的至少一个点突变。
具体地，将Fc的CH2结构域的一个或两个半胱氨酸工程化为在位置108和/或113处包含一个或两个半胱氨酸取代，其中根据IMGT进行编号。具体地，Fc在每个CH2结构域中包含一个或两个半胱氨酸取代，使得Fc仅包含1、2、3或4个游离的硫醇基。
具体地，抗原结合部分融合至Fc或Fc区域，特别是融合至CH2结构域的N-末端，或融合至将抗原结合部分与CH2结构域连接的铰链区域。
根据一具体实施方案，将抗原结合部分并入到Fc区域内，例如，在CH3结构域的C末端环区域中，其被理解为“结构环区域”。
根据一具体实施例，抗原结合部分是Fcab的抗原结合位点。具体地，Fcab包含一个或两个抗原结合部分。具体地，Fcab包含两个抗原结合部分，其中第一抗原结合部分并入到第一CH3结构域的C末端结构环区域，第二抗原结合部分并入到第二CH3结构域的C末端结构环区域。
此外，Fcab可以是包含一个或多个抗原结合部分的构建体的一部分，例如两个抗原结合部分，其中第一个与第一CH2-CH3链的N-末端融合，例如通过接头或铰链区域，并且第二个与第二CH2-CH3链的N-末端融合，例如通过接头或铰链区域。
具体地，ABM是结合抗原的Fc(特别是Fcab)，或者是包含抗原结合Fc(特别是mAb2)的全长多价或双特异性抗体。
根据一具体实施例，ABM是具有IgG、IgA、IgM或IgE中任一种结构的全长免疫球蛋白，其中Fc被交换为Fcab。因此，ABM包含三个、四个或至少三个或四个抗原结合部分，以及可选地两个、三个或更多个不同的抗原结合特异性。
在一特定的实施方案中，ABM是全长多价或双特异性抗体，其包含
i)两个抗原结合部分，每个具有一个抗原结合位点(例如，每一个是抗体的Fab臂)，其中每个抗原结合位点由CDR环组成，以及
ii)抗原结合部分，该抗原结合部分包含一个或两个抗原结合位点(例如，抗原结合Fc，该抗原结合Fc包括一个或两个CH3结构域中的抗原结合位点)，其中每个抗原结合位点由非CDR环组成。
具体地，ABM选自由单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体的抗原结合部分、Fcab分子和包含Fcab分子的抗体组成的组。特别地，ABM是人类、人源化或嵌合抗体。具体地，ABM是人类抗体，特别是人类IgG抗体，其经修饰用于引入如本文所述的CH2结构域中的点突变，并且可选地经进一步地修饰以引入一个或多个另外的抗原结合位点。
具体地，ABM是双特异性或多特异性的，特异性地识别两种或更多种不同的抗原，其中特异性抗原被一个、两个或更多个抗原结合部分识别。具体地，ABM是二价的或多价的，其中抗原分别被两个或更多个抗原结合部分特异性地识别。
具体地，所述ABM；是交叉反应的，其中通过抗原结合部分的一个交叉特异性结合位点特异性地识别两种或更多种抗原。
具体地，ABM是单克隆抗体。具体地，提供了单克隆抗体的制剂，其是通过培养宿主细胞的细胞系获得的，通过重组技术工程化所述宿主细胞的细胞系以表达单克隆抗体。
根据一具体实施方案，CH2结构域包括一个或两个半胱氨酸取代，其是N108C和/或L113C，其中根据IMGT进行编号。
具体地，CH2结构域是哺乳动物物种，例如人、鼠、兔、山羊、骆驼科动物、美洲驼、牛或马，或者是鸟类物种，例如母鸡。
特别地，CH2结构域是由氨基酸序列组成的野生型CH2结构域，所述氨基酸序列除了被工程化到预定位置的一个或两个半胱氨酸之外，是天然存在的，从而获得人工产物。
具体地，CH2结构域是IgG、IgA、IgM或IgE同种型中任何一种的免疫球蛋白，特别是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体中的任一种，优选地是人类抗体。
具体地，CH2结构域是人类IgG的CH2结构域，特别是IgG1，并且包括一个或两个半胱氨酸取代，其为N108C和/或L113C，其中根据IMGT进行编号。
具体地，CH2结构域是人类IgG的CH2结构域，特别是IgG1，并且包括一个或两个半胱氨酸取代，其为N325C和/或L328C，其中根据Kabat的EU索引进行编号。
具体地，CH2结构域包括氨基酸序列，或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列识别为SEQ ID NO:1、2或3中的任何一个，或是与SEQ ID NO:1、2或3中的任何一个具有至少90％序列一致性的氨基酸序列。
尤其是CH2结构域的功能变体的特征在于一定程度的序列一致性，例如，尤其是至少90％或至少95％的天然存在的序列的特征在于抗体结构域的β-桶状结构，其类似于人类IgG、IgA、IgM或IgE结构中各个结构域的结构，特别是人类IgG1结构。
具体地，可以使用CH2结构域的功能活性变体，其包含天然存在的序列中的一个或多个点突变，优选地，多达10个点突变，特别是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个点突变中的任何一个。
具体地，Fc或Fc区域是哺乳动物物种，例如人、鼠、兔、山羊、骆驼科动物、美洲驼、牛或马，或者是鸟类物种，例如母鸡。
特别地，Fc区域包括由氨基酸序列组成的野生型CH2-CH3结构域序列，其所述氨基酸序列除了被工程化到在预定位置的CH2中的一两个半胱氨酸之外，是天然存在的，从而获得人工产物。
具体地，Fc或Fc区域是IgG、IgA、IgM或IgE同种型中任何一种的免疫球蛋白，特别是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体中的任一种，优选地，是人类抗体。
具体地，由一个CH2和一个CH3结构域组成的Fc区域是人类IgG，特别是IgG1，并且在CH2结构域中包含一个或两个半胱氨酸取代，其为N108C和/或L113C，其中根据IMGT进行编号。
具体地，由一个CH2和一个CH3结构域组成的Fc区域是人类IgG，特别是IgG1，并且在CH2结构域中包含一个或两个半胱氨酸取代，其为N325C和/或L328C，其中根据Kabat的EU索引进行编号。
具体地，Fc结构域包括氨基酸序列，或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列被识别为SEQ ID NO:4、5或6中的任一个，或与SEQ ID NO:4、5或6中的任一个具有至少90％序列一致性的氨基酸序列。
尤其是Fc区域的功能变体的特征在于一定程度的序列一致性，例如尤其是至少90％或至少95％的天然存在序列的特征在于，CH2和CH3抗体结构域的β-桶状结构，其类似于人类IgG、IgA、IgM或IgE结构中各个结构域的结构，特别是人类IgG1结构。
具体地，可以使用Fc区域的功能活性变体，其包含天然存在的序列中的一个或两个点突变，所述点突变包含在Fc区域的一个或两个CH2和CH3结构域中，优选地，最多10个点突变，特别是，在抗体结构域CH2和CH3中的一个或两个中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10点突变中的任何一个。
根据某些实施方案，ABM特异性地识别在目标细胞表面上表达的目标抗原，特别是通过一个或多个抗原结合部分。这样的表面抗原特异性地在目标细胞的表面上，所述目标细胞是哺乳动物中的任何一种，特别是人类细胞，在与抗原结合时，其被靶向与ABM或与所述ABM连接的任何异源部分反应。
具体地，目标抗原选自细胞表面抗原，包括受体，特别是选自由erbB受体酪氨酸激酶(例如EGFR、包括Her2neu的HER2、HER3和HER4)组成的组。此外，还可以靶向其他抗原，例如TNF受体超家族的分子，例如Apo-1受体、TNFR1、TNFR2、神经生长因子受体NGFR、CD40、CD40-配体、OX40、TACI、BCMA、BAFF受体、T细胞表面分子、T细胞受体、T细胞抗原、Apo-3、DR4、DR5、DR6、诱饵受体，例如DcR1、DcR2、CAR1、HVEM、GITR、ZTNFR-5、NTR-1、TNFL1、IGFR-1、c-Met，但不限于这些分子，B细胞表面抗原，例如CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、DC-SIGN、实体瘤或血液癌细胞的抗原或标记、淋巴瘤或白血病细胞、其他血细胞包括血小板，但不限于这些分子。
根据具体的实施例，表面抗原选自由受体酪氨酸激酶(ErbB家族)组成的组。
具体地，ABM在结合至目标细胞后就内在化。根据具体的实施例，内在化的ABM特异性地识别选自由受体酪氨酸激酶(ErbB家族)的抗原组成的组。结合目标细胞后，ABM的内在化是通过标准的技术确定的，包括例如，流式细胞术、放射性标记的抗体研究、图像分析，或使用抗体药物缀合物的细胞毒性测定。
具体地，ABM包括由VH/VL结构域对组成的功能性抗原结合位点，其能够以高亲和力结合目标，并且其KD小于10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M中的任意。具体地，ABM是靶向两种不同抗原的双特异性或异二聚体抗体，其中每种抗原均通过抗体识别，其KD小于10-6M、10-7M、10-8M、10-9或10-10M中的任意。
具体地，ABM是靶向至少EGFR的单特异性或双特异性抗体。根据一具体实施例，抗体是西妥昔单抗(ImClone Systems,Bristol-Myers Squibb,Merck KGaA)。
具体地，ABM是双特异性或多特异性抗体，其中第一靶标是CD3、CD16或Her2neu中的任何一个，而第二靶标是EGFR。
根据一具体实施方案，ABM包括两个不同的Fab臂，从而提供了两个不同的Fv结构，每个具有特定的结合特征。具体地，ABM是靶向两种不同的抗原或两种不同的抗原表位的异二聚体或双特异性抗体。
具体地，ABM是异二聚体或双特异性抗体，其包含识别不同抗原或表位的第一和第二Fab臂，例如双特异性全长免疫球蛋白。
例如，本文描述的ABM中使用的抗原结合部分是Fab臂，它是由VH-CH1结构域序列组成的重链(HC)和由VL-CL(κ或λ)结构域序列组成的轻链(LC)的二聚体，具有或不具有任何二硫键、铰链结构域和/或连接抗体结构域的接头序列。当从抗体上切割时，Fab臂通常地被理解为Fab片段(或Fab部分)。Fab臂的具体特征在于，通过VH和VL结构域配对仅形成一个抗原结合位点，并且仅能单特异性地和单价地结合目标。
根据一特定的方面，本文描述的ABM是包含两个不同HC的异二聚抗体，每个HC包含CH2和CH3结构域，和可选地CH4结构域，其HC二聚化成Fc区域。
具体地，ABM包括异二聚体的Fc或Fc区域，其中第一Fc链与第二Fc链的不同之处在于CH2和/或CH3结构域中的至少一个点突变。
具体地，异二聚体Fc区域包含两个CH3结构域，所述CH3结构域经工程化引入，和/或特征在于以下一种或多种：
a)链交换工程化结构域(SEED)CH3异二聚体，其是由人类IgA和IgG CH3序列的交替片段组成；
b)一个或多个隆突(knob)或穴(hole)突变，优选地，是T366Y/Y407'T、F405A/T394'W、T366Y:F405A/T394'W:Y407'T、T366W/Y407'A和S354C:T366W/Y349'C:T366′S:L368′A:Y407V中的任意；
c)第一CH3结构域中的半胱氨酸残基与第二CH3结构域中的半胱氨酸残基共价连接，从而引入域间二硫键，优选地，连接两个CH3结构域的C-末端；
d)排斥电荷抑制异二聚体形成的一个或多个突变，优选地是K409D/D399'K、K409D/D399'R、K409E/D399'K、K409E/D399'R、K409D:K392D/D399'K:E356'K或K409D:K392D:K370D/D399'K:E356'K:E357'K中的任意；和/或
e)用于异二聚体形成和/或热稳定性所选的一种或多种突变，优选地是以下任意：
T350V:L351Y:F405A:Y407V/T350V:T366L:K392L:T394W，
T350V:L351Y:F405A:Y407V/T350V:T366L:K392M:T394W，
L351Y:F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W，
F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W，或
F405A:Y407V/T366L:T394W，
其中根据Kabat的EU索引进行编号。
此类CH3突变经工程化分别产生两条不同的Fc链和HC(至少因CH3域的序列不同而不同)，它们优选地彼此配对，从而获得Fc链或HC的异二聚体，从而显著地降低了产生HC同二聚体的趋势，即相同序列的两个HC的二聚体。
在本文所述的CH3点突变的说明书中，“斜线”将各自配对的一条链或一个结构域上的点突变与相应对的另一链或其他结构域上的点突变区分开；氨基酸位置编号中的“缩进”，表示异二聚体的第二条链或二聚体。“冒号”分别识别链或结构域的其中一个上的点突变的组合。
如上所述用于异二聚体形成所选的任何突变，或者根据Von Kreudenstein等人的公开内容(Landes Bioscience,vol.5,no.5,2013,pp 646-654)的其它突变是可以使用的。
优选地，(i)隆突；或(ii)穴突变，或(iii)隆突和穴突变在一个链或结构域上进行工程化，以及对应的(i)穴，或(ii)隆突突变，或(iii)穴和隆突突变在异二聚体的其它链上进行工程化。
具体地，一对CH3结构域，其包含一个或两个工程化的CH3结构域，所述CH3结构域可以包含多于一个(附加的)域间二硫桥，例如，2或3，连接两个CH3结构域的对。
具体地，在各自的CH3结构域对的两个CH3结构域中，不同的突变(根据上述a)经工程化，以产生同源的(匹配的)对，其中一个结构域包括β-折叠区域中接触表面的空间修饰，优选地，通过互补的空间修饰与另一结构域的各个接触表面相连。这样的空间修饰主要是由不同的氨基酸残基和侧链产生的，例如产生“隆突”或“穴”结构，它们互补形成“隆突到穴中”的二聚体。
根据一特定的方面，Fc区域中的每个CH3结构域是IgG类型的，其氨基酸序列被识别为SEQ ID NO:8(人类野生型IgG1的CH3)，或者是SEQ ID NO:8的功能变体，通过合并至少一个长度至少为2个氨基酸的β链IgA片段将其工程化，来获得链交换，并且优选地Fc区域包括通过将第一CH3结构域的IgA片段与第二CH3结构域的IgA片段配对的CH3结构域的同源对。根据链交换的CH3的一具体实施例，包含AG链的第一CH3结构域的特征在于识别为SEQID NO:9的氨基酸序列；包含GA链的匹配的第二CH3结构域的特征在于识别为SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
这样的链交换的CH3结构域可以具体地包含IgA和IgG氨基酸序列的交替片段，例如，包含至少1、2、3、4或5个不同的IgA片段，每个位于不同的位置，并通过非IgA片段(例如IgG片段)彼此分开。
根据一具体方面，ABM是效应子功能感受态抗体，其包含Fcγ受体结合位点，和/或C1q结合位点，可选地，在Fc区域中。
具体地，抗体的特征在于ADCC和/或CDC活性中的任意。
然而，根据一特别地优选的方面，所述ABM是效应子阴性(EN)抗体，其包含与Fcγ受体结合不足的Fc区域和/或C1q。
具体地，抗体是效应子缺陷的(在本文中也称为效应子阴性的)，通过Fc区域与Fcγ受体或CD16a的结合显著地减少或没有结合。
具体地，效应子阴性的抗体以人类IgG2的CH2序列或其工程化变体为特征，其包含于US8562986中描述的修饰后的人类IgG2的CH2结构域(F296A、N297Q)，融合到C末端CH3结构域的N末端(根据Kabat的EU索引编号)。
具体地，EN抗体具有显著的降低的，或没有ADCC和/或CDC。
具体地，如果有的话，ABM包含位于CH2和/或CH3结构域中的pH依赖性的FcRn结合位点。具体地，ABM包含抗体的Fc部分，其在CH2与CH3结构域的交界处，包含FcRn结合位点。具体地，FcRn结合位点具有结合FcRn的亲和力，以pH依赖性的方式，其KD小于10-4M，或小于10-5M、10-6M、10-7M或10-8M。
具体地，以pH依赖性方式，与FcRn结合的结合亲和力至少为1-log，与生理pH(pH7.4)下相同的结合亲和力相比，pH5-6下，优选地，至少增加2-log或3-log。
根据另一方面，对ABM进行工程化，从而改变pH依赖性FcRn结合。例如，至少一个人类IgG1的CH3结构域被工程化，从而在FcRn结合位点包含至少一个突变，以降低pH依赖性的FcRn结合，特别是H433A或H435A突变中的至少一个，或H433A和H435A突变中的至少一个，其中编号是根据Kabat的EU索引进行的。减少pH依赖性FcRn的结合，可以使得以pH依赖性方式，结合FcRn的结合亲和力小于1-log，与在生理pH(pH7.4)下相同的结合亲和力相比，优选地，与在pH5-6时大约相同或更低。
具体实施方案是指本文示例的任何ABM，或包括实施例部分中描述的任何重链和轻链，或任何重链和轻链的对。具体地，本文所述的ABM可包含实施例部分中所述的重链和轻链，或由实施例部分中所述的重链和轻链组成。
本发明进一步提供了ABM缀合物(ABMC)，其包含本文所述的ABM，以及在CH2结构域的位置108和113处，共价地缀合至一个或两个半胱氨酸的至少一个异源分子，其中根据IMGT进行编号。具体地，ABMC是半胱氨酸连接的ADC。
具体地，ABM:异源分子(药物)化学计量比范围在1:2-1:4之间。
具体地，使用了缀合化学方法，该方法通常地用于通过与游离的半胱氨酸反应，将药物生物缀合到大分子上。通过使半胱氨酸残基与α-卤代酮或迈克尔(Michael)受体(例如马来酰亚胺衍生物)反应，将其特异性地烷基化。具体地，ABM的任何或每个游离的硫醇，通过称为迈克尔加成的反应进行反应，以共价地连接异源分子。具体地，可以使硫醇与马来酰亚胺基反应，得到硫醇-马来酰亚胺加合物(迈克尔加合物)。
通过与非交联的高反应性半胱氨酸氨基酸反应使抗体与一个或多个药物部分缀合的适合的方法，是本领域众所周知的，例如在US7521541B2中描述的。
具体地，ABM的游离的半胱氨酸与相同ABM分子的另一个半胱氨酸未配对，因此在ABM内不交联，或没有任何部分的ABM分子内二硫键。
具体地，ABM的游离的半胱氨酸与其他带有硫醇的分子(除了相同的ABM分子之外)结合，例如未结合的半胱氨酸或谷胱甘肽，它们可以在细胞培养物中重组表达ABM之后存在。这种硫醇结合被理解为“硫醇封端”，其将防止与硫醇反应性试剂反应，并且优选地，通过用还原剂(例如TCEP(三-(2-羧乙基)-膦))还原抗体而除去。
如本文所用，术语“还原剂”是指将电子提供给另一化学物质的化学物质。示例性的还原剂包括二硫苏糖醇(DTT)、2-硫醇基乙醇(2-ME)和三(2-羧乙基)膦(TCEP)，以及它们的相关盐类(例如，TCEP-盐酸盐)。
用还原剂处理通常会减少抗体的链间二硫键。因此，优选地，在还原步骤之后进行使用氧化剂(例如脱氢抗坏血酸)的再氧化步骤。在还原和氧化步骤之间，可以包括纯化步骤。重氧化的抗体通常地包含高反应性的半胱氨酸氨基酸的游离的半胱氨酸。
如本文所用，术语“氧化剂”是指引起一对游离的硫醇转化为二硫键的化合物。氧化剂的实例包括，例如，5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、脱氢抗坏血酸(DHAA)和硫酸铜(CuSO4)。“再氧化步骤”是一确定的步骤，该步骤用来使一对游离的硫醇转化为二硫键。确定的步骤包括引入外源氧化剂和/或有意保持一段时间以允许自氧化。
作为硫醇基反应性马来酰亚胺的替代，可以通过用带有巯基的连接基氧化半胱氨酸的硫醇基来获得二硫键。
α，β-不饱和羰基化合物，以及α，β-不饱和腈与共振稳定的碳亲核试剂(如烯醇酸根离子和烯胺)的1,4-加成反应，例如烯醇酸根离子和烯胺，是已知的迈克尔加成。经历迈克尔加成的α，β-不饱和化合物称为迈克尔受体、亲核迈克尔供体，和产物迈克尔加合物。
因此，本发明提供了通过ABM的定点突变，通过位点特异性化学缀合，或通过ABM中的工程化位点的异源分子的位点特异性缀合。
根据具体的实施方案，异源分子是适合用于疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防的物质，优选地，选自由药学的药物质、毒素、放射性核素、免疫调节剂、细胞因子、淋巴因子、趋化因子、生长因子、肿瘤坏死因子、激素、激素拮抗剂、酶(例如L-天冬酰胺酶)、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、microRNA、肽核酸、光活性治疗剂、抗血管生成剂、促凋亡试剂、肽、脂质、碳水化合物、荧光标签、可视化肽、生物素、血清半衰期调节剂、捕获标签、螯合剂和固体支持物组成的组。
具体地，异源分子是染料、放射性同位素或细胞毒素中的任何一种。特别的示例包括荧光蛋白、染料，或与功能性分子(例如，PEG、卟啉、肽、肽核酸和药物)进行束缚的缀合。
具体的示例是指那些异源分子，其是人工的或生物化学的化合物或分子，其会干扰细胞的生理功能，例如癌症或癌细胞。可以与ABM相连的药物，可以包括细胞抑制剂或细胞毒性剂。例如，可用于与ABM共价偶联的细胞抑制剂，包括烷基化剂、抗代谢物、抗生素、有丝***抑制剂、激素或激素拮抗剂。烷基化剂可以例如包括白消安(马利兰)、卡铂(伯尔定(Paraplatin))、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺(癌得星(Cytoxan))、氮烯唑胺(DTIC-Dome)、磷酸雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氧乙胺(氮芥)、美法仑(苯丙氨酸芥子碱)、甲基苄肼、塞替派、尿嘧啶芥子、抗代谢物，可以是例如，包括克拉屈滨、阿糖胞苷(胞嘧啶***糖苷(Cytosine Arabinoside))、氟尿苷(FUDR，5-氟脱氧尿苷)、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶(5FU)、吉西他滨、羟基脲、6-巯基嘌呤(6MP)、甲氨蝶呤(氨甲蝶呤)、6-硫醇基鸟嘌呤、喷妥司汀、Pibobroman、替加氟、三甲曲沙、葡萄糖醛酸、抗生素，可以是例如，包括阿克拉霉素、博来霉素、放线菌素(放线菌素D)、柔红霉素、亚德里亚霉素(阿霉素)、表柔比星、依达比星、丝裂霉素C、米托蒽醌、普卡霉素(光辉霉素)，或有丝***抑制剂，可以例如包括，依托泊苷(VP-16，凡毕士(VePesid))、替尼泊苷(VM-26，威猛(Vumon))、长春碱、长春新碱、长春地辛、激素，或激素拮抗剂，其可以例如使用，包括布舍瑞林、缀合马***(普力马林)、可的松、氯烯雌醚(Tace)、氟美松(***(Decadron))、己烯雌酚(DES)、乙炔***(炔雌醇)、氟羟甲酮(***)、氟他胺、醋酸戈舍瑞林(诺雷得)、己酸羟孕酮(己酸孕酮)、亮丙瑞林、醋酸甲羟孕酮(普罗维拉)、醋酸甲孕酮(甲地孕酮)、***、他莫昔芬(诺瓦得士(Nolvadex))、睾内酯(去氢睾酮内酯)、***。诸如上述公开的那些细胞生长抑制或抗肿瘤化合物，在现有技术中是已知的，并且可以例如在D.S.Fischer&T.M.Knobf(1989),The cancer chemotherapyhandbook(第3版).Chicago:Year Book Medical and Association of Community CancerCenters(Spring,1992),Compendia-based drug bulletin,Rockville,MD中找到。
具体地，异源分子通过缀合接头，在CH2结构域的位置108和113处，与一个或两个半胱氨酸缀合，其中根据IMGT进行编号。这种缀合接头也被理解为间隔物，其与异源分子偶联。通常地，接头在与ABM反应之前，共价地连接至异源分子。
具体地，缀合接头包含马来酰亚胺基团。
具体地，缀合接头是可裂解的或不可裂解的接头。具体地，接头是合成的或人工的氨基酸序列，其将ABM连接或链接到异源分子或药物。
具体地，使用可裂解的接头，其作为对生理刺激(例如低pH、高谷胱甘肽浓度，和/或蛋白水解裂解)的响应而裂解。具体的可裂解的接头通过蛋白酶、酸，或通过二硫键体的还原(例如，谷胱甘肽介导的或谷胱甘肽敏感的)而裂解。例如，可裂解的接头可包含缬氨酸-瓜氨酸接头、腙接头或二硫键接头。
具体地，不可裂解的接头与内在化的ABM结合使用。在这种情况下，ABMC依赖于内在化后在溶酶体内的降解。具体的不可裂解的接头，包括与MMAF(mc-MMAF)、N-马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧酸酯(MCC)，或硫醇基-乙酰胺基丙烯酰基接头连接的马来酰亚胺基己酰基接头。
本发明进一步提供了表达***，其包含一个或多个编码本文所述的ABM的核酸分子，特别是分离的核酸分子。取决于不同链的数目，每个链由氨基酸序列组成，一个或多个编码核酸分子可用于表达***，其包括一个或多个表达载体中所包含的一个或多个表达盒。
具体地，将所述表达盒并入质粒中，所述质粒包含或合并本文所述核酸，其可选地包含其他序列，以表达由核酸序列编码的ABM，例如调控序列。
本发明进一步地提供了包含本文所述表达***的宿主细胞。具体地，宿主细胞是生产宿主细胞，所述生产宿主细胞包含至少一个表达盒或质粒，其并入一个或多个编码本文所述ABM的核酸分子。
具体地，宿主细胞瞬时地或稳定地表达ABM。根据具体的实施例，宿主细胞是真核宿主细胞，优选地，是任何酵母或哺乳动物细胞。
本发明进一步地提供了产生本文所述的ABM的方法，其中将本文所述的宿主细胞，在产生所述ABM的条件下培养或维持。
具体地，可以从细胞培养上清液中分离和/或纯化ABM。根据一特定的实施例，ABM是双特异性全长抗体，该双特异性全长抗体是异二聚体，包含两个不同HC和两个不同LC，并且ABM分别包含正确配对的同源HC/LC对和同源CL和CH1结构域，并且ABM是由宿主细胞产生的，其中少于10％产生的抗体是错误配对的，优选地少于5％，正如通过质谱法(LC-ESI-MS)比较最大峰强度所测量的。
具体地，本文描述的ABM或ABMC被提供用于医学、诊断或分析用途。
具体地，本文所述的ABM或ABMC被提供用于治疗癌症、自身免疫性疾病或过敏，靶向至少一种与所述疾病相关的抗原。因此，本发明进一步地涉及通过以有效量的本文所述的ABM或ABMC进行给药，来治疗患有癌症、自身免疫疾病或过敏的受试者的方法，其中所述ABM或ABMC靶向至少一种与所述疾病相关的抗原。
具体地，所述癌症选自由乳腺癌、***癌、卵巢癌、子***、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、转移性结肠直肠癌(mCRC)、不可切除的肝转移灶、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)组成的组。
本发明进一步地提供了包含本文所述的ABM或ABMC的药物制剂，优选地，以肠胃外或粘膜制剂的形式，可选地，包含药学上可接受的载体或赋形剂。
具体地，本文所述的ABM或ABMC以药物制剂形式提供，所述药物制剂在肠胃外制剂中包含药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明进一步地提供了本文所述的ABMC的生产方法，其包括以下步骤:
a)提供本文描述的ABM；以及
b)通过位点特异性缀合方法，特别是化学缀合方法，使CH2结构域的位置108和113处的一个或两个半胱氨酸中的至少一个硫醇基与异源分子反应。
具体地，所述至少一个硫醇基，使用包含马来酰亚胺基团的缀合接头，通过迈克尔反应与所述异源分子反应。
具体地，所述生产方法不包括裂解分子内的硫或二硫键的措施和/或反应步骤，否则该分子内的硫或二硫键将产生游离的硫醇基，例如，在还原的条件下。因此，在非还原条件下制备ABM和/或ABMC是优选的。
然而，根据一具体方面，将ABM用还原剂预处理以进行还原，并用氧化剂再氧化以制备ABM的游离的反应性半胱氨酸，以准备缀合，这可以提高缀合效率。
除非另有说明，否则本文中的位置根据IMGT***编号(Lefranc et al.,1999,Nucleic Acids Res.27:209-212)。但是，在实施例部分中，使用的是根据Kabat的EU索引进行编号。关于Kabat编号方案的解释可以在Kabat,EA,et al.,Sequences of proteins ofimmunological interest(NIH出版号91-3242,第5版(1991))中找到。表23表示突变蛋白的名称和编号的对应关系，是指参照根据Kabat的EU索引和IMGT编号在本文所指的位置，进行编号。
附图说明
图1：H561-4 Asn325Cys的质谱：用半胱氨酸修饰剂进行的处理，导致最大峰的位移约为829.5Da，对应于一个修饰的半胱氨酸残基。H561-4 Leu328Cys的质谱分析：用半胱氨酸修饰剂进行的处理，导致最大峰的位移约为1659Da，对应于两个修饰的半胱氨酸残基。
图2：双半胱氨酸取代突变体CX_N325CL328C-mal-val-cit-MMAE的HIC分析。
图3：单和双半胱氨酸取代突变体的质谱分析。
图4：B10v5x225M SEED–mal-val-cit-MMAE缀合物的HIC分析。
图5：CX_Alexafluor488和单半胱氨酸取代的突变体CX_N325C(Asn325Cys)和CX_L328C(Leu328Cys)突变体，与马来酰亚胺-Alexafluor488的偶联，内部化至EGFR强阳性A431和MB-MDA468细胞中。
图6：在pH 5.8时结合CX和CX_Asn325CysLeu328Cys_CysP6的FcRn，然后pH调至7.4用于解离。
图7：序列
SEQ ID NO:1：包含N325C取代的人类CH2的氨基酸序列，其中根据Kabat的EU索引进行编号；
SEQ ID NO:2：包含L328C取代的人类CH2的氨基酸序列，其中根据Kabat的EU索引进行编号；
SEQ ID NO:3：包含N325C和L328C取代的人类CH2的氨基酸序列，其中根据Kabat的EU索引进行编号；
SEQ ID NO:4：包含N325C取代的人类Fc的氨基酸序列，其中根据Kabat的EU索引进行编号；
SEQ ID NO:5：包含L328C取代的人类Fc的氨基酸序列，其中根据Kabat的EU索引进行编号；
SEQ ID NO:6：包含N325C和L328C取代的人类CH2的氨基酸序列，其中根据Kabat的EU索引进行编号；
SEQ ID NO:7：人类IgG1铰链区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:8：人类IgG1的CH3的氨基酸序列
SEQ ID NO:9：人类IgG1的氨基酸序列，根据SEED技术进行工程化包括一AG链；
SEQ ID NO:10：人类IgG1的氨基酸序列，根据SEED技术进行工程化包括一GA链
图8：用Mal-Val-Cit-MMAE评估基于西妥昔单抗的ADC的体外细胞毒性。
图9：在位置N325和L328C处，具有半胱氨酸突变的未缀合和毒素缀合的HER2结合抗体的HIC色谱图。
具体实施方式
在整个说明书中使用的具体的术语，具有以下含义。
如本文所用，术语“抗原结合分子”或ABM是指包含抗原结合部分的分子，其能够特异性地识别具有一定结合亲和力和/或亲合力的抗原或其表位，在本文中也称为“结合结构域”。根据ABM的具体的实施例，结合结构域是免疫球蛋白型结合区域或一个或多个(例如2个)抗体结构域，该抗体结构域包括CDR环或非CDR(或结构)环中的抗原结合位点，和尤其是抗原结合部分包含在以下任意中：单结构域抗体、单链可变域(VH/VL)、Fd、Fab、F(ab')2、scFv、Fd、Fv、抗原结合CH3、Fcab、mAb2、犰狳重复多肽、纤连蛋白III型结构域、肌腱蛋白III型结构域、锚蛋白重复基序结构域、脂蛋白、Kunitz结构域、Fyn衍生的SH2结构域、小蛋白、C型凝集素样结构域支架、工程化的抗体模拟物，以及保留抗原结合功能的任意上述的任何基因操纵的对应物。
ABM的具体实施方案包括抗体或其抗原结合片段，或由抗体或其抗原结合片段组成。
如本文所用，术语“抗体”定义为抗原结合多肽，其为免疫球蛋白，或类似免疫球蛋白的分子，或表现出模块化抗体形式的其他蛋白质，例如由一个或多个抗体结构域组成，并具有类似于免疫球蛋白或抗体的抗原结合特性，特别是可能表现出单或双或多特异性，或单、双或多价结合特性的蛋白质，例如，至少两种特异性结合位点，用于例如抗原、效应分子或结构(特别是病原体起源的或人类结构的，例如包括细胞相关蛋白或血清蛋白在内的自身抗原位)的表位。术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。
抗体通常由抗体结构域组成或包含抗体结构域，其被理解为免疫球蛋白的重链和/或轻链的恒定和/或可变结构域，其具有一个或多个或不具有接头序列。抗体特别地理解为由可变和/或恒定抗体结构域的组合组成或包含可变和/或恒定抗体结构域的组合，该结构域具有或不具有连接序列或铰接区域，包括可变的抗体结构域对，例如一个或两个VH/VL对。如果多肽包含的β-桶状结构，是由通过环序列连接的抗体结构域结构的至少两个β链组成的，则应被理解为抗体结构域。抗体结构域可以是天然结构的，或者可以通过诱变或衍生修饰，例如修饰抗原结合特性或任何其他特性，例如稳定性或功能性的特性，例如与Fc受体FcRn和/或Fc的γ受体的结合。
如本文所用，术语“抗体”具体地包括全长抗体，包括免疫球蛋白样结构的抗体。具体地，抗体可以是全长抗体，例如IgG类型(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。通常地，具有通过特异性的CDR结构的抗原结合位点的抗体，能够通过VH/VL结构域的CDR环来结合目标抗原。
术语“抗体”进一步地包括抗体、抗体结构域或抗体片段的任何衍生物、结合或融合。
术语“全长抗体”用于指包含抗体的Fc区域，或抗体的至少大部分Fc部分，其具体地包括重链的二聚体。全长抗体可以是单特异性或多特异性的，例如双特异性的，例如双特异性mAb2。本文使用术语“全长抗体”强调特定的抗体分子不是抗体片段。
据此，抗体通常地被理解为蛋白质(或蛋白质复合物)，其包括一种或多种基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ的恒定区域基因，以及免疫球蛋白可变区域基因。轻链(LC)分为κ(包括VL和Cκ结构域)或λ(包括VL和C的λ结构域)。重链(HC)分为γ、μ、α、δ或ε，它们反过来定义了免疫球蛋白类别，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
术语“抗体”应具体地包括分离形式的抗体，其基本上不含针对不同目标抗原的其他抗体，和/或包含抗体结构域的不同结构排列。分离的抗体仍然可以包含在组合制剂中，所述组合制剂包含分离的抗体的组合，例如至少一种其他抗体，例如单克隆抗体或具有不同特异性的抗体片段。
术语“抗体”应适用于动物来源的抗体，包括人类物种、例如哺乳动物，包括人、鼠、兔、山羊、骆驼科动物、美洲驼、牛和马，或禽类，例如母鸡，所述术语应特别地包括基于动物来源序列的重组抗体，例如人类序列。
术语“抗体”特别适用于人类抗体。
关于抗体使用的术语“人”，应理解为包括具有衍生自人类种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区域的抗体。人类抗体可以包括氨基酸残基，所述氨基酸残基，不是通过人类种系免疫球蛋白序列(例如，通过体外随机或定点诱变，或通过体内体细胞突变引入的突变)编码的，例如在CDR中。人类抗体包括从人类免疫球蛋白库，或从用于一种或多种人类免疫球蛋白转基因的动物中分离的抗体。
人类抗体优选地选自或衍生自由IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM组成的组。
鼠抗体优选地选自或衍生自由IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3和IgM组成的组。
术语“抗体”进一步地适用于嵌合抗体，例如，具有不同物种的起源序列(例如鼠源和人源序列)的嵌合抗体。
关于抗体使用的术语“嵌合”，是指这样的分子，其中重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分，与衍生自特定的物种或属于特定类别的免疫球蛋白中的相应的序列是同源的，而链的其余部分与另一个物种或类别中的相应的序列是同源的。通常地，轻链和重链的可变区域模拟衍生自一种哺乳动物的免疫球蛋白的可变区域，而恒定部分与衍生自另一种哺乳动物的免疫球蛋白的序列是同源的。例如，可变区域可以衍生自目前已知的来源，使用从非人类宿主有机体中容易获得的B细胞或杂交瘤，与衍生自例如人类细胞制剂的恒定区域结合。
术语“抗体”可以进一步地应用于人源化抗体。
关于抗体使用的术语“人源化”，是指具有抗原结合位点的分子，该分子基本上衍生自非人类物种的免疫球蛋白，其中分子的剩余的免疫球蛋白结构是基于人类免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或仅将互补决定区(CDR)移植到可变结构域的适当的框架区域上。抗原结合位点可以是野生型或经修饰的，例如，通过一个或多个氨基酸取代，优选地进行修饰，使其更类似于人类免疫球蛋白。某些形式的人源化免疫球蛋白保留了所有CDR序列(例如，人源化小鼠抗体，其包含来自小鼠抗体的所有六个CDR)。其他形式具有相对于原始抗体改变的一个或多个CDR。
根据一具体的实施方案，本文所述的ABM中包含的所有抗体结构域是人类来源或人类化或其功能活性变体，具有至少60％序列一致性，或至少70％、80％、90％或95％的序列一致性，优选地，其中抗体结构域的起源是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM或IgE抗体中的任意。具体地，所有抗体结构域都源于相同的基本免疫球蛋白折叠，尽管b-折叠形式可能不同，并且连接环当然是可变的，尤其是在V结构域中。
术语“抗体”还适用于单克隆或多克隆抗体，特别是重组抗体，该术语包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有抗体和抗体结构，例如源自动物的抗体，例如哺乳动物，其包括来自不同来源(例如嵌合、人源化抗体或杂交瘤来源的抗体)的基因或序列的人类。进一步的示例是指从宿主细胞中分离的抗体，该宿主细胞被转化以表达抗体，或者从抗体或抗体结构域的重组组合库中分离的抗体，或通过涉及抗体基因序列与其他DNA序列剪接的，任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。
术语“抗体”应理解为包括新的或现有的功能活性变体，例如天然存在的抗体。
还应理解，术语ABM或抗体的变体，特别是抗体样分子的变体，或抗体变体，也应包括此类分子的衍生物。
衍生物是一种或多种ABM和/或融合蛋白的任意组合，其中ABM的任何结构域或微结构域，可以在任何位置与一种或多种其他蛋白(例如与其他ABM，例如抗体或抗体片段)融合，还可与配体、酶、毒素等融合。
本文所述的ABM或ABMC可以特异性地用作分离的多肽或用作组合分子，例如，通过重组、融合或缀合技术与其他肽或多肽结合。肽优选地，与抗体结构域序列是同源的，并且优选地长为至少5个氨基酸，更优选地长为至少10或甚至至少50或100个氨基酸，并且至少部分地构成抗体结构域的环结构域。
ABM或抗体的衍生物也可以通过缔合获得，或通过各种化学技术，例如共价偶联、静电相互作用、二硫化物结合等，与其他物质结合而获得。与抗体结合的其他物质可以是脂质、碳水化合物、核酸、有机和无机分子或其任何组合(例如PEG、前药或药物)。衍生物也将包含具有相同氨基酸序列但完全地或部分地由非天然或化学修饰的氨基酸制成的ABM或抗体。在一具体的实施方案中，ABM是包含附加标签的衍生物，该附加标签允许与生物学上可接受的化合物具体的相互作用。对于可用的标签没有特别的限制，只要它对抗体与其目标的结合没有或可忍受的负面影响即可。合适的标签的示例包括His标签、Myc标签、FLAG标签、链球菌标签、钙调蛋白标签、GST标签、MBP标签和S标签。在另一个具体的实施方案中，抗体是包含标记的衍生物。如本文所用，术语“标记”是指可检测的化合物或组合物，其直接或间接地缀合至ABM，从而产生“标记的”ABM。标签本身可以被其本身检测到，例如放射性同位素标记或荧光标记，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。
ABM或抗体的衍生物是例如分别衍生自亲本ABM和抗体序列，例如亲本抗原结合(例如CDR)或框架(FR)序列，例如，突变体或变体，其通过例如在计算机上，或重组工程化，或其它通过化学衍生或合成，从而获得。
本文所用的术语“变体”应具体地包括本文所述的任何“突变体”、“同源物”或“衍生物”。术语“变体”应具体地涵盖以某些功能为特征的功能活性变体。
如本文进一步所述，本文所述的ABM或抗体的功能性的特征尤其在于某些抗原结合性质(特别是表位特异性)和被工程化为CH2结构域的半胱氨酸的游离的硫醇基团。
术语“变体”应特别地指抗体，例如突变抗体，或ABM的片段或抗体，例如通过诱变方法获得的，特别是删除、交换、将***物引入特异性的抗体的氨基酸序列或区域，或化学地衍生氨基酸序列，例如，在恒定结构域中工程化抗体的稳定性、效应子功能或半衰期，或在可变结构域中改善抗原结合的性质，例如，通过本领域可获得的亲和力成熟技术。可以采用任何已知的诱变方法，包括在期望的位置点突变，例如通过随机技术获得。在某些情况下，位置是随机地选择的，例如，用任何可能的氨基酸或优选的氨基酸的选择，来随机化抗体序列。术语“诱变”，是指用于改变多核苷酸或多肽序列的任何本领域公认的技术。优选的诱变的类型，包括易错PCR诱变、饱和诱变，或其他定点诱变。
本文中的术语“功能变体”也称为“功能活性变体”，可以例如，包括序列，所述序列是源于通过***、删除或取代一个或多个氨基酸的亲本序列的修饰，或在氨基酸序列或核苷酸序列中的核苷酸或在序列的一个或两个远端(例如在CDR或FR序列中的修饰，并且该修饰不会影响，特别是损害，该序列的活性)中一个或多个氨基酸残基的化学衍生。在对所选目标抗原具有特异性的结合位点的情况下，抗体的功能活性变体仍将具有预定的结合特异性，尽管这可以改变(例如改变对特定表位的精细特异性、亲和力、亲合力、Kon或Koff速率等)。例如，亲和力成熟的抗体，特别地理解为功能活性变体抗体。因此，亲和力成熟的抗体中的修饰的CDR序列，理解为功能活性变体。
功能活性优选地，由与亲本分子相比的变体的结构和功能决定，例如，在测定结合目标抗原的特异性和/或所需的分子在体内的半衰期，和/或FcRn以pH依赖性方式而结合的测定中，例如，在标准的测定中通过测量抗体的功能来确定。
当抗原在细胞表面表达时，通常地，在ELISA测定法、BIAcore测定法、Octet BLI测定法或基于FACS的测定法中，确定ABM在抗原结合方面的功能活性。
可以获得功能活性变体，例如，通过改变亲本ABM的序列，例如，具有抗体的特定天然结构(例如IgG1结构)的单克隆抗体，以获得在识别目标抗原方面具有相同特异性，但具有不同于亲本结构的结构的变体，例如，修饰任何抗体结构域以引入特异性突变，产生双特异性构建体，或产生亲本分子的片段。
通常地，可以修饰亲本ABM或序列以产生变体，所述变体在除了抗原结合位点，或结合位点内之外，还能在序列区域内结合突变，其不会损害抗原结合，并且优选地，具有与亲本ABM相似的生物活性，包括结合抗原的能力，例如，如通过针对抗原的特异性结合测定或功能测试所确定的，具有基本上相同的生物学活性。
如本文所用，术语“基本上相同的生物学活性”，是指基本上相同的活性所显示的活性，该活性至少是针对可比较的或亲本ABM所确定的活性的至少20％、至少50％、至少75％、至少90％，例如至少100％，或至少125％，或至少150％，或至少175％，或至多200％的活性。
本文所述的优选的变体在抗原结合方面具有功能活性，优选地，其具有特异性地结合单个抗原的能力，并且非显著地结合不是目标抗原的其他抗原，例如其具有的Kd值差至少为2log，优选地至少为3log。通常地，通过功能活性变体进行的抗原结合通常不会受到损害，其对应于作为亲本ABM或序列基本相同的结合亲和力，或包含序列变体的ABM，例如，其Kd值差小于2log，优选地小于3log，然而，甚至可能改善亲和力，例如，其Kd值差至少为1log，优选地至少为2log。
在一优选的实施方案中，亲本ABM的功能活性变体
a)是ABM的生物上的活性片段，该片段包含至少50％的分子序列，优选地，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％，最优选地至少97％、98％或99％；
b)通过至少一种氨基酸取代，添加和/或删除衍生自ABM，其中功能活性变体与该分子或其部分具有序列一致性，例如，具有至少50％序列一致性的抗体，优选地至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，还更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选地至少97％、98％或99％；和/或
c)由ABM或其功能活性变体组成，并且另外包含与多肽或核苷酸序列异源的至少一种氨基酸或核苷酸。
在一个实施方案中，本文所述的ABM的功能活性变体与上述变体基本相同，但是分别不同于其多肽或编码核苷酸序列，因为其衍生自不同物种的同源序列。这些被称为天然存在的变体或类似物。
术语“功能活性变体"还包括自然产生的等位基因变体，以及突变体或者其他任何非自然产生的变体。在现有技术中已知的是，等位基因变体(多)肽的改变形式，其特征是具有一个或多个氨基酸的替换、删除或添加基本上不改变多肽生物学功能的一种或多种氨基酸。
当如本文所述使用时，可以通过多肽或核苷酸序列中的序列改变，例如通过一个或多个点突变，来获得功能活性变体，其中序列改变保留或改善了未改变的多肽或核苷酸序列的功能。这种序列改变可以包括但不限于，(保守的)取代、添加、删除、突变和***。
特定的功能活性变体是CDR变体。CDR变体包括由CDR区域中的至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，其中所述修饰可以是氨基酸序列的化学或部分改变，其修饰允许该变体保留未修饰序列的生物学特征。CDR氨基酸序列的部分改变可以是通过删除或取代一个至几个氨基酸，例如1、2、3、4或5个氨基酸，或通过添加或***一个至几个氨基酸，例如1、2、3、4或5个氨基酸，或通过化学衍生一个至几个氨基酸，例如1、2、3、4或5个氨基酸或其组合。氨基酸残基中的取代可以是保守的取代，例如，用一个疏水性氨基酸替代另一个疏水性氨基酸。
保守的取代是指那些发生在氨基酸家族内部，涉及它们侧链和化学性质的取代。这种家族的示例是具有基本的侧链、具有酸性侧链、具有非极性脂肪族侧链、具有非极性芳香族侧链、具有不带电极性侧链、具有小侧链或具有大侧链等的氨基酸。
点突变特别应特别地理解为多核苷酸的工程化，其与非工程化的氨基酸序列的不同在于，一个或多个不同氨基酸的单个的(非连续)或双个的氨基酸的取代或交换，删除或***。
如本文进一步描述的，工程化到CH2结构域的位置108和/或113处的半胱氨酸，通常地通过定点突变获得，导致天然存在的氨基酸残基被半胱氨酸残基取代。
除了这种点突变之外，ABM还可包含点突变，例如用于在不同的预定位置处引入一个或多个另外的半胱氨酸或赖氨酸残基，其可用于缀合另外的异源分子。根据一具体的实施方案，本文所述的ABM工程化用于此类点突变，该点突变不改变糖基化位点的数量和类型。
本文所述的ABM的变体可包括点突变，该点突变是指相同极性和/或电荷的氨基酸的交换。在这方面，氨基酸是指由六十四个三联体密码子编码的20种天然存在的氨基酸。这20个氨基酸可以分为具有中性电荷、正电荷和负电荷的氨基酸：
下表中显示了20种天然存在的氨基酸，以及它们各自的三字母和单字母代码以及极性：
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关于多肽序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”，定义为在候选序列中的氨基酸残基百分比，其与在特定多肽序列中的氨基酸残基相同，为了实现最大百分比序列一致性，而不考虑任何保守的取代作为序列一致性的一部分，如果有必要，可在序列比对和引入空隙后计算氨基酸残基百分比。本领域技术人员可确定测定比对的适当的参数，包括在比较序列的全长上，实现最大比对所需的任何算法。
ABM变体特别地理解为包括具有特定糖基化模式的同源物、类似物、片段、修饰或变体，例如，通过糖工程化生产的，其是功能性的，并可用作功能性的等同物，例如，与特定目标结合并具有功能特性。ABM可以是糖基化的或未糖基化的。例如，如本文所述的重组的ABM可以在合适的哺乳动物细胞中表达，以允许通过表达ABM的宿主细胞确定的分子的特异性糖基化。
抗体结构域，特别是恒定抗体结构域(例如CL或CH1结构域)的术语“β-折叠”或“β链”，在本文中以下列方式理解。抗体结构域通常地由通过至少两个或三个主链氢键侧向连接的至少两个β链组成，形成大体上扭曲的、褶皱的折叠。β链是长度通常地为3至10个氨基酸的单个连续氨基酸段，采用这种扩展的构象，并参与主链与至少一条其他链的氢键，以便它们形成β折叠。在β折叠中，大多数β链与其他链相邻排列，并与它们的邻近物形成广泛的氢键网络，其中一条链的主链中的N-H基团，与相邻链的主链中的C＝O基团建立氢键。
抗体恒定结构域(例如CH2或CH3结构域)的结构，类似于可变结构域，由通过环连接的β链组成，其中一些包含短的α螺旋延伸。正如从各种Fc晶体结构的b因子可以看出，框架大部分是刚性的，而环则相对地是更加柔性的。抗体CH2或CH3结构域通常地具有形成β-折叠(A-B-C-D-E-F-G)的七条β链，其中这些β链通过环连接，三个环位于结构域的N末顶端(A-B、C-D、E-F)，并且另外三个环位于结构域(B-C、D-E、F-G)的N末顶端。结构域的“环区域”是指位于β链区域之间的蛋白质的部分(例如，每个CL或CH1结构域均包含七个从N-末端朝向C-末端的A至G的β折叠)。
抗体的Fv部分通常地被理解为VL和VH结构域对，其通过连接涉及每个结构域的C、C'和F链的结合表面(结合界面)，而产生(杂)二聚体。通过VL结构域的β-折叠区域与VH结构域的β-折叠区域的这种接触，产生了二聚体(称为VL/VH)。
Fab臂在本文中理解为一对第一和第二抗体链，其中第一链包含VL结构域和CL结构域，或由VL结构域和CL结构域组成，其连接至VL结构域的C末端(轻链，LC)，并且第二条链包含VH结构域和CH1结构域，或由VH结构域和CH1结构域组成，其与VH结构域的C-末端(重链，HC)相连，其中VL通过结合界面与VH连接(配对)，CL通过结合界面与CH1连接(配对)，从而产生LC和HC(也称为LC/HC)的(杂)二聚体。
抗体的Fc部分在本文中被理解为一对抗体链，每一个包含CH2结构域和CH3结构域，其连接至CH2结构域的C末端(Fc链)，其中每个抗体链的CH2结构域通过涉及每个CH2结构域的A、B和/或E链的结合表面(结合界面)相互连接，并且其中每个抗体链的CH3结构域通过涉及每个CH3结构域的A、B和/或E链的结合表面(结合界面)彼此连接(配对)，从而产生Fc链的(均)二聚体。本文所述的Fc可以来自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM。
在本文所述的一个实施方案中，Fc包含突变的CH3结构域，其在结构环中包含抗原结合位点。此类Fc被理解为抗原结合Fc，并且可以直接用作ABM，或者可以是ABM的一部分，例如，全长抗体的一部分，其包含抗原结合Fc的全长抗体的一部分，而不是在结构环中不包含抗原结合位点的Fc。
在本文所述的一个实施方案中，Fc包含突变的CH3结构域，例如其具有被异源序列取代的一条或多条β链的至少一部分，例如包括一个或多个点突变、隆突或穴突变。在这种情况下，Fc区域包含Fc链的异二聚体，其特征在于通过两个不同的CH3结构域的组装。
具体的隆突突变是一种或多种氨基酸取代，其通过合并一种或多种氨基酸来增加两个结构域之间的接触表面，所述一种或多种氨基酸提供了β链结构的额外突起，例如一种或多种CH3隆突突变，其选自由T366Y、T366W、T394W、F405A组成的组。特异性的隆突修饰表示抗体的CH3结构域中的突变T366W(根据Kabat的EU索引进行编号)。隆突突变特异性地提供匹配的(同源的)表面，以结合另一个抗体结构域，例如对其进行了修饰，以合并穴突变。
特异性的穴突变是一种或多种氨基酸取代，通过合并一种或多种氨基酸来增加两个结构域之间的接触表面，所述一种或多种氨基酸提供了β链结构的额外的穴，例如CH3穴突变中的一个或多个，该CH3穴突变选自由T366S、L368A和Y407V(根据Kabat的EU索引进行编号)组成的组。特异性的穴修饰表示在抗体的CH3结构域中的任何突变T366S、L368A、Y407V、Y407T(根据Kabat的EU索引编号)。穴突变可特异性地提供匹配的(同源的)表面，以结合另一个抗体结构域，例如对其进行了修饰，以合并隆突突变。
将隆突匹配到穴突变中，例如，一个CH3结构域上的T366Y，并在CH3结构域对的第二CH3结构域上匹配Y407’T，本文称为T366Y/Y407'T。进一步的匹配突变是
T366Y/Y407’T，
F405A/T394’W，
T366Y:F405A/T394’W:Y407’T，
T366W/Y407’A，和/或
S354C:T366W/Y349'C:T366'S:L368'A:Y407'V。
(根据Kabat的EU索引进行编号)
特异性的CH3突变包括分子间的β链交换，例如，其中CH3的β链内的一个或多个片段或序列被突变，以合并不同于原始CH3结构域的抗体结构域的片段或序列，例如，不同类型或亚型的抗体结构域。通过链交换获得特异性突变体，其中IgG类型的CH3结构域合并IgA类型的CH3结构域的一个或多个片段或序列。如果两个链交换的CH3结构域突变形成同源的配对，则每个CH3结构域的IgA片段或序列，产生同源的跨域间接触表面，使得突变的CH3结构域，优先地相对于野生型CH3结构域彼此配对。合并片段交换的抗体结构域的此类修饰的具体的示例，可以是链交换工程化的结构域(SEED)。此类修饰可通过优选地配对重链的SEED修饰的CH3结构域，而用于产生不对称或双特异性抗体。这是基于在保守的CH3结构域内，交换结构相关的序列。在SEED的CH3结构域中，源自人类IgA和IgG的交替序列产生两个不对称但互补的结构域，称为AG和GA。SEED设计允许有效生成AG/GA异二聚体，同时不利于AG和GA的SEED的CH3结构域的均二聚体化。
抗体结构域或LC/HC，或Fc链的连接，可进一步地通过结构域内或结构域间的二硫键来支持。二硫键通常地由两个半胱氨酸的硫醇基氧化而形成，从而连接S原子，以在两个半胱氨酸残基之间形成二硫键。
根据一具体的实施方案，抗体结构域包括合并半胱氨酸残基的突变，其能够形成二硫键以通过另外的结构域内二硫键来稳定抗体结构域，或通过另外的结构域间二硫键来稳定抗体结构域配对。具体地，半胱氨酸可以***(通过另外的氨基酸或氨基酸取代)在CH3结构域的C末端区域或C末端。一对带有额外半胱氨酸修饰的CH3，可以通过在CH3配对之间形成二硫键来稳定，从而产生CH3/CH3二聚体。在一些实施方案中，二硫键连接的抗体结构域是同二聚体或异二聚体，因此，是相同或不同结构域的对。
为了允许抗体链或结构域正确配对，可以特异性地使用任何CH3突变，例如隆突入穴技术、SEED技术、电荷排斥技术、二硫键连接或交叉mAb技术，以减少未正确结合的分子的数量。
抗体结构域的“对”在本文中应理解为是两个抗体结构域的集合，其中一个在其表面上，或在空腔中具有区域，所述区域与另一个上的区域特异性结合，并因此互补。抗体结合域可以通过接触β-折叠区域而缔合并组装，以形成一对抗体结构域。这样的结构域对也称为二聚体，例如，通过静电相互作用缔合、重组融合或共价连接，将两个结构域直接物理缔合，例如，包括固体和液体形式。本文具体地描述的是CL/CH1二聚体，其通过本文识别的位置上的某些点突变可以是优选的同源的抗体结构域对。
在一对抗体结构域中，抗体结构域在本文中称为“对应”结构域。在本文所述的抗体中，以下结构域被视为对应结构，其适当地形成一对抗体结构域(对应结构以斜杠(/)分隔):
VL/VH；
CL(Cλ或Cκ)/CH1；
CH2/CH2；
CH3/CH3；
如本文所描述的，关于ABM的术语“多价的”应指具有至少两个结合位点以结合相同目标抗原，特别是结合该目标抗原的相同或不同表位的分子。该术语应包括二价抗体，或具有2个或更多价结合目标抗原的化合价的分子，例如通过至少2、3、4个，甚至更多的结合位点。例如，二价抗体可通过两对VH/VL结构域，其均具有两个抗原结合位点，两者均结合相同的目标抗原。
关于本文所述的ABM的术语“多特异性”应指的是，具有至少两个特异性结合至少两种不同目标抗原的结合位点的分子。该术语应包括双特异性抗体或分子，所述分子具有2种或更多种特异性以结合一种以上的目标抗原，例如通过至少2、3、4个，或者甚至更多的结合位点。
例如，双特异性抗体可以通过第一对VH/VL结构域(第一Fv区域)结合一个目标抗原，并通过第二对VH/VL结构域(第二Fv区域)结合另一目标抗原。双特异性抗体，通常地由四个不同的抗体链组成，即两个HC和两个LC，从而通过第一HC与第一LC，以及第二HC与第二LC的异二聚化(配对)，形成两个不同的CDR结合位点。
在另一实施例中，双特异性抗体可通过在目标抗原结合抗体可变域的CDR环中的一个或多个抗原结合位点结合，而另一种目标抗原则通过抗体恒定域的非CDR环(在本文中称为“结构环”)中的一个或多个抗原结合位点结合。
如本文所用，术语“ABM缀合物”或“ABMC”应指ABM与一个或多个异源分子的缀合物，其中缀合是通过共价偶联异源分子的任何合适方法，例如通过化学或酶促连接。
本文所用的关于异源分子的术语“异源”，其与ABM缀合，应指任何物质分子或分子复合物，该物质分子或分子复合物与ABM的缀合不是天然存在的。异源分子尤其是指人造物质，或非人类或非哺乳动物的生物物质。示例性的异源分子是对目标细胞具有生物学活性的药物或毒素。
通常地，异源分子被衍生为包括缀合接头和/或反应性基团，其能够与ABM的一个或多个游离的硫醇基团反应。
如本文所用，术语“抗原”或“目标”应特别地包括所有抗原和目标分子，其能够通过抗体(也称为互补位)结合位点而识别。如本文所述的通过结合分子靶向的特别优选的抗原，其是那些已经被证明是，或能够与免疫或治疗相关的抗原，特别是那些已经对其临床功效进行测试的抗原。本文所用的术语“目标”或“抗原”应特别地包括分子，所述分子选自由(人类或其他动物)肿瘤相关受体和可溶性肿瘤相关抗原组成的组，所述抗原是自身抗原，例如位于肿瘤细胞或细胞因子或生长因子表面上的受体，这些受体大量地存在于癌症患者的血液中并与这种肿瘤有关。另外的抗原可以是病原体来源的，例如，微生物或病毒病原体。
目标抗原被识别为整个目标分子或被识别为这种分子的片段，尤其是亚结构，例如，目标的多肽或碳水化合物结构，通常地称为“表位”，例如，B细胞表位、T细胞表位，其是免疫相关的，即也可以通过天然或单克隆抗体识别。如本文所用，术语“表位”应特别指分子结构，所述分子结构可完全地构成特异性结合配偶体，或成为本文所述的ABM结合位点的特异性结合配偶体的一部分。术语表位也可以指半抗原。化学上，表位可以由碳水化合物、肽、脂肪酸、有机物、生化或无机物质或其衍生物，以及它们的任何组合组成。如果表位是多肽，则其在肽中通常地将包含至少3个氨基酸，优选地，8至50个氨基酸，更优选地约10-20个氨基酸。肽的长度没有关键的上限，其可以几乎包括蛋白质的多肽序列的全长。表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由多肽或碳水化合物链的一级序列的单个片段组成。线性表位可以是连续的或重叠的。构象表位由通过折叠多肽而形成三级结构而聚集在一起的氨基酸或碳水化合物组成，并且氨基酸在线性序列中不需要彼此相邻。具体地，表位是诊断相关分子的至少一部分，即样品中表位的不存在或存在与疾病或患者的健康状况或与制造或环境中的过程状况或与环境和食品状况定性地或定量地相关。表位也可以是治疗相关分子的至少一部分，即通过特异性的改变了疾病进程的结合结构域作为目标的分子。
具体的实施方案指天然存在的抗原或表位，或表位的合成(人工的)抗原。作为天然存在的抗原的衍生物的人工抗原，可以具有增加的抗原性或稳定性的优点，这与被识别为用于特异性ABM的结合配偶体有关。
本文所使用的“特异性”或“特异性结合”，是指在异源群体分子中对目标同源配体起决定作用的结合反应。因此，在指定条件下(例如免疫测定条件)，本文所述的ABM结合其特定目标，而不会大量结合样品中存在的其他分子。特异性结合是指根据选择的目标识别度，高、中或低结合亲和力或亲合力进行的选择性结合。如果结合常数或者结合动力学常数至少10倍不同，优选地至少100倍不同，更优选地至少1000倍不同，则通常地可实现选择性结合。
如本文所用，术语“抗原结合部分”是指分子(例如，一种肽或多肽，例如抗体结构域)或分子的缔合(例如，肽或多肽二聚体，例如抗体Fv)，具有能够结合抗原相互作用的不同结构。这些分子可以原样使用或整合在更大的蛋白质中，从而形成具有结合功能的此类蛋白质的特异性的区域。可变的结构可以衍生自结合蛋白的天然库，例如免疫球蛋白或抗体。还可通过随机化技术，特别是本文所述的那些，来产生变化的结构。这些包括诱变的CDR或非CDR区域(例如恒定抗体结构域的结构环区域)，抗体可变结构域或恒定结构域的环区域，特别是抗体的CDR环。通常地，本文所述的ABM的抗原结合位点，通过这种抗原结合部分形成。
抗体的抗原结合位点，通常地由重(“H”)和/或轻(“L”)链的N-末端可变(“V”)区域，或其中可变结构域的氨基酸残基形成。在重链和轻链的V区域内的三个高度地发散的延伸片段，称为“高变区域”，在更为保守的侧翼延伸片段之间，作为框架区域。抗原结合位点提供与结合的表位或抗原的三维表面互补的表面，并且高变区域称为“互补决定区域”或“CDR”。并入CDR的抗原结合位点在本文中也称为“CDR结合位点”。
并入到在恒定抗体结构域的结构环区域中的抗原结合位点也称为“非CDR结合位点”。
用以下方式理解术语“表达”。含有所需的编码序列的核酸分子的表达产物(例如本文所述的ABM)和控制序列(例如可操作连接的启动子)的核酸分子可用于表达目的。用这些序列转化或转染的宿主，能够产生编码的蛋白质。为了有效转化，表达***可能包含在载体中，然而，相关的DNA也可能被整合到宿主染色体上。具体地，该术语是指在合适的条件下宿主细胞和相容性载体，例如，用于蛋白质的表达，所述蛋白质由载体携带的外源DNA编码，并引入宿主细胞。
编码DNA是DNA序列，其编码特定的多肽或蛋白质(例如ABM)的特定的氨基酸序列。启动子DNA是DNA序列，其启动、调节或介导或控制编码DNA表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可以来自相同基因或不同基因，并且可以来自相同或不同有机体。重组克隆载体通常将包括一种或多种用于克隆或表达的复制***，一种或多种用于在宿主中选择的标记，例如抗生素耐药性，以及一个或多个表达盒。
本文所用的“载体”定义为克隆的重组核苷酸序列转录所需的DNA序列，即在合适的宿主有机体中，重组基因的转录及其mRNA的翻译。
“表达盒”是指DNA编码序列或DNA片段，可以在定义的限制位点***用于载体的表达产物的代码。盒限制位点的设计可确保将盒***适当的读取框架中。通常地，将外源DNA***载体DNA的一个或多个限制性位点，然后通过载体与可传递的载体DNA一起携带入宿主细胞。具有***或添加的DNA的DNA的片段或序列，例如表达载体，也可以称为“DNA构建体”。
表达载体包含表达盒，并且通常还包含在宿主细胞或基因组整合位点中自主复制的起点，一种或多种可选择的标记(例如氨基酸合成基因或赋予抗生素(例如腐草霉素、卡那霉素、G418或潮霉素)抗性的基因)，多个限制性酶切割位点，合适的启动子序列和转录终止子，这些组分可操作地连接在一起。如本文所用，术语“载体”包括自主地复制的核苷酸序列，以及基因组整合核苷酸序列。载体的常见类型是“质粒”，其通常是双链DNA的自包含分子，该分子可以容易地接受额外的(外源的)DNA，并且可以容易地引入至合适的宿主细胞中。质粒载体通常包含编码DNA和启动子DNA，并具有一个或多个适合***外源DNA的限制性位点。具体地，术语“载体”或“质粒”是指媒介物，其可以通过DNA或RNA序列(例如外源基因)引入宿主细胞，以转化宿主并促进引入的序列表达(例如转录和翻译)。
如本文所用，术语“宿主细胞”应指原代细胞，其被转化以产生特定的重组蛋白，例如本文所述的ABM，及其中的任何后代。应该理解的是，并非所有后代都与亲本细胞完全是一致的(由于故意或无意的突变或环境差异)，但是，只要这些后代保留与原始的转化细胞相同的功能，则这些改变的后代就包括在这些术语中。术语“宿主细胞系”是指用于表达重组基因，以产生重组多肽，例如重组ABM的宿主细胞的细胞系。如本文所用，术语“细胞系”是指已经建立了特定细胞类型的克隆，其具有在长时间内增殖的能力。这样的宿主细胞或宿主细胞系，可以在细胞培养物中维持，和/或培养以产生重组多肽。
如本文所用，术语“分离的”或“分离”，相对于核酸、ABM、ABMC或其他化合物，应指这样的化合物，该化合物从环境中充分地分离出来，并且其与环境自然地关联，从而以“基本上纯净”的形式存在。“分离的”不一定表示着排除与其他化合物或材料的人工或合成混合物，或存在不干扰基本的活性的杂质，并且可能由于，例如不完全纯化而存在。特别地，编码本文所述的ABM的分离的核酸分子，还意味着包括天然存在的核酸序列的密码子优化的变体，以改善在某些宿主细胞，或化学合成中的那些细胞中的表达。
关于核酸，有时使用术语“分离的核酸”。该术语在应用于DNA时，是指与其序列分开的DNA分子，该序列在其起源的生物的自然存在的基因组中立即连续。例如，“分离的核酸”可以包含DNA分子，该DNA分子***载体，如质粒或病毒载体中，或整合到原核或真核细胞或宿主有机体的基因组DNA中。当应用于RNA时，术语“分离的核酸”主要是指通过如上定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。可替代地，该术语可以指已经与其他核酸充分分开的RNA分子，在其天然状态下(即在细胞或组织中)，该核酸将与之缔合。“分离的核酸”(DNA或RNA)可以进一步地代表分子，所述分子是通过生物或合成手段直接地产生，并与其产生过程中其他组分分开。
关于多肽或蛋白质，例如分离的ABM或ABMC，术语“分离的”应特别地指不含或基本上不含其天然地缔合的物质的化合物，例如在它们的自然环境中，或通过体外或体内实践的重组DNA技术进行制备的环境(例如细胞培养物)中发现的其他化合物。分离的化合物可以与稀释剂或佐剂一起配制，并且出于实用目的仍可以分离-例如，当用于诊断或治疗时，多肽或多核苷酸可与药学上可接受的载体或赋形剂混合。
如本文所用，术语“重组”应意指“通过基因工程化制备，或是基因工程化导致的结果”。可替代地，使用术语“工程化的”。例如，可以通过工程化各自的亲本序列以分别产生修饰的ABM、抗体和结构域，来工程化ABM、抗体或抗体结构域，从而产生变体。重组宿主特别地包含表达载体或克隆载体，或者已经对其进行基因工程化，以包含重组核酸序列，特别是采用对宿主而言外源的核苷酸序列。通过在宿主中表达各自的重组核酸来产生重组蛋白。如本文所用，关于ABM或抗体的术语“重组”，分别包括通过重组方式来制备、表达、产生或分离的ABM和抗体，例如(a)ABM或从动物(例如鼠)体内分离的抗体，其对人免疫球蛋白基因或由其制备的杂交瘤是转基因或转染色体的，(b)ABM或从宿主细胞分离的抗体分别转化为表达ABM和抗体，例如从转染瘤中表达，(c)分别从重组的组合人类ABM库和抗体库分离的ABM或抗体，以及(d)通过涉及人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式来制备、表达、产生或分离的ABM或抗体。此类重组ABM或抗体分别包含ABM和抗体，其被工程化为，包括例如在抗体成熟期间发生的重排和突变。
一旦识别出ABM，或具有所期望的结构的抗体，就可以通过本领域众所周知的方法分别产生这种ABM和抗体，包括例如杂交瘤技术或重组的DNA技术。
在杂交瘤方法中，对小鼠或其他合适的宿主动物，例如仓鼠，将其免疫以诱导产生或能够产生与免疫蛋白特异性结合的抗体的淋巴细胞。可替代地，可以在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂，例如聚乙二醇，将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞。
可以检测杂交瘤细胞在其中生长的培养基，用于产生针对抗原的单克隆抗体。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，例如放射免疫测定法(RIA)或酶连接免疫吸附测定法(ELISA)来确定。
重组ABM，特别是单克隆抗体，可以例如通过分别分离编码所需蛋白质和多肽链(例如抗体链)的DNA，并且使用已知的重组表达载体(例如，包含编码本文所述的ABM的核苷酸序列的质粒或表达盒)，用表达的编码序列转染重组宿主细胞来产生。重组宿主细胞可以是原核和真核细胞，例如上述的那些。
根据一特定方面，核苷酸序列可以用于基因的操作以人源化ABM，特别是抗体，或改善其亲和力，或其他特征。例如，如果将ABM用于人类的临床试验和治疗，则可以将抗体恒定区域工程化为与人类恒定区域更相似，以避免免疫应答。基因地操纵ABM序列以获得对目标抗原的更大亲和力，是令人期望的。对于本领域技术人员显而易见的是，可以对ABM进行一种或多种多核苷酸改变，并且仍然保持其与目标抗原的结合能力。
通过各种方式产生ABM，特别是抗体的方法，是通常地为人所理解的。例如，美国专利6331415(Cabilly等人)描述了重组生产抗体的方法，其中重链和轻链在单个细胞中同时从单个载体或两个单独的载体表达。Wibbenmeyer等人(1999，Biochim Biophys Acta 1430(2):191-202)和Lee和Kwak(2003，J.Biotechnology 101:189-198)，描述了使用在大肠杆菌的单独培养物中表达的质粒，由分别产生的重链和轻链生产单克隆抗体。与ABM或抗体产生相关的各种其他技术，在例如Harlow,et al.,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),冷泉港实验室(Cold SpringHarbor),N.Y.,(1988)中提供。
单克隆抗体可以使用通过培养中的连续细胞系产生抗体分子的任何方法来产生。制备单克隆抗体的合适方法的实例包括Kohler等人的杂交瘤方法(1975,Nature 256:495-497)和人类B细胞杂交瘤方法(Kozbor,1984,J.Immunol.133:3001；和Brodeur et al.,1987,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,(MarcelDekker,Inc.,New York),pp.51-63)。
本文所述的ABM或ABMC可用于给药以治疗需要其的受试者。
如本文所用，术语“受试者”应指温血哺乳动物，特别是人类或非人类动物。因此，术语“受试者”也可以特别地指包括狗、猫、兔子、马、牛、猪和家禽的动物。特别地，本文描述的ABM或ABMC被提供用于医学用途，以治疗需要预防，或治疗疾病状况的对象或患者。术语“患者”包括接受预防或治疗的人类和其他哺乳动物受试者。因此，术语“治疗”旨在包括预防性和治疗性治疗。
具体地，本文描述的ABM或ABMC以基本上纯净的形式提供。如本文所用，术语“基本上纯净的”或“纯化的”是指包含至少50％(w/w)，优选地，至少60％、70％、80％、90％或95％的化合物的制剂，例如核酸分子、ABM或ABMC。通过适合于该化合物的方法(例如色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等)来测量纯度。
术语“治疗有效量”在本文中与任何术语，化合物的“有效量”或“足够量”可互换使用，例如本文所述的ABM或ABMC，是当给药于受试者时，“药物”的量或活性足以产生有益或期望的结果，包括临床结果，因此，其有效量或同义词取决于其应用的背景。
有效量是指足以治疗、预防或抑制此类疾病或紊乱的化合物的量。在疾病的上下文中，本文所述的治疗有效量的ABM或ABMC特别地用于治疗、调节、减弱、逆转，或影响受益于ABM与目标抗原相互作用的疾病或症状。
对应于这种有效量的化合物的量，将取决于各种因素而变化，例如给定的药物或化合物、药物制剂、给药途径、疾病或紊乱的类型、被治疗的受试者或宿主的身份等，但是仍然可以由本领域技术人员常规确定。
本文所述的ABM或ABMC可具体地用于药物组合物中。因此，提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的ABM或ABMC以及药学上可接受的载体或赋形剂，例如人工载体或赋形剂，其在体液中不与免疫球蛋白一起自然产生，或与免疫球蛋白一起自然产生，但在包含不同量或比例的载体或赋形剂的制剂中提供。
本文所述的药物组合物可以通过大剂量注射，或输注或通过连续输注方式给药。适合于促进这种给药方式的药物载体，是本领域众所周知的。
药学上可接受的载体通常包括任何和所有合适的固体或液体物质、溶剂、分散介质、涂层、等渗剂和吸收延迟剂等，其与本文所述的ABM或ABMC在生理上是相容的。药学上可接受的载体的其他实例包括无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及它们的任意组合。
在一个这样的方面，可以将ABM或ABMC与一种或多种载体组合物合并，所述载体适合于用于所期望的给药途径。ABM或ABMC可以，例如，与乳糖、蔗糖、淀粉、链烷酸的纤维素酯、硬脂酸、滑石粉、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、***胶、明胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和可选地其它压片或封装进行混合，用于常规给药。可替代地，可以将ABM或ABMC溶解在盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧甲基纤维素胶体溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉籽油、芝麻油、黄苠胶和/或各种缓冲液中。其他载体、佐剂和给药方式在药学领域是众所周知的。载体可包括控制的释放材料，或延时材料，例如单独或与蜡一起使用的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，或本领域熟知的其他材料。
另外的药学上可接受的载体是本领域已知的，并描述在例如REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES中。液体制剂可以是溶液、乳液或悬浮液，并且可以包括赋形剂，例如助悬剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂和螯合剂。
考虑药物组合物，其中配制了本文所述的ABM或ABMC以及一种或多种治疗活性剂。通过将具有所期望的纯度的所述ABM或ABMC，与可选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，以冻干制剂或水溶液形式混合，来制备稳定的制剂以进行储存。用于体内给药的制剂，具体地是无菌的，优选地，是以无菌水溶液的形式。这通过无菌滤膜或其他方法过滤容易地实现。本文公开的ABM或ABMC，和其他有治疗活性的药剂，可能形成免疫脂质体，和/或包被在微胶囊中。
包含本文所述的ABM或ABMC的药物组合物的给药，可以通过多种方式进行，包括口服、皮下、静脉内、鼻内、内服、透皮、粘膜、局部使用，例如凝胶、药膏、洗剂、乳膏等，腹膜内、肌肉内、肺内、***、肠胃外、直肠或眼内。
用于肠胃外给药的示例性制剂，包括适合于皮下、肌肉内或静脉内注射的那些，例如，无菌溶液、乳剂或混悬剂。
本发明具体地，提供了示例性ABM或ABMC，如本文提供的实施例中详述。进一步的ABM或ABMC变体是可行的，例如，包括示例性的ABM或ABMC的功能变体，例如其中Fc被进一步工程化，以改善分子的结构和功能，或其中包含不同CDR结合位点，或非CDR结合位点的抗体，例如，生产具有不同的特异性。
根据具体实施例，结合FoldX的Fc晶体结构的目视检查，被用于预测突变对Fc分子的可能影响(Schymkowitz et al.,2005)。将半胱氨酸引入IgG1抗体的野生型Fc片段中。通过尺寸排阻色谱、圆二色光谱和差示扫描量热法，对所得突变的Fc片段的生化和生物物理特性进行表征。使用表面等离振子共振测量，来表征与蛋白A、FcRn、CD16a和CD64的结合。使用Ellman分析法，滴定分子上的游离的硫醇。用市售的马来酰亚胺偶联试剂盒，将蛋白质特异性地生物素化。随后使用生物层干涉术，用抗生蛋白链菌素结合测定法测定生物素化。然后将产生具有野生型样SEC、DSC、CD谱图和特异性生物素化作用的Fc片段的突变引入到结合EGFR的Fcab中。进行了相同的蛋白质基本表征，此外，进行了内化分析，其中结合EGFR的Fcab与荧光团进行特异性地偶联，以证明该前ADC(preADC)构建体具有所预期的和必要的特性。
与现有技术的半胱氨酸取代相比，如Getarea分析，发现位置108和113处半胱氨酸(根据IMGT编号)都被掩埋了(http://curie.utmb.edu/getarea.html；参考Fraczkiewicz,R.and Braun,W.(1998)J.Comp.Chem.,19,319-333.)，同时发现所有其他现有技术的残留物都暴露在溶剂中。假定由于在这些位置上的药物缀合提供了更好的结果，因此由于暴露而进行了这些现有技术的替代。然而，令人惊讶的是，如本文所述，在CH2结构域的F-G环中对掩埋位置的选择甚至更好，这是因为在重组抗体的产生过程中，工程化的半胱氨酸的氧化的翻译后修饰的程度惊人的低。
这种氧化的翻译后修饰的产生是为人熟知的(Chen XN et al.MAbs.2009；1(6):563-71),例如通过在细胞培养过程中形成的二硫键，在工程化和未配对的半胱氨酸上，是以半胱氨酸化和/或谷胱甘肽化的形式存在。
令人惊讶地发现，在生产过程中未暴露于溶剂的半胱氨酸的抗体中的突变位置，减少了氧化的翻译后修饰的量，因此使得工程化半胱氨酸的SH基团可用于缀合至异源分子。
通过参考下述实例能够得到更充分的理解上述描述。但是，这些实施例仅仅是代表实践本发明的一个或多个实施方案的方法，而不应被解读为限制本发明的范围。
实施例
实施例1：通过N-末端环筛查确定CH2结构域的结构耐受性
为了确定IgG的CH2结构域的三个N末端环中的哪一个可用于与半胱氨酸突变以进行进一步工程化用于偶联毒素分子，进行了以下实验。通过使用定点诱变，用成对的引物elbc1、elbc2、elde1、elde2、elfg1和elfg2，交换BC环、DE环和FG环的残基，将识别序列序列ELDKWA(SEQ ID NO:11)植入到Fc片段的N末端环上。使用Quikchange诱变试剂盒(Agilent)，对克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZalphaA(Thermo Fisher Scientific，在SEQ ID NO:9中的Fc氨基酸序列)中的人类IgG1的Fc序列进行诱变，以得到构建体Fc_ELDKWA_BC(SEQ ID NO:13)、Fc_ELDKWA_DE(SEQ ID NO:14)和Fc_ELDKWA_FG(SEQ ID NO:15)。使用标准方法，将编码突变体的载体线性化，并转化入巴斯德毕赤酵母X33。在含博来霉素的YPD培养基上进行选择。在YPG培养基中培养转化体，并通过添加1％的甲醇诱导蛋白质表达，并持续3天。然后澄清上清液，并通过蛋白A色谱法，纯化肽移植的Fc片段。简言之，将上清液缓冲至pH7.0的0.1M的磷酸钠中，并加载到用相同缓冲液平衡的蛋白A柱上。洗涤后，蛋白质用0.1M的甘氨酸，pH为3.5时洗脱。加入2M的Tris中和含有洗脱液的部分，并用PBS透析。然后通过监测天然条件下的SEC谱图及其抗原识别能力，来测试植入的突变体的完整性。BC环中修饰的Fc突变体产生了较宽的洗脱曲线，而DE和FG植入的变体则是野生型的。在ELISA分析中，ELISAMaxisorp板用5μg/ml的2F5抗体包覆。用4％的BSA-PBS封闭后，3倍稀释系列中的Fc变体，起始浓度为10μg/ml，以允许与抗原反应。用蛋白A-HRP缀合物检测结合，并且用TMB展开反应，并用30％H2SO4终止。在405nm处读取吸光度，并减去620nm处的背景。与BC-环植入的变体相比，DE-和FG-环植入的蛋白质显示出对抗原具有更强的亲和力。由于DE-环定向移植物，消除了人类IgG1的天然存在的N-连接的糖基化位点(EU编号中的残基Asn297和IMGT编号中的84.4)，并且由于N-连接的糖基化与半胱氨酸结合的毒素分子直接相邻是人们所不期望的，在FG环中交换的氨基酸残基似乎最适合取代，并通过诱变成半胱氨酸残基而进一步工程化。
SEQ ID NO:12:Fc野生型序列
SEQ ID NO:13:Fc_ELDKWA_BC
SEQ ID NO:14:Fc_ELDKWA_DE
SEQ ID NO:15:Fc_ELDKWA_FG
表:1
表2：ELISA示出了N末端环移植的Fc变体与2F5抗体的结合
实施例2：筛选CH2结构域中FG环的残基以允许交换为半胱氨酸残基
使用Quikchange位点特异性诱变试剂盒，构建了克隆到pPICZalphaA载体中的Fc片段突变体。将残基Ser324、Asn325、Lys326、Ala327、Leu328、Pro329和Ala330分别地交换为半胱氨酸残基。
表3:
将编码突变体的载体线性化，并转化入巴斯德毕赤酵母X33(英杰公司(Invitrogen))。在含博来霉素的YPD培养基上进行选择。在YPG培养基中培养转化体，并通过添加1％的甲醇诱导蛋白质表达，并持续3天。然后澄清上清液，并通过蛋白A色谱法纯化突变的Fc片段。简言之，将上清液缓冲至pH7.0的0.1M的磷酸钠中，并加载到用相同缓冲液平衡的蛋白A柱上。洗涤后，蛋白质用0.1M的甘氨酸，pH为3.5时洗脱。加入2M的Tris，中和含有洗脱液的级分，并用PBS透析。通过监测天然条件下的SEC谱图分析突变体的完整性，并发现其在野生型Fc典型时间洗脱。突变体Lys326Cys包含5-10％的聚集体，Ala327Cys包含5％的聚集体，所有其他制剂均不含聚集体。
使用差示扫描量热法确定突变体的热稳定性概况。将5μM的蛋白溶液在自动化VP-DSC设备中以1℃/min的加热速率，从25℃加热到100℃，原位冷却并加热以进行第二次温度扫描，以此作为基线。为了进行评估，假设使用Windows的Origin 7.0，采用非2状态转换机制，从热曲线中减去基线并进行去卷积。CH3结构域的热转变几乎与未修饰的Fc相同。相反地，在大多数突变体中，对应于CH2结构域展开的转变在较低的温度下发生。在突变体Lys326Cys和Leu328Cys中观察到最严重不稳定的CH2结构域，Tm的负的位移为4.5℃。Ser324Cys在约3.5℃下去稳定化。突变体Asn325Cys和Ala327Cys的整个熔解曲线与野生型Fc的熔解曲线没有显著的差异。
使用试剂EZ-Link马来酰亚胺-PEG2-生物素(赛默科技(Thermo Scientific))测试蛋白质与马来酰亚胺-生物素的反应性。偶联后，将蛋白质针对PBS进行透析，然后使用生物层干涉仪检测其与ForteBio Octet中抗生蛋白链菌素尖端的结合。使蛋白质结合600s，解离阶段为600s。Fc_Asn325Cys显示强的阳性信号，而Fc_Ser324Cys和Fc_Leu328Cys显示弱的阳性信号。在该测定中，包括野生型Fc在内的所有其他突变体均为阴性。
游离的硫醇基使用Ellman分析法确定。该方法使用Ellman试剂(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸))，根据Riener等人(Riener CK,Kada G,Gruber HJ.Quick measurementof protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4'-dithiodipyridine.Anal Bioanal Chem.2002；373(4-5):266-276)进行。简言之，将蛋白质样品解冻并不稀释地施用。准备了两个装有100mM磷酸钠缓冲液(+0.2mM EDTA)的试管，并将pH分别设置为7.0和8.0。紧接测定之前，制备了10mM的DTNB(77.1mg DTNB在25mL的磷酸钠缓冲液中，pH为7)。使用200μM的BSA溶液作为阳性对照。混合833μL的pH 8的缓冲液+167μL的蛋白质+16.7μL的Ellman试剂，并在20℃下以300rpm摇动孵育30分钟。孵育后，在Hitachi U2910分光光度计上测量412nm的吸收，并使用以下方程式获得硫醇的浓度:
[SH]M＝(A412样品-A412无试剂-A412无蛋白质)÷ε412÷d×6
其中：[SH]M-样品中硫醇的摩尔浓度；A412样品-样品在412nm处的吸收；A412无试剂-无试剂在412nm处的吸收；A412无蛋白质-无蛋白质的空白在412nm处的吸收；ε412-在412nm的摩尔消光系数(14,150M-1cm-1)；d-比色皿的光程；6是稀释因子。
用BSA作为对照，显示硫醇的摩尔浓度为0.6，突变体Fc_Asn325Cys显示出每摩尔接近两个游离的硫醇基的可用的偶联。突变体Fc_Ser324Cys和Fc_Leu328Cys显示出每摩尔可用于偶联的游离的硫醇基少于一个。其他蛋白质显示出没有游离的硫醇基的存在。与EZ-Link马来酰亚胺-PEG2-生物素(赛默科技)反应的蛋白质显示出游离的硫醇基的可用性降低。
表4：硫醇基的摩尔浓度通过Ellman分析确定。
用BIAcore测量确定CD16a结合。Fc突变体Ser324Cys和Lys326Cys显示出与CD16a样野生型Fc相似的结合。所有其他克隆均显示出对该受体的亲和力大大降低。在Pro329Cys和生物素化Asn325Cys的情况下，未观察到结合。
FcRn结合通过BIAcore测量确定。对于野生型Fc和所有半胱氨酸突变体，与FcRn的缔合和解离均相似。生物素化对FcRn结合没有影响。
实施例3：EGFR结合Fcab克隆中的Ser324Cys、Asn325Cys和Leu328Cys突变体
wt Fc的CH2结构域中的FG环中的7个突变体中，有3个半胱氨酸交换的单个突变体被转移至EGFR结合Fcab克隆EAM151-5(WO2011003811A1):Ser324Cys、Asn325Cys和Leu328Cys。使用Quikchange定点诱变试剂盒和下表中列出的引物构建突变体。
表5：
使用试剂EZ-Link碘乙酰基-PEG2-生物素(赛默科技)的碘乙酰基生物素，标记突变体EAM151-5 Asn325Cys和野生型EAM151-5克隆。在即将使用之前，制备了4mM的碘代乙酰生物素试剂溶液。将计算量的试剂溶液添加到蛋白质溶液中，并在黑暗中于室温下孵育90分钟。通过在4℃下针对PBS透析除去未反应的生物素试剂。突变EAM151-5 Asn325Cys在生物层干涉测量中显示出与ForteBio Octet中链霉亲和素末端的显著结合，而生物素化的野生型EAM151-5，生物素化的野生型Fc和非生物素化的蛋白质EAM151-5 Asn325Cys、EAM151-5和野生型Fc，显示未与链霉亲和素尖端的结合。
游离的硫醇基用Ellman试剂滴定。BSA用作对照，并显示出0.64个游离的硫醇基前分子。单半胱氨酸取代的分子，在前分子上显示出不同数量的可接触的硫醇基团:EAM151-5Asn325Cys显示具有1.62个，EAM151-5 Ser324Cys显示具有0.83个，EAM151-5 Leu328Cys显示具有1.2个游离的硫醇基/分子。未修饰的EAM151-5给出阴性结果(0.16个游离的硫醇/分子)，野生型Fc(0.1个游离的硫醇/分子)也给出阴性结果。
巴斯德毕赤酵母衍生的FcabEAM151-5的热展开曲线的去卷积，可以使用三个非2状态转变来解决，其中第一个发生在63.55℃，第二个发生在66.29℃，第三个发生在67.99℃。最不稳定的突变型Fcab是EAM Leu328Cys，其转变温度为58.59℃、62.22℃和65.82℃。EAM Ser324Cys在DSC(58.94℃、62.89℃和65.60℃)中也显示出不稳定的特征。相反地，EAMAsn325Cys的热稳定性曲线接近EAM151-5，并且CH2结构域在61.87℃熔化，其CH3结构域保持其热稳定性(Tm在65.71℃和68.37℃)。
使用表面等离子体共振，确定与CD16a和CD64的结合。与野生型Fc相比，野生型Fc支架中的突变体Asn325Cys和Leu328Cys显示出对CD16a的亲和力显着降低。EAM151-5显示出与CD16a的结合动力学，其类似于野生型Fc。EAM Ser324Cys的结合动力学与EAM151-5相似，独立于生物素化作用。相反地，当未处理时，EAM Leu328Cys与CD16a的结合程度大大降低，而当生物素化时，结合几乎完全丧失。EAM151-5 Asn325Cys的结合力甚至比EAM151-5L328C弱，并且当生物素化时没有反应性。此外，与野生型Fc相比，野生型Fc的支架中的突变体Asn325Cys和Leu328Cys显示出对CD64的亲和力降低。与野生型Fc相比，EAM151-5与CD64的结合减少。与克隆EAM151-5相比，突变EAM151-5 Asn325Cys和EAM151-5 Leu328Cys与CD64的结合较少。
表6：野生型Fc、单一取代的突变体Fc Asn325Cys和Fc Leu328Cys、克隆EAM151-5和单一取代的突变体EAM151-5 Asn325Cys和EAM151-5 Leu328Cys结合至CD16a和CD64。
突变体 结合CD16a 结合CD64
野生型Fc +++ +++
Fc Asn325Cys + ++
Fc Leu328Cys + ++
EAM151-5 +++ ++
EAM151-5Asn325Cys +- +
EAM151-5Leu328Cys +- +
对于所有EAM151-5突变体，其与FcRn结合的动力学是相似的。对于生物素化的蛋白质，未观察到与FcRn的结合差异。
在确定与EGFR结合的ELISA中，野生型Fc作为阴性对照，EAM151-5和单半胱氨酸取代的突变体显示出与EGFR几乎相同的结合。生物素化后工程化的Fc片段显示了非常相似的结合行为。
在使用荧光显微镜的细胞测定中，在体外观察到EAM151-5突变体的内在化(表7)。将强EGFR阳性的MB-MDA468细胞与5μg/mL的Fc片段或EAM151-5克隆一起孵育，其先前已在4℃和37℃下，与Dylight488马来酰亚胺缀合，以分析活性的内在化作用。作为阴性对照，使用具有工程化的半胱氨酸(Fc Asn325Cys)的DyLight488标记的Fc片段。为了证实MB-MDA468细胞摄取的特异性，使用了细胞系EGFR阴性的MCF-7细胞系。使用野生型EAM151-5作为阴性对照。所有修饰的EAM151-5突变体均被细胞内在化。当将细胞与荧光标记的Fc衍生物在4℃孵育时，Fc突变体主要位于细胞表面，并且细胞荧光被解释为阳性信号。当在37℃下用荧光标记的Fc突变体孵育细胞时，点状出现表明荧光标记的Fc片段衍生物的内在化，这被解释为阳性信号。MCF-7细胞未显示任何Dy-Light488缀合的EAM Asn325Cys染色。未经修饰的EAM151-5内在化成MB-MDA468细胞后，显示出微弱的阳性信号，这可能是由于Dy-Light488的非特异性标记所致。
表7：EGFR结合的Fc片段进入MB-MDA468细胞的表面染色和内在化。
突变体 4℃下孵育 37℃下孵育
Fc Asn325Cys - +-
EAM151-5 未进行 +
EAM151-5Asn325Cys +++ +++
EAM151-5Leu328Cys +++ +++
实施例4：Her2结合Fcab克隆中的Asn325Cys和Leu328Cys突变体
克隆到pTT5载体(CNRC)中的Her2特异性Fcab克隆H561-4(Leung et al.MolTher.2015；23(11):1722-1733)用作主链，以引入突变Asn325Cys和Leu328Cys。如实施例2和3所述，使用HiSpeed Quikchange诱变试剂盒引入突变。蛋白质在CHO细胞中表达，并使用蛋白A色谱法纯化。
SEQ ID NO:42.H561-4 Asn325Cys克隆蛋白质序列
SEQ ID NO:43.H561-4 Leu328Cys克隆蛋白质序列
根据以下方案，将微管蛋白聚集抑制剂(Tubulysin)与SPDB接头缀合，并与FcabH-561-4偶联：将毒素在DMSO中稀释，并以1:4摩尔比添加到蛋白质制品中。在室温下孵育1.5h。将混合物加载到在PBS中平衡的PD-10柱上，并以1ml馏分收集蛋白质。通过测量A280识别含蛋白质的部分，并针对PBS透析过夜。
对偶联的突变体进行质谱分析。将3μg所需的蛋白质直接注入LC-MS***(LC:DionexbUltimate 3000LC，MS:Bruker,Maxis 4G，配备标准的ESI来源)。通过从15％到70％的乙腈线性梯度洗脱(Supelco Discovery Bio Wide Pore C5色谱柱，50*0.32mm，3μm的填料)洗脱蛋白质。使用Data Analysis 4.0(Bruker)处理数据，并通过MaxEnt对光谱进行去卷积。
对于变体H561-4 Asn325Cys，完整蛋白的测量结果显示出异质光谱，检测到三个不同的主要变体，表现出948Da的质量增量。然而，全长蛋白(缺少末端赖氨酸)显示出最高的强度。用半胱氨酸修饰剂进行的处理，引起最大峰的大约829.5Da的位移，其是由一个修饰的半胱氨酸残基引起。对于变体H561-4 Leu328Cys，完整蛋白的测量显示异质光谱，检测到三个不同的主要变体，显示出948Da的质量增量。然而，全长蛋白(缺少末端赖氨酸)显示出最高的强度。用半胱氨酸修饰剂进行的处理引起最大峰的大约1659Da的位移，其是由两个修饰的半胱氨酸残基引起。参见图1。
实施例5：西妥昔单抗框架中的Asn325Cys和Leu328Cys突变体
将西妥昔单抗(CX)的重链序列克隆到pTT5哺乳动物细胞表达载体中。使用Lightning Quikchange诱变试剂盒，将单个氨基酸取代Asn325Cys和Leu328Cys引入CX序列(以下序列)。突变Thr250Val和结合的突变Pro271Cys和Arg292Cys(CysP6或CP6)，导致重新相对于野生型稳定CH2结构域的二硫键(CysP6)，引入至CXAsn325Cys和CXLeu328Cys突变体序列中。将重链构建体与CX轻链构建体按1:1质量比混合，然后根据标准方案转染到CHO-S细胞中。用37.5μg的DNA，37.5μl的MAX试剂的混合物，以1×106/ml的密度转染30ml的CHO-S细胞，每种试剂均稀释在600μl的Opti-Pro培养基中。在湿润的气氛中，在5％的CO2下，于37℃下培养7天后，收获上清液，并使用蛋白A纯化法分离蛋白。简言之，将上清液用0.1M的磷酸钠缓冲液结合蛋白AHi-Trap柱，用0.1M的甘氨酸将pH移至3.5洗脱，并立即用2M的Tris中和。在PBS中进行大量透析后，蛋白质被储存在-80℃下。
SEQ ID NO:44.CX重链氨基酸序列(前19个氨基酸，前导肽加下划线)
SEQ ID NO:45.CX重链核苷酸序列
SEQ ID NO:46.CX轻链氨基酸序列(前20个氨基酸，前导肽加下划线)
SEQ ID NO:47CX轻链核苷酸序列
表8：
通过与马来酰亚胺-Alexafluor488一起孵育来标记突变体，并针对PBS进行充分透析，以去除未反应的试剂。使用偶联化学中的FACS实验，与西妥昔单抗通过赖氨酸残基和Alexafluor488偶联相比，评估了它们与强EGFR阳性细胞MB-MDA468和A431的结合水平。收获细胞，并以1×106细胞/ml的密度重悬浮于2％的BSA-PBS中。在96孔板中以100 000个细胞/孔进行染色。将细胞在冰中封闭30分钟，然后在2％的BSA-PBS中，与3倍稀释系列的Alexafluor488偶联的初级抗体，从冰上10nM开始一起孵育30分钟。分析之前，将细胞重悬于200μl的PBD中，稀释后的比例为1:100的7-AAD，并置于冰上。确定活细胞群体的平均荧光强度。高荧光信号表明，马来酰亚胺衍生的荧光团与半胱氨酸残基成功偶联。
此外，通过将细胞暴露于抗体饱和浓度不同的时间段来评估构建体的内在化。然后收集细胞，在2％的BSA-PBS中封闭，并与50μg/ml的Alexa488淬灭抗体一起孵育。根据公开的方案确定内在化抗体的百分比。监测内部化的时间过程，并评估其与西妥昔单抗偶联Alexafluor488赖氨酸残基的内部化是相似的。
为了大规模生产，将构建体转染到ExpiCHO细胞中。使用MaxTiter方案进行蛋白质生产。使用蛋白质A和SEC纯化分离的蛋白。与毒素mal-val-cit-MMAE(vedotin)的偶联是ADCs&Targeted NBE Therapeutics(Merck)的实验室进行的。使用质谱法，确定药物对CX_Asn325Cys的抗体比例(DAR)为1:1.26，CX_Asn325Cys为1:1.64，CX_Leu328Cys为1:1.64和CX_Leu328Cys_CysP6为1:52。
表9：使用马来酰亚胺偶联，与用Alexafluor488标记的突变体的MB-MDA468细胞系结合。
表10：使用马来酰亚胺偶联，与用Alexafluor488标记的突变体的A431细胞系结合。
表11：将CX_N325C突变体内在化到MB-MDA468细胞系中。
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表12：将CX_L328C突变体内在化到MB-MDA468细胞系中
通过使用Quikchange定点诱变试剂盒和引物p378vfor和p378vrev,引入稳定突变Ala378Val，来实现半胱氨酸取代突变体的稳定。如上所述进行蛋白质生产，与马来酰亚胺-Alexafluor488的偶联以及细胞结合测定。
表13：
表14：Ala378Val单半胱氨酸取代突变体与MB-MDA468细胞系的结合
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实施例6：双半胱氨酸突变体CX_Asn325CysLeu328Cys
使用CX_N325C构建体作为模板，并使用引物DDS328和DDS328A构建一个突变体CX_N325CL328C，将半胱氨酸残基引入一个分子的两个目标位置。使用引物CXP271C1和CXP271C2以及CXR292C1和CXR292C2，构建CysP6稳定的变体。
细胞结合抗原的结合与亲本抗体相当。由于在CH2结构域中进行了多次修饰，使用生物层干涉仪检查了突变体CX_Asn325CysLeu328Cys_CysP6与FcRn的结合。当在pH 5.8进行解离时(5.2×10-8对7.2×10-8nM)，发现其结合常数与野生型西妥昔单抗相当，并且保留了其pH依赖性FcRn结合。
表15：
将重链构建体与CX轻链构建体按1:1质量比混合，然后根据标准方案转染到CHO-S细胞中。将30ml的CHO-S细胞以1×106/ml的密度用37.5μg的DNA，37.5μl的MAX试剂的混合物转染，每种试剂均稀释于600μl的Opti-Pro培养基中。在37℃下培养7天后，在5％的CO2的潮湿气氛下收获上清液，并使用蛋白A纯化分离蛋白。简言之，将上清液用0.1M的磷酸钠缓冲液结合蛋白A Hi-Trap柱，并用0.1M的甘氨酸将pH位移至3.5洗脱，并立即用2M的Tris中和。在PBS中进行大量透析后，蛋白质被储存在-80℃下。
通过与马来酰亚胺-Alexafluor488一起孵育来标记突变体，并针对PBS进行充分透析，以去除未反应的试剂。使用NHS偶联化学中的FACS实验，与西妥昔单抗通过赖氨酸残基和Alexafluor488偶联相比，评估了它们与强EGFR阳性细胞MB-MDA468和A431的结合水平。收获细胞，并以1×106细胞/ml的密度重悬浮于2％的BSA-PBS中。在96孔板中以100 000个细胞/孔进行染色。将细胞在冰中封闭30分钟，然后在2％的BSA-PBS中，与3倍稀释系列的Alexafluor488偶联的初级抗体，从冰上10nM开始一起孵育30分钟。分析之前，将细胞重悬于200μl的PBD中，稀释后的比例为1:100的7-AAD，并置于冰上。确定活细胞群体的平均荧光强度。高荧光信号表明，马来酰亚胺衍生的荧光团与半胱氨酸残基成功偶联。
表16：
测试了所有半胱氨酸稳定的突变体以及CX_Asn325CysLeu328Cys和CX_Asn325CysLeu328Cys_CysP6的毒素偶联能力。将MAL-Val-Cit-MMAE以1mg/mL的浓度溶于DMSO，并与突变体以摩尔比为8毒素/抗体分子，进行孵育。经过广泛的透析后，在自然条件下分析了蛋白质制剂在SEC中的分布。SEC是在Superdex HiLoad 16/600Superdex 200pg上进行的，以PBS/0.2M的NaCl作为流动相，以Bio-Rad分子量标准作为蛋白质大小指标。发现分析的突变体不含聚集体。
检查了取代突变体的疏水相互作用色谱(HIC)柱中的迁移模式。层析在ProteomixEthyl-NP5 4.6×100mm Sepax色谱柱上进行，使用的是在25mM的Tris，pH 7.5缓冲液中的1.5至0M的(NH4)2SO4的梯度。突变体CX_Asn325CysLeu328Cys的洗脱时间明显晚于未偶联的蛋白质，这表明偶联的蛋白质与柱基质的相互作用是增加的。质谱分析表明，蛋白质种类与0、1或2个毒素分子结合在一起。参见图2和3。
此外，在WST-1增殖测定中，测试了CysP6稳定的单取代突变体和双突变体CX_Asn325CysLeu328Cys和CX_Asn325CysLeu328Cys_CysP6，对于MB-MDA468和A431细胞系以及作为阴性细胞系的HEK293-6E的细胞毒性。将细胞以10000个细胞/孔的浓度接种到96孔板中，加入100μl的含10％的FCS和青霉素/链霉素的DMEM中，并在5％的CO2的潮湿气氛中附着过夜。从10μg/mL开始，以5倍稀释系列添加毒素结合物和未结合蛋白，并孵育5天。尽管所有突变体均对目标细胞表现出一定程度的细胞毒性，但与未处理的对照相比，CX_Asn325CysLeu328Cys最有效，可导致EGFR阳性细胞系MB-MDA468的增殖降低至17.5％，而A431的增殖降低至24.5％。没有偶联毒素的蛋白质制备对细胞增殖没有影响，缀合的化合物对低的EGFR表达的对照细胞系HEK293-6E也没有影响。
表17：CX_Asn325CysLeu328Cys_mal_val_cit_MMAE对A431细胞系增殖的影响
表18：CX_Asn325CysLeu328Cys_mal_val_cit_MMAE对MB-MDA468细胞系增殖的影响
表19：CX_Asn325CysLeu328Cys_mal_val_cit_MMAE对HEK293-6E细胞系增殖的影响
实施例7：IgG1/2NQ突变体
将单突变Asn325Cys和Leu328Cys与所选的稳定化突变相结合，用于抗体形式的功能化，所述抗体形式是优化以沉默CX-IgG1/2NQ(SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:59)的效应子功能。另外，使用变体hu225M-IgG1/2NQ(以下序列)。
SEQ ID NO:62:CX IgG1/2NQ重链的氨基酸序列(前19个氨基酸，前导肽加下划线)
SEQ ID NO:63:CX IgG1/2NQ重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:64:hu225M-IgG1/2NQ重链的氨基酸序列(前19个氨基酸，前导肽加下划线)
SEQ ID NO:65:hu225M-IgG1/2NQ重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:66:hu225M轻链的氨基酸序列(前19个氨基酸，前导肽加下划线)
SEQ ID NO:67:hu225M轻链的核苷酸序列
使用下表中列出的引物，将Asn325Cys和Leu328Cys突变引入hu225M-IgG1/2NQ。通过使用引物NQN3253CL28C和NQN325CL328CA，通过诱变具有Asn325Cys突变的构建体构建了双突变体hu225M-IgG1/2NQ。
表20：
每个变体均表示为稳定的突变体，一次是与Pro271Cys/Arg292Cys(CysP6)突变的组合，其使用引物NQP1C和NQP1CA以及NQR2C和NQR2CA引入，一次是Ala378Val突变，其通过引物NQA378V和NQA378VA引入。从FoldX算法推断出这种特殊的稳定化动机，结构上位于CH3域的N末端环中，并证实可在3℃下改善CH2结构域的Tm。根据MaxTiter协议，突变体在ExpiCHO细胞中表达。蛋白A纯化后，hu225M变体的产量在18.4至57.7mg/L之间。仅对于用Ala378Val基序稳定的突变体，在天然条件下SEC中的同二聚体的量总计超过90％。Alexafluor488-马来酰亚胺标记可有效地偶联单半胱氨酸取代的突变体，可观察到与EGFR阳性细胞系MB-MDA468的结合。
表21：
实施例8：SEED突变体
将突变Asn325Cys和Leu328Cys引入双特异性抗EGFR/抗c-MET抗体的CH2结构域中，使用SEED技术实现异源二聚化。在该分子中，EGFR特异性抗体hu225M被表达为GA链上的单链片段，未修饰的c-MET特异性Fab片段，与异二聚体Fc的AG链融合。下表中列出了与Quikchange诱变试剂盒一起使用，以引入Asn325Cys和Leu328Cys突变的引物。根据MaxTiter协议，蛋白质在ExpiCHO细胞中表达。蛋白A纯化后，对于野生型，ExpiCHO细胞中的表达量总计为120mg/L，可以通过一步制备SEC过滤除去聚集的物质。将单个取代的变体与mal-val-cit-MMAE偶联。HIC分析显示毒素与Asn325Cys的SEED突变体有效的偶联。参见图4。
SEQ ID NO:80.225M scFv_GA链的蛋白质序列(前19个氨基酸，前导肽加下划线)
SEQ ID NO:81.225scFv_GA重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:82.B10v5_AG重链的蛋白质序列(前20个氨基酸，前导肽加下划线)
SEQ ID NO:83.B10v5_AG轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO:84.B10v5轻链的蛋白质序列(前20个氨基酸，前导肽加下划线)
表22：
表23：突变蛋白的对应名称和编号
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实施例9：IgG形式的单半胱氨酸取代的突变体(西妥昔单抗框架)
表达和稳定策略
通过筛选CH2结构域FG环的氨基酸残基，Fc片段中发现了两个位置Asn325和Leu328，其允许诱变为半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基可以与马来酰亚胺衍生的毒素或替代报道分子，进行偶联。以这种方式修饰的Fc片段仍然表达良好，并且在天然条件下，在SEC中表现出单体特征。构建了西妥昔单抗(CX)抗体的类似突变体。为了解决CH2结构域的不稳定，引入了稳定突变Thr250Val和双突变Pro271Cys/Arg292Cys，其导致了半胱氨酸键的重新形成，在此称为CysP6。Thr250Val源自FoldX算法(Schymkowitz J,Borg J,Stricher F,Nys R,Rousseau F,Serrano L.The FoldX web server:an online force field.NucleicAcids Res.2005；33(网络服务器出版(Web Server issue)):W382-388)并显示出可通过将Fc片段的Tm偏移9℃来稳定Fc片段的CH2结构域，而CysP6源自DSDbase算法(Vinayagam A,Pugalenthi G,Rajesh R,Sowdhamini R.DSDBASE:a consortium of native andmodelled disulphide bonds in proteins.Nucleic Acids Res.2004；32(数据库出版(Database issue)):D200-202。)，并证明可以在9℃的温度下稳定CH2结构域。当与单半胱氨酸突变体组合时，在Leu328Cys的情况下，突变Thr250Val被证明对表达水平有害，在某种程度上阻止了进一步表征。所有其他突变体都可以在HEK293-6E***中高水平表达和纯化，但是它们对半胱氨酸偶联的适应性，特别是对突变Leu328Cys的适应性低。接下来评估CHO细胞表达的突变体。对于所有Leu328Cys取代的变体，与马来酰亚胺-Alexafluor488缀合物偶联的模型(在以下段落中描述)，对CHO表达的蛋白质更为有效。为了更深刻地表征，在ExpiCHO***中表达了突变体，该突变体在纯化蛋白A和凝胶过滤后，递送了约300mg/L的蛋白。
与Alexafluor 488偶联的模型，细胞结合和内在化分析
首先，将单半胱氨酸取代的西妥昔单抗突变体，与马来酰亚胺衍生的Alexafluor488偶联。然后通过将细胞暴露于荧光标记抗体的系列稀释液中，来检查它们与Her1阳性细胞系MB-MDA468和A431的结合。根据标记的细胞群的荧光强度评估偶联的相对水平，并在将荧光读数标准化为最大荧光强度后，评估目标抗原结合。通过用抗Alexafluor488淬灭抗体(Thermo-Fisher Scientific)，淬灭细胞表面结合的荧光团的荧光，并比较未淬灭的样品和淬灭的样品，进行内部化实验(Austin CD，De Maziere AM，Pisacane PI，van Dijk SM，Eigenbrot C，Sliwkowski MX,et al.Endocytosis andsorting of ErbB2 and the site of action of cancer therapeutics trastuzumaband geldanamycin.Mol Biol Cell.2004；15(12):5268-5282.)。监测了内部化的时间过程，并评估其与西妥昔单抗偶联Alexafluor488赖氨酸残基的内部化相似(图5)。有趣的是，与MB-MDA468细胞相比，A431的内在化程度较低。
毒素偶联至半胱氨酸取代的突变体、质谱分析和细胞测定
在使用Alexafluor 488进行初步试验后，将抗体与Mal-Val-Cit-MMAE(vedotin)缀合，以评估具有代表性ADC有效负载的缀合效率。使用非优化方案进行缀合，确定CX_Asn325Cys的药物与抗体之比(DAR)为1:0.74，CX_Asn325Cys_CysP6为1:1.5，CX_Leu328Cys为1:1.56，CX_Leu328Cys_CysP6为1:5。使用体外细胞分析评估了这些ADC的目标细胞毒性。将Her1阳性细胞系A431和MDA-MB-468细胞，接种到多个孔板中，并用ADC和对照分子的系列稀释液处理。孵育三天后，通过使用CellTiter-发光细胞存活力分析(Promega)评估相对细胞存活力(图8)。与对照抗体(未缀合的CX抗体；MMAE缀合的、HER1非结合同种型对照抗体DigxMMAE)相比，所有CX-MMAE缀合物均显示出较低的蛋白质浓度，其细胞存活力低，表明细胞毒性显著增加。细胞毒性小分子MMAE(无间隔物)、紫杉醇和阿霉素可作为其他对照。
半胱氨酸残基被引入一个分子的两个目标位点，并且还构建了CysP6稳定的变体。细胞结合抗原的结合与亲本抗体相当。由于在CH2结构域中进行了多次修饰，使用生物层干涉仪检查了突变体CX_Asn325CysLeu328Cys_CysP6与FcRn的结合。当在pH 5.8时进行解离时(5.2×10-8对7.2×10-8nM)进行分离，发现其结合常数与野生型西妥昔单抗相当，并且其pH依赖性FcRn结合得以保留(图6)。
实施例10：测定突变为半胱氨酸的氨基酸侧链的表面暴露
GETAREA程序(Fraczkiewicz et al.1998,J.Comp.Chem.,19,319-333；可访问网络http://curie.utmb.edu/getarea.html)，允许快速计算溶剂可接触到的表面积，或蛋白质的溶剂化能量。人类IgG1的Fc片段1OQO.pdb的原子坐标，作为输入提供给程序。提供的探针半径为1.4埃。程序的输出如表24所示。
来自主链和侧链原子的贡献分别列在第4列和第5列中。下一列列出了每个残基侧链表面积与“随机卷曲”的比值。残基X的“随机卷曲”值是在30个随机构象的集合中三肽Gly-X-Gly中X的平均溶剂可接触的表面积。如果该比率值超过50％，则认为残留物暴露于溶剂中；如果该比率小于20％，则认为残留物被掩埋，标记为“o”和“i”，分别在最后一列。表25列出了标准遗传密码编码的20个氨基酸的“随机卷曲”值。
从表24所示的结果可以看出，Asn325和Leu328两个残基被掩埋(“在里面”)。
令人惊讶地发现，掩埋在CH2结构域的FG环里面的此类残基，适合用于半胱氨酸工程化。在现有技术中，主要根据表面可及性，选择适合用于Fc定点半胱氨酸工程化，以进行药物结合的合适位点，参见例如，WO 2017/112624 A1，其涉及“残基可接触性”，和WO 2014/124316 A2，其评估所有Fc位置表面的可接触性，以确定选择取代半胱氨酸残基的位点。值得注意的是，根据WO 2014/124316 A2，发现位置325和328(EU编号)处表面接触不足，因此被排除在半胱氨酸工程化之外。
表24：
表25：
实施例11：IgG形式的单半胱氨酸取代突变体(抗HER2框架)
将单氨基酸取代Asn325Cys和Leu328Cys引入衍生自曲妥珠单抗的HER2结合抗体的序列中(以下序列)。DNA链由GeneArt(赛默科技，雷根斯堡)重新合成，并克隆到哺乳动物表达载体pTT5上。将重链构建体与轻链构建体混合，并根据标准的方案转染到Expi293细胞(赛默科技)中。在培养和表达后，通过蛋白A色谱纯化抗体，并将缓冲液更换为PBS，1mM的EDTA，pH为7.4。
为了除去可能与引入的半胱氨酸残基形成二硫键的含硫醇分子，从而妨碍有效的缀合，施加了还原和再氧化方法。因此，通过在37℃下，与每个抗体用40摩尔当量的TCEP(三-(2-羧乙基)-膦)孵育2h，来完全还原抗体。然后，将缓冲液更换为PBS，1mM的EDTA，pH为7.4，并通过在25℃下施加20摩尔当量的DHAA(脱氢抗坏血酸)1.5h，使还原的抗体重新氧化。通过在25℃下，与6摩尔当量的mal-val-cit-MMAE孵育2-16h，然后用25摩尔当量的N-乙酰半胱氨酸淬灭来进行缀合。通过使用Superdex 200 10/300GL柱(GE Healthcare)的尺寸排阻色谱法，从而纯化反应混合物。DAR值通过疏水相互作用色谱(HIC)和ESI-MS确定。对于HIC，将缓冲液调整为0.5M的硫酸铵，然后使用标准HPLC***，将40μg处理过的抗体加到预平衡的MAbPac HIC-丁基柱(赛默科技)上。使用线性梯度从75％缓冲液A(2M的硫酸铵，25mM的Tris-HCl，pH为7.5)/25％的缓冲液B(25mM的Tris-HCl，pH为7.5)到0％的A/80％的B/20％的异丙醇，在20min内洗脱样品，并使用280nm处的UV吸收来监测mAb/ADC信号。
HIC色谱图(图9)显示了有效的和特异性的缀合，这是通过在以后的洗脱时间将抗体峰完全位移至明显的峰来表明的。根据HIC，DAR值是2.0或稍高，其通过质谱分析证实。
为了将描述的半胱氨酸位置与其他已知位置进行比较，另外七个在轻链或重链中具有半胱氨酸突变的HER2结合抗体，即重链位置D265C、S239C、S400C、K290C、S442C，和轻链位置V205C、K183C(所有位置根据EU进行编号)，被引入相同的HER2结合的曲妥珠单抗样抗体。如先前抗HER2抗体描述的缀合抗体，并通过HIC分析。然后，通过将DAR 2物种的HIC保留时间(HIC RRT)除以各个未缀合抗体的保留时间，来确定ADC的相对HIC保留时间(表26)。HIC RRT是ADC疏水性的指标，在很大程度上取决于毒素附着的位置。低RRT可以是体内特性良好的指标。与其他评估的变体相比，与位置N325C和L328C缀合的ADC显示较低范围的RRT。
SEQ ID NO:89.aHER2轻链的蛋白质序列(前20个氨基酸，前导肽加下划线)
SEQ ID NO:90.aHER2重链_N325C的蛋白质序列(前19个氨基酸，前导肽加下划线)
SEQ ID NO:91.aHER2重链_L328C的蛋白质序列(前19个氨基酸，前导肽加下划线)
表26：
本文描述的一些实施方案涉及：
1.特异性抗原结合成员(ABM)，其包含特异性抗原结合部分，和包含CH2结构域的抗体的Fc区域，其经工程化以在位置108和/或113处进行半胱氨酸取代，其中根据IMGT进行编号。
2.根据实施方案1所述的ABM，其中
a)抗原结合部分与所述抗体CH2结构域的N-末端融合；和/或
b)抗原结合部分包含在CH3结构域和/或Fc区域中。
3.根据实施方案1或2所述的ABM，其中所述CH2结构域包含一个或两个半胱氨酸取代，其为N108C和/或L113C，其中根据IMGT进行编号。
4.根据实施方案1至3中任一项所述的ABM，其中所述抗原结合部分包含抗体的抗原结合部分、Fcab、酶、粘附蛋白、受体的配体或配体结合部分。
5.根据实施方案1至4中任一项所述的ABM，其中所述抗原结合部分选自由Fab、F(ab')2、scFv、Fd、Fv、抗原结合CH3、Fcab，和在CDR或非CDR(或结构)环中包含至少一个抗体结合位点的一个或多个抗体结构域组成的组。
6.根据实施方案1至5中任一项所述的ABM，其中所述抗原结合部分通过接头和/或铰链区与CH2结构域的N-末端融合。
7.根据实施方案1至6中任一项所述的ABM，其中所述CH2结构域的C-末端与CH3结构域的N-末端融合，优选地，其中Fc区域包含于抗体Fc中，所述抗体Fc由抗体重链的二聚体组成。
8.根据实施方案1至7中任一项所述的ABM，其中Fc区域是IgG、IgA、IgM或IgE同种型的，优选地，是人类抗体的。
9.根据实施方案1至8中任一项所述的ABM，其是选自由单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体的抗原结合部分、Fcab分子和包含Fcab分子的抗体组成的组的抗体。
10.根据实施方案1至9中任一项所述的ABM，其特异性地识别在目标细胞表面上表达的目标抗原。
11.一种ABM缀合物(ABMC)，其包含实施方案1至10中任一项所述的ABM，以及在CH2结构域的位置108和113处共价缀合至一个或两个半胱氨酸的至少一个异源分子，其中根据IMGT进行编号。
12.根据实施方案11所述的ABMC，其中异源分子是适合用于疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防的物质，优选地，选自由药学的药物质、毒素、放射性核素、免疫调节剂、细胞因子、淋巴因子、趋化因子、生长因子、肿瘤坏死因子、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、microRNA、肽核酸、光活性治疗剂、抗血管生成剂、促凋亡试剂、肽、脂质、碳水化合物、荧光标签、可视化肽、生物素、血清半衰期调节剂、捕获标签、螯合剂和固体支持物组成的组。
13.根据实施方案11或12所述的ABMC，其中所述异源分子通过缀合接头在CH2结构域的位置108和113处与一个或两个半胱氨酸缀合，其中根据IMGT进行编号。
14.根据实施方案13所述的ABMC，其中所述缀合接头包含马来酰亚胺基团。
15.一种表达***，其包含一个或多个编码实施方案1至10中任一项所述的ABM的核酸分子。
16.宿主细胞，其包含实施方案15所述的表达***。
17.根据实施方案1-10中任一项所述的ABM的制备方法，其中在条件下培养或维持实施方案16的宿主细胞以产生所述ABM。
18.药物制剂，其包含根据实施方案1至10中任一项所述的ABM，或根据实施方案11至14中任一项所述的ABMC，以及肠胃外制剂中的药学上可接受的载体或赋形剂。
19.根据实施方案11-14中任一项所述的ABMC的生产方法，其包括以下步骤:
a)提供实施方案1至10中任一项所述的ABM；和
b)通过位点特异性缀合方法，使CH2结构域的108和113处的一个或两个半胱氨酸的至少一个硫醇基与异源分子反应。
20.根据实施方案19所述的方法，其中使用包含马来酰亚胺基团的缀合接头，使所述至少一个硫醇基通过迈克尔反应与所述异源分子反应。

Claims (20)

1.特异性抗原结合抗体，其包含特异性抗原结合部分和人IgG1抗体的Fc区域，所述Fc区域由SEQ ID NO：4、5和6中的任一个所示序列组成，所述Fc区域包含经一个或两个半胱氨酸取代工程化的CH2结构域，所述半胱氨酸取代为N108C、L113C或其组合，以使所述CH2结构域在相应的位置108和/或113处包含一个游离的硫醇基，其中根据IMGT进行编号。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中抗原结合部分与所述抗体CH2结构域的N-末端融合。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述CH2结构域包含两个半胱氨酸取代，其为N108C和L113C，其中根据IMGT进行编号。
4.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗原结合部分选自由Fab、F(ab')2、scFv、Fd和Fv组成的组。
5.根据权利要求1所述的抗体，其中抗原结合部分通过接头和/或铰链区与所述CH2结构域的N-末端融合。
6.根据权利要求1所述的抗体，其中所述CH2结构域的C-末端与CH3结构域的N-末端融合。
7.根据权利要求1所述的抗体，其中所述Fc区域包含于抗体Fc中，所述抗体Fc由抗体重链的二聚体组成。
8.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体选自由单克隆抗体、双特异性抗体和多特异性抗体组成的组。
9.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体特异性地识别在目标细胞表面上表达的目标抗原。
10.抗体缀合物，其包含权利要求1至9中任一项所述的抗体、至少一种异源分子和包含马来酰亚胺基团的缀合接头，其中异源分子与所述一个或两个半胱氨酸共价缀合，所述一个或两个半胱氨酸通过使游离的硫醇基与所述马来酰亚胺基反应，经由缀合接头在CH2结构域的相应的位置108和/或113处引入，其中根据IMGT进行编号。
11.根据权利要求10所述的抗体缀合物，其中异源分子选自由药学的药物质、毒素、放射性核素、细胞因子、淋巴因子、趋化因子、生长因子、肿瘤坏死因子、激素、激素拮抗剂、酶、荧光标签、生物素和捕获标签组成的组。
12.根据权利要求10所述的抗体缀合物，其中异源分子选自由肽、核酸分子、脂质和碳水化合物组成的组。
13.根据权利要求12所述的抗体缀合物，其中核酸分子是寡核苷酸、DNA或RNA。
14.根据权利要求12所述的抗体缀合物，其中RNA是siRNA、RNAi或microRNA。
15.根据权利要求10所述的抗体缀合物，其中抗体包含所述两个半胱氨酸取代N108C和L113C，且异源分子与其中一个半胱氨酸或与两个半胱氨酸缀合，其中根据IMGT进行编号。
16.表达***，其包含一个或多个编码权利要求1至9中任一项所述的抗体的核酸分子。
17.宿主细胞，其包含权利要求16所述的表达***。
18.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体的制备方法，其中在产生所述抗体的条件下，培养或维持权利要求16所述的宿主细胞。
19.药物制剂，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，或根据权利要求10至15中任一项所述的抗体缀合物，和在肠胃外制剂中的药学上可接受的载体或赋形剂。
20.根据权利要求10至15中任一项所述的抗体缀合物的生产方法，其包括以下步骤：
a)提供根据权利要求1至9中任一项所述的抗体；和
b)通过位点特异性缀合方法，使所述一个或两个半胱氨酸取代的至少一个游离的硫醇基与异源分子反应；
其中所述至少一个游离的硫醇基使用包含马来酰亚胺基团的缀合接头通过迈克尔反应与所述异源分子反应。
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