CN106062179A

CN106062179A - 无血清培养基

Info

Publication number: CN106062179A
Application number: CN201580008299.8A
Authority: CN
Inventors: F·P·巴里; E·J·穆尼; J·M·墨菲; G·M·肖; S·P·盖纳德
Original assignee: National University of Ireland
Current assignee: National University of Ireland
Priority date: 2014-02-14
Filing date: 2015-02-16
Publication date: 2016-10-26
Also published as: US10472605B2; EP3074505A1; JP2017506511A; EP3074505B1; US20170044489A1; WO2015121471A1

Abstract

本发明公开了一种用于间充质干细胞生长的无血清培养基，所述培养基包含FGF、TGF‑β和脂蛋白。

Description

无血清培养基

技术领域

本发明涉及一种无需使用血清作为培养基组分的干细胞生长培养基、利用该培养基的方法以及使用该培养基生产的细胞。

背景技术

间充质干细胞(MSC)是多潜能细胞，它可以分化成多种细胞类型，包括：成骨细胞(骨细胞)、软骨细胞(软骨的细胞)和脂肪细胞(脂细胞)。这种能力已对活体动物的特定细胞和组织以及他们在组织培养中生长的相应部分证实。

MSC是基于细胞的药物发现以及对许多人类疾病的潜在治疗的宝贵资源。MSC治疗包括移植物抗宿主病、多发性硬化症、克罗恩病、1型糖尿病、骨折和骨关节炎等疾病的潜力目前正在临床试验中。

据估计，MSC仅占骨髓单核细胞总数的0.001-0.01％；因此，这类群需要广泛的体外细胞培养扩大以获得足够的数量用于基础生物或临床应用。目前临床应用中使用大约1亿个细胞的剂量。

再生医学和细胞疗法的目前发展表明，在未来几年里，在细胞加工技术方面会有一个巨大的增长。这将涉及成体和胚胎干细胞，以及用于治疗目的的体细胞。此外，干细胞诱导性多能干细胞在药物筛选应用中使用的增加将大幅增加对细胞加工技术的需求。

分离和培养这些MSC大部分依赖于动物制品的使用，特别是胎牛血清(FBS)。

干细胞需要特定的生长条件。目前，骨髓来源的MSC在含血清培养基中分离、培养和分化。

几乎所有的在实验室培养中生长的哺乳动物细胞都需要在生长培养基中存在FBS，它提供了细胞附着和增殖所必需的激素和生长因子。这包括目前正在研究的用于治疗用途的人类细胞，如成体干细胞、胚胎干细胞以及其他体细胞。FBS是从肉类加工行业得到的胎牛血中获得的，它通常按照体积百分比浓度10％加入到生长培养基中。因此，干细胞的供给依赖于让它们生长的合适培养基的获得。

该技术已成功地应用几十年了，FBS是最常用的生长培养基的补充剂，因为胎血中存在蛋白质的复合混合物以及高水平的生长刺激因子。然而，在使用FBS时也存在相关问题，其中一些如下：

1.疾病传播到细胞疗法接受者的风险；

2.疾病传播到加工技术人员和医务人员的风险；

3.产品的不确定性和季节性供应；

4.需要在-20℃下冷冻保存；

5.批次与批次之间的显著变化；

6.因需求增加，预期主要供应链的问题。

FBS在用于人类治疗的细胞生产中使用，主要相关问题是传染性物质传播到接受者的风险。此外，还有一个相当大的风险，与处理这些材料的加工技术人员和医务人员相关。这种风险在最近几年变得非常严重，因为传染性牛海绵状脑病(BSE)俗称疯牛病的出现，以及人类获得变异型克雅氏病(vCJD)的相关风险。迄今为止，BSE已在欧洲、北美和世界其他许多地方的牛中被检测到。几乎所有现在批准用于人类治疗的细胞生长中的FBS，都来自澳大利亚和新西兰，这些地方仍然是没有BSE的。

BSE在世界各地的牛群中的出现，也导致重大的供应问题，预计会对未来的细胞疗法可用性造成严重影响。目前，这种有限供应的血清一般是足够实验室和研究使用的。然而，这些实验室和研究用途中的某些是针对生产将要进行中型或大型规模生产的商业产品。目前没有批准用于一般性使用的干细胞技术申请。因此，可以设想，当一个干细胞技术被释放为一般性使用时，血清的供应将根本不能满足这种需求。

事实上，可以预见的是，当细胞治疗产品被批准仅仅用于两个主要的适应症时，整个全球被批准的供应，即没有BSE的FBS，将会在制造的一年内消耗完。因此，当细胞疗法获得监管部门的批准和使用时，将会出现显著而前所未有的对于无FBS的生长培养基的需求。显然，干细胞生长培养基的供应将会成为干细胞技术的应用的限制因素。

此外，FBS是一种异质混合物，这导致血清批次之间缺乏再现性与性能。血清中包含许多不明或非量化的组分，因此不能被“定义”，也不能被再合成制造。因此，批次与批次之间变化的血清组合物，用于实验或其他用途的细胞培养时，使得标准化困难。同时，MSC是贴壁细胞群，目前这种附着到组织培养塑料上的能力大部分依赖于FBS。

事实上，由于FBS中的很多组分影响细胞附着、增殖和分化，控制这些参数，或相对于这些参数研究细胞具体要求，可以排除血清的使用。此外，血清的某些组分会抑制特定细胞类型的增殖，并在一定程度上可能抵消其增殖作用，导致次优的生长。

这种FBS的异质性引起生长特性的变化导致血清批次间缺乏重现性，导致基于细胞的产品和治疗面临制造和增长的问题。在良好制造协议(GMP)下制造的产品尤其如此，它是以使用一致的(并因此是可靠的)初始材料为先决条件。

此外，从治疗和管理的角度来看，FBS的存在是不理想的，因为这可能导致动物病原体的转移。虽然血清被批准用于医疗用途，它可能含有影响实验结果的病毒，或当培养的细胞意图用于植入人体时提供一个潜在的健康危害。此外，从监管的角度来看，在临床设置中使用的动物源性产品是不可取的，不仅是因为有传染性病原体传播的的风险，而且还有引起免疫应答的潜在性。

因此，为繁殖和/或产生干细胞，存在对无需添加血清的生长培养基的需求。任何这种新的生长培养基，最好是相对简单，而且易于大量生产。

因此，人们已经做出努力，以消除培养基中的FBS，和开发一种能够在活体外(exvivo)扩增MSC的明确的无血清培养基。

WO2011/111787公开了一种细胞制剂，其包含能维持免疫抑制能力的间充质干细胞，由无血清或低血清培养基生产得到。其描述了一种包含间充质干细胞的细胞制剂的制备方法，包括：一增殖步骤，其中间充质干细胞在包含FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的培养基中进行增殖；和一筛选步骤，其中，增殖步骤后的间充质干细胞经筛选，得到维持或改善免疫抑制能力的间充质干细胞。

WO98/104681公开了一种明确的无血清细胞培养基，它包含补充混合物、组分混合物、维生素混合物、无机盐混合物和氨基酸混合物。这种明确的培养基被公开用于培养成纤维细胞，尤其是软骨细胞。该发明还公开了一种使用肿瘤生长因子β(TGF-β)增强软骨细胞的分化以及提高软骨特异性基质的合成的方法，以及使用TGF-β和***(IGF)的组合来增强软骨细胞分化的方法。

对于MSC的其他培养基也曾被提出。WO 2005/113751公开了MSC在无血清培养基中的扩增；这种培养基是非常复杂的，除其它组分外，有些可以包含bFGF和TGF-β。US2010/0279412也公开了一种无血清培养基，其可包含FGF、TGF、EGF、磷脂酸、磷脂酰胆碱和维生素C。Chase et al,Stem Cell Research&Therapy 2010,1:8公开了一种用于人类MSC的无血清培养基，它包含bFGF、TGF-β1和PDGF。

本发明的目在于提供一种用于干细胞生长的培养基及方法，其作为上述的至少一个替代，并优选解决或至少改善一个或多个现有技术确认的问题。特定的实施例的目的在于提供一种用于MSC生长的培养基，无需补充血清，因此容易获得而且相对便宜。

发明内容

因此，本发明提供了用于一种用于培养干细胞的无血清培养基，包括：

(a)成纤维细胞生长因子(FGF)；

(b)转化生长因子β(TGF-β)；和

(c)脂蛋白。

本发明的一个优点是，它能生产一种完全没有FBS的培养基，即无血清生长培养基，其适合干细胞的增殖和组织培养，尤其是间充质细胞，尤其是人类细胞和组织。

此外，本发明的培养基适合于直接增殖从骨髓中分离的细胞，即，这些分离的细胞可以直接放置在本发明的培养基中进行培养，不需要首先在含有血清的培养基中进行孵育或增殖。

本发明培养基的另一个优点在于，细胞在在缺氧条件下培养可显示优越的生长动力学。

使用本发明培养基去生产细胞的进一步的优点在于：与现有技术中基于血清的培养基相比，本发明培养基的使用可增加细胞的产量。与以前使用的条件下相比，本发明的培养基能使制造商获得高得多的产量的细胞(至少十倍以上)。因此，每剂量的生产成本降低了约90％。因此，除了增强本发明培养基中细胞的生长特性，该培养基还有望提高从事生产临床试验和用途的基于MSC的产品的临床制造企业的竞争力。目前，在符合GMP的条件下，临床使用所需的大量MSC的生产成本，是企业发展再生医学疗法的主要问题之一。

此外，这种确定的培养基可以完全在符合GMP的标准下大规模生产，适用于人类细胞生长的使用。因而本发明的无血清培养基，在体外细胞培养的研究过程中，允许较大的重现性。

因此，本发明培养基的一些进一步优点在于：

-制造商不再受FBS供应不确定性的制约；

-疾病传播的风险去除，因为所有原材料可来源于GMP供应商；

-克服了基于血清的生长培养基出现的批次间不同的问题；此外，由于无血清培养基具有确定的组成，无需制造商或研究者进行血清“批次试验”。

无血清培养基的使用因此为细胞疗法从实验到临床使用的监管提供了重要的保障。当单一的临床剂量的生产成本昂贵得让人望而却步是因为每次生产的细胞产量可怜的时候，无血清培养基也大大降低了大规模生产MSC的成本，特别是GMP条件下培养的细胞用于治疗用途。

该培养基还可包含表皮生长因子(EGF)，合适浓度为1ng/ml到100ng/ml，优选为2ng/ml到50ng/ml，或2ng/ml到25ng/ml；在一个具体的例子中，EGF在培养基中的浓度为大约10ng/ml。该培养基还可包含纤连蛋白，浓度合适地为1μg/ml到100μg/ml，优选为1μg/ml到24μg/ml。

在本发明的培养基中包含EGF和纤连蛋白的优点在于，使用时，直接取自骨髓的样本在这样的培养基产生每集落形成单位(CFU)最多的细胞。

脂蛋白是复合颗粒，它在体内运输胆固醇、磷脂和甘油三酯。脂蛋白包括，从最大到最小(最不密集到最密集)，乳糜微粒(ULDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、中间密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。这些都是本领域中公认的和理解的术语，在文献中广泛使用，无需进一步定义。

低密度脂蛋白(LDL)此后涉及的是一类有大小不等范围的脂蛋白颗粒，其直径从约15nm或约18nm到约30nm，或到约25nm(基于激光的方法可用于此测量)。LDL颗粒通常包含一单一的载脂蛋白B-100分子(Apo B-100)，和非常接近80至100个额外的辅助蛋白。每个LDL通常具有高度疏水的核心，该核心由被称为亚油酸的多不饱和脂肪酸和数百至数千(约1500通常被作为一个平均水平)的酯化和非酯化胆固醇分子组成。这个核心也可以携带不同数量的甘油三酯和其他脂肪，被磷脂和未酯化的胆固醇的外壳以及单拷贝的载脂蛋白B-100包围。一些特定的LDL颗粒直径为约22nm，质量约300万道尔顿，虽然通常术语LDL是行业公知的，包括落入上述明确的参数内的颗粒。在典型的人体内，由于LDL颗粒含有可变的和不断变化数量的脂肪酸分子，所以有一个LDL颗粒的质量和大小的分布。

极低密度脂蛋白(VLDL)一般含有Apo B-100、ApoC1、ApoE、胆固醇，胆固醇酯和甘油三酯。当它在血液中循环时，VLDL可接收其它组分，这和其他的变化可及时将VLDL转换到其他脂蛋白形式。再次，术语VLDL为行业所公知，通常VLDL颗粒的直径从约30nm到约80nm。在体内，VLDL往往运输内源性产物，相反，乳糜微粒往往运输外源性产物。

中间密度脂蛋白(IDL)颗粒往往包含除了单一拷贝的Apo B-100外，还包含多个拷贝的受体配体ApoE，直径一般约25nm至35nm。最后，高密度脂蛋白(HDL)颗粒具有最高的密度和最小的尺寸，直径一般是从约7nm或8nm到约11nm或12nm。

该培养基可以包括一种或多种或所有以下脂蛋白：

高密度脂蛋白(HDL)；

低密度脂蛋白(LDL)；

中间密度脂蛋白(IDL)；

极低密度脂蛋白(VLDL)；和

乳糜微粒。

本发明优选的实施例中，培养基包括LDL或VLDL。在使用下面的实施例进一步详细描述时，包含LDL的培养基和包含VLDL的培养基使得细胞更好地生长，并促进具有所需形态的细胞生长。

优选地，培养基包括LDL，其可以包括以下的一个或多个：

大而轻LDL(lb LDL)颗粒，

小而密LDL(sd LDL)颗粒，和/或

脂蛋白(a)(Lp(a))。

据认为，脂蛋白是必不可少的，因为它提供胆固醇和磷脂，这些物质不能容易地通过任何其他方法提供。脂蛋白的适合水平为1μg/ml或以上、2μg/ml或以上、5μg/ml或以上，并分别可高达100μg/ml、80μg/ml或60μg/ml。具体实施例中，浓度为约4μg/ml和约40μg/ml。

在下面给出的更详细的实施例中，数目增加的成纤维细胞集落形成单位-(CFU-f)是在包含VLDL或LDL的培养基中获得的。当VLDL或LDL存在时，包括该CFU-f的细胞本身的形态也得到了改善。当培养基中含有HDL时，CFU-f包括密集的细胞簇，其中发生了一些分枝(outgrowth)。当在包含胎牛血清的培养基中分离时，这对观察到的CFU-f是非典型的。相反，使用包含VLDL或LDL的培养基获得的CFU-f具有分散的形态，其更加类似于与MSC相关的典型CFU-f形态。

此外，下面本发明的进一步实施例更详细的描述中，我们评估是否：1)在无血清培养基中加入纤连蛋白排除了预包被附着因子的需要，和2)或用无血清培养基配方从骨髓中分离和增殖MSC，是否必需纤连蛋白。本发明的培养基存在或缺乏纤连蛋白时，无论是CFU-f数量还是后续增殖率，培养的MSC没有观察到可见差异。这表明，对于(如从骨髓)分离或增殖MSC，无血清培养基配方无需附着因子。

培养基的FGF组分可以包括以下的一种或多种：FGF1，FGF2(bFGF)，FGF3，FGF4，FGF5，FGF6，FGF7，FGF8，FGF9，FGF10，FGF11，GF12，FGF13，FGF14，FGF15，FGF16，FGF17，FGF18，FGF19，FGF20，FGF21，FGF22和FGF23；优选的是FGF1，FGF2(bFGF)，FGF3，FGF4，FGF5，FGF6，FGF7，FGF8，FGF9和FGF10中的一种或多种；更优选的是，培养基包含FGF2(bFGF)。优选地，FGF存在的浓度是0.5ng/ml或以上，1ng/ml或以上，高达50ng/ml，高达30ng/ml，高达20ng/ml，或高达10ng/ml，或这些范围的任意组合。浓度从1ng/ml到20ng/ml是特别合适的。在具体的实施例中，约5ng/ml的浓度被成功使用。培养基的TGFβ组分可以包括TGFβ-1，TGFβ-2和TGFβ-3中的一种或多种，优选的是TGFβ-1。优选的，TGFβ存在的浓度是0.5ng/ml或以上，1ng/ml或以上，高达50ng/ml，高达30ng/ml，高达20ng/ml，高达10ng/ml，或这些范围的任意组合。浓度从1ng/ml到20ng/ml是特别合适的。在具体实例中，约5ng/ml的浓度被成功使用。

无血清培养基也可以包含或是基于一基础培养基(也是无血清)，旨在提供必需的矿物质、盐和维生素。基础培养基在本行业领域是公知的，一种这样的培养基是最低必需Eagle-α-修饰培养基(MEM-α)。其它此类基础培养基可从STEMCELL技术公司(STEMCELLTechnologies SARL,France)和StemCells有限公司(StemCells,lnc,USA)，以及其他的本行业技术所熟知的公司获得，适用于本发明的无血清培养基。

所述培养基还可以适当地包含其它组分如***、人血清白蛋白和/或胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)。一种具体的培养基在MEM-α中包含1％ITS，10nM的***，50mg/ml的人血清白蛋白。该培养基可以基于或包含其它基础培养基。此外，培养基可以不包含其他生长因子或包含进一步的生长因子。

除了本文其它地方描述的用途，该培养基还可以用于从供体(特别是人类供体)分离细胞。所述培养基还可以用于将在含有血清的条件下分离或生长的细胞转换到无血清条件下。因此，例如，细胞(如人细胞)可以使用任何培养基或条件进行分离，然后按照包括在本发明培养基存在下培养细胞的步骤，转换为在无血清条件下生长。

本发明还提供了一种在本发明培养基中培养干细胞的方法，该方法包括在该培养基中孵育干细胞。使用该方法培养的细胞可以是一种或多种间质干细胞(MSC)。有利的是，本发明的培养基中生长的MSC保留了成骨、成软骨、成脂肪和/或血管生成的潜力。在本发明的培养基存在和/或培养在其中的细胞，特别是MSC，可具有有利的免疫抑制性质。

因此，本发明还提供了在本发明的培养基中培养的干细胞，优选干细胞是间充质干细胞，更优选细胞是成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞和/或血管生成细胞。

同样，本发明还提供了一群上述定义的成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞和/或血管生成细胞。

本发明还提供一种本发明培养基中的干细胞，例如用作药物。本发明还提供了一种本发明培养基中的干细胞，用于筛选应用，例如药物筛选。

提供本发明培养基中的干细胞用于药物的一个好处是，从干细胞的初始分离到植入从分离的干细胞培养的干细胞，需要单一的生长培养基。换言之，分离或植入步骤无需分开的培养基。这大大简化了生产和使用干细胞或干细胞系的过程。此外，采用单一的全目的无血清培养基代替多种通常是基于血清的培养基，这样减少了这些培养基带来的感染风险。

优选的，本发明的培养基中的干细胞用于形成下列组织中的一种或多种：

(a)骨组织；

(b)血管组织；

(c)软骨组织；和/或

(d)脂肪组织。

有利的是，无血清培养的MSC在体内向骨组织的分化优于对照实验中培养在含血清培养基中的MSC。

本发明现在参考以下具体实施例和随附的附图进行说明，其中：

图1显示了在10％FBS中分离的MSC在有bFGF存在的无血清条件下重附着，在涂布(plating)18小时后的相对附着程度。组织培养瓶预包被有纤连蛋白(FN；黑色)、透明质酸(HA；蓝色)、玻连蛋白(VN；红色)或层粘连蛋白(LN；绿色)，使细胞在无血清条件下附着。对照包括无细胞外基质(ECM)附着因子存在下的无血清涂布和10％FBS(灰色)。结果代表3个生物学重复，n＝2；

图2显示了在10％FBS中分离并在有bFGF存在的无血清条件下重附着的MSC相对于无血清条件下的生长。组织培养瓶中预包被有FN(黑色)、HA(蓝色)、VN(红色)或LN(绿)，使细胞在无血清条件下附着。5天后获取细胞数。对照包括无ECM附着因子存在下的无血清涂布和10％FBS(灰色)。结果代表了3个生物学重复，n＝2；

图3显示了在10％FBS中分离的MSC，在含FGF2的无血清条件下重附着，在3代(P)过程中的附着程度。将MSC附着在有EGF(红色)的存在下的组织培养瓶上，或预包被有FN(紫色)的组织培养塑料制品上，或有EGF存在下的纤连蛋白包被的塑料上(绿色)并每3天进行传代。对照包括不存在ECM附着因子的无血清涂布(蓝色)和10％FBS(黑色)。结果代表3个生物学重复，n＝2；

图4显示了在10％FBS中分离的MSC，在无血清条件下，重附着在预包被有FN的组织培养瓶2天的生长。然后将细胞在有生长因子的存在下进行培养，每5天进行传代。对照包括无生长因子的无血清涂布和10％FBS。结果代表3个生物学重复，n＝2；

图5显示了在10％FBS中分离的MSC，在无血清条件下，重附着在预包被FN的组织培养瓶中2天的生长。细胞随后在存在有PGE2、胆固醇或脂蛋白的包含FGF2(5ng/ml)的无血清培养基中培养5天。对照包括无生长因子存在下的无血清涂布和10％FBS(A)。然后将细胞在脂蛋白的存在下培养，每5天进行传代，传代3次，对照包括无脂蛋白存在下的无血清涂布(B)。结果代表3个生物学重复，n＝2；

图6显示了实施例的结果，其中，在含FGF2的无血清(SF)培养基中，MSC从骨髓分离到预包被有纤连蛋白(FN)、玻连蛋白(VN)或透明质酸(HA)的塑料制品上，，以确定无血清MSC分离的合适的细胞外基质。集落形成单位(CFU；图6A)的数量以及细胞数量(图6B)是在原代培养结束时确定的。接种另一骨髓在预先包被有不同浓度纤连蛋白的组织培养塑料制品上，以确定所需纤连蛋白的最佳浓度。CFU的数量(图6C)和细胞产量(图6D)是在原代培养结束时确定的。对照包括10％FBS的存在下或没有包被的组织培养塑料制品上的MSC分离；

图7显示了实施例的结果，其中，MSC从骨髓分离到预包被有纤连蛋白的组织培养塑料制品上和/或有EGF存在下的组织培养塑料制品上。集落形成单位的数量(图7A)和细胞的数量(图7B)在原代培养结束时确定。对照包括在10％FBS存在下或在没有包被的组织培养塑料制品上的MSC分离；

图8显示了实施例的结果，其中，在无血清培养基中，MSC被分离在预包被有纤连蛋白(6ug/ml)的组织培养塑料制品上，所述无血清培养基包含的生长因子如表1给出。每一代结束时细胞用胰蛋白酶消化，并接种于包被有纤连蛋白的塑料制品上；对照细胞接种于10％FBS中的组织培养塑料制品上；

图9显示了实施例的结果，其中，在无血清培养基中，MSC被分离到预包被有纤连蛋白(6ug/ml)的组织培养塑料制品上，所述无血清培养基包含的生长因子如表3给出。每一代结束时细胞用胰蛋白酶消化，并接种于包被有纤连蛋白的塑料制品上；对照细胞接种于10％FBS中的组织培养塑料制品上；

图10显示了实施例的结果，其中，在无血清培养基中，分离的MSC在第3、6、9代结束时的表面特性，所述无血清培养基使用表3给出的条件7和8。在10％FBS中培养的MSC被用作对照；

图11显示了实施例的结果，其中，在第3代开始时，在无血清培养基中，分离的MSC的分化特征。对照为在10％FBS培养基中培养的MSC。MSC经历形成脂肪细胞的能力由油红O阳性液泡(a)来确定，茜素红染色以及阳性钙试验确定MSC经历成骨作用的能力(b)，成软骨作用的能力是由甲苯胺蓝染色和GAG蛋白定量确定(c)；结果代表4个生物学重复；

图12显示了，在第7代开始时，在无血清培养基中，分离的MSC的分化特征。对照为在10％FBS培养基中培养的MSC。MSC经历形成脂肪细胞的能力由油红O阳性液泡来确定(a)，茜素红染色以及阳性钙试验确定MSC经历成骨作用的能力(b)，成软骨作用由GAG蛋白的定量确定(c)；结果代表3个生物学重复；

图13显示了，在第3代开始时，在无血清培养基中，分离的MSC的血管生成分化特征。对照为在10％FBS培养基中培养的MSC；将MSC与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养，并量化所形成的小管的数量；结果表示为一百分比，其中单独的HUVEC形成的小管数设置为100％。结果代表4个生物学重复，n＝4；

图14显示了在无血清培养基中，培养的MSC向骨组织的体内分化；

图15显示了在无血清培养基中，培养的MSC向骨组织的体内分化；

图16显示了在缺氧和常氧条件下，使用无血清培养基和含血清培养基，培养的MSC的生长动力学和细胞形态学。图16A显示了MSC的生长动力学；图16B显示了所培养的MSC的细胞形态；图16C显示了来自4个不同的骨髓样本的细胞预测产量；

图17显示了在缺氧和常氧的条件下，无血清培养基相对于含血清培养基，培养的MSC的成骨分化。培养11天。平均值±SD，n＝4供体。比例尺：500um。**：P≤0.05；

图18显示了，在缺氧和常氧的条件下，无血清培养基相对于含血清的培养基，培养的MSC的成脂分化。平均值±SD，n＝4供体，比例尺：500um，*：P≤0.5；

图19显示了在缺氧和常氧的条件下，无血清培养基相对于含血清的培养基，培养的MSC的成软骨分化。培养18天。平均值±SD，比例尺：500um，n＝3供体；

图20显示了在缺氧和常氧的条件下，无血清培养基相对于含血清培养基，培养的MSC的促血管生成的能力。平均值±SD，比例尺：200um，n＝4供体；

图21显示了在缺氧和常氧的条件下，无血清培养基相对于含血清的培养基，培养的MSC的免疫原性程度。平均值±SD。n＝3MSC供体vs1MLR供体。统计：t检验；**P<0.05；以及

图22显示了在缺氧和常氧的条件下，无血清培养基相对于含血清的培养基，培养的MSC的表面细胞标志物表型。平均值±SD，n＝3供体(P3)。

具体实施方式

实施例1

图1显示了一个初步实验的结果，其中，4种附着因子支持在10％血清存在下分离的MSC在无血清环境中附着的能力在18h后检查；所述因子为：透明质酸(HA)、纤连蛋白(FN)、玻连蛋白(VN)、层粘连蛋白(LN)和表皮生长因子(EGF)。在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF2，FGF2)存在下附着的MSC的增殖在6天后也进行评估。结果表明，在无血清环境下18h后，玻连蛋白(0.5μg/ml)支持MSC附着最佳(图1)；然而，6天后，纤连蛋白(6μg/ml)显示出类似玻连蛋白(0.5μg/ml)的MSC产量(图2)。EGF(10ng/ml)也在传代过程后增加MSC的附着(图3)。

无血清培养基配方是基于描述培养牙髓干细胞的低血清细胞培养的文献(Tarleet al.，2010)选定的。基本培养基由以下组成：ITS(1％，BD)、抗坏血酸(10mM，SigmaAldrich)、***(10nM，Sigma Aldrich)、人血清白蛋白(50mg/ml，Sigma Aldrich)、青霉素/链霉素溶液(1％，Gibco)和MEM-α(Gibco)。接着检验一系列的生长因子对MSC增殖的影响。在无血清基础培养基中，MSC被附着在包被有纤连蛋白的组织培养塑料制品上48h。

抗坏血酸是维生素C源。MEM-α是最低必需培养基配方和缓冲液；其也提供，特别是，氨基酸，并且是一养分。***是类固醇和***样因子，HSA是蛋白源，以及ITS提供胰岛素、转铁蛋白(铁源)和硒酸。

基础培养基组成如下：

传代3次后，在第5、10和15天检测FGF2/FGF4和FGF7(1、5和10ng/ml)、PDGFaa/PDGFab和PDGFbb(1、5和10ng/ml)对MSC的增殖的影响。图4显示了FGF2(5ng/ml)、FGF4(5ng/ml)和PDGFab(10ng/ml)在无血清培养基中如何提高MSC的增殖。

为了进一步提高MSC的活力和增殖，在无血清基础培养基中加入脂蛋白。在血清存在下分离的MSC，在含FGF2的无血清培养基中，接种于涂有纤连蛋白的组织培养塑料制品上。起初，筛选一系列因子以支持胰蛋白酶消化后的MSC活力；检测***素E2(PGE2；50ug/ml)、胆固醇(30ug/ml)和脂蛋白(4ug/ml)对MSC在含FGF2(5ng/ml)的无血清培养基中的增殖的影响。低密度脂蛋白(40ug/ml；Sigma-Aldrich)显示出提高MSC增殖的作用，而PGE2和胆固醇具有抑制作用(图5a)。在传代3次后，脂蛋白提高在含有FGF2的无血清培养基中的MSC增殖(图5b)，并因此被加入到无血清培养基配方中。

起初，从3种骨髓分离MSC来确定合适的附着基质。玻连蛋白、透明质酸和纤连蛋白被筛选；在第1代结束时，纤连蛋白产生较多的集落形成单位(图6A)和最多的细胞数量(图6B)。接着，进一步的骨髓供体被筛选，以确定最佳纤连蛋白浓度；6ug/ml被选定为最适浓度(图6C和6D)。

为检测EGF在MSC分离和附着中的作用，5个骨髓被测试。在有FGF2(5ng/ml)存在下，MSC被分离在有EGF存在的包被有纤连蛋白的塑料制品上，或在有EGF存在的组织塑料制品上。结果表明，在骨髓供体之间存在变化，然而，得出的结论是，在此特定情况下，MSC的附着需要纤连蛋白(图7A和7B)。

为评估生长因子对MSC的增殖的影响，将4个骨髓样本接种于如表1所示的无血清基础培养基中包被有纤连蛋白的组织培养塑料制品上。

表1.添加到无血清基础培养基中的生长因子

条件	额外的生长因子
		1	FGF2(5ng/ml)
2	FGF2(5ng/ml)，EGF(10ng/ml)
		3	FGF2(5ng/ml)，FGF4(5ng/ml)
4	FGF2(5ng/ml)，FGF4(5ng/ml)，EGF(10ng/ml)
		5	FGF2(5ng/ml)，PDGFab(10ng/ml)
6	FGF2(5ng/ml)，PDGFab(10ng/ml)，EGF(10ng/ml)
		7	FGF2(5ng/ml)，TGFβ1(5ng/ml)
8	FGF2(5ng/ml)，TGFβ1(5ng/ml)EGF(10ng/ml)
		9	10％FBS

第1次传代后，MSC产量在不同条件问显示无差异；但是，第3代以后，条件1-6下累积群体倍增数广泛地下降。在所有条件中，条件7、8和9显示出平稳地增长(图8，骨髓1、2和3)。这些培养下的细胞产量见表2(注意，因此，表2中的培养基1和2分别对应表1中的培养基7和8)。

表2.图8实验中预测的每ml细胞产量

此外，无血清培养基显示出在促进来自5个供体的MSC的分离和增殖方面优于FBS，生长维持到第10代。此外，与生长在FBS中的培养物比较，在无血清培养基中MSC产量在3代末时是其十倍，在6代末时是其100倍之多。

为进一步评价MSC增殖，接种一额外的骨髓于如表3所示的无血清基础培养基中包被有纤连蛋白的组织培养塑料制品上。

表3.添加到无血清基础培养基的生长因子

条件	额外的生长因子
		5	FGF2(5ng/ml)，PDGFab(10ng/ml)
6	FGF2(5ng/ml)，PDGFab(10ng/ml)，EGF(10ng/ml)
		7	FGF2(5ng/ml)，TGFβ1(5ng/ml)
8	FGF2(5ng/ml)，TGFβ1(5ng/ml)，EGF(10ng/ml)
		10	FGF2(5ng/ml)，TGFβ1(5ng/ml)，PDGFab(10ng/ml)
11	FGF2(5ng/ml)，TGFβ1(5ng/ml)，PDGFab(10ng/ml)，EGF(10ng/ml)
		9	10％FBS

第1代后，MSC的产量在各条件之间没有明显的差异；但是，第2代后，条件5和6的累积群体倍增数下降。条件7、8、9、10和11在群体倍增数上稳步增加；然后，相对于条件7和8来说，PDGFab的添加(条件10和11)并没有增加MSC的产量(图9)。

MSC表面表型的表征是通过使用一面板的抗体去检测阳性和阴性标记来进行，这种分析是在第3、6和9代的末期进行。图10说明，与在10％FBS中培养的MSC相对比，无血清培养基(条件7和8)中培养的MSC，在标准面板的表面标记物表达上没有区别。此外，MSC的标记物CD90、CD73或CD105在第3、6和9代时仍然为阳性。然而，与血清培养的细胞相比，无血清条件7和8下培养的MSC具有较高的CD146表达，而且这在传代中得到保留。

为了进一步研究MSC表型，在第3代开始时，接种MSC于成脂肪、成骨和成软骨试验中。图11显示了不同MSC培养物形成脂肪细胞(图11a)、骨细胞(图11b)、软骨细胞(图11c)的能力没有差异。

为研究MSC表型的稳定性，在第7代开始时，再次接种MSC于成脂肪、成骨和成软骨试验中。图12显示MSC在后续传代后保留了其分化的能力，而且不同培养物形成脂肪细胞(图12a)、骨细胞(图12b)或软骨细胞(图12c)的能力没有差别。

为研究不同的MSC培养物的血管生成潜力，在第3代开始时，将MSC与人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)在基质胶上共培养。4小时后，对形成的小管的数量进行定量。为进一步评估MSC培养物分泌血管生成因子的情况，将来自2日龄的MSC培养物的MSC培养基加入到类似的基质胶上的HUVEC。

图13表明，与在10％FBS中培养的MSC相比，在含bFGF和TGFβ-1的无血清培养基中培养的MSC(无论有或没有EGF)形成较多的小管。此外，来自这些培养物的培养基也支持小管形成，因此说明这些无血清培养物有血管生成因子的释放。

图14和图15显示，在无血清培养基中培养的MSC在体内向骨组织分化。所产生的骨组织要优于对照实验中含血清培养基中的MSC产生的骨组织。

为了研究缺氧条件下MSC的培养是否增加细胞产量和/或维持骨髓来源的无血清MSC的特征，对无血清培养基的完整鉴定包括以下研究：生长动力学、细胞形态学、三系分化潜能、表面表型、促血管生成潜力和免疫学性质。这些实验的结果如图16所示，结果表明，与对照含血清培养基培养的细胞相比，缺氧培养的无血清培养基的细胞具有更优的生长动力学，同时也产生了更大的细胞产量。

实施例2

目的和方法

实施以下的操作以评估包含各种脂蛋白的本发明培养基对骨髓来源的MSC的增殖、分化、细胞形态学以及表面标记物表型的影响；以及评估对附着因子即纤连蛋白用于无血清培养基的需求。

培养基的制备

对脂蛋白的研究，制备的无血清(SF)培养基包括：无脂蛋白(No lipo)、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。其他存在的脂蛋白是乳糜微粒和中间密度脂蛋白，它们不在本研究评估之列，因为它们目前无法在市面上获得。

MSC培养

基于在SF培养基中的塑料附着，分离MSC：按照40x10⁶人骨髓单核细胞/T-175进行涂布，并于37℃，5％CO₂，21％O₂的条件下培养。当细胞一旦达到80-90％汇合时进行传代培养。在第3代(P3)末期时，评估MSC的生长动力学、三系分化和表面标记物表型。为了研究脂蛋白，SF培养基被改良为包含80ng/mL的各种脂蛋白中的一种，并将这些细胞接种于T175培养瓶中，所述培养瓶中已预包被有纤连蛋白。对于描述的纤连蛋白的研究，使用包含LDL的标准SF培养基(标准配方)，将细胞接种于T175培养瓶中，所述培养瓶没有纤连蛋白、预包被有纤连蛋白或者纤连蛋白添加到培养基本身。

为了传代SF细胞，对培养基充气，加入5ml的TrypLE于每一个T175培养瓶中。培养瓶在室温下孵育10min，在显微镜下观察细胞分离。一旦细胞分离，加入5ml的培养基，将细胞悬液转移至50mL离心管中，400xg离心5min。细胞生长到第3代(P3)时，将其用于三系分化研究或用于评估和流式细胞分析。

细胞样本的流式细胞分析如下所述。封闭液是在50mL管中，将1mL的小鼠血清加入到49mL的D-PBS中制备得到。FACS缓冲液是2％HSA溶液，用D-PBS制备得到的。

MSC染色

吸取1x10⁵细胞(100uL)到置于冰上的96孔板的8个孔的每个孔中，以及每种抗体一个孔，不染色细胞一个孔。接着将板在4℃、400g条件下离心4min。小心吸取悬浮液以免影响细胞团，每孔中加入50ul的封闭液，然后吹打溶液让细胞团重悬。将样本在封闭液中孵育1h。封闭后，和前面一样将板离心，重悬于50uL的包含合适抗体的FACS缓冲液中。样品与抗体在4℃的黑暗中孵育45min。与抗体孵育后，样品用FACS缓冲液洗涤三次，最后重悬于200μL的FACS缓冲液中，并转移到FACS管中。SYTOX红色死活细胞染料按照1:10000的最终稀释比例也添加到样品中，10分钟后利用BD FACS Canto II评估标志物的表达。

结果

进行CFU-f检测，将骨髓单核细胞(MNC)按照1x10⁶MNC/10cm²的密度一式三份接种于6孔板中。在第10天时，细胞用预冷的95％甲醇固定和2％结晶紫染色10min。然后，用PBS洗涤样品并成像。HDL组包含密集的CFU-f，而VLDL和LDL组包含分散的集落。

从骨髓中分离出MSC，并直接置于SF培养基中预包被有纤连蛋白的组织培养塑料制品上，所述SF培养基含或不含各种上述列出来的脂蛋白。观察到在含VLDL和LDL的组中CFU-f数量增加(是HDL的约3-5倍)。

对MSC的标志物CD105、CD73和CD90进行评估，并标准化至相同浓度下使用的他们的同型对照。观察到这些标志物的相当表达。此外，对CD146、CD271和W8B2进行评估。这些标志物都是之前被证明是保留在SF培养的MSC中，并在血清存在下丢失或大幅度减少。这些标志物的表达在供体之间变化很大，但MSC在暴露于不同的脂蛋白或在缺乏他们的情况下，没有观察到变化。

从骨髓中分离出MSC，直接涂布在组织培养塑料制品上，所述组织培养塑料制品没有预包被纤连蛋白、烧瓶预包被有纤连蛋白，或纤连蛋白添加到的培养基配方自身当中。***中有或没有纤连蛋白的存在，无论其是包含在培养基中或作为一个单独的预包被步骤，CFU-f的形成能力没有观察到区别。

结论

进行上述工作是为比较无血清中不同的特定脂蛋白，和评估纤连蛋白作为附着因子的需求。

在含HDL的SF培养基存在下的CFU-f形成密集细胞簇的CFU-f，细胞分枝(outgrowth)稀疏。相反，在包含VLDL的SF培养基或包含LDL的SF培养基中，分离的MSC形成的CFU-f具有分散的集落，其中细胞主要作为单个细胞被看见。VLDL和LDL参与在动脉中将脂肪运送到细胞，这可以表明为什么这些组的细胞形成更加分散、看起来更加健康的CFU-f。然而，在P3时，细胞全部有彼此相似的细胞形态，这可能表明，对于脂蛋白的一个需求可能仅仅是发生在MSC的初始分离中(在此情况下，从骨髓分离)。包含有VLDL或LDL的组中CFU-f数量增加。在每代结束时应用这些CFU-f数量和细胞产量来计算生长曲线。在脂蛋白组间没有观察到供体内差异，生长动力学方面,多个MSC供体的供体间差异一致。

为了进一步研究脂蛋白对MSC的影响，进行三系分化试验。成软骨作用通过测量硫酸化糖胺聚糖水平对DNA含量标准化的水平进行评估。基于这些结果，所有组之间没有观察到统计学差异。同样的，评估细胞的成骨潜力。细胞在标准的成骨培养基中培养10天，成骨作用通过测量钙水平作为形成的矿化基质的指标进行评估。在这些组内没有观察到统计学差异。成脂肪作用是通过测量脂肪形成进行评估，当用油红O染色时，脂肪形成会染成红色。与成骨作用和成软骨作用的情况一样，用各种脂蛋白培养的MSC的成脂肪潜力没有统计学差异。除了他们的三系潜力，MSC的特点是它们共表达CD90、CD105和CD73。在这之外，我们观察到，SF培养的MSC维持CD271、CD146和W8B2的表达，这些标记物是体内MSC的指示，其通常在体外培养早期或过程中丢失或显著减少。所有脂蛋白处理的细胞保持表达95％以上的MSC标志物CD105、CD73和CD90。所有组中也保持了CD271、CD146和W8B2的表达，但在高度可变的水平。然而，值得注意的是，由于各种脂蛋白的存在，这些标记物没有供体内差异。

基于上述结果，脂蛋白似乎对MSC的表面标志物表达、生长动力学或三系分化潜力没有影响。然而，脂蛋白的存在似乎对从骨髓中初始分离MSC是重要的。在含有HDL的SF培养基中建立的集落紧凑，看起来拥挤，而不能维持正常的CFU-f形态。此外，当在VLDL或LDL中分离时，获得的CFU-f的产量增加。基于上述数据，VLDL和LDL似乎比HDL更适合在无血清培养基中使用。

这项工作的最终目的是确定，在专门的无血清培养基中的MSC培养物的分离和建立中，纤连蛋白是否是必需的。添加纤连蛋白到无血清培养基也用来与培养表面预包被附着因子的标准做法做对比。这是通过看细胞的CFU-f数量和细胞生长动力学进行评估的，所述细胞从骨髓分离，直接置于没有纤连蛋白的组织培养塑料制品上、置于预包被有纤连蛋白的组织培养塑料制品上，和最后置于本身加入纤连蛋白的培养基中。从骨髓分离的标准化至MNC计数的CFU-f数量没有观察到差异。同样，在有或无纤连蛋白存在下，MSC培养物的生长动力学都没有受到影响，说明本发明无血清培养基中附着因子对于MSC的分离或增殖不是必须的。

因此，本发明提供了一种用于干细胞生长的培养基，所述培养基不使用血清作为培养基的组分；本发明还提供了利用该培养基的方法和使用该培养基产生的细胞。

Claims

1.一种培养间充质干细胞的无血清培养基，其包括：

(a)成纤维细胞生长因子(FGF)；

(b)转化生长因子β(TGF-β)；和

(c)脂蛋白。

2.根据权利要求1所述的培养基，其中该培养基中的脂蛋白浓度为1μg/ml～100μg/ml。

3.根据权利要求1-2任一项所述的培养基，其中该培养基的脂蛋白组分包括下述一种或多种：

(a)高密度脂蛋白(HDL)；

(b)低密度脂蛋白(LDL)；

(c)中间密度脂蛋白(IDL)；及

(d)极低密度脂蛋白(VLDL)。

4.根据权利要求3所述的培养基，其包括LDL。

5.根据权利要求4所述的培养基，其中LDL包括下述一种或多种或全部：

(a)大而轻LDL(lb LDL)颗粒；

(b)小而密LDL(sd LDL)颗粒；和

(c)脂蛋白(a)(Lp(a))。

6.根据权利要求4或5所述的培养基，其包括直径为15nm～30nm的LDL颗粒。

7.根据权利要求3所述的培养基，其包括VLDL。

8.根据权利要求7所述的培养基，其包括直径为30nm-80nm的VLDL颗粒。

9.根据前面的权利要求任一项所述的培养基，其中该培养基的FGF组分为FGF2(bFGF)，可选地浓度为1ng/ml至10ng/ml。

10.根据前面的权利要求任一项所述的培养基，其中该培养基的TGFβ组分为TGFβ-1，可选地浓度为1ng/ml至20ng/ml。

11.根据前面的权利要求任一项所述的培养基，其中该培养基还包括或基于一基础培养基。

12.根据前面的权利要求任一项所述的培养基，其中该培养基还包括***、人血清白蛋白和/或胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)。

13.根据前面的权利要求任一项所述的培养基，其中该培养基不包含其他的生长因子。

14.一种培养间充质干细胞例如人间充质干细胞的方法，包括在权利要求1-13任一项所述的培养基中孵育干细胞。

15.一种组合物，其在(b)权利要求1-13任一项所述的培养基中，包含(a)人类干细胞。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述干细胞为间充质干细胞、成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞或血管生成细胞。

17.权利要求1-13任一项所述的培养基中的干细胞，其用在医学上。

18.权利要求1-13任一项所述的培养基中的干细胞，其用在骨组织、血管组织、软骨组织或脂肪组织的形成中。