KR100407792B1 - 인간 글루카곤 유사펩타이드를 융합파트너로 이용한재조합 단백질의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 글루카곤 유래 유사체 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하여 재조합 단백질을 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 인간 글루카곤 유사체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하는 융합단백질을 코딩하는 유전자 단편을 얻는 단계; 상기 유전자 단편을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 미생물을 제조하는 단계; 상기 형질전환 미생물로부터 목적 단백질의 발현을 유도하여 재조합 불용성 응집체 형태로 생산하는 단계; 및 상기 재조합 불용성 응집체를 알칼리성 용액에 용해하여 수용성화시켜 활성 재조합 단백질을 얻는 단계로 구성된 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 의해 형질전환 미생물로부터 생산된 응집체는 변성제 및 환원제 등을 사용하지 않고도 쉽게 수용성화될 수 있으며 재조합 단백질 응집시의 상호작용으로 인해 저분자량의 올리고머 형태로 재조합 단백질을 얻을 수 있다.

Description

인간 글루카곤 유사 펩타이드를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법{Preparation method of recombinant protein by use of human glucagon-derived peptide analogue as a fusion expression partner}

본 발명은 인간 글루카곤 유래 유사체 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하여 재조합 단백질을 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 인간 글루카곤 유사체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하는 융합단백질을 코딩하는 유전자 단편을 얻는 단계; 상기 유전자 단편을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 미생물을 제조하는 단계; 상기 형질전환 미생물로부터 목적 단백질의 발현을 유도하여 재조합 불용성 응집체 형태로 생산하는 단계; 및 상기 재조합 불용성 응집체를 알칼리성 용액에용해하여 수용성화시켜 활성 재조합 단백질을 얻는 단계로 구성된 제조방법에 관한 것이다.

사람 또는 동물의 장기로부터 어렵게 얻어지던 여러 가지 중요한 단백질들을 유전자 재조합 방법을 이용하여 미생물로부터 생산하기 위해서는 목적 단백질의 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 얻고 이를 적당한 숙주세포에 형질전환시켜 형질전환 균체를 선별한 후 상기 형질전환 균체를 배양함으로써 목적 단벡질을 얻게 된다.

이를 위한 숙주세포로서 가장 많이 이용되고 있는 대장균은 다른 생물체에 비하여 그의 유전자 및 대사체계에 대한 정보가 가장 많이 알려져 있어 유전자 재조합 기술에 의하여 유용한 외래 단백질을 생산하기가 매우 용이하다. 하지만, 대장균으로부터 직접 발현시킨 목적 단백질은 N-말단에 메티오닌(methionine)이 첨가된 형태로 생산되기 때문에 이를 천연형 단백질로 전환시키는 단계가 필요하다. N-말단에 메티오닌이 첨가된 형태의 목적 단백질은 인간이나 기타 동물에 적용될 경우 면역반응(immunogenecity)을 유발하거나, 구조가 불안정해져 본래 단백질의 기능을 수행하지 못하는 경우가 발생할 수 있다. 또한, 발현되는 목적 단백질이 항세균성 펩타이드(antibacterial peptide)와 같이 독성이 매우 강한 경우에는 오히려 숙주세포의 성장을 저해하기도 하고, 분자량 10,000 이하의 작은 크기의 폴리펩타이드의 경우에는 숙주세포에 존재하는 단백질 분해효소에 의해 분해되어 안정적인 대량생산이 어렵게 된다.

이러한 문제점들을 해결하기 위한 방법으로, 목적 단백질의 N-말단에 적절한 융합파트너을 융합시켜 발현시키는 방법이 이용되고 있다. 상기 방법은 선택된 숙주에서 안정적으로 생산되는 것으로 알려진 수용성 단백질을 융합파트너로 이용하여 목적하는 폴리펩타이드를 생산하는 것이다. 지금까지 알려진 바에 따르면, 대장균에서 안정적으로 대량생산되는 수용성 단백질로는 β-갈락토시데이즈(β-galactosidase), 말토오즈 결합단백질(maltose binding protein, 45 kDa), 글루타치온-S-전달효소(glutathione-S-transferase, 26 kDa) 등이 있다. 하지만, 상기 단백질들을 N-말단의 융합파트너로 이용하는 경우에는 이로부터 생산된 융합단백질들은 친화 크로마토그래피(affinity chromatography) 등을 이용하여 용이하게 정제할 수 있는 장점이 있는 반면, 융합파트너가 발현시키고자 하는 폴리펩타이드에 비해 크기가 상대적으로 매우 커서 융합 부분의 크기에 따라 폴리펩타이드의 생산수율이 현저하게 저하되는 단점이 있다. 또한, 발현된 융합단백질이 세포 독성을 그대로 유지하는 경우에도 효과적인 제조방법으로 이용될 수 없다.

또 다른 방법으로 융합파트너를 이용하여 목적 폴리펩타이드를 세포 내에 불용성 응집체(inclusion bodies)의 형태로 발현시키는 방법이 사용될 수 있다(Ulman, A.,Gene,29, 27-31, 1984; Nilsson, B. et al.,EMBO J., 4, 1075-1080, 1985; Di Guan et al.,Gene, 67, 21-30, 1988; La Vallie, E.R. et al.,Bio/Technology, 11, 187-193, 1993). 상기 방법은 목적으로 하는 재조합 단백질이 초기 분리과정에서 세포 배양액으로부터 용이하게 분리될 수 있다는 장점을 가지고 있으나, 불용성 응집체의 형성과정 중 발현된 폴리펩타이드(peptide)의 폴딩(folding) 중간체가 분자 상호간의 다이설파이드 결합(intermolecular disulfide bond) 또는 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)에 의해 숙주세포 내 샤페론(chaperon), 라이보좀(ribosome), 초기인자 단백질 등과 같은 다른 불순물들과 비선택적으로 결합함으로써 목적 폴리펩타이드의 불용성 응집체 내 순도가 저하되는 단점을 가지고 있다(Anna Mituraki et al.,Bio/Technol.,7, 690-697, 1989).

특히, 목적으로 하는 재조합 단백질의 활성이 수용체 결합성에 있는 경우에는 재조합 단백질 자체의 소수성 특성으로 인하여 거대 응집체가 형성되게 되어 수용성으로 용해된다 하더라도 큰 분자량의 다량체를 형성하여 단위 질량 당 수용체 결합활성이 크게 저하되는 문제점이 있다. 일반적으로, 불용성 응집체로 부터 활성형 단백질을 순수 분리해내기 위해서는 구아니딘-하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride), 요소(urea) 등의 변성제(denaturant)를 사용하여 불용성 응집체를 용해시킨 후 다시 희석하여 리폴딩(refolding)과정을 거쳐야 재활성화된다. 또한, 다이설파이드 결합에 의해 생성된 응집체의 경우에는 용해를 위해 환원제(reducing agent)까지 함께 사용하여 처리해야 할 뿐 아니라 리폴딩하는 공정에 아직까지 많은 문제점이 제기되고 있어 생산수율을 감소시키는 주요 원인이 되기도 한다(Marston, F. A. O.,Biochem. J.,240, 1-12, 1986; Mitraki, A. and King, J.,Bio/Technology,7, 690-697, 1989).

한편, 인간 글루카곤(glucagon)은 췌장의 랑겔한스 α-세포(α-cells of the islets of Langerhans)로부터 분비되어 인슐린과의 길항작용에 의해 혈액 내의 포도당 농도를 조절하는 호르몬으로서, 저혈당 치료제 또는 내시경 및 X선 진단보조제로 미국, 일본 등지에서 이미 상업화되어 있는 펩타이드 호르몬이다. 또한, 글루카곤은 29개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로 대장균 내에서 융합단백질의 형태로 높은 발현율을 가지고 안정적으로 생산되는 것으로 알려져 있다(Shin et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol., 49, 364-370, 1998). 이와같이, 글루카곤은 3.5 kDa 크기의 매우 작은 펩타이드임에도 불구하고 X-ray 분석 결과 α-나선구조 (α-helix) 구조를 이루고 있으며, 안정한 상태를 유지하기 위하여 분자간의 강한 소수성 결합에 의해 스스로 올리고머(oligomer)를 형성하고 있다(Sasaki, K. et al.,Nature, 257, 751-757, 1975). 따라서, 크기가 작으면서도 소수성 자가결합성(hydrophobic self-association)이 강한 펩타이드인 글루카곤은 숙주세포로부터 목적 단백질의 생산수율을 향상시키는 동시에 목적 단백질이 고순도로 포함된 응집체를 생산하기 위한 융합파트너로서 매우 효과적으로 이용될 수 있다.

이에, 본 발명자들은 재조합 형질전환체로부터 목적 단백질을 안정적으로 대량 생산하기 위해 인간 글루카곤 또는 그 유사체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 N-말단의 융합파트너로서 이용하여 재조합 융합단백질을 효과적으로 생산하는 방법을 개발하고, 특정 글루카곤 유사체가 이용될 경우 목적하는 재조합 단백질이 안정적으로 발현되며 세포 배양액으로부터 분리된 응집체가 변성제 및 환원제를 사용하지 않아도 알칼리성 용액에서 쉽게 수용성화됨은 물론 재조합 단백질의 다량체 형성이 현저하게 억제되어 작은 분자량의 다량체를 형성함으로써 비활성도(specific activity)가 크게 향상된 재조합 융합단백질의 생산이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 형질전환 미생물로부터 목적 단백질을 불용성 응집체의 형태로 생산하는데 있어, 불용성 응집체를 변성제나 환원제를 사용하지 않고도 활성단백질로 분리해 내는 동시에 저분자량의 재조합 단백질 다량체 형성을 유도하는 융합단백질의 형태로 재조합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 인간 인터루킨-2를 직접 발현하는 발현벡터 pT7IL-2의 제조과정을 나타낸 것이고,

도 2는 천연형 인간 글루카곤 유전자가 융합된 인간 인터루킨-2를 발현하는 발현벡터 pGIL-2의 제조과정을 나타낸 것이고,

도 3은 인간 글루카곤 유래 유사체 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하여 인간 인터루킨-2를 융합단백질 형태로 발현하는 발현벡터 pGβIL-2의 제조과정을 나타낸 것이고,

도 4는도 1의 발현벡터로부터 직접 발현된 인간 인터루킨-2(IL-2) 및도 3의 발현벡터로부터 융합파트너와의 융합단백질 형태로 발현된 인간 인터루킨-2(GβㆍIL-2)의 용해도를 비교한 결과이고,

A : 직접 발현에 의해 생성된 IL-2(80 mg/L)를 포함한 단백질 응집체(0.4 g/L)

B : 융합 발현에 의해 생성된 GβㆍIL-2(300 mg/L)를 포함한 단백질 응집체 (1.0 g/L)

도 5는도 1의 발현벡터로부터 직접 발현된 인간 인터루킨-2(IL-2),도 2의 발현벡터로부터 발현된 천연형 인간 글루카곤 유전자가 융합된 인간 인터루킨-2(GㆍIL-2) 및도 3의 발현벡터로부터 발현된 인간 글루카곤 유사체를 포함하는 융합파트너를 이용하여 융합단백질 형태로 발현된 인간 인터루킨-2(GβㆍIL-2)의 알칼리 용해공정(pH 8->12->8) 후 용해된 응집체들의 웨스턴 블럿 분석(Western blot analysis) 결과를 나타낸 것이다.

레인 1 : IL-2

레인 2 : GㆍIL-2

레인 3 : GβㆍIL-2

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자가결합성이 강한 인간 글루카곤 의 유사 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하여 목적 단백질을 형질전환 미생물로부터 불용성 응집체의 형태로 생산한 후 이를 알칼리성 용액으로 쉽게 용해시켜 목적 단백질을 저분자량의 올리고머 형태로 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 인간 글루카곤 유사체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터가 형질전환된 형질전환 미생물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 자가결합성이 강한 인간 글루카곤의 유사 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하여 목적 단백질을 형질전환 미생물로부터 불용성 응집체의 형태로 생산한 후 이를 알칼리성 용액으로 쉽게 용해시켜 목적 단백질을 저분자량의 다량체 형태로 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법은

1) 목적단백질에 글루카곤 유래 폴리펩타이드가 융합된 불용성 응집체 형태의 융합단백질을 제조하는 단계;

2) 상기 불용성 응집체 형태의 융합단백질을 알칼리성 용액에 용해시켜 수용성 응집체를 제조하는 단계; 및

3) 상기 용액의 pH를 중성으로 복원하여 상기 수용성 응집체를 재활성화시키는 단계를 포함한다.

본 발명자들은 바람직한 실시예로서 상기 제조방법에 따라 인간 인터루킨-2를 인간 글루카곤 유사체를 포함하는 융합파트너를 이용하여 발현시켰다. 상기에서, 글루카곤 유래 폴리펩타이드는서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드인 것이 바람직하다. 이와같이 제조된 재조합 인간 인터루킨-2 융합단백질은 형질전환 미생물에 의해 생산된 전체 단백질 총량의 30∼40%를 차지하여 융합파트너 없이 인간 인터루킨-2만을 직접 발현시킬 때 보다 발현율이 현저하게 향상되었으며, 외래단백질이 포함된 불용성 응집체의 형태로 생산되었다. 상기 불용성 응집체는 알칼리성 용액에서 대량으로 쉽게 용해되기 때문에, 인터루킨-2를 단독 발현시켰을 때 생산되는 불용성 응집체를 변성제나 환원제에 용해시킨 후 리폴딩(refolding)과정을 거쳐 재활성화시켜야 하는 것과는 달리 알칼리 용해공정만으로도 재활성 재조합 단백질을 얻을 수 있어 리폴딩의 문제점을 극복할 수 있다. 이러한 특징은 N-말단에 결합된 융합파트너의 역할로 인해 응집체를 이루는 재조합 단백질 분자 상호간의 결합양식이 다이설파이드 결합에서 동일 분자들간의 소수성 결합으로 변환되었기 때문이다.

또한, 알칼리 용해공정에 의한 수용성화된 재조합 단백질은 110 kDa 정도의 균일한 분자량 분포를 이루는 저분자량 올리고머(low molecular-weight oligomer)의 형태로 얻어지는데, 이는 글루카곤 C-말단의 소수성 아미노산 잔기(F22, W25,L26)가 모두 글라이신(glycine)으로 치환된 글루카곤 유래 유사체가 융합파트너로 이용됨으로써 재조합 단백질이 응집될 때 저분자량 단계에서 쉽게 안정화되기 때문인 것으로 판단된다.

또한, 본 발명은 융합파트너를 이용하여 목적 단백질을 불용성 응집체 형태로 생산하기 위하여, 인간 글루카곤 유사체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

상기 재조합 발현벡터는

1) 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, 이하 "PCR"로 약칭함)으로 증폭하여 유전자 단편을 얻는 단계(단계 1);

2) 인간 글루카곤 유래 유사체 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 PCR로 증폭하여 유전자 단편을 얻는 단계(단계 3);

3) 단계 2의 인간 글루카곤 유래 유사체의 유전자 단편을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

4) 단계 1의 유전자 단편을 단계 3의 발현벡터 내에 포함되어 있는 인간 글루카곤 유래 유사체의 유전자 단편의 5'-말단 부분에 삽입하여 목적 단백질을 융합단백질 형태로 발현하는 재조합 벡터를 제조하는 단계(단계 4)에 의해 제조된다.

본 발명자들은 바람직한 실시예로서 인간 글루카곤 유래 유사체 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하여 인간 인터루킨-2를 목적 단백질로 생산하는 재조합 발현벡터를 제조하였다.

구체적으로, 단계 1의 인간 인터루킨-2를 코딩하는 유전자는서열번호 1및서열번호 2로 기재되는 시발체를 이용하여 인터루킨-2 생산균주의 플라스미드 DNA로부터 PCR로 증폭하였다.

단계 2의 발현벡터는 lac, trp, tac, pL, T3, T7, SP6, SV40 및 λ(pL/pR) 등의 적당한 프로모터를 갖는 벡터로서 본 발명자들은 T7 프로모터를 갖는 벡터에 단계 1의 인간 인터루킨-2 유전자 단편을 직접 삽입하였다.

단계 3의 글루카곤은 29개의 아미노산으로 구성된 α-나선 구조를 가지고 있는 펩타이드로서 대장균 내에서 안정적으로 발현되는 분자량 3.5 kDa 크기의 펩타이드 호르몬이다. 더우기, 글루카곤은 특유의 α-나선 구조를 안정하게 유지하기 위하여 소수성 결합에 의해 스스로 올리고머를 형성하는 자가결합성향이 강하기 때문에 융합파트너로서 효과적으로 이용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명자들은서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 인간 글루카곤 유래 유사체를 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하여 인간 인터루킨-2의 재조합 단백질을 생산하였다

상기 인간 글루카곤 유래 유사체를 포함하는 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 [Gβ펩타이드]-[폴리히스티딘 서열 (His 6)]의 순으로 구성된 융합파트너 Gβ로서, 상기 폴리히스티딘 서열은 금속 친화성을 나타내고 낮은 pH에서는 히스티딘이 양전하를 띄는 성질을 가지고 있어, 상기 융합파트너를 이용하여 생산된 융합단백질은 금속 킬레이트 수지(metal chelating resin) 및 양이온 교환수지(cation ion exchange resin) 등을 이용하여 용이하게 분리·정제될 수 있다.

또한, 상기 융합파트너의 단백질에는 코돈을 맞추기 위한 폴리펩타이드 혹은절단효소의 인식부위를 포함하는 폴리펩타이드가 링커(linker)로 이용될 수 있다. 본 발명자들은 상기 융합파트너 Gβ의 C-말단부위에 엔테로키나제(enterokinase) 절단부위인서열번호 11로 기재되는 Asp Asp Asp Asp Lys(DDDDK, 이하 "D4K"라 약칭함)를 포함하는 폴리펩타이드를 링커로 사용하였다.

아울러, 상기 융합파트너의 C-말단에 엔테로키나제 절단부위가 첨가된 폴리펩타이드 융합파트너 Gβ-D4K를 코딩하는 DNA 단편은 lac, trp, tac, pL, T3, T7, SP6, SV40 및 λ(pL/pR) 등의 적당한 프로모터를 갖는 벡터에 직접 삽입되거나, 상기 DNA 단편에 이들 프로모터와 리보좀 결합부위(ribosome binding site)를 갖는 DNA 단편을 결합시킨 후 다양한 플라스미드에 삽입하여 벡터 시스템을 구축할 수 있다.

단계 4의 재조합 발현벡터는 인간 글루카곤 유래 유사체의 아미노산 서열과 엔테로키나제 절단부위(D4K)를 포함하는 융합파트너의 유전자 단편을 단계 2의 발현벡터 내 인터루킨-2 유전자의 5'-말단에 삽입시킨 것으로써 인터루킨-2를 상기 D4K 서열을 포함하는 융합단백질의 형태로 발현한다.

상기 재조합 발현벡터에 의해 생산된 인간 인터루킨-2 융합단백질은 융합파트너에 부착된 히스티딘 서열에 의해 금속 킬레이드 수지 또는 양이온 교환수지 등에 의해 용이하게 분리·정제될 수 있으면 분리·정제과정에서 엔테로키나제 절단효소의 처리에 의하여 융합파트너가 제거된 인간 인터루킨-2 단백질만을 분리할 수 있어 분리·정제과정을 단순화하여 제조공적으로부터 목적 단백질의 회수를 용이하게 할 수 있다.

아울러, 본발명은 상기 재조합 발현벡터가 형질전환되어 목적 단백질을 융합단백질 형태로 생산하는 형질전환 미생물을 제공한다.

본 발명자들은 바람직한 실시예로서 상기 인간 글루카곤 유사체를 융합파트너로 이용하여 인터루킨-2를 발현하는 재조합 발현벡터를 하나한(Hanahan, D.,DNA Cloning,1, 109-135, IRS press, 1985,)의 방법에 따라 대장균 세포에 도입하여 대장균 형질전환체를 제조하고 이를 생명공학연구소 유전자은행에 2000년 7월 13일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 0830BP).

상기 형질전환된 재조합 대장균을 적당한 배양 조건에서 배양하여 인터루킨-2를 포함하는 융합단백질을 생산할 수 있으며, 배양된 세포를 라이소자임 소화(lysozyme digestion), 동결융해, 초음파 파쇄 또는 프렌치 프래스(French press) 등으로 처리한 후 원심분리나 여과를 통해 상기 융합단백질을 함유하는 세포 파쇄액을 얻을 수 있다. 상기 인간 인터루킨-2 융합단백질은 세포 파쇄액의 용해, 초여과, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과, 전기영동 및 친화성 크로마토그래피 등의 일반적인 정제방법을 통해 분리될 수 있으며, 분리된 융합단백질은 적당량의 엔테로키나제 처리에 의하여 융합파트너가 제거된 인터루킨-2 단백질만을 얻을 수 있다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 인터루킨-2를 직접 발현하는 재조합 발현벡터의 제조

본 발명자들은 형질전환 미생물로부터 인터루킨-2를 안정적으로 대량생산하는 발현 시스템을 제조하기 위하여, 생명공학 연구소 유전자은행으로부터 분양받은 인터루킨-2 생산균주(KCTC 8258P)의 플라스미드 pNKM21을 이용하였다. 상기 인터루킨-2 생산균주는 천연형 인터루킨-2의 유전자에서 125번째 아미노산인 시스테인(cysteine)이 세린(serine)으로 치환되어 있는 변형된 인터루킨-2 유전자를 가지고 있으며 상기 변형된 인터루킨-2 유전자가 PL 프로모터에 의해 발현이 조절되는 플라스미드 pNKM21을 포함하고 있다.

인터루킨-2 유전자를 확보하기 위하여, 상기 인터루킨-2 생산균주로부터 플라스미드 DNA를 분리한 후 이를 주형으로 하여서열번호 1로 기재되는 pNIL 및서열번호 2로 기재되는 pHIL 시발체 쌍을 이용하여 133개의 아미노산 서열을 암호화하는 인터루킨-2 유전자를 PCR 방법으로 증폭하였다.

PCR은 DNA 중합효소 반응용 완충용액(50 mM KCl; 20 mM Tris-HCl(pH 8.0); 2 mM MgCl₂)에 0.25 mM dNTPs, 주형 DNA 100 ng, 각각의 시발체 50 pmol을 혼합한 후 Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase, TaKara)를 이용하여 수행하였다. PCR 반응조건은 95℃에서 5분 동안 가열하여 변성시킨 후 95℃, 30초(denaturation), 55℃, 30초(annealing), 72℃, 60초(elongation)의 반응을 30회 반복하고 최종적으로 72℃에서 10분 동안 증폭하였다. PCR이 종료된 후 증폭된 DNA를 1% 아가로오즈 겔(agarose gel)에 전기영동하여 411 bp 위치에서 밴드가 검출되는 것을 확인하였다. 겔로부터 상기 위치의 밴드를 잘라낸 후 겔 추출 키트(Qiagen Gel extraction kit)를 이용하여 겔로부터 증폭된 DNA를 정제하였다. 이와같이 준비된 DNA를 제한효소 NdeI과 HindIII로 각각 처리하여 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖도록 한 후 상기 DNA를 발현벡터인 pT7-7의 제한효소 NdeI과 HindIII 위치에 삽입하여 인터루킨-2를 직접 발현(direct expression)하는 재조합 발현벡터를 제조하고 이를 pT7IL-2라 명명하였다(도 1).

<실시예 2> 인간 글루카곤 또는 유사체의 유전자를 융합파트너로 이용하여 인터루킨-2를 발현하는 재조합 발현벡터의 제조

<2-1> pGIL-2 플라스미드의 제조

인간 글루카곤 유전자 단편을 확보하기 위하여, DNA 합성기를 이용하여 제조된 글루카곤 유전자를 주형으로 하여서열번호 3으로 기재되는 GND1 및서열번호 4로 기재되는 GXXb1 시발체 쌍을 이용하여 상기 실시예 1의 반응조건으로 PCR을 수행하여 글루카곤 유전자 단편을 증폭하였다.

PCR이 종료된 후 증폭된 DNA를 2% 저-융점 아가로오즈 겔(low-melting agarose gel)에 전기영동하여 99 bp에서 밴드가 검출됨을 확인하고 겔로부터 상기 위치의 밴드를 잘라낸 후 실시예 1과 동일한 방법으로 겔로부터 증폭된 DNA를 정제하였다. 이와같이 정제된 DNA를 제한효소 NdeI과 XbaI로 각각 처리하여 5' 말단에NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 XbaI 제한효소 부위를 갖도록 한 후 발현벡터인 pT7-7의 제한효소 NdeI과 XbaI 위치에 삽입하여 발현벡터를 제조하였고 이를 pT-G라 명명하였다

상기와 같이 확보된 글루카곤 유전자에 인터루킨-2 유전자를 융합시키기 위하여, 실시예 1에서 제조된 발현벡터 pT7IL-2에 삽입되어 있는 인터루킨-2 유전자를 주형으로 하는 PCR을 수행하여 인터루킨-2 유전자 단편을 증폭하였다.

첫 번째 PCR 반응은서열번호 5로 기재되는 시발체 HD4K 및서열번호 2로 기재되는 시발체 pHIL를 이용하여 상기 실시예 1과 동일한 반응조건에서 수행하였고, 두 번째 PCR 반응은서열번호 6으로 기재되는 시발체 HDX1 및서열번호 2로 기재되는 시발체 pHIL을 이용하여 상기와 동일한 반응조건에서 첫 번째 PCR 반응에 의해 증폭된 DNA를 주형으로 이용하여 인터루킨-2 유전자를 증폭하였다. 증폭된 DNA는 1% 아가로오즈 겔에서 전기영동을 수행하여 411 bp에서 밴드가 검출되는 것을 확인하였고 실시예 1과 동일한 방법으로 겔로부터 증폭된 DNA를 정제하였다. 이와같이 정제된 DNA를 제한효소 XhoI과 HindIII로 각각 처리하여 5' 말단에 XhoI 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖도록 한 후 상기에서 제조된 발현벡터 pT7-G의 제한효소 XhoI과 HindIII 위치에 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하였고 이를 pGIL-2라 명명하였다(도 2).

<2-2> pGβIL-2 플라스미드의 제조

인간 글루카곤 유래 유사체 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하여 인간 인터루킨-2를 생산하는 발현 시스템을 제조하기 위하여, 글루카곤 유전자에 인터루킨-2 유전자를 융합시킨 상기 <2-1>의 발현벡터 pGIL-2를 주형으로 하는 PCR을 수행하여 융합파트너를 포함하는 GβIL-2 단편을 증폭하였다.

첫 번째 PCR 반응은서열번호 7로 기재되는 시발체 T7P 및서열번호 9로 기재되는 시발체 GG3-2을 이용하여 상기 실시예 1과 동일한 반응조건에서 수행하였고, 이로부터 증폭된 DNA 단편-1을 2% 저-융점 아가로오즈 겔에 전기영동하여 확인한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 정제하였다. 두 번째 PCR 반응은서열번호 8로 기재되는 시발체 GG3-1 및서열번호 2로 기재되는 시발체 pHIL을 이용하여 PCR 반응을 수행한 후 상기와 동일한 방법으로 DNA 단편-2을 확보하였다. 세 번째 PCR 반응은 상기와 같이 확보된 DNA 단편-1 및 단편-2를 각각 주형으로 하고 T7P/pHIL 시발체 쌍을 이용하여 인간 글루카곤 유래 유사체 폴리펩타이드를 융합파트너로 포함하는 GβIL-2 DNA 단편을 증폭하였다. 이와같이 증폭된 GβIL-2 DNA 단편을 1% 아가로오즈 겔에서 전기영동하여 531 bp 위치에서 밴드가 검출됨을 확인하였고, 겔로부터 상기 위치의 밴드를 잘라내어 실시예 1과 동일한 방법으로 겔로부터 증폭된 DNA를 정제하였다.

상기 GβIL-2 DNA 단편은서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 인간 글루카곤 유래 유사체 폴리펩타이드를 융합파트너로 포함한다. 상기 인간 글루카곤 유래 유사체를 포함하는 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 [Gβ펩타이드]-[폴리히스티딘 서열 (His 6)]의 순으로 구성된 융합파트너 Gβ로서, 금속 친화성을 나타내고 낮은 pH에서는 양전하를 띄는 성질을 가지는 히스티딘을 포함하고 있어 상기 융합파트너를 이용하여 생산된 융합단백질은 금속 킬레이트 수지(metal chelating resin) 및 양이온 교환수지(cation ion exchange resin) 등을 이용하여 용이하게 분리·정제될 수 있다. 또한, 상기 융합파트너의 단백질에는 코돈을 맞추기 위한 폴리펩타이드 혹은 절단효소의 인식부위를 포함하는 폴리펩타이드가 링커(linker)로 이용될 수 있다. 본 발명자들은 상기 융합파트너 Gβ의 C-말단부위에 엔테로키나제(enterokinase) 절단부위인서열번호 11로 기재되는 Asp Asp Asp Asp Lys(DDDDK, 이하 "D4K"라 약칭함)를 포함하는 폴리펩타이드를 링커로 사용하였다.

이와같이 증폭된 GβIL-2 DNA 단편을 제한효소 NdeI과 HindIII로 각각 처리하여 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖도록 한 후 발현벡터 pT7-7의 제한효소 NdeI과 HindIII 위치에 삽입하여 인간 글루카곤 유사체를 융합파트너로 이용하여 인터루킨-2를 발현하는 재조합 발현벡터를 제조하고 이를 pGβIL-2 라 명명하였다(도 3).

<실시예 3> 대장균 형질전환체의 제조

실시예 2의 재조합 발현벡터 pGβIL-2가 형질전환된 대장균 형질전환체를 제조하기 위하여, 실시예 1 내지 2에서 제조된 발현벡터 pT7IL-2, pGIL-2 및 pGβIL-2 등을 하나한이 기술한 방법(Hanahan D.,DNA Cloning,1, 109-135, IRS press, 1985)에 따라 대장균 BL21(DE3)(Studier, F. A. and Moffatt, B. A., 113-130,1986)에 형질전환시킨 후 앰피실린(amphicillin)이 포함된 배지에서 배양하여 상기 발현벡터가 형질전환되어 앰피실린 저항성을 나타내는 콜로니를 선별하였다.

상기와 같이 선별된 인간 글루카곤 유사체를 융합파트너로 이용하여 인터루킨-2를 발현하는 재조합 발현벡터 pGβIL-2가 형질전환된 대장균 형질전환체 BL21(DE3)/pGβIL-2를 생명공학연구소 유전자은행에 2000년 7월 13일자로 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0830BP).

<실시예 4> 세포 배양액으로부터 불용성 응집체의 분리

상기 실시예 3으로부터 선별된 고생산성 대장균 형질전환체를 100 mg/L 앰피실린이 첨가된 LB 배지에 배양하여 얻은 세포 배양액을 6,000 rpm에서 원심분리하여 배양액과 균체로 분리한 후 균체 침전물만을 회수하였다. 회수된 대장균체 침전물을 증류수로 현탁한 후 초음파 파쇄기를 이용하여 파쇄하였다. 이와같이 분리한 파쇄액을 5,000 g에서 10분 동안 원심분리하여 상등액과 침전물로 분리한 후 각각을 SDS-PAGE(14% Tris-Glycine gel)로 분석하여 재조합 단백질의 발현을 확인하였다. 재조합 단백질의 불용성 응집체는 0.5% Triton X-100으로 2회 세척하여 분리한 후필요한 분석을 수행하였다.

<실험예 1> 불용성 응집체의 알칼리성 용해도 측정

상기 실시예 3의 재조합 형질전환체로부터 생산된 불용성 단백질을 동결건조 방법으로 건조시키고 pH 12의 알칼리성 용액에 최종농도가 50 ㎎/㎖이 되도록 현탁하였다. 상기 시료를 동일한 pH 12 알칼리성 용액을 이용하여 순차적으로 2배씩 희석하면서 각각의 재조합 형질전환체로부터 생산된 불용성 단백질의 용해도(solubilization)를 조사하였다. 각각의 희석단계마다 5,000 g, 10분 동안 원심분리하여 시료를 상등액과 침전물로 분리한 후 브래드포드(Bradford) 정량방법을 이용하여 상등액 내 존재하는 각각의 단백질 양을 정량하고 하기수학식 1에 의해 용해도를 판정하였다. 침전물 내 단백질의 양은 침전물을 다량의 pH 12 알칼리성 용액으로 다시 용해시킨 후 정량하였다.

<수학식 1>

도 4에서 보듯이, 인터루킨-2를 직접 발현하는 발현벡터 pT71L-2가 형질전환된 재조합 형질전환체로부터 생산된 단백질 응집체에 비하여 인간 글루카곤 유사체 폴리펩타이드를 포함하는 융합파트너와 함께 인터루킨-2를 발현하는 재조합 발현백터 pGβ1L-2가 형질전환된 재조합 형질전환체로부터 생산된 단백질 응집체의 용해도가 훨씬 향상되었음을 알 수 있다. 인간 글루카곤 유사체를 포함하는 융합파트너 Gβ를 이용한 경우에는 1 g/L의 단백질 응집체 농도에서도 100%에 가까운 용해도를 나타내었다. 이와같이, 인간 글루카곤 유사체를 포함하는 융합파트너를 이용하여 재조합 형질전환체로부터 생산된 단백질 응집체는 변성제 또는 환원제를 전혀 이용하지 않으면서 단순히 pH 변화에 의해 다량으로 용해될 수 있어 불용성 단백질 응집체의 대량 생산시 분리·정제과정을 용이하게 할 수 있다. 또한, pH 12의 알칼리성 용액에서 쉽게 용해된 재조합 불용성 단백질 응집체는 용액의 pH를 약 8까지 다시 내림으로써 재활성화될 수 있어 기존의 리폴딩시 제기되는 문제점을 극복할 수 있다.

<실험예 2> 알칼리 용해공정을 거친 재조합 단백질의 다량체 형성 특성

상기 실험예 1과 같이 알칼리 용해공정을 거친 후 수용성 재조합 단백질의 다량체 형성정도를 조사하기 위하여, 각 응집체 내 단백질들을 native-PAGE(14% Tris-Glycine gel)로 분리한 후 웨스턴 블럿(Western blot) 분석을 수행하였다. 1차 항체로는 마우스에서 유래한 항 인터루킨-2 단일항체 IgG1(anti-interlukin-2 monoclonal antibody, Biosource, USA)을 이용하였고, 2차 항체로는 알칼라인 인산화효소(alkaline phosphatase)가 부착된 염소 유래의 항 마우스 항체 IgG(anti-mouse antibody) (Santa Cruz, USA)가 사용되었다.

그 결과, 인간 인터루킨-2를 직접 발현(direct expression)하는 재조합 벡터에 의해 생성된 재조합 단백질 응집체 또는 천연형 인간 글루카곤이 융합된 발현벡터에 의해 생성된 재조합 단백질 응집체는 거대 분자량의 다량체(multimer)를 형성하고 있으나, 인간 글루카곤 유사체 Gβ펩타이드가 융합된 재조합 발현벡터에 의해 생성된 재조합 인간 인터루킨-2는 분자량이 크게 감소함과 동시에 균일한 분자량분포를 나타내었다(도 5). 이와같이 인간 글루카곤 유사체인 Gβ펩타이드가 융합된 재조합 단백질의 분자량을 젤 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)를 수행하여 분석해 본 결과, 분자량이 약 110 kDa인 것으로 측정되었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 인간 글루카곤 유래의 유사 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용함으로써 재조합 인간 인터루킨-2를 형질전환 미생물로부터 안정적으로 발현시키는 제조방법을 제공한다. 본 발명의 제조방법에 의해 생성된 재조합 인간 인터루킨-2 융합단백질은 일반적으로 생성되는 불용성 응집체가 변성제나 환원제에 용해된 후 다시 리폴딩 과정을 거쳐야 활성화되는 것과는 달리 알칼리성 용액에서 다량이 쉽게 용해되는 특성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 제조방법은 알칼리 용해공정을 거친 후 재조합 융합단백질을 저분자량의 올리고머(oligomer) 형태로 용해시키기 때문에 융합단백질의 비활성도(specific activity: 단위 질량 당 수용체 결합활성)를 증가시키는 공정개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (9)

1) 목적단백질에서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 글루카곤 유래 폴리펩타이드가 융합된 불용성 응집체 형태의 융합단백질을 제조하는 단계;

2) 상기 불용성 응집체 형태의 융합단백질을 알칼리성 용액에 용해시켜 수용성 응집체를 제조하는 단계; 및

3) 상기 용액의 pH를 중성으로 복원하여 상기 수용성 응집체를 재활성화시키는 단계를 포함하는, 글루카곤 유래 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하여 재조합 단백질을 제조하는 방법.

삭제

제 1항에 있어서, 단계 1의 목적 단백질은 인간 인터루킨-2인 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 2의 알칼리성 용액은 pH 12인 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 1의 융합단백질은 목적단백질과 글루카곤 유래 폴리펩타이드 사이에 폴리히스티딘 서열(His6)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 1의 융합단백질은 목적단백질과 글루카곤 유래 폴리펩타이드 사이에서열번호 11로 기재되는 엔테로키나제 절단부위가 포함된 펩타이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 글루카곤 유래 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하여 인간 인터루킨-2를 융합단백질 형태로 발현하는 pGβIL-2 재조합 발현벡터.

제 7항에 있어서, 융합파트너는 엔테로키나제 절단부위 및 히스티딘 결합부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.

제 7항의 재조합 발현벡터가 형질전환된 대장균 형질전환체(수탁번호 : KCTC 0830BP).