CN105193848A - 一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂的制备方法，弥补现有技术的不足，降低移植抗宿主病的发生率，在较短时间内获得更多的具有较强免疫抑制功能的间充质干细胞，满足临床需求，为干细胞的移植功效提供了新的思路，发挥重要的实际应用价值。本发明还提供了一种用于治疗再生障碍性贫血的干细胞制备方法，该方法用特殊方法诱导和培养间充质干细胞，可以有效地提高和增强间充质干细胞免疫抑制能力，可进一步制备成治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂。

Description

一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂及其制备方法。

背景技术

再生障碍性贫血(aplasticanemia，AA，简称再障)是一种常见的自身免疫性血液***疾病，是造血干细胞减少导致的外周血全血细胞减少及骨髓增生不良为主要特征的一组疾病，其发病机制涉及造血微环境异常、造血干/祖细胞缺陷和免疫功能紊乱。具体表现为外周血全血细胞减少，骨髓穿刺检查中亦有造血细胞三系减少：中性粒细胞＜0.5×10⁹/L，血小板＜20×10⁹/L，网织红细胞＜1%，非造血细胞增多，患者表达增高的细胞因子包括IFN－γ、IL－2、TNF－α等。AA病情重，危害大，疗效差，死亡率高，是一种难治性疾病。

同时，目前研究者还普遍认为再生障碍性贫血是一种获得性骨髓造血功能衰竭症，再生障碍性贫血的发生、发展与T细胞功能亢进引起的造血组织损伤密切相关。

目前再障的主要治疗手段有：造血干细胞移植（HSCT）和免疫抑制剂（IST）治疗。其中造血干细胞移植应综合考虑患者年龄、人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen，HLA)与供者间配型符合程度、有无感染及反复输血史等因素，是目前最为可行的方法，但供者来源有限，费用高，病死率高，且5%-15%的患者因为慢性移植物抗宿主病(GvHD)影响疗效和生活质量。免疫抑制治疗适用于急性再生障碍性贫血（SAA）患者。IST的治疗反应率为60%-80%，5年生存率与HSCT相当，但大多数患者无法痊愈，血细胞数不能恢复到正常状态，5年复发率约为30％。因此HSCT后的并发症和IST后的复发危险仍旧困扰着当今的临床医生及医学研究者，尚需进一步探索能提高疗效，减轻不良反应的治疗途径。

间充质干细胞是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，不仅具有造血支持作用，同时还具有免疫抑制作用，且具有多向分化、组织修复、异体输注无毒副作用、可移植性和来源广泛的特点。

间充质干细胞的免疫调节功能如下：间充质干细胞抑制了T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）的功能，也影响了树突状细胞（DC细胞）的活性。此外，间充质干细胞还能够产生多种生长因子、细胞因子、趋化因子以及可能在细胞免疫调节或迁移过程中起关键作用的蛋白酶形成免疫抑制。间充质干细胞在体外有抑制T淋巴细胞增殖的作用，而且这种抑制作用不依赖于间充质干细胞的来源。

同时研究发现，间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫抑制作用呈剂量依赖性，随着间充质干细胞剂量的增加，抑制作用增强。因此，间充质干细胞用的免疫抑制疗法需要较大的细胞量才能起到作用，但干细胞移植数量的增加会引起血管栓塞、发热等副作用；所以，如果提高单个细胞的免疫抑制能力，在较少细胞量的情况下，移植较少细胞量即可充分起到免疫抑制作用，提高细胞治疗效力，保证最大的临床移植效果，同时最大限度的减少不良反应，而且降低了治疗成本，具有重要的意义，为自身免疫性疾病患者特别是再障患者带来了福音。

虽然将间充质干细胞应用于临床再生障碍性贫血治疗，不少病例也取得了一定效果。然而间充质干细胞应用于治疗再障仍处于探索期，还有许多问题有待于进一步的解决，如间充质干细胞的具体输注剂量，间充质干细胞分泌能力、分化潜能对于造血干细胞的具体影响如何等，仍未获得一种针对再生障碍性贫血的干细胞制剂。相信随着对间充质干细胞及干细胞与临床转化研究的不断深入，在不久的未来，间充质干细胞会成为治疗再障的又一种有效的方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，解决现有技术中针对治疗再障患者的间充质干细胞免疫抑制能力较低，及治疗再障的干细胞制剂及其制备方法的缺陷形成的具体输注剂量，间充质干细胞分泌能力、分化潜能对于造血干细胞的具体影响等，本发明提供了一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂的制备方法，弥补现有技术的不足，降低移植抗宿主病发生率，在较短时间内获得更多的具有较强免疫抑制功能的间充质干细胞，满足临床需求，为间充质干细胞的移植功效提供了新的思路，发挥重要的实际应用价值。

为了解决间充质干细胞免疫抑制能力用于治疗再障，本发明还提供了一种用于治疗再生障碍性贫血的干细胞制备方法，该方法用特殊方法诱导和培养间充质干细胞，可以有效地提高和增强间充质干细胞免疫抑制能力，可进一步制备成治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂。

本发明是通过以下方式实现的：

一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂的制备方法，所述的干细胞制剂中的干细胞是通过以下方法制备的，具体步骤如下：

（1）取P3~P6代的间充质干细胞，首先进行流式细胞鉴定，标记物CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达在90%以上；不表达CD34、CD45，在5%以下；

（2）将其以2×10⁴个/ml的浓度混匀于培养基A中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中贴壁培养，培养第2天换液，以后每2天换液1次；

（3）当上述细胞培养融合至80%-90%时，以0.025%胰蛋白酶-EDTA在37℃条件下消化3~4分钟，制备成细胞悬液，以2×10⁴个/ml的浓度混匀于培养基B中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中贴壁培养，培养第2天换液，以后每2天换液1次；

（4）当上述细胞培养融合至80%-90%时，以0.025%胰蛋白酶-EDTA在37℃条件下消化3~4分钟，制备成细胞悬液，以5×10⁵个/ml的浓度混匀于培养基C中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中贴壁培养48~72h，培养第2天换液；

（5）将上述步骤（4）特殊培养后的干细胞，以0.025%胰蛋白酶-EDTA在37℃条件下消化3~4分钟，制备成细胞悬液，以1000r/min离心10分钟，弃去上清液并以生理盐水重悬，以1000r/min离心10分钟后弃去上清液，收集沉淀的干细胞备用；

其中：所述的步骤（2）中培养基A的组成是：含10%胎牛血清、1×双抗的DMEM/F12培养基；

所述的步骤（3）中培养基B的组成是：含75μg/Lγ干扰素（INF-γ），75μg/L肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、15mg/L碱性成纤维生长因子(bFGF)、15mg/L表皮生长因子(EGF)、5g/L牛血清白蛋白（BSA）、1.5mg/L还原型谷胱甘肽、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、0.05mmol/Lβ-巯基乙醇、10mg/L氢化可的松、100nmol/L***和1%非必须氨基酸的无血清DMEM/F12培养基；

所述的步骤（4）中培养基C的组成是：含质量体积比为（1~5）%的人血白蛋白、质量体积比为0.5%的低分子肝素钙、质量体积比为（1~20）%的复方氨基酸、质量体积比为（0.3~0.7）%的维生素C、20ng/ml的白介素3（IL-3）、20ng/ml的重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、30ng/ml的白介素11（IL-11）、3U/ml的***（EPO）、50ng/ml的干细胞因子(SCF)和3U/ml的人促血液血管生长素(HAPO)以及（60-90）μmol/L的氯化钴（CoCl₂）的无血清DMEM/F12培养基。

进一步的，所述的步骤（4）中培养基C的优选组成是含质量体积比为5%的人血白蛋白、质量体积比为0.5%的低分子肝素钙、质量体积比为10%的复方氨基酸，质量体积比为0.5%的维生素C、20ng/ml的白介素3（IL-3）、20ng/ml的重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、30ng/ml的白介素11（IL-11）、3U/ml的***（EPO）、50ng/ml的干细胞因子(SCF)和3U/ml的人促血液血管生长素(HAPO)以及75μmol/L的氯化钴（CoCl₂）的无血清DMEM/F12培养基。

进一步的，所述的步骤（1）中的间充质干细胞的来源优选骨髓、脐带和胎盘。

进一步的，所述的步骤（5）中制备的干细胞活力保持在95%以上。

一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂是由上述步骤（1）~（5）制备的干细胞、人血白蛋白，低分子肝素钙，复方氨基酸，维生素C，无酚红的DMEM/F12培养基、白介素3（IL-3），重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF），白介素11（IL-11），***（EPO），干细胞因子(SCF)及人促血液血管生长素(HAPO)，按一定比例配制而成；

其中：治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂的具体组成为：步骤（1）~（5）制备的干细胞的浓度是（1~3）×10⁶个/ml；人血白蛋白、低分子肝素钙、复方氨基酸和维生素C的质量体积比分别为为5%、0.5%、10%和0.5%；白介素3（IL-3）、重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、白介素11（IL-11）、***（EPO）、干细胞因子(SCF)和人促血液血管生长素(HAPO)的浓度分别是20ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、3U/ml、50ng/ml和3U/ml；余量为无酚红的DMEM/F12培养基。

进一步的，所述的用于再生障碍性贫血的干细胞制剂进行外周静脉输注的有效剂量为（1~3）×10⁶个/kg，优选3×10⁶个/kg。该有效剂量是通过大量动物模型试验取得治疗效果以及临床实验而确定的。

本发明的有益效果在于：

1、本发明干细胞制剂含经过特殊方法培养制备的干细胞，免疫抑制能力增强，细胞活性强，并联合多种营养物质和细胞因子使用，进行再生障碍性贫血的治疗，治疗效果显著。

2、本发明干细胞制剂中的干细胞是经过特殊方法制备的，增强了免疫抑制功能，提高了细胞活性，优点如下，其中：

a、步骤（1）中选取P3~P6代间充质干细胞，可以保证细胞筛选的成功率，并选用较高标准的流式细胞仪筛选细胞：90%以上阳性标记以及5%以***性标记物，可以获得纯度较高且质量较好的细胞产品，以满足进一步的临床需要；

b、步骤（2）过渡培养，进一步优选细胞，为下一步细胞制备提供良好基础；

c、步骤（3）通过细胞因子和生物制剂添加物来刺激间充质干细胞表面受体，通过分子通路激活内源基因，上调细胞免疫抑制蛋白的表达和免疫抑制活性物质的分泌，能达到增强间充质干细胞免疫抑制功能的效果。其中γ干扰素(IFN-γ)不仅能增强间充质干细胞对T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞的接触抑制，还可以激活间充质干细胞内源基因，增加细胞释放的免疫抑制活性物质；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种促炎细胞因子，并参与正常炎症反应和免疫反应；碱性成纤维生长因子(bFGF)是胚胎干细胞培养基中的一个重要组成成分，使细胞在无血清培养基中保持未分化的形态，并且能够促进包括间叶细胞、神经外胚层和血管内皮细胞在内的一系列细胞的增殖，与多种物质共同组成了优化的培养基。

d、步骤（4）在细胞移植治疗前进一步优选适当的预处理以达到更好的临床效果，经过优选方法预处理的干细胞能够更加精确的达到创伤组织处并参与创伤组织的修复。

3、本发明方法制备的干细胞，在临床应用上具有很大的优势：具有来源广泛、取材简便、供体损伤小、增殖能力强并具有多种分化潜能；它既具有高度自我更新能力，又具有进一步分化各***祖细胞的能力；无免疫原性，不会发生免疫排斥反应，不会发生移植物抗宿主病；能快速修复骨髓抑制现象，使血象恢复正常；抗放射反应能力强；提升免疫及造血功能；受体内植入率高，病灶处归巢迅速；静脉注射能很容易被患者接受。

4、本发明干细胞制剂中的干细胞和添加的多种物质和细胞因子，能够发挥调节功能，有促进造血祖细胞系的增殖、分化，提高造血细胞生存率的作用，重建体内的造血***和免疫***。

5、本发明所形成的干细胞制剂，成分清晰，经严格标准化检测，可用于临床，安全可靠。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施案例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：

图1是本发明干细胞制剂中干细胞制备流程图。

图2是本发明实施例中干细胞抑制作用效果图。

图3是本发明实施例中大鼠骨髓细胞和组织形态图。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。

参照图1本发明干细胞制剂中干细胞制备流程图所示，本发明具体实施方式如下：

实施例1培养基的制备

1、培养基A的制备：制备含10%胎牛血清、1×双抗的DMEM/F12培养基；

2、培养基B的制备：制备含75μg/Lγ干扰素（INF-γ），75μg/L肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、15mg/L碱性成纤维生长因子(bFGF)、15mg/L表皮生长因子(EGF)、5g/L牛血清白蛋白（BSA）、1.5mg/L还原型谷胱甘肽、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、0.05mmol/Lβ-巯基乙醇、10mg/L氢化可的松、100nmol/L***和1%非必须氨基酸的无血清DMEM/F12培养基；

3、培养基C的制备：制备含质量体积比为5%的人血白蛋白、质量体积比为0.5%的低分子肝素钙、质量体积比为10%的复方氨基酸，质量体积比为0.5%的维生素C、20ng/ml的白介素3（IL-3）、20ng/ml的重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、30ng/ml的白介素11（IL-11）、3U/ml的***（EPO）、50ng/ml的干细胞因子(SCF)和3U/ml的人促血液血管生长素(HAPO)以及75μmol/L的氯化钴（CoCl₂）的无血清DMEM/F12培养基。

实施例2干细胞的制备

干细胞的制备的具体步骤如下：

（1）取P3~P6代的来源于骨髓、脐带或胎盘的间充质干细胞，首先进行流式细胞鉴定，其中标记物CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达在90%以上；不表达CD34、CD45，在5%以下；

（2）将其以2×10⁴个/ml的浓度混匀于培养基A中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中贴壁培养，培养第2天换液，以后每2天换液1次；

（3）当上述细胞培养融合至80%-90%时，以0.025%胰蛋白酶-EDTA在37℃条件下消化3~4分钟，制备成细胞悬液，以2×10⁴个/ml的浓度混匀于培养基B中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中贴壁培养，培养第2天换液，以后每2天换液1次；

（4）当上述细胞培养融合至80%-90%时，以0.025%胰蛋白酶-EDTA在37℃条件下消化3~4分钟，制备成细胞悬液，以5×10⁵个/ml的浓度混匀于培养基C中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中贴壁培养48~72h，培养第2天换液；

（5）将上述步骤（4）特殊培养后的干细胞，以0.025%胰蛋白酶-EDTA在37℃条件下消化3~4分钟，制备成细胞悬液，以1000r/min离心10分钟，弃去上清液并以生理盐水重悬，以1000r/min离心10分钟后弃去上清液，收集沉淀的干细胞备用；

（6）干细胞活力测定：将上述步骤（5）制备收集的干细胞进行活力测定，在95%以上。

实施例3干细胞抑制淋巴细胞增殖实验

1.淋巴细胞的制备：利用淋巴细胞分离液分离外周血，获得单个核细胞1×10⁸，将细胞重悬于50ml含10%胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺的DMEM/F12培养液中，加入抗CD3单克隆抗体、抗CD28单克隆抗体各100ng/ml，白细胞介素210ng/ml，于37℃，5%CO₂培养箱中培养5d，此时淋巴细胞形成大量悬浮集落。

2.取上述实施例2培养的干细胞沉淀用含10%胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺的DMEM/F12培养液重悬；调整干细胞悬液浓度为2×10⁵/ml，按100μl/孔置于96孔细胞培养板中，作为实验组；同时取未经实施例2所述步骤培养的干细胞作对照组。

3.实验组和对照组各取12复孔，培养1d待孔内MSC贴壁后，加入100μl培养好的浓度为2×10⁶/ml的淋巴细胞悬液，使实验组和对照组的干细胞均与淋巴细胞终浓度的比值为1∶10；另取12复孔加入200μl浓度为1×10⁶/ml的淋巴细胞悬液作为空白组；将96孔培养板置于37℃，5%CO₂培养箱中培养4~6d后，用移液器吸出各孔中含有悬浮淋巴细胞的培养液，转移到新的96孔培养板中，去除贴壁的干细胞；细胞悬液用CCK-8显色法计数淋巴细胞，于450nm波长下测量OD值确定增殖后的淋巴细胞的量；按照公式：抑制率=[(空白组-实验组)/空白组]×100%，计算实验组和对照组干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率。

4.实验结论：实验组经优选培养方法处理的干细胞的免疫抑制作用相对于对照组都有显著性差异(P＜0.01)(如图2所示)。

实施例4干细胞制剂的制备

将上述实施例2中步骤（1）~（5）制备收集的干细胞分别与人血白蛋白，低分子肝素钙，复方氨基酸，维生素C，无酚红的DMEM/F12培养基、白介素3（IL-3），重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF），白介素11（IL-11），***（EPO），干细胞因子(SCF)及人促血液血管生长素(HAPO)，按一定比例配制，即可获得一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂；

其中：所述的治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂的具体组成为：步骤（1）~（5）制备的干细胞的浓度是（1~3）×10⁶个/ml；人血白蛋白、低分子肝素钙、复方氨基酸和维生素C的质量体积比分别为为5%、0.5%、10%和0.5%；白介素3（IL-3）、重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、白介素11（IL-11）、***（EPO）、干细胞因子(SCF)和人促血液血管生长素(HAPO)的浓度分别是20ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、3U/ml、50ng/ml和3U/ml；余量为无酚红的DMEM/F12培养基。

除干细胞以外，本发明干细胞制剂其余成分需提前配制，4℃预冷备用。

本发明所述质量体积比均代表质量（g）与体积（ml）的比例。

本发明的干细胞制剂中干细胞在2-15℃温度中48小时内细胞仍保持为单细胞悬液状态，细胞活力保持在90%以上。

IL-3是一种造血正调控因子，与CSF有协同作用，可促进祖细胞的增殖和分化，阻止造血细胞凋亡而维持其存活。

IL-11可以促进巨核细胞和造血干细胞甚至多系祖细胞的发育，抑制TNF-γ的分泌，通过介导细胞间的黏附和分泌细胞因子调节造血干细胞的增殖、分化和成熟。

CSF和EPO能使原始的干细胞自身增殖复制，进一步提高造血因子的临床效应。

HAP具有促进早期造血干细胞和内皮细胞增殖的功能，同时作用于造血及内皮细胞系的新的生长因子，具有提高生存率、促进造血系增殖、分化的作用。

人血白蛋白和复方氨基酸均为临床注射液成分，可以为细胞提供营养，利于细胞的新陈代谢；维生素C的添加可维持各种过氧化物酶活性，有利于细胞代谢和活性的保持。

添加0.5%低分子肝素，保证细胞在保存过程中维持良好的细胞分散状态，减少了细胞间的黏附成团及细胞黏附容器壁的现象，降低了临床细胞注输时可能发生的血管内细胞成团栓塞的危险，同时也降低了细胞聚集而被输液滤器过滤导致的细胞损伤，而微量的肝素添加不会引发临床出血等不良反应。

本发明的干细胞制剂非常有利于干细胞的存活，且临床输注安全，细胞可在此次保存液中长时间保持较高的活力，便于临床运输而不受时间的苛刻限制，解决了异地患者使用，细胞需长时间运输的问题。

所添加的细胞因子IL-3，G-CSF，IL-11，EPO，SCF，HAPO相互作用，发挥调节功能，重建体内的造血***和免疫***。

所述的用于再生障碍性贫血的干细胞制剂进行外周静脉输注的有效剂量为（1~3）×10⁶个/kg，优选3×10⁶个/kg。该有效剂量是通过大量动物模型试验取得治疗效果以及临床实验而确定的。

实施例5静脉输注实验

1.实验分组：将30只已成模的再障大鼠随机分为①模型组（生理盐水静脉输注），②参考组（未经实施例2所述步骤培养的干细胞制剂静脉输注）和③实验组（本发明干细胞制剂输注），每组10只；另取未造模大鼠10只为④空白对照组（生理盐水静脉输注）；均经尾静脉注射：①模型组和④空白对照组：0.5ml生理盐水，②参考组：0.5ml未经实施例2所述步骤培养的干细胞制剂，③实验组：0.5ml本发明干细胞制剂，每两天注射一次，连续注射4次；观察各组大鼠生存率、外周血象、骨髓病理学特征等的变化，同时观察大鼠输注制剂前后INF-γ量的变化。

2.实验效果主要观察指标

①大鼠移植效果的观察；②血常规分析，包括白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)、血小板(Plt)等，并取血煌焦油蓝染色后推片计数网织红细胞；③骨髓造血组织增生情况检测；④血清IFN-γ检测；统计学分析采用SPSS10.0统计软件进行统计分析；所有数据均采用±标准误表示，组间比较采用t检验。

3.实验结果为：

①大鼠移植效果的观察

空白对照组大鼠伸展好动，皮毛光亮，体强肥大；其余各组大鼠陆续出现活动减少、反应迟钝、进食减少、眼神黯淡、皮毛欠光泽，体表脱毛等现象。模型组于第6天陆续出现体重下降、皮毛散乱，大便塘稀，随后上述症状逐渐加重，第7天濒临死亡，第13天出现死亡。参考组与实验组在10天内未出现死亡情况，第20天后有所好转，并且实验组的大鼠一般情况优于参考组。

②大鼠血常规分析

治疗7天后，模型组的血红蛋白、白细胞和血小板均明显减少与空白对照组比较有显著性差异(P均<0.01)；实验组的血红蛋白、白细胞和血小板又明显高于模型组(P<0.05)；参考组与实验组相比无统计学意义(p>0.05)。14天时参考组与实验组外周血象指标仍然很低，除RBC继续降低外，其他都轻度回升，而实验组回升比参考组明显，两组间差异有统计学意义(P<0.05)；两组均与与模型组差异有统计学意义。第21天时参考组与实验组血象明显回升，但实验组升高更明显，与空白对照相比无统计学意义(P>0.05)。

③大鼠骨髓造血组织增生情况检测

骨髓组织形态如图3所示，空白对照组大鼠骨髓细胞增生极度活跃，骨小梁丰富，排列整齐，结构完整；模型组骨髓组织早期大量出血，有核细胞数量减少，晚期脂肪组织增生，局部出现硬化现象；参考组骨髓抑制均有所改善，网状造血组织较为增生，分布较均匀，出现造血组织基本结构修复现象；而实验组细胞增生活跃，脂肪组织比模型组减少，并且随着治疗时间的延长造血组织逐渐增多，而且其结构比较紧密，空白区少，造血组织着色均匀，提示制剂能够明显改善再障大鼠的骨髓抑制。

④大鼠血清IFN-γ检测

模型组大鼠血清IFN-γ水平高于空白对照组，差别有统计学意义(P<0.01)；参考组大鼠血清IFN-γ水平高于空白对照组，差别有统计学意义(P<0.05)；实验组大鼠血清IFN-γ水平稍高于空白对照组，但差别无统计学意义(P>0.05)；这说明本发明所制备的干细胞制剂在体内能明显抑制IFN-γ的分泌。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂，其特征在于，是由特定方法制备的干细胞、人血白蛋白，低分子肝素钙，复方氨基酸，维生素C，无酚红的DMEM/F12培养基、白介素3（IL-3），重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF），白介素11（IL-11），***（EPO），干细胞因子(SCF)及人促血液血管生长素(HAPO)，按一定比例配制而成；

其中，所述的特定方法制备的干细胞的具体制备步骤如下：

（1）取P3~P6代的间充质干细胞，首先进行流式细胞鉴定，标记物CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达在90%以上；不表达CD34、CD45，在5%以下；

（2）将上述步骤（1）中鉴定后的干细胞以2×10⁴个/ml的浓度混匀于培养基A中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中贴壁培养，培养第2天换液，以后每2天换液1次；

（3）当上述步骤（2）中细胞培养融合至80%-90%时，以0.025%胰蛋白酶-EDTA在37℃条件下消化3~4分钟，制备成细胞悬液，以2×10⁴个/ml的浓度混匀于培养基B中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中贴壁培养，培养第2天换液，以后每2天换液1次；

（4）当上述步骤（3）中细胞培养融合至80%-90%时，以0.025%胰蛋白酶-EDTA在37℃条件下消化3~4分钟，制备成细胞悬液，以5×10⁵个/ml的浓度混匀于培养基C中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中贴壁培养48~72h，培养第2天换液；

（5）将上述步骤（4）特殊培养后的干细胞，以0.025%胰蛋白酶-EDTA在37℃条件下消化3~4分钟，制备成细胞悬液，以1000r/min离心10分钟，弃去上清液并以生理盐水重悬，以1000r/min离心10分钟后弃去上清液，收集沉淀的干细胞备用。

2.根据权利要求1所述的一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂，其特征在于，所述的特定方法制备的干细胞的具体制备步骤（2）中培养基A的组成是：含10%胎牛血清、1×双抗的DMEM/F12培养基；步骤（3）中培养基B的组成是：含75μg/Lγ干扰素（INF-γ），75μg/L肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、15mg/L碱性成纤维生长因子(bFGF)、15mg/L表皮生长因子(EGF)、5g/L牛血清白蛋白（BSA）、1.5mg/L还原型谷胱甘肽、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、0.05mmol/Lβ-巯基乙醇、10mg/L氢化可的松、100nmol/L***和1%非必须氨基酸的无血清DMEM/F12培养基；步骤（4）中培养基C的组成是：含质量体积比为（1~5）%的人血白蛋白、质量体积比为0.5%的低分子肝素钙、质量体积比为（1~20）%的复方氨基酸、质量体积比为（0.3~0.7）%的维生素C、20ng/ml的白介素3（IL-3）、20ng/ml的重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、30ng/ml的白介素11（IL-11）、3U/ml的***（EPO）、50ng/ml的干细胞因子(SCF)和3U/ml的人促血液血管生长素(HAPO)以及（60-90）μmol/L的氯化钴（CoCl₂）的无血清DMEM/F12培养基。

3.根据权利要求1所述的一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂，其特征在于，所述的特定方法制备的干细胞的具体制备步骤（4）中培养基C的优选组成是含质量体积比为5%的人血白蛋白、质量体积比为0.5%的低分子肝素钙、质量体积比为10%的复方氨基酸，质量体积比为0.5%的维生素C、20ng/ml的白介素3（IL-3）、20ng/ml的重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、30ng/ml的白介素11（IL-11）、3U/ml的***（EPO）、50ng/ml的干细胞因子(SCF)和3U/ml的人促血液血管生长素(HAPO)以及75μmol/L的氯化钴（CoCl₂）的无血清DMEM/F12培养基。

4.根据权利要求1所述的一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂，其特征在于，所述的特定方法制备的干细胞的具体制备步骤（1）中的间充质干细胞的来源优选骨髓、脐带和胎盘。

5.根据权利要求1所述的一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂，其特征在于，所述的特定方法制备的干细胞的具体制备步骤（5）中制备的干细胞活力保持在95%以上。

6.根据权利要求1所述的一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂，其特征在于，所述的特定方法制备的干细胞的浓度是（1~3）×10⁶个/ml；人血白蛋白、低分子肝素钙、复方氨基酸和维生素C的质量体积比分别为为5%、0.5%、10%和0.5%；白介素3（IL-3）、重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、白介素11（IL-11）、***（EPO）、干细胞因子(SCF)和人促血液血管生长素(HAPO)的浓度分别是20ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、3U/ml、50ng/ml和3U/ml；余量为无酚红的DMEM/F12培养基。

7.根据权利要求1所述的一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂，其特征在于，所述的用于再生障碍性贫血的干细胞制剂进行外周静脉输注的有效剂量为（1~3）×10⁶个/kg，优选3×10⁶个/kg。

8.权利要求1~7所述的一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂的制备方法。

9.权利要求1~7所述的一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂中干细胞的特定制备方法和用于制备治疗再生障碍性贫血患者的药物中的用途。