CN110283870A - 一种双菌株混合固态发酵玉米秸秆的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双菌株混合固态发酵玉米秸秆的方法，所述方法为：(1)配置LB平板/液体培养基和YPD平板/液体培养基；(2)将解淀粉芽孢杆菌和酵母菌分别接种于LB平板和YPD平板上，放入培养箱倒置培养，得到菌落；(3)将解淀粉芽孢杆菌和酵母菌的菌落分别接入到LB液体培养基和YPD液体培养基中，放入摇床继续培养；(4)配置玉米秸秆固体培养基；(5)将解淀粉芽孢杆菌接入到玉米秸秆固体培养基中，作用1～3天后再按解淀粉芽孢杆菌：酵母菌的数目比＝1:1的比例向培养基中加入酵母菌，继续发酵玉米秸秆；(6)浓缩收集玉米秸秆固体培养基中的乙醇。该方法能够为玉米秸秆的降解减少环境污染，同时残留的底物可制成蛋白质丰富的牲畜饲料。

Description

一种双菌株混合固态发酵玉米秸秆的方法

技术领域

本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种双菌株混合固态发酵玉米秸秆的方法及应用。

背景技术

当今人类社会主要面临着人口膨胀、能源危机、资源短缺、环境污染等多种问题，其中环境问题尤为严峻。我国是农业大国，每年产生数亿吨秸秆废料。农作物秸秆是在成熟果实被摘取后所剩余的农作物茎叶总称。秸秆是农作物进行光合作用和产物积累的场所，秸秆中含有多种有机物和矿物质元素。因此，作为一种农作物副产品，秸秆还是一种重要的具有多种功用的可再生生物资源。我国常见的重要农作物秸秆种类包括：水稻、小麦、玉米、豆类、薯类、油菜、甘蔗、棉花以及烟草等多个品种。作为农业大国，我国的农作物秸秆不仅产量巨大，而且种类非常丰富，其中占比最多的三种农作物秸秆包括水稻、玉米、小麦。据统计，我国农作物秸秆总年产量为超过6亿吨，在全球秸秆总产量中占比超过20％。玉米秸秆是所有农作物秸秆中产量最大的一种，每年我国在获得粮食大丰收的同时，还可以得到2亿多吨的玉米秸秆。

玉米秸秆的资源再利用，关乎社会、经济和环境多方面的问题。在长久过去的粗放经济时代，我国农村常用的的处理玉米秸秆方式往往是弃置、无控焚烧和秸秆腐熟还田。这种粗狂无序的处理方式，虽然在国家和地方出台了多项政策管控治理农作物的田间焚烧，但是由于没有更为有效的解决之道，因此效果并不明显。现在的农业中，还是存在资源的大量浪费，同时还会带来严重的空气污染、土地破坏等生态问题。随着我国农业结构的调整和优化，每年的玉米秸秆废气量仍旧在上升中。因此，提高玉米秸秆的再利用效率，创新发展再利用资源方式，是我国农业资源可持续发展的一条重要途径。

干燥处理后的玉米杆中含有的干物质中，按照种类分为矿物质元素的无机物和由粗蛋白组成的含氮有机物与无氮有机物。其中，后者的重量占到玉米秸秆干重的80％以上，主要分为纤维素、半纤维素、木聚糖醛酸和木质素等成分。玉米秸秆的细胞壁中最主要的成分是纤维素，这是一种由8000～12000个葡萄糖单体通过糖苷键缩合连接行程的有机大分子多糖。由于葡萄糖排列紧密，且被半纤维素和木质素围绕，所以在一般的有机溶剂中纤维素都不溶，也难发生水解反应。由于玉米秸秆中主要的维素、半纤维素以及木质素降解难度大，且占有比重非常高，在自然环境中自然降解速度非常缓慢。因此，在工业生产中玉米秸秆的降解以加快降解速度和提高转化效率为目标。

目前应用广泛、较为成熟的做法是先用物理或化学方法对大规模玉米秸秆进行预处理，再用生物法进行高效、特异性转化。物理方法是为了直接破坏纤维素和木质素的粘合力，使完整秸秆转变为粒度小的颗粒，增加后续生物反应的接触表面积，促进微生物或生物酶与秸秆的反应速度和效率。目前实际应用中可以广泛用于工业化生产的物理处理法有机械粉碎法、高温热解法、蒸汽***法和辐射法等方法。化学方法的直接目的是增加玉米秸秆中细胞壁中三种天然大分子结构复合物的溶解度，使其更容易被后续酶解消化。但是，仅依靠这两种方法，得到的产物复杂，目标产物含量低，后续还需要进一步分离和提纯，增加了流程复杂性，会造成目标物的进一步损失。同时，由于常用的强酸、强碱和有机溶剂，会造成严重的环境污染，这与再利用玉米秸秆，降低环境污染的初衷背道而驰。

生物降解法主要是应用纤维素降解菌的生物活性，处理和降解玉米秸秆，此法效率高、成本低并且绿色环保。生物降解法的效率除了与反应环境有关，另外主要取决于对微生物的选择。目前已经发现的自然界中已有的具有纤维素降解能力的微生物包括：细菌、真菌与放线菌，主要应用适应能力更强的细菌类微生物，应用广泛的有芽孢杆菌属的菌株，该菌株能够形成耐高温，存活力强大的芽孢，使其对反应环境的要求非常低。在目前实际应用的玉米秸秆的微生物降解方法中，大多选用的是单菌株法，即引入并参与玉米秸秆降解的主要是一种明确已知的菌种。但单菌株降解的明显缺点是降解速度慢，转化率低，因此可以引入双或多菌株生物降解法，这种方法在多个层次都能表现出优势。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种双菌株混合固态发酵玉米秸秆的方法及应用，本发明采用的解淀粉芽孢杆菌和酵母菌的降解作用效率高，且机制明确，易于控制和研究，通过单因素实验设计对玉米秸秆发酵工艺进行优化，筛选出最优降解玉米秸秆的发酵条件，设计出解淀粉芽孢杆菌和酵母菌复合菌种体系的配比与接入时间，制定出有良好降解效果的反应条件。能够为玉米秸秆的降解减少环境污染，同时残留的底物可制成蛋白质丰富的牲畜饲料。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种双菌株混合固态发酵玉米秸秆的方法，包括以下步骤：

步骤1)配置普通的LB平板、LB液体培养基和含有葡萄糖底物的YPD平板、YPD液体培养基，对培养基进行灭菌处理；

步骤2)将解淀粉芽孢杆菌接种于所述LB平板上，将酵母菌接种于所述YPD 平板上，放入培养箱倒置培养，得到菌落；

步骤3)将解淀粉芽孢杆菌的菌落接入到所述LB液体培养基中，将酵母菌落接入到所述YPD液体培养基中，放入摇床继续培养；

步骤4)配置玉米秸秆固体培养基，并对培养基进行灭菌处理；

步骤5)将解淀粉芽孢杆菌接入到所述玉米秸秆固体培养基中，作用1～3天；之后再按解淀粉芽孢杆菌：酵母菌的数目比＝1:1的比例向玉米秸秆固体培养基中加入酵母菌，继续发酵玉米秸秆；

步骤6)用蒸馏冷凝方法浓缩收集发酵完的玉米秸秆固体培养基中的乙醇，剩余固体残渣可作为生物菌肥。

优选地，步骤3)所述YPD液体培养基中葡萄糖底物的浓度为20g/L。

优选地，步骤4)所述玉米秸秆固体培养基的配置过程如下：将玉米秸秆晒干后用粉碎机粉碎至100目，以玉米秸秆：无菌水的质量比＝1:6的比例配置成粘稠状固体，再高温灭菌。

优选地，步骤5)所述解淀粉芽孢杆菌接入至玉米秸秆固体培养基中作用的时间为2天。

一种双菌株混合固态发酵玉米秸秆的方法在降解玉米秸秆方面的应用。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明选择酵母菌与解淀粉芽孢杆菌为出发菌株，以降解玉米秸秆，培养大量细菌蛋白质为目的，研究了单、双菌株同时发酵，顺序发酵对玉米秸秆的降解反应。通过单因素实验设计对玉米秸秆发酵工艺进行优化，筛选出最优降解条件，设计出解淀粉芽孢杆菌和酵母菌复合菌种体系的配比与加入时间，制定出最优降解效果的反应条件。

(2)本发明先用解淀粉芽孢杆菌作用玉米秸秆，再用酵母菌处理，实现了良好的降解玉米秸秆的效果，并且能够培养出大量的菌体，可以用于动物蛋白饲料的生产。解淀粉芽孢杆菌能够合成纤维素酶等降解玉米秸秆的酶，并且和酵母菌一样具备发酵酒精的功能。酵母菌中含有丰富的蛋白质、脂肪、糖、B族维生素、酶(辅酶)、核糖核酸、甾醇等营养物质，解淀粉芽孢杆菌为动物肠道益生菌，可改善动物肠道菌群的平衡，增强动物机体免疫能力，促进动物生长发育，提高动物生产性能。

(3)本发明采用解淀粉芽孢杆菌先产生纤维素酶降解玉米秸秆形成还原糖，然后菌用还原糖再进行下一步的代谢，此时加入酵母菌促进两种菌的生长，使得细菌数增多，酶量也变多，形成一个酶降解玉米秸秆，产生还原糖，菌再利用还原糖进行生长再产生酶的良性循环。

附图说明

图1为不同菌种发酵的最大酒精浓度；

图2为标准梯度葡萄糖所测吸光值。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明做进一步阐述。

本发明实施例中所使用的解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)和酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)是实验室购买的通用菌株和细胞。其中解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)的保藏编号为CGMCC No.1.7463。酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)的保藏编号为CGMCC No.2.1638。

实施例1

一种双菌株混合固态发酵玉米秸秆的方法，具体步骤如下：

1、活化培养基的制备

(1)配置普通的LB液体培养基：每100mL培养基中含有1g蛋白胨、1g 氯化钠和0.5g酵母粉，固体(平板)培养基中还需加入2g琼脂粉，加无菌水定容后放入高压灭菌锅中在121℃，20min条件下灭菌备用；

(2)配置葡萄糖浓度20g/L的YPD液体培养基，每100mL培养基中含有 2g蛋白胨、2g葡萄糖和2g酵母粉，固体(平板)培养基中还需加入2g琼脂粉，加无菌水定容后放入高压灭菌锅中在115℃，25min条件下灭菌备用。

2、菌种扩大培养与适应

(1)将存放于-80℃冰箱的解淀粉芽孢杆菌种和酵母菌种用接种环分别在 LB和YPD平板培养基上划线接种，放入培养箱28±2℃倒置培养2天；

(2)两天后将解淀粉芽孢杆菌的菌落接入到LB液体培养基中，将酵母菌落接入到YPD液体培养基中，种子培养过程采用三角瓶，放入摇床180rpm， 28±2℃培养2天。

3、玉米秸秆培养基的配置

将玉米秸秆晒干后用粉碎机粉碎到100目左右，以玉米秸秆：无菌水的质量比＝1:6的比例配置成粘稠状固体，在115℃，25min条件下高温灭菌。

4、固体培养基发酵

测量培养了两天的解淀粉芽孢杆菌和酵母菌的OD值，得到解淀粉芽孢杆菌和酵母菌的OD值。按解淀粉芽孢杆菌：酵母菌的数目比＝1:1的比例将解淀粉芽孢杆菌培养液和酵母菌液分别接入玉米秸秆培养基中，等解淀粉芽孢杆菌作用1 天、2天、3天后再接入酵母菌液，作用一周。

按以下方式配置培养基进行菌种固体发酵：1号培养基为解淀粉芽孢杆菌单独发酵，2号培养基为酵母菌单独发酵，3号培养基为解淀粉芽孢杆菌和酵母菌同时加入发酵，4号培养基为解淀粉芽孢杆菌作用1天后接入酵母菌发酵，5号培养基为解淀粉芽孢杆菌作用2天后接入酵母菌发酵，6号培养基为解淀粉芽孢杆菌作用3天后接入酵母菌发酵。

5、发酵后期处理

用蒸馏冷凝方法浓缩收集发酵完培养基中的乙醇，剩余固体残渣中含有大量细胞和玉米秸秆降解产生的营养物质，可作为生物菌肥。

6、结果分析

(1)液体培养基的酒精度的测定

每天在超净工作台中每瓶发酵液取5mL样品，然后补入20g/L浓度的YPD 培养基5mL。取出的样用酒精计测定酒精度，如图1所示。

由图1看出，单独的解淀粉芽孢杆菌和单独的酵母菌以及混合菌都可以发酵培养基并产生乙醇，而且混合状态下发酵产生的酒精量比单独的菌种发酵产生的酒精量更多。

根据实验过程得知，解淀粉芽孢杆菌生长速度慢，在发酵后期细菌密度多的时候才发酵产生大量乙醇，酵母菌生长速度快，但是发酵产乙醇的量少。将两种菌混合培养，便可以将两者优点结合起来，细菌生长速率很快，细菌密度高，发酵乙醇速度快，而且量比单独菌种发酵产生的乙醇量更多。

(2)培养基悬液吸光值、细胞数的测定，平板的观察

培养基1～6中，取1g未接菌的玉米秸秆培养基加100mL无菌水作为参照，测出1g接菌固体培养基加入100mL无菌水沉降得到的细菌悬液的OD值，再用显微镜和25×16规格的血球计数板观察计算出悬浮液中菌的数量，将不同培养基的结果进行对比。再将细菌悬液接入到平板上，培养两天后观察平板上酵母菌和解淀粉芽孢杆菌的生长情况，不同培养基之间进行对比，如表1所示。

表1玉米秸秆固体培养基发酵后加水配成悬液OD值

由表1可以看出，培养酵母菌的培养基悬液的细菌数和OD值最低，说明酵母菌在培养基中并没有良好的生长，而解淀粉芽孢杆菌细菌数明显较多，悬液 OD值较高，说明解淀粉芽孢杆菌能有效利用玉米秸秆培养基并能良好的生长。而混合培养中，同时加入菌液细菌可以生长，但是由于产生的糖原较少所以同时加入混合生长并没有单独的解淀粉芽孢杆菌多，而解淀粉芽孢杆菌作用2、3天后，培养基中有一定的葡萄糖累积，此时加入酵母菌便可以良好生长，细胞数更多，达到一种双菌株混合发酵玉米秸秆比单菌株发酵更好的结果。这说明单独的解淀粉芽孢杆菌可以作用玉米秸秆，之后加入酵母菌两者又可以协同生长，更有效的降解了玉米秸秆，也产生了大量的可作为动物饲料的细菌，提高了玉米秸秆的利用率。

(3)培养基中酶活的测定

用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定过滤液中的酶活。先配制1mg/mL的葡萄糖母液，分别取0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL于试管中，用蒸馏水补足至2mL。加入1.5mL DNS溶液并摇匀，沸水浴5min, 冷却后加蒸馏水定容至25mL，混匀，于540nm处测定吸光值，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，如图2所示。

取5g接菌玉米秸秆培养基，加入50mL无菌水，完全混匀后5000r/min离心30min，取上清液，再加入硫酸铵至不溶状态，沉淀过夜。第二天取液体，再次离心，取沉淀。沉淀加入磷酸盐缓冲溶液(KH₂PO₄：NaHPO₄＝1:1配置而成) 2mL，再加入0.5mL 1％浓度的羧甲基纤维素钠盐溶液混匀进行反应。取0.5mL 样品用蒸馏水补到2mL，加入1.5mL DNS溶液并摇匀，沸水浴5min，冷却后加蒸馏水定容至25mL，混匀，于540nm处测定吸光值，数据代入标准曲线里得到样品的酶活大小，如表2所示。

表2样品吸光值(OD值)以及计算所得酶活

如表2所示，因为所测结果有吸光度，所以证实了培养基中存在纤维素酶。 2号培养基中吸光值几乎为0，说明酵母菌单独培养并不能产生纤维素酶作用秸秆，而3号培养基同时加入混合发酵有些许吸光值，但是不高，2号解淀粉芽孢杆菌单独发酵与发酵作用2、3天后加入酵母菌吸光值在几组里都比较高，说明解淀粉芽孢杆菌能产生纤维素酶，而作用一段时间后再接入酵母菌也能产生不低于单独培养的酶量。

根据上述实验得到的结果可以得出结论：解淀粉芽孢杆菌可以产生纤维素酶，一开始加入玉米秸秆中解淀粉芽孢杆菌便产生纤维素酶作用纤维素产生葡萄糖，随后加入酵母菌，酵母菌利用纤维素酶作用产生的葡萄糖大量生长，又因为双菌混合生长有协同作用，所以又能刺激解淀粉芽孢杆菌生长，产生了更多的纤维素酶，还原了更多的糖，达到了一种良好的产酶-产糖-产菌的循环。因而双菌株顺序加入混合发酵是一种比单菌株降解效果更好的方法。

目前，对于如何使秸秆合理利用的研究主中在集中在以下3个方面：(1)按传统方法使用酶大规模降解秸秆纤维素，直接将秸秆还田，以增加土壤肥力；(2) 利用微生物发酵，发酵农作物秸秆生产蛋白饲料来饲养牲口；(3)利用相关的微生物将秸秆纤维素生产成人们所需要的能源比如酒精和甲烷。本发明先用酵母菌和解淀粉芽孢杆菌单独以及混合状态在有不同底物浓度下的培养基中进行培养，确定酵母菌和解淀粉芽孢杆菌混合生长有促进作用，再进行玉米秸秆的单菌株，混合菌株的同时、顺序固体发酵，发现经解淀粉芽孢杆菌处理过的玉米秸秆再经酵母菌处理可以有效的降解玉米秸秆并能产生大量蛋白质菌株。

Claims (5)

1.一种双菌株混合固态发酵玉米秸秆的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)配置普通的LB平板、LB液体培养基和含有葡萄糖底物的YPD平板、YPD液体培养基，对培养基进行灭菌处理；

步骤2)将解淀粉芽孢杆菌接种于所述LB平板上，将酵母菌接种于所述YPD平板上，放入培养箱倒置培养，得到菌落；

步骤3)将解淀粉芽孢杆菌的菌落接入到所述LB液体培养基中，将酵母菌落接入到所述YPD液体培养基中，放入摇床继续培养；

步骤4)配置玉米秸秆固体培养基，并对培养基进行灭菌处理；

步骤5)将解淀粉芽孢杆菌接入到所述玉米秸秆固体培养基中，作用1～3天；之后再按解淀粉芽孢杆菌：酵母菌的数目比＝1:1的比例向玉米秸秆固体培养基中加入酵母菌，继续发酵玉米秸秆；

步骤6)用蒸馏冷凝方法浓缩收集发酵完的玉米秸秆固体培养基中的乙醇，剩余固体残渣可作为生物菌肥。

2.根据权利要求1所述的一种双菌株混合固态发酵玉米秸秆的方法，其特征在于，步骤3)所述YPD液体培养基中葡萄糖底物的浓度为20g/L。

3.根据权利要求1所述的一种双菌株混合固态发酵玉米秸秆的方法，其特征在于，步骤4)所述玉米秸秆固体培养基的配置过程如下：将玉米秸秆晒干后用粉碎机粉碎至100目，以玉米秸秆：无菌水的质量比＝1:6的比例配置成粘稠状固体，再高温灭菌。

4.根据权利要求1所述的一种双菌株混合固态发酵玉米秸秆的方法，其特征在于，步骤5)所述解淀粉芽孢杆菌接入至玉米秸秆固体培养基中作用的时间为2天。

5.权利要求1所述一种双菌株混合固态发酵玉米秸秆的方法在降解玉米秸秆方面的应用。