CN101412985A - 用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基 - Google Patents

用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基 Download PDF

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本发明属于生物技术领域，为一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的、化学成分明确的无血清培养基。本发明通过在基础培养基中添加胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、***钠、生长因子、贴壁因子、激素、腐胺、无机盐、维生素、白蛋白和抗氧化剂，能使骨髓间充质干细胞在无血清条件下贴附于培养介质，实现体外培养和扩增，并维持多向分化的潜能，扩增后的细胞能够在体外诱导成成骨细胞和脂肪细胞。本发明的积极作用是，用本发明的无血清培养基生产的临床级别的人用细胞产品可有效地避免使用含血清培养基生产的细胞产品可能存在的风险。附图为采用本发明的无血清培养基培养骨髓间充质干细胞至汇合的照片。

Description

用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域的一种细胞培养基，尤其是一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基。
【背景技术】
骨髓间充质干细胞(MSCs)是骨髓基质的主要成份，为骨髓的造血功能提供结构和功能上的支持。目前的研究表明，骨髓间充质干细胞能够促进造血***的重建，具有有效的免疫调节功能，能够在体外抑制T-淋巴细胞增殖，延缓移植组织后出现的免疫排斥反应，还可以用于预防和治疗自体干细胞移植(ASCT)产生的移植物抗宿主疾病(GVHD)，避免在器官移植中产生免疫排斥反应，以及治疗自身免疫性疾病，如风湿性关节炎等。骨髓间充质干细胞具有多向分化的潜能，能够分化成多种细胞谱系，如成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、肝细胞、肾细胞、心肌细胞和神经细胞等等，因而可以通过组织工程技术进行组织修复和再生。由于骨髓间充质干细胞能够分化成多种细胞类型，并且免疫原性弱，因而可以作为组织工程理想的种子细胞来源。另外，骨髓间充质干细胞易于外源基因的转染和表达，可以广泛地应用于细胞治疗和基因治疗，具有十分广阔的应用前景。但是，骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极少，大约104～105个骨髓单核细胞中仅含有一个骨髓间充质干细胞，因此，仅仅通过自体或异体分离骨髓间充质干细胞显然无法满足临床需求，需要积极进行在体外培养和扩增骨髓间充质干细胞，以满足人们在应用上需求。
进行体外培养和扩增骨髓间充质干细胞(MSCs)通常需要在培养基中添加一定量(10％～20％)的胎牛血清，这曾被认为是培养骨髓间充质干细胞的最佳条件，且能较好地保持其生物学特性。
但是，使用动物血清具有两面性：一方面，动物血清能很好地支持细胞的生长：一是，血清中含有的大量的蛋白能够对细胞起到保护作用；二是，含有的微量元素和大量的营养成分能充实培养基以支持细胞的生长；三是，含有的多种细胞因子能促进细胞增殖；四是，还能为贴壁依赖细胞提供贴壁因子。
但在另一方面，对于动物血清生产的细胞产品，其生物安全性受到人们的普遍质疑：一是，由于各批次血清之间的成分差异较大，从而对细胞产品的稳定性产生影响；二是，成分不明确，大量的未知蛋白给研究工作带来极大的干扰；三是，更为严重的是，动物血清中可能含有由蛋白质构成的感染物和未知的动物传染病，在生产临床级别的人用细胞产品时，理论上会导致这些传染物的传播；四是，血清中的蛋白或肽可能在培养过程中被骨髓间充质干细胞整合，这样，当移植骨髓间充质干细胞时将导致宿主产生免疫反应。
为了克服动物血清在体外培养和扩增骨髓间充质干细胞(MSCs)时可能存在的缺陷，从20世纪九十年代起人们就开始了无血清培养骨髓间充质干细胞的研究。1995年，Donald等人开发了一种化学成分明确的无血清培养基RDM-F，用于体外扩增大鼠骨髓间充质干细胞。该培养基以60％DMEM-LG加40％MCDB-201为基础培养基，添加5μg/mL的胰岛素、0.1％(w/v)LA-BSA、10ng/mL PDGF-β β和1ng/mL bFGF，大鼠骨髓间充质干细胞在有血清培养基中贴壁完全后，更换成无血清培养基RDM-F进行培养[Lennon，D.P.，et al.，Exp Cell Res，219，p.211-222(1995)]。
Gronthos和Simmons等人以α-MEM为基础培养基，添加了10μg/mL牛胰岛素、2％(w/v)BSA、4μg/mL人低密度脂蛋白、200μg/mL饱和人转铁蛋白、2mmol/L L-谷氨酰胺、10nM***磷酸钠、100μM抗坏血酸(L-ascorbicacid2-phosphate，ASAP)，50μMβ-巯基乙醇[Gronthos，S.，Simmons，P.J.Blood，85，p.929-940(1995)]。
台湾长庚大学的刘继贤等人开发了用于体外扩增脐血间充质干细胞的无血清培养基，该培养基以IMDM为基础培养基，添加了人血清白蛋白、氢化可的松、SITE(SITE为商品名，是四种物质的简称：Selenite硒酸盐、Insulin胰岛素、Transferrin转铁蛋白、Ethanolamine乙醇胺)和bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)[Chi-Hsien Liu，et al.，Biochem Eng J，33，p.1-9(2007)]。
此外，美国专利USP 5,908,782以IMDM为基础培养基，添加了BSA、人脂蛋白、饱和人转铁蛋白、重组人胰岛素、维生素、氨基酸、微量元素以及重组人PDGF-β β(血小板衍生生长因子)和5-羟色胺作为培养骨髓间充质干细胞的无血清培养基。美国专利USP 7,109,032以F12(Coon’s modifiedHam’s F12)培养基为基础，添加了HAS、转铁蛋白、抗坏血酸、β-巯基乙醇、胆固醇、硒、维生素H、泛酰巯基乙胺钠、***以及EGF(表皮生长因子)/PDGF(血小板衍生生长因子)/FGF-2(成纤维细胞生长因子)/IGF-I(***-I)/LIF(白血病抑制因子)/SCF(干细胞因子)等细胞因子。
以上研究和开发的无血清培养基都是在基础培养基上添加纯化的蛋白、激素、生长因子、微量元素、维生素等物质，其特点是化学成分明确，能较好地维持骨髓间充质干细胞的生长，保持骨髓间充质干细胞的多向分化潜能。但是，这些无血清培养基均不能促进骨髓间充质干细胞贴壁。在体外培养时，骨髓间充质干细胞需要在含血清培养基中贴壁完全后，再更换成无血清培养基进行培养，这样会造成在培养基中残留一定量的动物血清，在严格的意义上说，并未达到真正的无血清培养，在临床应用中仍可能具有很大的风险。
【发明内容】
本发明的目的是，克服现有技术存在的不足，为体外培养和扩增骨髓间充质干细胞(MSCs)提供一种化学成分明确的无血清培养基，避免含血清培养基生产的产品在临床应用中可能存在的风险。
用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基是由各种营养成分，包括氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素、激素、生长因子、微量元素等众多成分组成的。在培养基组分的研究中必须关注到：一、在培养过程中任何一种营养物质的耗竭都会影响细胞的生长，严重的会导致细胞的死亡；反过来，如果营养物质过剩的话，也会在培养环境中积累大量的副产物，对细胞产生毒性，严重的会引起细胞的死亡；因此，培养基中各种营养成分要合理均衡，以满足细胞生长、代谢和维持功能的需求。二、骨髓间充质干细胞具有多向分化的潜能，在体外扩增过程中要保持其多向分化的潜能，因而在培养基中要添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子等，在促进增殖的同时维持骨髓间充质干细胞的多向分化的潜能。三、骨髓间充质干细胞是贴壁细胞，需要在无血清培养基中添加贴壁因子以促进其贴壁，使骨髓间充质干细胞能够直接在无血清培养基中贴壁生长。
为实现上述发明目的，本发明用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，为一种水溶液，其组分(包含基础培养基)如下：
基础培养基                              10～18g/L
碱性成纤维细胞生长因子                  1～20ng/mL
表皮生长因子                            1～10ng/mL
血清白蛋白                              1～20mg/mL
胰岛素                                  1～20μg/mL
转铁蛋白                                1～20μg/mL
乙醇胺                                  0.01～0.05mM
腐胺                                    200μM
维生素C                                 10～100μM
氢化可的松                              10μg/mL
***                                10nM
FeSO4·7H2O                                    0.834mg/mL
CuSO4·5H2O                                    0.0025mg/mL
ZnSO4·7H2O                                    0.863mg/mL
抗氧化剂：巯基乙醇                             0.01～0.05mM
贴壁因子：纤粘连蛋白                           5～10μg/cm2
所述的基础培养基为α-MEM、DMEM、IMDM、DMEM与Ham’s F12按1：1混合的培养基中的一种。
所述的抗氧化剂为巯基乙醇、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、***钠的一种或多种。所述组分中的0.01～0.05mM的巯基乙醇可用50-150U/mL的氧化氢酶、或50-150U/mL的超氧化物歧化酶、或0.01～0.05mM的***钠替代，或多种组合使用。
所述的贴壁因子为纤粘连蛋白、明胶、I型胶原蛋白的一种或多种。所述组分中的5～10μg/cm2的纤粘连蛋白可用50～100μg/cm2的明胶、或100～200μg/cm2的I型胶原蛋白替代，或多种组合使用。
所述组分中的维生素C为L-ascorbic acid，或可用L-ascorbic acid2-phosphate(维生素C磷酸盐)替代。
所述组分中的贴壁因子需预铺于培养介质(如培养皿、培养瓶等的)表面，或者直接添加至培养基中。
所述的α-MEM、DMEM、IMDM、按1：1混合的DMEM与Ham’s F12基础培养基的组分在已有的文献中已有公开报道，这里不再赘述。
利用本发明的无血清培养基进行骨髓间充质干细胞的体外培养和扩增，由于添加了维生素、激素、生长因子、微量元素、抗氧化剂和贴壁因子，因此不需要预先在含血清培养基中先进行贴壁，而后更换无血清培养基，最大可能地减少了血清的残留，同时较好地维持了骨髓间充质干细胞的生长，保持了骨髓间充质干细胞的多向分化潜能。
【附图说明】
附图1是采用本发明的无血清培养基培养骨髓间充质干细胞至汇合的照片；
附图2是采用α-MEM+10％FBS培养基培养的骨髓间充质干细胞至汇合的照片；
附图3是兔骨髓间充质干细胞在本发明的无血清培养基与含10％胎牛血清培养基中生长曲线的对比图；
附图4是兔骨髓间充质干细胞在本发明的无血清培养基与含10％胎牛血清培养基中扩增后经诱导成骨分化后胞外钙基质沉积的对比图；
附图5是兔骨髓间充质干细胞在本发明的无血清培养基和含10％胎牛血清培养基中扩增后诱导成脂肪分化后分化程度的对比图。
【具体实施方式】
以下以6个实施例给出本发明用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基的具体实施方式，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
以α-MEM为基础培养基，其组分如下：
α-MEM                      10.2g/L
碱性成纤维细胞生长因子      10ng/mL
表皮生长因子                10ng/mL
牛血清白蛋白                2mg/mL
牛胰岛素                    10μg/mL
转铁蛋白                    5.5μg/mL
乙醇胺                      0.02mM
腐胺                        200μM
维生素C                     100μM
氢化可的松                         10μg/mL
***                           10nM
FeSO4·7H2O                         0.834mg/mL
CuSO4·5H2O                         0.0025mg/mL
ZnSO4·7H2O                         0.863mg/mL
巯基乙醇                           0.05mM
***钠                           0.01mM
将上述组分在常温下溶于三蒸水或超纯水中，搅拌溶解，即为本发明所说的无血清培养基；经0.2μm过滤膜过滤除菌后，即可用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增。
实施例2
将I型鼠尾胶原溶解于0.02N的醋酸溶液中，胶原浓度为50mg/mL。将此胶原溶液稀释10倍，经0.2μm过滤膜过滤除菌后，以100μg/cm2铺于无菌的培养皿中，并在无菌环境中室温风干，用PBS润洗预铺了胶原的平皿两遍，该平皿即可用于骨髓间充质干细胞无血清培养。
实施例3
以空气栓塞法处死1月龄新西兰大白兔，解剖，分离出股骨、胫骨、尺骨、挠骨，并浸泡入75％乙醇中5分钟。PBS冲洗3～5遍，用碎骨钳将骨头剪碎，转入两个离心管中，加入15～30mL PBS，震荡，取上清。在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清。加入30mL PBS，混合均匀后，在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清。加入10mL PBS混合均匀，经150目筛网过滤，收集滤液，离心，无血清的α-MEM培养基重新悬浮。将该骨髓提取物沿离心管壁缓慢加至等体积Ficoll分离液上，在3000rpm条件下水平离心30分钟。用尖吸管吸取中间雾层，加PBS离心洗涤。用α-MEM+10％FBS培养液将细胞悬浮，台盼蓝拒染法计数。然后将细胞悬液稀释至1×106cells/mL，接种至10cm培养皿中，于CO2培养箱中培养，24～48小时后观察细胞贴壁，换液除去悬浮细胞。每隔3～4天更换培养基。原代细胞经7～10天长满了培养皿底部后，可进行传代培养。
原代培养后的骨髓间充质干细胞加3mL 0.025％胰酶/0.02％ EDTA进行消化，当细胞变圆、脱落后在1200rpm条件下离心5分钟，弃消化液，加入2～3mL 10mg/mL大豆胰酶抑制剂中和胰酶活性。在1200rpm条件下离心5分钟后倒去上清，PBS清洗两遍，加入实施例1所述的无血清培养基悬浮细胞，以1×104cells/cm2接种于实施例2所述的预铺了I型胶原蛋白的培养皿中。
参见附图1，采用本发明的无血清培养基培养骨髓间充质干细胞至汇合的照片；参见附图2，采用α-MEM+10％FBS培养基培养的骨髓间充质干细胞至汇合的照片。
实施例4
将无血清培养至汇合的骨髓间充质干细胞加3mL 0.025％胰酶/0.02％ EDTA进行消化，当细胞变圆、脱落后在1200rpm条件下离心5分钟，弃消化液，加入2～3mL10mg/mL大豆胰酶抑制剂中和胰酶活性。在1200rpm条件下离心5分钟后倒去上清，PBS清洗两遍，加入实施例1的无血清培养基悬浮，以0.5×104cells/孔接种于预铺了I型胶原蛋白的24孔板中，每个孔加入1mL本发明的无血清培养基，每天取样计数。
参见附图3。附图3比较了兔骨髓间充质干细胞在实施例1所述的无血清培养基与含10％胎牛血清培养基中的生长曲线。
实施例5
将使用实施例1所述的无血清培养基扩增的兔骨髓间充质干细胞以1×105cells/孔接种于6孔板中，在实施例1所述的无血清培养基中补充10μg/cm2的纤粘连蛋白和50μg/cm2的明胶，加入6孔板中，以培养骨髓间充质干细胞。当细胞生长至50％汇合时，更换成成骨诱导培养基进行诱导。成骨诱导培养基为DMEM-LG添加10％FBS、0.1μM***、50μg/mL抗坏血酸(L-ascorbic acid 2-phosphate)、10mM β-甘油磷酸钠。
诱导2周后用PBS润洗孔板中的对照细胞和成骨诱导细胞，之后加入200μL的0.1M盐酸，反应20分钟后将盐酸反应液转入冷冻离心管中在-20℃的条件下冻存。测定时取出离心管解冻，在漩涡混合器上充分振荡混匀，用钙测定试剂盒测定钙离子浓度。
参见附图4。附图4对比了用实施例1所述的无血清培养基与含10％胎牛血清培养基扩增后的兔骨髓间充质干细胞经诱导成骨分化后胞外钙基质的沉积。
实施例6
将使用实施例1所述的无血清培养基扩增的兔骨髓间充质干细胞以1×105cells/孔接种于实施例2所述的预铺了胶原的6孔板中，加入实施例1所述的无血清培养基培养，当细胞生长至80％汇合时，更换成脂肪诱导培养基进行诱导。脂肪诱导培养基为DMEM-LG添加10％FBS、1μM***、10μg/mL胰岛素、0.5mM IBMX、200μM消炎痛。诱导2周后，用10％甲醛固定，0.5％油红染色。脂肪细胞内的脂滴将被染成红色。用异丙醇将胞内的油红萃取出，用分光光度计在波长510nm处测吸光度，可反映脂肪分化程度。
参见附图5。附图5对比了用实施例1所述的无血清培养基与含10％胎牛血清培养基扩增后的兔骨髓间充质干细胞诱导成脂肪分化后的分化程度。

Claims (10)

1、一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，为一种水溶液，其组分，包含基础培养基如下：
基础培养基                      10～18g/L
碱性成纤维细胞生长因子          1～20ng/mL
表皮生长因子                    1～10ng/mL
血清白蛋白                      1～20mg/mL
胰岛素                          1～20μg/mL
转铁蛋白                        1～20μg/mL
乙醇胺                          0.01～0.05mM
腐胺                            200μM
维生素C                         10～100μM
氢化可的松                      10μg/mL
***                        10nM
FeSO4·7H2O                     0.834mg/mL
CuSO4·5H2O                     0.0025mg/mL
ZnSO4·7H2O                     0.863mg/mL
抗氧化剂：巯基乙醇              0.01～0.05mM
贴壁因子：纤粘连蛋白            5～10μg/cm2
2、根据权利要求1所述的用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，所述的基础培养基为α-MEM、DMEM、IMDM、DMEM与Ham’s F12按1：1混合的培养基中的一种。
3、根据权利要求1所述的用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，所述的抗氧化剂为巯基乙醇、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、***钠的一种或多种。
4、根据权利要求1所述的用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，所述组分中的0.01～0.05mM的巯基乙醇可用50～150U/mL的氧化氢酶、或50～150U/mL的超氧化物歧化酶、或0.01～0.05mM的***钠替代，或多种组合使用。
5、根据权利要求1所述的用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，所述的贴壁因子为纤粘连蛋白、明胶、I型胶原蛋白的一种或多种。
6、根据权利要求1所述的用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，所述组分中的5～10μg/cm2的纤粘连蛋白可用50～100μg/cm2的明胶、或100～200μg/cm2的I型胶原蛋白替代，或多种组合使用。
7、根据权利要求1所述的用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，所述组分中的维生素C可用维生素C磷酸盐替代。
8、根据权利要求1所述的用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，所述组分中的贴壁因子需预铺于培养介质的表面，或直接添加至培养基中。
9、根据权利要求1所述的用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，以α-MEM为基础培养基，其组分如下：
α-MEM                            10.2g/L
碱性成纤维细胞生长因子           10ng/mL
表皮生长因子                     10ng/mL
牛血清白蛋白                     2mg/mL
牛胰岛素                         10μg/mL
转铁蛋白                         5.5μg/mL
乙醇胺                           0.02mM
腐胺                             200μM
维生素C                          100μM
氢化可的松                       10μg/mL
***                         10nM
FeSO4·7H2O                      0.834mg/mL
CuSO4·5H2O                      0.0025mg/mL
ZnSO4·7H2O                      0.863mg/mL
巯基乙醇                         0.05mM
***钠                         0.01mM
10、根据权利要求1，或9所述的用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，将I型鼠尾胶原溶解于0.02N的醋酸溶液中，胶原浓度为50mg/mL；将此胶原溶液稀释10倍，经0.2μm过滤膜过滤除菌后，以100μg/cm2铺于无菌的培养皿中，并在无菌环境中室温风干，用PBS润洗预铺了胶原的平皿两遍，该平皿即可用于骨髓间充质干细胞的无血清培养。
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