CN101323837A

CN101323837A - 一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法

Info

Publication number: CN101323837A
Application number: CNA2007100606577A
Authority: CN
Inventors: 侯丽华; 马平生
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2008-12-17

Abstract

本发明公开了一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法，包括如下步骤：(1)用甲基磺酸乙酯对酿酒酵母双倍体菌株进行随机诱变，使待处理菌液中所述甲基磺酸乙酯的体积终浓度为2％－4％，所述酿酒酵母双倍体菌株的浓度为2×10⁶～6×10⁶个细胞/ml；(2)通过高效产孢、孢子纯化和充分融合的3－5轮有性重组，使文库中菌株间发生基因组重排，构建酿酒酵母乙醇高产菌株。本发明的方法所构建的重组菌株乙醇产量较对照菌株提高了8.88％，残糖降低了64.37％，发酵周期缩短了10小时，乙醇及高渗透压抗性是对照菌株的5.10倍，为燃料乙醇工业生产提供了优良的菌株。

Description

一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法

技术领域

本发明涉及一种全基因组的改造方法，特别是涉及一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法。

背景技术

高浓度乙醇是酵母乙醇发酵后期发酵缓慢乃至终止和发酵终点残糖高的主要因素，筛选耐高浓度乙醇的酵母菌株是提高酿酒酵母乙醇发酵性能的重要策略之一。同时，酵母的大多数与发酵相关的特性都是由多基因控制的，对这些基因了解的很少而且它们广泛的分布在整个基因组中。目前，虽然基因组重排技术已经成功的应用到了原核生物中，但是真核生物的复杂性使基因组重排技术还没有应用到酵母研究中。例如，酵母具有较厚细胞壁(100～200nm)，而且酵母的融合是由MAT等位基因控制的复杂过程等等，这些因素导致在酵母中不能直接应用原生质体融合的方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法，包括如下步骤：(1)用甲基磺酸乙酯对酿酒酵母双倍体菌株进行随机诱变，使待处理菌液中所述甲基磺酸乙酯的体积终浓度为2％-4％，所述酿酒酵母双倍体菌株的浓度为2×10⁶～6×10⁶个细胞/ml；(2)通过高效产孢、孢子纯化和充分融合的3-5轮有性重组，使文库中菌株间发生基因组重排，构建酿酒酵母乙醇高产菌株。

所述甲基磺酸乙酯的体积终浓度最好为3％。

所述酿酒酵母双倍体菌株的浓度为3×10⁶～5×10⁶个细胞/ml；

所述有性重组的轮数为4。

本发明的一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法，所构建的重组菌株乙醇产量较对照菌株提高了8.88％，残糖降低了64.37％，发酵周期缩短了10小时，乙醇及高渗透压抗性是对照菌株的5.10倍，为燃料乙醇工业生产提供了优良的菌株。

附图说明

图1为不同甲基磺酸乙酯浓度下酵母菌株的生长状况；

图2为不同甲基磺酸乙酯浓度下酵母菌株的糖耗情况；

图3为重组菌株在初糖浓度为30％时生长状况；

图4为重组菌株在初糖浓度为30％时耗糖情况；

图5为重组菌株在初糖浓度为30％时乙醇产量；

图6为重组菌株在初糖浓度为30％发酵终点时活菌浓度；

图7为本发明的原理示意图。

具体实施方式

本发明所使用的酿酒酵母双倍体菌株是可以采用任何来源的酿酒酵母双倍体菌株。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法，以实验室酿酒酵母双倍体菌株W303(本实验室保藏)为出发菌株，构建乙醇产量高、遗传稳定、发酵周期短等具有优良发酵性状的非整倍体酵母菌株。

实施例2

一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法，以工业酿酒酵母双倍体菌株(购于安琪酵母有限公司)为出发菌株构建发酵速率快、葡萄糖-醇转化率高、遗传稳定性高、乙醇终产量高和残糖低的非整倍体酵母菌株。

步骤如下：

1材料与方法

1.1材料

实验菌株：酿酒酵母双倍体菌株(商品化的安琪酵母)(简称酵母)

培养基：YPD，玉米面发酵培养基

1.2方法

1.2.1酵母用甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulphonate，EMS)诱变处理

[1]将酵母细胞接入YPD液体培养基中，于30℃下振荡培养过夜；

[2]测定细胞浓度使之处于对数生长期，收集大约1×10⁸个细胞于四个15ml塑料试管中，其中一个为对照。用pH值为7.0磷酸钠缓冲液(0.1mol/L)洗涤两次，最后用8ml的此缓冲液重悬；

[3]将上述细胞转移到玻璃试管中，分别加入不同剂量的EMS，对照不加。然后放入30℃摇床中，培养1h；(不同剂量是指：使待处理菌液中EMS的体积终浓度为0，2％，3％，4％)

[4]向各试管中加入等量的5％无菌的硫代硫酸钠失活EMS的突变作用；

[5]收集突变后的细胞，用5％无菌硫代硫酸钠洗两次，再用无菌水洗一次，用无菌水将其稀释到一定的浓度涂布在固体YPD平板上，将其放入30℃培养箱中培养；

[6]待平板上长出菌落后，计算EMS的细胞致死率，其中致死率介于50％～90％的诱变剂量为最佳诱变剂量范围。

[7]使用最佳的诱变剂量，对双倍体细胞进行EMS诱变。将诱变后的细胞接种到发酵培养基中进行发酵实验。

1.2.2酵母高效产孢法

[1]将酵母菌株在固体培养基上活化培养；

[2]从活化的平板上挑取适量的菌体接种到YPD液体培养基中，在30℃下培养至对数生长期；

[3]13000rpm离心30s收集上述菌体，弃掉上清，用无菌水洗三次去除残留培养基，将其接种到YPK液体培养基中，于28℃下培养12h；

[4]13000rpm离心30s收集上述菌体，弃掉上清，用无菌水洗三次去除残留培养基，将菌体重悬到高效液体生孢培养基中，于28℃下培养5d左右。

1.2.3孢子纯化方法

[1]室温下500rpm离心5min收集酵母双倍体细胞，用软化缓冲液重悬细胞使之浓度为5 OD₆₀₀U/ml，于30℃下温育10min；

[2]室温下500rpm离心5min收集上述酵母细胞和孢子，用原生质体缓冲液重悬使之浓度为25OD₆₀₀U/ml。加蜗牛酶使之浓度为0.5mg/OD₆₀₀，并在30℃下反应30min；

[3]室温下500rpm离心5min收集上述反应液，用等量的0.5％Triton X-100洗一次后，再用0.5％Triton X-100重悬；再加入等量的0.5％Triton X-100使孢子反应液为总体积的1/4。用超声波振荡这个反应体系使孢子分散并将其保存在4℃冰箱中；

2酿酒酵母乙醇高产菌株构建

2.1对诱变剂EMS的最佳剂量进行确定

针对不同的酵母菌株(包括单倍体和双倍体)，EMS所需的最佳剂量也不同，所以首先确定EMS的诱变剂量。分别用0％、2％、3％和4％的EMS处理等量的酵母双倍体细胞，在30℃摇床中培养1h；在终止EMS作用后，取等量的上述四种菌液稀释一定倍数后，均匀涂布到YPD平板上，待长出单菌落后计算出不同剂量的致死率。同时，将余下的突变细胞分别在初糖浓度为20％的发酵培养基中进行发酵，生长和耗糖情况见图1和图2。这四种诱变剂量的致死率分别为0、81％、95％和99％。在以往的研究中EMS剂量都是选择在50％～90％，在本发明中因为受试菌株是双倍体细胞，所以我们选择95％致死率的EMS剂量(即3％的EMS)为最佳诱变剂量，一是为了保证能够得到足够的突变群体；二是为了尽量减少负突变。

2.2配制选择平板

收集发酵结束时的发酵液，离心弃掉菌体后，蒸馏发酵液使乙醇等挥发性物质被蒸馏掉；将余下发酵液的pH值调为4.2，加入1.5％琼脂于115℃下灭菌15min；再分别加入乙醇配成含有1％、2％、3％一直到15％(V/V)不同浓度乙醇的选择平板。

2.3获得最初突变群体。

对酵母双倍体菌株进行EMS诱变处理，并将诱变后的细胞均匀涂布到含5％乙醇的选择平板上。于30℃下培养2d后，将平板上长出的这些细胞作为最初突变群体。

2.4第一轮基因组重排

将筛选得到的原始突变群体都接种到YPD液体培养基中，于30℃摇床中培养至对数生长期；收集细胞，并用无菌水洗三次后将其接种到YPK培养基中，于28℃摇床中培养12h；再收集细胞，并用无菌水洗三次后将其接种到高效产孢培养基中，为了保证能够高效产孢上述过程都是在摇瓶中进行；于28℃摇床中培养5d后，取样在显微镜下观察产孢效率；当产孢效率接近90％时，收集细胞进行孢子纯化，在此纯化过程中蜗牛酶可以消化营养细胞，但对孢子没有影响；然后将孢子再次接种到YPD液体培养基中于30℃摇床中培养20h，此过程是使孢子能够发生充分融合；收集细胞，并将其涂布在含有8％乙醇的选择平板上；于30℃下培养2d后，将该平板上长出的单菌落作为第二轮重排的母本。

2.5第二轮基因组重排，将选择平板上筛选得到的优良性状的重组菌株作为第三轮重排的母本。

方法同第一轮重排，将重排后的细胞涂布在含11％乙醇的选择平板上。于30℃下培养2d后，将该平板上长出的单菌落作为第三轮重排的母本。

2.6第三轮基因组重排，将选择平板上筛选得到的优良性状的重组菌株作为第四轮重排的母本。

方法同第一轮重排，将重排后的细胞涂布在含14％乙醇的选择平板上。于30℃下培养2d后，将该平板上长出的单菌落作为第四轮重排的母本。

2.7第四轮基因组重排，将选择平板上筛选得到的优良重组菌株进行浓醪发酵实验。

方法同第一轮重排，将重排后的细胞涂布在含18％乙醇的选择平板上。于30℃下培养2d后，将该平板上长出的单菌落及对照菌株在初糖浓度为20％的发酵培养基中进行发酵。发酵结束时(36h)测残糖浓度，从中选出残糖最低的重组菌株进行浓醪发酵。

3酿酒酵母乙醇高产菌株的浓醪发酵

将重组菌株和对照菌株即工业菌株在初糖浓度为300g/L的玉米面发酵培养基中进行乙醇发酵实验。发酵结果见图3、图4、图5，并在发酵结束时分别取50μl的发酵液稀释400倍后均匀的涂布到YPD平板上。于30℃下培养两天后，数单菌落个数并计算出活菌浓度见图6。

本技术提出了一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的新方法，由此方法构建的重组菌株乙醇产量较对照菌株提高了8.88％，残糖降低了64.37％，发酵周期缩短了10小时，乙醇及高渗透压是对照菌株的5.10倍，为燃料乙醇工业生产提供了优良的菌株。

Claims

1.一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法，其特征包括如下步骤：(1)用甲基磺酸乙酯对酿酒酵母双倍体菌株进行随机诱变，使待处理菌液中所述甲基磺酸乙酯的体积终浓度为2％-4％，所述酿酒酵母双倍体菌株的浓度为2×10⁶～6×10⁶个细胞/ml；(2)通过高效产孢、孢子纯化和充分融合的3-5轮有性重组，使文库中菌株间发生基因组重排，构建酿酒酵母乙醇高产菌株。

2.根据权利要求1所述的一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法，其特征所述甲基磺酸乙酯的体积终浓度为3％。

3.根据权利要求1所述的一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法，其特征是所述酿酒酵母双倍体菌株的浓度为3×10⁶～5×10⁶个细胞/ml。

4.根据权利要求1所述的一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法，其特征是所述有性重组的轮数为4。