CN102433302B - 一种间充质干细胞无血清培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种间充质干细胞无血清培养基，包括下列成分：以终浓度计，纤连蛋白：25μg/ml；碱性成纤维细胞生长因子：10ng/ml；人表皮细胞生长因子：15ng/ml；重组人胰岛素：1mg/ml；人转铁蛋白：0.55mg/ml；人血白蛋白：体积比为5%；***钠：0.67μg/ml；左旋卡尼丁：5mM；白藜芦醇：30μM。采用本发明提供的间充质干细胞无血清培养基培养间充质干细胞，由于不含有动物来源的血清，因此可以控制感染风险；间充质干细胞无血清培养基中加入的左旋卡尼丁和白藜芦醇，可以有效改善间充质干细胞生长状态；间充质干细胞生长速度显著提高，并且保证了间充质干细胞生物学特性保持不变。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞培养基技术领域，具体涉及一种间充质干细胞无血清培养基。
背景技术
间充质干细胞（Mesenchymal Stem
Cells，MSCs）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞广泛存在于全身多种组织中铭刻在体外培养扩增，并能在特定条件下分化成心肌细胞、神经细胞及脂肪细胞等。随着国内外学者对间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，目前已经可以从多种组织中分离出间充质干细胞。间充质干细胞具有支持造血和调节免疫等作用，在造血重建、组织修复、免疫治疗等方面具有广阔的临床应用前景。
现有的间充质干细胞培养方法使用的培养基大都含有动物血清，一方面造成成纤维细胞的污染，影响角质细胞生长，加速角质细胞分化；另一方面由于血清和成分不明的蛋白的存在，对细胞生物学、毒理学、病理学等基础研究形成干扰；同时采用添加血清的培养基构建的人工组织进行体内移植，可能引起免疫反应或引入不安全因素（如：病毒或其它病原体等），因此需要开发化学成分明确的无血清培养基。
由于无血清培养基组成方面的不足，因此在利用这些培养基培养细胞在过程中，生长速度慢，容易出现老化的特征，从而影响细胞的大量扩增。间充质干细胞在用于临床治疗时对细胞数量有很大的要求，而且还必需在短时间内得到足够的细胞以满足治疗的需要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供移植间充质干细胞无血清培养基，能够提高间充质干细胞地生长速度，提高扩增速率，同时保证间充质干细胞生物学特性。
为达到上述目的，本发明采取的技术方案是：提供一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，包括下列成分：以终浓度计，
纤连蛋白：
25μg/ml；
碱性成纤维细胞生长因子：
10ng/ml；
人表皮细胞生长因子：
15ng/ml；
重组人胰岛素：
1mg/ml；
人转铁蛋白：
0.55mg/ml；
人血白蛋白：
体积比为5%；
***钠：
0.67μg/ml；
左旋卡尼丁：
5mM；
白藜芦醇：
30μM。
所述间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：还包括基础培养基，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
本发明采用的DMEM/F12（Dulbecco's
Modified Eagle's Medium/ Ham's Nutrient Mixture F1）培养基采用DMEM和F12按溶液体积比1:1混合而成；DMEM/F12培养基由Gibco公司提供，货号为11320-033。
本发明采用的左旋卡尼丁（L-camitine），由珠海亿邦制药有限公司提供，国药准字h2005107；左旋卡尼丁是哺乳动物能量代谢中需要的体内天然物质，其主要功能是促进脂类代谢；缺氧、缺血时，脂酰-CoA堆积，线粒体内的长链脂酰卡尼汀也堆积，游离卡尼汀因大量消耗而降低；缺氧、缺血导致ATP（adenosine-triphosphate）水平下降，细胞膜和亚细胞膜通透性升高，堆积的脂酰-CoA可导致膜结构改变，膜相崩解而导致细胞死亡；另外，缺氧时以糖无氧酵解为主，脂肪酸等堆积导致酸中毒，离子紊乱，细胞自溶死亡；足够量的游离卡尼汀可使堆积的脂酰-CoA进入线粒体内，减少其对腺嘌呤核苷酸转位酶的抑制，使氧化磷酸化得以顺利进行。
本发明采用的白藜芦醇（Resveratrol），是多酚类化合物，主要来源于蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.的根茎提取物白藜芦醇是一种天然的抗氧化剂，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝结和血管舒张，保持血液畅通，可预防癌症的发生及发展，具有抗动脉粥样硬化和冠心病，缺血性心脏病，高血脂的防治作用。抑制肿瘤的作用还具有***样作用，可用于治疗乳腺癌等疾病。
采用本发明提供的间充质干细胞无血清培养基培养间充质干细胞，具有以下有益效果：
1、由于不含有动物来源的血清，因此可以控制感染风险；
2、间充质干细胞无血清培养基中加入的左旋卡尼丁和白藜芦醇，可以有效改善间充质干细胞生长状态；
3、间充质干细胞生长速度显著提高；
4、并且保证了间充质干细胞生物学特性保持不变；
在10天时间可以将脐带间充质干细胞或者是脂肪间充质干细胞数目扩增大约1000倍。扩增后的间充质干细胞的生物学特性不发生改变。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但它们不是对本发明的进一步限制。
本发明提供的间充质干细胞无血清培养基，包括下列成分：以终浓度计，
纤连蛋白：
25μg/ml；
碱性成纤维细胞生长因子：
10ng/ml；
人表皮细胞生长因子：
15ng/ml；
重组人胰岛素：
1mg/ml；
人转铁蛋白：
0.55mg/ml；
人血白蛋白：
体积比为5%；
***钠：
0.67μg/ml；
左旋卡尼丁：
5mM；
白藜芦醇：
30μM。
上述间充质干细胞无血清培养基，还包括基础培养基，基础培养基为DMEM/F12培养基。
实施例一：脂肪间充质干细胞在培养基中传代培养；
培养基1：本发明提供的间充质干细胞无血清培养基；
培养基2：L-DMEM+10%FBS（Fetal Bovine Serum）；
培养基3：STEMPRO
MSC SFM无血清培养基。
上述L-DMEM由Gibco公司提供，货号为11885-084。
上述STEMPRO MSC SFM无血清培养基由Gibco公司提供，货号为A10332-01。
操作步骤：
1.1 将脂肪间充质干细胞按照10000细胞/cm2的密度种植到3个T75细胞培养瓶中，分别加入培养基1，培养基2，培养基3，将培养基与脂肪间充质干细胞悬液充分混匀后，将3个细胞培养瓶放入到37℃、CO2浓度为5%的细胞培养箱中进行培养，此后每3天按照10000 细胞/cm2的密度进行细胞传代；
1.2 在细胞培养的第10天，将细胞培养瓶中的细胞收获；用0.25%的胰酶消化2 min，之后将间充质干细胞吹打下来并用各对应培养基终止消化；
1.3 将步骤1.2得到的间充质干细胞以200g的速度离心5min，收集间充质干细胞并用10ml的磷酸盐缓存溶液重悬后，再以200g的速度离心5min，得到的间充质细胞用10ml的磷酸盐缓存溶液混匀；
1.4 将步骤1.3得到的细胞用Invitrogen公司全自动细胞计数仪Countess进行细胞计数。每组测3次，结果取平均值如表1所述。
表1：脂肪间充质干细胞在培养基1、培养基2、培养基3中传代培养10天后，脂肪间充质干细胞的细胞数及活率检测结果
| 培养基1 | 培养基2 | 培养基3 | |
| 细胞数 | 8.2×107 | 9.4×106 | 4.2×107 |
| 活率 | 97.6% | 88.3% | 91.3% |
从表1看出，本发明提供的间充质干细胞无血清培养基相对于另外两种培养基可以更好的维持脂肪间充质干细胞的活性，使脂肪间充质干细胞保持更好的生长速度。
实施例二：脐带间充质干细胞在培养基中传代培养；
培养基1：本发明提供的间充质干细胞无血清培养基；
培养基2：L-DMEM+10%FBS（Fetal Bovine Serum）；
培养基3：STEMPRO
MSC SFM无血清培养基。
上述L-DMEM由Gibco公司提供，货号为11885-084。
上述STEMPRO MSC SFM无血清培养基由Gibco公司提供，货号为A10332-01。
操作步骤：
2.1. 将脐带间充质干细胞按照10000细胞/cm2的密度种植到3个T75细胞培养瓶中，分别加入培养基1，培养基2，培养基3，将培养基与脐带间充质干细胞悬液充分混匀后，将3个细胞培养瓶放入到37℃、CO2浓度为5%的细胞培养箱中进行细胞培养，此后每3天按照10000细胞/cm2的密度进行细胞传代；
2.2 在细胞培养的第10天，将细胞培养瓶中的细胞收获；用0.25%的胰酶消化2 min，之后将间充质干细胞吹打下来并用各对应培养基终止消化；
2.3 将步骤2.2得到的间充质干细胞以200g的速度离心5min，收集间充质干细胞用10ml的磷酸盐缓存溶液重悬后，再以200g的速度离心5min，得到的细胞用10ml的磷酸盐缓存溶液混匀；
2.4 步骤2.3得到的细胞用Invitrogen公司全自动细胞计数仪Countess进行细胞计数。每组测3次，结果取平均值如表2所述。
表2：脐带间充质干细胞在培养基1、培养基2、培养基3中传代培养10天后，脐带间充质干细胞的细胞数及活率检测结果
| 培养基1 | 培养基2 | 培养基3 | |
| 细胞数 | 7.3×107 | 7.1×106 | 5.2×107 |
| 活率 | 96.4% | 85.7% | 94.3% |
从表2看出，本发明提供的间充质干细胞无血清培养基相对于另外两种培养基可以更好的维持脐带间充质干细胞的活性，使脐带间充质干细胞保持更好的生长速度。
实施例三：在培养基中传代培养后的脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞的生物学特性；
培养基：本发明提供的间充质干细胞无血清培养基。
操作步骤：
3.1 将脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞按照10000细胞/cm2的密度分别种植到2个T175细胞培养瓶中，加入本发明提供的间充质干细胞无血清培养基中传代培养，每一种干细胞分别传代5次和10次；
3.2 将细胞培养瓶中的细胞收获，用0.25%的胰酶消化2 min，之后将间充质干细胞吹打下来并用培养基终止消化；
3.3 将步骤3.2得到的脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞以200g的速度离心5min，收集脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞用10ml的磷酸盐缓存溶液重悬后，再以200g的速度离心5min，得到的脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞分别传代5次和10次后的干细胞共四组分别分装到13个流式管中；对应的流式管中分别加入以下标记抗体：（1）小鼠抗人IgG2a-PE、（2）小鼠抗人CD11b-PE、（3）小鼠抗人IgG1-PE、（4）小鼠抗人CD19-PE、（5）小鼠抗人HLA-DR-PE、（6）小鼠抗人IgG1ƙ-PE、（7）小鼠抗人CD73-PE、（8）小鼠抗人IgG1ƙ-FITC、（9）小鼠抗人CD90-FITC、（10）小鼠抗人CD34-FITC、（11）小鼠抗人CD105-FITC、（12）小鼠抗人IgG2a-FITC、（13）小鼠抗人CD45；
3.4标记处理好的细胞使用BD公司的FACSAria流失细胞仪进行分析；分析结果如表3所述。
表3：经本发明提供的间充质干细胞无血清培养基传代培养5次或10次后的脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞的生物学特性参数变化统计结果
| CD73 | CD90 | CD105 | CD11b | CD34 | CD45 | CD19 | |
| 5次传代的脐带间充质干细胞 | 98.2% | 96.7% | 97.6% | 3.1% | 2.5% | 4.1% | 1.4% |
| 10次传代的脐带间充质干细胞 | 99.4% | 98.6% | 97.8% | 0.2% | 2.7% | 2.1% | 1.4% |
| 5次传代的脂肪间充质干细胞 | 98.3% | 96.4% | 96.3% | 1.1% | 3.2% | 0.4% | 0.6% |
| 10次传代的脂肪间充质干细胞 | 97.9% | 99.2% | 97.3% | 3.2% | 1.8% | 0.7% | 2.1% |
从表3看出，采用本发明提供的间充质干细胞无血清培养基培养的脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞不论是经过5次还是10次传代培养，都能够很好的保证脐带间充质干细胞或脂肪间充质干细胞的生物学特性不变。
Claims (2)
1.一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，包括下列成分：
纤连蛋白：
25μg/ml；
碱性成纤维细胞生长因子：
10ng/ml；
人表皮细胞生长因子：
15ng/ml；
重组人胰岛素：
1mg/ml；
人转铁蛋白：
0.55mg/ml；
人血白蛋白：
体积比为5%；
***钠：
0.67μg/ml；
左旋卡尼丁：
5mM；
白藜芦醇：
30μM。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：还包括基础培养基，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
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Effective date of registration: 20120711 Address after: 610000 Sichuan city of Chengdu province high tech Zone Renlu No. 246 days Applicant after: Chengdu Qingke Biotechnology Co., Ltd. Address before: 610000, No. 15, building 2, 13 White Silk Street, Qingyang District, Sichuan, Chengdu Applicant before: Chengdu Hui Yuan Bio Technology Development Co., Ltd. |
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