CN102041245A - 一种诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的试剂盒及其应用和诱导细胞分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的试剂盒及方法。该试剂盒包括成骨细胞诱导培养液和成骨细胞鉴定液。诱导培养液包括细胞培养液A、细胞培养液B、细胞培养液C、细胞培养液D、细胞培养液E。成骨细胞鉴定液包括细胞固定液、染色剂和洗涤剂。所述细胞培养液A为α-MEM液体培养基；细胞培养液B为胎牛血清；细胞培养液C为***溶液；细胞培养液D为β-甘油磷酸钠溶液；细胞培养液E为维生素C溶液；细胞固定剂为4％的多聚甲醛；染色剂为硫代硫酸钠、硝酸银和中性红；洗涤剂为双蒸水。

Description

一种诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的试剂盒及其应用和诱导细胞分化的方法

技术领域

本发明涉及一种诱导细胞分化的试剂盒及其应用和诱导细胞分化的方法，具体地，涉及一种诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的试剂盒及其应用和诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，可分化为成骨细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经细胞、肝细胞等多种组织细胞，临床上正应用于组织工程、基因治疗、细胞因子替代治疗等领域。骨髓间充质干细胞以其他干细胞无以比拟的优越性成为骨组织工程种子细胞的理想来源。

骨折后不愈合或延迟愈合的主要原因为缺乏足够数量的成骨细胞。利用自体骨髓细胞进行体外诱导分化为成骨，将扩增的细胞移植到骨折处，促进骨折愈合，可以缩短愈合时间。

先前对骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的研究中，诱导剂包含有新生小牛血清、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、***、β-甘油磷酸钠、维生素C、低糖DMEM等多种材料，不仅增加操作的复杂性，而且易对骨髓间充质干细胞造成干扰，影响骨髓间充质干细胞向成骨细胞的转化。

发明内容

为了解决骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种诱导细胞分化的试剂盒，其用于诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。进一步地，该试剂盒可用于进行成骨细胞鉴定。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了所述试剂盒在将大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞中的应用。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种诱导细胞分化的方法，采用该方法可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化。进一步地，采用该方法可以进行成骨细胞鉴定。

在本发明中，一种诱导细胞分化的试剂盒包括成骨细胞诱导培养液，该成骨细胞诱导培养液包括0.1mM***溶液、50mM维生素C溶液、以及胎牛血清。

所述成骨细胞诱导培养液还进一步包括1Mβ-甘油磷酸钠溶液，α-MEM液体培养基作为上述材料的溶剂和定容剂。

在本发明中，所述脂肪细胞诱导培养液可以是各组分的混合液，也可以将各组分单独包装贮存，临用时混合配制。

本发明的成骨细胞诱导培养液主要成分包括***、β-甘油磷酸钠和维生素C。***可以诱导骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性，促进成骨标记蛋白、***和胶原mRNA的表达，刺激细胞外胶原机制的生物合成、钙的沉积和矿化结节形成，但高浓度的***可诱导其向脂肪细胞分化。我们选择应用浓度为0.1mM的***溶液，既保证了其刺激碱性磷酸酶活性的特性，又防止发生其向脂肪细胞方向分化。β-甘油磷酸钠可以为成骨细胞提供磷酸离子，从而加速结节钙化。维生素C的作用主要促进细胞合成胶原，形成钙化。利用本发明的成骨细胞诱导培养液进行骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化，可以方便、有效的诱导出所需成骨细胞。

在一个具体实施方式中，所述成骨细胞诱导培养液包括细胞培养液A，细胞培养液B，细胞培养液C，细胞培养液D，细胞培养液E。其中，所述细胞培养液A为α-MEM液体培养基，细胞培养液B为胎牛血清，细胞培养液C为0.1mM***溶液，所述细胞培养液D为1Mβ-甘油磷酸钠溶液，所述细胞培养液E为50mM维生素C溶液。

所述成骨细胞诱导培养液中各组分可以优选按照以下比例进行配制：0.1mM***溶液5μl～15μl，1Mβ-甘油磷酸钠溶液0.5ml～1.5ml，50mM维生素C溶液80μl～120μl，胎牛血清5ml～15ml，加α-MEM液体培养基定容到100ml。

在一个优选实施例中，实验中所用成骨细胞诱导细胞培养液组分比例如下：0.1mM***溶液10μl，1Mβ-甘油磷酸钠溶液1ml，50mM维生素C溶液100μl，胎牛血清10ml，加α-MEM液体培养基定容到100ml。采用此配置比例，可以有效的将骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞。

本发明的试剂盒还可进一步包括成骨细胞鉴定液，该成骨细胞鉴定液包括细胞固定液、染色剂、以及洗涤剂。所述成骨细胞鉴定液包括细胞固定液、染色剂和洗涤剂。其中，所述细胞固定剂为4％的多聚甲醛溶液，所述细胞染色液为染色剂可为5％硫代硫酸钠溶液、1％硝酸银溶液和1％中性红溶液，所述细胞洗涤剂可为双蒸水。

本发明的成骨细胞鉴定液主要成分包括细胞固定液、染色剂、以及洗涤剂。4％的多聚甲醛溶液主要起到固定细胞作用。将双蒸水作为细胞洗涤剂主要是防止混进离子成分。细胞染色剂主要包括5％硫代硫酸钠溶液、1％硝酸银溶液和1％中性红溶液，由于骨髓间充质干细胞在诱导成骨过程中产生大量酸性物质，利用硫代硫酸钠溶液可去除氢离子，此时分别加入硝酸银溶液和硫代硫酸钠溶液，可以使金属银更好的显现出来，间接证实了钙结节的存在，中性红主要是体现细胞的结构特征。

本发明所提供的诱导细胞分化的方法包括以下步骤：

a、获取并扩增大鼠骨髓间充质干细胞；

b、将所述大鼠骨髓间充质干细胞转入成骨细胞诱导培养液中培养3～5周，所述成骨细胞诱导培养液包括以所述成骨细胞诱导培养液的体积为100ml计，300-330mg的β-甘油磷酸钠、850～910μg的维生素C、以及适量的液体培养基。

上述方法可进一步包括以下步骤：

c、弃去所述成骨细胞诱导培养液，用固定液固定细胞之后，加入染色剂孵育；

d、加入细胞洗涤剂冲洗，然后染色；

e、加入细胞洗涤剂冲洗后再染色，双蒸水漂洗后观察分化后的成骨细胞。

在步骤d和e中，所述细胞洗涤剂可为双蒸水；在步骤c中，所述染色剂可为5％硫代硫酸钠溶液；在步骤d中，可采用1％硝酸银溶液进行染色；在步骤e中，可采用1％中性红溶液进行染色。

本发明提供了一种诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的试剂盒，其主要包括成骨细胞诱导培养液和成骨细胞鉴定液。

本发明所采用的技术方案是：利用快速制备骨髓间充质干细胞的试剂盒取得大量细胞后，加入成骨细胞诱导培养液，体外诱导4周后，利用成骨细胞鉴定液对成骨细胞进行鉴定。

本发明进行诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的过程包括：

1、骨髓间充质干细胞的原代分离培养和传代扩增：

将细胞利用洗涤液从骨髓腔内冲出，利用快速制备骨髓间充质干细胞的试剂盒取得大量细胞，为细胞形态呈梭形的骨髓间充质干细胞。

2、诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化：

弃除培养瓶的培养液，用洗涤液充分清洗细胞，传代至培养皿内，加入成骨细胞诱导培养液，每周换液2次，放置在37℃的二氧化碳孵箱内连续培养4周。

3、成骨细胞的鉴定：

从孵箱内取出诱导4周的细胞培养皿，弃去细胞诱导液，4％的多聚甲醛固定，5％的硫代硫酸钠孵育30分钟，双蒸水冲洗，用1％硝酸银溶液强光下染色15分钟，双蒸水冲洗掉浮于细胞表面的黑色物质，继续5％的硫代硫酸钠溶液染色2分钟，1％的中性红复染10分钟，双蒸水漂洗后观察。

本发明的有益效果是：可以利用此试剂盒和方法，将骨髓间充质干细胞有效诱导分化为成骨细胞，既证实了骨髓间充质干细胞的分化能力，又可得到大量成骨细胞，利于成骨细胞缺乏的修复。

为了更好地理解本发明的本质，下面结合附图通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。

附图说明

图1：骨髓间充质干细胞加入成骨细胞诱导液4周后加入成骨细胞鉴定液后细胞观察图。

图2：骨髓间充质干细胞加入普通细胞培养液4周后加入成骨细胞鉴定液后细胞观察图。

具体实施方式

下面结合本发明实施来进一步说明本发明的实质性内容，但不以此来限制本发明。本发明所用试验材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

一、制备用于诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的试剂盒

(一)溶液配制

本发明用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒包括以下制剂：

1、成骨细胞诱导培养液：包括细胞培养液A，细胞培养液B，细胞培养液C，细胞培养液D，细胞培养液E。其中，所述细胞培养液A为α-MEM液体培养基，细胞培养液B为胎牛血清，细胞培养液C为0.1mM***溶液，所述细胞培养液D为1Mβ-甘油磷酸钠溶液，所述细胞培养液E为50mM维生素C溶液。

成骨细胞诱导细胞培养液组分比例如下：0.1mM***溶液10μl，1Mβ-甘油磷酸钠溶液1ml，50mM维生素C溶液100μl，胎牛血清10ml，加α-MEM液体培养基定容到100ml。

2、成骨细胞鉴定液：所述成骨细胞鉴定液包括细胞固定液、染色剂和洗涤剂。其中，所述细胞固定剂为4％的多聚甲醛溶液，所述细胞染色液为染色剂为5％硫代硫酸钠溶液、1％硝酸银溶液和1％中性红溶液，所述细胞洗涤剂为双蒸水。

(二)试剂盒的分装

试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量：0.1mM***溶液1管(10μl/管)，1Mβ-甘油磷酸钠溶液1管(1ml/管)，50mM维生素C溶液1管(100μl/管)，胎牛血清1瓶(10ml/瓶)，α-MEM液体培养基1瓶(88.89ml/瓶)，4％的多聚甲醛溶液1瓶(20ml/瓶)，5％硫代硫酸钠溶液1瓶(20ml/瓶)，1％硝酸银溶液1瓶(20ml/瓶)，1％中性红溶液1瓶(20ml/瓶)，双蒸水1瓶(20ml/瓶)。按上述剂量说明对试剂盒中各组分进行包装，即可得到诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的试剂盒。

二、骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化

利用步骤一中所述试剂盒进行骨髓间充质干细胞向成骨细胞进行诱导分化。

(一)骨髓间充质干细胞的原代培养及传代扩增：

4周龄清洁级SD大鼠1只，颈椎脱臼处死，利用快速制备骨髓间充质干细胞的试剂盒(主要包括磷酸盐缓冲液、α-MEM液体培养基、胎牛血清、胰蛋白酶液)进行培养，短期内获得可用的骨髓间充质干细胞。

(二)诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化：

弃除培养瓶的培养液，用洗涤液充分清洗细胞，传代至培养皿内，加入成骨细胞诱导培养液，每周换液2次，放置在37℃的二氧化碳孵箱内连续培养4周。另外利用相同条件下获得的骨髓间充质干细胞，加入普通培养液，每周换液2次，放置在37℃的二氧化碳孵箱内连续培养4周作为对照。

(三)成骨细胞的鉴定：

从孵箱内取出诱导4周的细胞培养皿，弃去细胞诱导液，4％的多聚甲醛固定，5％的硫代硫酸钠孵育30分钟，双蒸水冲洗，用1％硝酸银溶液强光下染色15分钟，双蒸水冲洗掉浮于细胞表面的黑色物质，继续5％的硫代硫酸钠溶液染色2分钟，1％的中性红复染10分钟，双蒸水漂洗后观察。

显微镜下观察，细胞形态由梭形改变为多角形，细胞呈多层性、重叠性排列，形成间质内含大量矿盐沉积的钙化结节，染色剂染色阳性(图1)。对照组染色为阴性(图2)。

以上对本发明较佳实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (10)

1.一种诱导细胞分化的试剂盒，用于将骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞，包括成骨细胞诱导培养液，该成骨细胞诱导培养液包括：

0.1mM***溶液；

50mM维生素C溶液；以及

胎牛血清。

2.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述成骨细胞诱导培养液进一步包括：

1Mβ-甘油磷酸钠溶液；以及

α-MEM液体培养基。

3.权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述成骨细胞诱导培养液的组分比例为：0.1mM***溶液5μl～15μl，1M β-甘油磷酸钠溶液0.5ml～1.5ml，50mM维生素C溶液80μl～120μl，胎牛血清5ml～15ml，加α-MEM液体培养基定容到100ml。

4.权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述成骨细胞诱导培养液组分的比例为：0.1mM***溶液10μl，1Mβ-甘油磷酸钠溶液1ml，50mM维生素C溶液100μl，胎牛血清10ml，加α-MEM液体培养基定容到100ml。

5.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括成骨细胞鉴定液，该成骨细胞鉴定液包括细胞固定液、染色剂、以及细胞洗涤剂，其中，所述染色剂包括：

染色剂A：5％硫代硫酸钠溶液，

染色剂B：1％硝酸银溶液，以及

染色剂C：1％中性红溶液。

6.权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞固定液为4％的多聚甲醛溶液，所述细胞洗涤剂为双蒸水。

7.权利要求1～6之一所述的试剂盒在将大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞中的应用。

8.一种诱导细胞分化的方法，用于将骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞，包括以下步骤：

a、获取并扩增骨髓间充质干细胞；

b、将所述骨髓间充质干细胞转入成骨细胞诱导培养液中培养3～5周，所述成骨细胞诱导培养液包括0.1mM***溶液、50mM维生素C溶液、以及胎牛血清。

9.权利要求8所述的方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：

c、弃去所述成骨细胞诱导培养液，用固定液固定细胞之后，加入染色剂孵育；

d、加入细胞洗涤剂冲洗，然后染色；

e、加入细胞洗涤剂冲洗后再染色，双蒸水漂洗后观察分化后的成骨细胞。

10.权利要求9所述的方法，其特征在于，所述细胞洗涤剂为双蒸水；在步骤c中，所述染色剂为5％硫代硫酸钠溶液；在步骤d中，采用1％硝酸银溶液进行染色；在步骤e中，采用1％中性红溶液进行染色。

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