CN101484469B - 生产***-ⅰ的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了生产IGF-I的方法，特征在于培养包含表达载体的原核宿主细胞，所述载体含有编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含所述IGF-I，其N端与前肽C端相连，由此所述前肽C端以氨基酸-Y-Pro结束，其中Y选自Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro或Pro-Arg-Pro，回收所述融合蛋白，用IgA蛋白酶切割，和回收所述IGF-I。IGF-I对于治疗神经变性病症如阿尔茨海默病有用。

Description

生产***-Ⅰ的方法

技术领域

本发明涉及生产***-I(IGF-I)的方法、药物组合物和使用方法。 

发明背景 

人***I(IGF-I)为在结构上与胰岛素相关的循环激素。传统上认为IGF-I是生长激素对外周组织起作用的主要介体。IGF-I由70个氨基酸组成，也称作生长调节素C，且定义为SwissProt No.P01343。其用途、活性和生产在下列文献中提及：例如，le Bouc，Y.等人，FEBS Lett.196(1986)108-112；de Pagter-Holthuizen，P.等人，FEBS Lett.195(1986)179-184；Sandberg Nordqvist，A.C.等人，Brain Res.Mol.Brain Res.12(1992)275-277；Steenbergh，P.H.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.175(1991)507-514；Tanner，J.M.等人，Acta Endocrinol.(Copenh.)84(1977)681-696；Uthne，K.等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.39(1974)548-554；EP 0123228；EP 0128733；US 5,861,373；US 5,714,460；EP 0597 033；WO 02/32449；WO 93/02695。 

IGF-I功能的调控是十分复杂的。在循环中，仅0.2％的IGF-I以游离形式存在，而大部分与IGF结合蛋白(IGFBP)结合，IGFBP对IGF具有极高的亲和力，并调控IGF-I功能。该IGF-I因子可以通过其释放机制如蛋白酶对IGFBP的蛋白水解而局部释放。 

IGF-I在发育和成熟大脑中起旁分泌作用(Werther，G.A.等人，Mol.Endocrinol.4(1990)773-778)。体外研究表明IGF-I为CNS中几种类型神经元的有效的非选择性营养因子(Knusel，B.等人，J.Neurosci.10(1990)558-570；Svrzic，D.和Schubert，D.，Biochem.Biophys.Res.Commun.172 (1990)54-60)，所述神经元包括多巴胺能神经元(Knusel，B.等人，J.Neurosci.10(1990)558-570)和少突胶质细胞(McMorris，F.A.和Dubois-Dalcq，M.，J.Neurosci.Res.21(1988)199-209；McMorris，F.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)822-826；Mozell，R.L.，和McMorris，E.A.，J.Neurosci.Res.30(1991)382-390))。US 5,093,317中提及了胆碱能神经元细胞的存活通过施用IGF-I得到提高。还已知IGF-I刺激外周神经再生(Kanje，M.等人，Brain Res.486(1989)396-398)并提高鸟氨酸脱羧酶活性(US 5,093,317)。US 5,861,373和WO 93/02695中提及了治疗中枢神经***损伤或疾病的方法，主要是通过增加IGF-I和/或其类似物在患者中枢神经***中的活性浓度来影响神经胶质和/或非胆碱能神经元细胞。WO 0232449涉及减轻或预防哺乳动物中枢神经***中局部缺血性损伤的方法，这通过向哺乳动物鼻腔施用包含治疗有效量的IGF-I或其生物活性(片段)的药物组合物来进行。有效减轻或预防与局部缺血事件相关的局部缺血性损伤的量的IGF-I通过哺乳动物的鼻腔吸收并被转运入中枢神经***。EP 0874641请求保护IGF-I或IGF-II在制备用于治疗或预防中枢神经***中的神经元损伤的药物中的用途，所述的神经元损伤是因为AIDS相关痴呆、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病、皮克病、亨廷顿舞蹈病、肝性脑病、皮质-基底神经节综合征、进行性痴呆、具有痉挛性截瘫的家族性痴呆、进行性核上麻痹、多发性硬化、Schilder脑硬化或急性坏死性出血性脑脊髓炎引起的，其中所述的药物为用于在血脑屏障或血-脊髓屏障外部以有效量肠胃外施用所述IGF的剂型。 

游离IGF-I的脑和血清水平的下降与AD的散发和家族形式的发病机制相关。此外，IGF-I防止神经元受到Aβ-诱导的神经毒性的影响(Niikura，T.等人，J.Neurosci.21(2001)1902-1910；Dore，S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)4772-4777；Dore，S.等人，Ann.NY Acad.Sci.890(1999)356-364)。近来，经证实外周施用IGF-I能够降低大鼠和小鼠脑Aβ水平(Carro，E.等人，Nat.Med.8(2002)1390-1397)。此外，研究证实在转基因AD小鼠模型中，延长的IGF-I治疗显著减少了脑淀粉状蛋白斑块的沉 积。这些数据强烈支持了IGF-I能够通过从大脑中清除Aβ降低脑Aβ水平和减轻与斑块相关的脑痴呆的观点。 

IgA蛋白酶的识别位点描述为Yaa-Pro.！.Xaa-Pro。Yaa表示Pro (或极少为Pro与Ala、Gly或Thr组合：Pro-Ala、Pro-Gly或Pro-Thr)。Xaa表示Thr、Ser或Ala(Pohlner，J.等人，Bio/Technology 10(1992)799-804；Pohlner，J.等人，Nature 325(1987)458-462和US 5,427,927)。Wood，S.G.和Burton，J.，Infect Immun.59(1991)1818-1822鉴定了天然切割位点。对于淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)(2型)的免疫球蛋白A1蛋白酶而言，合成的肽底物有自我蛋白酶解位点Lys-Pro-Ala-Pro.！.Ser-Pro，Val-Ala-Pro-Pro.！.Ser-Pro，Pro-Arg-Pro-Pro.！.Ala-Pro，Pro-Arg-Pro-Pro.！.Ser-Pro，Pro-Arg-Pro-Pro.！.Thr-Pro，和IgA1切割位点Pro-Pro-Thr-Pro.！.Ser-Pro和Ser-Thr-Pro-Pro.！.Thr-Pro。 

WO 2006/066891公开了包含***-1(IGF-I)和一个或两个聚乙二醇基团的缀合物，其特征在于：所述IGF-I在野生型IGF-I氨基酸序列的第27、37、65、68位多达三个位置上具有氨基酸改变，使得一个或两个所述氨基酸为赖氨酸，氨基酸27为极性氨基酸但不是赖氨酸，通过所述赖氨酸的伯氨基缀合，所述聚乙二醇基团总分子量为20到100kDa。这样的缀合物对于治疗神经变性病症如阿尔茨海默病有用。 

WO 2006/074390涉及IGF-I变体和包含IGF-I变体与某些融合成分的融合蛋白。WO 2006/074390涉及某些IGF-1变体。 

通过融合蛋白重组生产IGF-I的方法由EP0155655和US 5,158,875已知。但经常发现重组生产的IGGF-I具有微不均一性(Forsberg，G.等人，Biochem.J.271(1990)357-363)。 

发明概述 

本发明提供了在原核生物中重组生产IGF-I的方法，其不带N端附着的甲硫氨酸，具有高纯度和高产率。 

本发明包含生产IGF-I的方法，特征在于： 

a)培养包含表达载体的原核宿主细胞，所述载体含有编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含所述IGF-I，其N端与前肽C端相连， 

b)由此所述前肽C端以氨基酸-Y-Pro结束，其中Y选自Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro或Pro-Arg-Pro， 

c)回收所述融合蛋白，并用IgA蛋白酶切割，和 

d)回收所述IGF-I。 

回收的IGF-I在N端没有甲硫氨酸附着。 

本发明优选实施方案中，前肽选自SEQ ID NO：2-5的肽。 

本发明其它实施方案中，融合蛋白包含所述IGF-I，其N端与前肽C端相连，特征在于所述前肽C端以氨基酸-Y-Pro结束，其中Y选自Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro或Pro-Arg-Pro。由于-Y-Pro序列，前肽能够通过IgA蛋白酶处理而与所述IGF-I分离。 

优选本发明所述的融合蛋白以式Met-X₁-His_n-X₂-Y-Pro-[IGF-I]为特征，其中： 

·Met表示甲硫氨酸， 

·X₁为价键、丝氨酸或天冬酰胺， 

·His为组氨酸， 

·n为0到6的数字， 

·X₂为连接肽，选自SEQ ID NO：6-10的肽， 

·Pro为脯氨酸，和 

·Y选自Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro或Pro-Arg-Pro。 

优选前肽如式Met-X₁-His_n-X₂-Y-Pro-所示，其中： 

·Met表示甲硫氨酸， 

·X₁为价键、丝氨酸或天冬酰胺， 

·His为组氨酸， 

·n为0到6的数字， 

·X₂为连接肽，选自SEQ ID NO：6-10的肽， 

·Pro为脯氨酸，和 

·Y选自Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro或Pro-Arg-Pro。 

前肽C端与IGF-IN端(甘氨酸)相连。前肽的长度优选至多30个氨基酸。优选X₁为价键。优选n为0或6。优选X₂为SEQ ID NO：7的肽。优选Y为Pro-Arg-Pro。 

本发明还包含药物组合物，其包含本发明所述的IGF-I，优选还包含可药用载体。 

本发明还包含生产药物组合物的方法，所述药物组合物包含本发明所述的IGF-I。 

本发明还包含本发明所述的IGF-I在制备治疗AD的药物中的用途。 

本发明还包含治疗AD的方法，特征在于对需要这样治疗的患者给药药物有效量的氨基反应性(amino-reactive)IGF-I，优选每周施用一到两次。 

发明详述 

令人惊奇地发现IgA蛋白酶，优选淋病奈瑟球菌的IgA蛋白酶，能够切割氨基酸序列Y-Pro.！.Gly-Pro。Y选自Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro或Pro-Arg-Pro。优选用作切割位点的序列为Pro-Pro.！.Gly-Pro或Pro-Arg-Pro-Pro.！.Gly-Pro(SEQ ID NO：11)(.！.：切割位置)。对于本发明所述方法，IgA蛋白酶切割位点具有氨基酸共有序列Y-Pro.！.Gly-Pro，由此Gly-Pro为IGF-I的头两个氨基酸。Y优选表示以氨基酸Pro、Pro-Ala、Arg-Pro或Pro-Arg-Pro结尾的氨基酸序列。这样的Y氨基酸序列，特别是Pro-Arg-Pro能够再用Ala或Pro-Ala基团延长，例如Ala-Pro-Arg-Pro(SEQ ID NO：12)或Pro-Ala-Pro-Arg-Pro(SEQ  ID  NO：13)。特别优选的切割氨基酸序列为Pro-Arg-Pro-Pro.！.Gly-Pro(SEQ ID NO：11)、Pro-Ala-Pro.！.Gly-Pro(SEQID NO：14)、Pro-Pro-.！.Gly-Pro(SEQ ID NO：15)、 Ala-Pro-Arg-Pro-Pro.！.Gly-Pro(SEQ ID NO：16)或Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro.！.Gly-Pro(SEQ ID NO：17)。 

根据本发明，术语“IgA蛋白酶”包括特异性切割IgA的蛋白酶和例如Kornfeld，S.J.和Plaut，A.G.，Rev.Infekt.Dis.3(1981)521-534描述的蛋白酶，例如淋病奈瑟球菌(2型)的IgA1蛋白酶。如DE-A 3622221；Koomey，J.M.等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79(1982)7881-7885；Bricker，J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983)2681-2685；Pohlner，J.，Nature 325(1987)458-462；和Halter，R.等人，EMBO J.3(1984)1595-1601描述的重组IgA蛋白酶也同样适合。优选所述IgA蛋白酶为淋病奈瑟球菌的IgA蛋白酶。优选所述淋病奈瑟球菌(2型)的IgA1蛋白酶具有SEQ ID NO：21的序列。 

本发明所述IGF-I指人蛋白，IGF-I由70个氨基酸组成，也称作生长调节素C，且定义为SwissProt No.P01343。其用途、活性和生产在下列文献中提及：例如，le Bouc，Y.等人，FEBS Lett.196(1986)108-112；dePagter-Holthuizen，P.等人，FEBS Lett.195(1986)179-184；SandbergNordqvist，A.C.等人，Brain Res.Mol.Brain Res.12(1992)275-277；Steenbergh，P.H.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.175(1991)507-514；Tanner，J.M.等人，Acta Endocrinol.(Copenh.)84(1977)681-696；Uthne，K.等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.39(1974)548-554；EP 0123228；EP 0128733；US 5,861,373；US 5,714,460；EP 0597033；WO02/32449；WO 93/02695。 

本发明所述IGF-I包含的IGF-I选自：IGF-I、C端截短的IGF-I(缺失3-6个氨基酸)、R36A(用丙氨酸取代第36位的精氨酸)、R37A。优选所述IGF-I C端与人Fc连接，Fc来自IgG，优选IgG1或IgG4。 

C端截短的IGF-I(缺失3-6个氨基酸)为SEQ ID NO：1的IGF-I中C端缺失3-6个氨基酸。 

R36A表示SEQ ID NO：1的IGF-I中氨基酸第36位的精氨酸被丙氨酸取代。 

R37A表示SEQ ID NO：1的IGF-I中氨基酸第37位的精氨酸被丙氨酸取代。 

融合蛋白的编码基因优选处于适合的(优选诱导型)表达信号的控制下，以便能够根据需要生产融合蛋白。可以用适合的原核或真核(植物和动物)细胞作为生产蛋白融合物的宿主细胞；但也可以用非细胞体系。 

本发明所述方法的优选实施方案特征在于：宿主细胞用重组DNA或重组载体转化，其中所述DNA或载体包含至少一拷贝编码本发明所述融合蛋白的基因，在适当培养基中培养转化的细胞，使编码融合蛋白的基因在转化的细胞中表达，用IgA蛋白酶切割融合蛋白，分离IGF-I。 

本发明所述融合蛋白的表达能够通过例如与无赖氨酸的β-半乳糖苷酶基因片段融合，在DNA水平得到改善，即Y包含无赖氨酸的β-半乳糖苷酶蛋白的一部分。其它增加融合蛋白表达的供选方案为技术人员已知。表达产物的纯化和分离能够通过与其它多肽融合得到促进，特别是带高电荷的多肽或蛋白(例如多聚(Lys，Arg))，或能够以高亲和力与特定物质结合的多肽或蛋白(例如链霉亲和素)(见例如EP-A 0089626，EP-A 0306610)。特别优选的连接肽是SEQ ID NO：6-10的肽，优选N端前有SHHHHHH(SEQ ID NO：18，NHHHHHH(SEQ ID NO：19)或HHHHHH(SEQ ID NO：20)。 

本发明还提供编码本发明所述融合蛋白的(重组)核酸，其中IgA蛋白酶切割位点整合在前肽和IGF-I之间的连接区域。 

本发明所述的重组DNA可以通过分子生物学领域技术人员已知的方法获得。为此，载体含有编码IGF-I氨基酸序列的DNA序列，通常用限制性核酸内切酶在此基因的5’末端区域切割，再与含有期望序列的寡核苷酸重新连接。 

另外，本发明还提供含有至少一拷贝本发明所述重组DNA的重组载体。适合在原核生物中作为蛋白质表达基础的载体为技术人员已知。此载体优选为能够令本发明所述重组DNA高度表达的载体。载体上的重组DNA优选处于诱导型表达信号的控制下(例如λ、tac、lac或trp启动子)。 

本发明所述的载体可以存在于染色体外(例如质粒)，也可以整合进宿主生物的基因组中(例如λ噬菌体)。本发明所述的载体优选为质粒。适合在特定宿主生物中各情况下的基因表达的载体为分子生物学领域技术人员已知。可以是真核载体，但优选原核载体。在原核生物中表达本发明所述DNA的适合载体的实例为例如，商业途径可购得的pUC和pUR载体。 

本发明还提供本用发明所述重组DNA和/或本发明所述重组载体转化的细胞，优选原核细胞，特别优选大肠杆菌(E.coli)细胞。 

当融合蛋白在原核生物中表达时，形成无活性的略溶聚集体(折射体、包涵体)。因此融合蛋白必须转化为其活性形式。使用本领域技术人员熟知的方法(参见例如EP-A 0219874，EPA 0114506，WO 84/03711)，先加入变性剂进行增溶，然后复性，如果期望的话再进行纯化步骤。 

处理待用IgA蛋白酶切割的IGF-I融合蛋白所需要的条件并无关紧要。但在此过程中，优选IGF-I融合蛋白与IgA蛋白酶的重量比为1∶1到100∶1。反应优选在pH 6.5到8.5的缓冲水性溶液中进行。缓冲液浓度范围优选在50到500mmol/l之间，如果期望的话，加入0-100mmol/l氯化钠。切割优选在室温进行至少60分钟至长达5天，优选在24-72小时之间。 

经过增溶、复性和用IgA蛋白酶切割之后，这样得到的切割产物优选用疏水作用层析、离子交换层析和/或按尺寸分级的方法纯化。这样生产的IGF-I在第1位没有甲硫氨酸。 

药物制剂

IGF-I可以作为混合物给药，或作为用例如疏水作用层析、离子交换层析或尺寸排阻层析分离的不同物质进行给药。本发明的化合物可以根据制备药物组合物的方法配制，这些方法为本领域技术人员已知。为生产这样的组合物，本发明所述的IGF-I与可药用载体在混合物中混合，优选用包含药物组合物期望成分的水性溶液透析或透析过滤。这样可药用的载体在例如雷氏药学大全(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第18版，1990，Mack出版公司，Oslo等人编(例如1435-1712页)中描述。组合物通 常含有有效量例如约0.1到100mg/ml的本发明所述物质，和适当量的载体。可以肠胃外给药组合物。本发明所述的IGF-I优选通过腹膜内、皮下、静脉内或鼻内给药。 

本发明所述的药物制剂可以根据本领域已知方法制备。通常，用预期在药物组合物中使用的缓冲液透析或透析过滤IGF-I溶液，通过浓缩或稀释调整期望的最终蛋白质浓度。 

提供下列实施例和序列用以帮助对本发明的理解，而本发明的真正范围由所附的权利要求书阐明。应理解可以对提出的方法进行修改而不脱离本发明的精神。氨基酸名称采用单字母代码(例如R)或三个字母代码(例如Arg)的缩写形式。R36A表示IGF-I突变体，其中氨基酸第36位的精氨酸被丙氨酸替换。 

序列表

SEQ ID NO：1人IGF-I的氨基酸序列(SwissProt P01343的氨基酸49-118)。 

SEQ ID NO：2优选前肽的氨基酸序列 

SEQ ID NO：3优选前肽的氨基酸序列 

SEQ ID NO：4优选前肽的氨基酸序列 

SEQ ID NO：5优选前肽的氨基酸序列 

SEQ ID NO：6-10连接肽 

SEQ ID NO：11-17切割序列 

SEQ ID NO：18-20其它 

SEQ ID NO：21淋病奈瑟球菌(2型)的IgA1蛋白酶的氨基酸序列 

实施例 

实施例1

EP 0972838描述了可用的表达载体和大肠杆菌菌株。在选择性琼脂平板上培养表达融合蛋白的大肠杆菌克隆，将一接种环转移至(100ml)选 择性培养基中，在37℃培养13h至光密度(578nm)为2-4。在接下来的6小时中将培养物储存在冰上，然后在37℃进行主要培养物的自动接种。在光密度(578am)为50时通过加入1.0mM IPTG起始IGF-I突变体的表达。全部发酵过程延续长达16小时。通过对比SDS-PAGE凝胶上产物的蛋白质条带与IGF标准条带的容积强度(volumetric intensity)用密度计量测定蛋白质的量。离心收获培养液。 

为得到纯化的包涵体(IB)物质，用下列方法处理从标准发酵收获的生物量：孵育0.3g/100g生物干重溶菌酶和5U/1g生物干重Benzonase核酸酶20分钟并均质化。加入30U/1g生物干重Benzonase核酸酶，在37℃孵育60分钟。加入0.5L布里杰缓冲液(Brij-buffer)/L，室温孵育30分钟。离心后，沉淀按照300ml Tris-EDTA-Puffer/100g生物湿重(纯化的IB湿重)进行重悬，室温孵育30分钟并离心。1g IB/L在室温溶于6.8M盐酸胍，0.1M TrisHCl，0.1M DTT，pH 8.5过夜。混浊液在4℃对6.8M盐酸胍，0.1M TrisHCl，pH 8.0透析。透析后，离心移去不溶成分。将前体IGF-I(pro-IGF-I)溶液在0.8M精氨酸，0.1M TrisHCl，0.1M盐酸胍，1mM GSH，1mM GSSH，pH 8.5中室温稀释50倍，以进行折叠。两小时后在溶液中补充2M氯化钠，过滤，以流速10ml/min上HIC柱(ButylSepharose 4Fast Flow；通用电气安玛西亚公司(GE，AmershamBiosciences))，柱用含2M NaCl，0.8M精氨酸，0.1M TrisHCl，0.1M盐酸胍，pH 8.5的缓冲液室温预平衡。用平衡缓冲液洗涤柱至达到基线，用十倍柱体积的线性梯度洗脱柱，以平衡缓冲液开始，用含有0.1M TrisHCl，5％乙二醇，pH 8.5的缓冲液结束。洗脱的级分用反向高效液相层析(rpHPLC)分析。合并含有正确形成SS-桥的蛋白质的级分。在反应混合物中添加淋病奈瑟球菌(2型)的IgA1蛋白酶(w/w比1∶50)，室温孵育过夜(见图2)。反应混合物用50mM乙酸pH 4.5以1∶2稀释，然后上以50mM乙酸平衡的阳离子IEC柱(MacroCap SP support；通用电气安玛西亚公司，乌普萨拉，瑞典)，或上SEC Superdex^TM 200柱(通用电气公司(GeneralElectric))。洗涤柱至达到基线，用20倍柱体积的线性梯度洗脱，以50mM 乙酸开始，用添加1M氯化钠的50mM乙酸结束。洗脱的级分用SDS-PAGE分析。合并含有IGF-I分子大小的单个条带的级分作为IGF-I。通过分析性尺寸排阻层析(SEC)结合静态光散射检测、胰蛋白酶消化物的质谱(MS)分析、Asp-N消化物的质谱分析和分析性阳离子IEC或SEC确认了IGF-I的一致性(identity)。 

序列表

<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)

<120>生产***-I的方法

<130>23908

<150>EP06018171

<151>2006-08-31

<160>20

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>70

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>人IGF-I的氨基酸序列(SwissProt P01343的氨基酸49-118)

<400>1

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe

1               5                   10                  15

Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

            20                  25                  30

Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys

        35                  40                  45

Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu

    50                  55                  60

Lys Pro Ala Lys Ser Ala

65                  70

<210>2

<211>19

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>优选前肽的氨基酸序列

<400>2

Met His His His His His His Arg Ala Arg Arg Phe Arg Arg His Pro

1               5                   10                  15

Arg Pro Pro

<210>3

<211>18

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>优选前肽的氨基酸序列

<400>3

Met Ser His His His His His His Asn His Asn Arg Glu His Pro Arg

1               5                   10                  15

Pro Pro

<210>4

<211>17

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>优选前肽的氨基酸序列

<400>4

Met Asn His His His His His His Ile Glu Gly Arg His Pro Arg Pro

1               5                   10                  15

Pro

<210>5

<211>20

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>优选前肽的氨基酸序列

<400>5

Met Asn His His His His His His Thr Glu Phe Glu Asn Ile Glu His

1               5                   10                  15

Pro Arg Pro Pro

            20

<210>6

<211>8

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>连接肽

<400>6

Lys Ala Lys Arg Phe Lys Lys His

1               5

<210>7

<211>8

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>连接肽

<400>7

Arg Ala Arg Arg Phe Arg Arg His

1               5

<210>8

<211>8

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>连接肽

<400>8

Asn Thr Glu His Asn Arg Glu His

1               5

<210>9

<211>5

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>连接肽

<400>9

Ile Glu Gly Arg His

1               5

<210>10

<211>8

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>连接肽

<400>10

Thr Glu Phe Glu Asn Ile Glu His

1               5

<210>11

<211>6

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>切割序列

<400>11

Pro Arg Pro Pro Gly Pro

1               5

<210>12

<211>4

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>切割序列

<400>12

Ala Pro Ara Pro

1

<210>13

<211>5

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>切割序列

<400>13

Pro Ala Pro Arg Pro

1               5

<210>14

<211>5

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>切割序列

<400>14

Pro Ala Pro Gly Pro

1               5

<210>15

<211>4

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>切割序列

<400>15

Pro Pro Gly Pro

1

<210>16

<211>7

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>切割序列

<400>16

Ala Pro Arg Pro Pro Gly Pro

1               5

<210>17

<211>8

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>切割序列

<400>17

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Gly Pro

1               5

<210>18

<211>7

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>其它

<400>18

Ser His His His His His His

1               5

<210>19

<211>7

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>其它

<400>19

Asn His His His His His His

1               5

<210>20

<211>6

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>其它

<400>20

His His His His His His

1           5

<210>21

<211>960

<212>PRT

<213>淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)

<220>

<221>misc_feature

<223>淋病奈瑟球菌(2型)IgA1蛋白酶的氨基酸序列

<400>21

Met Ala Leu Val Arg Asp Asp Val Asp Tyr Gln Ile Phe Arg Asp Phe

1               5                   10                  15

Ala Glu Asn Lys Gly Lys Phe Phe Val Gly Ala Thr Asp Leu Ser Val

            20                  25                  30

Lys Asn Lys Arg Gly Gln Asn Ile Gly Asn Ala Leu Ser Asn Val Pro

        35                  40                  45

Met Ile Asp Phe Ser Val Ala Asp Val Asn Lys Arg Ile Ala Thr Val

    50                  55                  60

Val Asp Pro Gln Tyr Ala Val Ser Val Lys His Ala Lys Ala Glu Val

65                  70                  75                  80

His Thr Phe Tyr Tyr Gly Gln Tyr Asn Gly His Asn Asp Val Ala Asp

                85                  90                  95

Lys Glu Asn Glu Tyr Arg Val Val Glu Gln Asn Asn Tyr Glu Pro His

            100                 105                 110

Lys Ala Trp Gly Ala Ser Asn Leu Gly Arg Leu Glu Asp Tyr Asn Met

        115                 120                 125

Ala Arg Phe Asn Lys Phe Val Thr Glu Val Ala Pro Ile Ala Pro Thr

    130                 135                 140

Asp Ala Gly Gly Gly Leu Asp Thr Tyr Lys Asp Lys Asn Arg Phe Ser

145                 150                 155                 160

Ser Phe Val Arg Ile Gly Ala Gly Arg Gln Leu Val Tyr Glu Lys Gly

                165                 170                 175

Val Tyr His Gln Glu Gly Asn Glu Lys Gly Tyr Asp Leu Arg Asp Leu

            180                 185                 190

Ser Gln Ala Tyr Arg Tyr Ala Ile Ala Gly Thr Pro Tyr Lys Asp Ile

        195                 200                 205

Asn Ile Asp Gln Thr Met Asn Thr Glu Gly Leu Ile Gly Phe Gly Asn

    210                 215                 220

His Asn Lys Gln Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Lys Gln Ala Leu Ser Gln

225                 230                 235                 240

Asp Ala Leu Thr Asn Tyr Gly Val Leu Gly Asp Ser Gly Ser Pro Leu

                245                 250                 255

Phe Ala Phe Asp Lys Gln Lys Asn Gln Trp Val Phe Leu Gly Thr Tyr

            260                 265                 270

Asp Tyr Trp Ala Gly Tyr Gly Lys Lys Ser Trp Gln Glu Trp Asn Ile

        275                 280                 285

Tyr Lys Lys Glu Phe Ala Asp Lys Ile Lys Gln His Asp Asn Ala Gly

    290                 295                 300

Thr Val Lys Gly Asn Gly Glu His His Trp Lys Thr Thr Gly Thr Asn

305                 310                 315                 320

Ser His Ile Gly Ser Thr Ala Val Arg Leu Ala Asn Asn Glu Gly Asp

                325                 330                 335

Ala Asn Asn Gly Gln Asn Val Thr Phe Glu Asp Asn Gly Thr Leu Val

            340                 345                 350

Leu Asn Gln Asn Ile Asn Gln Gly Ala Gly Gly Leu Phe Phe Lys Gly

        355                 360                 365

Asp Tyr Thr Val Lys Gly Ala Asn Asn Asp Ile Thr Trp Leu Gly Ala

    370                 375                 380

Gly Ile Asp Val Ala Asp Gly Lys Lys Val Val Trp Gln Val Lys Asn

385                 390                 395                 400

Pro Asn Gly Asp Arg Leu Ala Lys Ile Gly Lys Gly Thr Leu Glu Ile

                405                 410                 415

Asn Gly Thr Gly Val Asn Gln Gly Gln Leu Lys Val Gly Asp Gly Thr

            420                 425                 430

Val Ile Leu Asn Gln Lys Ala Asp Ala Asp Lys Lys Val Gln Ala Phe

        435                 440                 445

Ser Gln Val Gly Ile Val Ser Gly Arg Gly Thr Leu Val Leu Asn Ser

    450                 455                 460

Ser Asn Gln Ile Asn Pro Asp Asn Leu Tyr Phe Gly Phe Arg Gly Gly

465                 470                 475                 480

Arg Leu Asp Ala Asn Gly Asn Asp Leu Thr Phe Glu His Ile Arg Asn

                485                 490                 495

Val Asp Glu Gly Ala Arg Ile Val Asn His Asn Thr Asp His Ala Ser

            500                 505                 510

Thr Ile Thr Leu Thr Gly Lys Ser Leu Ile Thr Asn Pro Asn Ser Leu

        515                 520                 525

Ser Val His Ser Ile Gln Asn Asp Tyr Asp Glu Asp Asp Tyr Ser Tyr

    530                 535                 540

Tyr Tyr Arg Pro Arg Arg Pro Ile Pro Gln Gly Lys Asp Leu Tyr Tyr

545                 550                 555                 560

Lys Asn Tyr Arg Tyr Tyr Ala Leu Lys Ser Gly Gly Arg Leu Asn Ala

                565                 570                 575

Pro Met Pro Glu Asn Gly Val Ala Glu Asn Asn Asp Trp Ile Phe Met

            580                 585                 590

Gly Tyr Thr Gln Glu Glu Ala Arg Lys Asn Ala Met Asn His Lys Asn

        595                 600                 605

Asn Arg Arg Ile Gly Asp Phe Gly Gly Phe Phe Asp Glu Glu Asn Gly

    610                 615                 620

Lys Gly His Asn Gly Ala Leu Asn Leu Asn Phe Asn Gly Lys Ser Ala

625                 630                 635                 640

Gln Asn Arg Phe Leu Leu Thr Gly Gly Ala Asn Leu Asn Gly Lys Ile

                645                 650                 655

Ser Val Thr Gln Gly Asn Val Leu Leu Ser Gly Arg Pro Thr Pro His

            660                 665                 670

Ala Arg Asp Phe Val Asn Lys Ser Ser Ala Arg Lys Asp Ala His Phe

        675                 680                 685

Ser Lys Asn Asn Glu Val Val Phe Glu Asp Asp Trp Ile Asn Arg Thr

    690                 695                 700

Phe Lys Ala Ala Glu Ile Ala Val Asn Gln Ser Ala Ser Phe Ser Ser

705                 710                 715                 720

Gly Arg Asn Val Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ile Thr Ala Thr Asp Asn

                725                730                 735

Ala Lys Val Asn Leu Gly Tyr Lys Asn Gly Asp Glu Val Cys Val Arg

            740                 745                 750

Ser Asp Tyr Thr Gly Tyr Val Thr Cys Asn Thr Gly Asn Leu Ser Asp

        755                 760                 765

Lys Ala Leu Asn Ser Phe Asp Ala Thr Arg Ile Asn Gly Asn Val Asn

    770                 775                 780

Leu Asn Gln Asn Ala Ala Leu Val Leu Gly Lys Ala Ala Leu Trp Gly

785                 790                 795                 800

Lys Ile Gln Gly Gln Gly Asn Ser Arg Val Ser Leu Asn Gln His Ser

                805                 810                 815

Lys Trp His Leu Thr Gly Asp Ser Gln Val His Asn Leu Ser Leu Ala

            820                 825                 830

Asp Ser His Ile His Leu Asn Asn Ala Ser Asp Ala Gln Ser Ala Asn

        835                 840                 845

Lys Tyr His Thr Ile Lys Ile Asn His Leu Ser Gly Asn Gly His Phe

    850                 855                 860

His Tyr Leu Thr Asp Leu Ala Lys Asn Leu Gly Asp Lys Val Leu Val

865                 870                 875                 880

Lys Glu Ser Ala Ser Gly His Tyr Gln Leu His Val Gln Asn Lys Thr

                885                 890                 895

Gly Glu Pro Asn Gln Glu Gly Leu Asp Leu Phe Asp Ala Ser Ser Val

            900                 905                 910

Gln Asp Arg Ser Arg Leu Phe Val Ser Leu Ala Asn His Tyr Val Asp

        915                 920                 925

Leu Gly Ala Leu Arg Tyr Thr Ile Lys Thr Glu Asn Gly Ile Thr Arg

    930                 935                 940

Leu Tyr Asn Pro Tyr Ala Gly Asn Arg Arg Pro Val Lys Pro Ala Pro

945                 950                 955                 960

Claims (7)

1.生产IGF-I的方法，特征在于：

a)培养包含表达载体的原核宿主细胞，所述载体含有编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含所述IGF-I，其N端与前肽C端相连，其中Gly-Pro为IGF-I的头两个氨基酸，

b)所述前肽C端以氨基酸-Y-Pro结束，其中Y选自Pro、Pro-Ala、Arg-Pro或Pro-Arg-Pro，

c)回收所述融合蛋白，并用IgA蛋白酶切割，和

d)回收所述IGF-I。

2.权利要求1所述的方法，特征在于所述IGF-I选自SEQ ID NO：1的IGF-I、C端截短的IGF-I，其中截短3-6个氨基酸、SEQ ID NO：1的IGF-I，其中用丙氨酸取代36位的精氨酸、SEQ ID NO：1的IGF-I，其中用丙氨酸取代37位的精氨酸。

3.权利要求1或2所述的方法，特征在于所述IGF-IC端与人Fc相连，Fc来自IgG。

4.权利要求1或2所述的方法，特征在于前肽以下式表示

Met-X₁-His_n-X₂-Y-Pro-，

其中

●Met表示甲硫氨酸，

●X₁为价键、丝氨酸或天冬酰胺，

●His为组氨酸，

●n为0到6的数字，

●X₂为连接肽，选自SEQ ID NO：6-10的肽，

●Pro为脯氨酸，和

●Y选自Pro、Pro-Ala、Arg-Pro或Pro-Arg-Pro。

5.融合蛋白，包含与前肽C端相连的IGF-I，其中Gly-Pro为IGF-I的头两个氨基酸，特征在于所述前肽C端以氨基酸-Y-Pro结束，其中Y选自Pro、Pro-Ala、Arg-Pro或Pro-Arg-Pro。

6.权利要求5所述的融合蛋白，特征在于所述前肽长度至多30个氨基酸。

7.权利要求5或6所述的融合蛋白，特征在于所述融合蛋白由下式表示：

Met-X₁-His_n-X₂-Y-Pro-[IGF-I]，

其中

●Met表示甲硫氨酸，

●X₁为价键、丝氨酸或天冬酰胺，

●His为组氨酸，

●n为0到6的数字，

●X₂为连接肽，选自SEQ ID NO：6-10的肽，

●Pro为脯氨酸，和

●Y选自Pro、Pro-Ala、Arg-Pro或Pro-Arg-Pro。