CN111040957A - 一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法 - Google Patents

一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111040957A
CN111040957A CN201910944041.9A CN201910944041A CN111040957A CN 111040957 A CN111040957 A CN 111040957A CN 201910944041 A CN201910944041 A CN 201910944041A CN 111040957 A CN111040957 A CN 111040957A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ethanol
strain
sugar
fermentation
tolerant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910944041.9A
Other languages
English (en)
Inventor
汤岳琴
缪晡
王莉
陈栋
李勇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan University
China Petroleum and Chemical Corp
Sinopec Shanghai Engineering Co Ltd
Original Assignee
Sichuan University
China Petroleum and Chemical Corp
Sinopec Shanghai Engineering Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan University, China Petroleum and Chemical Corp, Sinopec Shanghai Engineering Co Ltd filed Critical Sichuan University
Priority to CN201910944041.9A priority Critical patent/CN111040957A/zh
Publication of CN111040957A publication Critical patent/CN111040957A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C12N1/185—Saccharomyces isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C12N15/04—Fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株，所述发酵菌株为SEB12，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，其保藏编号为CGMCC No.18216，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明还提供了一种上述耐乙醇耐高糖的发酵菌株的构建方法。在乙醇葡萄糖共发酵、高糖或高温情况下，本发明的发酵菌株SEB12的乙醇发酵速率相对于出发菌株较高，说明所述菌株具有耐高糖、耐高乙醇的优势，对实现非粮生物质乙醇化工业化生产具有重要意义。

Description

一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法
技术领域
本发明涉及发酵菌株领域，具体涉及一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法。
背景技术
随着环境污染的加剧和全球化石能源的日渐枯竭，开发新的清洁能源势不容缓，生物乙醇作为一种新型的可再生能源，日益成为研究热点。以非粮生物质生产燃料乙醇替代化石燃料，可有效解决化石燃料带来的能源危机和环境污染，为了降低成本，则需提高终点乙醇浓度，采用超高浓度(VHG)乙醇发酵(培养基含糖量大于250g/L以期获得15％以上的乙醇)可以提高终点乙醇浓度从而提高生产设备使用率、节省精馏能耗和工业用水是一种节能减排的发酵技术。然而在VHG发酵过程中，酿酒酵母往往会受到各种因素胁迫，其中发酵初期高浓度底物的渗透作用以及终产物乙醇对菌株的毒性作用是制约酿酒酵母生产乙醇的重要瓶颈，尽管目前已有一些关于酿酒酵母对乙醇或高糖耐受能力的报道，但大多数研究以实验室酵母为出发菌株，且多针对单一物质，对多耐受性酿酒酵母的研究极少。而这些研究主要集中在酿酒酵母如何抵御乙醇毒性或高渗条件，但对于如何同时构建既耐受乙醇又耐受高糖的工业菌株尚不明确。由于在实际VHG发酵过程中，酿酒酵母会受到多种胁迫，因此，如何提高菌株在发酵初期的高糖耐受性和发酵末期的乙醇耐受性是实现非粮生物质能源转化的关键瓶颈。
选育同时具有耐受高糖和乙醇特性的工业菌株，对实现非粮生物质乙醇化工业化生产具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法，以耐高温工业菌株为出发菌株，拟通过常压室温等离子体(ARTP)技术获得耐乙醇、耐高糖突变菌株，并结合基因组重排等技术使突变菌株随机杂交，最终通过TTC显色反应、杜氏导管、摇瓶发酵等方法对突变酵母菌株进行筛选，获得一株高糖和乙醇耐受能力较强的突变菌SEB12。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株，所述发酵菌株为SEB12，所述发酵菌株分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，其保藏编号为CGMCCNo.18216，保藏日期为2019年07月12日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的第二方面提供了一种上述耐乙醇耐高糖的发酵菌株的构建方法，其包括以下步骤：
步骤1，选取出发菌株：SEB1和IR-2，将SEB1和IR-2产生的孢子通过原生质体融合获得絮凝性融合子RHZ-1；
步骤2，挑选一环RHZ-1菌株培养，再诱导其突变；
步骤3，TTC初筛和杜氏导管复筛，筛选出在乙醇和高糖条件下均产气较快的菌株进行三角瓶发酵，选择产乙醇量有所提升的菌株；
步骤4，经过三轮基因组重排和步骤3的筛选方法获得耐受性能优良的突变菌株。
进一步地，步骤2的诱变菌株突变的方法为等离子体照射。
进一步地，等离子照射时间为50-70s。
进一步地，等离子照射时间为60s。
进一步地，步骤2的菌株培养至对数生长期与稳定期之间的过渡期。
进一步地，步骤3的具体实验步骤包括：
a.将经过ARTP诱变后的菌液涂布于2％YPD平板上培养后，倾倒在TTC上层培养基进行染色，避光培养0.5～1h，选择红色较深的菌株保存(颜色越深，其代谢越旺盛)；
b.通过杜氏导管法，取无水乙醇对应加入到内含杜氏管的YPD培养基中，混匀，接入各突变酵母静置培养，观察产气情况；
c.配制含葡萄糖的内含杜氏管的YPD培养基，接入各突变酵母，静置培养，观察产气情况；
d.选择在乙醇和高糖条件下均产气较快的菌株进行发酵，选择产乙醇量有所提升的菌株进行下一步基因组重排。
进一步地，步骤4的具体实验步骤包括：
a.取活化后的突变菌株，接种于100mL的YPD液体培养基中，在30℃，180rpm条件下培养约11h至对数期，5000rpm离心30s去上清收集菌体，用无菌水洗涤三次后，接种于100mLYPK预产孢培养基中，28℃，180rpm条件下培养12h，5000rpm离心30s去上清收集菌体，无菌水洗涤三次后，将菌体重悬于100mL的高效液体生孢培养基中，28℃，180rpm条件下培养5d。
b.5000rpm离心30s去上清收集生孢后的细胞，用软化缓冲液重悬细胞使其最终浓度(OD600)为5，30℃条件下培养10min后，5000pm离心30s去上清收集菌体，用原生质体缓冲溶液重悬细胞使其最终浓度(OD600)为25。
c.加入浓度为3％的蜗牛酶使其最终浓度(OD600)为14.4，30℃条件下反应30min后，5000rpm离心30s去上清收集菌体，用等量的0.5％(v/v)的Triton X-100洗涤一次后，再用0.5％(v/v)的Triton X-100重悬使孢子反应液为总体积的1/4。
d.震荡该体系，使子囊壁充分破裂释放出孢子。
e.将孢子用无菌水洗涤三次后重新接入100mL YPD液体培养基中，30℃，100rpm条件下培养24h使孢子进行充分接合形成二倍体菌株，将所得菌液涂布于含乙醇的YPD平板上，待菌落长起后，通过步骤3的方法进行筛选，最后通过三角瓶发酵选择性能进一步提升的突变菌株进行第二轮基因组重排，重排后的菌株再进行筛选，以此往复，通过三轮基因组重排，获得耐受性能优良的突变菌株SEB12。
进一步地，步骤d中的震荡方法采用的是超声波，震荡至视野中无二倍体细胞时，终止超声破碎。
最后，本发明还提供了一种耐乙醇耐高糖的发酵菌株SEB12在非粮生物质乙醇化工业化生产的应用。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
本发明所提供的一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及其构建方法，提高了乙醇收率，对实现非粮生物质乙醇化工业化生产具有重要意义。
附图说明
本发明的公开的一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株为SEB12，其已进行保藏，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，其保藏编号为CGMCC No.18216，保藏日期为2019年07月12日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
图1是本发明一实施例中的出发菌株RHZ-1和突变菌株在乙醇葡萄糖共发酵的情况下乙醇含量和葡萄糖含量变化的对比图；
图2是本发明一实施例中的出发菌株RHZ-1和突变菌株在高糖条件下乙醇含量和葡萄糖含量变化的对比图；
图3是本发明一实施例中的出发菌株RHZ-1和突变菌株在高温条件下乙醇含量和葡萄糖含量变化的对比图。
具体实施方式
本发明涉及一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例为发酵菌株SEB12的构建方法，其包括如下步骤：
(1)出发菌株：出发菌株SEB1和IR-2，SEB1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.11321，IR-2分离自印度尼西亚发酵食品中，具有乙醇生产能力，有絮凝性，来源记载在下述文献中：Hiroshi K,Yoshio S,Toshio M,Harumi K,Yorikazu S.1985.Continuous ethanol fermentation with cell recycling usingflocculating yeast.J.Ferment.Technol.63:159-165；本实施例中的IR-2生物材料从日本产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology,AIST)获得。将SEB1和IR-2产生的孢子通过原生质体融合获得絮凝性融合子RHZ-1。
(2)ARTP诱变处理：挑选一环RHZ-1菌株至2％YPD液体培养基中，放入160rpm的30℃恒温摇床中进行预培养。预培养16h后取1mL菌液，8000×g离心2min，收集菌体，转接至2％YPD中，放入160rpm的30℃恒温摇床中培养。培养24h时，菌株RHZ-1处于对数生长期与稳定期之间的过渡期。此阶段的酵母菌，生长繁殖旺盛，是基因复制和重组的重要阶段，对外界环境的影响相对比较敏感，此时进行等离子体照射，可增加基因突变与稳定遗传的几率。
取菌液1mL，经4000rpm离心3min，去清液，加入1mL EDTA和5％甘油混合溶液打散菌体。取0.01mL菌悬液均匀涂抹至照射玻片上，照射时间为60s(酵母菌株的存活率约为10％)。照射三组平行样，将照射后的玻片放入1mL的生理盐水中混匀，保存。取0.1mL混合后的菌悬液于2％YPD固体培养基上，均匀涂布，于30℃培养箱中培养48h。
(3)TTC初筛和杜氏导管复筛：将步骤(2)经过ARTP诱变后的菌液涂布于2％YPD平板，于30℃培养48h，待菌落长起后，倾倒10mL TTC上层培养基，30℃下避光培养0.5～1h，选择红色较深的菌株保存(颜色越深，其代谢越旺盛)。然后通过杜氏导管法，取0.9mL的无水乙醇对应加入到9.1mL YPD培养基中(内含杜氏管)，混匀，使乙醇体积分数为9％，接入各突变酵母，30℃静置培养，观察产气情况。另配制葡萄糖浓度为30％(w/v)的YPD培养基(内含杜氏管)，接入各突变酵母，30℃静置培养，观察产气情况。最后，选择在乙醇和高糖条件下均产气较快的菌株进行三角瓶发酵，选择产乙醇量有所提升的菌株进行下一步基因组重排。
(4)基因组重排：取活化后的突变菌株，接种于100mL的YPD液体培养基中，在30℃，180rpm条件下培养约11h至对数期，5000rpm离心30s去上清收集菌体，用无菌水洗涤三次后，接种于100mL YPK预产孢培养基中，28℃，180rpm条件下培养12h，5000rpm离心30s去上清收集菌体，无菌水洗涤三次后，将菌体重悬于100mL的高效液体生孢培养基中，28℃，180rpm条件下培养5d。5000rpm离心30s去上清收集生孢后的细胞，用软化缓冲液重悬细胞使其最终浓度为(OD600)为5，30℃条件下培养10min后，5000pm离心30s去上清收集菌体，用原生质体缓冲溶液重悬细胞使其最终浓度(OD600)为25，加入浓度为3％的蜗牛酶使其最终浓度(OD600)为14.4，30℃条件下反应30min后，5000rpm离心30s去上清收集菌体，用等量的0.5％(v/v)的Triton X-100洗涤一次后，再用0.5％(v/v)的Triton X-100重悬使孢子反应液为总体积的1/4，用超声波震荡该体系，使子囊壁充分破裂释放出孢子，期间不断观察破壁效率，待视野中无二倍体细胞时，终止超声破碎，用无菌水洗涤三次后，重悬于0.5％(v/v)的Triton X-100中并将其4℃进行保存。将保存在Triton X-100中的孢子用无菌水洗涤三次后重新接入100mL YPD液体培养基中，30℃，100rpm条件下培养24h使孢子进行充分接合形成二倍体菌株，将所得菌液涂布于含乙醇的YPD平板上，待菌落长起后，通过步骤(3)描述的方法进行TTC平板染色初筛和杜氏导管复筛，最后通过三角瓶发酵选择性能进一步提升的突变菌株进行第二轮基因组重排，重排后的菌株再进行筛选，以此往复，通过三轮基因组重排，最终获得耐受性能优良的突变菌株SEB12。
实施例2
本实施例为验证发酵菌株SEB12的性质，具体步骤如下：
(1)乙醇葡萄糖共发酵
以工业酿酒酵母菌株RHZ-1为出发菌株，对其进行ARTP诱变，通过TTC显色反应、杜氏导管、三角瓶发酵等对突变菌株进行筛选，获得乙醇耐受性菌株，并对乙醇耐受性菌株进行三轮基因组重排，获得最佳耐受菌株SEB12。在9％(v/v)初始乙醇和151g/L葡萄糖条件下(初始OD660为1.5)共发酵96h后，其产生乙醇13.41g/L，残糖含量为117.6g/L，较出发菌株RHZ-1分别提高了119.2％(6.118g/L)，降低了14.35％(137.3g/L)。该结果表明，在乙醇葡萄糖共发酵条件下SEB12产乙醇量显著高于出发菌株RHZ-1，具有较强的乙醇耐受性(表1和图1)。
表1 9％(v/v)乙醇和151g/L葡萄糖混合条件下菌株发酵96h结果对比
Figure BDA0002223688940000061
(2)VHG乙醇发酵结果
为了进一步探究菌株SEB12的高糖耐受性，对其进行了高糖条件下的发酵研究。菌株SEB12在264.9g/L葡萄糖条件下(初始OD660为1.5)发酵前48h，产乙醇量与出发菌株RHZ-1无明显差异，72h后，其进一步将残糖耗尽，终点乙醇浓度高达135.1g/L，较出发菌株提高7.25％(125.3g/L)，而此时，RHZ-1还剩余16.46g/L葡萄糖，乙醇量不再累积(图2)。基于消耗糖的乙醇收率，两株菌收率均达到98％以上，说明其代谢乙醇的能力较强。基于总糖的乙醇收率，SEB12为99.99％，而RHZ-1仅为92.8％(表2)。以上结果说明SEB12具有较强的高糖耐受性，并且在VHG发酵后期乙醇积累量显著高于出发菌株。
表2 264.9g/L葡萄糖条件下菌株发酵96h结果对比
Figure BDA0002223688940000071
(3)42℃高温发酵结果
接下来对菌株SEB12的高温耐受性进行探究，在42℃、葡萄糖浓度为100g/L和125g/L时(初始OD660为1.5)，发酵24h，菌株RHZ-1和SEB12均能将葡萄糖耗尽，且乙醇收率高于94％。当葡萄糖浓度提高至150g/L时，发酵72h后，其产乙醇64.05g/L，基于总糖的乙醇收率高达83.38％，而RHZ-1为79.64％(表3和图3)。结果表明，菌株SEB12不仅具有较强的耐乙醇性，其耐温性也较好,相比RHZ-1有一定程度的提高。
表3 42℃条件下菌株发酵72h结果对比
Figure BDA0002223688940000072
根据以上结果可知，突变菌株SEB12，与出发菌株RHZ-1相比，具有耐高糖、耐乙醇性、耐温性的优势。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株，其特征在于，所述发酵菌株为SEB12，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，其保藏编号为CGMCC No.18216，保藏日期为2019年07月12日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种构建如权利要求1所述的耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1，选取出发菌株：SEB1和IR-2，将SEB1和IR-2产生的孢子通过原生质体融合获得絮凝性融合子RHZ-1；
步骤2，挑选一环RHZ-1菌株培养，再诱导其突变；
步骤3，TTC初筛和杜氏导管复筛，筛选出在乙醇和高糖条件下均产气较快的菌株进行发酵，选择产乙醇量有所提升的菌株；
步骤4，经过三轮基因组重排和步骤3的筛选方法，获得耐受性能优良的突变菌株。
3.根据权利要求2所述的构建耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，步骤2的诱变菌株突变的方法为等离子体照射。
4.根据权利要求3所述的构建耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，所述的等离子照射时间为50-70s。
5.根据权利要求2所述的构建耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，步骤2的菌株培养至对数生长期与稳定期之间的过渡期。
6.根据权利要求2所述的构建耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，步骤3的具体实验步骤包括：
a.将经过ARTP诱变后的菌液涂布于2％YPD平板上培养后，倾倒在TTC上层培养基进行染色，避光培养0.5～1h，选择红色较深的菌株保存；
b.通过杜氏导管法，取无水乙醇对应加入到内含杜氏管的YPD培养基中，混匀，接入各突变酵母静置培养，观察产气情况；
c.配制含葡萄糖的内含杜氏管的YPD培养基，接入各突变酵母，静置培养，观察产气情况；
d.选择在乙醇和高糖条件下均产气较快的菌株进行发酵，选择产乙醇量有所提升的菌株进行下一步基因组重排。
7.根据权利要求2所述的构建耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，步骤4的具体实验步骤包括：
a.取活化后的突变菌株，接种于YPD液体培养基中，培养至对数期，离心去上清收集菌体，用无菌水洗涤后，接种于YPK预产孢培养基中，培养11-13h，离心，去上清收集菌体，无菌水洗涤后，将菌体重悬于高效液体生孢培养基中进行培养；
b.离心，去上清收集生孢后的细胞，用软化缓冲液重悬细胞使其最终浓度OD600为5，30℃条件下培养后，离心，去上清收集菌体，用原生质体缓冲溶液重悬细胞使其最终浓度OD600为25；
c.加入浓度为3％的蜗牛酶使其最终浓度OD600为14.4，30℃条件下反应后，离心，去上清收集菌体，用等量的Triton X-100洗涤一次后，再用Triton X-100重悬使孢子反应液为总体积的1/4；
d.震荡该体系，使子囊壁充分破裂释放出孢子；
e.将孢子用无菌水洗涤三次后重新接入YPD液体培养基中培养至孢子进行充分接合形成二倍体菌株，将所得菌液涂布于含乙醇的YPD平板上，待菌落长起后，通过步骤3的方法进行筛选，最后通过三角瓶发酵选择性能进一步提升的突变菌株进行第二轮基因组重排，重排后的菌株再进行筛选，以此往复，通过三轮基因组重排，获得耐受性能优良的突变菌株SEB12。
8.根据权利要求7中所述的构建耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，步骤d中的震荡方法采用的是超声波，震荡至视野中无二倍体细胞时，终止超声破碎。
9.一种如权利要求1所述的发酵菌株SEB12在非粮生物质乙醇化工业化生产的应用。
CN201910944041.9A 2019-09-30 2019-09-30 一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法 Pending CN111040957A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910944041.9A CN111040957A (zh) 2019-09-30 2019-09-30 一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910944041.9A CN111040957A (zh) 2019-09-30 2019-09-30 一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111040957A true CN111040957A (zh) 2020-04-21

Family

ID=70232231

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910944041.9A Pending CN111040957A (zh) 2019-09-30 2019-09-30 一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111040957A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112195112A (zh) * 2020-08-04 2021-01-08 中国石油化工股份有限公司 一株耐乙醇、耐高温、耐高渗的多重耐受性发酵菌株及构建方法
CN114921353A (zh) * 2022-05-23 2022-08-19 中国科学院天津工业生物技术研究所 高存活率酿酒酵母及其应用
CN115948263A (zh) * 2022-12-13 2023-04-11 大连理工大学 一株高温高糖高渗耐受酵母及其选育方法与高浓度乙醇发酵应用

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101215562A (zh) * 2007-12-28 2008-07-09 天津大学 一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法
CN101633896A (zh) * 2009-08-27 2010-01-27 中国科学院微生物研究所 一种耐高浓度乙酸的酿酒酵母菌株及其应用
CN102154138A (zh) * 2011-01-24 2011-08-17 天津科技大学 一种多耐性高产酒精酵母突变株tt31及其筛选方法
CN102329743A (zh) * 2011-09-29 2012-01-25 浙江大学 低甘油合成、高酒精耐性的工业酿酒酵母菌株及其应用
CN103820346A (zh) * 2014-03-12 2014-05-28 南京工业大学 一株酿酒酵母及其在发酵产乙醇中的应用
CN104031854A (zh) * 2014-06-20 2014-09-10 广西科学院 一株提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株及其构建方法
CN105368730A (zh) * 2015-11-10 2016-03-02 四川大学 一株快速发酵木糖产乙醇的酿酒酵母菌株及构建方法
CN107603898A (zh) * 2017-10-26 2018-01-19 中国科学院天津工业生物技术研究所 酿酒酵母及其育种方式及工业化发酵生产乙醇的应用
CN108148829A (zh) * 2018-03-09 2018-06-12 青岛啤酒股份有限公司 利用基因组重组技术制备新型酿酒酵母的方法及所得新型酿酒酵母
CN108368475A (zh) * 2015-11-25 2018-08-03 拉金德拉·苏拉纳 通过经改良酵母菌株酿酒酵母在高温下生产高量乙醇的方法
CN108624517A (zh) * 2018-03-26 2018-10-09 四川剑南春（集团）有限责任公司 耐糖耐乙醇酿酒酵母及其用途
CN109370929A (zh) * 2018-12-05 2019-02-22 北京工商大学 一种酿酒酵母菌在酿酒中的应用
CN112195112A (zh) * 2020-08-04 2021-01-08 中国石油化工股份有限公司 一株耐乙醇、耐高温、耐高渗的多重耐受性发酵菌株及构建方法

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101215562A (zh) * 2007-12-28 2008-07-09 天津大学 一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法
CN101633896A (zh) * 2009-08-27 2010-01-27 中国科学院微生物研究所 一种耐高浓度乙酸的酿酒酵母菌株及其应用
CN102154138A (zh) * 2011-01-24 2011-08-17 天津科技大学 一种多耐性高产酒精酵母突变株tt31及其筛选方法
CN102329743A (zh) * 2011-09-29 2012-01-25 浙江大学 低甘油合成、高酒精耐性的工业酿酒酵母菌株及其应用
CN103820346A (zh) * 2014-03-12 2014-05-28 南京工业大学 一株酿酒酵母及其在发酵产乙醇中的应用
CN104031854A (zh) * 2014-06-20 2014-09-10 广西科学院 一株提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株及其构建方法
CN105368730A (zh) * 2015-11-10 2016-03-02 四川大学 一株快速发酵木糖产乙醇的酿酒酵母菌株及构建方法
CN108368475A (zh) * 2015-11-25 2018-08-03 拉金德拉·苏拉纳 通过经改良酵母菌株酿酒酵母在高温下生产高量乙醇的方法
CN107603898A (zh) * 2017-10-26 2018-01-19 中国科学院天津工业生物技术研究所 酿酒酵母及其育种方式及工业化发酵生产乙醇的应用
CN108148829A (zh) * 2018-03-09 2018-06-12 青岛啤酒股份有限公司 利用基因组重组技术制备新型酿酒酵母的方法及所得新型酿酒酵母
CN108624517A (zh) * 2018-03-26 2018-10-09 四川剑南春（集团）有限责任公司 耐糖耐乙醇酿酒酵母及其用途
CN109370929A (zh) * 2018-12-05 2019-02-22 北京工商大学 一种酿酒酵母菌在酿酒中的应用
CN112195112A (zh) * 2020-08-04 2021-01-08 中国石油化工股份有限公司 一株耐乙醇、耐高温、耐高渗的多重耐受性发酵菌株及构建方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘秀颖等: "基于基因组DNA诱变的遗传重组改造乙醇工业酵母的耐热性及发酵性能", 《生物工程学报》 *
张晓阳等: "代谢工程与全基因组重组构建酿酒酵母抗逆高产乙醇菌株", 《中国生物工程杂志》 *
张良等: "耐高温酵母高浓度发酵生产燃料乙醇工艺优化", 《应用与环境生物学报》 *
杨士春等: "响应曲面法优化酵母菌发酵产乙醇的工艺", 《安徽农业科学》 *
董晓宇等: "高产乙醇酿酒酵母的筛选鉴定及发酵条件优化", 《大连大学学报》 *
费文斌等: "1株耐热产乙醇酵母的分离、鉴定与性能测试", 《江苏农业科学》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112195112A (zh) * 2020-08-04 2021-01-08 中国石油化工股份有限公司 一株耐乙醇、耐高温、耐高渗的多重耐受性发酵菌株及构建方法
CN114921353A (zh) * 2022-05-23 2022-08-19 中国科学院天津工业生物技术研究所 高存活率酿酒酵母及其应用
CN114921353B (zh) * 2022-05-23 2023-08-29 中国科学院天津工业生物技术研究所 高存活率酿酒酵母及其应用
CN115948263A (zh) * 2022-12-13 2023-04-11 大连理工大学 一株高温高糖高渗耐受酵母及其选育方法与高浓度乙醇发酵应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112195112B (zh) 一株耐乙醇、耐高温、耐高渗的多重耐受性发酵菌株及构建方法
CN102154138B (zh) 一种多耐性高产酒精酵母突变株tt31及其筛选方法
Pasha et al. Strain improvement of thermotolerant Saccharomyces cerevisiae VS3 strain for better utilization of lignocellulosic substrates
CN109706089B (zh) 一种耐受抑制物的木糖发酵菌株及其构建方法和应用
CN111040957A (zh) 一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法
CN101967452B (zh) 一种发酵性丝孢酵母菌株及其生产微生物油脂的应用
CN102174433B (zh) 一株高抗逆性贝氏梭菌及其应用
CN103820346B (zh) 一株酿酒酵母及其在发酵产乙醇中的应用
CN105462874A (zh) 一种丁酸梭菌及其在厌氧发酵产氢中的应用
CN103555778A (zh) 一种产氢细菌与含油微藻梯级耦合产能的方法
CN102634464A (zh) 耐高温酿酒酵母及其分离培养方法
CN105969702B (zh) 粘质沙雷氏菌rz 21-c6及其应用
CN103421850A (zh) 一种利用丰富栅藻生产生物乙醇的方法
CN102146345B (zh) 一种乙酸耐性乙醇生产酿酒酵母菌株及菌株筛选方法
CN105624051A (zh) 基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株及构建方法
CN103911334B (zh) 一种高抗逆性拜氏梭菌及其应用
CN107893043A (zh) 一种耐受高浓度乙酸的运动发酵单胞菌突变株及其应用
CN104830739B (zh) 一种海洋嗜琼胶菌及其制法和应用
CN102154137B (zh) 一株温度耐受性酿酒酵母及其应用
CN114990102A (zh) 一种产纤维素酶木霉菌株的复合诱变育种方法
Saeid et al. Isolation and Identification of the Hanseniaspora opuntiae MK 460485 as an efficient strain for ethanol production
CN103667147B (zh) 一株高阿魏酸抗逆性拜氏梭菌及其应用
Priya et al. Screening and characterization of bioethanol producing yeasts from various sources
CN109251868B (zh) 一株酿酒酵母及应用
CN108220187B (zh) 一种耐受低pH值的运动发酵单胞菌突变株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200421