CN113234672B - 一种人间充质干细胞培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞培养技术领域，公开了一种人间充质干细胞培养基及其应用。本发明所述培养基以DMEM/F12为基础培养基添加如下成分：人血白蛋白、人转铁蛋白、人胰岛素、纤连蛋白、胆固醇、***钠、氢化可的松、腐胺、β‑巯基乙醇、乙醇胺、L‑抗坏血酸、bFGF、EGF、PDGF‑BB、SCF、烟酰胺和阿卡地新。本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基，在优化培养基成分的基础上，添加了四种特定生长因子、阿卡地新和烟酰胺，可以增强细胞的增殖能力，在细胞传代过程中，减缓细胞的衰老过程，同时适用于间充质干细胞原代培养。

Description

一种人间充质干细胞培养基及其应用
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，更具体的说是涉及一种人间充质干细胞培养基及其应用。
背景技术
间充质干细胞是目前倍受关注的一类具有自我更新能力和多向分化潜能的组织干细胞，可以从脐带、脂肪、胎儿血液、骨髓、肝脏等组织获得。MSCs虽来源于中胚层，但在特定条件下，可分化为各胚层的多种细胞或组织，如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经样细胞、内皮细胞以及肝细胞等，这为临床应用间充质干细胞治疗多种疾病提供了一个广阔的前景。但在MSCs质量研究及临床前研究上，细胞数的需求量较大，需要建立适宜的培养条件进行体外扩增。
传统方法中，干细胞的培养体系主要应用含动物血清(如胎牛血清)的培养基，但是动物血清所带来的异源性污染和已知或未知的病毒、支原体等病原体污染，在此种环境下生长的干细胞，其内部结构会发生何种变化尚未可知，为MSCs的临床研究带来潜在的风险。相比较而言，无血清培养体系的研发对MSCs临床应用的标准化和安全性具有重要的意义。
市场上商品化的MSCs无血清培养基如Stem Cell公司的Mesent Cult-XF Medium，Gibco公司的Stem PRO MSC SFM等基本都从国外进口，价格昂贵，并且细胞生长周期短，细胞增殖效果不够理想，细胞衰老快，不适用于原代分离培养等缺点。
国内的一些产品和技术同样面临类似的问题：(1)无血清培养基成分复杂、配制困难；(2)培养基组份虽相对简单，但细胞存在体外长期培养，会发生衰老，细胞增殖率和多向分化能力下降。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人间充质干细胞培养基，使得所述培养基无需添加血清，并可增强细胞的增殖能力，在细胞传代过程中，减缓细胞的衰老过程，同时可适用于间充质干细胞原代培养。
本发明的另外一个目的在于提供上述培养基在制备间充质干细胞中的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种人间充质干细胞培养基，以DMEM/F12为基础培养基添加如下成分：
人血白蛋白、人转铁蛋白、人胰岛素、纤连蛋白、胆固醇、***钠、氢化可的松、腐胺、β-巯基乙醇、乙醇胺、L-抗坏血酸、bFGF、EGF、PDGF-BB、SCF、烟酰胺和阿卡地新。
为解决商品化无血清培养基高成本及目前无血清培养基培养条件下间充质干细胞在传代中易于老化的问题，本发明在优化培养基成分的基础上，主要添加了4种特定的促进细胞生长的因子和能延缓细胞衰老的烟酰胺(Nicotinamide,NAM)和阿卡地新(5-氨基咪唑-4-羧基酰胺核糖核苷，AICAR)，组成间充质干细胞无血清培养基的最优配方，4种生长因子适配于烟酰胺与阿卡地新，可促进间充质干细胞的各项性能。
作为优选，各成分在基础培养基中的浓度为：
人血白蛋白10-20g/L、人转铁蛋白5-20mg/L、人胰岛素1-10mg/L、纤连蛋白1-5mg/L、胆固醇5-30μg/ml、***钠30-50nmol/L、氢化可的松10-50μg/L、腐胺5-30mg/L、β-巯基乙醇5×10-5M、乙醇胺1-3μg/ml、L-抗坏血酸1-50mg/L、bFGF 5-10ng/ml、EGF 5-10ng/ml、PDGF-BB 5-10ng/ml、SCF5-10ng/ml、烟酰胺5-10mM、阿卡地新1-3mM。
在本发明具体实施方式中，所述各成分在基础培养基中的浓度为：
人血白蛋白10g/L、人转铁蛋白10mg/L、人胰岛素5mg/L、纤连蛋白5mg/L、胆固醇20μg/ml、***钠30nmol/L、氢化可的松20μg/L、腐胺15mg/L、β-巯基乙醇5×10-5M、乙醇胺1μg/ml、L-抗坏血酸25mg/L、bFGF 10ng/ml、EGF10ng/ml、PDGF-BB 10ng/ml、SCF 5ng/ml、烟酰胺5mM、阿卡地新1mM。
在本发明具体实施方式中，所述培养基中bFGF、EGF、PDGF-BB、SCF、人血白蛋白、人转铁蛋白和人胰岛素为重组人bFGF、重组人EGF、重组人PDGF-BB、重组人SCF、重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白和重组人胰岛素。所述重组是指利用基因重组技术，将可以翻译成目标蛋白的基因片段通过载体转入可以表达特定重组蛋白分子的宿主细胞中，从而制备获得目标蛋白，其具有和天然目标蛋白相同结构和功能，也可通过市售途径购买。
与不同成分的培养基以及商用培养基对比，本发明培养基用于间充质干细胞的制备、传代和培养能够缩短原代间充质干细胞的出现时间，提高间充质干细胞的增殖速度，延缓其衰老进程使其稳定传代至P10代不出现明显的衰老现象，同时保证其潜在的分化能力。基于此，本发明提出了所述培养基在制备间充质干细胞中的应用。
作为优选，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或胎盘间充质干细胞。
同时，本发明还提供了一种制备间充质干细胞的方法，取含有间充质干细胞的组织材料，采用本发明所述培养基进行培养制备。其中，所述含有间充质干细胞的组织材料为脐带、脂肪、脐血、胎盘和骨髓。
在本发明具体实施方式中，本发明分别提供了一种利用脐带和脂肪组织获得间充质干细胞的方法。在脐带间充质干细胞分离培养中，将脐带清洗并剪碎，与培养皿中添加所述培养基进行原代培养，培养过程中定期换液，细胞在培养皿内长出，汇合度达80％后，用Tryspin-EDTA消化并收获细胞，以细胞密度8000个/cm2或其他合适的密度接种传代；
在脂肪间充质干细胞分离培养中，清洗乳糜状脂肪，添加胶原酶消化，消化后组织液过滤，洗涤，然后离心去上清并添加所述培养基培养重悬细胞沉淀、培养，培养过程中定期换液，汇合度达80％后，用Tryspin-EDTA消化并收获细胞，以细胞密度8000个/cm2或其他合适的密度接种传代。
由以上技术方案可知，本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基，在优化培养基成分的基础上，添加了四种特定生长因子、阿卡地新和烟酰胺，可以增强细胞的增殖能力，在细胞传代过程中，减缓细胞的衰老过程，同时适用于间充质干细胞原代培养。
附图说明
图1所示为实施例1中培养基组份1培养的脐带MSCs P10细胞形态；
图2所示为实施例1中培养基组份3培养的脐带MSCs P10细胞形态；
图3所示为实施例2中培养基组份1、培养基组份4和培养基组份5培养的MSCs P5细胞生长曲线；
图4所示为脐带MSCs P5/P10细胞成脂诱导分化油红O染色结果；
图5所示为脐带MSCs P5/P10细胞成骨诱导分化茜素红染色结果；
图6所示为脐带MSCs P5/P10细胞成软骨诱导分化阿利新蓝染色结果；
图7所示为本发明培养基制备的脂肪间充质干细胞P10细胞形态。
具体实施方式
本发明公开了一种人间充质干细胞培养基及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述培养基及其应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的培养基及其应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所涉及的对比试验中，除去记载的区别外，其他实验条件、原料来源均保持一致。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：脐带间充质干细胞的培养制备
无菌采集脐带，长度约为10cm，用0.9％的生理盐水清洗5遍后，将脐带组织机械剪碎，剪碎组织块大小为2mm3，分别均匀的放置于10cm细胞培养皿中，贴壁的组织块之间的间隙为5-10mm，留出充分的空间使间充质干细胞进行原代生长，每个培养皿中分别加入培养基组份1、培养基组份2和培养基组份3，置37℃、5％CO2培养箱培养，随后每3-4d换液1次，细胞在培养皿内长出，汇合度达80％后，用Tryspin-EDTA消化并收获细胞，以细胞密度8000个/cm2接种传代培养至P10代，观察细胞形态。
所用培养基如下：
培养基组份1：DMEM/F12、重组人血白蛋白10g/L、重组人转铁蛋白10mg/L、重组人胰岛素5mg/L、纤连蛋白5mg/L、胆固醇20μg/ml、***钠30nmol/L、氢化可的松20μg/L、腐胺15mg/L、β-巯基乙醇5×10-5M、乙醇胺1μg/ml、L-抗坏血酸25mg/L、重组人bFGF 10ng/ml、重组人EGF 10ng/ml、重组人PDGF-BB 10ng/ml、重组人SCF 5ng/ml、烟酰胺5mM、阿卡地新1mM。
培养基组份2：DMEM/F12、重组人血白蛋白10g/L、重组人转铁蛋白10mg/L、重组人胰岛素5mg/L、纤连蛋白5mg/L、胆固醇20μg/ml、***钠30nmol/L、氢化可的松20μg/L、腐胺15mg/L、β-巯基乙醇5×10-5M、乙醇胺1μg/ml、L-抗坏血酸25mg/L、烟酰胺5mM、阿卡地新1mM。
培养基组份3：间充质干细胞无血清培养基(NC0103+NC0103.S)，购自友康恒业生物科技(北京)有限公司。
显微镜下观察3种培养基是否支持原代细胞培养，用3种培养基培养脐带MSCs至P10观察不同代次细胞形态。
培养结果显示，培养基组份2不支持细胞原代分离，无法获得间充质干细胞，培养基组份1和3可用于原代细胞分离培养。用培养基组份1培养的细胞培养至P10代，各代次细胞形态均呈典型的短小梭形，形态均一、轮廓清晰，无明显差别(图1)。培养基组份3培养的细胞，培养至P5代时，细胞形态不均，部分细胞变长或变成不规则形状，培养至P10细胞大部分变长或成不规则形状，细胞明显衰老(图2)。
实施例2：脐带间充质干细胞的培养制备
1、原代培养实验
无菌采集脐带，长度约为10cm，用0.9％的生理盐水清洗5遍后，将脐带组织机械剪碎，剪碎组织块大小为2mm3，分别均匀的放置于10cm细胞培养皿中，贴壁的组织块之间的间隙为5-10mm，留出充分的空间使间充质干细胞进行原代生长，每个培养皿中分别加入培养基组份1、培养基组份2、培养基组份3、培养基组份4和培养基组份5，置37℃、5％CO2培养箱培养，随后每3-4d换液1次，细胞在培养皿内长出，汇合度达80％后，用Tryspin-EDTA消化并收获细胞，以细胞密度8000个/cm2接种传代培养至P10代，观察细胞形态。
培养基组份1：DMEM/F12、重组人血白蛋白10g/L、重组人转铁蛋白10mg/L、重组人胰岛素5mg/L、纤连蛋白5mg/L、胆固醇20μg/ml、***钠30nmol/L、氢化可的松20μg/L、腐胺15mg/L、β-巯基乙醇5×10-5M、乙醇胺1μg/ml、L-抗坏血酸25mg/L、重组人bFGF 10ng/ml、重组人EGF10ng/ml、重组人PDGF-BB 10ng/ml、重组人SCF 5ng/ml、烟酰胺5mM、阿卡地新1mM。
培养基组份2：DMEM/F12、重组人血白蛋白10g/L、重组人转铁蛋白10mg/L、重组人胰岛素5mg/L、纤连蛋白5mg/L、胆固醇20μg/ml、***钠30nmol/L、氢化可的松20μg/L、腐胺15mg/L、β-巯基乙醇5×10-5M、乙醇胺1μg/ml、L-抗坏血酸25mg/L、重组人EGF 10ng/ml、烟酰胺5mM、阿卡地新1mM。
培养基组份3：DMEM/F12、重组人血白蛋白10g/L、重组人转铁蛋白10mg/L、重组人胰岛素5mg/L、纤连蛋白5mg/L、胆固醇20μg/ml、***钠30nmol/L、氢化可的松20μg/L、腐胺15mg/L、β-巯基乙醇5×10-5M、乙醇胺1μg/ml、L-抗坏血酸25mg/L、重组人bFGF 10ng/ml、重组人EGF 10ng/ml、烟酰胺5mM、阿卡地新1mM。
培养基组份4：DMEM/F12、重组人血白蛋白10g/L、重组人转铁蛋白10mg/L、重组人胰岛素5mg/L、纤连蛋白5mg/L、胆固醇20μg/ml、***钠30nmol/L、氢化可的松20μg/L、腐胺15mg/L、β-巯基乙醇5×10-5M、乙醇胺1μg/ml、L-抗坏血酸25mg/L、重组人bFGF 10ng/ml、重组人EGF 10ng/ml、重组人PDGF-BB 10ng/ml、烟酰胺5mM、阿卡地新1mM。
培养基组份5：DMEM/F12、重组人血白蛋白10g/L、重组人转铁蛋白10mg/L、重组人胰岛素5mg/L、纤连蛋白5mg/L、胆固醇20μg/ml、***钠30nmol/L、氢化可的松20μg/L、腐胺15mg/L、β-巯基乙醇5×10-5M、乙醇胺1μg/ml、L-抗坏血酸25mg/L、重组人bFGF 10ng/ml、重组人EGF 10ng/ml、重组人PDGF-BB 10ng/ml、重组人IGF-Ⅰ10ng/ml、烟酰胺5mM、阿卡地新1mM。
显微镜下观察5种培养基是否支持原代细胞培养，用5种培养基培养脐带MSCs至P10，观察不同代次细胞形态。
细胞培养结果表明：培养基组份1培养的脐带组织5天即有细胞长出，培养至14天细胞汇合度达约80％；培养基组份2和3培养的脐带组织培养至第10天有少量细胞长出，14天后细胞汇合度较低，不适合原代细胞培养；培养基组份4和组份5培养的脐带组织5天开始有细胞长出，培养至14天细胞汇合度为70％-80％。因此，选择培养基组分1、4和5进行后续细胞增殖实验。
2、细胞增殖实验
将来源相同的脐带MSCs P5(按实施例1培养基组分1制备获得)分别用培养基组份1、培养基组份4和培养基组份5调整细胞密度为1×104个/ml，分别加入96孔细胞培养板中5个孔中，100μl/孔。每种培养基共接种五块96孔板，置37℃，5％CO2培养箱中培养，分别于孵育24/48/72/96/168小时后，取1块96孔板，每孔加入10μl的CCK8溶液，将培养板置培养箱中孵育3小时，酶标仪读取OD450吸光值，绘制细胞在不同培养基中的生长曲线。
实验结果见图3，培养基组份1培养的细胞生长较快，且培养72小时后，相同时间培养基组份1培养的细胞细胞数量较多，且与培养基组份4和组份5相比差异显著(P＜0.05)。
实施例3：脐带间充质干细胞表型鉴定结果和诱导分化
1、表型鉴定
将经过实施例1中培养基组分1制备的脐带MSCs P5和P10代细胞，弃培养液，0.9％氯化钠注射液洗涤1次，用Tryspin-EDTA消化，300g离心5min，用0.9％氯化钠注射液洗涤1次，调整细胞数为1×106个/管，加入2.5μl抗体，4℃孵育30min，用0.9％氯化钠注射液洗涤2次，最后用300μl的0.9％氯化钠注射液重悬细胞，流式细胞仪检测。结果见表1，本发明的无血清培养基培养的P5和P10代细胞CD73、CD90、CD105、CD44的表达量均≥95％，CD14、CD19、HLA-DR、CD34、CD45的表达量均≤2％，均符合脐带间充质干细胞表面标志物要求。
表1脐带间充质干细胞P5和P10表型鉴定结果
Figure BDA0003101006710000071
Figure BDA0003101006710000081
2、诱导分化
将经过实施例1中培养基组分1制备的脐带MSCs P5和P10代细胞，定向诱导分化为骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。实验结果表明，采用本发明培养基培养的脐带间充质干细胞未影响细胞的分化潜能，且细胞传至第10代能具有分化潜能，见图4-图6。
实施例4：脂肪间充质干细胞的制备和表型鉴定
1、制备
取出乳糜状脂肪，用0.9％氯化钠注射液冲洗，去除血渍，直至洗涤液较清澈。加入等体积的胶原酶，置37℃恒温摇床上消化30-40min。将消化后的组织液过滤，收集消化液至50ml离心管内，用0.9％氯化钠注射液定容至40-45ml，500g离心5min。离心后弃上清，用适量的培养基(实施例1培养基组分1)重悬离心后的沉淀，对收获的细胞进行计数，按8000个/cm2的细胞密度接种于10cm细胞培养皿内，置37℃、5％CO2培养箱培养。培养24h后换液，之后每4-5天换液1次，当细胞汇合度达80％时，用Tryspin-EDTA消化并收获细胞，以8000个/cm2的细胞密度接种传代，培养至P10代。图7是使用发明的无血清培养基培养的P10代脂肪间充质干细胞的形态，呈纤维样，漩涡状生长。
2、表型鉴定
取上述方法制备的脂肪MSCs P5和P10代细胞，弃培养液，用0.9％氯化钠注射液洗涤1次，用Tryspin-EDTA消化，300g离心5min，0.9％氯化钠注射液洗涤1次，调整细胞数为1×106个/管，加入2.5μl抗体，4℃孵育30min，用0.9％氯化钠注射液洗涤2次，最后用300μl的0.9％氯化钠注射液重悬细胞，流式细胞仪检测。结果见表2，本发明的无血清培养基培养的脂肪MSCs P5和P10代细胞CD73、CD90、CD105、CD44的表达量均≥95％，CD14、CD19、HLA-DR、CD34、CD45的表达量均≤2％，均符合脂肪间充质干细胞表面标志物要求。
表2脂肪间充质干细胞P5和P10表型鉴定结果
Figure BDA0003101006710000091
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种人间充质干细胞培养基，其特征在于，以DMEM/F12为基础培养基添加如下成分：
人血白蛋白、人转铁蛋白、人胰岛素、纤连蛋白、胆固醇、***钠、氢化可的松、腐胺、β-巯基乙醇、乙醇胺、L-抗坏血酸、bFGF、EGF、PDGF-BB、SCF、烟酰胺和阿卡地新；
各成分在基础培养基中的浓度为：
人血白蛋白10-20g/L、人转铁蛋白5-20mg/L、人胰岛素1-10mg/L、纤连蛋白1-5mg/L、胆固醇5-30μg/ml、***钠30-50nmol/L、氢化可的松10-50μg/L、腐胺5-30mg/L、β-巯基乙醇5×10-5M、乙醇胺1-3μg/ml、L-抗坏血酸1-50mg/L、bFGF 5-10ng/ml、EGF 5-10ng/ml、PDGF-BB 5-10ng/ml、SCF 5-10ng/ml、烟酰胺5-10mM、阿卡地新1-3mM。
2.根据权利要求1所述培养基，其特征在于，所述各成分在基础培养基中的浓度为：
人血白蛋白10g/L、人转铁蛋白10mg/L、人胰岛素5mg/L、纤连蛋白5mg/L、胆固醇20μg/ml、***钠30nmol/L、氢化可的松20μg/L、腐胺15mg/L、β-巯基乙醇5×10-5M、乙醇胺1μg/ml、L-抗坏血酸25mg/L、bFGF 10ng/ml、EGF 10ng/ml、PDGF-BB 10ng/ml、SCF 5ng/ml、烟酰胺5mM、阿卡地新1mM。
3.根据权利要求1-2任意一项所述培养基，其特征在于，所述bFGF、EGF、PDGF-BB、SCF、人血白蛋白、人转铁蛋白和人胰岛素为重组人bFGF、重组人EGF、重组人PDGF-BB、重组人SCF、重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白和重组人胰岛素。
4.权利要求1-3任意一项所述培养基在制备间充质干细胞中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或胎盘间充质干细胞。
6.一种制备间充质干细胞的方法，其特征在于，取含有间充质干细胞的组织材料，采用权利要求1-3任意一项所述培养基进行培养制备。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述含有间充质干细胞的组织材料为脐带、脂肪、脐血、胎盘和骨髓。
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