DE69218948T2

DE69218948T2 - IGF-I zur Verbesserung der neuronale Lage

Info

Publication number: DE69218948T2
Application number: DE69218948T
Authority: DE
Inventors: Peter Gluckman; Karoly Nikolics
Original assignee: Auckland Uniservices Ltd; Genentech Inc
Current assignee: Auckland Uniservices Ltd; Genentech Inc
Priority date: 1991-08-01
Filing date: 1992-08-03
Publication date: 1997-07-31
Anticipated expiration: 2012-08-04
Also published as: EP0597033A1; DK0597033T3; EP0597033B1; GR3023874T3; DE69218948D1; ES2101865T3; ATE151293T1; US5714460A; WO1993002695A1; USRE43982E1; CA2114251A1; CA2114251C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von IGF-1 und/oder einem biologisch aktiven Analogon von IGF-1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Schädigung des Zentralnervensystems, die Gliazellen oder andere nicht-cholinerge Zellen betrifft.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Nach asphyktischen, traumatischen, toxischen, infektiösen, degenerativen, metabolischen, ischämischen oder hypoxischen Schädigungen des Zentralnervensystems (ZNS) eines Menschen kann ein gewisser Schädigungsgrad bei mehreren verschiedenen Zelltypen resultieren. Beispielsweise wird periventrikuläre Leukomalazie, eine Läsion, welche die periventrikulären Oligodendrozyten betrifft, im allgemeinen als Folge einer hypoxisch-ischämischen Schädigung des sich entwickelnden Gehirns eines Frühgeborenen angesehen (Bejar et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 150:357-363 (1988); Sinha et al., Arch. Dis. Child., 65:1017-1020 (1990); Young et al., Ann. Neurol., 12:445-448 (1982)). Ferner sind in den meisten Kortexregionen von Primaten (Mesulam et al., Neurosci., 12:669-686 (1984)) und Ratten (Brownstein et al., in Handbook of Chemical Neuroanatomy Classical Transmitters in the CNS, Bjorklund et al., Hrsg., Elsevier, Amsterdam, S.23-53 (1984)) keine cholinergen neuronalen Zellkörper vorhanden. Eine Schädigung der Großhirnrinde durch Trauma, Asphyxie, Ischämie, Toxine oder Infektion tritt häufig auf und kann sensorische, motorische oder kognitive Defekte verursachen. Gliazellen, nicht-neuronale Zellen im ZNS, sind für die normale ZNS-Funktion erforderlich. Infarkte sind eine Hauptkomponente einer hypoxisch-ischämisch induzierten Schädigung und der Verlust von Gliazellen stellt eine wesentliche Komponente der Infarktbildung dar.
Erkrankungen des ZNS können auch einen Verlust spezifischer Zellpopulationen verursachen. Beispielsweise ist Multiple Sklerose mit einem Verlust an Myelin und Oligodendrozyten assoziiert, auf ähnliche Weise ist die Parkinson-Krankheit mit einem Verlust dopaminerger Neuronen assoziiert. Einige Fälle, in denen eine ZNS-Schädigung oder -Erkrankung zu einem überwiegenden Verlust von Gliazellen oder anderen nichtcholinergen Zelltypen oder zu Infarktbildung führen kann, umfassen: perinatale Asphyxie in Verbindung mit einem fötalen Gefahrenzustand wie nach Abreißen oder Verschluß der Nabelschnur oder assoziiert mit intrauteriner Wachstumshemmung; perinatale Asphyxie, die mit unzureichender Reanimation oder Atmung assoziiert ist; schwerwiegende ZNS-Schädigungen, die mit beinahe eingetretenem Ertrinkungstod, beinahe eingetretenem plötzlichen Kindstod, Kohlenmonoxidinhalation, Vergiftung mit Ammoniak oder anderen Gasen, Herzstillstand, Kollaps, Koma, Meningitis, Hypoglykämie und Status Epilepticus verbunden sind; Perioden zerebraler Asphyxie, die mit einem Herz-Bypass-Eingriff verbunden sind; zerebrale Anoxie oder Ischämie, die mit Schlaganfall, hypotensiven Perioden und hypertensiven Krisen verbunden sind; Gehirntrauma.
Es gibt viele andere Fälle, in denen eine ZNS-Schädigung oder -Erkrankung Gliazellen und nicht-cholinerge Neuronen des ZNS schädigen kann. Es ist wünschenswert, die Schädigung in diesen Fällen zu behandeln. Es ist auch wünschenswert, das Ausmaß der ZNS-Schäden, welche als Ergebnis induzierter zerebraler Asphyxie in Situationen wie einem Herz-Bypass-Eingriff erfahren werden können, zu verhindern oder zu verringern. Bisher gab es im Stand der Technik keinen Hinweis auf die Anwendung von Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) zur Verhinderung oder Behandlung einer ZNS-Schädigung oder -Erkrankung, welche zu Infarktbildung oder einem Verlust von Gliazellen und anderen nicht-cholinergen Nervenzellen in vivo führt.
1FG-1 ist ein Polypeptid, das natürlicherweise in Flüssigkeiten des menschlichen Körpers, z.B. Blut und Human-Hirnflüssigkeit, vorkommt. Die meisten Gewebe, und insbesondere die Leber, produzieren IGF-1 zusammen mit spezifischen IGF-bindenden Proteinen. Die IGF-1-Produktion steht unter dem dominierenden stimulierenden Einfluß des Wachstumshormons (GH) und einige der IGF-1-bindenden Proteine werden durch GH ebenfalls erhöht. Siehe Tanner et al., Acta Endocrinol., 84: 681-696 (1977); Uthne et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 39: 548-554(1974)). IGF-1 wurde aus Human-Serum isoliert und auf rekombinante Weise produziert. Siehe beispielsweise EP 123,228 und 128,733.
Es wurden verschiedene biologische Aktivitäten von IGF-1 identifiziert. Beispielsweise senkt IGF-1 Berichten nach die Blutglukose-Spiegel bei Menschen. Guler et al., N. Engl. J. Med., 317:137-140 (1987). Ferner fördert IGF-1 das Wachstum in verschiedenen metabolischen Zuständen, die durch niedrige IGF-1-Spiegel gekennzeichnet sind, wie z.B. bei hypophysektomierten Ratten (Skottner et al., J. Endocr., 112: 123- 132 (1987), diabetischen Ratten [Scheiwiller et al., Nature, 323: 169-171(1986)] und Zwergratten [Skottner et al., Endocrinology, 124: 2519-2526(1989)]. Das Nierengewicht von hypophysektomierten Ratten erhöht sich nach anhaltenden subkutanen Injektionen von IGF-1 wesentlich. Guler et al., Proceedings of the 1st European Congress of Endocrinology, 103: Abstract 12-390 (Kopenhagen, 1987). Die Nieren von Snell- Zwergmäusen und Zwergratten verhielten sich ähnlich. Van Buul-Offers et al., Pediatr. Res. 20: 825-827 (1986); Skottner et al., Endocrinology, supra. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit für IGF-1 ist die Verbesserung der glomerulären Filtration und des renalen Plasmaflusses. Guler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2868-2872 (1989). Die anabole Wirkung von IGF-1 bei schnellwachsenden neugeborenen Ratten wurde in vivo demonstriert. Philipps et al., Pediatric Res., 23: 298 (1988). Bei unterernährten, gestressten, kranken oder geschwächten Tieren sind die IGF-1-Spiegel bekanntermaßen erniedrigt.
Man nimmt an, daß IGF-1 eine parakrine Rolle beim sich entwickelnden und reifen Gehirn spielt (Werther et al., Mol. Endocrinol., 4:773-778(1990)). In vitro-Studien weisen darauf hin, daß IGF-1 ein potentes unselektives trophisches Agens für mehrere Neuronentypen im ZNS ist (Knusel et al., J. Neurosci., 10(2):558-570 (1990); Svezic und Schubert, Biochem. Biophys. Res. Commun., 172(1):54-60 (1990)), einschließlich dopaminerger Neuronen (Knusel et al., J. Neurosci., 10(2):558-570 (1990)) und Oligodendrozyten (McMorris und Dubois, J. Neurosci. Res., 21:199-209 (1988); McMorris et al., PNAS, USA, 83:822-826 (1986); Mozell und McMorris, J. Neurosci. Res., 30:382-390 (1991)). Verfahren zur Erhöhung der Überlebensrate cholinerger Neuronenzellen durch die Verabreichung von IGF-1 wurden beschrieben (Lewis et al., US-Patent Nr.5,093,317 (erteilt am 3. März 1992).
IGF-1-Rezeptoren sind im ZNS weit verbreitet (Bohannon et al., Brain Res., 444:205-213 (1988); Bondy et al., Neurosci., 46:909-923 (1992)) und treten sowohl auf Gliazellen (Kiess et al., Endocrinol., 124:1727-1736 (1989) als auch Neuronen (Sturm et al., Endocrinol., 124:388-396 (1989)) auf. Diese Rezeptoren vermitteln die anabolen und somatogenen Wirkungen von IGF-1 und besitzen eine höhere Affinität für IGF-1 als Insulin (Hill et al., Neurosci., 17:1127-1138 (1986); Lesniak et al., Endocrinol., 123:2089-2099(1988)). Ab 3 Tagen nach einer Schädigung werden stark erhöhte Niveaus an IGF-1 insbesondere im sich entwickelnden ZNS erzeugt (Gluckman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 182(2);593-599 (1992); Yamaguchi et al., Neurosci. Lett., 128:273-276 (1991)). Die Wirkung von IGF-1 bei Verabreichung nach einer Schädigung als zentrales Neuroprotektivum (Gluckman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 182(2);593-599 (1992) (siehe Experimente A und B) legen einen Wirkungsmodus nahe, der eine Störung der aktivierten Prozesse, die zum Zelltod führen, beinhaltet. Endogener und exogener IGF- 1 stimulieren die periphere Nervenregeneration (Karje et al., Brain Res., 486:396-398 (1989). Es ist gezeigt worden, daß IGF-1 die Ornithindecarboxylase- Aktivität in normalen Rattengehirnen erhöht (US-Patent Nr.5,093,317).
Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Medikaments (einer therapeutischen Zusammensetzung) zur Behandlung oder Verhinderung von ZNS- Schäden, welche(s) die vorgenannten Ziele mindestens teilweise in einer einfachen, aber wirkungsvollen Weise erreicht oder der Öffentlichkeit mindestens eine nützliche Wahl bietet.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von IGF-1 und/oder einem biologisch aktiven Analogon von IGF-1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Schädigung des Zentralnervensystems, die Gliazellen oder andere nicht-cholinerge Zellen betrifft.
Insbesondere wird die Konzentration von IGF-1 im ZNS des Patienten erhöht.
Der Ausdruck "behandeln", wie hier verwendet, bezieht sich darauf, daß eine Verminderung der Schwere der ZNS-Schäden bewirkt wird durch eine Verringerung von Infarkten und des Verlusts von Gliazellen und nicht-cholinergen Neuronenzellen, die nach einer ZNS-Schädigung erlitten werden. Er umfaßt die Minimierung solcher Schäden nach einer ZNS-Schädigung.
Vorzugsweise werden IGF-1 und/oder Analoga davon dem Patienten direkt verabreicht.
Alternativ kann eine Verbindung verabreicht werden, welche nach der Verabreichung an den Patienten die aktive Konzentration von IGF-1 oder natürlich vorkommenden Analoga von IGF-1 im ZNS des Patienten erhöht. Beispielsweise können positiv regulierende bindende Proteine von IGF-1 oder natürlich vorkommenden Analoga davon verabreicht werden.
Vorzugsweise wird das Medikament im Zeitraum vom Zeitpunkt der Schädigung bis 100 Stunden nach der ZNS-Schädigung verabreicht und noch bevorzugter 0,5 bis 8 Stunden nach der ZNS-Schädigung.
In einer ersten Form wird, vorzugsweise, der IGF-1 und/oder ein Analogon oder Analoga davon, das oder die aus der Gruppe aus IGF-2, verkürztem IGF-1 (des-1-3- IGF-1), Analoga von IGF-2 und synthetischen Analoga von IGF-1 ausgewählt ist bzw. sind, durch laterale zerebroventrikuläre Injektion in das Gehirn eines Patienten in der Zeitspanne vom Zeitpunkt der ZNS-Schädigung bis einschließlich 8 Stunden nachher verabreicht.
In einer weiteren bevorzugten Form wird der IGF-1 und/oder ein Analogon oder Analoga davon, das oder die aus der Gruppe aus IGF-2, verkürztem IGF-1 (des-1-3- IGF-1), Analoga von IGF-2 und synthetischen Analoga von IGF-1 ausgewählt ist bzw. sind, durch einen chirurgisch eingeführten Shunt in die Hirnkammer eines Patienten in der Zeitspanne vom Zeitpunkt der ZNS-Schädigung bis einschließlich 8 Stunden nachher verabreicht.
In einer weiteren bevorzugten Form der vorliegenden Erfindung wird IGF-1 und/oder ein Analogon oder Analoga davon, das oder die aus der Gruppe aus IGF-2, verkürztem IGF-1 (des-1-3-IGF-1), Analoga von IGF-2 und synthetischen Analoga von IGF-1 ausgewählt ist bzw. sind, peripher einem Patienten verabreicht zur Passage in die laterale Gehirnkammer in der Zeitspanne vom Zeitpunkt der ZNS-Schädigung bis einschließlich 8 Stunden nachher. Vorzugsweise ist es IGF-1 selbst, der mittels lateraler Gehirnkammerinjektion oder mit Hilfe des chirurgisch eingeführten Shunts verabreicht wird.
Vorzugsweise wird das Medikament entsprechend dem Schädigungsmuster oder der nach einer ZNS-Schädigung verstrichenen Zeit verabreicht.
Vorzugsweise beträgt der verabreichte Dosisbereich etwa 0,1 bis 1000 µg an IGF- 1 oder Analogon oder der Verbindung, welche dessen Konzentration erhöht, pro 100 g Körpergewicht.
IGF-1 kann allein oder in Verbindung mit anderen Medikamenten oder Wachstumsfaktoren eingesetzt werden, welche dazu bestimmt sind, dem Verlust von ZNS- Zellen wie Gliazellen und nicht-cholinergen Neuronen entgegenzuwirken.
"Verhinderung" bedeutet eine Verminderung der Schwere der ZNS-Schäden, die nach einer ZNS-Schädigung erlitten werden, und kann auch eine Hemmung der Symptome von ZNS-Schäden einschließen.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von IGF- 1 und/oder Analoga davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von ZNS- Schäden.
Alternativ umfaßt die Erfindung die Verwendung einer Verbindung, welche nach Verabreichung an einen Patienten die aktive Konzentration von IGF-1 und/oder natürlich vorkommenden Analoga davon im ZNS des Patienten erhöht, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer ZNS-Schädigung.
Die Erfindung besteht auch in einem Medikament, welches zur Behandlung von nach einer ZNS-Schädigung erlittenen ZNS-Schäden geeignet ist, umfassend IGF-1 und/oder Analoga davon, gegebenenfalls in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel bereitgestellt.
Das Medikament zur Behandlung von ZNS-Schäden kann auch eine Verbindung umfassen, welche nach Verabreichung an den Patienten, der unter ZNS-Schäden leidet, die aktive Konzentration von IGF-1 und/oder natürlich vorkommenden Analoga davon im ZNS des Patienten erhöht.
Obwohl die vorliegende Erfindung im vorstehenden breit definiert ist, wird es für Fachleute auf diesem Gebiet ersichtlich sein, daß sie nicht darauf beschränkt ist, sondern Ausführungsformen umfaßt, von denen die Beschreibung Beispiele gibt.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Zeichnungen wird zu einem besseren Verständnis der Erfindung führen:
Figur 1 zeigt Kompositzeichnungen (A-D), welche die Verteilung von IGF-1- mRNA, IGF-1-Peptid und BP-3-mRNA nach schwerer ischämischer Hypoxie darstellen; und
Figur 2 ist ein Histogramm, welches den Neuronenverlust für IGF-1-behandelte Ratten und Kontrollratten im Versuch 1 erläutert, worin 20 µg IGF-1 2 Stunden nach ischämischer Hypoxie verabreicht wurden,
Figur 3 zeigt die Infarktrate nach einer Behandlung mit 50 µg IGF-1 2 Stunden nach der Hypoxie. [Das Auftreten von Infarkten war nach der Behandlung mit 5-50 µg IGF-1 verringert, *p< 0,05, **p< 0,01],
Figur 4 zeigt regionale Neuronenverlustwerte nach einer Behandlung mit 0-50 µg IGF-1 [der Gesamtneuronenverlust war nach 50 µg vermindert (p (0,01)],
Figur 5 ist ein Vergleich regionaler Neuronenverlustwerte nach einer Behandlung mit äquimolaren Konzentrationen an Insulin, IGF-1 und Vehikel 2 Stunden nach der Schädigung (IGF-1 verbesserte das Ergebnis im Vergleich zu Insulin (p (0,05)),
Figur 6 zeigt die Infarktrate nach einer Behandlung mit äquimolaren Dosen an Insulin, IGF-1 oder Vehikel 2 Stunden nach der Schädigung [IGF-1 verringerte die Infarktrate im Vergleich zum Vehikel (p (0,05)],
Figur 7 zeigt die Wirkung der Verabreichung von 20 µg IGF-1, die 1 Stunde vor der Hypoxie gegeben wurden (die Behandlung änderte das Ergebnis nicht signifikant), und
Figur 8 zeigt die Wirkung der Behandlung mit IGF-1 hinsichtlich der Wiederherstellung der Kortextemperatur. Diese Messungen wurden während und nach der Hypoxie der geschädigten Hemisphäre durchgeführt. Die Behandlung änderte die Gehirntemperatur nicht signifikant.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von IGF-1 und/oder einem biologisch aktiven Analogon von IGF-1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Schädigung des Zentralnervensystems, die Gliazellen oder andere nicht-cholinerge Zellen betrifft. Beispielsweise kann der Patient eine perinatale Asphyxie oder eine mit einem Schlaganfall verbundene Asphyxie oder zerebrale Ischämie oder andere nichtbeschränkende Beispiele von ZNS-Schädigungen erlitten haben, die oben beschrieben wurden. In diesen Fällen ist es wünschenswert, die Symptome der ZNS-Schäden zu vermindern oder zu eliminieren.
Die ZNS-Schäden können beispielsweise gemessen werden durch den Grad des permanenten neurologischen Defekts der kognitiven Funktion und/oder der Neigung zu Krampf-auslösenden Störungen.
Es wird vorgeschlagen, daß die Konzentration an IGF-1 und/oder Analoga davon im ZNS und insbesondere im Gehirn des Patienten erhöht werden sollte, um die ZNS- Schäden zu behandeln. Dementsprechend können IGF-1 und/oder Analoga davon dem Patienten direkt verabreicht werden. IGF- 1 bedeutet Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor 1. Analoga von IGF-1 bedeuten Verbindungen, welche eine ähnliche biologische Wirkung wie IGF-1 ausüben und umfassen IGF-2 und Analoga von IGF-2 (IGF-2 übt bekanntermaßen einige ähnliche biologische Wirkungen wie IGF-1 aus), natürlich vorkommende Analoga (z.B. des-1-3-IGF-1) oder eines der bekannten synthetischen Analoga von IGF- 1. Diese Verbindungen können von Menschen oder anderen Lebewesen staimen. IGF- 1 und Analoga können aus natürlichen Quellen gereinigt oder mittels rekombinanter DNA- Techniken hergestellt werden. Rekombinanter IGF-1 und des-1-3-IGF-1 sind im Handel erhältlich.
Alternativ können Verbindungen verabreicht werden, welche nach Verabreichung an den Patienten die aktive Konzentration von IGF-1 und/oder natürlich vorkommenden Analoga davon im ZNS erhöhen. "Aktive Konzentration" bedeutet die biologische Konzentration von IGF-1 und/oder Analoga im ZNS des Patienten, welche in der Lage ist, eine Wirkung auf die ZNS-Schäden auszuüben. Beispielsweise können positiv regulierende Bindungsproteine von IGF-1 eingesetzt werden, um die aktive Konzentration von IGF-1 zu erhöhen. Die IGF-1-bindenden Proteine 1 bis 3 (IGF-1-BP-1-3) können beispielsweise die Konzentration von IGF-1 im ZNS unter geeigneten Bedingungen erhöhen.
IGF-1, Analoga davon und Verbindungen, welche dessen/deren aktive Konzentrationen erhöhen, können zentral oder systemisch verabreicht werden. Wünschenswerterweise werden die Verbindungen dem ZNS des Patienten direkt verabreicht. Dementsprechend können die Zusammensetzungen direkt an das Gehirn oder die Hirnflüssigkeit durch Techniken verabreicht werden, welche lateral ventrikuläre Punktur durch eine Nahtöffnung oder Stirnfontanelle, Lumbal- oder Zisternen-Punktur oder dgl. umfassen.
Auf Wunsch kann eine Kombination der Verbindungen verabreicht werden. Ferner können sie erneut mit anderen Agentien oder Wachstumsfaktoren, z.B. transformierendem Wachstumsfaktor ß (TG-ß), verabreicht werden.
Die folgenden Experimente zeigen, daß die Expression von IGF-1 nach einer neuralen Schädigung einem bestimmten Zeitverlauf folgt und in bestimmten Gebieten des Körpers stattfindet. Dementsprechend sollten die Zusammensetzungen entsprechend dem Muster der ZNS-Schädigung und der nach einer Schädigung verstrichenen Zeit verabreicht werden, um die wunschenswertesten Ergebnisse zu erzielen. Die Zusammensetzungen können direkt dem Bereich des Körpers verabreicht werden, wo die größten ZNS- Schäden aufgetreten sind.
Die Zusammensetzungen können beispielsweise etwa 0,5 bis 100 Stunden nach einer Schädigung verabreicht werden. Es kann nur eine Behandlung erforderlich sein. Alternativ kann der Patient eine wiederholte Behandlung erhalten.
Ein geeigneter Dosisbereich kann beispielsweise zwischen etwa 0,1 bis 1000 µg an IGF-1 und/oder Analoga oder Verbindungen, welche dessen/deren Konzentrationen erhöhen, pro 100 g Körpergewicht liegen, wenn die Zusammensetzung zentral verabreicht wird.
Die Erfindung betrifft auch ein Medikament zur Behandlung einer ZNS-Schädigung. Das Medikament kann IGF-1 und/oder Analoga davon oder eine Verbindung umfassen, welche die Konzentration von IGF-1 im ZNS erhöht, wie z.B. IGF-1-bindende Proteine 1 bis 3 oder eine Mischung davon. Die Verbindungen werden wunschenswerterweise in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel bereitgestellt, wie im Stand der Technik bekannt. IGF-1, IGF-2, Analoga und Verbindungen, welche desssen/deren Konzentration erhöhen, können nach rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden, wie z.B. im neuseeländischen Patent Nr.208339 offenbart, wenn die jeweiligen DNA-Sequenzen bekannt sind. Alternativ können die Verbindungen aus natürlichen Quellen isoliert werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden experimentellen Daten gestützt. In den folgenden Studien wurde festgestellt:
1) IGF-1 wird nach einer ZNS-Schädigung mit einem bestimmten Zeitverlauf in bestimmten Gebieten der Schädigung exprimiert.
2) Anderungen der ZNS-Spiegel von IGF-1 können die als Folge einer Schädigung des ZNS resultierenden ZNS-Schäden ändern.
3) IGF-1, der nach einer Schädigung des ZNS verabreicht wurde, verbessert das Ergebnis, wohingegen vor einer Schädigung verabreichter IGF-1 das Ergebnis nicht verschlechterte. So hängt die Wirkung der Behandlung mit IGF-1 vom zeitlichen Zusammenhang mit der Schädigung ab.
21 Tage alte Ratten wurden einer einseitigen Karotis-Ligatur mit nachfolgender Inhalationsasphyxie unter definierten Bedingungen unterworfen, um entweder leichten oder schweren Neuronenverlust mit Infarktbildung auf der unterbundenen Seite zu erzeugen.
Leichter oder schwerer Neuronenverlust wurde bei 21 Tage alten Ratten wie folgt induziert: Die rechte Karotis-Artene wurde unter leichter Halothan-Narkose unterbunden. Sie wurden dann in einem Inkubator mit 34ºC und 85 % Luftfeuchtigkeit untergebracht. Die eingeatmeten Gase wurden durch 8% O&sub2; in Stickstoff für 15 Minuten (leicht) oder 90 Minuten (schwer) ersetzt, dann wurde zu Luft zurückgekehrt. Zu verschiedenen Zeiten nach der Hypoxie (1 h, 5 h, 3 und 5 Tage) wurden die Tiere mit Pentobarbitol (Nembutal) narkotisiert, die Gehirne entfernt und auf Trockeneis zur in-situ-Hybridisierung schnell gefroren. Zur Histologie wurden die Ratten 5 Tage nach der Hypoxie getötet und dann mit 0,9% Salzlösung, gefolgt von Formaldehyd-Essigsäure-Methanol (1:1:8), perfundiert.
Zu definierten Zeitpunkten nach der Asphyxie wurden die Ratten für die Histologie getötet. Nach 90-minütiger Asphyxie war (schwerer) Neuronenverlust, Bewertung durch Thionin/saures-Fuchsin-Anfärbung, im unterbundenen Kortex weit verbreitet. Es gab schweren Neuronenverlust und Infarktbildung im Gebiet der mittleren Hirnarterie, einschließlich des lateralen Kortex, Hippocampus, Striatum und Thalamus. Die in-situ- Hybridisierungs-Histochemie erfolgte unter Verwendung einer Maus-IGF-1-cDNA- Sonde, welche von einem genomischen Klon erhalten wurde, der die gesamte Sequenz für Exon 3 umfaßt.
Die Hybridisierungs-Histochemie erfolgte wie an anderer Stelle beschrieben in McCabe, J.T., Morrell, J.L., Ivel, R., Schmale, H. Richter, D. Pfaff, D.W. In situ hybridization technique to localise rRNA and mRNA in mammalian neurons, 3. Histochem. Cytochem. 34(1986)45-50; Smith, M., Auer, R., Siesjo, B., The density and distribution of ischemic brain injury in the rate following 2-10 min of forebrain ischemia, Ann. Neuropathol. 64 (1984) 319-332; Mathews, L.S. Norstedt, G., Palmiter, R.D. (1986) Regulation of insulin-like growth factor 1 gene expression by growth hormone, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9343-9347; Lowe, W.L.Jr., Roberts, C.T. Jr., Lasky, S.R. Leroith, D. (1987) Differential expression of alternative 5'untranslated regions in mRNAS encoding rat insulin-like growth factor I, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8946-8950.
Nach der Hybridisierung wurden die Schnitte viermal in 2xSSC plus 10 mM ß- Mercaptoethanol bei Raumtemperatur jeweils 10 Minuten gewaschen, viermal in 2xSSC bei Raumtemperatur für jeweils 10 Minuten, zweimal in 2xSSC bei 50ºC für jeweils 15 Minuten und zweimal in 0,2xSSC bei 50ºC für jeweils 10 Minuten. Zum Nachweis von IGF-1-MRNA wurde eine 830bp lange mIGF-1-DNA-Sonde, erhalten aus einer genomischen Mausmilz-DNA-Bank, eingesetzt. Die Sonde umfaßt die gesamte Sequenz des Exons 3 (182 bp). Die Maus-IGF-1-Sonde war eine großzügige Gabe von Dr. P. Rotwein, Department International Medicine, Washington University, (St. Louis, Missouri 63110). Für den IGFBP-1-mRNA-Nachweis wurde ein 364 bp-Fragment von hIGFBP- 1 eingesetzt, welches die Sequenz für den größten Teil des C-Terminus des Proteins und einen kleinen Teil der 3'-flankierenden Sequenz enthielt. Die hIGFBP-1-Sonde war eine großzügige Gabe von Dr. D.R. Clemmons, Department Medicine University North Carolina in Chapel Hill (Chapel Hill, North Carolina 27599-7170, USA). Zum Nachweis von IGFBP-3-mRNA wurde eine hIGFBP-3-cDNA vollständiger Länge von etwa 2,6 kb eingesetzt, welche großzügig von Dr. S.K. Spratt (Biogrowth Inc., Richmond, Kalifornien 94806, USA) überlassen worden war. Kontrollen wurden durchgeführt unter Verwendung von RNAse A (40 µg/ml 0,5M NaCl/20 mM Tris 7,5/1mM EDTA bei 37ºC). Eine Vorbehandlung mit RNAse unterdrückte das Signal fast vollständig. Northern-Blots mit jeder Sonde offenbarten die erwarteten Banden bei 7,4, 1,9 und 1,7-1,1 kb für IGF-1, eine einzelne Bande für IGFBP-3 bei 2,6 kb, die Hauptbande für BP-1 lag bei 1,7 kb.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Figur 1 dargestellt.
Das resultierende Signal zeigte eine Induktion der IGF-1 MRNA nach 72 Stunden. Die Induktion war in erster Linie auf die unterbundene Seite beschränkt und war nach 5 Tagen am ausgeprägtesten im lateralen Kortex, Hippocampus, Striatum, Thalamus und pyriformen Kortex (siehe Figur 1).
In Figur 1 stellt die rechte Hemisphäre immer die geschädigte Seite dar. Die Teilbilder A und B zeigen Diagrammdarstellungen der Verteilung von mRNA für IGF- 1(A) und IGFBP-3 (B) 72 und 120 Stunden nach der Asphyxie. 21 Tage alte Ratten wurden einer einseitigen Karotis-Ligatur plus 90-minütiger Inhalationsasphyxie unter Standardbedingungen unterworfen. Die in-situ-Hybridisierung wurde mit 12 µm-Schnitten unter Bedingungen mäßig hoher Stringenz durchgeführt (siehe oben).
Das Teilbild C zeigt die anti-MGF-1-Immunhistochemie 120 Stunden nach der Asphyxie. Die IGF-1-Immunhistochemie wurde wie folgt durchgeführt: Das eingesetzte Antiserum (878/4) wurde gegen rec-n-met-hIGF-1 induziert und wies eine Kreuzreaktion mit IGF-2 von < 1 % auf. Der IGP-1 wurde nach immunozytochemischen Standardverfahren nachgewiesen. Für Doppelmarkierungsreaktionen inkubierten wir erst Hirnschnitte mit Kaninchen-Anti-hIGF-1 und entwickelten diese Reaktion mit dem Chromogen Diaminobenzedin, welches ein braunes Reaktionsprodukt ergibt. Dann wurden nach einem Waschschritt die Schnitte mit monoklonalen Antikörpern gegen saures Gliafibrillenprotein (GFAP, Amersham) inkubiert und diese zweite Reaktion wurde mit dem Chromogen Benzidin-Dihydrochlorid sichtbar gemacht, welches ein blaues Reaktionsprodukt ergibt. Mit diesem Verfahren stellten wir fest, daß IGF-1-positive Zellen auch GFAP-positiv und somit Astrozyten waren. Die Färbung wurde durch vorherige Absorption mit hlgf-1 deutlich herabgesetzt.
Teilbild D ist eine starke Vergrößerung des Teilbilds C. Es zeigt den Hippocampus- Bereich der geschädigten Seite. Astrozyten-ähnliche Zellen (Pfeile), wie durch GFAP- Doppelmarkierung (nicht gezeigt) bestätigt, exprimieren IGF-1 nach der Schädigung. Die Vergrößerungen sind in den Teilbildern angegeben.

SCHLÜSSEL:

DG =Gyrus dentatus
LC = lateraler Kortex
Pu = Putamen
Th = Thalamus.
Die Spezifität der Induktion wurden demonstriert durch eine überwiegend einseitige Expression auf der unterbundenen Seite, geringerer Induktion bei Tieren, die einer geringeren Schädigung unterworfen worden waren, und durch negative Kontrollen unter Verwendung von RNAse A. Die Sonde wurde auch dazu verwendet, um gegen einen Northern-Blot von Rattenleber-Poly(A)'-RNA-Proben zu hybridisieren. Die Banden, welche nach der Hybridisierung mit der MIGF-1-Sonde nachgewiesen wurden, stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten [S. Shimasasi, A. Koba, M. Mecado, M. Shimonasa, N. Ling, Biochem. Biophys. Res. Comm. 165,907 (1989)] überein.
Die Immunhistochemie erfolgte unter Verwendung eines polyklonalen Anti-MGF- 1-Kaninchenantiserums. Zellen, die eine Färbung für IGF-1 ergaben, konnten auf beiden Seiten des Großhirns identifiziert werden, jedoch war die Intensität der Färbung in der geschädigten Region der unterbundenen Hemisphäre beträchtlich größer. Diese Färbung war bei GFAP-positiven Astrozyten zu sehen (siehe Figur 1).
Im Kreislauf und innerhalb von Geweben ist IGF-1 gewöhnlich mit spezifisch bindenden Proteinen assoziiert. Die Hirnflüssigkeit weist relativ hohe Konzentrationen des spezifisch IGF-2 bindenden Proteins IGFBP-2 auf, jedoch geringe Niveaus der IGF-1- bindenden Proteine IGFBP-3 oder IGFBP-1 [L. Tseng, A. Brown, Y. Yang, J. Romanus, C. Orlowski, T. Taylor, M. Rechler, Mol Endo 3, 1559 (1989); CSF BPs and BPs in general].
Obwohl die Bedeutung dieser bindenden Proteine nach wie vor umstritten ist, ändern sie eindeutig die biologische Verfügbarkeit und Antwort auf IGF-1 in spezifischer Weise. Nachdem ferner IGFBP-1 und IGFBP-3 unabhängig reguliert werden, ist es wahrscheinlich, daß sie eine unterschiedliche biologische Bedeutung haben. Die Expression von IGFBP- 3 und IGFBP-1 wurde unter Anwendung von in-situ-Hybridisierungs-Histochemie untersucht. Im Gehirn von Kontrollratten (21 Tage p.p.) war keine IGFBP-3-mRNA nachweisbar. Nach der hypoxisch-ischämischen Schädigung war ein Signal für die IGFBP- 3-mRNA in der geschädigten Region 72 Stunden nach der Schädigung sichtbar und maximal nach 120 Stunden. Die Induktion war auf den lateralen Kortex, das Striatum und den Gyrus dentatus beschränkt. Keine Induktion war beim kontralateralen Kortex zu sehen.
Im Gegensatz dazu legen vorläufige Daten eine niedrige Expression von IGFBP- 1-mRNA in der kontralateralen Hemisphäre kurz nach der Schädigung (+1 h) nahe. Keine IGFBP-1-mRNA konnte bei den Kontrollen oder zu irgendwelchen anderen bisher untersuchten Zeitpunkten nach der Hypoxie festgestellt werden.
Diese Daten legen nahe, daß nach einer hypoxisch-ischämischen Schädigung IGF- 1 in Astrozyten induziert wird, insbesondere im Gebiet der Schädigung, und ein verändertes Milieu an bindenden Proteinen mit einem größeren Verhältnis von BP-3 zu BP-1 vorliegt.
Es ist die Auffassung vertreten worden, daß die primäre Form von IGF-1 im ZNS eine verkürzte Form mit einem fehlenden N-terminalen Tripeptid ist [V. Sara, C. Carlsson- Skwirut, T. Bergman, H. Jorvall, P. Roberts, M. Crawford, L. Hakansson, L. Civalero, A. Nordberg, Biochem. Biophys. Res. Comm. 1965, 766 (1989); des 1-3 IGF-1). Man nimmt an, daß dieses verkürzte IGF-1 durch eine unterschiedliche Spaltung aus Pro- IGF-1 gebildet wird. Der eingesetzte Antikörper unterscheidet des-1-3-IGF-1 nicht von IGF-1. Des-1-IGF-1 bindet wenig an IGFBP-1, behielt jedoch die Bindung an IGFBP- 3 so ziemlich bei. Es ist von Interesse, daß die von uns beobachteten Änderungen mit diesem Bindungsprofil kompatibel sind und nahelegen, daß IGF-1, der mit IGFBP-3 komplexiert ist, im Gehirn nach einer Asphyxie eine besondere Rolle spielen könnte.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. Diese Beispiele dienen nur zur Erläuterung und sollen die Erfindung in keiner Weise beschränken. Alle Patent- und Literaturreferenzen, welche in der Beschreibung zitiert werden, sind ausdrücklich mit eingeschlossen.

BEISPIEL 1

Das Ziel dieser Studien war die Beurteilung der Wirkungen einer Verabreichung von IGF-1 nach einer ZNS-Schädigung. Es wurden erwachsene Ratten (200-300 g) eingesetzt. Die Experimente beinhalteten die Behandlung der Ratten mit IGF-1 vor und nach einer ZNS-Schädigung. Diese Ratten wiesen eine hypoxisch-ischämische Schädigung einer Hirnhemisphäre auf, welche nach einem Standardverfahren induziert worden war. Eine Karotis-Artene war unterbunden und das Tier 2 Stunden später für einen definierten Zeitraum einer Inhalationshypoxie unterworfen worden. Das Ausmaß, die Länge der Hypoxie, die Umgebungstemperatur und Luftfeuchtigkeit wurden festgelegt, um den Schädigungsgrad zu standardisieren. Sie wurden 5 Tage später getötet für eine histologische Analyse unter Verwendung von Farbstoffen (saures Fuchsin), die für nekrotische Neuronen spezifisch sind.
Bei solchen Experimenten ist der Zelltod typischerweise auf die Seite der arteriellen Ligatur beschränkt und findet sich hauptsächlich im Hippocampus, Gyrus dentatus und lateralen Kortex der unterbundenen Hemisphäre.

VERSUCH A

Eine einseitige hypoxisch-ischämische Schädigung wurde bei erwachsenen (300 ± 10 g) männlichen Wistar-Ratten induziert. Die Ratten wurden einer einseitigen Karotis- Ligatur unter leichter Halothan-Narkose unterworfen. Nach einer Stunde Erholung wurden sie in einem Inkubator bei 31 ºC und 85 ± 5 % Luftfeuchtigkeit 1 Stunde lang vor der Schädigung untergebracht. Sie wurden 10-minütiger Inhalationsasphyxie (FiO2 6,0%) unterworfen und nach der Asphyxie 1 Stunde lang im Inkubator gehalten.
Zwei Stunden nach Beendigung der Inhalations-Schädigung wurde eine einzelne stereotaxisch kontrollierte laterale zerebroventrikuläre Injektion von entweder 20 µg rekombinantem Human-IGF-1 oder künstlicher Hirnflüssigkeit (CSF) gegeben.
Rekombinanter MGF-1 oder Verdünnungsmittel wurden hergestellt und gewichtsmäßig übereinstimmenden Paaren wie folgt verabreicht: Zwei Stunden nach der Asphyxie wurde den Ratten ein leichtes Halothan-Narkotikum gegeben, diese in einen stereotaxischen Rahmen eingebracht und eine einzelne ICV-Injektion von entweder 10 µl CSF (n= 14) oder 10 µl CSF plus 20 µg IGF-1 (n= 14) gegeben. Rekombinanter hIGF- 1 (Genentech, South San Francisco) wurden in dem CSF-Verdünnungsmittel, das 0,1M Essigsäure umfaßte, mit 200 µg/10 µl gelöst. Diese Lösung wurde neunfach mit 0,15M PBS (phosphatgepufferter Salzlösung) verdünnt, was einen pH von 7,3 ± 0,5 ergab.
Die Tiere wurden dann 120 Stunden so gehalten, narkotisiert und die Tiere in situ mit Formaldehyd-Essigsäure-Methanol (1:1:8) für die histologische Beurteilung fixiert.
Überlebende und tote Neutronen wurden mit Hilfe einer Thioninisaures-Fuchsin- Färbetechnik unterschieden [C. Williams, A. Gunn, C. Mallard, P. Gluckman Ped. Res., (1990). A. Brown, J. Brierley, J. Neurol. Sci. 16, 59-84 (1971)].
Der Grad der erlittenen neuralen Schäden wurde quantifiziert, indem der Neuronenverlustwert gemessen wurde. Die Neuronenverlustwerte sind der Durchschnitt der anfälligen Regionen des Hippocampus und Kortex. 100% entspricht einem Totalverlust an Neuronen, 0% entspricht keinem Verlust.
Der Prozentsatz an toten Neuronen wurde von zwei unabhängigen Beobachtern abgeschätzt, wobei es sich für einen davon um einen Blindversuch handelte. Die Korrelation zwischen den von den beiden Beobachtern erhaltenen Werten betrug r=0,92, p 0,0001. Die Wirkung der Behandlung wurde bewertet mit MANOVA, gefolgt von paarweisen Vergleichen jeder Region unter Anwendung von Fisher's "Least-Significant- Difference"-Verfahren. Die Behandlung verringerte den Neuronenverlust (p< 0,01). Der Neuronenverlust war im Gyrus dentatus und lateralen Kortex (*p< 0,05) verringert. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen IGF-1- und CSF-behandelten Gruppen für die folgenden physiologischen Parameter: Masse, Alter, venöse Glukose- und Laktat- Konzentrationen und mittlere Kortextemperatur während der Hypoxie.
Die Ergebnisse sind in Figur 2 dargestellt. Die IGF-1-Therapie verringerte das Ausmaß des Neuronenabsterbens in der unterbundenen Hemisphäre im Vergleich zu den CSF-behandelten Kontrollen. Die systemische Blutglukose änderte sich als Antwort auf die intrazerebrale IGF-1-Injektion nicht.
Eine einzelne zentrale Injektion von IGF-1 nach einer asphyktischen Schädigung der erwachsenen Ratte war mit einer deutlichen Verbesserung des histologisch festgestellten Ergebnisses verbunden. So werden in diesem Modell einer hypoxisch-ischämischen Enzephalopathie IGF-1 und IGFBP-3 im Bereich der Schädigung induziert und exogener IGF-1 verbessert bei intrazerebroventrikulärer Verabreichung das Ergebnis.

VERSUCH B

Aufgrund der potentiellen Anwendbarkeit dieser Therapien, die nach der Schädigung wirksam sind, wurden weitere Untersuchungen durchgeführt, um die Wirkungsweise und die Wirkungen von zentraler IGF-1- und Insulin-Behandlung nach einer hypoxischischämischen Schädigung zu klären. Diese wurden erstens durchgeführt, um die Dosis- Antwort-Charakteristiken der IGF-1-Behandlung zu bestimmen, zweitens, um festzustellen, ob die neuroprotektiven Wirkungen durch den Insulin- oder Typ 1-IGF-Rezeptor vermittelt wurden, und drittens, um die Beziehung zwischen der IGF-1-Verabreichung und dem Zeitpunkt der Schädigung zu klären. Die Wirkungen der IGF-1-Behandlung auf die Blutglukose und die Gehirntemperatur wurden ebenfalls bewertet.
Diese Studien wurden von dem Animal Ethical Committee der University of Auckland gebilligt. Erwachsene männliche Wistar-Ratten (52-66 Tage, 280-320 g) wurden unter 3 % Halothan/O&sub2;-Narkose vorbereitet. Die rechte Karotis-Artene wurde unterbunden. Eine Führungskanüle wurde auf der Dura 8,2 mm anterior des Bregma und 1,4 mm rechts von der Mittellinie plaziert. Bei ausgewählten Ratten wurde ein Temperatur-Transmitter (MINI-MITTER SM-FH-BP-Hirnsonde) 5 mm vom Bregma auf der Dura der unterbundenen Seite plaziert. Die Kanüle und der Transmitter wurden mit Zahnzement am Platz fixiert. Arterienblutproben wurden mittels einer linksseitigen Herzkammerpunktur vor der Ligatur erhalten und das Serum auf Glukose und Laktat mit einem 230Y-Glukose-Laktat- Analysator (Yellow Springs Instrument Co., Inc., Ohio) analysiert. Für die Gruppe der Behandlung vor der Schädigung wurde Vollblut für Glukose- und Laktat-Messungen eingesetzt. Den Ratten wurde 1 Stunde Erholung von der Narkose gestattet und wurden dann in einen Inkubator mit einer Luftfeuchtigkeit von 85 ± 5% und einer Temperatur von 31 ± 0,5 ºC 1 Stunde lang vor der Hypoxie untergebracht. Die Sauerstoffkonzentration wurde verringert und bei einer Hypoxie von 6 + 0,2% O&sub2; 10 Minuten lang gehalten. Die Ratten wurden nach der Hypoxie 2 Stunden im Inkubator gehalten. Eine zusätzliche Ratte mit einer Gehirntemperatur-Sonde war in jeder Gruppe eingeschlossen, um die Kortextemperatur von 1 Stunde vor der Schädigung bis 2 Stunden nach der Schädigung aufzuzeichnen. Intraventrikuläre Injektionen wurden mit 1µl/Minute unter 1,5% - 2% Halothan-Narkose durchgeführt. Die Ratten in jeder Behandlungsgruppe erhielten die Infusionen gleichzeitig. Die Ratten hatten während des Versuchs freien Zugang zu Nahrung und wurden 120 Stunden nach der Hypoxie mit einer Überdosis an Natriumpentobarbitol getötet. Das Hirn wurde für die histologische Analyse wie vorher beschrieben präpariert (Klempt et al. 1991). Kurz gesagt, wurde das Gehirn in situ mit FAM (Formaldehyd, Essigsäure, Methanol 1:1:8) perfündiert und dann in Paraffin eingebettet. Die Schnitte wurden mit Thionin und saurem Fuchsin gefärbt. Das Ausmaß des Neuronenverlusts wurde bestimmt wie bereits an anderer Stelle beschrieben (Klempt et al. 1991). Kurz gesagt, wurde dies mittels Lichtmikroskopie von zwei unabhängigen Bewertern durchgeführt, von denen einer keine Informationen über die Versuchsgruppierungen besaß. Der Prozentsatz an abgestorbenen Neuronen im Hippocampus, Kortex und Striatum wurde bei drei Schnitten von anterior zu posterior bewertet. Der Prozentsatz an abgestorbenen Neuronen wurde wie folgt bewertet: 0: < 10%; 2: 10- 50%, 3: 50-90%, 4: > 90%, 5: keine überlebenden Neuronen. Alle Gehirne wurden auch hinsichtlich der Anwesenheit oder Abwesenheit von Kortex-Infarkten, definiert als Bereich von totem Gewebe oder parenchymaler Pannekrose aufgrund des Absterbens von sowohl Gliazellen als auch Neuronen, bewertet. Ratten, die vor Versuchsende starben, wurden von der histologischen Analyse ausgeschlossen.
1) Dosis-Antwort: Zur Untersuchung der Dosis-Antwort für die IGF-1- Antwort wurden 16 Gruppen von 4 Ratten mit entweder 50, 5, 0,5 oder 0 µg (Vehikel) rekombinantem Human-IGF-1 (Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien 94080) behandelt. Der IGF-1 wurde in einem 20 µl-Bolus im Verlauf von 20 Minuten gegeben. Das Vehikel war 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) in 0,1M-Citrat, verdünnt mit Natriumbicarbonat und phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,3 ± 0,05. Die mittlere Kortextemperatur während der Hypoxie betrug 37,1 ± 0,3ºC. 7 Tiere starben, über alle Behandlungsgruppen verteilt. Die arteriellen Serumglukose- und Laktat- Konzentrationen wurden 1 Stunde nach der Infüsion für mit 50 µg IGF-1 und für mit Vehikel behandelte Tiere mit einem 230Y-Glukose-Laktat-Analysator (Yellow Springs Instrument Co., Inc., Ohio) gemessen.
2) Spezifität der Wirkung: Zum Vergleich der Wirkung von Insulin mit IGF- 1 wurden 18 Gruppen von drei Ratten entweder mit 20 µg IGF-1, 20 µ Insulin (Eli Lilly, Indianapolis, USA) oder Vehikel behandelt. Diese wurden in 10 µl im Verlauf von 10 Minuten 2 Stunden nach der Schädigung gegeben. Das Vehikel war 0,1M Essigsäure, verdünnt mit 0,1 % BSA, gelöst in 0,15M PBS: beide Hormone wurden auf ähnliche Weise verdünnt. Eine mit Vehikel behandelte Ratte starb.
3) Verabreichungszeit: Um die Wirkungen einer Verabreichung vor der Schädigung zu beurteilen, wurden 11 Paare von Ratten untersucht, die mit 20 µg rekombinantem Human-IGF-1 oder nur Vehikel behandelt worden waren. Diese wurden als 10 µl im Verlauf von 10 Minuten gegeben. Das Vehikel war 0,1M Essigsäure, verdünnt mit 0,15M PBS. Ein Tier starb während des Versuchs.
4) Gehirntemperatur-Aufzeichnungen: Die Temperatur des ipsilateralen Kortex wurde während der Hypoxie und für 20 Stunden danach in einer separaten Gruppe von 9 mit 20 µg IGF-1 behandelten und 9 mit Vehikel behandelten Ratten aufgezeichnet. IGF- 1 oder nur Vehikel wurde 2 Stunden nach der Hypoxie gegeben. Die Temperatur wurde kontinuierlich mittels telemetrischer Minimitter-Sonden gemessen, Durchschnittswerte berechnet und in 1-minütigen Intervallen gespeichert (Dale et al. 1989). Aufzeichnungen von 3 Ratten wurden aufgrund technischer Probleme verworfen.
5) Statistik: MANOVA, gefolgt von der Anwendung einer geschützten "Least- Significant-Difference"-Prozedur für nachträgliche Vergleiche, wurde zum Vergleich von Neuronenverlust und physiologischen Parametern der Gruppen eingesetzt. Die Neuronenverlustwerte wurden logarithmisch transformiert und wiederholt in dem Bereich gemessen. Die Infarktrate wurde unter Anwendung von Fisher's exaktem Test mit der Bonferroni-Korrektur für mehrfache Vergleiche verglichen. Die Ergebnisse sind als Mittelswert ± Standardfehler dargestellt.

Ergebnisse

1) Dosis-Antwort-Studie: Fünf Tage nach der Hypoxie war ein Neuronenverlust im Bereich der mittleren Zerebralarterie der unterbundenen Hemisphäre von Vehikelbehandelten Kontrollen weit verbreitet. Es lag umfangreicher Neuronenverlust und Infarktbildung innerhalb des lateralen Kortex, Hippocampus und Striatum vor. 5 bis 50 µg IGF-1 verringerten (p< 0,05) das Auftreten von Infarkten in dosisabhängiger Weise (Figur 3). In allen Bereichen der geschädigten Hemisphäre gab es eine dosisabhängige Verringerung des Neuronenverlusts (p< 0,01) (Figur 4). Eine Behandlung mit 50 µg IGF- 1 beeinflußte die Serumglukose-Konzentrationen (8,8 ± 0,2 mM/1) im Vergleich zu Vehikel-behandelten Kontrollen (8,7 ± 0,2 mM/1) bei einer Messung 1 Stunde nach der Infusion nicht.
2) Spezifität: Die IGF-1-Behandlung verbesserte das histologische Gesamtergebnis im Vergleich zu Insulin (p< 0,05) (Figur 5). Nur die IGF-1-Behandlung verringerte die Infarktrate (p< 0,05) (Figur 6).
3) Timing: Im Vergleich zur post-asphyktischen Verabreichung von 20 µg IGF- 1 beim vorhergehenden Experiment. Das histologische Ergebnis war bei den Vehikel- und IGF-1-Gruppen, die 1 Stunde vor der Hypoxie behandelt worden waren, nicht signifikant verschieden (Figur 7).
4) Gehirntemperatur: Die IGF-1-Behandlung (n=7) nach der Hypoxie veränderte die Kortextemperatur im Vergleich zu Vehikel-behandelten Kontrollen (n=8) nicht signifikant (Figur 8).
Tabelle 1 beschreibt den Status jeder Behandlungsgruppe vor der Schädigung.

Erörterung des Versuchs B

Typ-1-IGF-Rezeptoren treten im ZNS sowohl auf Neuronen als auch Gliazellen auf, mit der höchsten Dichte im Striatum und Kortex (Lesniak et al., 1988; Hill et al., 1986). Eine IGF-1-Behandlung verlängerte den Neuronenverlust in allen untersuchten Regionen. Diese Behandlung verringerte auch das Auftreten von Infarkten, was anzeigt, daß der Verlust an Gliazellen verringert wurde. Diese Ergebnisse stimmen mit in-vitro- Studien überein, welche darauf hinweisen, daß IGF-1 potente trophische unselektive Wirkungen auf Neuronen ausübt (Knusel et al., 1990). Insulin besitzt eine viel geringere Affinität für IGF-Rezeptoren und konkurriert mit IGF-1 nur bei 100-fach höheren Konzentrationen (Gilmour et al., 1988). Somit zeigen unsere Ergebnisse an, daß die neuroprotektiven Wirkungen über IGF-Rezeptoren stattfinden (siehe Figur 5). Es ist wahrscheinlich, daß die früher berichteten neuroprotektiven Wirkungen von Insulin über den IGF-Rezeptor vom Typ 1 stattfinden.
Es ist festgestellt worden, daß viele früher beschriebene neuroprotektive Strategien indirekt durch Induktion von Hypothermie wirksam sind (Buchan, Pulsinelli, 1990). Eine Erniedrigung der Kortextemperatur um nur 20 kann das Ergebnis verbessern (Bustom et al., 1987). Die IGF-1-Behandlung änderte die Kortextemperatur nicht, was diese Möglichkeit ausschließt (siehe Figur 8). IGF-1 ist bei einer systemischen Gabe in hohen Dosen, welche die IGF-bindenden Proteine sättigen, hypoglykämisch. Einige Studien legen nahe, daß Hyperglykämie das Ergebnis verschlechtern kann, indem die Laktat- Akkumulation erhöht wird, und es ist möglich, daß ein hypoglykämischer Effekt schützend sein kann. Jedoch änderte die zentrale IGF-Behandlung die systemischen Glukosekonzentrationen bei den eingesetzten Dosen nicht signifikant. Somit ist ein hypoglykämischer Mechanismus unwahrscheinlich.
IGF-1, der 1 Stunde vor der Hypoxie gegeben wurde, änderte das Ergebnis nicht (siehe Figur 7). Ratten-CSF wird etwa alle 2 Stunden umgesetzt und die Halbwertszeit von IGF-1 ist aufgrund von Aufnahme im Gewebe wahrscheinlich kurz. Die mangelnde Wirkung kann auf einen schnellen Umsatz von IGF-1 zurückzufähren sein, der wenig Aktivität nach der Schädigung zurückläßt. Es wird allgemein angenommen, daß die Wanderung von Peptiden aus der Gehirnflüssigkeit (CSF) in das Gehirnparenchym durch einfache Diffusion geschieht. Dieser Prozess führt zu sehr steilen (1000-fachen) Konzentrationsgradienten über relativ geringe Entfernungen von 1 mm in das Parenchym (Pardridge, 1991). Angesichts der stark unterschiedlichen Tiefen der Strukturen, welche durch die Behandlung beeinflußt werden, ist es unwahrscheinlich, daß sich IGF-1 nur durch einfache Diffüsion bewegt (siehe Figuren 4 und 5). Nachdem das asphyktische Gehirn das Expressionsmuster von IGF-bindenden Proteinen hinsichtlich einer erhöhten Expression von IGFBP-2 und BP-3 und einer Inhibierung von BP-1 ändert (Gluckman et al., 1992; Gluckman et al., 1991), ist es möglich, daß es die Expression von bindenden Proteinen ist, welche die Kinetik der IGF-Verteilung ändert.

TABELLE 1 - STATUS VOR DER SCHÄDIGUNG

Zusammenfassung der Experimente

Rekombinanter Human-IGF-1 (in diesen Experimenten in 0,5M Essigsaure mit 20 µg/10 µl gelöst, anschließend neunfach mit 0,15M phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt, um einen pH von etwa 7,3 zu ergeben), der in einer Einzeldosis in der Zeitspanne, die mit dem Zeitpunkt der ZNS-Schädigung oder -Verletzung beginnt, bis etwa 8 Stunden danach (und einschließlich eines Zeitpunkts von etwa 2 Stunden nach der neuralen Schädigung) verabreicht wurde, hat eine therapeutische Wirkung bei der Verringerung oder Eliminierung der Schwere der ZNS-Schäden, die nach einer neuralen Schädigung erlitten werden, gezeigt. IGF-1 ist besonders nützlich bei der Verringerung von Infarkten und des Verlusts von Gliazellen und nicht-cholinergen Neuronenzellen, der mit einer neuralen Schädigung verbunden ist.
Somit ist ersichtlich, daß mindestens bei den bevorzugten Formen der Erfindung ein Verfahren und/oder Medikament zur Behandlung von ZNS-Schäden bereitgestellt wird, welches imstande ist, die ZNS-Schäden im wesentlichen zu verhindern oder zu behandeln. Die ZNS-Schäden können mit Asphyxie, Hypoxie, Toxinen, Infarkten, Ischämie oder Trauma assoziiert sein. Es versteht sich, daß die Hauptanwendung der Erfindung Menschen betrifft. Jedoch ist die Brauchbarkeit der Erfindung nicht darauf beschränkt und die Behandlung anderer, nicht-menschlicher Lebewesen, insbesondere Säuger, wird ebenfalls von der Erfindung umfaßt.
Mit der vorliegenden Erfindung wird daher erkannt die Bedeutung der Verabreichung eines Medikaments, welches IGF-1 und/oder andere Verbindungen mit ähnlicher Wirkung umfaßt, an einen Patienten bei oder nach einer ZNS-Schädigung mit der Folge, daß die ZNS-Schäden minimiert werden durch Verhinderung der sonst resultierenden selbstinduzierten Schäden, die nach der Schädigung auftreten würden, d.h., sie betrifft nicht die Reparatur von Schäden, die bereits aufgetreten sind, sondern eine Behandlung bei oder nach der Schädigung, jedoch bevor die daraus folgenden Langzeitschäden auftreten, wodurch das Auftreten solcher Schäden minimiert wird.

Claims

1. Verwendung von IGF-1 und/oder einem biologisch aktiven Analogon von IGF-l zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Schädigung des Zentralnervensystems, die Gliazellen oder andere nicht-cholinerge Zellen betrifft.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Schädigung des Zentralnervensystems eine hypoxische Schädigung ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Schädigung des Zentralnervensystems eine ischämische Schädigung ist.

4. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Schädigung des Zentralnervensystems eine traumatische Schädigung ist.

5. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Schädigung des Zentralnervensystems nicht-cholinerge Nervenzellen betrifft.

6. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Schädigung des Zentralnervensystems Gliazellen betrifft.

7. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Schädigung des Zentralnervensystems eine Folge der Parkinson-Krankheit ist.

8. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Schädigung des Zentralnervensystems eine Folge von Multipler Sklerose ist.

9. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Schädigung des Zentralnervensystems eine Folge einer demyelinisierenden Störung ist.

10. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1-9, worin das IGF-1 und/oder biologisch aktive Analogon von IFG-1 in dem Zeitraum vom Zeitpunkt der Schädigung des Zentralnervensystems bis 100 Stunden nach der Schädigung verabreicht wird.

11. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1-10, worin das IGF-1 und/oder biologisch aktive Analogon von IGF-1 mindestens einmal in dem Zeitraum vom Zeitpunkt der Schädigung des Zentralnervensystems bis etwa 8 Stunden nachher verabreicht wird.

12. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1-11, worin das IGF-1 und/oder biologisch aktive Analogon von IGF- 1 einem Säuger in einer Menge von etwa 0,1 bis 1000 µg IGF-1 pro 100 g Körpergewicht des Säugers verabreicht wird.

13. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1-12, worin das biologisch aktive Analogon von IGF-1 aus Insulinähnlichem Wachstumsfaktor 2 (IGF-2) und verkürztem IGF-1 (des-1-3-IGF-1) ausgewählt ist.