CN103820346A

CN103820346A - 一株酿酒酵母及其在发酵产乙醇中的应用

Info

Publication number: CN103820346A
Application number: CN201410088818.3A
Authority: CN
Inventors: 虞龙; 陈晓双; 李玉燕; 刘媛
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2014-03-12
Filing date: 2014-03-12
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2034-03-12
Also published as: CN103820346B

Abstract

本发明公开了一株酿酒酵母及其在发酵产乙醇中的应用，酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）SC-X234，已于2014年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC M2014005，采用了低能N⁺注入介导spt15基因技术，以SC-100为出发菌，利用TTC平板、酒精平板进行初筛，得到的菌株进行发酵复筛，逐渐提高酵母在酒精中的耐性，最终获取产量可达到15.75%的生产菌株SC-X234，该菌株可以大大提高发酵产率低的问题，且糖醇转化率较高。在5L发酵罐中，乙醇产量可以达到126g/l,比原始出发菌提高了87.5%，作为燃料乙醇具有很高的经济价值。

Description

一株酿酒酵母及其在发酵产乙醇中的应用

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株酿酒酵母及其在发酵产乙醇中的应用。

背景技术

化石能源是当今能源结构的主体，却是一类非常宝贵的不可再生资源，其储量有限，以我国为例，我国虽是石油生产大国，却也是石油消费大国和石油资源短缺大国。2008 年我国生产原油 1.9 亿吨；消费石油 3.65 亿吨，净进口原油 1.75亿吨，进口量占消费总量的 48％。而截至 2006 年底，我国累积探明石油可采储量为 20.43 亿吨，照此计算，现有石油仅能维持几十年的需要，石油供需矛盾十分突出，并将不断加剧。在这种大环境下，进行生物质能源的开发，来代替不可再生的化石能源就具有重要的实际意义。目前我国政府也已充分认识到开发使用这种"绿色能源"的重要性，近年对生物质能源研究的投入力度不断增加，特别是对研究开发用植物纤维替代粮食生产燃料乙醇给予厚望。

燃料乙醇( fuel ethanol) 是指向汽油或柴油中加入一定比例的无水乙醇。一来解决作为一次能源汽油、柴油的潜在数量有限的问题; 二是提高汽油和柴油的燃烧水平, 有利于加强环境保护。虽然酒精的燃烧值仅是汽油燃烧值的2/3, 但酒精分子中含有氧, 燃烧过程中抗爆性能好。当汽油中酒精的添加量不超过15%时, 对汽车的行驶性能无明显影响, 但尾气中的CO、NOx 化物和CH 化物的含量可降低30%~ 50%。技术研发上，世界各国均投入了巨额人力物力进行燃料乙醇的开发，尤其是研究开发用植物纤维替代粮食生产燃料乙醇优势显著。以美国为例，美国以纤维素制乙醇的技术开发较早，美国能源部 1999 年提出计划，到 2005 年把燃料乙醇的生产成本降低 36%，1999 年，美国可再生能源研究所和有关开发企业的关键发酵技术已达到相当高的水平，当然尚存在一些问题。目前各国科学家在许多领域已取得了重大进展：如微生物纤维素酶的生产效率显著提高，多种新的原料预处理实用技术已被开发；能共发酵葡萄糖和木糖的工程菌成功构建；秸秆生物转化燃料乙醇反应器的研究取得一定进展；纤维素生产乙醇中试已扩大至数十立方米发酵罐生产规模等。利用数量巨大的农作物秸秆和林产下脚料（含木质纤维素）制取燃料乙醇，已经列入我国的"十五"、"十一五"科技发展计划中。利用纤维素原料生产乙醇是利用产纤维素酶的微生物或纤维素酶先将纤维素水解成可发酵性糖，再利用酵母将其发酵成乙醇，因此获得高效产乙醇的菌株是其中的关键因素，同时各种筛选高产乙醇菌株成为研究的热点。本文通过介绍了一种新型的诱变方法提高了菌株产酒精的能力，同时提高了酿酒酵母对乙醇的耐性。目前国内产乙醇的最高水平为12%，国外最高水平可到15%。

发明内容

为了解决目前发酵产乙醇中乙醇产量低，没有高产乙醇的菌株，进而发酵产乙醇生产成本高的问题，本发明提供了一株酿酒酵母SC-X234及其在发酵产乙醇中的应用，通过诱变提高了酿酒酵母对发酵中酒精的耐性，同时保证乙醇产量在15.75%的水平。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SC-X234，已于2014年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC M 2014005，地址：中国武汉武汉大学。

本发明所述的酿酒酵母SC-X234的筛选方法：酿酒酵母原始出发菌株SC-100经过低能氮离子束注入介导spt15基因后，利用高乙醇平板、TTC平板筛选得到的菌株，经过耐乙醇驯化后且摇瓶发酵得到产乙醇浓度最高的酿酒酵母为下一轮诱变菌株。重复上述步骤，直至获取目标菌株SC-X234，具体步骤如下：

（a）单孢子悬浮液的制备：将酿酒酵母出发菌SC-100制成孢子悬浮液，浓度为1×10⁶个/mL；

（b）低能离子束介导spt15基因的诱变：取100μL孢子悬浮液及50μL含spt15的质粒（含spt15的质粒由南京工业大学许琳老师赠送），均匀涂布到无菌空平板上，以无菌风吹干，在20Kev能量下，40×10¹⁴ions/cm²剂量下进行氮离子诱变，离子注入完毕后，在无菌环境下用1mL TE溶液进行洗脱，洗脱后的菌液在37℃温浴1h，然后涂布到酒精平板上，进行压力筛选，37℃倒置培养2-3d。

（c）TTC平板的初筛：将TTC上层培养基低温倒在步骤（b）中已经长好的平板上，在37℃倒置培养1-2d，筛选到细胞脱氢酶活力强的菌株，活力越强，红色越深。

（d）发酵复筛：将步骤（c）筛选出的酿酒酵母菌接入斜面，在37℃下培养1-2d，然后斜面转入种子培养基中，在37℃下培养8-10h。取种子液接入发酵培养基中，接种量10%（v/v），250mL摇瓶装30mL培养基，发酵温度37℃，发酵48h，测定发酵液中酒精的含量，筛选出酒精含量最高的酿酒酵母菌作为下一轮诱变筛选的出发菌株，重复上述步骤直至筛选到目标菌株SC-X234。

上述筛选方法中：步骤（b）中的酒精平板是在YPD培养基中加入5%-10%的酒精，步骤（c）的TTC培养基分为上层培养基和下层培养基，下层培养基即为YPD培养基，上层培养基组分为TTC 0.5g 葡萄糖5g 琼脂15g定容到1L, pH自然。步骤（d）种子培养基成分碳源5%、氮源0.7%，无机盐 0.016%，缓冲剂 0.1 %，pH=5.5，步骤（d）中发酵培养基成分成分：碳源36%、氮源1.1%、无机盐0.02%、缓冲剂0.5%,其中碳源为葡萄糖或玉米淀粉中的一种或混合物；氮源:有机氮源为酵母膏，无机氮源：硫酸铵，pH=5.5，缓冲剂为磷酸二氢铵。

本发明酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SC-X234的形态学及生理化学特性：

菌落颜色：乳白色

需氧方式：兼性厌氧

菌落大小：2-3mm

生长温度：35-40℃

最适pH ：5.0-5.5

菌落形态：圆形

美兰染色：活菌为无色，死菌为蓝色。

上述酿酒酵母SC-X234在发酵生产乙醇中的应用，包括如下步骤：

1）平板培养：将酿酒酵母SC-X234接于平板基本培养基上培养，培养温度为35-40℃，培养时间1-2d；

2）斜面培养：将步骤1）中平板培养的酿酒酵母SC-X234转接到斜面基本培养基上，培养时间18-20h，培养温度35-40℃；

3）种液培养：将步骤2）中斜面培养的酿酒酵母SC-X234接到种子培养基中培养，培养时间8-10h，培养温度35-40℃，摇床转速为150r/min；

4）发酵培养：将步骤3）中的种液转接到发酵培养基中，接种量为10%，培养时间为48h，培养温度为35-40℃，摇床转速为100r/min。

其中：步骤1）和2）中的基本培养基包含如下质量百分数的组分：碳源2%、氮源3-4%、琼脂2%，其余为水，pH自然；其中所述的碳源为葡萄糖或玉米淀粉中的一种或两种，所述氮源为蛋白胨或酵母粉的混合物。

步骤3）种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源5%、氮源 0.5-1%，无机盐 0.01-0.02%，缓冲剂 0.1-0.2%，pH=5.5，其中碳源为葡萄糖、玉米淀粉或糖蜜中的一种或几种混合物；氮源为酵母粉、硫酸铵或者磷酸氢二铵中的一种或几种，缓冲剂为磷酸二氢铵。

步骤4）发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源32-36%、氮源1-2%、无机盐0.02-0.05%、缓冲剂0.5-1%，pH=5.5，其中碳源为葡萄糖或玉米淀粉中的一种或几种混合物；氮源为酵母膏、硫酸铵中的一种或几种，缓冲剂为磷酸二氢铵。

注入介导spt15基因是为了提高酿酒酵母对乙醇的耐性，spt15是起始转录因子，spt15基因的突变会使酿酒酵母的酒精耐性发生改变，为了筛选高耐乙醇的酿酒酵母，从而获取高产乙醇的酿酒酵母。

有益效果：本发明采用了低能N⁺注入介导spt15基因技术，以SC-100为出发菌，利用 TTC平板、酒精平板进行初筛，得到的菌株进行发酵复筛，逐渐提高酵母在酒精中的耐性，最终获取产量可达到15.75%的生产菌株SC-X234，该菌株可以大大提高发酵产率低的问题，且糖醇转化率较高。在5L发酵罐中，乙醇产量可以达到126g/L，比原始出发菌提高了87.5%，作为燃料乙醇具有很高的经济价值。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1 酿酒酵母SC-X234的筛选方法

出发菌株酿酒酵母SC-100是购自于安琪酵母股份公司的安琪酵母干粉便于标记，实验室将其命名为SC-100。

以SC-100为出发菌筛选酿酒酵母SC-X234，具体步骤如下：

a）单孢子悬浮液的制备：将酿酒酵母出发菌制成孢子悬浮液，浓度为1×10⁶个/mL。

b) 低能离子束介导spt15基因的诱变：取100μL孢子悬浮液及50μL含spt15的质粒，均匀涂布到无菌平板上，以无菌风吹干，在20Kev能量下，40×10¹⁴ions/cm²剂量下进行氮离子诱变，离子注入完毕后，在无菌环境下用1mL TE溶液进行洗脱，洗脱后的菌液在37℃温浴1h，然后涂布到酒精平板上，进行压力筛选，37℃倒置培养2-3d。

c)诱变株的筛选

TTC平板的初筛：将TTC上层培养基低温倒在步骤（b）中长好的平板上，在37℃倒置培养1-2d，筛选到细胞活力强的菌株,脱氢酶活力越强，红色越深。

d）发酵复筛：将步骤（c）筛选出的酿酒酵母菌接入斜面培养基中，在37℃下培养1-2d，然后斜面转入种液中，在37℃下培养8-10h。取种子液接入发酵培养基中，接种量10%（v/v），250mL摇瓶装30mL培养基，转速为100r/min，发酵温度37℃，发酵48h，测定发酵液中酒精的含量，筛选出酒精含量最高的酿酒酵母菌作为下一轮诱变筛选的出发菌株，重复上述步骤直至筛选到目标菌株SC-X234。

其中培养基配方为：

步骤b)中的酒精平板培养基为：葡萄糖2%、鱼粉蛋白胨2%、琼脂2%、酵母膏2%、酒精8%其余为水pH自然。步骤c)中的TTC培养基为：TTC0.5g、葡萄糖5g、琼脂15g定容到1L自然pH

步骤（c）的TTC平板分为上层培养基和下层培养基，下层培养基即为YPD培养基，上层培养基组分为TTC 0.5g 葡萄糖5g 琼脂15g定容到1L，pH自然。

步骤d）中的种子液培养基:葡萄糖5%、酵母膏0.5%、硫酸镁0.01%、氯化钙0.06g/L、硫酸铵0.2%、磷酸氢二铵0.1%、pH为5.5,其中葡萄糖需要分消（分消为分开单独灭菌的意思）。

步骤d）中的发酵培养基：葡萄糖36%、酵母膏0.1%、氯化钙0.01%、硫酸铵1%、磷酸氢二铵0.5%、硫酸镁0.01%、pH5.5，其中葡萄糖需要分消。

发酵结果酒精含量检测如表1

表1

菌号	出发菌SC-100	诱变株SC-X234
			酒精含量（v/v）	8%	15%

经过诱变选育的酵母的产酒精的能力较出发菌有很大的提升。

实施例2

本实施例说明诱变株酿酒酵母SC-X234的生物学形态及遗传稳定性

本发明酿酒酵母SC-X234的形态学及生理化学特性：菌落呈乳白色，兼性厌氧，菌落大小为2-3mm，圆形菌落，生长温度35-40℃，最适pH为5.0-5.5，美兰染色：活菌为无色，死菌为蓝色。

以实施例1中的培养基及培养条件进行传代实验，结果如表2，

表2 酿酒酵母SC-X234的遗传稳定性

传代次数	酒精产量（v/v）
		1	15.25
2	15
		3	15
4	15.25
		5	14.75
6	15.25

从遗传稳定性实验结果分析可知，突变株酿酒酵母SC-X234经过6次传代实验，其酒精产量稳定，具有很好的遗传稳定性，可以作为进一步开发和研究的菌株。

实施例3

本实例说明酿酒酵母SC-X234利用玉米糖化液发酵产酒精

本实施例中所述培养基配方如下：

平板培养基：葡萄糖2%、蛋白胨2%、琼脂2%、酵母膏2%，其余为水，自然pH。

斜面培养基：葡萄糖2%、蛋白胨2%、琼脂2%、酵母膏2%其余为水，自然pH。

种子培养基：葡萄糖5%、酵母膏0.5%、硫酸镁0.01%、氯化钙%、硫酸铵0.2%、磷酸氢二铵0.1%、pH为5.5,其中葡萄糖需要分消。

发酵培养基：玉米糖化液32%、酵母膏0.1%、氯化钙0.01%、硫酸铵1%、磷酸氢二铵0.5%、硫酸镁0.01% pH5.5，其中葡萄糖需要分消，玉米糖化液为玉米经液化酶和糖化酶处理后的产物。

将酿酒酵母SC-X234接种到平板培养基，培养温度37℃，培养时间12h-24h，然后转入斜面培养基，在37℃下培养1-2d，然后斜面转入种子培养基中，在37℃下培养8-10h。取种子液接入发酵培养基中，接种量10%（v/v），250mL摇瓶装30mL培养基，转速为100r/min,发酵温度37℃，发酵48h，测定发酵液中酒精的含量达到13.5%（v/v），比同等条件的原始出发菌提高了50.6%。

实施例4

本实例说明突变株SC-X234酿酒酵母利用糖蜜发酵产酒精

本实验所述实验培养基配方

平板培养基：葡萄糖2%、鱼粉蛋白胨2%、琼脂2%、酵母膏2%，其余为水，自然pH。

斜面培养基：葡萄糖2%、鱼粉蛋白胨2%、琼脂2%、酵母膏2%，其余为水，自然pH。

种子培养基：葡萄糖5%、酵母膏0.5%、硫酸镁0.01%、氯化钙0.06%、硫酸铵0.2%、磷酸氢二铵0.1%、pH为5.5，其中葡萄糖需要分消。

发酵培养基：糖蜜32%、酵母膏0.1%、氯化钙0.01%、硫酸铵1%、磷酸氢二铵0.5%、硫酸镁0.01% 、pH5.5，其中葡萄糖需要分消。

将酿酒酵母SC-X234接种到平板培养基，培养温度37℃，培养时间12h-24h，然后转入斜面培养基，在37℃下培养1-2d，然后斜面转入种液中，在37℃下培养8-10h。取种子液接入发酵培养基中，接种量10%（v/v），250mL摇瓶装30mL培养基，转速为100r/min,发酵温度37℃，发酵48h，测定发酵液中酒精的含量达到10.5%（v/v），比同等条件的原始出发菌提高了75%。

实施例5

本实例说明突变株SC-X234酿酒酵母在5L发酵罐中发酵产酒精

本实验所述实验培养基配方

平板培养基：葡萄糖2%、鱼粉蛋白胨2%、琼脂2%、酵母膏2%其余为水，自然pH。

斜面培养基：葡萄糖2%、鱼粉蛋白胨2%、琼脂2%、酵母膏2%其余为水，自然pH。

种子培养基：葡萄糖5%、酵母膏0.5%、硫酸镁0.01%、氯化钙0.06%、硫酸铵0.2%、磷酸氢二铵0.1%、pH为5.5,其中葡萄糖需要分消。

发酵培养基：葡萄糖32%、酵母膏0.1%、氯化钙0.01%、硫酸铵1%、磷酸氢二铵0.5%、硫酸镁0.01%、pH5.5，其中葡萄糖需要分消。

将酿酒酵母SC-X234接种到平板培养基，培养温度37℃，培养时间12h-24h，然后转入斜面培养基，在37℃下培养1-2d，然后斜面转入种液中，在37℃下培养8-10h。取种子液接入含有3L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量10%（v/v），转速为100r/min ，发酵温度37℃，发酵48h，检测酒精含量达到15.75%，同比相同条件下的出发菌株提高了96.9%。

以上实施例中酒精检测方法为：气象色谱（毛细管柱AC-20）柱箱温度：60℃；进样器温度：190℃；检测器温度：240℃。内标物：正丙醇。检测液配置方法：（0.5mL 6%正丙醇溶液+0.5mL被测样品）定容至10mL。进样量：2μL 。

本发明所采用的培养基配方中百分比（%）为质量百分比。

Claims

1.一种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SC-X234，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC M 2014005。

2.权利要求1所述的酿酒酵母SC-X234在发酵生产乙醇中的应用。

3.根据权利要求2所述的酿酒酵母SC-X234在发酵生产乙醇中的应用，其特征在于包括如下步骤：

3）种液培养：将步骤2）中斜面培养的酿酒酵母SC-X234接到种子培养基中培养，培养时间8-10h，培养温度35-40℃；

4）发酵培养：将步骤3）中的种液转接到发酵培养基中，接种量为10%，培养时间为48h，培养温度为35-40℃。

4.根据权利要求3所述的酿酒酵母SC-X234在发酵生产乙醇中的应用，其特征在于：步骤1）和2）中的基本培养基包含如下质量百分数的组分：碳源2%、氮源3-4%、琼脂2%，其余为水，pH自然；其中所述的碳源为葡萄糖或玉米淀粉中的一种或两种，所述氮源为蛋白胨或酵母膏。

5.根据权利要求3所述的酿酒酵母SC-X234在发酵生产乙醇中的应用，其特征在于：步骤3）种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源5%、氮源 0.5-1%，无机盐 0.01-0.02%，缓冲剂 0.1-0.2%，pH=5.5，其中碳源为葡萄糖、玉米淀粉或糖蜜中的一种或几种混合物；氮源为酵母膏、硫酸铵或者磷酸氢二铵中的一种或几种；无机盐为硫酸镁和氯化钙中的一种或几种；缓冲剂为磷酸二氢铵。

6.根据权利要求3所述的酿酒酵母SC-X234在发酵生产乙醇中的应用，其特征在于：步骤4）发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源32-36%、氮源1-2%、无机盐0.02-0.05%、缓冲剂0.5-1%，pH=5.5，其中碳源为葡萄糖、糖蜜或玉米淀粉中的一种或几种混合物；氮源为酵母膏、硫酸铵中的一种或几种，缓冲剂为磷酸二氢铵，无机盐为硫酸镁和氯化钙中的一种或几种。