CN114457011A - 一种干细胞培养基及干细胞分离培养方法 - Google Patents

一种干细胞培养基及干细胞分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种干细胞培养基及干细胞分离培养方法，该干细胞培养基包括以下组分：体积百分比为45‑50％的基础培养基DMEM、体积百分比为5‑10％的胎牛血清、体积百分比为20‑25％的百通干细胞培养基、体积百分比为20‑25％的α‑MEM培养基、浓度为50ng/ml的bFGF、浓度为50ng/ml的EGF以及浓度为10mg/mL的VC。本发明的干细胞培养基为多种培养基按照一定的比例进行混合，在成本较低的基础上，培养出细胞活性和细胞纯度均达到95％以上；在较低的代数就可以达到较大的细胞总量；对多种来源的干细胞都有很好的培养效果，特别在来源脐带间充质干细胞的培养中，效果显著；结合本发明相应的干细胞分离培养方法，平均一条脐带，在***便可达到100亿个细胞总数。

Description

一种干细胞培养基及干细胞分离培养方法
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，具体为一种干细胞培养基及干细胞分离培养方法。
背景技术
干细胞是一种具有多种分化潜能的细胞，可以广泛运用于药物学、组织器官修复、细胞治疗领域中。干细胞的主要来源有脐带，胚胎，骨髓，脂肪，牙髓中，多向分化潜能和自我更新是干细胞的基本特点。具体来讲，干细胞具有以下一些生物学特点：
1、属非终末分化细胞，终生保持未分化或低分化特征，缺乏分化标记。2、在机体的数目位置相对恒定。3、具有自我更新能力。4、能无限地***、增殖，可在较长时间内处于静止状态，干细胞可连续***几代。5、具有多向分化潜能，能分化为各种不同类型的组织细胞；也具有分化发育的可塑性，在特定环境下，能被诱导分化成在发育上无关的细胞类型，其分化受所处周围微环境的干细胞壁龛影响。6、***的慢周期性。7、干细胞通过两种方式生长，一种是对称***，形成两个相同的干细胞，另一种是非对称***方式，非对称***中一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来，另外一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞。
干细胞具有以下功能：
1、替代和修复死亡和受损伤的细胞
这些细胞具有自动归巢的特点，注入人体后，可聚集至受损器官及相关部位，并分化成特定细胞。干细胞注入人体后，新细胞和组织在目标组织的微环境下生长，受损组织得到修复。利用干细胞自身分化功能生长新组织细胞，弥补组织细胞老化、死亡、损伤，使病变组织和细胞恢复正常。加入新血管，形成微循环，改善损伤组织。
2、旁分泌作用
在向组织内注入干细胞后，可产生多种生物活性因子，如神经营养因子、抗凋亡因子等多种因子、调节肽、气体信号分子等，并能对周围细胞起作用。能促进细胞增殖，抑制功能细胞凋亡，将现有组织祖细胞分化为组织细胞，修复受损组织，生长新组织。
3、激活休眠和处于抑制状态的细胞
机体的生长和发育是通过细胞***来完成的，当细胞***时，一部分脱离了正常的细胞周期，表现为功能性睡眠。有些细胞受内因子的影响，生长受抑制。这类处于休眠或被抑制状态的细胞不再***、增殖，仅进入老化代谢过程，导致人体新生细胞减少，新陈代谢减慢，人体进入衰老阶段。随着年龄的增长，干细胞将年轻的信号传递给脱离细胞周期的成年细胞。休眠及受干细胞刺激的抑制态细胞激活后，再进入细胞周期，通过***增殖，增加体内新生细胞数，使人体代谢过程恢复正常甚至逆转。
其中，脐带间充质干细胞具有来源广泛、取材容易，便于移植，具有强大的增殖能力，在体外长期培养过程中可以始终保持其多向分化潜能，在特定条件诱导下可以分化为成骨、软骨、肌腱、肌细胞、脂肪细胞、神经细胞和肝细胞等，是一种理想的组织工程种子细胞。
目前，市场上针对干细胞的培养基价格都较为昂贵，对于大量培养干细胞细胞进行运用和研究都是很大的消耗，多数实验室运用基础培养基进行配置的培养基价格便宜，但培养效果差强人意，不仅培养的细胞状态在多次传代后变差，而且细胞总数也较低。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种干细胞培养基及干细胞分离培养方法，能够解决上述技术问题。
(二)技术方案
为解决上述技术问题，本发明提供如下一技术方案：一种干细胞培养基，包括以下组分：体积百分比为45-50％的基础培养基DMEM、体积百分比为5-10％的胎牛血清、体积百分比为20-25％的百通干细胞培养基、体积百分比为20-25％的α-MEM培养基、浓度为50ng/ml的bFGF、浓度为50ng/ml的EGF以及浓度为10mg/mL的VC。
优选的，干细胞培养基包括以下组分：体积百分比为45％的基础培养基DMEM、体积百分比为5％的胎牛血清、体积百分比为25％的百通干细胞培养基、体积百分比为25％的α-MEM培养基、浓度为50ng/ml的bFGF、浓度为50ng/ml的EGF以及浓度为10mg/mL的VC。
优选的，基础培养基DMEM为低糖型。
为解决上述技术问题，本发明提供如下另一技术方案：一种干细胞分离培养方法，该干细胞分离培养方法包括以下步骤：
S1：将脐带用100ml0.9％生理盐水进行清洗，倒掉生理盐水，再用100ml75％的酒精完全浸泡脐带3-5分钟，倒掉酒精，再用100ml 0.9％生理盐水清洗掉残余酒精，倒掉生理盐水；
S2：将脐带剪成3cm长度的小段，然后用镊子将每段中的两条动脉以及一条静脉剥离出来，进一步去除表皮，主要保留动脉和静脉之间的啫喱样物质，进一步用剪刀剪成3×3mm大小的组织块，放在9cm培养皿中，先进行1小时左右的贴壁，然后在培养皿加入10ml权利要求1-3任一项的干细胞培养基，放置在37℃，5％CO2的培养箱中5-6天；
S3：在步骤S2完成5-6天的静置培养后，倒掉培养皿中旧的干细胞培养基，进行第一次换液倒入新的干细胞培养基，重新将培养皿放置在37℃，5％CO2的培养箱进行培养；
S4：在步骤S3进行3-4天后观察，倒掉培养皿中旧的干细胞培养基，进行第二次换液倒入新的干细胞培养基，重新将培养皿放置在37℃，5％CO2的培养箱进行培养；
S5：在步骤S4进行3-4天后观察，当培养皿中细胞密度达到50％，用镊子将培养皿中的组织块转移到新的培养皿中，对旧的培养皿中的细胞进行传代操作：用PBS缓冲液进行清洗，然后用0.25％的胰酶进行消化2min，加入干细胞培养基进行终止反应，将细胞悬液转移到离心管中进行离心，离心后倒掉上清，加入干细胞培养基将细胞稀释成1×106浓度加入到培养瓶中，进一步放置在37℃，5％CO2的培养箱进行培养；
S6：在步骤S5进行2-3天后，当S5中新的培养皿中细胞密度达到50％，对S5中新的培养皿中的细胞进行的传代操作；同时观察S5中传代到培养瓶的细胞情况，当其细胞密度达到80％以上，对传代到培养瓶的细胞进行第二次传代操作，或者作为种子细胞进行冻存操作。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种干细胞培养基及干细胞分离培养方法，具备以下有益效果：本发明的干细胞培养基为多种培养基按照一定的比例进行混合，在成本较低的基础上，培养出细胞活性和细胞纯度均达到95％以上；一般干细胞的传代培养扩增比例为1：3，用本发明的干细胞培养基的平均扩增比例为1：6，在较低的代数就可以达到较大的细胞总量，满足各种后续实验的要求；对多种来源的干细胞都有很好的培养效果，特别在来源脐带间充质干细胞的培养中，效果显著；结合本发明相应的干细胞分离培养方法，平均一条脐带，在***便可达到100亿个细胞总数。
附图说明
图1为不同培养基每个时期的活性对比图；
图2为不同培养基在显微镜下P4细胞观察图(4×)；
图3为不同培养基在显微镜下P4细胞观察图(10×)；
图4为不同培养基在显微镜下P4细胞观察图(20×)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种干细胞培养基，包括以下组分：体积百分比为45-50％的基础培养基DMEM、体积百分比为5-10％的胎牛血清、体积百分比为20-25％的百通干细胞培养基、体积百分比为20-25％的α-MEM培养基、浓度为50ng/ml的bFGF、浓度为50ng/ml的EGF以及浓度为10mg/mL的VC。
优选的，上述干细胞培养基包括以下组分：体积百分比为45％的基础培养基DMEM、体积百分比为5％的胎牛血清、体积百分比为25％的百通干细胞培养基、体积百分比为25％的α-MEM培养基、浓度为50ng/ml的bFGF、浓度为50ng/ml的EGF以及浓度为10mg/mL的VC。
基础培养基DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的，其与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)；优选的，本发明的干细胞培养基采用低糖型的基础培养基DMEM。
胎牛血清是一种性状、外观浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体，胎牛血清应取自剖腹产的胎牛，牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，常用于动物细胞的体外培养，具有极为重要的功能。
百通干细胞培养基为杭州百通生物技术有限公司所生产的现有市面上普遍使用的干细胞培养基；α-MEM培养基为MEM的改良培养基，百通干细胞培养基与α-MEM培养基均可从现有市面上购买所得。
bFGF为人碱性成纤维细胞生长因子，EGF为人表皮生长因子，VC为维生素C。
本发明还提供一种干细胞分离培养方法，该干细胞分离培养方法包括以下步骤：
S1：将脐带用100ml0.9％生理盐水进行清洗，倒掉生理盐水，再用100ml75％的酒精完全浸泡脐带3-5分钟，倒掉酒精，再用100ml 0.9％生理盐水清洗掉残余酒精，倒掉生理盐水。
S2：将脐带剪成3cm长度的小段，然后用镊子将每段中的两条动脉以及一条静脉剥离出来，进一步去除表皮，主要保留动脉和静脉之间的啫喱样物质(Wharton’s Jelly)，进一步用剪刀剪成3×3mm大小的组织块，放在9cm培养皿中，先进行1小时左右的贴壁，然后在培养皿加入10ml权利要求1-3任一项的干细胞培养基，放置在37℃，5％CO2的培养箱中5-6天；中间不需要观察和进行其他操作。
S3：在步骤S2完成5-6天的静置培养后，进行观察，显微镜下可以看到干细胞零散生长，倒掉培养皿中旧的干细胞培养基，进行第一次换液倒入新的干细胞培养基，重新将培养皿放置在37℃，5％CO2的培养箱进行培养。
S4：在步骤S3进行3-4天后观察，一般在此时可以看到培养皿有30％左右的细胞密度，倒掉培养皿中旧的干细胞培养基，进行第二次换液倒入新的干细胞培养基，重新将培养皿放置在37℃，5％CO2的培养箱进行培养。
S5：在步骤S4进行3-4天后观察，当培养皿中细胞密度达到50％，一般在此时可以看到培养皿有70％左右的细胞密度，用镊子将培养皿中的组织块转移到新的培养皿中，对旧的培养皿中的细胞进行传代操作：用PBS缓冲液进行清洗，然后用0.25％的胰酶进行消化2min，加入干细胞培养基进行终止反应，将细胞悬液转移到离心管中进行离心，离心后倒掉上清，加入干细胞培养基将细胞稀释成1×106浓度加入到培养瓶中，进一步放置在37℃，5％CO2的培养箱进行培养。
S6：在步骤S5进行2-3天后，观察新的培养皿中的细胞贴壁情况，当S5中新的培养皿中细胞密度达到50％，一般此时培养皿有70％左右的细胞密度，对S5中新的培养皿中的细胞进行第一次传代操作，操作具体可参考上述S5中的传代操作；同时观察S5中传代到培养瓶的细胞情况，当其细胞密度达到80％以上，一般此时培养瓶有90％左右的细胞密度，对传代到培养瓶的细胞进行第二次传代操作，或者作为种子细胞进行冻存操作。
为保持细胞良好的干细胞特性，干细胞一般传到***，进行全部冻存。
与现有技术相比，本发明提供了一种干细胞培养基及干细胞分离培养方法，具备以下有益效果：本发明的干细胞培养基为多种培养基按照一定的比例进行混合，在成本较低的基础上，培养出细胞活性和细胞纯度均达到95％以上；一般干细胞的传代培养扩增比例为1：3，用本发明的干细胞培养基的平均扩增比例为1：6，在较低的代数就可以达到较大的细胞总量，满足各种后续实验的要求；对多种来源的干细胞都有很好的培养效果，特别在来源脐带间充质干细胞的培养中，效果显著；结合本发明相应的干细胞分离培养方法，平均一条脐带，在***便可达到100亿个细胞总数。
下面对不同培养基进行试验结果统计，培养基A：百通干细胞培养基(市面上普遍使用的培养基)，培养基B：DMEM+10％PBS+,bFGF 100ng/ml,EGF100ng/ml(实验室使用的培养基)，培养基C：本发明的干细胞培养基。
从图1可以看出，培养基C在不同时期的活性均高于培养基A、B。
关于本发明的干细胞培养基的诱导分化能力，成脂诱导分化：细胞贴壁100％汇合后，加入间质干细胞成脂诱导液，成脂诱导72小时后，细胞内有小脂滴出现，约2周后脂滴数量增加并相互融合，细胞由长梭形变为圆形或多边形，油红O染色显示有大量脂质沉淀。成骨诱导分化：细胞贴壁约70％汇合后，加入间质干细胞成骨诱导液，诱导培养3天后，细胞体积增大，呈短梭状；诱导第7天，细胞呈多角形，胞质内细胞颗粒增多；14天，胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长，细胞间可见钙质沉积；29天，细胞结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构，钙结节形成明显，经茜素红染色呈红色结节。
需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种干细胞培养基，其特征在于，包括以下组分：体积百分比为45-50％的基础培养基DMEM、体积百分比为5-10％的胎牛血清、体积百分比为20-25％的百通干细胞培养基、体积百分比为20-25％的α-MEM培养基、浓度为50ng/ml的bFGF、浓度为50ng/ml的EGF以及浓度为10mg/mL的VC。
2.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于：所述干细胞培养基包括以下组分：体积百分比为45％的所述基础培养基DMEM、体积百分比为5％的所述胎牛血清、体积百分比为25％的所述百通干细胞培养基、体积百分比为25％的所述α-MEM培养基、浓度为50ng/ml的所述bFGF、浓度为50ng/ml的所述EGF以及浓度为10mg/mL的所述VC。
3.根据权利要求2所述的干细胞培养基，其特征在于：所述基础培养基DMEM为低糖型。
4.一种干细胞分离培养方法，其特征在于，所述干细胞分离培养方法包括以下步骤：
S1：将脐带用100ml0.9％生理盐水进行清洗，倒掉生理盐水，再用100ml 75％的酒精完全浸泡脐带3-5分钟，倒掉酒精，再用100ml 0.9％生理盐水清洗掉残余酒精，倒掉生理盐水；
S2：将所述脐带剪成3cm长度的小段，然后用镊子将每段中的两条动脉以及一条静脉剥离出来，进一步去除表皮，主要保留动脉和静脉之间的啫喱样物质，进一步用剪刀剪成3×3mm大小的组织块，放在9cm培养皿中，先进行1小时左右的贴壁，然后在培养皿加入10ml权利要求1-3任一项所述的干细胞培养基，放置在37℃，5％CO2的培养箱中5-6天；
S3：在所述步骤S2完成5-6天的静置培养后，倒掉所述培养皿中旧的所述干细胞培养基，进行第一次换液倒入新的所述干细胞培养基，重新将所述培养皿放置在37℃，5％CO2的培养箱进行培养；
S4：在所述步骤S3进行3-4天后观察，倒掉所述培养皿中旧的所述干细胞培养基，进行第二次换液倒入新的所述干细胞培养基，重新将所述培养皿放置在37℃，5％CO2的培养箱进行培养；
S5：在所述步骤S4进行3-4天后观察，当所述培养皿中细胞密度达到50％，用镊子将所述培养皿中的所述组织块转移到新的培养皿中，对旧的所述培养皿中的细胞进行传代操作：用PBS缓冲液进行清洗，然后用0.25％的胰酶进行消化2min，加入所述干细胞培养基进行终止反应，将细胞悬液转移到离心管中进行离心，离心后倒掉上清，加入所述干细胞培养基将细胞稀释成1×106浓度加入到培养瓶中，进一步放置在37℃，5％CO2的培养箱进行培养；
S6：在所述步骤S5进行2-3天后，当所述S5中新的培养皿中细胞密度达到50％，对所述S5中新的培养皿中的细胞进行所述的传代操作；同时观察所述S5中传代到所述培养瓶的细胞情况，当其细胞密度达到80％以上，对传代到所述培养瓶的细胞进行第二次所述传代操作，或者作为种子细胞进行冻存操作。
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林田 等: ""人脐带间充质干细胞培养体系的优化"", 《广西医科大学学报》 *

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