CN101525612A

CN101525612A - 一种快速高效构建s酵母优良菌株的方法

Info

Publication number: CN101525612A
Application number: CN200910068602A
Authority: CN
Inventors: 曹小红; 侯丽华; 王春玲; 曾斌
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2009-04-24
Filing date: 2009-04-24
Publication date: 2009-09-09

Abstract

本发明涉及一种快速高效构建S酵母优良菌株的方法，是在确定EMS(甲基磺酸乙酯)对S酵母(即酱油企业所用的鲁氏酵母)双倍体细胞最佳作用时间的基础上，用EMS对非传统酵母菌株S酵母双倍体进行随机诱变，产生S酵母遗传多样性菌株文库，通过高效产孢、孢子纯化、充分融合、耐盐性筛选的多轮有性重组使文库中菌株间发生基因组重排，从而构建具有优良发酵性状的S酵母重组菌株。由此方法构建的重组菌株的耐盐性得到了明显的提高，发酵周期缩短了10天，产生的风味物质较野生型菌株明显改善，而且还产生了重要的风味物质4－EG；该优良菌株在高盐稀态发酵中能产生醇厚、酯香的酱油风味，具有较好的理化指标，为酱油的工业生产提供了优良的菌株。

Description

一种快速高效构建S酵母优良菌株的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域以及食品发酵领域，涉及菌株改造的遗传操作方法，尤其是一种快速高效构建S酵母优良菌株的方法。

背景技术

高浓度盐是决定酱油发酵过程后期盐水发酵过程中的酵母代谢活性的主要因素，因此筛选耐高盐的S酵母菌株是改善酱油风味、提高酱油质量的重要策略之一。同时，S酵母的大多数与风味相关的特性都是由多基因控制的，这些基因广泛分布在整个基因组中，人们对之了解很少，因此一般采用全基因组进行改造的方法即基因组重排策略对S酵母进行遗传修饰方法予以解决。目前，虽然基因组重排技术已经成功地应用到了原核生物及少部分真核生物中，但是真核生物的复杂性使基因组重排技术广泛应用受到了一定的限制。例如，S酵母比模式生物酿酒酵母的细胞壁还厚，而且S酵母的融合是由MAT等位基因控制等，这些因素导致在S酵母中直接应用由原生质体融合介导的基因组重排的效率比较低。因此，本专利提供了一种由酵母自身的有性重组介导的基因组重排方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用基因组重排策略快速高效构建S酵母优良菌株的方法。

本发明实现上述目的的技术方案是：

一种快速高效构建S酵母优良菌株的方法，其构建方法包括如下步骤：

(1)将S酵母菌株采用EMS进行诱变，以确定最佳的EMS诱变时间；

(2)配制含有各种盐浓度的选择平板；

(3)对培养后的S酵母菌株双倍体细胞进行EMS诱变，处理时长为在上步骤所确定的最佳作用时间，并将诱变后的细胞均匀涂布到含盐的选择平板上，经筛选得到S酵母菌株即为原始突变群体；

(4)将原始突变群体进行高效产孢、以及孢子纯化；

(5)将纯化后的孢子进行充分融合，融合后的孢子在含盐的选择平板上进行筛选，将筛选出的所有单菌落作为下一轮基因组重排的母本；

(6)重复步骤(4)、(5)，最后一轮筛选出的单菌落即为S酵母优良菌株。

而且，所述EMS为甲基磺酸乙酯，其体积百分浓度为2％。

而且，所述最佳的EMS诱变时间的确定是采用EMS对5×10⁷个细胞/ml双倍体S酵母菌株进行随机诱变，其最佳的诱变时间为60min。

而且，所述的基因组重排的轮数为三轮。

而且，所述的含盐选择平板随着基因组重排次数的增加盐的浓度逐步提高。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明是在确定甲基磺酸乙酯对S酵母(即酱油企业所用的鲁氏酵母)双倍体细胞最佳作用时间的基础上，用甲基磺酸乙酯对非传统酵母菌株S酵母双倍体进行随机诱变，产生S酵母遗传多样性菌株文库，通过高效产孢、孢子纯化和充分融合的多轮有性重组使文库中菌株间发生基因组重排，从而构建具有优良发酵性状的S酵母重组菌株。由此方法构建的重组菌株的耐盐性得到了明显的提高，发酵周期缩短了10天，产生的风味物质较野生型菌株明显改善，而且还产生了重要的风味物质4-EG；特别是4-羟基-2(或5)乙基-5(或2)-甲基-3(2氢)-呋喃酮(4-hydroxy-2(or 5)-ethyl-5(or 2)-methyl-3(2H)-furanone，HEMF)比对照提高了75％，此外还产生了4-乙基愈创木酚(4-ethylguaiacol，4-EG)，而野生型S酵母不能产生4-EG。

2、本发明利用基因组重排策略快速高效构建S酵母优良菌株，该优良菌株在高盐稀态发酵中能产生醇厚、酯香的酱油风味，具有较好的理化指标(比如氨基酸态氮、总氮、无盐固形物等)，为酱油的工业生产提供了优良的菌株。

附图说明

图1为本发明优良菌株构建方法原理图；

图2为本发明重组菌株与对照菌株对其它盐离子耐性的改善，其中A：YPD平板；B：YPD+0.1mol/l LiCl平板；C：YPD+3mol/lKCl平板；

图3为本发明重组菌株与对照菌株酱油发酵结束后的主要风味物质的气相色谱图，其中A：重组菌株；B：对照菌株；C：标准样品。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

需要首先说明的是：本发明所涉及的S酵母优良菌株，以S酵母野生型菌株(公知菌种，在天津科技大学菌种保藏中心有保藏，任何人通过正常途径都可以得到)为出发菌株，构建出具有醇厚、酯香的酱油风味、遗传稳定、发酵周期短等优良发酵性状的重组S酵母菌株。

一种快速高效构建S酵母优良菌株的方法，步骤是：

(1)S酵母野生型菌株用EMS诱变剂进行诱变处理：

a将S酵母野生型菌株接入YPD液体培养基(即酵母提取物蛋白胨培养基)中，于30℃下振荡培养过夜；

b测定细胞浓度使之处于对数生长期，收集大约1×10⁸个细胞于四个15ml塑料试管中，其中一个为对照；用pH值为7.0磷酸钠缓冲液(0.1mol/l)洗涤两次，最后用8ml的此缓冲液重悬；

c将上述细胞转移到五个玻璃试管中，分别加入2％的EMS诱变剂，本实施例中EMS诱变剂是甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS，Sigma)；然后放入30℃摇床中，分别培养0、20min、40min、60min和80min；

d向各玻璃试管中加入等量的5％无菌的硫代硫酸钠失活EMS的突变作用；

e收集突变后的细胞，用5％无菌硫代硫酸钠洗涤两次，再用无菌水洗涤一次；用无菌水将其稀释到一定的浓度并涂布在固体YPD平板上，将其放入30℃培养箱中培养；

f待平板上长出菌落后，计算EMS的细胞致死率，其中致死率介于50％～90％的作用时间为最佳作用时间；

g对双倍体细胞进行EMS诱变，处理时长为在上一步确定的最佳作用时间，得到诱变后的S酵母菌株。

(2)酵母高效产孢：

a将诱变后得到的S酵母菌株在固体培养基上活化培养；

b从活化的平板上挑取适量的菌体接种到YPD液体培养基中，在30℃下培养至对数生长期；

c 13000rpm离心30s收集上述菌体，弃掉上清，用无菌水洗三次去除残留培养基，将其接种到预产孢培养基中，于25℃下培养12h；

d 13000rpm离心30s收集上述菌体，弃掉上清，用无菌水洗三次去除残留培养基，将菌体重悬到高效液体生孢培养基中，于25℃下培养5d左右，得到单倍体孢子。

(3)孢子纯化及融合：

a室温下500rpm离心5min收集酵母双倍体孢子，用软化缓冲液重悬细胞使之浓度为5OD₆₀₀U/ml，于30℃下温育10min；

b室温下500rpm离心5min收集上述酵母细胞和孢子，用原生质体缓冲液重悬使之浓度为25OD₆₀₀U/ml，加蜗牛酶使之浓度为0.5mg/OD₆₀₀，并在30℃下反应30min，得到反应液；

c室温下500rpm离心5min收集上述反应液，用等量的0.5％ TritonX-100洗一次后，再用0.5％ Triton X-100重悬；再加入等量的0.5％ TritonX-100使孢子反应液为总体积的1/4，用超声波振荡这个反应体系使孢子分散并将其保存在4℃冰箱中。

d将孢子再次接种到孢子融合培养基中于30℃摇床中培养20h，此过程是使孢子能够发生充分融合。

(4)S酵母耐盐性菌株的构建：

a对诱变剂EMS的最佳作用时间进行确定：

针对不同的酵母菌株，一定剂量的EMS所需的最佳作用时间也不同，所以首先确定EMS的最佳作用时间。作用时间分别为0、20min、40min、60min和80min；在终止EMS作用后，取等量的上述四种菌液稀释一定倍数后，均匀涂布到YPD平板上，待长出单菌落后计算出不同剂量的致死率。这五种作用时间的致死率分别为0、39％、51％、76％和94％。在以往的研究中EMS致死率都是选择在50％～90％，在本发明中因为受试菌株是双倍体细胞，所以我们选择76％致死率的EMS作用时间(即2％的EMS作用60min)为最佳作用时间，一是为了保证能够得到足够的突变群体；二是为了尽量减少负突变。

b配制选择平板

YPD液体培养基分别加入22％、24％、26％和28％NaCl的固体培养基，将pH值调为5.6，加入1.5％琼脂于115℃下灭菌15min，即得到用于筛选最初突变菌体库、第一轮重排、第二轮重排和第三轮重排的选择平板。

c获得最初突变群体。

对S酵母野生型菌株进行EMS诱变处理，并将诱变后的细胞均匀涂布到含22％氯化钠的选择平板上，于30℃下培养3d后，将平板上长出的这些细胞作为最初突变群体(注：经实验证明S酵母野生型菌株在含22％氯化钠的选择平板上不能生长)。

d第一轮基因组重排(附图1)

将由最初突变群体筛选得到的原始突变群体都接种到YPD液体培养基中，于30℃摇床中培养至对数生长期；收集细胞，并用无菌水洗三次后将其接种到预产孢培养基中，于25℃摇床中培养12h；再收集细胞，并用无菌水洗三次后将其接种到高效产孢培养基中，为了保证能够高效产孢上述过程都是在摇瓶中进行；于25℃摇床中培养5d后，取样在显微镜下观察产孢效率；当产孢效率接近50％时，收集细胞进行孢子纯化，在此纯化过程中蜗牛酶可以消化营养细胞，但对孢子没有影响；然后将孢子再次接种到孢子融合培养基中于30℃摇床中培养20h，此过程是使孢子能够发生充分融合；收集细胞，并将其涂布在含有24％氯化钠的选择平板上；于30℃下培养3d后，将该平板上长出的单菌落作为第二轮重排的母本。

f第二轮基因组重排，将选择平板上筛选得到的优良性状的重组菌株作为第三轮重排的母本。

方法同第一轮重排，将重排后的细胞涂布在含26％氯化钠的选择平板上。于30℃下培养3d后，将该平板上长出的单菌落作为第三轮重排的母本。

g第三轮基因组重排，方法同第一轮重排，将重排后的细胞涂布在含28％氯化钠的选择平板上。

h对重组菌株和对照菌株的耐盐性进行测定，即分别在含0.1mol/l LiCl，3mol/lKCl的YPD平板上的dilution实验(附图2，其中A：YPD平板；B：YPD+0.1mol/l LiCl平板；C：YPD+3mol/lKCl平板)。

i将重组菌株和对照菌株即野生型菌株在高盐稀态酱酪中进行酱油发酵实验。发酵结束后测定酱油中的风味物质(附图3，其中A：重组菌株；B：对照菌株；C：标准样品)。

Claims

1、一种快速高效构建S酵母优良菌株的方法，其特征在于：构建方法包括如下步骤：

(1)将S酵母菌株采用EMS进行诱变，以确定最佳的EMS诱变时间；

(2)配制含有各种盐浓度的选择平板；

(3)对培养后的S酵母菌株双倍体细胞进行EMS诱变，处理时长为在上步骤所确定的最佳作用时间，并将诱变后的细胞均匀涂布到含盐的选择平板上，平板上得到的所有S酵母菌株即为原始突变群体；

(4)将原始突变群体进行高效产孢、以及孢子纯化；

2、根据权利要求1所述的一种快速高效构建S酵母优良菌株的方法，其特征在于：所述EMS为甲基磺酸乙酯，其体积百分浓度为2％。

3、根据权利要求1所述的一种构建S酵母优良菌株的方法，其特征在于：所述最佳的EMS诱变时间的确定是采用EMS对5×10⁷个细胞/ml双倍体S酵母菌株进行随机诱变，其最佳的诱变时间为60min。

4、根据权利要求1所述的一种构建S酵母优良菌株的方法，其特征在于：基因组重排的轮数为三轮。

5、根据权利要求1所述的一种构建S酵母优良菌株的方法，其特征在于：在含盐的选择平板上进行筛选，而且随着基因组重排次数的增加所采用的选择平板的含盐浓度逐步提高。