JPH07503128A - ヒト毛様体ニューロン親和性因子の先端欠失型および突然変異タンパク質型の合成と精製 - Google Patents
ヒト毛様体ニューロン親和性因子の先端欠失型および突然変異タンパク質型の合成と精製Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ヒト毛様体ニューロン親和性因子の
先端欠失型および突然変異タンパク置型の合成と精製本発明は、組換えDNA技
術によって得られるヒト毛様体ニューロン親和性因子(CNTF)の生物学的に
活性な先端欠失型および突然変異タンパク置型(これらタンパク質の単量体型を
含む)の合成法と精製法に関する。本発明によれば、対応する天然型CNTFよ
りもアミノ酸数が少ないヒトCNTFポリペプチドを得ることができる。これら
新しい型のCNTFは天然のCNTFとは異なる化学的特性および物理化学的特
性を発揮し、様々な医薬的応用に有用である。
関連技術の説明
A1毛様体ニューロン親和性因子
毛様体神経節(CG)は2つのニューロン集団、すなわち毛様体と脈絡膜を含有
し、これらは共にコリン作動性である。CGニューロンは脈絡膜、毛様体および
虹彩中の眼の内在性筋肉構造に神経を分布している。ヒヨコの胚の発育中には、
それらの軸索が眼内の神経支配領域との連結を確立するE8日とE15日の間に
、CGニューロンの約半分が死ぬ。
このニューロンの死は眼の除去によって強く増進され、一方、補足的な眼芽の移
植によってかなり妨害される。
この観察結果から、上記神経支配領域がそれら自身の特異的ニューロンのための
栄養因子を含有するという仮説が導かれた。
E8日の様々なヒヨコの肝組織がら得られる抽出物は、同じ発育段階にあるヒョ
コ胚毛様体神経節から得られる解離されたニューロンのものとは異なる、それら
自身の栄養活性を発揮した(Adlerら(1979)Science 204
+1434−1436)。
次いでこの栄養活性が毛様体ニューロン親和性因子(CNTF)と関連づけられ
た(Barbinら(1984)J、 Neurochea+、 43:146
8−1478)。
胚中の全CNTF栄養活性の3分の1は眼中で観測され、そのほとんどは脈絡膜
中と眼の内在性筋肉構造中に局在していた。
イオン交換クロマトグラフィー、ショ糖勾配超遠心分離およびドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によるこのタンパ
ク質の精製は、それが約21Kdの分子量と負の正味の電荷を有することを示し
た。E8日のヒヨコCGニューロン中、E10日のヒヨコDRGニューロン中、
およびEl1日の交感ニューロン中の精製タンパク質によって発揮される栄養活
性は10” 10−12Mのオーダーであって、これは雄マウスの顎下腺から精
製されるもう1つのニューロン親和性因子、すなわち神経成長因子(NGF)と
、そのニューロンDRGおよび交感標的に関して同じである。
酵素チロノン・ヒドロキシラーゼとフェニルエタノールアミンN−メチルトラン
スフェラーゼに対するそれらの効果の程度は異なるものの、CTNFはNGFと
同様に培養クロム親和性副腎細胞の成長を支持する。CNTFはヒヨコ網膜細胞
培養中でChAT活性を引き起こし、コリン作動性ニューロン応答を示す。CN
TFは脳の脳橋基底領域のコリン作動性ニューロンに対する栄養効果を持たず、
これをコリン作動性ユニーロン親和性因子と見なすことはできない。
CNTFはインビトロでいくつかの交感ニューロン、頭蓋神経節のを髄ニューロ
ン(Barbinら(1984)J、 Neurocheo、 43 :146
8)、を髄の運動ニューロン(Arakawaら(1990)J、 Neuro
sci、 10:3507 ; longら(1990)Soc、 Neuro
sci、^bstr、 16:4W4 : Hagalら(1
991)Devel、 Brain Res、 63:141)および海馬二、
−o:/(Ipら(1991)J、 Neurosci、 P1:
3124)の生存と発育を増進する。また寡突起神経膠細胞と神経膠星状細胞に
分化する0−2Aとして知られる祖先膠細胞の分化にインビトロで影響を与える
ことも明らかにされている(Li11ienら(1988)Neuron 1:
48)。
このタンパク質の特徴は等電点5.8、分子量24KDaというものであって、
組換え細菌の総タンパク質の30%までをCNTFとして生産することが比較的
容品なのであるが、まさにその特徴ゆえに、均一に純粋なタンパク質を得るには
様々なりロマトグラフィ一工程を使用する必要がある。これらの様々な工程には
イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動、イオン金属相互作用クロマトグラフィーおよび疎水相互作用クロ
マトグラフィーが含まれる。これらの工程の多くは工業的なレベルで実行するこ
とが難しく、したがってこの因子の生産コストをがなり増大させるので、代替と
なる精製法の発見が強(望まれている。
89組換えDNA技術
生物学的に活性なタンパク質を単離するための従来の技術には生物学的液体また
は組織からの精製によるタンパク質の単離が含まれるが、この技術で得ることが
できるタンパク質の量は必ずしもそれらの構造、機能、とりわけ応用の研究を可
能にするほど充分でない。
したがって充分量のタンパク質を得るには、組換えDNA技術を使用してこれら
のタンパク質をコード化する遺伝子を発現ベクター中にクローン化することが組
換えDNA技術によれば、目的のタンパク質を大量に発現させ得る一連のベクタ
ーを構築することができる。組換えDNA技術を用いることによって、分子生物
学者はDNA配列を配置し、組み立てて、目的のタンパク質を生産することがで
きるハイブリッド分子を作成できるようになった。制限酵素による切断、それに
よって得られる断片のりガーゼによる連結、組み立てるべきオリゴヌクレオチド
の化学合成、この分野で研究している様々な研究室で考案されたその他の方法な
ど、様々な反応が使用される。これらの技術はSambrookら(1989)
llolecularCloning、 A Laboratory 1lan
ual(第2版、コールド・スプリング+ハーバ−・ラボラトリ−・プレス、ニ
ューヨーク州コールド・スプリング・ラボラトリ−)に要約されている。
高い発現レベルを得るためには、組み立てるべきDNA要素がいくつかの必須情
報を含有しなければならない。これらの要素には例えば複製起点、抗生物質に関
する選択標識、発現プロモーター、目的の遺伝子のための転写活性化因子および
当業者の知るその他の調節要素が含まれる。転写および翻訳調節要素に機能的に
連結した目的の遺伝子を含むこれらの要素の組み合わせは発現プラスミドと呼ば
れるプラスミドを形成する。このような発現プラスミドまたはベクターは宿主細
胞(これらは真核生物由来であってもよいし、原核生物由来でありでもよい)に
おけるタンパク質の発現を容易にする。次いで、以降の精製によってタンパク質
を得ることができる。
成長因子などの遺伝子の発現を自然に制御するプロモーターはあまり活性ではな
く、適切な自然の条件下でのみ活性化されるのであるが、その条件はしばしば未
知である。この目的のためには、パボーバウイルス系のウィルスから得られるも
のやその他の既知のプロモーターなど、既知の活性を持つプロモーターがしばし
ば使用される。
したがって高レベルの遺伝子発現を得るために使用される調節要素は、互いに連
結してハイブリッド分子を形成する異なる遺伝子断片と結合した様々な起源(真
核生物、細菌、ウィルスなど)のDNAの組み合わせである。遺伝子の転写活性
は調節配列とコード配列の間に適切な距離があるかどうかに依存する。
調節配列に近接して位置する遺伝子を得るための従来の技術は、それらのクロー
ニングを容易にする適当な制限エンドヌクレアーゼ部位が存在するかどうかに依
存する。適合する部位が近くになく、異なる部位だけの場合には、そのような制
限部位を含有するオリゴヌクレオチドリンカーの合成によって各セグメントを結
合させることができる。この系は分子生物学者にとって大いに制約である。もう
1つの方法はPCR技術を使用することである(Saikiら(1988)Sc
ience 239:487−489)。この技術によって、遺伝子セグメント
をlXl0’倍にまで増幅することができる。その原理は2つのオリゴヌクレオ
チドの使用に基づいており、それらのオリゴヌクレオチドのそれぞれを増幅すべ
きDNA鎖の1つと正確に対を形成させることができる。遺伝子配列に関する2
つのオリゴヌクレオチドの間の距離は生産される分子の大きさを決定する。これ
ら2つのオリゴヌクレオチドを、以降のクローニングを可能にする制限部位がそ
れらの配列内に存在するように構築する。この制限部位は天然に存在するか、も
しくは最小数のヌクレオチドを縮重させることによって特別に構築される。部位
特異的突然変異導入法として知られるこの方法は分子生物学者が予め決定した位
置に制限部位を構築することを可能にする。他の遺伝子セグメントと適合する部
位の構築はクローニングを容易にするばかりでなく、異なる遺伝子セグメントを
特異的に結合することをも可能にする。この技術を直接突然変異導入法によるク
ローニングと定義することができる。
また、修飾された遺伝子を上述の適切な発現ベクターに挿入した後に、得られた
遺伝子の長さを増減することによって遺伝子配列を適当に変化させることもでき
る。野生型遺伝子のコードされているタンパク質の特性と同じか、もしくは異な
る特性を持つペプチドを得ることができる。つまり天然のタンパク質よりもアミ
ノ酸数が少ない先端欠失型のポリペプチドや野生型タンパク質配列中に存在する
あるアミノ酸配列を欠く欠失型のポリペプチドを得ることができる。これらの新
しいポリペプチド型は天然のタンパク質とは大いに異なる化学的特性、物理化学
的特性および生物学的特性を保持し得る。異なる型のポリペプチドを得るべく、
その遺伝子に突然変異を導入することによって、天然型と同じ生物学的活性を持
ち、天然のタンパク質よりもアミノ酸数が少ない新しい型のポリペプチドか、天
然のタンパク質受容体の遮断を可能にする新しい型のポリペプチドを得ることが
上の記述に基づき、本発明の目的は、均一に先端削除された形態および/または
突然変異した形態(イソ型と定義する)のヒト毛様体ニューロン親和性因子の宿
主細胞による大量な発現と精製である。これらの新しいポリペプチドは、単独で
、あるいは他の分子またはそれらの誘導体もしくは製品化された生体適合物質と
組み合わせて、治療目的に使用することができる。
本発明のもう1つの目的は、CNTF成長因子の1またはそれ以上のイソ型と天
然のガングリオノド、その誘導体または半合成類縁体の1つ、もしくはその塩の
1つとの間の新しい錯体の1またはそれ以上、あるいはそのリン脂質、他の成長
因子、天然のポリマー(酸性多糖など)もしくは化学的に修飾または変換された
生体適合物質との会合物を活性物質として含有する医薬調製物を提供することで
ある。
また本発明は、天然のガングリオノド、それらの誘導体または半合成類縁体の1
つ、あるいはそれらの塩の、成長因子CNTFのイソ型および突然変異タンパク
質との新しい錯体、あるいはヒアルロン酸またはその誘導体の1つの、成長因子
CNTFのイソ型および突然変異タンパク質との新しい錯体のすべてを、上記の
適応症に対して治療的に使用することをも包含する。皮下注射、筋肉内注射また
は脳内注射によるヒトへの日用量は体重1kgにつき活性物質0.05mgない
し5mgの間で変化し得る。
本発明のさらなる目的は、単量体の均一な精製を容易にするという利点を持つヒ
トCNTF突然変異タンパク質を生産する方法を提供することである。この方法
には、少なくとも6つのヒスチジン残基に対する突然変異タンパク質の融合と、
ポリペプチド鎖中の酵素的または化学的切断部位の存在が含まれる。これらの6
ヒスチジン残基の存在は、金属イオンとの相互作用によるクロマトグラフィーカ
ラムを通すクロマトグラフィーによって、CNTFの突然変異タンパク質を宿主
生物によって生産される複雑なタンパク質混合物から一段階で分離することを可
能にする。このようにして分離された突然変異タンパク質を化学的または酵素的
に切断し、同じカラムから純粋な形態で回収する。この突然変異タンパク質は、
アミノ末端から始まる最初の14アミノ酸が除去されているものであって、この
組換えタンパク質が精製の間に酸化型になることができず、それゆえにその単量
体型が維持されるようにCNTFの唯一のシスティンがセリンで置換されている
CNTFのポリペプチド型である。この突然変異タンパク質は精製後にその生物
学的活性を維持する。
本発明の応用可能性のさらなる範囲は下記の詳細な説明と図面から明らかになる
であろう。しかし、詳細な説明と特定の例が本発明の好ましい態様を示している
とはいうものの、それらは単に例示のために記載されるのであるということを理
解すべきである。なぜなら本発明の思想と範囲に包含される様々な改変や修飾は
この詳細な説明から当業者に明らかになるであろうからである。
図面の簡単な説明
本発明の上記の目的とその他の目的、特性および利点は下記の詳細な説明を添付
の図面との関連で考慮することによってより良く理解されるであろう。ただしこ
れらの図面はすべて単に例示のために記載するのであって、本発明を制限するも
のではない。
図1はヒトCNTFをコード化する核酸配列を示す。
図2は図1の核酸配列によってコード化されるアミノ酸配列を示す。
図3はヒトCN1”F分子のアミノ末端の最初の14アミノ酸を欠(形態のヒト
CNTFをコード化する核酸配列を示す。
図4は、図3の核酸配列によってコード化される、ヒトCNTF分子のアミノ末
端の最初の14アミノ酸を欠く形態のヒトCNTFのアミノ酸配列とその他のデ
ータを示す。
図5はヒ1−CNTF分子のカルボキシ末端の最後の26アミノ酸を欠く形態の
ヒトCNTFをコード化する核酸配列を示す。
図6は、図5の核酸配列によってコード化される、ヒトCNTF分子のカルボキ
シ末端の最後の26アミノ酸を欠く形態のヒトCNTFのアミノ酸配列とその他
のデータを示す。
図7はヒトCNTF分子のアミノ末端の最初の14アミノ酸とその分子のカルボ
キシ末端の最後の26アミノ酸の両方を欠く形態のヒトCNTFをコード化する
核酸配列を示す。
図8は、図7の核酸配列によってコード化される、ヒトCNTF分子のアミノ末
端の最初の14アミノ酸とその分子のカルボキン末端の最後の26アミノ酸の両
方を欠(形態のヒトCNTFのアミノ酸配列とその他のデータを示す。
図9は本明細書に開示するヒトCNTFの新しい先端欠失ポリペプチド型の発現
に使用するベクターを得るために用いるクローニング法を示す。
図10は実施例1〜3で報告するヒトCNTFの先端欠失型と、実施例5で記述
する配列が削除された先端欠失型を示す。
図11はヒトCNTFの先端欠失ポリペプチド型の生物学的活性を野生型のヒト
CNTFタンパク質と比較して示すものである。このデータはED50として計
算される比活性が様々な形態について少なくとも5X10”1Mであることを示
している。
図12は発現ベクターCNTF(Hi s)s△14Ser17CNTFの構造
を示す。
図13は発現ベクター△14Ser17CNTFの構造を示す。
図14は、緩衝液Aで充填し、緩衝液BとCで洗浄した実施例13の細菌性出発
物質の溶出特性図を示す。組換えタンパク質は緩衝液り中に溶出する。
図15は、ヒドロキシルアミンによる酵素的切断後の実施例13のCNTF(H
is)aAsnG]yD14ser17cNTFの溶出特性図を示す。突然変異
タンパク質GIyD14Ser17CNTFは緩衝液C中に溶出し、突然変異タ
ンパク質CNTF(Hi 5)sAsnは緩衝液り中に溶出する。
図16は、エンテロキナーゼによる酵素的切断後の実施例13の突然変異タンパ
ク質HisgD14Ser17CNTFの溶出特性図を示す。組換えタンパク質
は緩衝液C中に溶出する。
発明の詳細な説明
下記の本発明の詳細な説明は本発明を実施する当業者を助けるために記載するも
のであるが、当業者はこの創意に富む発見の思想や範囲から逸脱することな(本
明細書で議論する態様に改変や修飾を施し得るのであるから、下記の詳細な説明
が本発明を不当に制約すると見なすべきではない。
本明細書で引用する各文献の内容はその全部が参考文献として本明細書の一部を
構成する。
本発明は概して組換えDNA技術の分野に属する。本発明は、天然のCNTFの
特異的に突然変異した形態(これをイソ型と呼ぶ)であって、それらのポリペプ
チド配列中の1またはそれ以上の欠失の存在ゆえに対応する天然型とは異なるも
のならびにCNTFの突然変異タンパク質に関する。これらのイソ型と突然変異
タンパク質は対応する天然のタンパク質の生物学的活性を保持することができる
。
一般的な組換えDNA技術
制限酵素によるDNAの切断は製造者の指示に従って行った。一般に20μmの
反応溶液中で1μgのプラスミドをIUの酵素を用いて切断した。温度とインキ
ュベーション時間はどの酵素を使用したかに依存するが、通常は37℃で1時間
とした。すべての場合について、インキュベーション後、40mM)リスーHC
]、20mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA中のLMPアガロース(BRL
、米国)を通す電気泳動によってプラスミドと遺伝子断片を精製し、次いでジエ
ネクリーン(GENECLEANR)キット(バイ第101インコーポレイテツ
ド、米国カリフォルニア州う・ジヨウ)を用いてそのアガロースから溶出させた
。”連結は20μmの反応体積中でDNA0.5μgにっきIUの濃度のTJ
DNAリガーゼを用いて13℃で12時間行った。正しいプラスミド配列を確認
するための分析は、その連結産物を大腸菌HBIOI中にトランスフェクション
し、50μg/mlのアンピシリンを含むLB(バリン・ベルタニ)培地中の寒
天プレート上で形質転換された細胞を選択することによって行った。回収した細
胞を100μg/mlのアンピシリンを含むLB中で生育させ、クィアゲン(Q
uiagen。
ダイゲンGmbH,西ドイツ・ドユッセルドルフ)からのキットを用いて、小さ
い調製物とより大きい調製物の両方について、プラスミドを精製した。クィアゲ
ンが推奨する方法によって細菌細胞からクローニングベクターを調製した。
すべてのオリゴヌクレオチドを、380B DNAノンセサイザー(アプライド
・バイオシステムズ、米国)を用い、製造者の指示に従って、固相で合成した。
これらをNH,中55℃で12時間処理した後、スピード−バキューム遠心機で
回収した。これらを2.5M酢酸アンモニウム中に再懸濁した後、3体積の冷た
いエタノール(−20℃)で沈殿させた。それを冷たい80%エタノールで再洗
浄し、水に再懸濁した。オリゴヌクレオチドの濃度を分光光度測定法で評価した
。
増幅はパーキン・エルマー・シーラスDNAサーマル・サイクラ−で行い、増幅
に使用する試薬は関連DNA7&Iアンブリフアイア−(パーキン・エルマー・
ンータス)のものとした。簡単に述べると、100μmの総混合物中に。、5U
のTAQポリメラーゼと共に200μMの各オリゴヌクレオチド、0.5μMの
各ヌクレアーゼcdATP、dTTP、dCTP、dGTP)、0.1μgのヒ
トDNAおよび反応緩衝液を含有する混合物を使用し、蒸発を防ぐためにその反
応混合物を液体パラフィンで覆った。
増幅反応は装置を次の条件下で25サイクルに設定することによって行った29
5℃で1分間の変性、45℃での配列、72℃での伸長。
天然型のCNTFと比較して部分的なアミノ酸配列と変化した配列を有し、天然
のタンパク質とは異なる化学的特性と物理化学的特性を保持するタンパク質をコ
ード化する遺伝子を得るために、野生型CNTF遺伝子配列に対して特別な修飾
を加えた。
ヒト毛様体ニューロン親和性因子の遺伝子とタンパク質本明細書に開示する核酸
配列およびポリペプチドまたはそれらの生物学的に機能的な等価物のそれぞれを
本発明に従って使用することができる。「生物学的に機能的な等価物」という用
語は、本明細書では、後述する特定の核酸配列およびポリペプチドと同じもしく
は類似の生物学的活性を発揮する核酸配列またはポリペプチドを意味する。
例えば、生物学的機能的に等価な分子を与える置換、付加または欠失によって後
述の核酸配列を改変することができる。遺伝子コードの縮重ゆえに、実質上後述
のアミノ酸配列と同じものをコード化する他のDNA配列を本発明の実施に用い
てもよい。これらには、その配列内の生理学的機能的に等価なアミノ酸残基をコ
ード化する異なるコドンの置換(これは表立たない(サイレント)変化をもたら
す)によって改変された後述のCNTF遺伝子のすべてもしくは一部からなる核
酸配列が含まれるが、それらに限定されない。同様に、本発明のCNTFタンパ
ク質またはその誘導体には、その配列内の残基が機能的に等価なアミノ酸残基で
置換(これは表立たない(サイレント)変化をもたらす)されている改変された
配列を含む実質的に後述のアミノ酸配列のすべてを含有するものが含まれるが、
それらに限定されない。例えば配列内の1またはそれ以上のアミノ酸残基を、機
能的な等価物として作用する類似の極性を持つ他のアミノ酸で置換して、表立た
ない(サイレント)改変をもたらすことができる。配列内のあるアミノ酸の代替
物はそのアミノ酸が属する種類の他の構成要素から選択することができる。例え
ば非極性(疎水性)アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、
プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。極
性中性アミノ酸にはグリノン、セリン、スレオニン、システィン、チロノン、ア
スパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に荷電した(塩基性)アミノ酸には
アルギニン、リノンおよびヒスチジンが含まれる。負に荷電した(酸性)アミノ
酸にはアスパラギン酸とグルタミン酸が含まれる。
翻訳の途中または翻訳後に、例えばグリコリル化、タンパク質加水分解的切断、
抗体分子または他の細胞配位子などへの結合によって、弁別的に修飾されたCN
TF断片またはその誘導体も本発明の範囲に包含される。後述の実施例は大腸菌
における生物学的に活性な組換えCNTFイソ型または突然変異タンパク質の発
現を例示することによって、CNTFの非グリコジル化型が生物学的に活性であ
ることを示すものである。
さらに、組換えCNTFをコード化する本発明の核酸配列を加工して、CNTF
のプロセシングまたは発現を変化させることができる。例えばCNTFをコード
化する配列の上流にシグナル配列を挿入してCNTFの分泌を可能にし、それに
よって収集や生物学的利用能を容易にすることができるが、この例示は限定のた
めではない。
さらに、ある与えられたCNTFイソ型または突然変異タンパク質をインビトロ
またはインビボで突然変異させることによって、翻訳、開始および/または終結
配列を作成および/または破壊するか、あるいはコード領域内に変異を作成する
か、かつ/または、新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成させるが、もしく
は既に存在するそれを破壊して、さらなるインビトロ修飾を容易にすることがで
きる。当該技術分野で知られている突然変異導入の技術は、インビトロ部位特異
的突然変異導入法(Hutchisonら(1978)J、 Biol、 Ch
ew、 253 :6551)、TAB”lノンカー(ファルマシア)の使用な
どを含めて(ただしこれらに限定されない)、いずれも使用することができる。
ヒトCNTFの発現ベクタ一
本発明での使用が予期されるベクターには、その中に後述のDNA配列を必要な
操作用の要素と共に挿入することができるものが含まれる。次いでそのようなベ
クターを宿生細胞中に移し、その中で複製させることができる。好ましいベクタ
ーはその制限部位が充分に報告されていて、上記DNA配列の転写にとって好ま
しいか、もしくは必要な操作用の要素を含有するものである。
本発明のいくつかの態様では本明細書に記載のDNA配列の1またはそれ以上を
含有するベクターを使用する。これらのベクターのすべてが次の特徴のいくつか
あるいはすべてを持つことが好ましい:(1)最小数の宿主生物配列を保持する
こと;(2)所望の宿主中で安定に維持され、増殖されること;(3)所望の宿
主中で高いコピー数で存在する能力を有すること;(4)目的の遺伝子の転写を
促進するように配置された調節可能なプロモーターを保持すること;(5)上記
DNA配列を挿入する部分とは離れているプラスミドの部分に存在する選択可能
な特色をコードする少なくとも1つの標識DNA配列を有すること:(6)転写
を終結させ得るDNA配列を含有すること。
本発明のDNA配列を発現させることができるクローニングベクターは様々な操
作用の要素を含有する。これらの「操作用の要素」には少なくとも1つのプロモ
ーター、少なくとも1つのンヤイン・ダルガノ配列とイニシェークーコドンおよ
び少なくとも1つの終結コドンが含まれ得る。これらの「操作用の要素」には次
に挙げるものの1またはそれ以上が含まれてもよい:少なくとも1つのオペレー
ター、細胞内空間から輸出されるべきタンパク質のための少なくとも1つのリー
ダー配列、少なくとも1つの調節因子タンパク質の遺伝子、クローン化されたC
NTF DNAの適切な転写とそれに続く翻訳にとって必要な、あるいは好まし
いその他のDNA配列。
これらの操作用の要素のいくつかは本発明の好ましいベクターのそれぞれの中に
存在し得る。必要な追加の操作用の要素を同定し、それを当業者に公知の方法(
SaIIlbrookら(前記)に記述されている方法など)を用いてこれらの
ベクターに加え得るということは予期される。
調節因子
調節因子はある環境条件の存在下でDNA配列の発現を防ぐように作用し、他の
環境条件の存在下では、CNTF DNA配列によってコードされているタンパ
ク質の転写とそれに続(発現を可能にするであろう。具体的には、例えばイソプ
ロピルチオ−ベーターD−ガラクトシド(IPTG)の不在下ではDNA配列の
発現が起こらないか、もしくは発現の程度が太き(減じられるように、調節因子
セグメントをベクター中に挿入することが好ましい。この状況では、CNTFイ
ソ型または突然変異タンパク質の発現の開始に先立って、上記DNA配列を含有
する形質転換された微生物を所望の密度まで生育させることができる。所望の細
胞密度に達した後に、上記DNA配列の発現を引き起こすことができる物質を微
生物環境に添加することによって所望のタンパク質の発現を誘導することができ
る。
プロモーター
発現ベクターは、それ自身のタンパク質を発現させるために宿主生物が使用し得
るプロモーターを含有しなければならない。ラクトースプロモーター系が一般に
使用されるが、他の微生物プロモーターも単離され、特徴づけられているので、
当業者は組換えCNTFイソ型および突然変異タンパク質の発現にそれらを使用
することができる。
転写終結区
本発明で予期される転写終結区はベクターを安定化させるように機能する。具体
的には、Rosenbergら(1979)Ann、 Rev、 Genet、
13:319−353に記述されている配列は本発明での使用が予期されるも
のである。
非翻訳配列
遺伝子転写物への3°または5°非非翻訳列の組込みを可能にするようにコード
領域の3゛または5°末端を構築することも望ましい。これらの非翻訳配列には
、Schmeissnerら(1984)J、 Mol、Biol、 176:
39−53によって開示されたような、mRNAを安定化するものが含まれる。
リポソーム結合部位
外来タンパク質の微生物発現にはリポソーム結合部位を含む操作用の要素が必要
である。リポソーム結合部位とは、Goldら、 Ann、 Rev、 Mic
robiol、 35:557−580およびMarquisら(1986)G
ene 42:175−183に説明されているように、タンパク質合成の開始
時にリポソームが認識し、結合する配列である。好ましいリポソーム結合部位は
GAGGCGCAAAAA(ATG)である。
リーダー配列と翻訳共役因子
さらに、fatson、 M、 E、がNucleic Ac1ds Res、
12+5145−5163で説明しているように、タンパク質を宿主細胞質か
ら排出すべき場合には、適当な分泌リーダー(シグナル)配列をコードするDN
Aが上記DNA配列の5′末端に存在することが好ましい。リーダー配列のDN
Aは、リーダー配列がCNTFのすぐ隣にあって、かつ、リーダー配列がCNT
Fに共有結合している融合タンパク質の生産を可能にする位置になければならな
い。すなわち上記2つのDNAコード配列の間に転写または翻訳シグナルが存在
してはならない。
いくつかの宿主微生物種では、いくつかの大腸菌の場合のように、適当なリーダ
ー配列の存在が完成したタンパク質の周辺腔への輸送を可能にするであろう。
ある種の大腸菌、サツカロミセスおよびバチスルとシュードモナスの株の場合に
は、適切なリーダー配列によって、タンパク質が細胞膜を通過して細胞外培地中
に輸送されるようになる。この状況では、細胞外タンパク質からそのタンパク質
を精製することができる。
CNTFイソ型をコードするDNA配列の直前に追加のDNA配列を位置させる
ことができる。この追加のDNA配列は翻訳共役因子として機能することができ
る。すなわちこれは、それが隣接する阻害因子RNAのりボゾーム結合部位のす
ぐ隣にリポソームを配置するように機能するRNAをコード化するDNA配列で
ある。翻訳共役因子はT A A CG A G G CG CA A A A
A A T G A A A A A GACAGCTATCGCGATCT
TGGAGGATGATTAAATGというDNA配列と翻訳共役因子に関連す
る分野の当業者が現在知っている方法を用いて誘導することができる。
翻訳終結区
本発明で予期される翻訳終結区はmRNAの翻訳を停止させるように機能する。
これらは、Kohli、 J、 、 Mo1. Gen、 Genet、 18
2:430−439に記述されているような天然のものであってもよいし、Pe
ttersson、 R,F、 (1983)Gene 24 :15−17に
記述されているような合成品であってもよい。
さらに、薬剤耐性標識や宿主微生物による選択可能な特色の発現を引き起こす他
の標識など、選択可能な標識をクローニングベクターが含有することが好ましい
。本発明の一態様では、アンピシリン耐性のための遺伝子がベクターに含まれる
。他のプラスミドには、テトラサイクリン耐性のための遺伝子やクロラムフェニ
コール耐性のための遺伝子を含ませることができる。
このような薬剤耐性またはその他の選択可能な標識は形質転換体の選択を容易に
する。さらに、このような選択可能な標識がクローニングベクター中に存在する
ことは、混入した微生物が培養培地中で増殖することを抑制する際に役に立ち得
る。形質転換された宿主微生物の純粋培養は、誘導された表現型を生存に必要と
する条件下でその微生物を培養することによって得られる。
本明細書で議論する操作用の要素は、先行文献と本明細書に含まれる教示に照ら
して、当業者によって簡単に選択される。これらの操作用の要素の一般的な例は
B、 Levin(1983)Genes(ウィリー・アンド・サンズ、ニュー
ヨーク)に説明されている。好適な操作用の要素の様々な例は上記のベクター中
に認めることができるし、上述のベクターの基本的特徴を議論している刊行物を
概観することによって見つけることができる。
必要かつ所望の成分部分のすべての合成と単離を終えたら、当業者が一般に知っ
ている方法によってベクターを組み立てることができる。このようなベクターの
組み立ては当該技術分野の通常の技術の範囲内にあり、それゆえに過度の実験を
伴わずに行うことができる。
本発明のDNA配列とそれらに付随する操作用の要素の複数コピーを各ベクター
に挿入することができる。このような場合、宿主生物が生産する所望のCNTF
イソ型のベクターあたりの量は増大するであろう。ベクター中に挿入し得るDN
A配列の多重コピーの数は、得られるベクターの、その大きさゆえの、適当な宿
主細胞中に移され、その宿主細胞中で複製し、転写されるという能力によっての
み制限される。
他の宿主微生物
大腸菌以外の微生物での使用に適したベクターも本発明での使用が予期される。
そのような微生物には例えばバチルス、ンユードモナスおよび酵母が含まれる。
また、本明細書に開示するヒトCNTFの先端欠失型および突然変異タンパク質
量の哺乳類細胞(例えばチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞を含む)中での発現
も本発明の範囲に包含される。
バチルス中での発現について、好ましいベクターはアルファ・アミラーゼ・プロ
モーター、ズブチリシン・プロモーター、P−43プロモーターまたは5paC
−126プロモーターなどの調節されたプロモーターを含むべきである。有用な
転写終結区にはrrnとrrnBT、Tが含まれる。転写開始部位とリーダーペ
プチドは、B、 amyloliquefaciensの天然のプロテアーゼ、
B、amyloliquefaciensのアルファーアミラーゼおよびB、
5ubtilisのズブチリシンからのものの中がら選択することができる。有
用な抗生物質標識はKan’とCam’である。リボゾーム結合部位はB、 a
myloliquefacjensの天然のプロテアーゼ遺伝子およびB、 a
myloliquefaciensのアルファーアミラーゼ遺伝子から得ること
ができる。バチルス属の宿主中で好ましい発現系にはプラスミドpUB110を
クローニング伝達体として使用することが含まれる。
シュードモナス中での発現については、プロモーターをTrp、LacおよびT
acから選択することができる。有用な転写開始部位とリーダーペプチドはボス
ホリバーゼC遺伝子とエキソトキシンA遺伝子から得ることができる。有用な抗
生物質標識はスルホンアミドとストレプトマイシンに対するものである。有用な
りボゾーム結合部位は大腸菌のTrpプロモーターから得ることができる。とり
わけ好ましいベクターはプラスミドR8FIOIOとその誘導体を使用するであ
ろう。
酵母の場合、有用なプロモーターにはGal lおよび10.Adhlおよび1
1、Pho 5が含まれる。転写終結区はCycSUna、アルファ因子および
Sac 2の中から選択することができる。転写開始部位とリーダーペプチドは
インベルターゼ遺伝子、酸ホスファターゼ遺伝子およびアルファ因子遺伝子がら
得ることができる。有用な選択標識はUra 3、Leu 2、Hjs3および
Taplである。
最後に哺乳類細胞中での発現の場合には、本発明の先端欠失型または突然変異タ
ンパク質量CNTFをコード化するDNAがリボゾームを結合するのに優れた配
列を有すべきである。そのような配列についてはKozakがNucleic
Ac1ds Re5earch(1987)15:8125−8132に記述し
ている。GuarenteがCell(198g)52:303−305に、ま
た、KadonagaらがCe1l(1987)51:1079−1090に記
述しているように、転写プロモーターと転写エンハンサ−を含有する発現ベクタ
ー中にCNTFをコード化する断片を挿入することができる。所望もしくは必要
であれば、ファルマシア・プラスミドpMSG中のプロモーターのように調節可
能なプロモーターを用いることができる。Au5ubelら(1,987)が”
Current Protocols in Mo1ecular Biolo
gy−(ウB
リー)に記述しているように、ベクターから転写されたmRNAが適切に加工さ
れるように、ベクターは完全なポリアデニル化シグナルを保持すべきである。最
後に、大腸菌中での複製と選択を可能にするべく、ベクターがpBR322のよ
うなプラスミドから得られる複製起点と少な(とも1つの抗生物質耐性標識を含
有してもよい。
本明細書に記載のCNTFを生産する安定な細胞系を選択するためには、Au5
ubelら(前記)が記述の如く、発現ベクターが薬剤耐性標識などの選択可能
な標識の遺伝子か、あるいは欠損細胞系のための補足的遺伝子(例えばdhfr
−細胞系を形質転換するためのジヒドロ葉酸リダクターゼ(dhfr)遺伝子な
ど)を保持することができる。別法として、選択可能な標識を保持する別個のプ
ラスミドを発現ベクターと共に同時形質転換することができる。
哺乳類細胞のためのベクターは、リン酸カルシウム: DNA同時沈殿、エレク
トロポレーションまたはプロトプラスト融合を含むいくつかの技術によって、哺
乳類細胞に導入することができる。^usubel(前記)によって記述されて
いるリン酸カルシウムとの同時沈殿は好ましい方法である。
好ましいベクターには例えばPSVT7真核発現プラスミドが含まれる。
実施例1
最初の14アミノ酸を欠く形態のCNTFを得るために、2つのオリゴヌクレオ
チドを合成した。第1の(A)は、5’AACATATGGACCTGTAGC
CGCTCTATC3’という配列を有し、ヒトCNTF配列の最初のオリゴヌ
クレオチド後の42番目のオリゴヌクレオチドからその位置が開始する。以降の
クローニングを容易にするために1つのNdel制限部位を加え、この遺伝子の
転写を開始させるためにメチオニンコドンを加えた。
5’TTGTCGACTCACATTTTCTTGTTGTTAGCAATAT
3’という配列を持ち、CNTFをコード化する配列の末端に逆向きに位置する
オリゴヌクレオチド(B)と共に上記のオリゴヌクレオチドを用いることによっ
て、プラスミドpT7.7hCNTF(Negroら(1991)J、 Neu
rosci、 Res、 29:270)を使って、図3に示す配列を増幅する
ことができる。
図4に示すアミノ酸配列、分子量データ、残基数およびアミノ酸組成の転写を得
るために、この配列をNdelと5allで切断し、T4 DNAリガーゼを用
いてプラスミドpT7.7(図9)中にクローン化した。
このポリペプチドは天然のポリペプチドのアミノ末端から開始する最初の14ア
ミノ酸を欠いている。メチオニンをこのアミノ酸配列の開始部分に導入した。
この新しいポリペプチド型の等電点(pl)は、天然のタンパク質の6.38と
比べて、6.05である。
実施例2
カルボキン末端の26アミノ酸を欠く形態のCNTFを得るために、2つのオリ
ゴヌクレオチドを合成した。第1の(C)は5’TTCATAGGCTTTTA
CTGAAGCATTCA3’という配列を有し、CNTF遺伝子をコード化す
る配列の最初からその位置が始まる。第2のオリゴヌクレオチド(D)は5°T
TGTCGACTCAATGGATGGACCTTACTGTCCAC3’とい
う配列を有し、CNTF遺伝子の末端で逆向きに位置する。さらに、最後の17
アミノ酸が除去されるように、上記遺伝子の開始部分に対して523の位置にあ
る遺伝子の末端に停止コドンを加えた。以降のクローニングを容易にするために
5all制限部位をも加えた。オリゴヌクレオチド(C)および(D)をプラス
ミドpT7.7hCNTFと共に用いることによって、図5に示すヌクレオチド
配列を増幅することができる。
図6に示すアミノ酸配列の転写を得るために、この配列をNdelと5allで
切断し、T4 DNAリガーゼを用いてプラスミドpT7.7中にクローン化し
た。
この配列はCNTFの最後の26アミノ酸を欠(ので、このポリペプチドは17
4アミノ酸からなる。得られた分子量は20007KDaである。この新しい型
のplは5.67である。
実施例3
アミノ末端の最初の14アミノ酸を欠き、かつ、カルボキシ末端の最後の26ア
ミノ酸を欠くヒトCNTFのポリペプチド型を得るために、2つのオリゴヌクレ
オチド(すなわち実施例1での(A)と実施例2での(D))およびプラスミド
pT7.7hCNTFを用いて図7に示す配列を増幅した。
図8に示すアミノ酸配列の転写が得られるように、この配列をNdelと5aI
Iで切断し、T4 DNAリガーゼを用いてプラスミドp77.7中にクローン
化した。
この配列はCNTFの最初の14アミノ酸と最後の26アミノ酸を欠く。したが
ってこのポリペプチドは最初に加えたメチオニンを考慮に入れると161アミノ
酸を含有する。
得られたポリペプチドは18476KDaの分子量と5.14の等電点を有する
。
実施例4
図9は、本明細書に開示するヒ)CNTFの新しいポリペプチド型の発現に使用
するベクターを得るために用いたクローニング法を示す。
実施例5
プラスミドpT7.7hCNTFから、所望の欠失に応じて適切に選択される2
つのオリゴヌクレオチドを用いて全配列を増幅することができる。
以下に詳述するのは、野生型のヒトCNTFポリペプチド配列に対してセグメン
ト137〜150が欠失しているポリペプチド配列を得るための方法である。
次のオリゴヌクレオチドは共に5phI制限部位を含有し、この部位は上記ブラ
スミド中には存在しない。
AGCATGCGGATCTTGTATTCCAGGAGTTGCATGCTC
TTTGAGAAGAAGCTGTこれら2つのオリゴヌクレオチドを既に記述
したPCR技術で使用する。精製したDNAを5phIで切断した後、T4 D
NAリガーゼで連結する。
この方法によって、リガーゼによって結合した直線状のセグメントを得ることが
できる。2つの選択されたオリゴヌクレオチドの間のヌクレオチド距離が突然変
異体中の欠失の程度を決定する。
図10は実施例1〜3で報告したヒトCNTFの先端欠失型のすべてと、実施例
5に記述の如く生産される配列が欠如した型とを表している。
突然変異したプラスミドp T 77 RCN T F (Negroら(19
91)J、 Neurosci、 Res、 29:251)を含有する大腸菌
BL21(D3)のコロニーを200 tt g/m +のアンピノリンが入っ
ているLB培地5mlに接種する。既に記述したように、各細胞系はその発現ベ
クター中に挿入された遺伝子配列によってコード化されているポリペプチド配列
を発現させる。
すべての構築を大腸菌HBIOI中で行った。タンパク質発現を得るために、C
NTFの先端欠失型または削除型を含有するプラスミドを、BL21(D3)を
含む異なる大腸菌糸中に導入した。
細胞を30℃で終夜生育させた。一部を200μg/mlのアンピンリンが入っ
ているM9培地で1/100に希釈した。590μmにおける吸光性が0.80
Dになるまで細胞を生育させた。この時点でイソプロピル・チオガラクトシド(
IPTG)を4mMの最終濃度で加えた。細胞をさらに3時間生育させ、遠心分
離し、トリス−HCI(、pH8,0)、10mM EDTAに再懸濁すると、
以降の抽出の準備ができた。
実施例7
遠心分離後に得られたベレットを50mMトリス(pH7,4)と50mMNa
C1(C)で少な(とも3回洗浄した。各洗浄後に、600rpmで10分間遠
心分離することによってベレットを回収した。
最終ベレットを緩衝液に再懸濁し、800ps iで少なくとも2回、モンテイ
ン・ガラリン(Montain Gaulin)に通した。
得られた物質を再び600rpmで10分間遠心分離し、8M尿素、50mMト
リス(pH7,4)、1mM PMSF、2mM EDTAに室温で再懸濁した
。
600rpmで10分間の遠心分離後、可溶性物質を1M尿素に対して透析した
。
600rpmで15分間のさらなる遠心分離後に得られた上清を、突然変異した
タンパク質のplに基づ<pHで適切に平衡化した七ノQ(Mono Q)カラ
ムなどのイオン交換カラムに充填した。
これらの条件下では、組換えタンパク質が10mM〜1.0MのNaCl11度
で溶出した。得られた物質を50mM酢酸アンモニウムに対して透析し、逆相カ
ラムに充填した。
使用したカラムはブイダック(Vydac)C187μm(0,46X26cm
)であり、使用した溶媒は(A)0.05%TFA(水中)と(B)0.05%
TFA(アセトニトリル中)である。
このカラムをAと10%Bで平衡化し、タンパク質を充填した。
このようにして勾配を作成したが、ここで緩衝液(B)の百分率は60分間で6
0%に達し、その後、カラムを100%(B)で10分間洗浄した。
組換えタンパク質はこのカラムから単一のピークとして溶出した。
実施例1.2および3に記述したようにして得たポリペプチドの活性を、810
日のヒヨコの胚の背面根ニューロン細胞を培養中で維持するというそれらの能力
によって評価した。これらの細胞をEIO日のヒヨコの胚から取り出し、トリプ
ノンで解離し、その後の予備培養段階によって濃縮した。
次にそれらのニューロンを96穴組織培養皿に接種し、ポリオルニチン(15m
Mホウ酸緩衝液(pH8,4)中100 u g/m ] )とラミニン(10
μg/ml)で処理した。ニューロンを1ウエルにつき4000ニユーロンの濃
度で接種し、培養培地は100μg/mIのベニンジン、2mM L−グルタミ
ンおよび10%不活化ウソつ児血清を含むダルヘソコ最小必須培地(DMEM)
とした。培養24時間後ニ生き残った= ニー o ンを数えた(Skaper
ら(1985)Dev、 Brain Res、 24:39−46)。
図11は、野生型のヒトCNTFタンパク質と比較した先端欠失ポリペプチド型
の生物学的活性の例を示している。この実験の結果は、ED50として計算した
比活性が様々な形態について少なくとも5×10−目N4であったことを示して
いる。
ヒトCNTF配列(Negroら(1991)J、 Neurosci、 Re
s、 29 :251)に基づいて、次のオリゴヌクレオチドを構築した
I 1eTrpHi sHi sHi stl i ski sHi 5Asn
G 1yAspLeuSerSerArgSerl leこのヌクレオチドはそ
の5′領域にBgl11部位を含有する。6つのHisコドンが存在し、その後
に第15コドンから始まるCNTF配列の部分が続いている。さらに、/スティ
ンをコード化する第17コドン(TGT)をセリンをコード化する(T CT)
で置換した。ノステインの存在下では2つのCNTF分子が合体して二量体を形
成し、それが生物学的活性を低下させるので、この修飾が必要であった。このオ
リゴヌクレオチドを、5°AGGTCGACTACATTTTCTGTTGTT
AG3°という配列のオリゴヌクレオチド5alIと共にPCRて使用した。増
幅産物をBglIIと5allで切断し、プラスミドpT77 h CNT F
(Negroら(1991)J、 Neurosci、 Res、 29+2
70)のBamH1部位とSal工部工部間にクローン化した。BamHIとB
gllIは適合する制限部位である。
図12はこの発現ベクターを表している。これはアンピンリンに対する耐性(A
MP’)、T7プロモーター、制限部位N(Ndeり、Nh(Nhel)、B(
B amHI)、Bg(BgI I I)および5(SalI)を含んでいる。
ヒスチジン(M)とヒドロキシルアミンに関する切断部位(H)の位置をも示し
ている。
化学的切断部位Hを含有する融合タンパク質を次に示すこの融合タンパク質は、
6つのヒスチジンとアミノ酸アスパラギンおよびグリノンによってもう1つのC
NTF分子に融合したCNTF分子である。これら2つのアミノ酸はヒドロキシ
ルアミンに関する切断部位を表す。
ヒトCN T F (Negroら(1991)J、 Neurosci、 R
es、 29:25] )の配列に基づいて、次のオリゴヌクレオチドを構築し
た
5°TCTAGATCTCTCTAGCCGCTCTAT3’AspLeuSe
rSerArgSerI Ieこのオリゴヌクレオチドには、その5′領域にB
glll制限部位が存在する。
さらにアミノ酸ンステインをコード化する第17コドン(TGT)がアミノ酸セ
リンをコード化する(T CT)で置換されている。このオリゴヌクレオチドを
上述のオリゴヌクレオチド5ailと共にPCHに用いた。増幅産物をBgll
Iと5allで切断し、発現プラスミドpR3ETB(インビトロアン)の制限
部位BamHIとXhoI(これらはそれぞれBgllIおよび5allと適合
する)の間にクローン化した。
図13はその発現ベクターを示す。これはアンピシリンに対する耐性(AMP゛
)、T7プロモーター、制限部位N(Ndel)、B(BamHI)、Bg(B
glII)、5(Sall)およびX(Xhol)を明示している。さらにヒス
チジン(M)とエンテロキナーゼに関する切断部位の位置も示されている。
この融合タンパク質の最初のアミノ酸は次の通りである;Met−^rg−G
1 y−3er−His−H1s−11i s−Hi 5−Hi 5−Hi 5
−Gl y−Met−^1a−3er|Met−Thr−Gly−Gly−
Gln−Gln−Met−GIY−^rg−^5p−Leu−Tyr−^sp−
^sp−^sp−^5p−Lys−Aspl 5−Leul@6−3erl 7
−
理解できるであろうが、転写されたタンパク質はそのアミノ末端領域に6つのヒ
スチジンを含有し、その後にLysとAsp、5の間のエンテロキナーゼに関す
る切断部位が続く融合タンパク質であり、これがAsp−Asp−Asp−As
p−Lys−Asp+sという配列をリジンの後ろで切断することを容易にする
。
細菌の生育は実施例6に記述の通りであった。
遠心分離後に得たベレットを緩衝液(50mMトリス(pH7,4)、50mM
NaC])で少なくとも3回洗浄し、各洗浄ごとに遠心分離によってベレットを
回収した。最終ベレットを上記の緩衝液に再懸濁し、800ps iで少なくと
も2回、モンテイン・ガラリンに通した。得られた物質を再び600rpmで1
0分間遠心分離し、緩衝液A(6Mグアニジン、O,IM NaH2PO4,1
00mMトリス、pH8)に再懸濁した。それを再び前と同様に遠心分離し、そ
の上清をIMAC−NTAクロマトグラフィーカラム(クィアアン)に充填する
ことによって、金属イオンと相互作用させた。8mlのNTA樹脂にニッケルを
充填し、70m1の緩衝液Aで洗浄した。螺動ポンプを用いて上記の上清を緩衝
液A中に30〜50m1/時間の速度で充填した。次にそのカラムを緩衝液B(
8M尿素。
0.1M Na82PO4,10mMトリス、pH8)で洗浄した後、40m1
の緩衝液C(8M尿素、0.IM NaH2PO4,10mMトリス、pH6,
3)で再び洗浄した。組換え突然変異タンパク質を緩衝液D(8M尿素、O,I
M NaHzPo 4、 10 mM )リス、pH4,5)で溶出させた。
突然変異タンパク質CNTF(His)6AsnGlyD14Ser17CNT
Fを水に対して透析し、沈殿物を6Mグアニジンおよび2Mヒドロキシルアミン
に再懸濁した。そのポリペプチドを37℃で12時間インキュベーションすると
、この期間中にヒドロキシルアミンがポリペプチドを2つの部分(それぞれCN
TF(His)6AsnとGIyD14Ser17CNTF)に切断する。
他方、突然変異タンパク質His6D14Ser17CNTFを50mMCa(
12,50mMトリス−HCI(pH8)に対して透析し、1:500の酵素基
質比を用いて37℃で12時間、エンテロキナーゼ(ベーリンガー)で消化した
。
この期間中にポリペプチドは2つの部分(Hi s 6とD14Ser17CN
TF)に分かれる。このようにして消化した突然変異タンパク質を緩衝液入に対
して透析し、上述のカラムに充填した。
ポリペプチドCNTF(His)aAsnGIyD14ser17cNTFの最
終産物は次の突然変異タンパク質によって表される:G]yD14Ser17C
NTF(、:、れは緩衝液C中に溶出する)とCNTF(H45)aAsn(こ
れは緩衝液り中に溶出する)。
ポリペプチドHis6D14Ser17CNTFの最終産物は、緩衝液C中に溶
出する突然変異タンパク質D14Ser17CNTFである。
この方法によって得られる2つの組換え突然変異タンパク質を次の流れ図に示す
ように精製する
突然変異タンパク質: CNTF(+1is)6AsnG1yD14Ser17
CNTF細菌ペレツト
緩衝液A中での可溶化
緩衝液A中のIMAC−NTAカラムの充填緩衝液Bによる洗浄(ヒスチジン非
含有タンパク質)緩衝液C1こよる洗浄(わずかなヒスチジンを伴う細菌タンパ
ク質)緩衝液りによる洗浄(突然変異タンパク質CNTF(His)a^5nG
1yD14ser17cNTF)透析
遠心分離
ベレット
6Mグアニンノン2Mヒドロキシルアミン、37℃、12時間による可溶化緩衝
液Aによる透析
緩衝液A中のIMAC−NTAカラムの充填緩衝液Bによる洗浄
緩衝液Cによる洗浄(G1yD14Ser17CNTF)緩衝液りによる洗浄(
CNTF(His)aAsn)突然変異タンパク質 (His)sDI4ser
17cNTF細菌ベレット
緩衝液A中での可溶化
IMAC−NTAカラムの充填
緩衝液Bによる洗浄(ヒスチジン非含有タンパク質)緩衝液Cによる洗浄(わず
がなヒスチジンを伴う細菌タンパク質)緩衝液りによる洗浄((His)sD1
4ser17cNTF)透析
エンテロキナーゼによる消化、1:500.3″1℃で12時間緩衝液、へによ
る透析
IMAC−NTAカラムの充填
緩衝液Bによる洗浄
緩衝液Cによる洗浄(D14Ser17CNTF)緩衝液りによる洗浄((Hi
s)6)
図]、4は、緩衝液A中に充填し、緩衝液BとCて洗浄した細菌性出発物質の溶
出特性図を示す。組換えタンパク質は緩衝液り中に溶出する。
図15は、ヒドロキシルアミンによる酵素的切断後のCNTF(Hi 5)6A
snGIyD14ser17cNTFの溶出特性図を示す。突然変異タンパク質
GIyD14Ser17CNTFは緩衝液C中に溶出し、突然変異タンパク質C
NTF(His)、Asnは緩衝液り中に溶出する。
図16は、エンテロキナーゼによる酵素的切断後の突然変異タンパク質His6
D14ser17cNTFの溶出特性図を示す。この組換えタンパク質は緩衝液
C中に溶出する。
突然変異タンパク質を非変性条件下で精製することも可能である。この場合、I
MACカラム(ファルマンア)を使用することができる。様々な段階には、30
℃における細菌の生育、リン酸緩衝液(pH7,4)中での突然変異タンパク質
の可溶化および非変性条件下のカラムへの充填が含まれる。タンパク質は変性条
件について示したものと同じpH値で溶出する。
アプライド・パイオンステムズ自動タンパク質配列決定装置モデル477Aを用
いて、組換え突然変異タンパク質のアミノ末端配列をエドマン分解によって決定
した。アミノ酸から誘導されるフェニルチオヒダントインを装置で決定した。
GlyD14Ser17CNTFのN−末端アミノ酸から始まる最初の10アミ
ノ酸の配列はGly−Asp−Leu−5er−5er−Arg−8er−I
1e−Trp−L e u−A ] ]a−、Ar gであり、D14Ser1
7CNTFについてはAsp−Leu−5er−5er−Arg−5er−I
Ie−Trp−Leu−Ala−Arg−LysTあった。この配列は、Gly
D14Ser17CNTFに最初の14アミノ末端アミノ酸が存在せず、グリノ
ンアミノ末端アミノ酸が存在し、位置17のンステインがセリンに置換されてい
る場合のCNTFの配列(図2)に対応する。
D14Ser17の場合、最初の14アミノ酸が削除され、位置17のシスティ
ンがセリンで置換されている。
ヒヨコの背面神経節から摘出したEIO日の胚ニューロン細胞を培養中で維持す
るという突然変異タンパク質の効力に基づいて、組換え突然変異タンパク質の生
物学的活性を評価した。EIO日のヒヨコの胚から細胞を摘出し、解離し、一連
の予備培養段階によって濃縮した。次にそのニューロンを組織培養用の96穴プ
レートに接種し、ポリオルニチン(1−00μg/m1.ホウ酸緩衝液(pH8
゜4)中)およびラミニン(10μg/ml中)で処理した。ニューロンを1ウ
エルにつき4000ニユーロンの濃度で接種した。培養培地は100μg/ml
のペニシリン、2mML−グルタミンおよび10%不活化ウシつ児血清を含むダ
ルベツコ最小必須培地(DMEM)とした。生き残ったニューロンを培養の24
時間後に数えた(Skaperら(1985)Dev、 Brain Res、
24:39−46)。
単一突然変異タンパク質はED50として計算した次の比活性を持っていた。
CNTF(His)6AsnG]yD14Ser17CNTF 20%g/m1
GIyD14Ser17CNTF 0.25%g/m1CNTF(Hi 5)6
Asn 0.5μg/m](Hi 5)6D14Sc r 17CNTF 0.
4μg/l1lID14Ser17CNTF 0.12%g/ml医薬組成物
ガングリオノド、リン脂質、ヒアルロン酸またはそれらの誘導体、半合成類縁体
もしくはそれらの塩の1つと共に、あるいはこれらを含まずに、本発明のヒトC
NTF分子の溶液を含有する医薬組成物の製剤化には、CNTF分子の有効量を
医薬的に許容し得る賦形剤との混合物中に混合するという、患者に投与される医
薬的に許容し得る組成物を調製するためのよく知られている方法が含まれる。
適切な賦形剤とその製剤は、他のタンパク質を含めて、例えば“Remingt
on’ s Pharmaceutical 5cicnces(1985)−
(マソク畢バブリノングφカンパニー、 Easton編。
米国)に記述されている。このような賦形剤には注射可能な「デポ−製剤」が含
まれる。これに基づき、本医薬製剤には、生理学的液体と等張な適当なpHの緩
衝液に含まれる医薬的に許容し得る賦形剤または希釈剤の1またはそれ以上を伴
うCNTF成長因子の溶液またはその凍結乾燥粉末が含まれるが、これに限られ
るわけではない。凍結乾燥製剤の場合、マンニトールやグリツジなど(これらに
限られるわけではない)の支持賦形剤を用いることができ、所望のpHの適度に
等張な緩衝溶液を得るべく、所望の体積の適当な緩衝溶液を加える。所望の体積
の等張溶液中の本CNTF分子の医薬組成物のために同様の溶液を使用すること
ができ、所望のpH(例えば中性pH)の等強性医薬調製物を一貫して得るため
には、適当な濃度のリン酸塩またはクエン酸塩を含む生理学的な緩衝溶液の使用
が含まれるが、これに限られるわけではない。
経口的、局所的、直腸的、非経口的、局部的、吸入的、脳内的または鼻孔内的に
医薬調製物を使用することができる。したがってこれらは固体または半固体型、
例えば火剤、錠剤、クリーム剤、ゼラチンカプセル剤、カプセル剤、坐剤、軟ゼ
ラチンカプセル剤、ゲル剤、膜、不織製品、チューブレット、糸、ミクロ球およ
びスポンジなどであり得る。非経口的使用と脳内使用のためには、筋肉内または
皮下投与のための形管を使用することができ、注入、静脈内注射あるいは脳内注
射のための形態を使用することができ、したがってこれらの形態を活性化合物の
溶液として、あるいは上述の使用に適し、生理学的液体と適合する浸透圧を有す
る1またはそれ以上の医薬的に許容し得る賦形剤または希釈剤と混合すべき活性
化合物の凍結乾燥粉末として調製することができる。局部的使用のためには、局
所的使用のためのクリームや軟膏の形態、あるいはスプレーの形態にある調製物
を使用することができる。吸入のためには、算用スプレーなどのスプレーの形態
にある調製物を使用することができる。ポリマーを伴う使用については、膜、ス
ポンジ、不織製品、チューブレラ)・、糸、ミクロ球、ナノ球およびナノカプセ
ルの形態にある調製物を使用することができる。
本発明の調製物はヒトまたは動物に対する投与に使用することができる。これら
は好ましくは、溶液剤、スプレー剤、軟膏およびクリームの場合には0.01%
ないし10%の活性化合物を含有し、固形調製物の場合には、1%ないし100
%(好ましくは5%ないし50%)の活性化合物を含有する。投与すべき投与量
は個々の必要性、所望の効果および選択した投与経路に依存する。
本医薬調製物には、脂肪親和性の賦形剤(例えば水溶性賦形剤、グリコゼラチン
などの牛乳化性賦形剤またはその他)を伴う直腸投与用の坐剤も含まれるが、こ
れに限られるわけではない。これらの調製物中では、全賦形剤の0.01ないし
1重量%にわたる量て上記CNTFが存在し得る。坐剤は適当な量のアセチルサ
リチレートを含有し得るが、これらに限られるわけではない。本医薬製剤には、
鼻孔投与、吸入投与および筋肉内投与のためのミクロ球、ナノ球、ナノカプセル
も含まれる。さらに上記製剤はそれらが意図する使用法に応じて、例えば膜、ス
ポンジ、管、誘導路などの他の特殊な形態をも含み得る。
活性物質 μg 0.5〜1(2500BU)塩化ナトリウム mg 16
クエン酸緩衝液pH=7 ml 2
適量の注射用水中
調製物番号22mlバイアルが次の物質を含有する活性物質 μg 5〜10(
25000BU)塩化ナトリウム mgl、6
クエン酸緩衝液pH=7 ml 2
適量の注射用水中
調製物番号32mlバイアルが次の物質を含有する活性物質 μg 0.5〜1
(2500BU)塩化ナトリウム mg 16
カングリオノドナトリウム塩 mg 100クエン酸緩衝液pH=7 ml 2
適量の注射用水中
調製物番号42mlバイアルが次の物質を含有する活性物質 μg 5〜10(
25000BU)塩イ1ナトリウム mg 16
ガシゲリ第5.・ドナト)ノウム塩 mg 50クエン酸緩衝液pH=7 ml
2
適量の注射用水中
調製物番号52mlバイアルが次の物質を含有tゑ一活性物質 tlg 0.5
〜1(2500BU)塩化ナトリウム mg 16
モノンアロテトラヘキソンルカングリオノド(GMI)ナトリウム塩 mg 1
00クエン酸緩衝液pH=7 ml 2
適量の注射用水中
調製物番号6・2mlバイアルが次の物質を含有する活性物質 μg 5〜10
(25000BU)塩化ナトリウム mg 1.6
モノノアロテトラヘキソノルガングリオノド(GMI)ナトリウム塩 mg 1
00クエン酸緩衝液pH=7 ml 2
適量の注射用水中
凍結乾燥した活性物質 μg 2〜4(100OOBU)グリツジ mg 30
b)2mlの溶媒アンプルが次の物質を含有する塩化ナトリウム mg 16
注射用水中のクエン酸緩衝液 2mlになる適量凍結乾燥した活性物質 μg
2へ4(]、0000BLl)塩化ナトリウム mg 16
注射用水中のクエン酸緩衝液 2mlになる適量凍結乾燥した活性物質 μg
5〜10(25000BtJ)塩化ナトリウム mg24
注射用水中のクエン酸緩衝液 3mlになる適量凍結乾燥した活性物質 μg
5〜10(25000BU)ガングリオンドナトリウム塩 mg 100塩化ナ
トリウム mg 24
注射用水中のクエン酸緩衝液 3mlになる適量凍結乾燥した活性物質 μg
5〜10(25000BU)ガングリオ/ドナトリウム塩 mg 50塩化ナト
リウム mg 24
注射用水中のクエン酸緩衝液 3mlになる適量凍結乾燥した活性物質 μg
0.5〜1(2500BU)モノンアロテトラヘキソシルガングリオシド(GM
I)ナトリウム塩 mg 100塩化ナトリウム mg 24
注射用水中のクエン酸緩衝液 3mlになる適量凍結乾燥した活性物質 μg
5〜10(25000BU)モノンアロテトラへキソシルガングリオシド(GM
I)ナトリウム塩 mg 100塩化ナトリウム mg 24
注射用水中のクエン酸緩衝液 3mlになる適量凍結乾燥した活性物質 μg
5〜10(25000BU)3−sn−ボスファチンルセリン mg 50レシ
チン mg 15
マンニトール mg 101
00b)4の溶媒アンプルが次の物質を含有するマンニトール mg 60
4m1になる適量の注射用水中
凍結乾燥した活性物質 μg 5〜10(25000BU)マンニトール mg
60
b)3mlの溶媒アンプルが次の物質を含有する・塩化ナトリウム mg 24
注射用水中のクエン酸緩衝液 3mlになる適量凍結乾燥した物質 μg 2.
5〜5(12500BU)塩化ナトリウム mg 16
注射用水中のクエン酸緩衝液 2mlになる適量C)直腸投与用の坐剤の例
調製物番号17
活性物質 μg 5〜10(25000BU)ココア脂 mg 2.5
調製物番号18
活性物質 μg 5〜10(25000BU)カーボワックス1540 g 1
.75カーボワソクス6000 g 0.75調製物番号19
活性物質 μg 5〜10(25000BU)活性物質 μg 5〜10(25
000BU)ゼラチン g 0.25
調製物番号21
ヒアルロン酸のベンジルアルコールとの部分的エステルを含有するクリームであ
って、その100gが次の物質を含有する・活性物質 μg 10〜20(50
000BU)ヒアルロン酸のベンジルアルコールとの部分的エステルgo、2
ポリエチレングリコールモノステアレート400g 10.000
セチオールV g 5.000
ラネソテSX g 2.000
パラオキシ安息香酸メチル g 0.075パラオキ7安息香酸プロピル g
0.050デヒドロ酢酸ナトリウム g 0.100グリセリンF、U、 g
1.500
ソルビトール70 g 1.500
テストクリーム g 0.050
注射用水 100.000gになる適量調製物番号22
ヒアルロン酸のベンジルアルコールとの全エステルを含有するクリームであって
、その100gが次の物質を含有する:活性物質 μg 10〜20(5000
0BU)ヒアルロン酸のベンジルアルコールとの全エステルg 0.2
ポリエチレングリコールモノステアレート400g 10.000
セチオールV g 5.000
ラネツテSX g 2.000
バラオキシ安息香酸メチル g O,075パラオキシ安息香酸プロピル g
0.050デヒドロ酢酸ナトリウム g O,100グ’Jセ’JンF、U、
g 1.500ソルビトール70 g 1.500
テストクリーム g 0.050
注射用水 100.000gになる適量ここに本発明を記述したので、本発明が
様々に変化し得ることは明らかであろう。そのような変化は本発明の思想と範囲
からの逸脱であると見なすべきではなく、当業者にとって自明であるような修飾
はすべて以下の請求の範囲の範囲に包含されるものと解釈される。
!HAGGGCCTGAACAA[;AAf:ATCAACCTG[;AC丁C
丁GCGGATGGGATGCTCCCGG Acr TGT TCT TGT
AGT TGG ACCTGA GAC[;CCTACCCT ACG435
CAG TGG CAA GCA CTG ATCAGT GGA GTG
AGCTi;A CCG AGG CAG AGCGTCACCGTT CGT
GACTAG TCA CCT CACTCG ACT GGCTCCGTC
TCG226TGGCCAGGCTCTTAGAAGACCAGCAGG丁GC
ATTTTACCCCAACCGACCGGT CCG AGA ATCTTC
T[;G TCG TCCACG TAA AAT GGG GTT GGC2
71AAGGTGACTTCCATCAAGC丁^TACATACCCTTCT
TCTCCAAGTCGTTCCACTGAAGGTAGTTCGATATGT
ATGGGAAGAAGAGGTTCAGC316C丁GCCTTTGCATA
CCAGATAG^GGAGTTAATG^■^CTCCTGGAATGACG
GAAACGTATGGTCTATCTCCTCAATTACTATGAGGA
CC丁丁A361ACAAGATCCCCC[)CAATGAGGCTGA丁G
GGATGCCT^丁TAATGTTGTGT TCT AGG G[;G C
GT TACTCC[;ACTACCCT ACG SAT AAT TACA
AC406GAGATGGTGGTCTCTTTGAGAAGAAGCTGTG
GGGCCTAAAGGTGCCTCTACCACCAG AGA AACTC
T TCT TCG ACA CCCCG[; ATT TCCACG451T
GCAGGAGCTTTCACAGTGGACAGTAAGGTCCATCCA
TGACCTTCACGTCCTCGAAAG丁GTCACCTGTCA丁TC
CAGG丁Af;GTACTl;GAAG541 ATT A丁A 丁TG I
JA ACA ACA A[;A AAA TGT GAG TCG ACA
ATAATATAACGArTGTTGTTCTTTTACACrCAGC丁G
丁TFig、3
1BIIANNKKM
残基数=187
分子量: 21400
アミノ酸組成
361 TACIJG ATA GAG GAG TTA ATG ATA C
TCCTG GAA TACAAG ATCCCC^TG GTCTAT CT
CCTCAAT TACTAT GAG GACCTT ATG TTCTAG
GGG406 CGCAAT GAG GCT GAT GGG ATG C
CT ATT AAT G丁T GGA GAT GG丁GGTGCG TTA
CTCCGA CTA CCCTACGGA TAA TTA CAA CC
T CTA CCA CCAFig、5
残基数・161゜
分子量 19476
1g1O
Ai−X’l/乙ロー1丁
Fig12
Fig13
溶出物(ml)
フロントベージの続き
(51) Int、 C1,’ 識別記号 庁内整理番号C12N 1/21
7236−4B
C12P 21102 C9282−4B//CC12N 1/21
C12R1:19)
(C12P 21102
C12R1:19)
(81)指定国 EP(AT、BE、CH,DE。
DK、ES、FR,GB、GR,IE、IT、LU、MC,NL、SE)、0A
(BF、BJ、CF、CG、CI、CM、GA、GN、ML、MR,SN、TD
、TG)、 AU、 BB、 BG、 BR,CA、 C3,FI、 HU。
JP、KP、KR,LK、MG、MN、MW、No、PL、RO,RU、SD、
US
I
Claims (40)
- 1.野生型ヒト毛様体ニューロン親和性因子(CNTF)のアミノ末端の少なく とも1アミノ酸を欠くか、野生型ヒトCNTFのカルボキシ末端の少なくとも1 アミノ酸を欠くか、あるいは野生型ヒトCNTFのアミノ末端とカルボキシ末端 の両方の少なくとも1アミノ酸を欠く、ヒトCNTFの先端欠失型をコード化す る配列からなる核酸配列。
- 2.図4に記載のアミノ酸配列と機能的に等価な生物学的活性を有するポリペプ チドをコード化する配列からなる請求項1の核酸配列。
- 3.図6に記載のアミノ酸配列と機能的に等価な生物学的活性を有するポリペプ チドをコード化する配列からなる請求項1の核酸配列。
- 4.図8に記載のアミノ酸配列と機能的に等価な生物学的活性を有するポリペプ チドをコード化する配列からなる請求項1の核酸配列。
- 5.ヒト毛様体ニューロン親和性因子(CNTF)のアミノ末端の少なくとも1 アミノ酸を欠き、かつ、該CNTF内に少なくとも1つのアミノ酸置換を含有す るヒトCNTFの先端欠失突然変異タンパク質型をコード化する配列からなる核 酸配列。
- 6.D14Ser17CNTFのアミノ酸配列と機能的に等価な生物学的活性を 有するポリペプチドをコード化する配列からなる請求項5の核酸配列。
- 7.図3に記載の核酸配列もしくは遺伝子コードの縮重に従うその変異種からな る請求項2の核酸配列。
- 8.図5に記載の核酸配列もしくは遺伝子コードの縮重に従うその変異種からな る請求項3の核酸配列。
- 9.図7に記載の核酸配列もしくは遺伝子コードの縮重に従うその変異種からな る請求項4の核酸配列。
- 10.D14Ser17CNTFをコード化する核酸配列もしくは遺伝子コード の縮重に従うその変異種からなる請求項6の核酸配列。
- 11.図4に記載のアミノ酸配列もしくは機能的に等価な生物学的活性を有する アミノ酸配列からなるヒト毛様体ニューロン親和性因子の先端欠失型。
- 12.図6に記載のアミノ酸配列もしくは機能的に等価な生物学的活性を有する アミノ酸配列からなるヒト毛様体ニューロン親和性因子の先端欠失型。
- 13.図8に記載のアミノ酸配列もしくは機能的に等価な生物学的活性を有する アミノ酸配列からなるヒト毛様体ニューロン親和性因子の先端欠失型。
- 14.D14Ser17CNTFのアミノ酸配列もしくは機能的に等価な生物学 的活性を有するアミノ酸配列からなるヒト毛様体ニューロン親和性因子の先端欠 失突然変異タンパク質型。
- 15.ヒト毛様体ニューロン親和性因子(CNTF)のアミノ末端の少なくとも 1アミノ酸を欠くか、ヒトCNTFのカルボキシ末端の少なくとも1アミノ酸を 欠くか、あるいはヒトCNTFのアミノ末端とカルボキシ末端の両方の少なくと も1アミノ酸を欠くヒトCNTFの先端欠失型をコード化する核酸配列を含む組 換え発現ベクターであって、形質転換された原核または真核細胞中でヒト毛様体 ニューロン親和性因子の該先端欠失型を発現させる能力を有する組換え発現ベク ター。
- 16.該核酸配列が請求項2、3または4のいずれかに定義するヌクレオチド配 列を有する請求項15の組換え発現ベクター。
- 17.該核酸配列が図3、5または7のいずれかに記載のヌクレオチド配列を有 する請求項15の組換え発現ベクター。
- 18.ヒト毛様体ニューロン親和性因子(CNTF)のアミノ末端の少なくとも 1アミノ酸を欠き、かつ、該CNTF内に少なくとも1つのアミノ酸置換を含有 するヒトCNTFの先端欠失突然変異タンパク質型をコード化する核酸配列を含 む組換え発現ベクターであって、形質転換された原核または真核細胞中でヒト毛 様体ニューロン親和性因子の該先端欠失突然変異タンパク質型を発現させる能力 を有する組換え発現ベクター。
- 19.該核酸配列がD14Ser17CNTFをコード化する請求項18の組換 え発現ベクター。
- 20.該ベクターがCNTF(His)6Δ14Ser17CNTFである請求 項18の組換え発現ベクター。
- 21.該ベクターがΔ14Ser17CNTFである請求項18の組換え発現ベ クター。
- 22.請求項15のベクターで形質転換された原核または真核細胞。
- 23.請求項18のベクターで形質転換された原核または真核細胞。
- 24.咳細胞が大腸菌、バチルス属の構成要素、シュードモナス属の構成要素、 酵母または哺乳類細胞である請求項22の細胞。
- 25.該細胞が大腸菌、バチルス属の構成要素、シュードモナス属の構成要素、 酵母または哺乳類細胞である請求項23の細胞。
- 26.医薬的に許容し得る担体または希釈剤と請求項11、12または13のい ずれかのヒト毛様体ニューロン親和性因子の有効神経治療量とを含む医薬組成物 。
- 27.医薬的に許容し得る担体または希釈剤と請求項14のヒト毛様体ニューロ ン親和性因子の有効神経治療量とを含む医薬組成物。
- 28.天然のガンダリオシドまたは該ガングリオシドの誘導体、半合成類縁体あ るいは塩をさらに含む請求項26または27の医薬組成物。
- 29.天然の多糖または該多糖の誘導体あるいは半合成類縁体をさらに含む請求 項26または27の医薬組成物。
- 30.該多糖がヒアルロン酸である請求項29の医薬組成物。
- 31.神経機能の維持、回復またはその損失の防止によって神経障害を治療する 方法であって、請求項11、12または13のいずれかのヒト毛様体ニューロン 親和性因子の有効量を患者に投与することからなる方法。
- 32.神経機能の維持、回復またはその損失の防止によって神経障害を治療する 方法であって、請求項14のヒト毛様体ニューロン親和性因子の有効量を患者に 投与することからなる方法。
- 33.神経機能の維持、回復またはその損失の防止によって神経障害を治療する 方法であって、請求項28の医薬組成物の有効量を患者に投与することからなる 方法。
- 34.神経機能の維持、回復またはその損失の防止によって神経障害を治療する 方法であって、請求項29の医薬組成物の有効量を患者に投与することからなる 方法。
- 35.神経系の老化もしくは免疫系を冒す疾患によって引き起こされる神経病理 学的状態の治療法であって、請求項11、12または13のいずれかのヒト毛様 体ニューロン親和性因子の有効量を患者に投与することからなる方法。
- 36.神経系の老化もしくは免疫系を冒す疾患によって引き起こされる神経病理 学的状態の治療法であって、請求項14のヒト毛様体ニューロン親和性因子の有 効量を患者に投与することからなる方法。
- 37.神経系の老化もしくは免疫系を冒す疾患によって引き起こされる神経病理 学的状態の治療法であって、請求項28の医薬組成物の有効量を患者に投与する ことからなる方法。
- 38.神経系の老化もしくは免疫系を冒す疾患によって引き起こされる神経病理 学的状態の治療法であって、請求項29の医薬組成物の有効量を患者に投与する ことからなる方法。
- 39.ヒト毛様体ニューロン親和性因子(CNTF)のアミノ末端領域の少なく とも1アミノ酸を欠き、かつ、該CNTFの残りの部分に少なくとも1つのアミ ノ酸置換を含有する形態のCNTFからなるヒトCNTFの突然変異タンパク質 型を生塵する方法であって、次の段階からなる方法:(a)野生型ヒトCNTF のアミノ末端領域に存在するアミノ酸をコード化する少なくとも1つのコドンを 欠き、かつ、野生型ヒトCNTFには存在しないアミノ酸をコード化するように 修飾された少なくとも1つのコドンを該CNTFの残りの部分に含有する形態の ヒトCNTFをコード化する第1の核酸配列であって、少なくとも6つのヒスチ ジン残基と化学的または酵素的切断部位とをコード化する配列からなる第2の核 酸配列に融合しているもの、からなる核酸配列を宿主細胞中で発現させ、 (b)該宿主細胞の抽出物を生産し、 (c)固定化した金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によって 該抽出物を精製し、 (d)組換え突然変異タンパク質CNTFを回収し、(e)段階(d)の該CN TFを化学的または酵素的切断剤と共にインキュベートし、 (f)段階(e)で生成した反応生成物を固定化した金属アフィニティークロマ トグラフィー(IMAC)によって精製し、(g)CNTFの該突然変異タンパ ク質型を回収する。
- 40.該突然変異タンパク質がD14Ser17CNTFである請求項39の方 法。
Applications Claiming Priority (5)
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