CN102703339A - 高产精氨酸脱亚胺酶菌株及用它生产l-瓜氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高产精氨酸脱亚胺酶菌株及用它生产L-瓜氨酸的方法。本发明高产精氨酸脱亚胺酶菌株为粪链球菌(streptococcus faecalis)BM-2 CGMCC No.4990。该菌株经30L发酵罐小试发酵，产L-瓜氨酸量达到98g/L，较出发菌株产L-瓜氨酸量提高了50％，且连续发酵5批后，发现该菌产L-瓜氨酸稳定，产L-瓜氨酸水平明显高于已经报道的菌株，具有重要的工业生产应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及高产精氨酸脱亚胺酶菌株及用它生产L-瓜氨酸的方法，属于生物技术领域。
背景技术
精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase，ADI)，是一种能够分解L-精氨酸的蛋白质。学者们首先从支原体Mycoplasma arginini提取物中纯化得到ADI，研究发现该酶可以抑制动物血管内皮细胞增生，相关研究进一步证实，精氨酸脱亚胺酶不仅能抑制多种恶性肿瘤细胞的体外增殖，还能够抑制体内的恶性肿瘤的增生。精氨酸脱亚胺酶作为一种新型抗肿瘤物质，已经受到越来越多研究者的重视。
据报道，精氨酸脱亚胺酶能催化L-精氨酸转化为L-瓜氨酸，该酶促反应仅一步，可有效避免L-瓜氨酸全合成途径中复杂的反馈调节作用，使L-瓜氨酸可以积累到较高的浓度。L-瓜氨酸具有很多重要的生理功能，如清除自由基，血管舒张作用，稳定血压以及诊断类风湿关节炎等，与L-鸟氨酸、L-精氨酸等合用于治疗高氨血症，应用前景十分广阔。由此可见，精氨酸脱亚胺酶作用广泛，具有非常重要的开发价值。
此前所报道的精氨酸脱亚胺酶大多来自于支原体，而支原体是病原微生物，容易引起病害，有较大的危险性，且支原体为寄生性微生物，培养难度较大，不利于精氨酸脱亚胺酶的发酵生产。本文中所研究的精氨酸脱亚胺酶生产菌株是粪链球菌，该菌株安全性好，易于发酵制备，有利于精氨酸脱亚胺酶的大规模生产和临床应用。但是目前的研究结果仍未达到令人满意的水平，主要是由于菌种活力较低，难以工业化应用。诱变选育是利用物理或化学因素处理微生物细胞群体，促使其中少数细胞中的遗传物质(主要是DNA)结构发生变化，从而引发微生物遗传性状发生变化，然后设法从群体中筛选出少量优良突变菌株的过程。诱变筛选高产菌株一直是国内外科研工作者在这方面研究的热点方法。
紫外诱变相对于其他几种射线(X射线、β射线、γ射线等)来说最易取材，对人体的伤害也最小，是最简单方便而且又十分有效的一种物理诱变方法。化学诱变是使用化学诱变剂与生物体的遗传物质发生作用，并改变其结构，使其后代发生变异的一种诱变方法。化学诱变剂诱发突变率高，而且染色体畸变较少，对处理材料损伤轻，有的化学诱变剂只限于DNA的某些特定部位。
发明内容
本发明的目的在于解决现有精氨酸脱亚胺酶生产菌种的缺陷，解决比酶活低的问题。本发明提供一种利用紫外线、硫酸二乙酯复合诱变的方法对精氨酸脱亚胺酶生产菌株进行诱变育种，筛选得到了一株高产精氨酸脱亚胺酶的突变株，并且对该突变株进行发酵，利用精氨酸脱亚胺酶能催化L-精氨酸转化成为L-瓜氨酸的性质，通过检测新生成L-瓜氨酸的量，来计算精氨酸脱亚胺酶的活力，发现突变株的酶活力有了很大的提高。
本发明以粪链球菌(streptococcus faecalis)ATCC 10180为出发菌株，利用紫外线、硫酸二乙酯复合诱变的方法进行诱变育种，筛选得到了一株高产精氨酸脱亚胺酶的突变株，即粪链球菌(streptococcus faecalis)BM-2。该菌株已于2011年06月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.4990。
本发明粪链球菌(streptococcus faecalis)BM-2 CGMCC No.4990具有以下微生物学特性：菌体直径在0.5-2μm之间，固体培养物主要以双球菌为主，也有少量呈3-5个排列的短链，液体培养物以长链为主；菌落均为圆形、乳白色，表面微凸湿润，边缘整齐，半透明，直径1-2mm。
本发明的粪链球菌(streptococcus faecalis)BM-2CGMCC No.4990的培养及发酵：
(1)固体培养基和种子培养基(后者不含琼脂)由下列重量份的组分组成：
酪蛋白胨5-50份、牛肉膏5-50份、酵母提取物1-30份、葡萄糖1-30份、乙酸钠1-30份、柠檬酸二铵1-30份、吐温801-30份、磷酸氢二钾1-30份、七水硫酸镁0.1-1份、一水硫酸锰0.01-0.1份、琼脂10-50份和水1000份；
培养条件：pH 6.0-8.0，培养温度为25-40℃，培养时间20-60h。
(2)发酵培养基组成(重量份)：葡萄糖5-50份、玉米浆2-50份、蛋白胨5-50份、牛肉膏2-50份、精氨酸2-50份、磷酸二氢钾1-20份、七水硫酸镁0.1-1份、氯化钠1-20份、一水硫酸锰0.01-0.05份和水1000份。
以粪链球菌(streptococcus faecalis)BM-2CGMCC No.4990生产L-瓜氨酸的方法，其特征是，
(1)取一支保存有粪链球菌(streptococcus faecalis)BM-2CGMCC No.4990的甘油管，室温放置至融化，吸取0.5-1ml菌液接种至一级种子摇瓶中，25-40℃培养20-60h；
(2)按照1％的接种量接种至二级种子摇瓶中，25-40℃培养20-60h；
(3)然后按照1-5％的接种量接种至发酵罐中，培养20-60h，培养条件：温度25-40℃，转速150-300r/min，pH 6.0-7.0；发酵过程中流加补料液(葡萄糖和氨水)，使发酵液中葡萄糖的含量不低于0.5g/L，pH维持在6.0-7.0之间。
本发明的有益效果是：
第一，本发明涉及的精氨酸脱亚胺酶突变菌株经30L发酵罐小试发酵，产L-瓜氨酸量达到98g/L，较出发菌株产L-瓜氨酸量提高了50％，且连续发酵5批后，发现该菌产L-瓜氨酸稳定，产L-瓜氨酸水平明显高于已经报道的菌株，具有重要的工业生产应用价值。
第二，本发明提供的一株精氨酸脱亚胺酶高产突变株产酸量高，性状稳定，具有重要的经济效益和社会效益，也为构建基因工程菌奠定了基础。
具体实施方式
实施例1高产精氨酸脱亚胺酶菌株BM-2的选育
(1)出发菌株ATCC 10180菌悬液的制备：
用无菌接种针挑取1环斜面保存的粪链球菌(streptococcus faecalis)ATCC10180菌株，在固体培养基上进行划线培养。活化后挑取一环新鲜菌体用无菌盐水进行稀释，菌液浓度稀释至107个/ml，得到菌悬液。
固体培养基和种子培养基(后者不含琼脂)由下列重量组分组成：酪蛋白胨10份、牛肉膏20份、酵母提取物20份、葡萄糖20份、乙酸钠10份、柠檬酸二铵5份、吐温802份、磷酸氢二钾2份、七水硫酸镁0.1份、一水硫酸锰0.05份、琼脂20份和水1000份：
制备平板菌种的工艺条件pH 7.0，培养温度为37℃，培养时间24h。
(2)出发菌株紫外线诱变：
吸取0.1ml稀释好的菌悬液涂布在固体平板培养基上，紫外灯(功率20W，照射距离35cm)照射一定时间(2min)后，30℃下避光培养24h，观察结果。选择致死率在70-80％的平板上的边缘平滑、大小均匀的菌落，进行发酵摇瓶初筛试验。
(3)紫外线突变菌株的发酵摇瓶初筛：
诱变后，从平板上挑选200株生长良好的菌株接种至斜面培养基上培养。挑取一环斜面培养基上的菌株，接入100ml种子培养基中，37℃，200r/min培养24h。培养完毕，将种子液按照1％的比例接种至200ml发酵培养基中，37℃，200r/min培养24h。将发酵液离心，弃沉淀，测定上清液中的L-瓜氨酸含量。从200株突变株中筛选到20株L-瓜氨酸产量提高的菌株，对20株菌进行传代试验，传至第10代时，进行30L罐试验。
发酵培养基由下列重量份组分组成：葡萄糖40份、玉米浆20份、蛋白胨5份、牛肉10份、精氨酸10份、磷酸二氢钾5份、七水硫酸镁0.5份、氯化钠2份、一水硫酸锰0.02份和水1000份。
(4)紫外线突变菌株的30L罐发酵复筛：
将紫外初筛后获得的20株突变株在平板上活化，取平板上的单菌落接至200ml种子培养基中，37℃，200r/min培养24h。向30L发酵罐中，按5％的接种量接入发酵培养基中，培养24h，培养条件：37℃，200r/min，pH7.0，发酵到第5周期开始流加补料液，使发酵液中葡萄糖的含量不低于0.5g/L，pH值维持在6.5-7.0之间(截止到发酵结束，一般需要补加葡萄糖500g，补加20％氨水500ml)。发酵结束后，测定发酵液中L-瓜氨酸产量。以L-瓜氨酸产量提高的菌株为出发菌株再次进行紫外诱变，初筛、复筛。经过三轮诱变筛选，最终得到一株L-瓜氨酸产量最高的突变株ATCC 10180-A，其L-瓜氨酸产量达到70g/L。
(5)紫外诱变突变株菌悬液的制备，硫酸二乙酯诱变：
用无菌接种针挑取1环斜面保存的紫外诱变突变株ATCC 10180-A，在固体培养基上进行划线培养。活化后挑取一环新鲜菌体用无菌盐水进行稀释，菌液浓度稀释至107个/ml，得到菌悬液。
取2mL菌悬液，加至15mL pH6.5的磷酸缓冲液，向其中加入0.5mL硫酸二乙酯，35℃处理40min。取0.1mL处理液涂布于固体平板上，37℃培养24h后，从中选出生长良好的菌落300株，接入斜面，4℃冰箱保存。
(6)紫外诱变突变株的发酵摇瓶初筛：
挑取一环斜面保存的菌株接入100mL种子培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。按1％接种量将种子培养基接入至200mL发酵培养基中，37℃、200r/min培养24h。将发酵液离心，弃沉淀，测定上清液中L-瓜氨酸的含量。从300株突变株中筛选到10株L-瓜氨酸产量提高的菌株，对这10株菌进行传代试验，传至第10代时，进行30L罐试验。
(7)紫外诱变突变株的30L发酵罐发酵复筛：
将10株突变株在新鲜固体平板上活化，挑取平板上的单菌落接于200mL种子培养基中，37℃培养24h。向30L发酵罐中，按5％接种量接入发酵培养基中，培养24h，培养条件：温度37℃，转速200r/min，pH7.0。发酵到第8周期开始流加补料液(截止到发酵结束，一般需要补加葡萄糖800g，补加20％氨水800ml)。发酵结束后，测定发酵液中L-瓜氨酸产量。经筛选，得到一株L-瓜氨酸产量最高的突变株BM-2，其L-瓜氨酸产量达到98g/L。
(8)将该突变株，进行甘油管保存：
先将该菌株涂于茄子瓶中，30℃培养30h后，用30％的甘油将其保存于深冷管中，置于-70℃冰箱内。
(9)突变菌株微生物学特性：菌体直径在0.5-2μm之间，固体培养物主要以双球菌为主，也有少量呈3-5个排列的短链，液体培养物以长链为主；菌落均为圆形、乳白色，表面微凸湿润，边缘整齐，半透明，直径1-2mm。
实施例2L-瓜氨酸生产方法
种子培养基组成(重量份)：酪蛋白胨7.5份、牛肉膏10份、酵母提取物5份、葡萄糖10份、乙酸钠5份、柠檬酸二铵2份、吐温801份、磷酸氢二钾4份、七水硫酸镁0.3份、一水硫酸锰0.03份和水1000份；
发酵培养基组成(重量份)：葡萄糖5份、玉米浆2份、蛋白胨10份、牛肉膏30份、精氨酸20份、磷酸二氢钾5份、七水硫酸镁0.5份、氯化钠3份、一水硫酸锰0.03份和水1000份。
(1)取一支甘油管，室温放置至融化，吸取lml菌液接种至一级种子摇瓶中，30℃培养30h后；
(2)按照1％的接种量接种至二级种子摇瓶中，30℃培养30h；
(3)然后按照5％的接种量接种至30L发酵罐中，培养35h，培养条件：温度30℃，转速150r/min，pH 6.5-7.0。发酵到第10周期开始流加补料液(葡萄糖和氨水)，使发酵液中葡萄糖的含量不低于0.5g/L，pH维持在6.5-7.0之间，截止到发酵结束，共补加葡萄糖800g，补加20％氨水800ml。发酵结束后，测定发酵液中L-瓜氨酸含量可达到98.5g/L。
实施例3
种子培养基组成(重量份)：酪蛋白胨20份、牛肉膏5份、酵母提取物10份、葡萄糖20份、乙酸钠10份、柠檬酸二铵10份、吐温8010份、磷酸氢二钾10份、七水硫酸镁0.5份、一水硫酸锰0.05份和水1000份；
发酵培养基组成(重量份)：葡萄糖20份、玉米浆10份、蛋白胨20份、牛肉膏20份、精氨酸30份、磷酸二氢钾10份、七水硫酸镁0.8份、氯化钠10份、一水硫酸锰0.02份和水1000份。
(1)取一支甘油管，室温放置至融化，吸取0.5ml菌液接种至一级种子摇瓶中，37℃培养24h后；
(2)按照1％的接种量接种至二级种子摇瓶中，37℃培养24h；
(3)然后按照3％的接种量接种至30L发酵罐中，培养30h，培养条件：温度37℃，转速170r/min，pH 6.5-7.0。发酵到第8周期开始流加补料液(葡萄糖和氨水)，使发酵液中葡萄糖的含量不低于0.5g/L，pH维持在6.5-7.0之间，截止到发酵结束，共补加葡萄糖700g，补加20％氨水650ml。对发酵液中L-瓜氨酸进行测定，含量达到99.5g/L。
Claims (3)
1.粪链球菌(streptococcus faecalis)BM-2CGMCC No.4990。
2.以权利要求1所述的粪链球菌(streptococcus faecalis)BM-2CGMCC No.4990生产L-瓜氨酸的方法，其特征是，
(1)取一支保存有粪链球菌(streptococcus faecalis)BM-2CGMCC No.4990的甘油管，室温放置至融化，吸取0.5-1ml菌液接种至一级种子摇瓶中，25-40℃培养20-60h；
(2)按照1％的接种量接种至二级种子摇瓶中，25-40℃培养20-60h；
(3)然后按照1-5％的接种量接种至发酵罐中，培养20-60h，培养条件：温度25-40℃，转速150-300r/min，pH 6.0-7.0；发酵过程中流加补葡萄糖和氨水，使发酵液中葡萄糖的含量不低于0.5g/L，pH维持在6.0-7.0之间。
3.如权利要求2所述的生产L-瓜氨酸的方法，其特征是，所述步骤(1)和(2)的摇瓶种子培养基由下述重量份的组分组成：酪蛋白胨5-50份、牛肉膏5-50份、酵母提取物1-30份、葡萄糖1-30份、乙酸钠1-30份、柠檬酸二铵1-30份、吐温801-30份、磷酸氢二钾1-30份、七水硫酸镁0.1-1份、一水硫酸锰0.01-0.1份和水1000份；所述步骤(3)的发酵培养基由下述重量份的组分组成：葡萄糖5-50份、玉米浆2-50份、蛋白胨5-50份、牛肉膏2-50份、精氨酸2-50份、磷酸二氢钾1-20份、七水硫酸镁0.1-1份、氯化钠1-20份、一水硫酸锰0.01-0.05份和水1000份。
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Denomination of invention: High-yield arginine deiminase bacterial strain and method for producing L-citrulline by same Effective date of registration: 20180428 Granted publication date: 20130814 Pledgee: Zouping Pudong Development Bank and Limited by Share Ltd Pledgor: Shandong NB Biological Engineering Co.,Ltd. Registration number: 2018370000082 |