JPH07503128A - ヒト毛様体ニューロン親和性因子の先端欠失型および突然変異タンパク質型の合成と精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト毛様体ニューロン親和性因子の 先端欠失型および突然変異タンパク置型の合成と精製本発明は、組換えＤＮＡ技 術によって得られるヒト毛様体ニューロン親和性因子（ＣＮＴＦ）の生物学的に 活性な先端欠失型および突然変異タンパク置型（これらタンパク質の単量体型を 含む）の合成法と精製法に関する。本発明によれば、対応する天然型ＣＮＴＦよ りもアミノ酸数が少ないヒトＣＮＴＦポリペプチドを得ることができる。これら 新しい型のＣＮＴＦは天然のＣＮＴＦとは異なる化学的特性および物理化学的特 性を発揮し、様々な医薬的応用に有用である。

関連技術の説明 Ａ１毛様体ニューロン親和性因子 毛様体神経節（ＣＧ）は２つのニューロン集団、すなわち毛様体と脈絡膜を含有 し、これらは共にコリン作動性である。ＣＧニューロンは脈絡膜、毛様体および 虹彩中の眼の内在性筋肉構造に神経を分布している。ヒヨコの胚の発育中には、 それらの軸索が眼内の神経支配領域との連結を確立するＥ８日とＥ１５日の間に 、ＣＧニューロンの約半分が死ぬ。

このニューロンの死は眼の除去によって強く増進され、一方、補足的な眼芽の移 植によってかなり妨害される。

この観察結果から、上記神経支配領域がそれら自身の特異的ニューロンのための 栄養因子を含有するという仮説が導かれた。

Ｅ８日の様々なヒヨコの肝組織がら得られる抽出物は、同じ発育段階にあるヒョ コ胚毛様体神経節から得られる解離されたニューロンのものとは異なる、それら 自身の栄養活性を発揮した（Ａｄｌｅｒら（１９７９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０４ ＋１４３４−１４３６）。

次いでこの栄養活性が毛様体ニューロン親和性因子（ＣＮＴＦ）と関連づけられ た（Ｂａｒｂｉｎら（１９８４）Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅａ＋、　４３：１４６ ８−１４７８）。

胚中の全ＣＮＴＦ栄養活性の３分の１は眼中で観測され、そのほとんどは脈絡膜 中と眼の内在性筋肉構造中に局在していた。

イオン交換クロマトグラフィー、ショ糖勾配超遠心分離およびドデシル硫酸ナト リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によるこのタンパ ク質の精製は、それが約２１Ｋｄの分子量と負の正味の電荷を有することを示し た。Ｅ８日のヒヨコＣＧニューロン中、Ｅ１０日のヒヨコＤＲＧニューロン中、 およびＥｌ１日の交感ニューロン中の精製タンパク質によって発揮される栄養活 性は１０”　１０−１２Ｍのオーダーであって、これは雄マウスの顎下腺から精 製されるもう１つのニューロン親和性因子、すなわち神経成長因子（ＮＧＦ）と 、そのニューロンＤＲＧおよび交感標的に関して同じである。

酵素チロノン・ヒドロキシラーゼとフェニルエタノールアミンＮ−メチルトラン スフェラーゼに対するそれらの効果の程度は異なるものの、ＣＴＮＦはＮＧＦと 同様に培養クロム親和性副腎細胞の成長を支持する。ＣＮＴＦはヒヨコ網膜細胞 培養中でＣｈＡＴ活性を引き起こし、コリン作動性ニューロン応答を示す。ＣＮ ＴＦは脳の脳橋基底領域のコリン作動性ニューロンに対する栄養効果を持たず、 これをコリン作動性ユニーロン親和性因子と見なすことはできない。

ＣＮＴＦはインビトロでいくつかの交感ニューロン、頭蓋神経節のを髄ニューロ ン（Ｂａｒｂｉｎら（１９８４）Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｏ、　４３　：１４６ ８）、を髄の運動ニューロン（Ａｒａｋａｗａら（１９９０）Ｊ、　Ｎｅｕｒｏ ｓｃｉ、　１０：３５０７　；　ｌｏｎｇら（１９９０）Ｓｏｃ、　Ｎｅｕｒｏ ｓｃｉ、＾ｂｓｔｒ、　１６：４W４　：　Ｈａｇａｌら（１ ９９１）Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　６３：１４１）および海馬二、 −ｏ：／（Ｉｐら（１９９１）Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　P１： ３１２４）の生存と発育を増進する。また寡突起神経膠細胞と神経膠星状細胞に 分化する０−２Ａとして知られる祖先膠細胞の分化にインビトロで影響を与える ことも明らかにされている（Ｌｉ１１ｉｅｎら（１９８８）Ｎｅｕｒｏｎ　１： ４８）。

このタンパク質の特徴は等電点５．８、分子量２４ＫＤａというものであって、 組換え細菌の総タンパク質の３０％までをＣＮＴＦとして生産することが比較的 容品なのであるが、まさにその特徴ゆえに、均一に純粋なタンパク質を得るには 様々なりロマトグラフィ一工程を使用する必要がある。これらの様々な工程には イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ポリアクリルアミド ゲル電気泳動、イオン金属相互作用クロマトグラフィーおよび疎水相互作用クロ マトグラフィーが含まれる。これらの工程の多くは工業的なレベルで実行するこ とが難しく、したがってこの因子の生産コストをがなり増大させるので、代替と なる精製法の発見が強（望まれている。

８９組換えＤＮＡ技術 生物学的に活性なタンパク質を単離するための従来の技術には生物学的液体また は組織からの精製によるタンパク質の単離が含まれるが、この技術で得ることが できるタンパク質の量は必ずしもそれらの構造、機能、とりわけ応用の研究を可 能にするほど充分でない。

したがって充分量のタンパク質を得るには、組換えＤＮＡ技術を使用してこれら のタンパク質をコード化する遺伝子を発現ベクター中にクローン化することが組 換えＤＮＡ技術によれば、目的のタンパク質を大量に発現させ得る一連のベクタ ーを構築することができる。組換えＤＮＡ技術を用いることによって、分子生物 学者はＤＮＡ配列を配置し、組み立てて、目的のタンパク質を生産することがで きるハイブリッド分子を作成できるようになった。制限酵素による切断、それに よって得られる断片のりガーゼによる連結、組み立てるべきオリゴヌクレオチド の化学合成、この分野で研究している様々な研究室で考案されたその他の方法な ど、様々な反応が使用される。これらの技術はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９） ｌｌｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１ｌａｎ ｕａｌ（第２版、コールド・スプリング＋ハーバ−・ラボラトリ−・プレス、ニ ューヨーク州コールド・スプリング・ラボラトリ−）に要約されている。

高い発現レベルを得るためには、組み立てるべきＤＮＡ要素がいくつかの必須情 報を含有しなければならない。これらの要素には例えば複製起点、抗生物質に関 する選択標識、発現プロモーター、目的の遺伝子のための転写活性化因子および 当業者の知るその他の調節要素が含まれる。転写および翻訳調節要素に機能的に 連結した目的の遺伝子を含むこれらの要素の組み合わせは発現プラスミドと呼ば れるプラスミドを形成する。このような発現プラスミドまたはベクターは宿主細 胞（これらは真核生物由来であってもよいし、原核生物由来でありでもよい）に おけるタンパク質の発現を容易にする。次いで、以降の精製によってタンパク質 を得ることができる。

成長因子などの遺伝子の発現を自然に制御するプロモーターはあまり活性ではな く、適切な自然の条件下でのみ活性化されるのであるが、その条件はしばしば未 知である。この目的のためには、パボーバウイルス系のウィルスから得られるも のやその他の既知のプロモーターなど、既知の活性を持つプロモーターがしばし ば使用される。

したがって高レベルの遺伝子発現を得るために使用される調節要素は、互いに連 結してハイブリッド分子を形成する異なる遺伝子断片と結合した様々な起源（真 核生物、細菌、ウィルスなど）のＤＮＡの組み合わせである。遺伝子の転写活性 は調節配列とコード配列の間に適切な距離があるかどうかに依存する。

調節配列に近接して位置する遺伝子を得るための従来の技術は、それらのクロー ニングを容易にする適当な制限エンドヌクレアーゼ部位が存在するかどうかに依 存する。適合する部位が近くになく、異なる部位だけの場合には、そのような制 限部位を含有するオリゴヌクレオチドリンカーの合成によって各セグメントを結 合させることができる。この系は分子生物学者にとって大いに制約である。もう １つの方法はＰＣＲ技術を使用することである（Ｓａｉｋｉら（１９８８）Ｓｃ ｉｅｎｃｅ　２３９：４８７−４８９）。この技術によって、遺伝子セグメント をｌＸｌ０’倍にまで増幅することができる。その原理は２つのオリゴヌクレオ チドの使用に基づいており、それらのオリゴヌクレオチドのそれぞれを増幅すべ きＤＮＡ鎖の１つと正確に対を形成させることができる。遺伝子配列に関する２ つのオリゴヌクレオチドの間の距離は生産される分子の大きさを決定する。これ ら２つのオリゴヌクレオチドを、以降のクローニングを可能にする制限部位がそ れらの配列内に存在するように構築する。この制限部位は天然に存在するか、も しくは最小数のヌクレオチドを縮重させることによって特別に構築される。部位 特異的突然変異導入法として知られるこの方法は分子生物学者が予め決定した位 置に制限部位を構築することを可能にする。他の遺伝子セグメントと適合する部 位の構築はクローニングを容易にするばかりでなく、異なる遺伝子セグメントを 特異的に結合することをも可能にする。この技術を直接突然変異導入法によるク ローニングと定義することができる。

また、修飾された遺伝子を上述の適切な発現ベクターに挿入した後に、得られた 遺伝子の長さを増減することによって遺伝子配列を適当に変化させることもでき る。野生型遺伝子のコードされているタンパク質の特性と同じか、もしくは異な る特性を持つペプチドを得ることができる。つまり天然のタンパク質よりもアミ ノ酸数が少ない先端欠失型のポリペプチドや野生型タンパク質配列中に存在する あるアミノ酸配列を欠く欠失型のポリペプチドを得ることができる。これらの新 しいポリペプチド型は天然のタンパク質とは大いに異なる化学的特性、物理化学 的特性および生物学的特性を保持し得る。異なる型のポリペプチドを得るべく、 その遺伝子に突然変異を導入することによって、天然型と同じ生物学的活性を持 ち、天然のタンパク質よりもアミノ酸数が少ない新しい型のポリペプチドか、天 然のタンパク質受容体の遮断を可能にする新しい型のポリペプチドを得ることが 上の記述に基づき、本発明の目的は、均一に先端削除された形態および／または 突然変異した形態（イソ型と定義する）のヒト毛様体ニューロン親和性因子の宿 主細胞による大量な発現と精製である。これらの新しいポリペプチドは、単独で 、あるいは他の分子またはそれらの誘導体もしくは製品化された生体適合物質と 組み合わせて、治療目的に使用することができる。

本発明のもう１つの目的は、ＣＮＴＦ成長因子の１またはそれ以上のイソ型と天 然のガングリオノド、その誘導体または半合成類縁体の１つ、もしくはその塩の １つとの間の新しい錯体の１またはそれ以上、あるいはそのリン脂質、他の成長 因子、天然のポリマー（酸性多糖など）もしくは化学的に修飾または変換された 生体適合物質との会合物を活性物質として含有する医薬調製物を提供することで ある。

また本発明は、天然のガングリオノド、それらの誘導体または半合成類縁体の１ つ、あるいはそれらの塩の、成長因子ＣＮＴＦのイソ型および突然変異タンパク 質との新しい錯体、あるいはヒアルロン酸またはその誘導体の１つの、成長因子 ＣＮＴＦのイソ型および突然変異タンパク質との新しい錯体のすべてを、上記の 適応症に対して治療的に使用することをも包含する。皮下注射、筋肉内注射また は脳内注射によるヒトへの日用量は体重１ｋｇにつき活性物質０．０５ｍｇない し５ｍｇの間で変化し得る。

本発明のさらなる目的は、単量体の均一な精製を容易にするという利点を持つヒ トＣＮＴＦ突然変異タンパク質を生産する方法を提供することである。この方法 には、少なくとも６つのヒスチジン残基に対する突然変異タンパク質の融合と、 ポリペプチド鎖中の酵素的または化学的切断部位の存在が含まれる。これらの６ ヒスチジン残基の存在は、金属イオンとの相互作用によるクロマトグラフィーカ ラムを通すクロマトグラフィーによって、ＣＮＴＦの突然変異タンパク質を宿主 生物によって生産される複雑なタンパク質混合物から一段階で分離することを可 能にする。このようにして分離された突然変異タンパク質を化学的または酵素的 に切断し、同じカラムから純粋な形態で回収する。この突然変異タンパク質は、 アミノ末端から始まる最初の１４アミノ酸が除去されているものであって、この 組換えタンパク質が精製の間に酸化型になることができず、それゆえにその単量 体型が維持されるようにＣＮＴＦの唯一のシスティンがセリンで置換されている ＣＮＴＦのポリペプチド型である。この突然変異タンパク質は精製後にその生物 学的活性を維持する。

本発明の応用可能性のさらなる範囲は下記の詳細な説明と図面から明らかになる であろう。しかし、詳細な説明と特定の例が本発明の好ましい態様を示している とはいうものの、それらは単に例示のために記載されるのであるということを理 解すべきである。なぜなら本発明の思想と範囲に包含される様々な改変や修飾は この詳細な説明から当業者に明らかになるであろうからである。

図面の簡単な説明 本発明の上記の目的とその他の目的、特性および利点は下記の詳細な説明を添付 の図面との関連で考慮することによってより良く理解されるであろう。ただしこ れらの図面はすべて単に例示のために記載するのであって、本発明を制限するも のではない。

図１はヒトＣＮＴＦをコード化する核酸配列を示す。

図２は図１の核酸配列によってコード化されるアミノ酸配列を示す。

図３はヒトＣＮ１”Ｆ分子のアミノ末端の最初の１４アミノ酸を欠（形態のヒト ＣＮＴＦをコード化する核酸配列を示す。

図４は、図３の核酸配列によってコード化される、ヒトＣＮＴＦ分子のアミノ末 端の最初の１４アミノ酸を欠く形態のヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列とその他のデ ータを示す。

図５はヒ１−ＣＮＴＦ分子のカルボキシ末端の最後の２６アミノ酸を欠く形態の ヒトＣＮＴＦをコード化する核酸配列を示す。

図６は、図５の核酸配列によってコード化される、ヒトＣＮＴＦ分子のカルボキ シ末端の最後の２６アミノ酸を欠く形態のヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列とその他 のデータを示す。

図７はヒトＣＮＴＦ分子のアミノ末端の最初の１４アミノ酸とその分子のカルボ キシ末端の最後の２６アミノ酸の両方を欠く形態のヒトＣＮＴＦをコード化する 核酸配列を示す。

図８は、図７の核酸配列によってコード化される、ヒトＣＮＴＦ分子のアミノ末 端の最初の１４アミノ酸とその分子のカルボキン末端の最後の２６アミノ酸の両 方を欠（形態のヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列とその他のデータを示す。

図９は本明細書に開示するヒトＣＮＴＦの新しい先端欠失ポリペプチド型の発現 に使用するベクターを得るために用いるクローニング法を示す。

図１０は実施例１〜３で報告するヒトＣＮＴＦの先端欠失型と、実施例５で記述 する配列が削除された先端欠失型を示す。

図１１はヒトＣＮＴＦの先端欠失ポリペプチド型の生物学的活性を野生型のヒト ＣＮＴＦタンパク質と比較して示すものである。このデータはＥＤ５０として計 算される比活性が様々な形態について少なくとも５Ｘ１０”１Ｍであることを示 している。

図１２は発現ベクターＣＮＴＦ（Ｈｉ　ｓ）ｓ△１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦの構造 を示す。

図１３は発現ベクター△１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦの構造を示す。

図１４は、緩衝液Ａで充填し、緩衝液ＢとＣで洗浄した実施例１３の細菌性出発 物質の溶出特性図を示す。組換えタンパク質は緩衝液り中に溶出する。

図１５は、ヒドロキシルアミンによる酵素的切断後の実施例１３のＣＮＴＦ（Ｈ ｉｓ）ａＡｓｎＧ］ｙＤ１４ｓｅｒ１７ｃＮＴＦの溶出特性図を示す。突然変異 タンパク質ＧＩｙＤ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦは緩衝液Ｃ中に溶出し、突然変異タ ンパク質ＣＮＴＦ（Ｈｉ　５）ｓＡｓｎは緩衝液り中に溶出する。

図１６は、エンテロキナーゼによる酵素的切断後の実施例１３の突然変異タンパ ク質ＨｉｓｇＤ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦの溶出特性図を示す。組換えタンパク質 は緩衝液Ｃ中に溶出する。

発明の詳細な説明 下記の本発明の詳細な説明は本発明を実施する当業者を助けるために記載するも のであるが、当業者はこの創意に富む発見の思想や範囲から逸脱することな（本 明細書で議論する態様に改変や修飾を施し得るのであるから、下記の詳細な説明 が本発明を不当に制約すると見なすべきではない。

本明細書で引用する各文献の内容はその全部が参考文献として本明細書の一部を 構成する。

本発明は概して組換えＤＮＡ技術の分野に属する。本発明は、天然のＣＮＴＦの 特異的に突然変異した形態（これをイソ型と呼ぶ）であって、それらのポリペプ チド配列中の１またはそれ以上の欠失の存在ゆえに対応する天然型とは異なるも のならびにＣＮＴＦの突然変異タンパク質に関する。これらのイソ型と突然変異 タンパク質は対応する天然のタンパク質の生物学的活性を保持することができる 。

一般的な組換えＤＮＡ技術 制限酵素によるＤＮＡの切断は製造者の指示に従って行った。一般に２０μｍの 反応溶液中で１μｇのプラスミドをＩＵの酵素を用いて切断した。温度とインキ ュベーション時間はどの酵素を使用したかに依存するが、通常は３７℃で１時間 とした。すべての場合について、インキュベーション後、４０ｍＭ）リスーＨＣ ］、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ中のＬＭＰアガロース（ＢＲＬ 、米国）を通す電気泳動によってプラスミドと遺伝子断片を精製し、次いでジエ ネクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＲ）キット（バイ第１０１インコーポレイテツ ド、米国カリフォルニア州う・ジヨウ）を用いてそのアガロースから溶出させた 。”連結は２０μｍの反応体積中でＤＮＡ０．５μｇにっきＩＵの濃度のＴＪ　 ＤＮＡリガーゼを用いて１３℃で１２時間行った。正しいプラスミド配列を確認 するための分析は、その連結産物を大腸菌ＨＢＩＯＩ中にトランスフェクション し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ（バリン・ベルタニ）培地中の寒 天プレート上で形質転換された細胞を選択することによって行った。回収した細 胞を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ中で生育させ、クィアゲン（Ｑ ｕｉａｇｅｎ。

ダイゲンＧｍｂＨ，西ドイツ・ドユッセルドルフ）からのキットを用いて、小さ い調製物とより大きい調製物の両方について、プラスミドを精製した。クィアゲ ンが推奨する方法によって細菌細胞からクローニングベクターを調製した。

すべてのオリゴヌクレオチドを、３８０Ｂ　ＤＮＡノンセサイザー（アプライド ・バイオシステムズ、米国）を用い、製造者の指示に従って、固相で合成した。

これらをＮＨ，中５５℃で１２時間処理した後、スピード−バキューム遠心機で 回収した。これらを２．５Ｍ酢酸アンモニウム中に再懸濁した後、３体積の冷た いエタノール（−２０℃）で沈殿させた。それを冷たい８０％エタノールで再洗 浄し、水に再懸濁した。オリゴヌクレオチドの濃度を分光光度測定法で評価した 。

増幅はパーキン・エルマー・シーラスＤＮＡサーマル・サイクラ−で行い、増幅 に使用する試薬は関連ＤＮＡ７＆Ｉアンブリフアイア−（パーキン・エルマー・ ンータス）のものとした。簡単に述べると、１００μｍの総混合物中に。、５Ｕ のＴＡＱポリメラーゼと共に２００μＭの各オリゴヌクレオチド、０．５μＭの 各ヌクレアーゼｃｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、０．１μｇのヒ トＤＮＡおよび反応緩衝液を含有する混合物を使用し、蒸発を防ぐためにその反 応混合物を液体パラフィンで覆った。

増幅反応は装置を次の条件下で２５サイクルに設定することによって行った２９ ５℃で１分間の変性、４５℃での配列、７２℃での伸長。

天然型のＣＮＴＦと比較して部分的なアミノ酸配列と変化した配列を有し、天然 のタンパク質とは異なる化学的特性と物理化学的特性を保持するタンパク質をコ ード化する遺伝子を得るために、野生型ＣＮＴＦ遺伝子配列に対して特別な修飾 を加えた。

ヒト毛様体ニューロン親和性因子の遺伝子とタンパク質本明細書に開示する核酸 配列およびポリペプチドまたはそれらの生物学的に機能的な等価物のそれぞれを 本発明に従って使用することができる。「生物学的に機能的な等価物」という用 語は、本明細書では、後述する特定の核酸配列およびポリペプチドと同じもしく は類似の生物学的活性を発揮する核酸配列またはポリペプチドを意味する。

例えば、生物学的機能的に等価な分子を与える置換、付加または欠失によって後 述の核酸配列を改変することができる。遺伝子コードの縮重ゆえに、実質上後述 のアミノ酸配列と同じものをコード化する他のＤＮＡ配列を本発明の実施に用い てもよい。これらには、その配列内の生理学的機能的に等価なアミノ酸残基をコ ード化する異なるコドンの置換（これは表立たない（サイレント）変化をもたら す）によって改変された後述のＣＮＴＦ遺伝子のすべてもしくは一部からなる核 酸配列が含まれるが、それらに限定されない。同様に、本発明のＣＮＴＦタンパ ク質またはその誘導体には、その配列内の残基が機能的に等価なアミノ酸残基で 置換（これは表立たない（サイレント）変化をもたらす）されている改変された 配列を含む実質的に後述のアミノ酸配列のすべてを含有するものが含まれるが、 それらに限定されない。例えば配列内の１またはそれ以上のアミノ酸残基を、機 能的な等価物として作用する類似の極性を持つ他のアミノ酸で置換して、表立た ない（サイレント）改変をもたらすことができる。配列内のあるアミノ酸の代替 物はそのアミノ酸が属する種類の他の構成要素から選択することができる。例え ば非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、 プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。極 性中性アミノ酸にはグリノン、セリン、スレオニン、システィン、チロノン、ア スパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には アルギニン、リノンおよびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ 酸にはアスパラギン酸とグルタミン酸が含まれる。

翻訳の途中または翻訳後に、例えばグリコリル化、タンパク質加水分解的切断、 抗体分子または他の細胞配位子などへの結合によって、弁別的に修飾されたＣＮ ＴＦ断片またはその誘導体も本発明の範囲に包含される。後述の実施例は大腸菌 における生物学的に活性な組換えＣＮＴＦイソ型または突然変異タンパク質の発 現を例示することによって、ＣＮＴＦの非グリコジル化型が生物学的に活性であ ることを示すものである。

さらに、組換えＣＮＴＦをコード化する本発明の核酸配列を加工して、ＣＮＴＦ のプロセシングまたは発現を変化させることができる。例えばＣＮＴＦをコード 化する配列の上流にシグナル配列を挿入してＣＮＴＦの分泌を可能にし、それに よって収集や生物学的利用能を容易にすることができるが、この例示は限定のた めではない。

さらに、ある与えられたＣＮＴＦイソ型または突然変異タンパク質をインビトロ またはインビボで突然変異させることによって、翻訳、開始および／または終結 配列を作成および／または破壊するか、あるいはコード領域内に変異を作成する か、かつ／または、新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成させるが、もしく は既に存在するそれを破壊して、さらなるインビトロ修飾を容易にすることがで きる。当該技術分野で知られている突然変異導入の技術は、インビトロ部位特異 的突然変異導入法（Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎら（１９７８）Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｗ、　２５３　：６５５１）、ＴＡＢ”ｌノンカー（ファルマシア）の使用な どを含めて（ただしこれらに限定されない）、いずれも使用することができる。

ヒトＣＮＴＦの発現ベクタ一 本発明での使用が予期されるベクターには、その中に後述のＤＮＡ配列を必要な 操作用の要素と共に挿入することができるものが含まれる。次いでそのようなベ クターを宿生細胞中に移し、その中で複製させることができる。好ましいベクタ ーはその制限部位が充分に報告されていて、上記ＤＮＡ配列の転写にとって好ま しいか、もしくは必要な操作用の要素を含有するものである。

本発明のいくつかの態様では本明細書に記載のＤＮＡ配列の１またはそれ以上を 含有するベクターを使用する。これらのベクターのすべてが次の特徴のいくつか あるいはすべてを持つことが好ましい：（１）最小数の宿主生物配列を保持する こと；（２）所望の宿主中で安定に維持され、増殖されること；（３）所望の宿 主中で高いコピー数で存在する能力を有すること；（４）目的の遺伝子の転写を 促進するように配置された調節可能なプロモーターを保持すること；（５）上記 ＤＮＡ配列を挿入する部分とは離れているプラスミドの部分に存在する選択可能 な特色をコードする少なくとも１つの標識ＤＮＡ配列を有すること：（６）転写 を終結させ得るＤＮＡ配列を含有すること。

本発明のＤＮＡ配列を発現させることができるクローニングベクターは様々な操 作用の要素を含有する。これらの「操作用の要素」には少なくとも１つのプロモ ーター、少なくとも１つのンヤイン・ダルガノ配列とイニシェークーコドンおよ び少なくとも１つの終結コドンが含まれ得る。これらの「操作用の要素」には次 に挙げるものの１またはそれ以上が含まれてもよい：少なくとも１つのオペレー ター、細胞内空間から輸出されるべきタンパク質のための少なくとも１つのリー ダー配列、少なくとも１つの調節因子タンパク質の遺伝子、クローン化されたＣ ＮＴＦ　ＤＮＡの適切な転写とそれに続く翻訳にとって必要な、あるいは好まし いその他のＤＮＡ配列。

これらの操作用の要素のいくつかは本発明の好ましいベクターのそれぞれの中に 存在し得る。必要な追加の操作用の要素を同定し、それを当業者に公知の方法（ ＳａＩＩｌｂｒｏｏｋら（前記）に記述されている方法など）を用いてこれらの ベクターに加え得るということは予期される。

調節因子 調節因子はある環境条件の存在下でＤＮＡ配列の発現を防ぐように作用し、他の 環境条件の存在下では、ＣＮＴＦ　ＤＮＡ配列によってコードされているタンパ ク質の転写とそれに続（発現を可能にするであろう。具体的には、例えばイソプ ロピルチオ−ベーターＤ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）の不在下ではＤＮＡ配列の 発現が起こらないか、もしくは発現の程度が太き（減じられるように、調節因子 セグメントをベクター中に挿入することが好ましい。この状況では、ＣＮＴＦイ ソ型または突然変異タンパク質の発現の開始に先立って、上記ＤＮＡ配列を含有 する形質転換された微生物を所望の密度まで生育させることができる。所望の細 胞密度に達した後に、上記ＤＮＡ配列の発現を引き起こすことができる物質を微 生物環境に添加することによって所望のタンパク質の発現を誘導することができ る。

プロモーター 発現ベクターは、それ自身のタンパク質を発現させるために宿主生物が使用し得 るプロモーターを含有しなければならない。ラクトースプロモーター系が一般に 使用されるが、他の微生物プロモーターも単離され、特徴づけられているので、 当業者は組換えＣＮＴＦイソ型および突然変異タンパク質の発現にそれらを使用 することができる。

転写終結区 本発明で予期される転写終結区はベクターを安定化させるように機能する。具体 的には、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９７９）Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、 　１３：３１９−３５３に記述されている配列は本発明での使用が予期されるも のである。

非翻訳配列 遺伝子転写物への３°または５°非非翻訳列の組込みを可能にするようにコード 領域の３゛または５°末端を構築することも望ましい。これらの非翻訳配列には 、Ｓｃｈｍｅｉｓｓｎｅｒら（１９８４）Ｊ、　Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、　１７６： ３９−５３によって開示されたような、ｍＲＮＡを安定化するものが含まれる。

リポソーム結合部位 外来タンパク質の微生物発現にはリポソーム結合部位を含む操作用の要素が必要 である。リポソーム結合部位とは、Ｇｏｌｄら、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ、　３５：５５７−５８０およびＭａｒｑｕｉｓら（１９８６）Ｇ ｅｎｅ　４２：１７５−１８３に説明されているように、タンパク質合成の開始 時にリポソームが認識し、結合する配列である。好ましいリポソーム結合部位は ＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＡＡ（ＡＴＧ）である。

リーダー配列と翻訳共役因子 さらに、ｆａｔｓｏｎ、　Ｍ、　Ｅ、がＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 　１２＋５１４５−５１６３で説明しているように、タンパク質を宿主細胞質か ら排出すべき場合には、適当な分泌リーダー（シグナル）配列をコードするＤＮ Ａが上記ＤＮＡ配列の５′末端に存在することが好ましい。リーダー配列のＤＮ Ａは、リーダー配列がＣＮＴＦのすぐ隣にあって、かつ、リーダー配列がＣＮＴ Ｆに共有結合している融合タンパク質の生産を可能にする位置になければならな い。すなわち上記２つのＤＮＡコード配列の間に転写または翻訳シグナルが存在 してはならない。

いくつかの宿主微生物種では、いくつかの大腸菌の場合のように、適当なリーダ ー配列の存在が完成したタンパク質の周辺腔への輸送を可能にするであろう。

ある種の大腸菌、サツカロミセスおよびバチスルとシュードモナスの株の場合に は、適切なリーダー配列によって、タンパク質が細胞膜を通過して細胞外培地中 に輸送されるようになる。この状況では、細胞外タンパク質からそのタンパク質 を精製することができる。

ＣＮＴＦイソ型をコードするＤＮＡ配列の直前に追加のＤＮＡ配列を位置させる ことができる。この追加のＤＮＡ配列は翻訳共役因子として機能することができ る。すなわちこれは、それが隣接する阻害因子ＲＮＡのりボゾーム結合部位のす ぐ隣にリポソームを配置するように機能するＲＮＡをコード化するＤＮＡ配列で ある。翻訳共役因子はＴ　Ａ　Ａ　ＣＧ　Ａ　Ｇ　Ｇ　ＣＧ　ＣＡ　Ａ　Ａ　Ａ 　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　ＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＣＴ ＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡＴＧというＤＮＡ配列と翻訳共役因子に関連す る分野の当業者が現在知っている方法を用いて誘導することができる。

翻訳終結区 本発明で予期される翻訳終結区はｍＲＮＡの翻訳を停止させるように機能する。

これらは、Ｋｏｈｌｉ、　Ｊ、　、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１８ ２：４３０−４３９に記述されているような天然のものであってもよいし、Ｐｅ ｔｔｅｒｓｓｏｎ、　Ｒ，Ｆ、　（１９８３）Ｇｅｎｅ　２４　：１５−１７に 記述されているような合成品であってもよい。

さらに、薬剤耐性標識や宿主微生物による選択可能な特色の発現を引き起こす他 の標識など、選択可能な標識をクローニングベクターが含有することが好ましい 。本発明の一態様では、アンピシリン耐性のための遺伝子がベクターに含まれる 。他のプラスミドには、テトラサイクリン耐性のための遺伝子やクロラムフェニ コール耐性のための遺伝子を含ませることができる。

このような薬剤耐性またはその他の選択可能な標識は形質転換体の選択を容易に する。さらに、このような選択可能な標識がクローニングベクター中に存在する ことは、混入した微生物が培養培地中で増殖することを抑制する際に役に立ち得 る。形質転換された宿主微生物の純粋培養は、誘導された表現型を生存に必要と する条件下でその微生物を培養することによって得られる。

本明細書で議論する操作用の要素は、先行文献と本明細書に含まれる教示に照ら して、当業者によって簡単に選択される。これらの操作用の要素の一般的な例は Ｂ、　Ｌｅｖｉｎ（１９８３）Ｇｅｎｅｓ（ウィリー・アンド・サンズ、ニュー ヨーク）に説明されている。好適な操作用の要素の様々な例は上記のベクター中 に認めることができるし、上述のベクターの基本的特徴を議論している刊行物を 概観することによって見つけることができる。

必要かつ所望の成分部分のすべての合成と単離を終えたら、当業者が一般に知っ ている方法によってベクターを組み立てることができる。このようなベクターの 組み立ては当該技術分野の通常の技術の範囲内にあり、それゆえに過度の実験を 伴わずに行うことができる。

本発明のＤＮＡ配列とそれらに付随する操作用の要素の複数コピーを各ベクター に挿入することができる。このような場合、宿主生物が生産する所望のＣＮＴＦ イソ型のベクターあたりの量は増大するであろう。ベクター中に挿入し得るＤＮ Ａ配列の多重コピーの数は、得られるベクターの、その大きさゆえの、適当な宿 主細胞中に移され、その宿主細胞中で複製し、転写されるという能力によっての み制限される。

他の宿主微生物 大腸菌以外の微生物での使用に適したベクターも本発明での使用が予期される。

そのような微生物には例えばバチルス、ンユードモナスおよび酵母が含まれる。

また、本明細書に開示するヒトＣＮＴＦの先端欠失型および突然変異タンパク質 量の哺乳類細胞（例えばチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞を含む）中での発現 も本発明の範囲に包含される。

バチルス中での発現について、好ましいベクターはアルファ・アミラーゼ・プロ モーター、ズブチリシン・プロモーター、Ｐ−４３プロモーターまたは５ｐａＣ −１２６プロモーターなどの調節されたプロモーターを含むべきである。有用な 転写終結区にはｒｒｎとｒｒｎＢＴ、Ｔが含まれる。転写開始部位とリーダーペ プチドは、Ｂ、　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの天然のプロテアーゼ、 Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのアルファーアミラーゼおよびＢ、　 ５ｕｂｔｉｌｉｓのズブチリシンからのものの中がら選択することができる。有 用な抗生物質標識はＫａｎ’とＣａｍ’である。リボゾーム結合部位はＢ、　ａ ｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｊｅｎｓの天然のプロテアーゼ遺伝子およびＢ、　ａ ｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのアルファーアミラーゼ遺伝子から得ること ができる。バチルス属の宿主中で好ましい発現系にはプラスミドｐＵＢ１１０を クローニング伝達体として使用することが含まれる。

シュードモナス中での発現については、プロモーターをＴｒｐ、ＬａｃおよびＴ ａｃから選択することができる。有用な転写開始部位とリーダーペプチドはボス ホリバーゼＣ遺伝子とエキソトキシンＡ遺伝子から得ることができる。有用な抗 生物質標識はスルホンアミドとストレプトマイシンに対するものである。有用な りボゾーム結合部位は大腸菌のＴｒｐプロモーターから得ることができる。とり わけ好ましいベクターはプラスミドＲ８ＦＩＯＩＯとその誘導体を使用するであ ろう。

酵母の場合、有用なプロモーターにはＧａｌ　ｌおよび１０．Ａｄｈｌおよび１ １、Ｐｈｏ　５が含まれる。転写終結区はＣｙｃＳＵｎａ、アルファ因子および Ｓａｃ　２の中から選択することができる。転写開始部位とリーダーペプチドは インベルターゼ遺伝子、酸ホスファターゼ遺伝子およびアルファ因子遺伝子がら 得ることができる。有用な選択標識はＵｒａ　３、Ｌｅｕ　２、Ｈｊｓ３および Ｔａｐｌである。

最後に哺乳類細胞中での発現の場合には、本発明の先端欠失型または突然変異タ ンパク質量ＣＮＴＦをコード化するＤＮＡがリボゾームを結合するのに優れた配 列を有すべきである。そのような配列についてはＫｏｚａｋがＮｕｃｌｅｉｃ　 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（１９８７）１５：８１２５−８１３２に記述し ている。ＧｕａｒｅｎｔｅがＣｅｌｌ（１９８ｇ）５２：３０３−３０５に、ま た、ＫａｄｏｎａｇａらがＣｅ１ｌ（１９８７）５１：１０７９−１０９０に記 述しているように、転写プロモーターと転写エンハンサ−を含有する発現ベクタ ー中にＣＮＴＦをコード化する断片を挿入することができる。所望もしくは必要 であれば、ファルマシア・プラスミドｐＭＳＧ中のプロモーターのように調節可 能なプロモーターを用いることができる。Ａｕ５ｕｂｅｌら（１，９８７）が” Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ−（ウB リー）に記述しているように、ベクターから転写されたｍＲＮＡが適切に加工さ れるように、ベクターは完全なポリアデニル化シグナルを保持すべきである。最 後に、大腸菌中での複製と選択を可能にするべく、ベクターがｐＢＲ３２２のよ うなプラスミドから得られる複製起点と少な（とも１つの抗生物質耐性標識を含 有してもよい。

本明細書に記載のＣＮＴＦを生産する安定な細胞系を選択するためには、Ａｕ５ ｕｂｅｌら（前記）が記述の如く、発現ベクターが薬剤耐性標識などの選択可能 な標識の遺伝子か、あるいは欠損細胞系のための補足的遺伝子（例えばｄｈｆｒ −細胞系を形質転換するためのジヒドロ葉酸リダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子な ど）を保持することができる。別法として、選択可能な標識を保持する別個のプ ラスミドを発現ベクターと共に同時形質転換することができる。

哺乳類細胞のためのベクターは、リン酸カルシウム：　ＤＮＡ同時沈殿、エレク トロポレーションまたはプロトプラスト融合を含むいくつかの技術によって、哺 乳類細胞に導入することができる。＾ｕｓｕｂｅｌ（前記）によって記述されて いるリン酸カルシウムとの同時沈殿は好ましい方法である。

好ましいベクターには例えばＰＳＶＴ７真核発現プラスミドが含まれる。

実施例１ 最初の１４アミノ酸を欠く形態のＣＮＴＦを得るために、２つのオリゴヌクレオ チドを合成した。第１の（Ａ）は、５’ＡＡＣＡＴＡＴＧＧＡＣＣＴＧＴＡＧＣ ＣＧＣＴＣＴＡＴＣ３’という配列を有し、ヒトＣＮＴＦ配列の最初のオリゴヌ クレオチド後の４２番目のオリゴヌクレオチドからその位置が開始する。以降の クローニングを容易にするために１つのＮｄｅｌ制限部位を加え、この遺伝子の 転写を開始させるためにメチオニンコドンを加えた。

５’ＴＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＧＴＴＡＧＣＡＡＴＡＴ ３’という配列を持ち、ＣＮＴＦをコード化する配列の末端に逆向きに位置する オリゴヌクレオチド（Ｂ）と共に上記のオリゴヌクレオチドを用いることによっ て、プラスミドｐＴ７．７ｈＣＮＴＦ（Ｎｅｇｒｏら（１９９１）Ｊ、　Ｎｅｕ ｒｏｓｃｉ、　Ｒｅｓ、　２９：２７０）を使って、図３に示す配列を増幅する ことができる。

図４に示すアミノ酸配列、分子量データ、残基数およびアミノ酸組成の転写を得 るために、この配列をＮｄｅｌと５ａｌｌで切断し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用 いてプラスミドｐＴ７．７（図９）中にクローン化した。

このポリペプチドは天然のポリペプチドのアミノ末端から開始する最初の１４ア ミノ酸を欠いている。メチオニンをこのアミノ酸配列の開始部分に導入した。

この新しいポリペプチド型の等電点（ｐｌ）は、天然のタンパク質の６．３８と 比べて、６．０５である。

実施例２ カルボキン末端の２６アミノ酸を欠く形態のＣＮＴＦを得るために、２つのオリ ゴヌクレオチドを合成した。第１の（Ｃ）は５’ＴＴＣＡＴＡＧＧＣＴＴＴＴＡ ＣＴＧＡＡＧＣＡＴＴＣＡ３’という配列を有し、ＣＮＴＦ遺伝子をコード化す る配列の最初からその位置が始まる。第２のオリゴヌクレオチド（Ｄ）は５°Ｔ ＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＡＴＧＧＡＴＧＧＡＣＣＴＴＡＣＴＧＴＣＣＡＣ３’とい う配列を有し、ＣＮＴＦ遺伝子の末端で逆向きに位置する。さらに、最後の１７ アミノ酸が除去されるように、上記遺伝子の開始部分に対して５２３の位置にあ る遺伝子の末端に停止コドンを加えた。以降のクローニングを容易にするために ５ａｌｌ制限部位をも加えた。オリゴヌクレオチド（Ｃ）および（Ｄ）をプラス ミドｐＴ７．７ｈＣＮＴＦと共に用いることによって、図５に示すヌクレオチド 配列を増幅することができる。

図６に示すアミノ酸配列の転写を得るために、この配列をＮｄｅｌと５ａｌｌで 切断し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いてプラスミドｐＴ７．７中にクローン化し た。

この配列はＣＮＴＦの最後の２６アミノ酸を欠（ので、このポリペプチドは１７ ４アミノ酸からなる。得られた分子量は２０００７ＫＤａである。この新しい型 のｐｌは５．６７である。

実施例３ アミノ末端の最初の１４アミノ酸を欠き、かつ、カルボキシ末端の最後の２６ア ミノ酸を欠くヒトＣＮＴＦのポリペプチド型を得るために、２つのオリゴヌクレ オチド（すなわち実施例１での（Ａ）と実施例２での（Ｄ））およびプラスミド ｐＴ７．７ｈＣＮＴＦを用いて図７に示す配列を増幅した。

図８に示すアミノ酸配列の転写が得られるように、この配列をＮｄｅｌと５ａＩ Ｉで切断し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いてプラスミドｐ７７．７中にクローン 化した。

この配列はＣＮＴＦの最初の１４アミノ酸と最後の２６アミノ酸を欠く。したが ってこのポリペプチドは最初に加えたメチオニンを考慮に入れると１６１アミノ 酸を含有する。

得られたポリペプチドは１８４７６ＫＤａの分子量と５．１４の等電点を有する 。

実施例４ 図９は、本明細書に開示するヒ）ＣＮＴＦの新しいポリペプチド型の発現に使用 するベクターを得るために用いたクローニング法を示す。

実施例５ プラスミドｐＴ７．７ｈＣＮＴＦから、所望の欠失に応じて適切に選択される２ つのオリゴヌクレオチドを用いて全配列を増幅することができる。

以下に詳述するのは、野生型のヒトＣＮＴＦポリペプチド配列に対してセグメン ト１３７〜１５０が欠失しているポリペプチド配列を得るための方法である。

次のオリゴヌクレオチドは共に５ｐｈＩ制限部位を含有し、この部位は上記ブラ スミド中には存在しない。

ＡＧＣＡＴＧＣＧＧＡＴＣＴＴＧＴＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＧＣＡＴＧＣＴＣ ＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＴこれら２つのオリゴヌクレオチドを既に記述 したＰＣＲ技術で使用する。精製したＤＮＡを５ｐｈＩで切断した後、Ｔ４　Ｄ ＮＡリガーゼで連結する。

この方法によって、リガーゼによって結合した直線状のセグメントを得ることが できる。２つの選択されたオリゴヌクレオチドの間のヌクレオチド距離が突然変 異体中の欠失の程度を決定する。

図１０は実施例１〜３で報告したヒトＣＮＴＦの先端欠失型のすべてと、実施例 ５に記述の如く生産される配列が欠如した型とを表している。

突然変異したプラスミドｐ　Ｔ　７７　ＲＣＮ　Ｔ　Ｆ　（Ｎｅｇｒｏら（１９ ９１）Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｒｅｓ、　２９：２５１）を含有する大腸菌 ＢＬ２１（Ｄ３）のコロニーを２００　ｔｔ　ｇ／ｍ　＋のアンピノリンが入っ ているＬＢ培地５ｍｌに接種する。既に記述したように、各細胞系はその発現ベ クター中に挿入された遺伝子配列によってコード化されているポリペプチド配列 を発現させる。

すべての構築を大腸菌ＨＢＩＯＩ中で行った。タンパク質発現を得るために、Ｃ ＮＴＦの先端欠失型または削除型を含有するプラスミドを、ＢＬ２１（Ｄ３）を 含む異なる大腸菌糸中に導入した。

細胞を３０℃で終夜生育させた。一部を２００μｇ／ｍｌのアンピンリンが入っ ているＭ９培地で１／１００に希釈した。５９０μｍにおける吸光性が０．８０ Ｄになるまで細胞を生育させた。この時点でイソプロピル・チオガラクトシド（ ＩＰＴＧ）を４ｍＭの最終濃度で加えた。細胞をさらに３時間生育させ、遠心分 離し、トリス−ＨＣＩ（、ｐＨ８，０）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡに再懸濁すると、 以降の抽出の準備ができた。

実施例７ 遠心分離後に得られたベレットを５０ｍＭトリス（ｐＨ７，４）と５０ｍＭＮａ Ｃ１（Ｃ）で少な（とも３回洗浄した。各洗浄後に、６００ｒｐｍで１０分間遠 心分離することによってベレットを回収した。

最終ベレットを緩衝液に再懸濁し、８００ｐｓ　ｉで少なくとも２回、モンテイ ン・ガラリン（Ｍｏｎｔａｉｎ　Ｇａｕｌｉｎ）に通した。

得られた物質を再び６００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、８Ｍ尿素、５０ｍＭト リス（ｐＨ７，４）、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、２ｍＭ　ＥＤＴＡに室温で再懸濁した 。

６００ｒｐｍで１０分間の遠心分離後、可溶性物質を１Ｍ尿素に対して透析した 。

６００ｒｐｍで１５分間のさらなる遠心分離後に得られた上清を、突然変異した タンパク質のｐｌに基づ＜ｐＨで適切に平衡化した七ノＱ（Ｍｏｎｏ　Ｑ）カラ ムなどのイオン交換カラムに充填した。

これらの条件下では、組換えタンパク質が１０ｍＭ〜１．０ＭのＮａＣｌ１１度 で溶出した。得られた物質を５０ｍＭ酢酸アンモニウムに対して透析し、逆相カ ラムに充填した。

使用したカラムはブイダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ１８７μｍ（０，４６Ｘ２６ｃｍ ）であり、使用した溶媒は（Ａ）０．０５％ＴＦＡ（水中）と（Ｂ）０．０５％ ＴＦＡ（アセトニトリル中）である。

このカラムをＡと１０％Ｂで平衡化し、タンパク質を充填した。

このようにして勾配を作成したが、ここで緩衝液（Ｂ）の百分率は６０分間で６ ０％に達し、その後、カラムを１００％（Ｂ）で１０分間洗浄した。

組換えタンパク質はこのカラムから単一のピークとして溶出した。

実施例１．２および３に記述したようにして得たポリペプチドの活性を、８１０ 日のヒヨコの胚の背面根ニューロン細胞を培養中で維持するというそれらの能力 によって評価した。これらの細胞をＥＩＯ日のヒヨコの胚から取り出し、トリプ ノンで解離し、その後の予備培養段階によって濃縮した。

次にそれらのニューロンを９６穴組織培養皿に接種し、ポリオルニチン（１５ｍ Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，４）中１００　ｕ　ｇ／ｍ　］　）とラミニン（１０ μｇ／ｍｌ）で処理した。ニューロンを１ウエルにつき４０００ニユーロンの濃 度で接種し、培養培地は１００μｇ／ｍＩのベニンジン、２ｍＭ　Ｌ−グルタミ ンおよび１０％不活化ウソつ児血清を含むダルヘソコ最小必須培地（ＤＭＥＭ） とした。培養２４時間後ニ生き残った＝　ニー　ｏ　ンを数えた（Ｓｋａｐｅｒ ら（１９８５）Ｄｅｖ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　２４：３９−４６）。

図１１は、野生型のヒトＣＮＴＦタンパク質と比較した先端欠失ポリペプチド型 の生物学的活性の例を示している。この実験の結果は、ＥＤ５０として計算した 比活性が様々な形態について少なくとも５×１０−目Ｎ４であったことを示して いる。

ヒトＣＮＴＦ配列（Ｎｅｇｒｏら（１９９１）Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｒｅ ｓ、　２９　：２５１）に基づいて、次のオリゴヌクレオチドを構築した Ｉ　１ｅＴｒｐＨｉ　ｓＨｉ　ｓＨｉ　ｓｔｌ　ｉ　ｓｋｉ　ｓＨｉ　５Ａｓｎ Ｇ　１ｙＡｓｐＬｅｕＳｅｒＳｅｒＡｒｇＳｅｒｌ　ｌｅこのヌクレオチドはそ の５′領域にＢｇｌ１１部位を含有する。６つのＨｉｓコドンが存在し、その後 に第１５コドンから始まるＣＮＴＦ配列の部分が続いている。さらに、／スティ ンをコード化する第１７コドン（ＴＧＴ）をセリンをコード化する（Ｔ　ＣＴ） で置換した。ノステインの存在下では２つのＣＮＴＦ分子が合体して二量体を形 成し、それが生物学的活性を低下させるので、この修飾が必要であった。このオ リゴヌクレオチドを、５°ＡＧＧＴＣＧＡＣＴＡＣＡＴＴＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴ ＡＧ３°という配列のオリゴヌクレオチド５ａｌＩと共にＰＣＲて使用した。増 幅産物をＢｇｌＩＩと５ａｌｌで切断し、プラスミドｐＴ７７　ｈ　ＣＮＴ　Ｆ 　（Ｎｅｇｒｏら（１９９１）Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｒｅｓ、　２９＋２ ７０）のＢａｍＨ１部位とＳａｌ工部工部間にクローン化した。ＢａｍＨＩとＢ ｇｌｌＩは適合する制限部位である。

図１２はこの発現ベクターを表している。これはアンピンリンに対する耐性（Ａ ＭＰ’）、Ｔ７プロモーター、制限部位Ｎ（Ｎｄｅり、Ｎｈ（Ｎｈｅｌ）、Ｂ（ Ｂ　ａｍＨＩ）、Ｂｇ（ＢｇＩ　Ｉ　Ｉ）および５（ＳａｌＩ）を含んでいる。

ヒスチジン（Ｍ）とヒドロキシルアミンに関する切断部位（Ｈ）の位置をも示し ている。

化学的切断部位Ｈを含有する融合タンパク質を次に示すこの融合タンパク質は、 ６つのヒスチジンとアミノ酸アスパラギンおよびグリノンによってもう１つのＣ ＮＴＦ分子に融合したＣＮＴＦ分子である。これら２つのアミノ酸はヒドロキシ ルアミンに関する切断部位を表す。

ヒトＣＮ　Ｔ　Ｆ　（Ｎｅｇｒｏら（１９９１）Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｒ ｅｓ、　２９：２５］　）の配列に基づいて、次のオリゴヌクレオチドを構築し た ５°ＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＴＣＴＡＧＣＣＧＣＴＣＴＡＴ３’ＡｓｐＬｅｕＳｅ ｒＳｅｒＡｒｇＳｅｒＩ　Ｉｅこのオリゴヌクレオチドには、その５′領域にＢ ｇｌｌｌ制限部位が存在する。

さらにアミノ酸ンステインをコード化する第１７コドン（ＴＧＴ）がアミノ酸セ リンをコード化する（Ｔ　ＣＴ）で置換されている。このオリゴヌクレオチドを 上述のオリゴヌクレオチド５ａｉｌと共にＰＣＨに用いた。増幅産物をＢｇｌｌ Ｉと５ａｌｌで切断し、発現プラスミドｐＲ３ＥＴＢ（インビトロアン）の制限 部位ＢａｍＨＩとＸｈｏＩ（これらはそれぞれＢｇｌｌＩおよび５ａｌｌと適合 する）の間にクローン化した。

図１３はその発現ベクターを示す。これはアンピシリンに対する耐性（ＡＭＰ゛ ）、Ｔ７プロモーター、制限部位Ｎ（Ｎｄｅｌ）、Ｂ（ＢａｍＨＩ）、Ｂｇ（Ｂ ｇｌＩＩ）、５（Ｓａｌｌ）およびＸ（Ｘｈｏｌ）を明示している。さらにヒス チジン（Ｍ）とエンテロキナーゼに関する切断部位の位置も示されている。

この融合タンパク質の最初のアミノ酸は次の通りである；Ｍｅｔ−＾ｒｇ−Ｇ　 １　ｙ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈ１ｓ−１１ｉ　ｓ−Ｈｉ　５−Ｈｉ　５−Ｈｉ　５ −Ｇｌ　ｙ−Ｍｅｔ−＾１ａ−３ｅｒ|Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ− Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−ＧＩＹ−＾ｒｇ−＾５ｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−＾ｓｐ− ＾ｓｐ−＾ｓｐ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐｌ　５−Ｌｅｕｌ@６−３ｅｒｌ　７ − 理解できるであろうが、転写されたタンパク質はそのアミノ末端領域に６つのヒ スチジンを含有し、その後にＬｙｓとＡｓｐ、５の間のエンテロキナーゼに関す る切断部位が続く融合タンパク質であり、これがＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓ ｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ＋ｓという配列をリジンの後ろで切断することを容易にする 。

細菌の生育は実施例６に記述の通りであった。

遠心分離後に得たベレットを緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７，４）、５０ｍＭ ＮａＣ］）で少なくとも３回洗浄し、各洗浄ごとに遠心分離によってベレットを 回収した。最終ベレットを上記の緩衝液に再懸濁し、８００ｐｓ　ｉで少なくと も２回、モンテイン・ガラリンに通した。得られた物質を再び６００ｒｐｍで１ ０分間遠心分離し、緩衝液Ａ（６Ｍグアニジン、Ｏ，ＩＭ　ＮａＨ２ＰＯ４，１ ００ｍＭトリス、ｐＨ８）に再懸濁した。それを再び前と同様に遠心分離し、そ の上清をＩＭＡＣ−ＮＴＡクロマトグラフィーカラム（クィアアン）に充填する ことによって、金属イオンと相互作用させた。８ｍｌのＮＴＡ樹脂にニッケルを 充填し、７０ｍ１の緩衝液Ａで洗浄した。螺動ポンプを用いて上記の上清を緩衝 液Ａ中に３０〜５０ｍ１／時間の速度で充填した。次にそのカラムを緩衝液Ｂ（ ８Ｍ尿素。

０．１Ｍ　Ｎａ８２ＰＯ４，１０ｍＭトリス、ｐＨ８）で洗浄した後、４０ｍ１ の緩衝液Ｃ（８Ｍ尿素、０．ＩＭ　ＮａＨ２ＰＯ４，１０ｍＭトリス、ｐＨ６， ３）で再び洗浄した。組換え突然変異タンパク質を緩衝液Ｄ（８Ｍ尿素、Ｏ，Ｉ Ｍ　ＮａＨｚＰｏ　４、　１０　ｍＭ　）リス、ｐＨ４，５）で溶出させた。

突然変異タンパク質ＣＮＴＦ（Ｈｉｓ）６ＡｓｎＧｌｙＤ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴ Ｆを水に対して透析し、沈殿物を６Ｍグアニジンおよび２Ｍヒドロキシルアミン に再懸濁した。そのポリペプチドを３７℃で１２時間インキュベーションすると 、この期間中にヒドロキシルアミンがポリペプチドを２つの部分（それぞれＣＮ ＴＦ（Ｈｉｓ）６ＡｓｎとＧＩｙＤ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦ）に切断する。

他方、突然変異タンパク質Ｈｉｓ６Ｄ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦを５０ｍＭＣａ（ １２，５０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８）に対して透析し、１：５００の酵素基 質比を用いて３７℃で１２時間、エンテロキナーゼ（ベーリンガー）で消化した 。

この期間中にポリペプチドは２つの部分（Ｈｉ　ｓ　６とＤ１４Ｓｅｒ１７ＣＮ ＴＦ）に分かれる。このようにして消化した突然変異タンパク質を緩衝液入に対 して透析し、上述のカラムに充填した。

ポリペプチドＣＮＴＦ（Ｈｉｓ）ａＡｓｎＧＩｙＤ１４ｓｅｒ１７ｃＮＴＦの最 終産物は次の突然変異タンパク質によって表される：Ｇ］ｙＤ１４Ｓｅｒ１７Ｃ ＮＴＦ（、：、れは緩衝液Ｃ中に溶出する）とＣＮＴＦ（Ｈ４５）ａＡｓｎ（こ れは緩衝液り中に溶出する）。

ポリペプチドＨｉｓ６Ｄ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦの最終産物は、緩衝液Ｃ中に溶 出する突然変異タンパク質Ｄ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦである。

この方法によって得られる２つの組換え突然変異タンパク質を次の流れ図に示す ように精製する 突然変異タンパク質：　ＣＮＴＦ（＋１ｉｓ）６ＡｓｎＧ１ｙＤ１４Ｓｅｒ１７ ＣＮＴＦ細菌ペレツト 緩衝液Ａ中での可溶化 緩衝液Ａ中のＩＭＡＣ−ＮＴＡカラムの充填緩衝液Ｂによる洗浄（ヒスチジン非 含有タンパク質）緩衝液Ｃ１こよる洗浄（わずかなヒスチジンを伴う細菌タンパ ク質）緩衝液りによる洗浄（突然変異タンパク質ＣＮＴＦ（Ｈｉｓ）ａ＾５ｎＧ １ｙＤ１４ｓｅｒ１７ｃＮＴＦ）透析 遠心分離 ベレット ６Ｍグアニンノン２Ｍヒドロキシルアミン、３７℃、１２時間による可溶化緩衝 液Ａによる透析 緩衝液Ａ中のＩＭＡＣ−ＮＴＡカラムの充填緩衝液Ｂによる洗浄 緩衝液Ｃによる洗浄（Ｇ１ｙＤ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦ）緩衝液りによる洗浄（ ＣＮＴＦ（Ｈｉｓ）ａＡｓｎ）突然変異タンパク質　（Ｈｉｓ）ｓＤＩ４ｓｅｒ １７ｃＮＴＦ細菌ベレット 緩衝液Ａ中での可溶化 ＩＭＡＣ−ＮＴＡカラムの充填 緩衝液Ｂによる洗浄（ヒスチジン非含有タンパク質）緩衝液Ｃによる洗浄（わず がなヒスチジンを伴う細菌タンパク質）緩衝液りによる洗浄（（Ｈｉｓ）ｓＤ１ ４ｓｅｒ１７ｃＮＴＦ）透析 エンテロキナーゼによる消化、１：５００．３″１℃で１２時間緩衝液、へによ る透析 ＩＭＡＣ−ＮＴＡカラムの充填 緩衝液Ｂによる洗浄 緩衝液Ｃによる洗浄（Ｄ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦ）緩衝液りによる洗浄（（Ｈｉ ｓ）６） 図］、４は、緩衝液Ａ中に充填し、緩衝液ＢとＣて洗浄した細菌性出発物質の溶 出特性図を示す。組換えタンパク質は緩衝液り中に溶出する。

図１５は、ヒドロキシルアミンによる酵素的切断後のＣＮＴＦ（Ｈｉ　５）６Ａ ｓｎＧＩｙＤ１４ｓｅｒ１７ｃＮＴＦの溶出特性図を示す。突然変異タンパク質 ＧＩｙＤ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦは緩衝液Ｃ中に溶出し、突然変異タンパク質Ｃ ＮＴＦ（Ｈｉｓ）、Ａｓｎは緩衝液り中に溶出する。

図１６は、エンテロキナーゼによる酵素的切断後の突然変異タンパク質Ｈｉｓ６ Ｄ１４ｓｅｒ１７ｃＮＴＦの溶出特性図を示す。この組換えタンパク質は緩衝液 Ｃ中に溶出する。

突然変異タンパク質を非変性条件下で精製することも可能である。この場合、Ｉ ＭＡＣカラム（ファルマンア）を使用することができる。様々な段階には、３０ ℃における細菌の生育、リン酸緩衝液（ｐＨ７，４）中での突然変異タンパク質 の可溶化および非変性条件下のカラムへの充填が含まれる。タンパク質は変性条 件について示したものと同じｐＨ値で溶出する。

アプライド・パイオンステムズ自動タンパク質配列決定装置モデル４７７Ａを用 いて、組換え突然変異タンパク質のアミノ末端配列をエドマン分解によって決定 した。アミノ酸から誘導されるフェニルチオヒダントインを装置で決定した。

ＧｌｙＤ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦのＮ−末端アミノ酸から始まる最初の１０アミ ノ酸の配列はＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ａｒｇ−８ｅｒ−Ｉ　 １ｅ−Ｔｒｐ−Ｌ　ｅ　ｕ−Ａ　］　］ａ−、Ａｒ　ｇであり、Ｄ１４Ｓｅｒ１ ７ＣＮＴＦについてはＡｓｐ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｉ　 Ｉｅ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＬｙｓＴあった。この配列は、Ｇｌｙ Ｄ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦに最初の１４アミノ末端アミノ酸が存在せず、グリノ ンアミノ末端アミノ酸が存在し、位置１７のンステインがセリンに置換されてい る場合のＣＮＴＦの配列（図２）に対応する。

Ｄ１４Ｓｅｒ１７の場合、最初の１４アミノ酸が削除され、位置１７のシスティ ンがセリンで置換されている。

ヒヨコの背面神経節から摘出したＥＩＯ日の胚ニューロン細胞を培養中で維持す るという突然変異タンパク質の効力に基づいて、組換え突然変異タンパク質の生 物学的活性を評価した。ＥＩＯ日のヒヨコの胚から細胞を摘出し、解離し、一連 の予備培養段階によって濃縮した。次にそのニューロンを組織培養用の９６穴プ レートに接種し、ポリオルニチン（１−００μｇ／ｍ１．ホウ酸緩衝液（ｐＨ８ ゜４）中）およびラミニン（１０μｇ／ｍｌ中）で処理した。ニューロンを１ウ エルにつき４０００ニユーロンの濃度で接種した。培養培地は１００μｇ／ｍｌ のペニシリン、２ｍＭＬ−グルタミンおよび１０％不活化ウシつ児血清を含むダ ルベツコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）とした。生き残ったニューロンを培養の２４ 時間後に数えた（Ｓｋａｐｅｒら（１９８５）Ｄｅｖ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、 　２４：３９−４６）。

単一突然変異タンパク質はＥＤ５０として計算した次の比活性を持っていた。

ＣＮＴＦ（Ｈｉｓ）６ＡｓｎＧ］ｙＤ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦ　２０％ｇ／ｍ１ ＧＩｙＤ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦ　０．２５％ｇ／ｍ１ＣＮＴＦ（Ｈｉ　５）６ Ａｓｎ　０．５μｇ／ｍ］（Ｈｉ　５）６Ｄ１４Ｓｃ　ｒ　１７ＣＮＴＦ　０． ４μｇ／ｌ１ｌＩＤ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦ　０．１２％ｇ／ｍｌ医薬組成物 ガングリオノド、リン脂質、ヒアルロン酸またはそれらの誘導体、半合成類縁体 もしくはそれらの塩の１つと共に、あるいはこれらを含まずに、本発明のヒトＣ ＮＴＦ分子の溶液を含有する医薬組成物の製剤化には、ＣＮＴＦ分子の有効量を 医薬的に許容し得る賦形剤との混合物中に混合するという、患者に投与される医 薬的に許容し得る組成物を調製するためのよく知られている方法が含まれる。

適切な賦形剤とその製剤は、他のタンパク質を含めて、例えば“Ｒｅｍｉｎｇｔ ｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｃｎｃｅｓ（１９８５）− （マソク畢バブリノングφカンパニー、　Ｅａｓｔｏｎ編。

米国）に記述されている。このような賦形剤には注射可能な「デポ−製剤」が含 まれる。これに基づき、本医薬製剤には、生理学的液体と等張な適当なｐＨの緩 衝液に含まれる医薬的に許容し得る賦形剤または希釈剤の１またはそれ以上を伴 うＣＮＴＦ成長因子の溶液またはその凍結乾燥粉末が含まれるが、これに限られ るわけではない。凍結乾燥製剤の場合、マンニトールやグリツジなど（これらに 限られるわけではない）の支持賦形剤を用いることができ、所望のｐＨの適度に 等張な緩衝溶液を得るべく、所望の体積の適当な緩衝溶液を加える。所望の体積 の等張溶液中の本ＣＮＴＦ分子の医薬組成物のために同様の溶液を使用すること ができ、所望のｐＨ（例えば中性ｐＨ）の等強性医薬調製物を一貫して得るため には、適当な濃度のリン酸塩またはクエン酸塩を含む生理学的な緩衝溶液の使用 が含まれるが、これに限られるわけではない。

経口的、局所的、直腸的、非経口的、局部的、吸入的、脳内的または鼻孔内的に 医薬調製物を使用することができる。したがってこれらは固体または半固体型、 例えば火剤、錠剤、クリーム剤、ゼラチンカプセル剤、カプセル剤、坐剤、軟ゼ ラチンカプセル剤、ゲル剤、膜、不織製品、チューブレット、糸、ミクロ球およ びスポンジなどであり得る。非経口的使用と脳内使用のためには、筋肉内または 皮下投与のための形管を使用することができ、注入、静脈内注射あるいは脳内注 射のための形態を使用することができ、したがってこれらの形態を活性化合物の 溶液として、あるいは上述の使用に適し、生理学的液体と適合する浸透圧を有す る１またはそれ以上の医薬的に許容し得る賦形剤または希釈剤と混合すべき活性 化合物の凍結乾燥粉末として調製することができる。局部的使用のためには、局 所的使用のためのクリームや軟膏の形態、あるいはスプレーの形態にある調製物 を使用することができる。吸入のためには、算用スプレーなどのスプレーの形態 にある調製物を使用することができる。ポリマーを伴う使用については、膜、ス ポンジ、不織製品、チューブレラ）・、糸、ミクロ球、ナノ球およびナノカプセ ルの形態にある調製物を使用することができる。

本発明の調製物はヒトまたは動物に対する投与に使用することができる。これら は好ましくは、溶液剤、スプレー剤、軟膏およびクリームの場合には０．０１％ ないし１０％の活性化合物を含有し、固形調製物の場合には、１％ないし１００ ％（好ましくは５％ないし５０％）の活性化合物を含有する。投与すべき投与量 は個々の必要性、所望の効果および選択した投与経路に依存する。

本医薬調製物には、脂肪親和性の賦形剤（例えば水溶性賦形剤、グリコゼラチン などの牛乳化性賦形剤またはその他）を伴う直腸投与用の坐剤も含まれるが、こ れに限られるわけではない。これらの調製物中では、全賦形剤の０．０１ないし １重量％にわたる量て上記ＣＮＴＦが存在し得る。坐剤は適当な量のアセチルサ リチレートを含有し得るが、これらに限られるわけではない。本医薬製剤には、 鼻孔投与、吸入投与および筋肉内投与のためのミクロ球、ナノ球、ナノカプセル も含まれる。さらに上記製剤はそれらが意図する使用法に応じて、例えば膜、ス ポンジ、管、誘導路などの他の特殊な形態をも含み得る。

活性物質　μｇ　０．５〜１（２５００ＢＵ）塩化ナトリウム　ｍｇ　１６ クエン酸緩衝液ｐＨ＝７　ｍｌ　２ 適量の注射用水中 調製物番号２２ｍｌバイアルが次の物質を含有する活性物質　μｇ　５〜１０（ ２５０００ＢＵ）塩化ナトリウム　ｍｇｌ、６ クエン酸緩衝液ｐＨ＝７　ｍｌ　２ 適量の注射用水中 調製物番号３２ｍｌバイアルが次の物質を含有する活性物質　μｇ　０．５〜１ （２５００ＢＵ）塩化ナトリウム　ｍｇ　１６ カングリオノドナトリウム塩　ｍｇ　１００クエン酸緩衝液ｐＨ＝７　ｍｌ　２ 適量の注射用水中 調製物番号４２ｍｌバイアルが次の物質を含有する活性物質　μｇ　５〜１０（ ２５０００ＢＵ）塩イ１ナトリウム　ｍｇ　１６ ガシゲリ第５．・ドナト）ノウム塩　ｍｇ　５０クエン酸緩衝液ｐＨ＝７　ｍｌ 　２ 適量の注射用水中 調製物番号５２ｍｌバイアルが次の物質を含有ｔゑ一活性物質　ｔｌｇ　０．５ 〜１（２５００ＢＵ）塩化ナトリウム　ｍｇ　１６ モノンアロテトラヘキソンルカングリオノド（ＧＭＩ）ナトリウム塩　ｍｇ　１ ００クエン酸緩衝液ｐＨ＝７　ｍｌ　２ 適量の注射用水中 調製物番号６・２ｍｌバイアルが次の物質を含有する活性物質　μｇ　５〜１０ （２５０００ＢＵ）塩化ナトリウム　ｍｇ　１．６ モノノアロテトラヘキソノルガングリオノド（ＧＭＩ）ナトリウム塩　ｍｇ　１ ００クエン酸緩衝液ｐＨ＝７　ｍｌ　２ 適量の注射用水中 凍結乾燥した活性物質　μｇ　２〜４（１００ＯＯＢＵ）グリツジ　ｍｇ　３０ ｂ）２ｍｌの溶媒アンプルが次の物質を含有する塩化ナトリウム　ｍｇ　１６ 注射用水中のクエン酸緩衝液　２ｍｌになる適量凍結乾燥した活性物質　μｇ　 ２へ４（］、００００ＢＬｌ）塩化ナトリウム　ｍｇ　１６ 注射用水中のクエン酸緩衝液　２ｍｌになる適量凍結乾燥した活性物質　μｇ　 ５〜１０（２５０００ＢｔＪ）塩化ナトリウム　ｍｇ２４ 注射用水中のクエン酸緩衝液　３ｍｌになる適量凍結乾燥した活性物質　μｇ　 ５〜１０（２５０００ＢＵ）ガングリオンドナトリウム塩　ｍｇ　１００塩化ナ トリウム　ｍｇ　２４ 注射用水中のクエン酸緩衝液　３ｍｌになる適量凍結乾燥した活性物質　μｇ　 ５〜１０（２５０００ＢＵ）ガングリオ／ドナトリウム塩　ｍｇ　５０塩化ナト リウム　ｍｇ　２４ 注射用水中のクエン酸緩衝液　３ｍｌになる適量凍結乾燥した活性物質　μｇ　 ０．５〜１（２５００ＢＵ）モノンアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＭ Ｉ）ナトリウム塩　ｍｇ　１００塩化ナトリウム　ｍｇ　２４ 注射用水中のクエン酸緩衝液　３ｍｌになる適量凍結乾燥した活性物質　μｇ　 ５〜１０（２５０００ＢＵ）モノンアロテトラへキソシルガングリオシド（ＧＭ Ｉ）ナトリウム塩　ｍｇ　１００塩化ナトリウム　ｍｇ　２４ 注射用水中のクエン酸緩衝液　３ｍｌになる適量凍結乾燥した活性物質　μｇ　 ５〜１０（２５０００ＢＵ）３−ｓｎ−ボスファチンルセリン　ｍｇ　５０レシ チン　ｍｇ　１５ マンニトール　ｍｇ　１０１ ００ｂ）４の溶媒アンプルが次の物質を含有するマンニトール　ｍｇ　６０ ４ｍ１になる適量の注射用水中 凍結乾燥した活性物質　μｇ　５〜１０（２５０００ＢＵ）マンニトール　ｍｇ 　６０ ｂ）３ｍｌの溶媒アンプルが次の物質を含有する・塩化ナトリウム　ｍｇ　２４ 注射用水中のクエン酸緩衝液　３ｍｌになる適量凍結乾燥した物質　μｇ　２． ５〜５（１２５００ＢＵ）塩化ナトリウム　ｍｇ　１６ 注射用水中のクエン酸緩衝液　２ｍｌになる適量Ｃ）直腸投与用の坐剤の例 調製物番号１７ 活性物質　μｇ　５〜１０（２５０００ＢＵ）ココア脂　ｍｇ　２．５ 調製物番号１８ 活性物質　μｇ　５〜１０（２５０００ＢＵ）カーボワックス１５４０　ｇ　１ ．７５カーボワソクス６０００　ｇ　０．７５調製物番号１９ 活性物質　μｇ　５〜１０（２５０００ＢＵ）活性物質　μｇ　５〜１０（２５ ０００ＢＵ）ゼラチン　ｇ　０．２５ 調製物番号２１ ヒアルロン酸のベンジルアルコールとの部分的エステルを含有するクリームであ って、その１００ｇが次の物質を含有する・活性物質　μｇ　１０〜２０（５０ ０００ＢＵ）ヒアルロン酸のベンジルアルコールとの部分的エステルｇｏ、２ ポリエチレングリコールモノステアレート４００ｇ　１０．０００ セチオールＶ　ｇ　５．０００ ラネソテＳＸ　ｇ　２．０００ パラオキシ安息香酸メチル　ｇ　０．０７５パラオキ７安息香酸プロピル　ｇ　 ０．０５０デヒドロ酢酸ナトリウム　ｇ　０．１００グリセリンＦ、Ｕ、　ｇ　 １．５００ ソルビトール７０　ｇ　１．５００ テストクリーム　ｇ　０．０５０ 注射用水　１００．０００ｇになる適量調製物番号２２ ヒアルロン酸のベンジルアルコールとの全エステルを含有するクリームであって 、その１００ｇが次の物質を含有する：活性物質　μｇ　１０〜２０（５０００ ０ＢＵ）ヒアルロン酸のベンジルアルコールとの全エステルｇ　０．２ ポリエチレングリコールモノステアレート４００ｇ　１０．０００ セチオールＶ　ｇ　５．０００ ラネツテＳＸ　ｇ　２．０００ バラオキシ安息香酸メチル　ｇ　Ｏ，０７５パラオキシ安息香酸プロピル　ｇ　 ０．０５０デヒドロ酢酸ナトリウム　ｇ　Ｏ，１００グ’Ｊセ’ＪンＦ、Ｕ、　 ｇ　１．５００ソルビトール７０　ｇ　１．５００ テストクリーム　ｇ　０．０５０ 注射用水　１００．０００ｇになる適量ここに本発明を記述したので、本発明が 様々に変化し得ることは明らかであろう。そのような変化は本発明の思想と範囲 からの逸脱であると見なすべきではなく、当業者にとって自明であるような修飾 はすべて以下の請求の範囲の範囲に包含されるものと解釈される。

！ＨＡＧＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＡ［；ＡＡｆ：ＡＴＣＡＡＣＣＴＧ［；ＡＣ丁Ｃ 丁ＧＣＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＣＴＣＣＣＧＧ　Ａｃｒ　ＴＧＴ　ＴＣＴ　ＴＧＴ 　ＡＧＴ　ＴＧＧ　ＡＣＣＴＧＡ　ＧＡＣ［；ＣＣＴＡＣＣＣＴ　ＡＣＧ４３５ 　ＣＡＧ　ＴＧＧ　ＣＡＡ　ＧＣＡ　ＣＴＧ　ＡＴＣＡＧＴ　ＧＧＡ　ＧＴＧ　 ＡＧＣＴｉ；Ａ　ＣＣＧ　ＡＧＧ　ＣＡＧ　ＡＧＣＧＴＣＡＣＣＧＴＴ　ＣＧＴ 　ＧＡＣＴＡＧ　ＴＣＡ　ＣＣＴ　ＣＡＣＴＣＧ　ＡＣＴ　ＧＧＣＴＣＣＧＴＣ ＴＣＧ２２６ＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＴＴＡＧＡＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧ丁ＧＣ ＡＴＴＴＴＡＣＣＣＣＡＡＣＣＧＡＣＣＧＧＴ　ＣＣＧ　ＡＧＡ　ＡＴＣＴＴＣ Ｔ［；Ｇ　ＴＣＧ　ＴＣＣＡＣＧ　ＴＡＡ　ＡＡＴ　ＧＧＧ　ＧＴＴ　ＧＧＣ２ ７１ＡＡＧＧＴＧＡＣＴＴＣＣＡＴＣＡＡＧＣ丁＾ＴＡＣＡＴＡＣＣＣＴＴＣＴ ＴＣＴＣＣＡＡＧＴＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＡＡＧＧＴＡＧＴＴＣＧＡＴＡＴＧＴ ＡＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣ３１６Ｃ丁ＧＣＣＴＴＴＧＣＡＴＡ ＣＣＡＧＡＴＡＧ＾ＧＧＡＧＴＴＡＡＴＧ＾■＾ＣＴＣＣＴＧＧＡＡＴＧＡＣＧ ＧＡＡＡＣＧＴＡＴＧＧＴＣＴＡＴＣＴＣＣＴＣＡＡＴＴＡＣＴＡＴＧＡＧＧＡ ＣＣ丁丁Ａ３６１ＡＣＡＡＧＡＴＣＣＣＣＣ［）ＣＡＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡ丁Ｇ ＧＧＡＴＧＣＣＴ＾丁ＴＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴ　ＴＣＴ　ＡＧＧ　Ｇ［；Ｇ　Ｃ ＧＴ　ＴＡＣＴＣＣ［；ＡＣＴＡＣＣＣＴ　ＡＣＧ　ＳＡＴ　ＡＡＴ　ＴＡＣＡ ＡＣ４０６ＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧＴＣＴＣＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＴＧ ＧＧＧＣＣＴＡＡＡＧＧＴＧＣＣＴＣＴＡＣＣＡＣＣＡＧ　ＡＧＡ　ＡＡＣＴＣ Ｔ　ＴＣＴ　ＴＣＧ　ＡＣＡ　ＣＣＣＣＧ［；　ＡＴＴ　ＴＣＣＡＣＧ４５１Ｔ ＧＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＣＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＧＴＡＡＧＧＴＣＣＡＴＣＣＡ ＴＧＡＣＣＴＴＣＡＣＧＴＣＣＴＣＧＡＡＡＧ丁ＧＴＣＡＣＣＴＧＴＣＡ丁ＴＣ ＣＡＧＧ丁Ａｆ；ＧＴＡＣＴｌ；ＧＡＡＧ５４１　ＡＴＴ　Ａ丁Ａ　丁ＴＧ　Ｉ ＪＡ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　Ａ［；Ａ　ＡＡＡ　ＴＧＴ　ＧＡＧ　ＴＣＧ　ＡＣＡ　 ＡＴＡＡＴＡＴＡＡＣＧＡｒＴＧＴＴＧＴＴＣＴＴＴＴＡＣＡＣｒＣＡＧＣ丁Ｇ 丁ＴＦｉｇ、３ １ＢＩＩＡＮＮＫＫＭ 残基数＝１８７ 分子量：　２１４００ アミノ酸組成 ３６１　ＴＡＣＩＪＧ　ＡＴＡ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＴＴＡ　ＡＴＧ　ＡＴＡ　Ｃ ＴＣＣＴＧ　ＧＡＡ　ＴＡＣＡＡＧ　ＡＴＣＣＣＣ＾ＴＧ　ＧＴＣＴＡＴ　ＣＴ ＣＣＴＣＡＡＴ　ＴＡＣＴＡＴ　ＧＡＧ　ＧＡＣＣＴＴ　ＡＴＧ　ＴＴＣＴＡＧ 　ＧＧＧ４０６　ＣＧＣＡＡＴ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　ＧＧＧ　ＡＴＧ　Ｃ ＣＴ　ＡＴＴ　ＡＡＴ　Ｇ丁Ｔ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＧＧ丁ＧＧＴＧＣＧ　ＴＴＡ 　ＣＴＣＣＧＡ　ＣＴＡ　ＣＣＣＴＡＣＧＧＡ　ＴＡＡ　ＴＴＡ　ＣＡＡ　ＣＣ Ｔ　ＣＴＡ　ＣＣＡ　ＣＣＡＦｉｇ、５ 残基数・１６１゜ 分子量　１９４７６ １ｇ１Ｏ Ａｉ−Ｘ’ｌ／乙ロー１丁 Ｆｉｇ１２ Ｆｉｇ１３ 溶出物（ｍｌ） フロントベージの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　１／２１　 ７２３６−４Ｂ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４Ｂ／／ＣＣ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ 、ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ。

ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、 ＵＳ Ｉ

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．野生型ヒト毛様体ニューロン親和性因子（ＣＮＴＦ）のアミノ末端の少なく とも１アミノ酸を欠くか、野生型ヒトＣＮＴＦのカルボキシ末端の少なくとも１ アミノ酸を欠くか、あるいは野生型ヒトＣＮＴＦのアミノ末端とカルボキシ末端 の両方の少なくとも１アミノ酸を欠く、ヒトＣＮＴＦの先端欠失型をコード化す る配列からなる核酸配列。
2. ２．図４に記載のアミノ酸配列と機能的に等価な生物学的活性を有するポリペプ チドをコード化する配列からなる請求項１の核酸配列。
3. ３．図６に記載のアミノ酸配列と機能的に等価な生物学的活性を有するポリペプ チドをコード化する配列からなる請求項１の核酸配列。
4. ４．図８に記載のアミノ酸配列と機能的に等価な生物学的活性を有するポリペプ チドをコード化する配列からなる請求項１の核酸配列。
5. ５．ヒト毛様体ニューロン親和性因子（ＣＮＴＦ）のアミノ末端の少なくとも１ アミノ酸を欠き、かつ、該ＣＮＴＦ内に少なくとも１つのアミノ酸置換を含有す るヒトＣＮＴＦの先端欠失突然変異タンパク質型をコード化する配列からなる核 酸配列。
6. ６．Ｄ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦのアミノ酸配列と機能的に等価な生物学的活性を 有するポリペプチドをコード化する配列からなる請求項５の核酸配列。
7. ７．図３に記載の核酸配列もしくは遺伝子コードの縮重に従うその変異種からな る請求項２の核酸配列。
8. ８．図５に記載の核酸配列もしくは遺伝子コードの縮重に従うその変異種からな る請求項３の核酸配列。
9. ９．図７に記載の核酸配列もしくは遺伝子コードの縮重に従うその変異種からな る請求項４の核酸配列。
10. １０．Ｄ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦをコード化する核酸配列もしくは遺伝子コード の縮重に従うその変異種からなる請求項６の核酸配列。
11. １１．図４に記載のアミノ酸配列もしくは機能的に等価な生物学的活性を有する アミノ酸配列からなるヒト毛様体ニューロン親和性因子の先端欠失型。
12. １２．図６に記載のアミノ酸配列もしくは機能的に等価な生物学的活性を有する アミノ酸配列からなるヒト毛様体ニューロン親和性因子の先端欠失型。
13. １３．図８に記載のアミノ酸配列もしくは機能的に等価な生物学的活性を有する アミノ酸配列からなるヒト毛様体ニューロン親和性因子の先端欠失型。
14. １４．Ｄ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦのアミノ酸配列もしくは機能的に等価な生物学 的活性を有するアミノ酸配列からなるヒト毛様体ニューロン親和性因子の先端欠 失突然変異タンパク質型。
15. １５．ヒト毛様体ニューロン親和性因子（ＣＮＴＦ）のアミノ末端の少なくとも １アミノ酸を欠くか、ヒトＣＮＴＦのカルボキシ末端の少なくとも１アミノ酸を 欠くか、あるいはヒトＣＮＴＦのアミノ末端とカルボキシ末端の両方の少なくと も１アミノ酸を欠くヒトＣＮＴＦの先端欠失型をコード化する核酸配列を含む組 換え発現ベクターであって、形質転換された原核または真核細胞中でヒト毛様体 ニューロン親和性因子の該先端欠失型を発現させる能力を有する組換え発現ベク ター。
16. １６．該核酸配列が請求項２、３または４のいずれかに定義するヌクレオチド配 列を有する請求項１５の組換え発現ベクター。
17. １７．該核酸配列が図３、５または７のいずれかに記載のヌクレオチド配列を有 する請求項１５の組換え発現ベクター。
18. １８．ヒト毛様体ニューロン親和性因子（ＣＮＴＦ）のアミノ末端の少なくとも １アミノ酸を欠き、かつ、該ＣＮＴＦ内に少なくとも１つのアミノ酸置換を含有 するヒトＣＮＴＦの先端欠失突然変異タンパク質型をコード化する核酸配列を含 む組換え発現ベクターであって、形質転換された原核または真核細胞中でヒト毛 様体ニューロン親和性因子の該先端欠失突然変異タンパク質型を発現させる能力 を有する組換え発現ベクター。
19. １９．該核酸配列がＤ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦをコード化する請求項１８の組換 え発現ベクター。
20. ２０．該ベクターがＣＮＴＦ（Ｈｉｓ）６Δ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦである請求 項１８の組換え発現ベクター。
21. ２１．該ベクターがΔ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦである請求項１８の組換え発現ベ クター。
22. ２２．請求項１５のベクターで形質転換された原核または真核細胞。
23. ２３．請求項１８のベクターで形質転換された原核または真核細胞。
24. ２４．咳細胞が大腸菌、バチルス属の構成要素、シュードモナス属の構成要素、 酵母または哺乳類細胞である請求項２２の細胞。
25. ２５．該細胞が大腸菌、バチルス属の構成要素、シュードモナス属の構成要素、 酵母または哺乳類細胞である請求項２３の細胞。
26. ２６．医薬的に許容し得る担体または希釈剤と請求項１１、１２または１３のい ずれかのヒト毛様体ニューロン親和性因子の有効神経治療量とを含む医薬組成物 。
27. ２７．医薬的に許容し得る担体または希釈剤と請求項１４のヒト毛様体ニューロ ン親和性因子の有効神経治療量とを含む医薬組成物。
28. ２８．天然のガンダリオシドまたは該ガングリオシドの誘導体、半合成類縁体あ るいは塩をさらに含む請求項２６または２７の医薬組成物。
29. ２９．天然の多糖または該多糖の誘導体あるいは半合成類縁体をさらに含む請求 項２６または２７の医薬組成物。
30. ３０．該多糖がヒアルロン酸である請求項２９の医薬組成物。
31. ３１．神経機能の維持、回復またはその損失の防止によって神経障害を治療する 方法であって、請求項１１、１２または１３のいずれかのヒト毛様体ニューロン 親和性因子の有効量を患者に投与することからなる方法。
32. ３２．神経機能の維持、回復またはその損失の防止によって神経障害を治療する 方法であって、請求項１４のヒト毛様体ニューロン親和性因子の有効量を患者に 投与することからなる方法。
33. ３３．神経機能の維持、回復またはその損失の防止によって神経障害を治療する 方法であって、請求項２８の医薬組成物の有効量を患者に投与することからなる 方法。
34. ３４．神経機能の維持、回復またはその損失の防止によって神経障害を治療する 方法であって、請求項２９の医薬組成物の有効量を患者に投与することからなる 方法。
35. ３５．神経系の老化もしくは免疫系を冒す疾患によって引き起こされる神経病理 学的状態の治療法であって、請求項１１、１２または１３のいずれかのヒト毛様 体ニューロン親和性因子の有効量を患者に投与することからなる方法。
36. ３６．神経系の老化もしくは免疫系を冒す疾患によって引き起こされる神経病理 学的状態の治療法であって、請求項１４のヒト毛様体ニューロン親和性因子の有 効量を患者に投与することからなる方法。
37. ３７．神経系の老化もしくは免疫系を冒す疾患によって引き起こされる神経病理 学的状態の治療法であって、請求項２８の医薬組成物の有効量を患者に投与する ことからなる方法。
38. ３８．神経系の老化もしくは免疫系を冒す疾患によって引き起こされる神経病理 学的状態の治療法であって、請求項２９の医薬組成物の有効量を患者に投与する ことからなる方法。
39. ３９．ヒト毛様体ニューロン親和性因子（ＣＮＴＦ）のアミノ末端領域の少なく とも１アミノ酸を欠き、かつ、該ＣＮＴＦの残りの部分に少なくとも１つのアミ ノ酸置換を含有する形態のＣＮＴＦからなるヒトＣＮＴＦの突然変異タンパク質 型を生塵する方法であって、次の段階からなる方法：（ａ）野生型ヒトＣＮＴＦ のアミノ末端領域に存在するアミノ酸をコード化する少なくとも１つのコドンを 欠き、かつ、野生型ヒトＣＮＴＦには存在しないアミノ酸をコード化するように 修飾された少なくとも１つのコドンを該ＣＮＴＦの残りの部分に含有する形態の ヒトＣＮＴＦをコード化する第１の核酸配列であって、少なくとも６つのヒスチ ジン残基と化学的または酵素的切断部位とをコード化する配列からなる第２の核 酸配列に融合しているもの、からなる核酸配列を宿主細胞中で発現させ、 （ｂ）該宿主細胞の抽出物を生産し、 （ｃ）固定化した金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって 該抽出物を精製し、 （ｄ）組換え突然変異タンパク質ＣＮＴＦを回収し、（ｅ）段階（ｄ）の該ＣＮ ＴＦを化学的または酵素的切断剤と共にインキュベートし、 （ｆ）段階（ｅ）で生成した反応生成物を固定化した金属アフィニティークロマ トグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製し、（ｇ）ＣＮＴＦの該突然変異タンパ ク質型を回収する。
40. ４０．該突然変異タンパク質がＤ１４Ｓｅｒ１７ＣＮＴＦである請求項３９の方 法。