CN103232948B - 一株耐高温酿酒酵母菌株及其选育方法 - Google Patents

Abstract

一株耐高温酿酒酵母菌株及其选育方法。本发明提供的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae SY-5-11L，保藏号为CGMCC No.7377。该菌在其它发酵性能不受影响的情况下，在38℃高温发酵条件下乙醇产量为13.9%（v/v），较亲本菌株提高了17.8%。在40℃高温发酵条件下乙醇产量为12.2%（v/v），较亲本菌株提高了34.1%。通过对酿酒酵母出发菌株进行人工紫外诱变，筛选出23株在高温发酵条件下乙醇产量明显提高的正向突变株做为基因组重排文库，进行三轮基因组重排后，筛选出高温发酵条件下乙醇产量最高的突变株。最终选育得到的酿酒酵母菌株可在高温发酵条件下进行乙醇发酵，对发酵设备及工艺条件没有特殊要求，一般工厂的设备和条件均可使用，因而有广泛的应用前景。

Description

一株耐高温酿酒酵母菌株及其选育方法

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一株耐高温酿酒酵母菌株及其选育方法。

背景技术：

酒精在国计民生中占有很重要的位置，在医药、有机合成、食品工业、工农业及国防工业都有着广泛的应用。随着近年来酒精需求量的不断加大，酒精的生产越来越受到人们的关注。2001年中国政府将“大力发展燃料酒精”列入到“十五”计划中。在对车用燃料酒精“十五”发展专项规划的论证中。

现阶段，生产酒精的原料主要是玉米等淀粉质原料，糖蜜以及纤维质原料等；用于发酵的菌株主要是酿酒酵母；所采用的工艺一般是浓醪发酵工艺。现今燃料乙醇的生产规模已十分巨大也较为成熟，然而依然存在着问题，其中最重要的是由于酵母发酵过程中的产热反应引起的发酵醪液温度的升高。过高的温度会对酵母的繁殖和发酵产生很多不利的影响。高温发酵有发酵速度快，节省冷却水等重要优势，故综合考虑乙醇生产过程，对酿酒菌株进行改造，选育耐温型酵母是关键的解决方案。

酵母对高温等胁迫条件的耐受性是由众多基因和代谢通路协同控制的，且多条调控途径尚不明确，因此采用分子育种技术对有限的目标基因进行基因组定向改造效果有限。采用传统诱变技术进行育种，多数酵母菌株对诱变剂产生了“钝化”反应，大大削弱了传统育种技术的效果。基因组重排是一种可以快速改良菌株复杂性能的育种方法，它是基于黑箱原理之上，使基因组发生正向突变优化组合的一种育种方法。可经过多轮融合，使正向突变表型不断聚集，最终得到性能有较大提升的重排菌株，相比于经典诱变育种、原生质体融合，具有明显的优势。基于这个前提，可通过将传统诱变育种技术与基因组重排技术相结合，选育出耐高温酿酒酵母菌株。

发明内容：

本发明的目的是提供一株耐高温酿酒酵母菌株及其选育方法。

本发明提供的酿酒酵母菌株是具有耐高温性能的酿酒酵母菌株，具体为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SY-5-11L。该菌已于2013年3月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101），保藏编号为CGMCC No.7377。

所述酿酒酵母菌株在其它发酵性能不受影响的情况下，在高温40℃发酵条件下乙醇产量为12.2%（v/v），较出发菌株乙醇产量相比提高了34.1%。

所述酿酒酵母菌株的选育方法，具体可以通过人工诱变出发菌株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC2.0119(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，公众可以通过该保藏管理委员会获得出发菌株2.0119)，筛选出若干耐高温酿酒酵母突变株作为正向突变株文库，将该文库通过三轮高效生孢杂交实现三轮基因组重排来获得。

上述诱变和基因组重排方法可以用常规的方法获得，这些方法已有许多文献报道，如Lihua Hou,Novel methods of genome shuffling in Saccharomyces cerevisiae[J]．BiotechnologyLetters,2009,31(5):671-677。与改造耐受性相关基因的分子育种方法相比，这种通过传统诱变育种和新型基因组重排集合相结合的方法，效率和效果均有明显优势；且菌株比基因组定向改造得到的突变株稳定性更高，更有利于工业化应用。

本发明所提供的构建上述酿酒酵母菌株的方法是，先将出发菌株经传统紫外诱变，获得基因型多样的突变株群体；以38℃高温培养为初筛条件，筛得的菌株以TTC（氯化三苯基四氮唑）法进行复筛，经复筛后得到的突变株再进行高温发酵实验测试产乙醇能力，最终从中筛选出一定数量的相对于亲本高温发酵性能有所提升的突变株,建立用于基因组重排的原始正向突变株文库。对酿酒酵母的高效生孢、杂交等基因组重排条件进行优化。在该条件下，对原始正向突变株文库进行三轮基因组重排，每轮重排后，选出高温下产乙醇能力有提高的重排株作为下一轮基因组重排的正向突变株文库。每轮重排之后在高温发酵条件下筛选获得乙醇产量最高的基因组重排最优菌，最终三轮基因组重排后获得高温发酵条件下乙醇产量最高的酿酒酵母菌株。

本发明所述酿酒酵母菌株可用于酿酒生产中。

有益效果：

本发明利用酿酒酵母细胞的有性生殖特性，对双倍体亲本酵母菌株进行传统诱变育种，以获得充分的遗传多样性突变株群体，并通过多轮有性重组以及生孢来实现基因组重排，构建得到在高温发酵条件下高产乙醇的酿酒酵母菌株。该菌株具有很高的遗传稳定性，不易产生回复突变，有应用于工业化生产的潜能。通过本方法构建的酿酒酵母重组菌株CGMCC No.7377具有较强的高温耐受性以及较高的乙醇终产量等特点，能够降低发酵过程中冷却以及后期蒸馏所需的能耗，提高经济效益。筛选得到的工程菌对发酵设备及条件没有特殊要求，一般工厂的设备和条件均可使用，因而有广泛的应用前景。

附图说明：

图1是紫外诱变的致死率曲线。

图2是基因组重排过程的技术路线图。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1：耐高温酿酒酵母菌株的选育

（1）传统诱变育种建立突变株文库

挑取一环酵母菌斜面培养物接种于5mL的YPD液体培养基中，30℃、100rpm培养至对数生长中后期，离心收集菌体并用无菌生理盐水洗涤两次，重悬细胞将浓度调至10⁶个/mL。取4mL菌悬液于Ф70mm培养皿中，用15W紫外灯，距培养皿内菌液高度30cm进行照射，紫外照射后的菌液置于YPD液体中于30℃、100rpm培养4h后，取适当稀释后涂于YPD培养基平板上。对菌液照射不同的时间（0s，5s，10s，20s，30s，40s，50s，60s，70s，80s），分别稀释涂板培养两天，待菌落长出来，对平板上的菌落计数，并计算致死率，绘制基于不同照射时间的致死率曲线（如图1所示）。故选定40s作为最终诱变时间。按照以上诱变方法对细胞进行人工紫外诱变，将诱变之后的菌液经30℃、100rpm培养4h后涂布到YPD平板进行初筛。

将诱变后得到的菌液稀释后涂布YPD平板，于高温培养条件进行初筛后，挑出其中较大的菌落于TTC平板进行复筛，将筛得的突变株接种于玉米粉水解液中于40℃温度下静置发酵三天，检测发酵液酒精度。选取23株产酒度高于出发菌株的突变株，建立突变株文库。

所述玉米粉水解液的制备方法如下：将1500g玉米粉加入4500mL65～70℃的自来水，放置20min，使玉米粉颗粒充分吸水膨胀。加入液化酶（a-淀粉酶）0.9mL，在85～90℃下液化1.5h。液化完成后，降温至60℃，加入糖化酶3mL。在55～60℃下糖化20h。将糖化液用滤布过滤，得到澄清滤液，即为玉米水解液，煮沸10分钟冷却待用。

（2）基因组重排

基因组重排技术路线如图2所示。将突变株文库的细胞群体都接种到YPD液体培养基中，在30℃，180rpm下培养至对数期，离心收集细胞。用无菌水将菌体洗净，随后将菌泥接入到预产孢培养基（10g/L KAc，10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨）中，28℃，200rpm培养12h，离心收集菌体。用无菌水将菌体洗三次后将所得菌泥接种到高效液体生孢培养基（10g/L KAc，1g/L酵母提取物，0.5g/L葡萄糖，50mg/L腺嘌呤，100mg/L组氨酸，50mg/L尿嘧啶，100mg/L色氨酸，100mg/L亮氨酸）中，28℃，200rpm下培养5d。将完成高效生孢过程的菌液离心收集细胞，用2%的蜗牛酶液（加入2.5%的β-巯基乙醇）将细胞重悬，于30℃，180rpm处理12h，离心收集菌体，用等量的0.5％（V/V）的Triton X-100重悬，用超声波震荡该体系，使子囊壁充分破裂并释放出孢子，期间不断观察破壁效率，待视野中无二倍体细胞时，终止超声破碎，用无菌水将菌体洗三次，重悬于0.5％（V/V）的Triton X-100。将一定的孢子菌悬液涂布到YPD培养基中，置于30℃、100rpm培养24h以上，使细胞充分杂交，由此完成第一轮基因组重排。收集细胞，并将其涂布在YPD平板上，40℃培养箱内培养24h，从平板上挑取较大的菌落，继续用TTC法进行复筛，将复筛之后得到的突变株接种于玉米粉水解液中于40℃温度下静置发酵三天，检测发酵液酒精度，选取若干株产酒度进一步提高的菌株，用于构建第二轮基因组重排的突变株文库。

按照上述步骤，将新一轮构建的突变株文库的细胞群体进行产孢、孢子纯化、杂交，进行第二、三轮基因组重排，并在第三轮基因组重排后，筛选出在高温发酵条件下产酒度最高的基因组重排株。

实施例2：基因组重排菌株的发酵性能

（1）基因组重排菌株的高温耐受性

将出发菌株AY12与基因组重排菌株LYQ-F3培养至对数生长期，分别接种至装有麦芽汁培养基（6°Brix）的杜氏管中，分别在设定温度（30℃、35℃、38℃、40℃、42℃）下静置培养，每12h观察产气情况并记录结果（如表1所示）。如结果所示，基因组重排后，菌株在高温条件下的产气较出发菌株有了明显提升，表明基因组重排菌株的高温耐受性高于出发菌株。

表1出发菌株与基因组重排菌株的高温耐受性

注：所示数据为三次以上实验的代表性结果。

（2）基因组重排菌株的发酵实验

将出发菌株和基因组重排选育出的突变株同时进行乙醇发酵试验，测定比较菌株在不同温度下的产乙醇能力，结果见表2。由表2可知，发酵温度为30℃时，出发菌株的乙醇产量为酒精度15.1%（v/v），突变株的乙醇产量为酒精度14.8%（v/v），突变株没有发酵性能优势；而在38℃与40℃高温发酵条件下，突变株的乙醇产量分别为13.9%（v/v）和12.2%（v/v），较出发菌株分别提高了17.8%和34.1%。由此可见，本发明提供的酿酒酵母菌株具有在高温条件下高产乙醇的优良发酵性能。

表2出发菌株和突变株产乙醇（%，v/v）能力比较

菌株	30℃	38℃	40℃
				出发菌株	15.1	11.8	9.1
突变株	14.8	13.9	12.2

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。

Claims (2)

1.一株耐高温酿酒酵母菌株，具体为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SY-5-11L，保藏编号为CGMCC No.7377，所述耐高温酿酒酵母菌株在高温40℃发酵条件下乙醇产量为12.2％v/v，较出发菌株乙醇产量相比提高了34.1％。

2.如权利要求1所述的一株耐高温酿酒酵母菌株在酿酒生产中的应用。