CN101268101A - 用于癌症治疗的抗-CTLA-4抗体和含有CpG基序的合成寡脱氧核苷酸联合治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及施用抗－CTLA－4抗体，尤其针对人CTLA－4的人抗体，例如具有抗体3.1.1，4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，12.9.1.1，和MDX－010的氨基酸序列的抗体，其与免疫刺激核苷酸即CpG ODN PF3512676相组合，用于治疗癌症。本发明涉及在疾病期间的任意点(例如在癌症的任意阶段)，施用抗－CTLA－4抗体和CpG ODN PF3512676的组合，作为对局限的或转移的癌症的新辅助疗法、辅助疗法、一线疗法、二线疗法和三线疗法。

Description

用于癌症治疗的抗-CTLA-4抗体和含有CpG基序的合成寡脱氧核苷酸联合治疗
相关申请
本申请要求享有2005年7月7日提交的标题为“ANTI-CTLA-4ANTIBODY AND CpG-MOTIF-CONTAINING SYNTHETICOLIGODEOXYNUCLEOTIDE COMBINATION THERAPY FOR CANCER TREATMENT”的美国临时申请系列号60/697082的优先权，其完整内容通过参考引用并入本文。
发明领域
本发明涉及抗-CTLA-4抗体与CpG寡核苷酸组合在癌症治疗中的应用。
发明背景
癌症治疗的一个替代方案是靶向免疫***(″免疫疗法″)，替代和/或附加至靶向肿瘤本身。免疫疗法的一个潜在益处是，通过增强患者自身对肿瘤的免疫应答，同时使对正常细胞的有害作用最小化，提供提高的功效。
细胞毒性T淋巴细胞-相关抗原4(CTLA-4；CD152)是一种在激活的T细胞上表达的细胞表面受体。CTLA-4的天然配体是B7.1(CD80)和B7.2(CD86)，它们存在于抗原呈递细胞(APC，包括树突细胞，激活的B-细胞，和单核细胞)上。CTLA-4是起下调节T-细胞激活和维持免疫体内稳态作用的免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白的一个成员。更具体地，认为在决定对抗原的应答时，CD28和CTLA-4输送由T细胞整合的相对信号。抗原刺激T细胞受体的结果受CD28共刺激信号以及源自CTLA-4的抑制信号的调节。它也由T细胞上的CD28或CTLA-4与在抗原呈递细胞上表达的B7分子的相互作用决定。
实验证据表明，B7与CTLA-4的结合，会向T细胞递送负调节信号，在动物模型中阻断该负信号会导致增强的T细胞免疫功能和抗肿瘤活性(Thompson和Allison，1997，Immunity 7：445-450；McCoy和LeGros，1999，lmmunol.& Cell Biol.77：1-10)。几项研究已经证实，用抗鼠CTLA-4阻断mAb治疗小鼠，会显著增强T细胞-介导的对多种鼠实体瘤的杀伤，包括已建立的肿瘤，且可以诱导抗肿瘤免疫性(Leach等，1996，Science 271：1734-1736；Kwon等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：8099-8103；Kwon等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：15074-15079；Yang等，1997，Cancer Res.57：4036-4041；Hanson等的美国专利号6,682,736)。此外，人类中CTLA-4的多态性已经与自身免疫病如类风湿性关节炎和I型糖尿病的风险增高相关联。
另外，Allison等的美国专利5,811,097涉及施用CTLA-4阻断剂来降低肿瘤细胞生长。国际公开号WO 00/37504(在2000年6月29日公开)涉及人抗-CTLA-4抗体，和那些抗体在治疗癌症中的应用。WO01/14424(在2001年3月1日公开)涉及其它人抗-CTLA-4抗体，和这些抗体在治疗癌症中的应用。WO 93/00431(在1993年1月7日公开)涉及用能与CTLA-4-Ig融合蛋白反应的单克隆抗体调节细胞相互作用。WO 00/32231(在2000年6月8日公开)涉及CTLA-4阻断剂与肿瘤疫苗的组合用于刺激T-细胞。WO 03/086459涉及使用CTLA-4抗体促进记忆应答的方法。因而，本领域已经证实了治疗开发的潜力，所述治疗包含抑制CTLA-4结合，以增强和/或延长抗肿瘤应答。
细菌DNA具有激活B细胞和天然杀伤细胞的免疫刺激作用(Tokunaga，T.，等，1988.Jpn.J.Cancer Res.79：682-686；Tokunaga，T.，等，1984，JNCI 72：955-962；Messina，J.P.，等，1991，J.Immunol.147：1759-1764；综述见Krieg，1998，In：AppliedOligonucleotide Technology，CA.Stein和A.M.Krieg，(编.)，John Wiley和Sons，Inc.，New York，NY，pp.431-448)。细菌DNA的免疫刺激作用，是在特定碱基背景(CpG基序)中存在未甲基化的CpG二核苷酸的结果，它们在细菌DNA中常见，但是在脊椎动物DNA中甲基化且表现不足(underrepresented)(Krieg等，1995 Nature374：546-549；Krieg，1999 Biochim.Biophys.Acta 93321：1-10)。用含有这些CpG基序的合成寡脱氧核苷酸(ODN)，可以模仿细菌DNA的免疫刺激作用。这样的CpG ODN对人和鼠白细胞具有高度刺激作用，会诱导B细胞增殖、细胞因子和免疫球蛋白分泌、天然杀伤(NK)细胞溶解活性、IFN-γ分泌、和树突细胞(DC)和其它抗原呈递细胞的激活以表达共刺激分子和分泌细胞因子(尤其在促进Th1样T细胞应答的发展中重要的Th1样细胞因子)。天然磷酸二酯主链CpG ODN的免疫刺激作用，是高度CpG特异性的，在于如果CpG基序被甲基化、改变成GpC或以其它方式消除或改变，该作用会急剧降低(Krieg等，1995Nature 374：546-549；Hartmann等，1999 Proc.Natl.Acad.Sci USA96：9305-10)。
以前认为，免疫刺激作用需要在嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶序列的背景中的CpG基序(Krieg等，1995 Nature 374：546-549；Pisetsky，1996 J.Immunol.156：421-423；Hacker等，1998 EMBO J.17：6230-6240；Lipford等，1998 Trends in Microbiol.6：496-500)。但是，现在清楚了，小鼠淋巴细胞会非常好地应答不在该背景中的磷酸二酯CpG基序(Yi等，1998 J.Immunol.160：5898-5906)，这也适用于人B细胞和树突细胞(Hartmann等，1999 Proc.Natl.Acad.Sci USA 96：9305-10；Liang，1996J.Clin.Invest.98：1119-1129)。
一类CpG ODN能有效地激活B细胞，但是相对较弱地诱导IFN-α和NK细胞激活；该类型被称作B类。B类CpG寡核苷酸通常被完全稳定化，且包括在某些优选的碱基背景内的未甲基化的CpG二核苷酸。参见，例如，美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；和6,339,068。
尽管抗-CTLA-4抗体或ODN的诱导抗肿瘤应答的单独应用在癌症治疗中具有巨大前景，仍然需要开发用这样的免疫治疗方案***更特别是实体瘤的新疗法。
发明概述
新治疗方案的开发，尤其能增加或增强患者免疫***的抗肿瘤活性、同时减少现有化疗剂的细胞毒性副作用的新治疗方案的开发，是必要的。本发明提供了这样的方案。
因而，在一个实施方案中，本发明提供了治疗需要这样的治疗的患者的癌症的方法，所述方法包含，给所述患者施用治疗有效量的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合部分，与治疗有效量的CpG ODNPF3512676(CpG 7909(也称作ProMune)；TCG TCG TTT TGT CGT TTTGTC GTT；SEQ ID NO：37)相组合。在一个实施方案中，该方法是非疫苗方法。
在一个实施方案中，每天、隔天、每周2次或每周施用所述CpGODN。
在一个实施方案中，所述治疗是选自下述的疗法：新辅助疗法，辅助疗法，一线疗法，二线疗法，和三线疗法。
根据实施方案，所述癌症选自：脑癌，乳腺癌，子***，结肠直肠癌，皮肤T-细胞淋巴瘤，胃癌，头颈部癌，肝癌，肺癌，黑素瘤，急性髓细胞白血病，非霍奇金淋巴瘤，卵巢癌，胰腺癌，***癌，肾细胞癌，和肉瘤。
在其它实施方案中，所述人抗-CTLA-4抗体的所述治疗有效量范围是约0.1mg/kg-50mg/kg，或约0.3mg/kg-20mg/kg，包括但不限于选自下述的所述人抗-CTLA-4抗体的治疗有效量：至少1mg/kg，至少3mg/kg，至少6mg/kg，至少10mg/kg，和至少15mg/kg。
在一个实施方案中，所述抗-CTLA-4抗体或其抗原结合部分，是选自下述的至少一种抗体：(a)具有约10-8或更大的对CTLA-4的结合亲和力的人抗体，且其会抑制CTLA-4与B7-1之间的结合和CTLA-4与B7-2之间的结合；(b)具有包括至少一种人CDR序列的氨基酸序列的人抗体，所述人CDR序列对应源自选自以下的抗体的CDR序列：4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，12.9.1.1，和10D1；(c)具有选自4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，12.9.1.1，和10D1的抗体的重链和/或轻链的氨基酸序列的人抗体；(d)抗体或其抗原结合部分，其与至少一种具有选自4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，12.9.1.1，和10D1的抗体的氨基酸序列的抗体竞争结合CTLA-4；和(e)抗体或其抗原结合部分，其与至少一种具有选自4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，12.9.1.1，和10D1的抗体的氨基酸序列的抗体交叉竞争结合CTLA-4。
在另一个实施方案中，所述抗体是具有选自4.1.1，4.13.1，11.2.1，和10D1的抗体的氨基酸序列的人抗体。在相关的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，其中所述重链的重链可变域和所述轻链的轻链可变域的氨基酸序列选自：(a)SEQ ID NO：3的氨基酸序列和SEQ ID NO：9的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：15的氨基酸序列和SEQ ID NO：21的氨基酸序列；(c)SEQ ID NO：27的氨基酸序列和SEQ ID NO：33的氨基酸序列；(d)SEQ ID NO：1的核酸序列编码的氨基酸序列和SEQ ID NO：7的核酸序列编码的氨基酸序列；(e)SEQ ID NO：13的核酸序列编码的氨基酸序列和SEQ ID NO：19的核酸序列编码的氨基酸序列；(f)SEQ ID NO：25的核酸序列编码的氨基酸序列和SEQ ID NO：31的核酸序列编码的氨基酸序列；和(g)抗体10D1的可变域的氨基酸序列。
在另一个相关的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分是选自下述的抗体：(a)包含SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQID NO：10，SEQ IDNO.11和SEQ ID NO：12所述氨基酸序列的抗体；(b)包含SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所述氨基酸序列的抗体；和(c)包含SEQID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所述氨基酸序列的抗体。
在另一个相关的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分包含具有SEQ ID NO：27所述氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：33所述氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个相关的实施方案中，所述抗体选自：(a)包含SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：8所述氨基酸序列的抗体；(b)包含SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：20所述氨基酸序列的抗体；和(c)包含SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：32所述氨基酸序列的抗体。
在一个实施方案中，在施用所述CpG ODN之前1-7天，施用所述抗体。在该实施方案和其它实施方案中，在施用所述抗体后约1-100天，施用所述CpG ODN。
在一个实施方案中，皮下施用所述CpG ODN。
在另一个实施方案中，以1mg-50mg/天的量，施用所述CpG ODN。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗癌症的药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合部分，和治疗有效量的CpG ODN PF3512676，以及药学可接受的载体。
本文将更详细地描述本发明的这些和其它实施方案。
本发明的每个限定可以包括本发明的多种不同实施方案。因此预见到，涉及任意一个元素或元素的组合的本发明的每个限定，可以包含在本发明的每个方面中。本发明的应用不限于下面说明书所述的或附图解释的构造和组分排列的细节。本发明能包括其它实施方案，且能以多种方式实施或实现。
本文使用的措辞和术语用于描述目的，不应当视作限制。“包括”、“包含”、或“具有”、“含有”和其变体在本文中的应用，意在包括其后面列出的项目和其等同物以及另外的项目。
附图简述
结合附图可以更好地理解本发明的之前概述、以及下面的详细说明。为了说明本发明，在附图中显示了目前优选的实施方案。但是应当理解，本发明不限于所示的精确排列和手段。
在附图中：
图1，包括图1A-1D，显示了抗-CTLA-4抗体4.1.1的核苷酸和氨基酸序列。图1A显示了4.1.1重链的全长核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。图1B显示了4.1.1重链的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，以及在括号“[]”之间指明的4.1.1重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。每个4.1.1重链CDR的氨基酸序列加下划线。CDR序列如下：CDR1：GFTFSSHGMH(SEQ ID NO：4)；CDR2：VIWYDGRNKYYADSV(SEQ ID NO：5)；和CDR3：GGHFGPFDY(SEQ ID NO：6)。图1C显示了4.1.1轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)。图1D显示了全长4.1.1轻链的氨基酸序列(SEQID NO：8)，以及在括号“[]”之间指明的可变区(SEQ ID NO：9)。每个CDR的氨基酸序列指明如下：CDR1：RASQSISSSFLA(SEQ IDNO：10)；CDR2：GASSRAT(SEQ ID NO：11)；和CDR3：CQQYGTSPWT(SEQID NO：12)。
图2，包括图2A-2D，显示了抗-CTLA-4抗体4.13.1的核苷酸和氨基酸序列。图2A显示了4.13.1重链的全长核苷酸序列(SEQ ID NO：13)。图2B显示了4.13.1重链的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：14)，以及在括号“[]”之间指明的4.13.1重链可变区的氨基酸序列(SEQ IDNO：15)。每个4.13.1重链CDR的氨基酸序列加下划线。CDR序列如下：CDR1：GFTFSSHGIH(SEQ ID NO：16)；CDR2：VIWYDGRNKDYADSV(SEQID NO：12)；和CDR3：VAPLGPLDY(SEQ ID NO：18)。图2C显示了4.13.1轻链的核苷酸序列(SEQ IDNO：19)。图2D显示了全长4.13.1轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)，以及在括号“[]”之间指定的可变区(SEQ ID NO：21)。每个CDR的氨基酸序列指明如下：CDR1：RASQSVSSYLA(SEQ ID NO：22)；CDR2：GASSRAT(SEQ ID NO：23)；和CDR3：CQQYGRSPFT(SEQ ID NO：24)。
图3，包括图3A-3D，显示了抗-CTLA-4抗体11.2.1的核苷酸和氨基酸序列。图3A显示了11.2.1重链的全长核苷酸序列(SEQ ID NO：25)。图3B显示了11.2.1重链的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：26)，以及在括号“[]”之间指明的11.2.1重链可变区的氨基酸序列(SEQ IDNO：27)。每个11.2.1重链CDR的氨基酸序列加下划线。CDR序列如下：CDR1：GFTFSSYGMH(SEQ ID NO：28)；CDR2：VIWYDGSNKYYADSV(SEQID NO：29)；和CDR3：DPRGATLYYYYYGMDV(SEQ ID NO：30)。图3C显示了11.2.1轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO：31)。图3D显示了全长11.2.1轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)，以及在括号“[]”之间指明的可变区(SEQ ID NO：33)。每个CDR的氨基酸序列指明如下：CDR1：RASQS INSYLD(SEQ ID NO：34)；CDR2：AASSLQS(SEQ ID NO：35)；和CDR3：QQYYSTPFT(SEQ ID NO：36)。
发明详述
本发明涉及治疗癌症的新治疗方法，其包含共同施用抗-CTLA-4抗体和CpG ODN(即，CpG ODN PF3512676)的组合。根据本发明要治疗的癌症包括、但不限于，膀胱癌，脑肿瘤，乳腺癌，子***，结肠直肠癌，胃肠癌，头颈部癌，肝细胞癌，霍奇金病，卡波西肉瘤，急性和慢性白血病，皮肤T-细胞白血病，髓细胞和淋巴细胞白血病，肺癌(包括非小细胞肺癌)，黑素瘤，非霍奇金淋巴瘤，卵巢癌，胰腺癌，***癌，肾细胞癌，皮肤鳞状细胞癌，甲状腺癌，和其它类型的癌和肉瘤(例如，脂肪肉瘤，骨肉瘤)，以及许多其它。在多种不同的实施方案中，该方法包含，施用与所述抗体组合的CpG ODNPF3512676，用于癌症的新辅助疗法、辅助疗法、一线疗法、二线疗法或三线疗法。
在本发明中可采用的抗体和生产它们的方法，描述在2000年6月29日公开为WO 00/37504的国际申请号PCT/US99/30895，2002年4月12日公开的欧洲专利申请号EP 1262193A1，现在授权为美国专利号6,682,736的美国专利申请号09/472,087，现在公开为美国专利申请公开号2002/0086014的美国专利申请号09/948,939中(例如，MDX-010，Medarex，Princeton，NJ)，它们各自整体通过参考引用并入本文。尽管本文提供了与这些抗体有关的氨基酸和核酸序列的信息，进一步的信息可以参见美国专利号6,682,736，以及公开的申请WO00/37504，EP 1262193，和US2002/0086014；在那些申请中所述的序列通过参考引用并入本文。
在现在公开为美国专利申请公开号2003/0086930的美国专利申请号10/153,382中，讨论了这些抗体治疗多种不同癌症的某些应用，该申请如同整体阐述一样通过参考引用并入本文。
在本发明中使用的CpG免疫刺激寡核苷酸是B类CpG免疫刺激寡核苷酸。B类CpG免疫刺激寡核苷酸已经描述在USP 6,194,388B1和6,239,116B1中，它们分别在2001年2月27日和2001年5月29日授权。本发明的CpG免疫刺激寡核苷酸称作CpG ODN PF3512676，并通过下述核苷酸序列定义
5′TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT 3′(SEQ I D NO：37)。
CpG ODN PF3512676会强烈激活人B细胞，并对干扰素-α诱导具有微小作用。如本文更详细描述的，CpG ODN PF3512676可具有同质的或嵌合的主链，包括但不限于磷酸二酯和硫代磷酸酯主链连接。
在另一个实施方案中，抗体-CpG ODN PF3512676组合与至少一种其它治疗剂一起施用，所述其它治疗剂例如、但不限于不针对CTLA-4的其它单克隆抗体(例如，AVASTIN(贝伐单抗)，MYELOTARG(吉姆单抗)，BEXXAR(托西莫单抗)，RITUXAN(美罗华)，HERCEPTIN(曲妥单抗))，或具有类似作用的蛋白配体；激活抗原呈递细胞(树突细胞，巨噬细胞，B细胞，单核细胞)的试剂，包括1型干扰素(例如，干扰素α和β)；干扰素γ；BCG；提供任意和所有形式的肿瘤抗原的试剂，包括蛋白抗原，肽抗原，全细胞裂解物和其衍生物；遗传编码的抗原(例如，腺病毒编码的抗原)；已经在体内或离体被改变以增强其免疫性质的免疫***的细胞组分(例如，自体树突细胞，淋巴细胞，热激蛋白，等)；化疗剂，例如、但不限于，环磷酰胺，甲氨蝶呤，依托泊苷，阿霉素，紫杉烷，氟尿嘧啶，阿糖胞苷(AraC)，和含铂试剂，以及许多其它试剂。抗原的实例包括PSA抗原(例如，PROSTVAC/TRICOM)和黑素瘤-衍生的gp100抗原。该组合还可以与细胞因子或生长因子(例如但不限于GM-CSF)联合施用。
在一个实施方案中，治疗方法是非疫苗方法。本文使用的非疫苗方法是指，CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗体的组合不与外源抗原一起使用以刺激对抗原的免疫应答。但是，非疫苗方法可以包括刺激对内源抗原的免疫应答。内源抗原包括由癌细胞或肿块在体内表达、释放或脱落的那些抗原。
1.定义
除非在本文中另外限定，本发明所使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所通常理解的意义。而且，除非上下文另外需要，单数形式术语应包括复数形式，复数形式术语应包括单数形式。通常，本文所述与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白核酸化学和杂交相关的术语以及这些技术，是本领域所熟知和通常使用的。
除非另外说明，本发明的方法和技术通常根据本领域所公知的方法进行，并且在本说明书通篇引用和讨论的各种通用和更专业的参考文献中有所描述。这样的参考文献包括，例如，Sambrook和Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Approach，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，NY(2001)，Ausubel et al.，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(2002)，以及Harlow和Lane Antibodies：A Labora tory Manual，Cold SpringHarbor Labora tory Press，Cold Spring Harbor，NY(1990)，通过参考引用并入本文。如本领域通常的做法或如本文所述，酶促反应和纯化技术根据厂商的说明进行。本文描述的与分析化学、合成有机化学以及药物和药剂化学相关的术语及其实验室操作和技术，是本领域所公知的并在本领域中通常使用。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及对患者的治疗。
如本文所用的，下列每个术语具有在该节中伴随其的含义。
本文所使用的冠词“一个(种)”指一个(种)或多于一个(种)(即，至少一个(种))该冠词的语法对象。作为实例，“一种成分”指一种成分或一种以上成分。
如本文所使用的，20种常规氨基酸和它们的缩写遵从常规的用法。参见Immunology-A Synthesis(2nd Edition，E.S.Golub和D.R.Gren，编.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，它通过参考引用并入本文。
在本文中使用常规表示法描述多肽序列：多肽序列的左手端是氨基末端；多肽序列的右手端是羧基末端。
“保守的氨基酸置换”是指，其中氨基酸残基被具有相似化学特性(例如电荷性或者疏水性)的侧链R基的另一氨基酸残基所置换。通常，保守的氨基酸置换不会实质性地改变蛋白质的功能特性。在两个或者多个氨基酸序列通过保守置换而彼此不同的情况下，序列同一性百分比或者相似程度可被上调，以校正置换的保守性质。进行这种调节的方法，对于本领域的技术人员是已知的。参见，例如Pearson，Methods Mol.Biol.243：307-31(1994)。
具有相似化学特性的侧链的氨基组的实例包括，1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸：以及7)含硫侧链：半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，谷氨酸-天冬氨酸、以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
或者，保守替换是在Gonnet等，Science 256：1443-45(1992)(通过参考引用并入本文)中公开的PAM250对数似然矩阵(log-likelihood matrix)中具有正值的任意改变。“中度保守的”替换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任意改变。
优选的氨基酸置换是如下这些：(1)减少对蛋白水解的敏感性，(2)减少对氧化作用的敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，以及(4)赋予或者修饰该类似物的其它物理化学或功能特性。包含置换、缺失和/或***的类似物可以包括除了天然存在的肽序列外的序列的各种突变型蛋白。例如，单个或者多个氨基酸置换(优选保守的氨基酸置换)可以在天然存在的序列中(优选在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分中)进行。保守的氨基酸置换应不实质性改变母序列的结构特征(例如，替代氨基酸应不倾向于打破母序列中出现的螺旋或者破坏表征母序列的其它类型二级结构)。现有技术公认的多肽的二级和三级结构的例子描述于Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton等，Nature354：105(1991)，各自通过参考引用并入本文。
多肽的序列相似性(也称作序列同一性)通常使用序列分析软件测定。蛋白分析软件利用对各种置换、缺失和其它修饰(包括保守的氨基酸置换)赋予的相似性衡量来匹配类似序列。例如，GCG含有″Gap″和″Bestfit″等程序，其可以使用缺省参数来测定紧密相关的多肽(例如来自不同生物物种的同源多肽)之间的、或野生型蛋白质与其突变型蛋白质之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG 6.1版本。多肽序列也可以通过使用GCG 6.1版本中的FASTA程序，使用默认参数或推荐参数进行比较。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供了查询和研究的序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132：185-219(2000))。当将本发明的序列与含有来自不同有机体的大量序列的数据库进行比较时，另外一种优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是blastp或tblasm。参见例如Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Altschul等，Nucleic Acids Res.25：3389-402(1997)，通过参考引用并入本文。
完整的“抗体”包括通过二硫键相互连接的至少两个重链(H)和两个轻链(L)。概述参见Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.(1989))(为所有目的，整体通过参考引用并入本文)。每一重链由重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域构成。每个轻链由轻链可变区(LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步划分为高变区(称作互补性决定区(CDR))以及散布于其中的更为保守的区域(称为构架区(FR))。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按照下列顺序排列：FR1、CDR1，FR2、CDR2，FR3、CDR3，FR4。氨基酸到各个结构域的分配根据下列定义：Kabat，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，MD(1987和1991))，或Chothia & Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia等，Nature 342：878-883(1989)。
重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白向宿主组织或因子的结合，包括免疫***的各种不同细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(C1q)。
术语″抗体″可包括完整抗体的抗原结合部分，它保留了完整抗体的特异性结合抗原(例如CTLA-4)的能力。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过对完整抗体的酶法或化学切割来生产。
抗原结合部分的实例包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，即包括由铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的单域抗体(″dAb″)，如Ward等，Nature 341：544-546(1989)所述；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VH和VL)是由分开的基因编码，但是它们可以使用重组技术通过合成的连接物结合在一起，使它们可制备成为单一蛋白链，其中VH和VL区域配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv))；参见例如Bird等Science 242：423-426(1988)；和Huston等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988))。这种单链抗体也包括在术语“抗体”之内。
″双特异性抗体″具有2种不同的结合特异性，参见，例如，美国专利号5,922,845和美国专利号5,837,243；Zeilder J.Immunol.163：1246-1252(1999)；Somasundaram Hum.Antibodies 9：47-54(1999)；Keler Cancer Res.57：4008-4014(1997)。例如，本发明提供了双特异性抗体，其具有一个对细胞表面抗原(例如人CTLA-4)的结合位点，和对效应细胞表面上的Fc受体的第二个结合位点。本发明也提供了多特异性抗体，其具有至少3个结合位点。
术语″双特异性抗体″还包括″双体″。双体是二价的、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单一多肽链上表达，但是使用连接物，该连接物太短而不允许同一链上的2个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链上的互补结构域配对，并建立2个抗原结合位点(参见，例如，Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)；Poljak等，Structure 2：1121-1123(1994))。
本文中可互换使用的术语“人抗体”或者“人序列抗体”，包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在)的抗体。本发明的人序列抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点专一诱变或者体内体细胞突变所引入的突变)。但是，本文所使用的术语“人抗体”不意在包括“嵌合”抗体，所述“嵌合”抗体中来源于其它哺乳类物种的种系(例如小鼠)的CDR序列已经被嫁接到人构架序列上(即“人源化的”或者PRIMATIZEDTM抗体)。
本文所使用的术语“嵌合抗体”指含有来自两种或者多种不同抗体的区域的抗体。在一个实施方案中，一个或者多个CDR来源于人抗-CTLA-4抗体。在另一个实施方案中，所有的CDR来源于人抗-CTLA-4抗体。在另一个实施方案中，来源于一种以上的人抗-CTLA-4抗体的CDR组合在嵌合人抗体内。例如，嵌合抗体可以包括来源于第一人抗-CD40抗体的轻链的CDR1、来源于第二人抗-CTLA-4抗体的轻链的CDR2和来源于第三人抗-CTLA-4抗体的轻链的CDR3，并且重链的CDR可以来源于一种或者多种其它抗-CD40抗体。此外，构架区可以来源于同样的抗-CTLA-4抗体之一或者来源于一个或者多个不同的人。
而且，正如前述所讨论的，嵌合抗体包括含有来源于一个以上物种的种系序列的部分的抗体。
本文关于抗体使用的术语″竞争″是指，第一抗体或其抗原结合部分与第二抗体或其抗原结合部分竞争结合，其中在有第二抗体存在下第一抗体与它的同源表位的结合，与在没有第二抗体存在下第一抗体的结合相比，可检测地下降。或者，在有第一抗体存在下第二抗体与它的表位的结合也可检测地下降，可以如此，但不需要如此。也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与它的表位的结合，而第二抗体不抑制第一抗体与它的相应表位的结合。但是，当每种抗体可检测地抑制另一种抗体与它的同源表位或配体的结合时，无论是相同程度、更大或更小程度，都认为抗体彼此“交叉竞争”与它们各自表位的结合。例如，交叉竞争抗体可以结合本发明的抗体(例如，3.1.1，4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，和12.9.1.1)所结合的表位或表位的一部分。竞争和交叉竞争抗体都包含在本发明中。无论这种竞争或交叉竞争的发生机理如何(例如，位阻，构象变化，或结合共同表位或其一部分，等)，技术人员基于本文提供的教导会明白，这样的竞争和/或交叉竞争抗体都包括在内且可以用于本文公开的方法中。
术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由具有化学活性的表面分子结群例如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特异性的三维结构特征以及特异性的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在有变性溶剂存在下，与前者的结合会丧失，但是与后者的结合不会。
本文所使用的短语“特异性结合”指如蛋白质、核酸、抗体等化合物识别和结合样本中的特定分子，但实质上不识别或结合其它分子。例如，识别和结合样本中的同源配体的抗体或者肽抑制剂(例如结合其同源抗原CTLA-4的抗-CTLA4抗体)，但实质上不识别和结合样本中的其它分子。因此，在指定的检测条件下，指定的结合部分(例如，抗体或其抗原结合部分)优先与特定目标分子结合，而不以显著量与测试样本中存在的其它成分结合。许多检测形式可用于选择能与目标分子特异性结合的抗体。例如，使用固相ELISA免疫检测、免疫沉淀反应、BIAcore以及蛋白印迹分析来识别能与CTLA-4特异性反应的抗体。典型地，特异性或者选择性的反应至少是背景信号或噪声的两倍，更典型超过10倍背景，更为具体地，当平衡解离常数(KD)≤1μM、优选≤100nM和最优选≤10nM时，称抗体“特异性结合”抗原。
术语“KD”指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
本文所使用的“基本上纯的”指，目标物种是存在的占优势的物种(即，基于摩尔，它比组合物中的任何其它单独的物种更丰富)，优选基本上纯的级分是这样的组合物，其中目标物种(例如抗-CTLA-4抗体)占存在的所有大分子物种的至少约50％(基于摩尔)。通常，基本上纯的组合物含有超过约80％的组合物中存在的所有大分子物种，更优选超过约85％、90％、95％和99％。最优选地，目标物种纯化到基本上同质(组合物中的污染物物种不能用传统的检测方法检测到)，其中组合物基本上由单一大分子物种组成。
本文使用的术语″有效量″或″治疗有效量″是指，当施用给哺乳动物、优选人时，与在没有该化合物的情况下检测到的反应相比会介导可检测的治疗反应的量。通过许多本领域公知的方法，包括，例如，本文公开的这些方法，可以容易地评价治疗反应，例如、但不限于，肿瘤生长的抑制和/或减小(包括肿瘤大小停滞)，肿瘤大小，转移等。
本领域技术人员会明白，本文施用的化合物或组合物的有效量可以变化，且可以基于许多因素容易地确定，例如所治疗的疾病或病症，疾病的阶段，治疗的哺乳动物的年龄和健康和身体状况，疾病的严重性，施用的具体化合物，等。
″治疗有效量″或″有效量″意在定量将瘤形成病症的一种或多种症状可检测地减轻至一定程度所需的试剂量，包括、但不限于：1)癌细胞数的减少；2)肿瘤大小的减小；3)对癌细胞向周围器官中浸润的抑制(即，减慢至一定程度，优选停止)；3)肿瘤转移的抑制(即，减慢至一定程度，优选停止)；4)抑制肿瘤生长至一定程度；5)在一定程度上缓解或减轻与病症有关的一种或多种症状；和/或6)缓解或减轻与施用抗癌剂有关的副作用。
结合本文提供的教导，通过选择各种活性化合物和加权因子(例如效力，相对生物利用度，患者体重，不利副作用的严重性和优选的给药模式)，可以计划有效的预防性或治疗性处理方案，它不会造成实质的毒性，且仍然能完全有效地治疗特定患者。任意特定应用的有效量，可以取决于所治疗的疾病或病症、疾病或病症的严重性、和患者的健康和大小等因素而变化。本领域普通技术人员可以经验为主地确定CpG ODN PF3512676、抗-CTLA-4抗体和/或其它治疗剂的有效量，不需要过度实验。
ODN和/或抗体单独或一起的治疗有效量，可以从动物模型最初确定。治疗有效剂量也可以从特定ODN和/或特定抗体的人数据确定，或从已知会表现出类似的药理学活性的其它化合物的人数据确定。肠胃外给药可能需要更高的剂量。应用的剂量可以根据施用的化合物的相对生物利用度和效力来调节。在上述方法和本领域熟知的其它方法的基础上调节剂量来达到最大效能，是在普通技术人员的能力范围内。
本文使用的术语″指导材料″包括出版物、录音、图表、或任意其它表达介质，它们可以用于传达本发明的化合物、组合/或组合物在用于影响、减轻或治疗本文所述的各种疾病或病症的药盒中的有用性。任选地或可选地，指导材料可以描述一种或多种减轻细胞、组织或哺乳动物的疾病或病症的方法，包括本文别处公开的方法。
药盒的指导材料可以例如附着在装有本发明的化合物和/或组合物的容器上，或可以与装有化合物和/或组合物的容器一起运输。或者，指导材料可以与容器分开运输，意图使接受者协作地使用指导材料和化合物。
本发明的ODN和/或抗体可以在药剂分配器中提供。药剂分配器是限定多个药物贮存隔室的包装，每个隔室用于容纳单个单元的药剂。完整的药物疗程装在多个药物贮存隔室中。
限定多个药物贮存隔室的包装可以是任意类型的一次性药物包装或卡片，其将药剂容纳在单个隔室中。例如，包装是从卡片构建的泡罩包装，其可以从坚硬的纸材料、泡罩片和背衬板制备。这样的卡片是本领域普通技术人员众所周知的。
作为一个实例，药剂分配器可以盛装整个药物疗程。分配器可以包括日期标记，以指明哪一天服用单个药剂单元。它们可以沿着药剂包装的第一侧面进行标记。也可以标示剂量标记，例如沿着与药剂包装第一侧面垂直的药剂包装第二侧面，从而指明服用单个药剂单元的时间。单位剂量可以包含在泡罩式分配器中。
除特别指出外，术语″患者″或″受试者″可互换使用，指哺乳动物例如人患者和非人灵长类动物，以及兽医对象例如兔、大鼠和小鼠，以及其它动物。优选地，患者指人类。
本文使用的″治疗″指，降低患者经历的疾病症状(即，肿瘤生长和/或转移，或由免疫细胞的数量和/或活性介导的其它作用等)的频率。该术语包括，施用本发明的化合物或试剂来预防或延迟疾病的症状、并发症或生化标记(例如，***癌中PSA水平的升高)的发生，减轻症状，或阻止或抑制疾病、病症或障碍的进一步发展。治疗可以是预防性的(预防或延迟疾病的发生，或预防其临床或亚临床症状的出现)或在疾病出现后治疗性抑制或减轻症状。
″联合治疗″包括施用CpG ODN PF3512676和CTLA-4抗体，作为意在提供这些治疗剂共同作用的有益作用的特定治疗方案的一部分。组合的有益作用包括、但不限于，源自治疗剂组合的药代动力学的或药效学的共同作用。这些治疗剂的联合给药，通常在限定的时间段内进行(通常是几分钟，几小时，几天或几周，这取决于选择的组合)。″联合治疗″通常无意包括施用2种或多种这样的治疗剂作为偶然地和任意地导致本发明组合的分开单一治疗方案的一部分。
″联合治疗″包括以顺序方式施用这些治疗剂，也就是说，其中在不同时间施用每种治疗剂，以及以基本上同时的方式施用这些治疗剂或至少2种治疗剂。基本上同时给药可以如下实现，例如，通过给受试者施用具有固定比例的每种治疗剂的单个胶囊，或多个每种治疗剂的单独胶囊。每种治疗剂的顺序的或基本上同时的给药，可以通过任意适当途径来实现，包括、但不限于，经口途径，静脉内途径，肌肉内、皮下途径，和通过粘膜组织直接吸收。治疗剂可以通过相同途径或不同途径来施用。例如，第一种治疗剂(例如，CpG ODN PF3512676)可以通过皮下注射来施用，第二种试剂(例如，抗-CTLA-4抗体)可以静脉内施用。此外，选定组合中的第一种治疗剂可以通过静脉内注射来施用，而组合中的其它治疗剂可以经口施用。或者，例如，2种治疗剂均可以经口施用，或2种治疗剂均可以通过静脉内注射施用。
″联合治疗″也可以包括上述治疗剂进一步与其它生物活性成分(例如、但不限于，第二种不同的抗肿瘤试剂，树突疫苗或其它肿瘤疫苗)和非药物治疗(例如、但不限于，手术或放射治疗)联合施用。当联合治疗还包含放射治疗时，放射治疗可以在任意适当的时间进行，只要达到治疗剂和放射治疗组合的共同作用的有益效果即可。例如，在适当情况下，当从治疗剂给药中暂时去除放射治疗(可能几天或甚至几周)时，仍然达到有益效果。
II.抗-CTLA-4抗体
如本文前面别处所述，优选的抗-CTLA-4抗体是特异性结合人CTLA-4的人抗体。示例性的人抗-CTLA-4抗体详细描述在2000年6月29日公开的公开号为WO 00/37504的国际申请号PCT/US99/30895，2002年4月12日公开的欧洲专利申请号EP 1262193A1，和现在授权给Hanson等美国专利号6,682,736的美国专利申请号09/472,087，以及公开为US2002/0086014的美国专利申请号09/948,939中，它们的所有公开内容特此通过参考引用并入本文。这样的抗体包括、但不限于，3.1.1，4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，和12.9.1.1，以及MDX-010。人抗体会在本发明的治疗方法中提供实质的优势，因为预见到它们会使人患者中与非人抗体的使用有关的免疫原性和变应性反应最小化。
在WO 00/37504，EP 1262193，和美国专利号6,682,736以及美国专利申请公开号US2002/0086014和US2003/0086930中，广泛地讨论了本发明的有用的人抗-CTLA-4抗体的特征，其中所述的氨基酸和核酸序列整体通过参考引用并入本文。简而言之，本发明的抗体包括具有以下抗体的氨基酸序列的抗体：例如、但不限于，抗体3.1.1，4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，12.9.1.1，和MDX-010.本发明也涉及具有这些抗体的重链和轻链的CDR的氨基酸序列的抗体，以及上述申请和专利所述的具有CDR区中的变化的抗体。本发明也涉及具有这些抗体的重链和轻链的可变区的抗体。在另一个实施方案中，抗体选自具有抗体3.1.1，4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，和12.9.1.1，和MDX-010的重链和轻链的全长、可变区或CDR氨基酸序列的抗体。
在一个实施方案中，本发明包含抗体-治疗剂组合，其包含在公开为美国专利申请公开号2002/0086014和2003/0086930的美国专利申请号09/948,939和其中引用的参考文献中公开的人抗-CTLA-4抗体，包括、但不限于，MAb 10D1(MDX-010，Medarex，Princeton，NJ)。更优选地，抗-CTLA-4抗体是MDX-010。或者，抗-CTLA-4抗体是11.2.1(Ticilimumab；CP-675，206)。
在另一个实施方案中，VH的氨基酸序列包含SEQ ID NO：3，15和27所述的氨基酸序列。在另一个实施方案中，VL包含SEQ ID NO：9，21和33所述的氨基酸序列。更优选地，VH和VL分别包含SEQ ID NO：3(VH4.1.1)和SEQ ID NO：9(VL4.1.1)所述的氨基酸序列；SEQ ID NO：15(VH4.13.1)和SEQ ID NO：21(VL4.13.1)所述的氨基酸序列；和SEQ IDNO：27(VH11.2.1)和SEQ ID NO：33(VL11.2.1)所述的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，重链的氨基酸序列包含由包含SEQ ID NO：1，13，和25所述核酸序列的核酸编码的氨基酸序列。在另一个实施方案中，轻链包含由包含SEQ ID NO：7，19和31所述核酸序列的核酸编码的氨基酸序列。更优选地，重链和轻链分别包含由包含下述核酸序列的核酸编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：1(重链4.1.1)和SEQ ID NO：7(轻链4.1.1)所述核酸序列；SEQ ID NO：13(重链4.13.1)和SEQ IDNO：19(轻链4.13.1)所述核酸序列；和SEQ ID NO：25(重链11.2.1)和SEQ ID NO：31(轻链11.2.1)所述核酸序列。
此外，抗体可以包含重链氨基酸序列，后者包含源自VH3-30或3-33基因、或其中的保守置换或体细胞突变的人CDR氨基酸序列。抗体也可以在它的轻链中包含CDR区，其源自A27或012基因，即，小于5个、或小于10个这样的突变。抗体也可以包含来自这些基因的构架区，包括相差小于5个、或小于10个氨基酸的那些。也包括具有本文所述构架区的抗体，它们已经突变来反映原始种系序列。
在本发明的其它实施方案中，抗体会抑制CTLA-4和B7-1之间的结合，CTLA-4和B7-2之间的结合，或二者。优选地，抗体可以以约100nM或更低、更优选约10nM或更低，例如约5nM或更低，更优选约2nM或更低，或更优选例如约1nM或更低的IC50，抑制与B7-1的结合。类似地，抗体可以以约100nM或更低、更优选约10nM或更低，例如更优选约5nM或更低，更优选约2nM或更低，或更优选例如约1nM或更低的IC50，抑制与B7-2的结合。
此外，在另一个实施方案中，抗-CTLA-4抗体具有对CTLA-4约10-8的结合亲和力，或更大的亲和力，更优选约10-9或更大的亲和力，更优选约10-10或更大的亲和力，更优选约10-11或更大的亲和力。
抗-CTLA-4抗体可以与具有选自4.1.1，6.1.1，11.2.1，4.13.1和4.14.3的抗体的重链和轻链氨基酸序列的抗体竞争结合。此外，抗-CTLA-4抗体可以与MDX-010抗体竞争结合。
在另一个实施方案中，抗体优选地与具有抗体4.1.1，4.13.1，4.14.3，6.1.1.或11.2.1的重链和轻链序列、可变重链和可变轻链序列、和/或重链和轻链CDR序列的抗体交叉竞争。例如，抗体可以结合具有选自4.1.1，4.13.1，4.14.3，6.1.1，或11.2.1的抗体的重链和轻链氨基酸序列、可变序列和/或CDR序列的抗体所结合的表位。在另一个实施方案中，抗体与具有MDX-010的重链和轻链序列或抗原-结合序列的抗体交叉竞争。
在另一个实施方案中，使用包含下述重链和轻链的抗-CTLA-4抗体实施本发明：包含选自3.1.1，4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，和12.9.1.1的抗体的CDR-1、CDR-2、和CDR-3氨基酸序列的重链，包含选自3.1.1，4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，和12.9.1.1的抗体的CDR-1、CDR-2、和CDR-3氨基酸序列的轻链，或具有选自以下的所述CDR序列变化的序列：保守变化，其中所述保守变化选自：将非极性残基替换为其它非极性残基，将极性带电荷的残基替换为其它极性不带电荷的残基，将极性带电荷的残基替换为其它极性带电荷的残基，和结构类似的残基的置换；非保守置换，其中所述非保守置换选自：将极性带电荷的残基置换为极性不带电荷的残基，和将非极性残基置换为极性残基，添加和缺失。
在本发明的另一个实施方案中，抗体在构架区或CDR区中含有从种系序列小于10，7，5，或3个氨基酸变化。在另一个实施方案中，抗体在构架区中含有小于5个氨基酸变化，在CDR区中含有小于10个变化。在一个优选的实施方案中，抗体在构架区中含有小于3个氨基酸变化，在CDR区中含有小于7个变化。在一个优选的实施方案中，构架区中的变化是保守的，CDR区中的变化是体细胞突变。
在另一个实施方案中，抗体在重链和轻链CDR-1、CDR-2和CDR-3序列中与抗体3.1.1，4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，和12.9.1.1的CDR序列具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％序列同一性。更优选地，抗体在重链和轻链CDR-1、CDR-2和CDR-3序列中与抗体3.1.1，4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，和12.9.1.1的序列具有100％序列同一性。
在另一个实施方案中，抗体在重链和轻链可变区序列中与抗体3.1.1，4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，和12.9.1.1的可变区序列具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％序列同一性。更优选地，抗体在重链和轻链可变区序列中与抗体3.1.1，4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，和12.9.1.1的序列具有100％序列同一性。
尽管可能优选本文前面讨论的抗-CTLA-4抗体，本领域的技术人员基于本文所提供的公开内容，将会理解本发明包括多种抗-CTLA-4抗体，且不限于这些特定的抗体。更具体地，尽管优选人抗体，但是本发明不限于人抗体；相反，本发明包括各种有用的抗体而不管物种起源，并且尤其包括嵌合人源化和/或灵长动物源化抗体。而且，尽管本文示例的抗体通过使用转基因哺乳动物(例如，含有人免疫所有组成部分的小鼠)获得，本领域的技术人员基于本文所提供的公开内容，可以理解本发明不限于通过这种方法或者通过其它任何特定方法产生的抗体。取而代之的是，本发明包括通过任何方法产生的抗-CTLA-4抗体，包括但不限于本领域已知的方法(例如筛选噬菌体展示文库等)或者在将来开发的用于产生本发明的抗-CTLA-4抗体的方法。基于本文所提供的、以及在例如Bedian等的美国专利第6,682,736号、和美国专利申请公开第2002/0088014号中广泛公开的内容，本领域的技术人员能够轻易地产生和鉴定对于使用本文公开的新方法与治疗剂联合治疗乳腺癌有用的抗体。
本发明包括用转基因非人哺乳动物产生的人抗体，即，公开于Hanson等的U.S.6,682,736中的XenoMouseTM(Abgenix，Inc.，Fremont，CA)。
另一个产生“人”抗体的转基因鼠***称为“HuMAb-MouseTM”(Medarex，Princeton，NJ)，它含有编码非重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，连同使内源性的μ和κ链基因座失活的靶向突变(Lonberg等Nature 368：856-859(1994)以及美国专利第5,770,429号)。
但是，本发明使用通过用任意转基因哺乳动物制成的人抗-CTLA-4抗体，所述转基因哺乳动物例如但不限于Kirin TC MouseTM(KirinBeer Kabushiki Kaisha，Tokyo，Japan)，例如Tomizuka等，Proc NatlAcad Sci USA 97：722(2000)；Kuroiwa等，Nature Biotechnol18：1086(2000)；Mikayama等的美国专利申请公开第2004/0120948号所述：以及前述的HuMAb-MouseTM(Medarex，Princeton，NJ)和XenoMouseTM(Abgenix，Inc.，Fremont，CA)。因此，本发明包括使用通过用任意转基因或者其它非人动物制成的抗-CTLA-4抗体。
此外，尽管生产人抗-CTLA-4抗体的优选方法包含，使用含有人免疫所有组成部分的非人转基因哺乳动物制备抗体，本发明不限于该方案。相反，本领域技术人员会明白，在本文提供的公开内容的基础上，本发明包括使用对CTLA-4特异性的人或任何其它抗体的任意生产方法，根据本领域已知的任意方法或者在将来开发的用于产生特异性结合目标抗原的抗体的方法制备。
人抗体可以通过下述方法制备，包括、但不限于，使用噬菌体展示抗体文库。使用这些技术，可以针对CTLA-4表达细胞、CTLA-4本身、CTLA-4形式、其表位或肽、和其表达文库产生抗体(见例如美国专利5,703,057)，然后可以筛选它们的上述活性。
在另一个实施方案中，本发明的方法所使用的抗体不是完全的人抗体，而是“人源化”的抗体。更具体地，鼠抗体或者源自其它物种的抗体能通过用本领域公知的技术而被“人源化”或者“灵长动物源化”。参见例如Winter和Harris Immunol.Today 14：43-46(1993)，Wright等Crit.Reviews in Immunol.12：125-168(1992)，和Cabilly等的美国专利第4,816,567号，以及Mage和Lamoyi inMonoclonal Antibody Production Techniques and Applicationspp.79-97，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，NY(1987)。
可以理解，基于本文所提供的公开内容，用于本发明的抗体能从转基因非人类哺乳动物以及源自它们的杂交瘤获得，但也能在除了杂交瘤之外的细胞系中表达。
可得到的作为表达宿主的哺乳动物细胞系为本领域所公知，包括许多可获自美国典型培养物中心(ATCC)的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，NS0，HeLa细胞，幼仓鼠肾(BHK)细胞，猴肾细胞(COS)和人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)。也可使用非哺乳动物原核和真核细胞，包括细菌、酵母、昆虫和植物细胞。
可以使用本领域所公知的各种表达***，例如但不限于，在例如Sambrook和Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Approach，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(2001)，和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，NY(2002)中所描述的那些。这些表达***尤其包括基于二氢叶酸还原酶(DHFR)的***。谷氨酰胺合成酶表达***在欧洲专利号EP216846，EP 256055，和EP 323997以及欧洲专利申请号89303964中有全部或部分讨论。在一个实施方案中，所使用的抗体在NS0细胞中用谷氨酰胺合成酶***(GS-NS0)制成。在另一个实施方案中，抗体在CHO细胞中用DHFR***制成。这两种***都为本领域所公知，尤其在Barnes等的Biotech & Bioengineering 73：261-270(2001)和其中引用的参考文献中有所描述。
对抗体CH2结构域定点诱变以消除糖基化可能是优选的，以便阻止由非人糖基化引起的免疫原性、药代动力学功能和/或效应功能变化。此外，通过酶(参见，例如，Thotakura等Meth.Enzymol.138：350(1987))和/或化学方法(参见，例如，Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.259：52(1987))，可以将抗体去糖基化。
此外，本发明包括使用含有改变的糖基化方式的抗-CTLA-4抗体。基于本文所提供的公开内容，本领域的技术人员能够理解，与天然存在的抗体相比，抗-CTLA-4抗体能被修饰成包括额外的、更少的或者不同的糖基化位点。这种修饰在例如美国专利申请公开第2003/0207336和2003/0157108号、以及国际专利公开第WO 01/81405和00/24893号中有所描述。
此外，本发明包括使用抗-CTLA-4抗体，而不论抗体上存在的糖形(如果存在)。而且，用于广泛地重新塑造存在于糖蛋白上的糖形的方法，在现有技术中已知，包括，例如在国际专利公开第WO03/031464、WO98/58964和WO99/22764号，以及美国专利申请公开第2004/0063911、2004/0132640、2004/0142856、2004/0072290号，以及Umana等的美国专利第6,602,684号中描述的那些。
而且，本发明包括使用含有任何现有技术中已知的共价和非共价修饰的抗-CTLA-4抗体，所述修饰包括但不限于，将多肽与各种非蛋白质聚合物(例如聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯)之一按照例如美国专利申请公开第2003/0207346和2004/0132640号、以及美国专利第4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192、4,179,337号中描述的方式连接。
此外，木发明包括使用抗-CTLA-4抗体、或其抗原结合部分、嵌合蛋白质(包括，例如人血清白蛋白多肽)、或其片段。不论嵌合蛋白质是否使用重组方法来生产，例如通过编码嵌合蛋白质的嵌合核酸的克隆、或通过两个肽部分的化学键连，本领域的技术人员一旦具有本发明提供的教导便可以理解，该嵌合蛋白质在现有技术是已知的，并且该嵌合蛋白质能够赋予希望的生物特性，例如但不限于，增加本发明的抗体的稳定性和血清半衰期，因此这类分子也包括在本文中。
用于本发明而生产的抗体不需要开始便具有特定的需要的同种型。而是，所产生的抗体可以具有任何同种型，并且可以是此后使用常规技术转换的同种型。这些包括直接重组技术(参见，例如美国专利4,816,397)、和细胞-细胞融合技术(参见例如美国专利第5,916,771号)。
本发明的抗体的效应功能可以通过同种型转换至IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM来改变，而用于多种治疗用途。而且，通过使用例如双特异物(bispecifics)、免疫毒素、或放射性标记，可以避免细胞杀伤的补体依赖性。
因此，尽管用于本发明的优选抗体由具有3.1.1，4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，12.9.1.1，和MDX-010的氨基酸序列或例如其V区或CDR的序列的抗体例示，本发明绝不限于使用这些或任何其它特定的抗体。本发明包括组合施用本发明的任意抗-CTLA-4抗体和至少一种激素治疗剂。优选地，抗体是4.1.1，4.13.1，11.2.1，和/或MDX-010。但是，在本发明的方法中，可以使用在本文别处所述的或本领域已知的或将来开发的任意抗-CTLA-4抗体或其抗原结合部分。更具体地，人源化嵌合抗体，源自任意物种的抗-CTLA-4抗体(包括在例如Casterman和Hamers的美国专利号5,759,808和6,765,087中描述的从camelids得到的单链抗体)，以及任意人抗体，可以与治疗剂相组合，用于实现本文公开的新方法。
本发明也包括尤其在国际专利公开号WO 00/37504(2000年6月29日公开)；WO 01/14424(2001年3月1日公开)；WO 93/00431(1993年1月7日公开)；和WO 00/32231(2000年6月8日公开)中公开的这样的抗体。
尽管抗体4.1.1，4.13.1和11.2.1为IgG2抗体，且所述抗体的可变区的序列提供在本文(图1-3)，在本文参考和引入的申请和专利中，可以理解，本文包括这些抗体的全长序列，以及包括SEQ ID NO：1-36中所列的序列并进一步包括任何恒定区的任意抗体的应用，而不论在本文别处更充分讨论的同种型。同样，包括MDX-010的全长序列或其任意部分(包括编码MDX-010的抗原结合部分的序列)的任意抗体，可以与至少2种激素治疗剂组合施用，从而治疗***癌。
因而，本领域技术人员在获知本文提供的教导后会容易地明白，本发明的抗-CTLA-4抗体-治疗剂组合可以包含众多的抗-CTLA-4抗体。
而且，本领域的技术人员基于本文提供的内容可以理解，本发明不限于仅仅单一抗体的给药：相反，本发明包括与治疗剂组合施用至少一种抗-CTLA-4抗体，例如4.1.1，4.13.1和11.2.1。而且，本发明包括施用任意已知抗-CTLA-4抗体的任意组合，包括、但不限于，施用治疗剂与例如4，1.1，4.13.1，11.2.1和MDX-010组合。因而，抗-CTLA-4抗体的任意组合可以与至少一种治疗剂组合，本发明包括任意这类组合及其改变。
III.CpG ODN
CpG寡核苷酸含有被发现会引起免疫应答的特定序列。这些特定序列称作″免疫刺激基序″，含有免疫刺激基序的寡核苷酸称作″免疫刺激寡核苷酸分子″和等同地″免疫刺激寡核苷酸″。免疫刺激寡核苷酸包括至少一个免疫刺激基序，优选地该基序是内部基序。术语“内部免疫刺激基序”指比基序序列长至少一个核苷酸(在5′和3′末端)的寡核苷酸序列内基序序列的位置。
CpG寡核苷酸包含至少一个未甲基化的CpG二核苷酸。含有至少一个未甲基化的CpG二核苷酸的寡核苷酸是含有胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列的寡核苷酸分子(即，″CpG DNA″或含有通过磷酸键连接到3′鸟嘌呤上的5′胞嘧啶的DNA)，且激活免疫***。整个CpG寡核苷酸可以是未甲基化的，或部分可以是未甲基化的，但是至少5′CG 3′的C必须是未甲基化的。
B类CpG寡核苷酸用下式表示：
5′X1CGX2 3′
其中X1和X2是核苷酸。在有些实施方案中，X1可以是腺嘌呤，鸟嘌呤，或胸腺嘧啶，和/或X2可以是胞嘧啶，腺嘌呤，或胸腺嘧啶。
B类CpG寡核苷酸也用下式表示：
5′X1X2CGX3X43′
其中X1，X2，X3，和X4是核苷酸。X2可以是腺嘌呤，鸟嘌呤，或胸腺嘧啶。X3可以是胞嘧啶，腺嘌呤，或胸腺嘧啶。
B类CpG寡核苷酸包括由至少下式代表的寡核苷酸：
5′N1X1X2CGX3X4N23′
其中X1，X2，X3，和X4是核苷酸，且N是任意核苷酸，N1和N2是各自由约0-25个N组成的寡核苷酸序列。X1X2可以是选自下述的二核苷酸：GpT，GpG，GpA，ApA，ApT，ApG，CpT，CpA，CpG，TpA，TpT，和TpG；X3X4可以是选自下述的二核苷酸：TpT，ApT，TpG，ApG，CpG，TpC，ApC，CpC，TpA，ApA、和CpA。
B类CpG寡核苷酸公开在PCT公开专利申请PCT/US 95/01570和PCT/US 97/19791，和分别在2001年2月27日和2001年5月29日授权的USP 6,194,388B1和USP 6,239,116B1中。
免疫刺激寡核苷酸分子可以具有同质主链(例如，完全磷酸二酯或完全硫代磷酸酯)或嵌合主链。为本发明的目的，嵌合主链是指部分稳定的主链，其中至少一个核苷酸间连接是磷酸二酯或磷酸二酯样连接，且其中至少一个其它核苷酸间连接是稳定的核苷酸间连接，其中所述至少一个磷酸二酯或磷酸二酯样连接和所述至少一个稳定的连接是不同的。由于已有报道boranophosphonate连接相对于磷酸二酯连接来说是稳定的，为所述主链的嵌合性质的目的，boranophosphonate连接可以分类为磷酸二酯样或分类为稳定的，这取决于其所处环境。例如，在一个实施方案中，根据本发明的嵌合主链可包括至少一个磷酸二酯(磷酸二酯或磷酸二酯样)连接和至少一个boranophosphonate(稳定的)连接。在另一个实施方案中，根据本发明的嵌合主链可以包括boranophosphonate(磷酸二酯或磷酸二酯样)连接和硫代磷酸酯(稳定的)连接。“稳定的核苷酸间连接”是指与磷酸二酯核苷酸间连接相比，相对能够抵抗体内降解(例如通过核酸外切酶或核酸内切酶)的核苷酸间连接。优选的稳定的核苷酸间连接包括但不限于硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，膦酸甲酯，和甲基硫代磷酸酯。其它稳定的核苷酸间连接包括但不限于肽，烷基，去磷酸类型的连接，和其它上述连接。
修饰的主链例如硫代磷酸酯可以用亚磷酰胺或H-膦酸化学方法用自动技术合成。可以用例如美国专利号4,469,863中描述的方法制备芳基-和烷基-膦酸；烷基磷酸三酯(其中带电荷的氧部分烷基化)，例如美国专利号5,023,243和欧洲专利号092,574中所述，可以使用商业可获得的试剂用自动固相合成方法制备。制备其它DNA主链修饰和取代的方法已有描述。Uhlmann E等(1990)Chem Rev 90：544；Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem 1：165。制备嵌合寡核苷酸的方法也是已知的。例如Uhlmann等的专利中已经描述了这些技术。
混和主链修饰的ODN可以使用商业可获得的DNA合成仪和标准亚磷酰胺化学合成。(F.E.Eckstein，″Oligonucleotides andAnalogues-A Practical Approach″IRL Press，Oxford，UK，1991，和M.D.Matteucci和M.H.Caruthers，Tetrahedron Lett.21.719(1980))。偶联以后，通过用Beaucage试剂(R.P.Iyer，W.Egan，J.B.Regan and S.L.Beaucage，J.Am.Chem.Soc.112，1253(1990))(在乙腈中浓度为0.075M)或苯乙酰二硫化物(PADS)进行硫化反应，然后用乙酸酐，2，6-卢剔啶的四氢呋喃溶液(1∶1∶8；v∶v∶v)和N-甲基咪唑(在四氢呋喃中浓度为16％)加帽，引入PS连接。该加帽步骤在硫化反应之后进行，以使在应是硫代磷酸酯的位置上不希望的磷酸二酯(PO)连接的形成降到最低限度。在磷酸二酯连接的引入过程中，例如在CpG二核苷酸上，中间体磷-III通过用碘的水/吡啶溶液处理被氧化。从固体支持物上切割下来并通过浓氨水的处理进行最后的去保护(15小时，50℃)以后，通过用NaCl梯度(例如缓冲液A：乙腈/水＝1∶4/v∶v中NaH2PO4浓度为10mM，pH6.8；缓冲液B：乙腈/水＝1∶4/v∶v中NaH2PO4浓度为10mM，NaCl浓度为1.5M；在30分钟内5到60％B，速度为1ml/min)在Gen-Pak Fax柱(Millipore-Waters)上进行HPLC，或通过毛细管凝胶电泳，分析ODN。可以用HPLC或在Source High Performance柱(Amersham Pharmacia)上用FPLC纯化ODN。将HPLC-同质级分合并，并通过C18柱或超滤进行脱盐。用MALDI-TOF质谱对ODN进行分析，以证实计算的质量。
本发明的寡核苷酸还可以包括其它修饰。它们包括非离子的DNA类似物，例如烷基-和芳基-磷酸(其中带电荷的膦酸氧被烷基或芳基取代)，磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中带电荷的氧部分被烷基化。在任一末端或两个末端含有二醇(例如四乙二醇或六乙二醇)的寡核苷酸，还已显示能基本上抵抗核酸酶降解。
在有些实施方案中，所述寡核苷酸可以是柔性或半柔性寡核苷酸。柔性寡核苷酸是具有部分稳定主链的免疫刺激寡核苷酸，其中只在至少一个内部嘧啶-嘌呤二核苷酸(YZ)的内部或其紧邻处存在磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。优选YZ是YG，嘧啶-鸟嘌呤核苷(YG)二核苷酸。所述至少一个内部YZ二核苷酸本身具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。紧邻所述至少一个内部YZ二核苷酸存在的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接可以是在所述至少一个内部YZ二核苷酸的5’，3’或同时在5’和3’。
更具体地，磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接涉及“内部二核苷酸”。通常内部二核苷酸是指任意一对通过核苷酸间连接相连的相邻核苷酸，其中该对核苷酸中的任何一个核苷酸都不是末端核苷酸，即，该对核苷酸中没有一个核苷酸是限定寡核苷酸的5’或3’末端的核苷酸。因此n个核苷酸长的线性寡核苷酸具有总共n-1个二核苷酸，只有n-3个内部二核苷酸。内部二核苷酸的每个核苷酸间连接都是内部核苷酸间连接。因此n个核苷酸长的线性寡核苷酸具有总共n-1个核苷酸间连接，只有n-3个内部核苷酸间连接。因此，策略性放置的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接指位于寡核苷酸序列中任意一对核苷酸之间的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。在一些实施方案中，所述磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接不位于最接近5’或3’末端的任何一对核苷酸之间。
优选紧邻所述至少一个内部YZ二核苷酸存在的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接本身是内部核苷酸间连接。因此对于序列N1YZN2，其中N1和N2每一个独立于另一个是任意单个核苷酸，所述YZ二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接，此外(a)当N1是内部核苷酸的时候，N1和Y通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，(b)当N2是内部核苷酸的时候，Z和N2通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，或者(c)当N1是内部核苷酸的时候，N1和Y通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，并且当N2是内部核苷酸的时候，Z和N2通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连。
据信根据本发明的柔性寡核苷酸与完全稳定的寡核苷酸相比，对核酸酶切割相对敏感。不受特定理论或机制的限制，认为本发明的柔性寡核苷酸相对于全长柔性寡核苷酸可被切割产生具有降低的或没有免疫刺激活性的片段。据信引入至少一个对核酸酶敏感的核苷酸间连接，特别是在所述寡核苷酸中部附近，可以提供一个“关闭开关”，它可以改变所述寡核苷酸的药代动力学，以便减少所述寡核苷酸的最大免疫刺激活性的持续时间。这在希望避免与慢性局部炎症或免疫刺激相关的损伤的组织和临床应用(例如肾)中可具有特殊的价值。
半柔性寡核苷酸是具有部分稳定主链的免疫刺激寡核苷酸，其中仅仅在至少一个内部嘧啶一嘌呤(YZ)二核苷酸内存在磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。半柔性寡核苷酸与相应的完全稳定的免疫刺激寡核苷酸相比，通常具有增强的免疫刺激效力。由于半柔性寡核苷酸的更大效力，在一些实例中，为达到所希望的生物效果，与常规的完全稳定的免疫刺激寡核苷酸相比，半柔性寡核苷酸可以以更低的有效浓度使用，并且具有更低的有效剂量。
认为半柔性寡核苷酸的上述性质通常随着涉及内部YZ二核苷酸的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接的“剂量”的增加而增强。因此认为，例如，通常对给定的具有4个内部YZ二核苷酸的寡核苷酸序列来说，具有4个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间连接的寡核苷酸比具有3个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间连接的寡核苷酸更具免疫刺激效果，后者又比具有2个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间连接的寡核苷酸更具免疫刺激效果，后者又比具有1个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间连接的寡核苷酸更具免疫刺激效果。重要的是，包括甚至1个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间连接，经常可优于没有内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间连接。除了磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接的数目，沿着寡核苷酸长度上的位置分布也可影响效力。
除了在优选的内部位置上的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接之外，柔性和半柔性寡核苷酸通常还包括能抵抗降解的5’和3’末端。这种抵抗降解的末端可以包括任何能使得对核酸外切酶消化的抗性比相应的未修饰末端增强的适当修饰。例如，所述5’和3’末端可以通过在其中包括主链的至少一个磷酸修饰来稳定。在优选的实施方案中，在每个末端所述主链的至少一个磷酸修饰独立地是硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，膦酸甲酯，或甲基硫代磷酸酯核苷酸间连接，在另一个实施方案中，所述可抵抗降解的末端包括一个或多个在3’末端通过肽或酰胺键连接起来的核苷酸单元。
磷酸二酯核苷酸间连接是在自然界中发现的寡核苷酸特征性的连接类型。磷酸二酯核苷酸间连接包括磷原子，其侧翼是两个桥接的氧原子，另外还通过两个额外的氧原子结合，一个带电荷，另一个不带电荷。当缩短寡核苷酸的组织半衰期是重要的时候，磷酸二酯核苷酸间连接是特别优选的。
磷酸二酯样核苷酸间连接是含有磷的桥接基团，其在化学上和/或非对映异构方面与磷酸二酯类似。与磷酸二酯相似性的衡量，包括对核酸酶消化的易感性以及激活RNA酶H的能力。因此，例如磷酸二酯(而不是硫代磷酸酯)寡核苷酸易被核酸酶消化，但是磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸都能够激活RNA酶H。在优选的实施方案中，所述磷酸二酯样核苷酸间连接是boranophosphate(或等同地boranophosphonate)连接。美国专利号5,177,198；美国专利号5,859,231；美国专利号6,160,109；美国专利号6,207,819；Sergueev等，(1998)J Am Chem Soc 120：9417-27。在另一个优选的实施方案中，所述磷酸二酯样核苷酸间连接是非对映纯的Rp硫代磷酸酯。认为非对映纯的Rp硫代磷酸酯比混合的或非对映纯的Sp硫代磷酸酯更容易被核酸酶消化且更好地激活RNA酶H。CpG寡核苷酸的立体异构体是公开的PCT申请PCT/US99/17100(WO00/06588)的主题。应当注意，为本发明的目的，术语“磷酸二酯样核苷酸间连接”特别排除二硫代磷酸酯和膦酸甲酯核苷酸间连接。
如上所述，本发明的柔性和半柔性寡核苷酸可在C和G之间具有磷酸二酯样连接。磷酸二酯样连接的一个例子是Rp构象的硫代磷酸酯连接。寡核苷酸p手性对于CpG寡核苷酸的免疫活性具有明显相反的影响，这取决于活性测量的时间点(Krieg等，2003，Oligonucleotides，13(6)：491-499)。在40分钟的早期时间点，硫代磷酸酯CpG寡核苷酸的Rp(而不是Sp)立体异构体在鼠脾细胞中诱导JNK磷酸化。相反，当在44小时的晚期时间点测定时，Sp(而不是Rp)立体异构体具有刺激脾细胞增殖的活性。这种Rp和Sp立体异构体的动力学和生物活性差异并不是由于细胞摄入的任何差异造成的，而很可能是由于p手性的两种相对的生物学作用。首先，Rp立体异构体与Sp相比在早期时间点具有增强的刺激免疫细胞的活性，表明Rp可能更有效地与CpG受体TLR9相互作用或诱导下游信号传导途径。另一方面，Rp PS-寡核苷酸与Sp相比更快的降解，会导致信号传导的持续时间短得多，使得在较晚时间点检测的时候Sp PS-寡核苷酸表现出更具生物活性。
CpG二核苷酸本身的p手性可获得惊人强烈的效果。与立体随机的CpG寡核苷酸相比，其中单个CpG二核苷酸以Rp相连的同源物活性稍强，但是含有Sp连接的同源物对于诱导脾细胞增殖几乎没有活性。
因此，寡核苷酸可以在主链组成上是异质的，从而含有连接到一起的聚合物单元的任何可能的组合。
术语“寡核苷酸”还包括具有取代或修饰(例如在糖上)的寡核苷酸。例如，它们包括具有在2’部位与除羟基以外的低分子量有机基团共价结合和在5’部位与除磷酸基团或羟基以外的低分子量有机基团共价结合的主链糖的核酸。因此，修饰的寡核苷酸可以包括2′-O-烷基化核糖基团。此外，修饰的寡核苷酸可以包括取代核糖的***糖或2′-氟代***糖等糖。
本发明的免疫刺激寡核苷酸与天然RNA和DNA相比，可以包括各种化学修饰和取代，涉及磷酸二酯核苷酸间桥，或β-D-核糖单元。化学修饰的实例是技术人员所公知的，描述在例如Uhlmann E等(1990)Chem Rev 90：543；″Protocols for Oligonucleotides and Analogs″Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques，S.Agrawal，Ed，Humana Press，Totowa，USA 1993；Crooke ST等，(1996)Annu Rev Pharmacol Toxicol 36：107-129；and Hunziker J等(1995)Mod Synth Methods 7：331-417。与由天然DNA或RNA组成的相同序列的寡核苷酸相比，根据本发明的寡核苷酸可以具有一个或多个修饰，其中每个修饰位于特定的磷酸二酯核苷酸间桥接和/或特定的β-D-核糖单元。
例如，本发明涉及寡核苷酸，其可能含有一个或多个修饰，其中每个修饰独立地选自：
a)用修饰的核苷酸间桥接代替位于核苷酸3’和/或5’端的磷酸二酯核苷酸间桥接，和
b)用去磷酸桥接代替位于核苷酸3’和/或5’端的磷酸二酯桥接。
c)用另一个单元代替糖磷酸主链的糖磷酸单元，和
d)用修饰的糖单元代替β-D-核糖单元。
寡核苷酸的化学修饰的更详细的实施例如下所述：
位于核苷酸3’端和/或5’端的磷酸二酯核苷酸间桥接可以被修饰的核苷酸间桥接替代，其中所述修饰的核苷酸间桥接例如选自：硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，NR1R2-亚磷酰胺，boranophosphate，α-羟苄基膦酸酯，磷酸盐(C1-C21)-O-烷基酯，磷酸盐-[(C6-C12)芳基-(C1-C21)-O-烷基]酯，(C1-C8)烷基膦酸酯和/或(C6-C12)芳基膦酸酯桥接，(C7-C12)-□-羟甲基-芳基(例如WO95/01363中公开的)，其中(C6-C12)芳基，(C6-C20)芳基和(C6-C14)芳基可选地被卤素，烷基，烷氧基，硝基，氰基取代，且其中R1和R2彼此独立地是氢，(C1-C18)-烷基，(C6-C20)-芳基，(C6-C14)-芳基-(C1-C8)-烷基，优选的是氢，(C1-C8)-烷基，优选的是(C1-C4)-烷基和/或甲氧乙基，或者R1和R2与携带它们的氮原子一起形成5-6-元杂环，所述杂环可以另外含有选自O，S和N的其它杂原子。
位于核苷酸3’端和/或5’端的磷酸二酯桥接被去磷酸桥接替代(去磷酸桥接描述在例如Uhlmann E和Peyman A″Methods inMolecular Biology″，Vol.20，″Protocols for Oligonucleotidesand Analogs″，S.Agrawal，Ed.，Humana Press，Totowa 1993，Chapter16，pp.355ff)，其中去磷酸桥接例如选自去磷酸桥接formacetal，3′-thioformacetal，甲基羟胺，肟，亚甲基二甲基-亚肼基，二亚甲基砜和/或甲硅烷基。
糖磷酸主链(即糖磷酸主链由糖磷酸单元组成)上的糖磷酸单元(即β-D-核糖和磷酸二酯核苷酸间桥接一起形成糖磷酸单元)可以被另一个单元替代，其中另一个单元例如适合于构建“吗啉代-衍生物”寡聚物(如例如Stirchak EP等(1989)Oligonucleotides Res 17：6129-41中所述)，也就是说，例如用吗啉代-衍生物单元替代；或者构建聚酰胺寡核苷酸(“PNA″；如例如Nielsen PE等(1994)Bioconjug Chem 5：3-7中所述)，也就是说，例如用PNA主链单元例如用2-氨乙基甘氨酸替代。
β-核糖单元或β-D-2’-脱氧核糖单元可以被修饰的糖单元替代，其中修饰的糖单元例如选自β-D-核糖，α-D-2′-脱氧核糖，L-2′-脱氧核糖，2′-F-2′-脱氧核糖，2′-F-***糖，2′-O-(C1-C6)烷基-核糖，优选地，2′-O-(C1-C6)烷基-核糖是2′-O-甲基核糖，2′-O-(C2-C6)链烯基-核糖，2′-[O-(C1-C6)烷基-O-(C1-C6)烷基]-核糖，2′-NH2-2′-脱氧核糖，β-D-木-呋喃糖，α-***呋喃糖，2，4-二脱氧-β-D-赤-己-吡喃糖，和碳环(在例如Froehler J(1992)Am Chem Soc114：8320中所述)和/或开链糖类似物(在例如Vandendriessche等(1993)Tetrahedron 49：7223中所述)和/或二环糖类似物(在例如Tarkov M等(1993)Helv Chim Acta 76：481中所述)。
在有些实施方案中，所述糖是2’-O-甲基核糖，特别对于通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连的一个或两个核苷酸。
在本文所述的特定序列中，定义了一组修饰的碱基。例如字母Y用于表示含有胞嘧啶或修饰的胞嘧啶的核苷酸。本文使用的修饰的胞嘧啶是天然存在的或非天然存在的胞嘧啶的嘧啶碱基类似物，它可以替代该碱基而不会削弱所述寡核苷酸的免疫刺激活性。修饰的胞嘧啶包括但不限于5-取代的胞嘧啶(例如5-甲基-胞嘧啶，5-氟代-胞嘧啶，5-氯代-胞嘧啶，5-溴代-胞嘧啶，5-碘代-胞嘧啶，5-羟基-胞嘧啶，5-羟甲基-胞嘧啶，5-二氟甲基-胞嘧啶，和未取代的或取代的5-炔基-胞嘧啶)，6-取代的胞嘧啶，N4-取代的胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧啶)，5-氮杂-胞嘧啶，2-巯基-胞嘧啶，异胞嘧啶，假-异胞嘧啶，具有稠环***的胞嘧啶类似物(例如N，N’-亚丙基胞嘧啶或吩噁嗪)，和尿嘧啶和它的衍生物(例如5-氟代-尿嘧啶，5-溴代-尿嘧啶，5-溴乙烯基-尿嘧啶，4-硫代-尿嘧啶，5-羟基-尿嘧啶，5-丙炔基-尿嘧啶)。一些优选的胞嘧啶包括5-甲基-胞嘧啶，5-氟代-胞嘧啶，5-羟基-胞嘧啶，5-羟甲基-胞嘧啶，和N4-乙基-胞嘧啶。在本发明的另一个实施方案中，所述胞嘧啶碱基被通用碱基(例如3-硝基吡咯，P-碱基)，芳香环***(例如氟苯或二氟苯)或氢原子(dSpacer)取代。
字母Z用于表示鸟嘌呤或修饰的鸟嘌呤碱基。本文使用的修饰的鸟嘌呤是天然存在的或非天然存在的鸟嘌呤的嘌呤碱基类似物，它可以替代该碱基而不会削弱所述寡核苷酸的免疫刺激活性。修饰的鸟嘌呤包括但不限于7-去氮鸟嘌呤，7-去氮-7-取代的鸟嘌呤(例如7-去氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤)，7-去氮-8-取代的鸟嘌呤，次黄嘌呤，N2-取代的鸟嘌呤(例如N2-甲基-鸟嘌呤)，5-氨基-3-甲基-3H，6H-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7-二酮，2，6-二氨基嘌呤，2-氨基嘌呤，嘌呤，吲哚，腺嘌呤，取代的腺嘌呤(例如N6-甲基-腺嘌呤，8-氧-腺嘌呤)8-取代的鸟嘌呤(例如8-羟基鸟嘌呤和8-溴代鸟嘌呤)，和6-硫代鸟嘌呤。在本发明的另一个实施方案中，所述鸟嘌呤碱基被通用碱基(例如4-甲基-吲哚，5-硝基-吲哚，和K-碱基)，芳香环***(例如苯并咪唑或二氯-苯并咪唑，1-甲基-1H-[1，2，4]***-3-羧酸酰胺)或者氢原子(dSpacer)取代。
所述寡核苷酸可以具有一个或多个可及的5’末端。能够制备具有两个这样的5’末端的修饰的寡核苷酸。这可以通过例如将两个寡核苷酸通过3’-3’连接相连起来产生具有一个或两个可及的5’末端的寡核苷酸来实现。所述3’-3’连接可以是磷酸二酯，硫代磷酸酯或任意其它修饰的核苷酸间桥接。获得这种连接的方法是本领域已知的。例如，这种连接描述在Seliger，H.；等，Oligonucleotide analogswith terminal 3′-3′-and 5′-5′-internucleotidic linkages asantisense inhibitors of viral gene expression，Nucleotides &Nucleotides(1991)，10(1-3)，469-77和Jiang，等，Pseudo-cyclicoligonucleotides：in vitro and in vivo properties，Bioorganic&Medicinal Chemistry(1999)，7(12)，2727-2735。
此外，其中3’末端核苷酸之间的连接并非磷酸二酯、硫代磷酸酯或其它修饰桥接的3’-3’连接的寡核苷酸可以用另外的间隔物制备，例如三-或四-乙二醇磷酸部分(Durand，M.等，Triple-helixformation by an oligonucleotide containing one(dA)12 and two(dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains，Biochemistry(1992)，31(38)，9197-204，美国专利号5658738，和美国专利号5668265)。或者，非核苷酸连接物可以用标准的亚磷酰胺化学，从乙二醇、丙二醇获得，或得自脱碱基脱氧核糖(dSpacer)单元(Fontanel，Marie Laurence等，Sterical recognition by T4polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5′-attachedto oligonucleotides；Oligonucleotides Research(1994)，22(11)，2022-7)。非核苷酸连接物可以引入一次或多次，或者彼此组合，以使要被连接的两个ODN的3’末端之间具有任意希望的距离。
所述寡核苷酸对降解具有部分抗性(例如是稳定的)。“稳定的寡核苷酸分子”指对于体内降解(例如通过外切或内切核酸酶)相对具有抗性的寡核苷酸。寡核苷酸稳定可以通过主链修饰获得。具有硫代磷酸酯连接的寡核苷酸提供最大的活性，且保护寡核苷酸不被细胞内的外切或内切核酸酶降解。其它修饰的寡核苷酸包括磷酸二酯修饰的寡核苷酸，磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸的组合，膦酸甲酯，甲基硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，对乙氧基，及其组合。在任一或两个末端含有二醇(例如四乙二醇或六乙二醇)的寡核苷酸，也已经显示可以基本上抵抗核酸酶降解。
所述免疫刺激寡核苷酸还可以在核苷酸或核苷酸类似物部分之间含有一个或多个非常规连接。通常的核苷间连接是3′5′-连接。所有其它连接都认为是非常规的核苷间连接，例如2′5′-，5′5′-，3′3′-，2′2′-，2′3′-连接。因此，命名2’到5’是根据核糖的碳原子选择的。但是，如果使用的是非天然糖部分，例如环扩大的糖类似物(例如己糖，环己烯或吡喃糖)或双环或三环糖类似物，则该命名根据单体的命名而变化。在3’-脱氧-β-D-吡喃核糖类似物(也称为p-DNA)中，单核苷酸例如通过4’2’-连接相连。
如果所述寡核苷酸含有一个3’3’-连接，那么这种寡核苷酸可具有两个未连接的5’-末端。类似地，如果所述寡核苷酸含有一个5’5’-连接，那么这种寡核苷酸可具有两个未连接的3’-末端。未连接的核苷酸末端的可及性可更好地被它们的受体接入。这两类非常规的连接(3’3’-和5’5’-)描述在Ramalho Ortigao等(AntisenseResearch and Development(1992)2，129-46)，其中具有3’3’-连接的寡核苷酸据报道对核酸酶切割显示出增强的稳定性。
在一个分子中也可以组合不同类型的连接，这可能导致寡聚物的分枝。如果所述寡核苷酸的一部分在3’-末端通过3’3’-连接与第二寡核苷酸部分相连，在2’-末端通过2’3’-连接与所述分子的第三部分相连，会得到例如具有三个5’-末端的分枝(3’3’-，2’3’-分枝)的寡核苷酸。
Figure A20068003252000431
X是例如：
X是例如：
Figure A20068003252000442
Y是例如：
IV.CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗体联合治疗
本发明涉及联合治疗，其包含共同施用CpG ODN PF 3512676和抗-CTLA-4抗体，优选包含尤其是抗体4.1.1，4.13.1，和11.2.1，10D1(MDX-010)的抗原-结合部分的抗体。在一个实施方案中，将抗-CTLA-4抗体和CpG ODN PF3512676的组合共同施用给患者来治疗癌症。
癌症类型
抗-CTLA-4抗体和CpG ODN PF3512676的组合可以用于治疗原发性和继发性(即，转移性)癌症。更具体地，在许多潜在的治疗选择中，CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4联合治疗可以用于治疗肾细胞癌，乳腺癌，结肠直肠癌，卵巢癌，非小细胞肺癌，黑素瘤，皮肤T-细胞淋巴瘤，和NHL(包括缓慢进展的和侵袭性的)，以及许多其它。尽管这些癌症是优选的，本发明涉及对许多种恶性细胞增殖障碍的治疗，包括、但不限于癌和肉瘤。其它实例包括卡波西肉瘤，滑膜肉瘤，幼红细胞瘤，间皮瘤，肝胆管(肝和胆管)瘤，原发性或继发性脑瘤，肺癌(NSCLC和SCLC)，骨癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，骨癌，***区癌，胃癌，胃肠(胃，结直肠，和十二指肠)癌，结肠癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，子***，***癌，外阴癌，霍奇金病，食道癌，小肠癌，内分泌***癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，***癌，***癌，睾丸癌，慢性或急性髓细胞白血病，慢性或急性淋巴细胞性白血病，淋巴细胞性淋巴瘤，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，胰腺癌，中枢神经***(CNS)肿瘤，包括原发性或继发性CNS肿瘤，原发性CNS淋巴瘤，脊椎肿瘤，脑干胶质瘤，成胶质细胞瘤，脑膜瘤，成肌细胞瘤，星形细胞瘤，垂体腺瘤，肾上腺皮质癌，胆囊癌，多发性骨髓瘤，胆管癌，纤维肉瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，或一种或多种前述癌症的组合。
待治疗的癌症可以是难治的癌症。本文使用的难治的癌症是，对开处的普通护理标准抵抗的癌症。这些癌症可能表现得最初对治疗有反应(然后复发)，或者它们可以对治疗完全不反应。普通护理标准随癌症类型和在受试者中的进展程度而异。它可以是化疗，免疫疗法，手术，或放射，或其组合。本领域普通技术人员知道这样的护理标准。因此，根据本发明治疗难治癌症的受试者可能已经暴露于对其癌症的另一种治疗。或者，如果癌症可能是难治的(例如，鉴于对癌细胞的分析或受试者的病史)，则受试者可能未暴露于另一种治疗。
难治癌症的实例包括、但不限于白血病，黑素瘤，肾细胞癌，结肠癌，肝癌，胰腺癌，非霍奇金淋巴瘤，和肺癌。
治疗类型
本领域技术人员会明白，一旦获知本文公开的教导，本发明包括CpG ODN治疗，联合抗-CTLA-4抗体，连同或序贯(在前或在后)连同手术、放疗或二者，用于治疗癌症。也就是说，各种不同的治疗可以与抗-CTLA-4抗体-CpG ODN PF3512676联合治疗相组合，本领域技术人员在获知本文提供的教导后会明白。
在某些情况下，本发明的方法可以用于替代现有的手术操作或药物治疗，尽管在其它情况下，本发明可以用于提高现有的治疗这些疾病的疗法的功效。因此，联合治疗可以用于治疗正在或将会接受尤其是癌症治疗的受试者。例如，所述试剂可以与另一种抗增殖(例如，抗癌)治疗组合地施用给受试者。合适的抗癌治疗包括手术操作来去除肿瘤块，化疗或局部放射。其它抗增殖治疗可以在本发明的CpG ODNPF3512676/抗-CTLA-4抗体组合治疗之前、同时或之后施用。在施用不同治疗之间，也可以延迟几小时、几天，在有些情况下延迟几周，以便可以在其它治疗之前或之后施用CpG ODN PF3512676/抗-CTLA-4抗体组合。本发明还预见到，在手术、放射或化疗之前和之后，CpG ODNPF3512676/抗-CTLA-4抗体组合在癌症患者中的应用。
因而，本发明包括抗-CTLA-4抗体与CpG ODN PF3512676组合作为新辅助疗法、辅助疗法、一线疗法、二线疗法和/或三线疗法，在癌症的缓解诱导或维持治疗中的应用。也就是说，在一个实施方案中，抗体-CpG ODN PF3512676组合可以作为新辅助疗法，在例如肿瘤(例如，***癌，乳腺癌和肺癌)的手术切除之前共同施用。在另一个实施方案中，抗体-CpG ODN PF3512676组合可以作为新辅助疗法(即，在手术前)和在手术后作为辅助疗法施用。该组合可以用作一线治疗，替代其它试剂(例如，干扰素-α)。
本发明的方法和组合物不仅可以用于未治疗的患者，而且可以用于治疗对其它抗癌疗法(例如但不限于单独(或与其它抗癌剂组合)施用的CpG ODN PF 3512676，或单独(或与其它抗癌剂组合)施用的抗-CTLA-4抗体)部分地或完全地无反应的患者。在不同的实施方案中，本发明提供了可以用于治疗患者的已经显示是或可能是难治的或对治疗不反应的疾病或病症的方法和组合物，其包含施用抗-CTLA-4抗体和/或CpG ODN PF 3512676中的任一种或二者，其中治疗被增强的免疫应答所改善。在一个实施方案中，该方法包含组合CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗体(优选，抗体4.1.1，抗体4.13.1，抗体11.2.1，抗体MDX-010，或其任意组合)。
因而，例如，所述组合可以用于治疗转移性肾细胞癌，在细胞因子-难治的患者中作为二线疗法，在缓慢进展NHL中作为二线疗法(与美罗华进一步组合)，并在进展的NHL中在CHOP-R(环磷酰胺，多柔比星，长春新碱，和***，与美罗华)中作为二线疗法，以及其它。当共同施用抗-CTLA-4抗体-CpG ODN PF3512676组合时，这些疗法的组合也包含在本发明中，例如、但不限于，其中所述组合用于新辅助疗法、辅助疗法、一线疗法、二线疗法和三线疗法或其任意组合。
CpG ODN PF3512676可以与抗-CTLA-4抗体(如上所述)一起用于缓解诱导，然后用单独的CpG ODN PF 3512676进行维持治疗。因而，缓解诱导疗法可能需要一个或多个重复循环的联合CpG ODNPF3512676/抗-CTLA-4抗体疗法。但是，一旦观察到缓解(这将是医学从业人员显而易见的)，受试者可以进行维持治疗。这样的维持治疗可以包含CpG ODN PF3512676的单一疗法。为了维持治疗的目的，CpGODN PF3512676可以每周施用1次或2次，或两周1次，优选皮下。
尽管通过涉及辅助疗法、一线疗法、二线疗法和/或三线疗法的方法例示了本发明，包括施用包含共同施用CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗体的组合，本领域技术人员在获知本文提供的教导后会明白，本发明不限于任何特定疗法。相反，包含组合的CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗体疗法的方法包括在整个疾病和治疗持续期间施用该组合。更具体地，本文公开的新方法可以在转移之前和之后以及为已经变成化疗剂难治的患者提供治疗益处，因为抗体可以增强免疫应答，包括由治疗介导的任意应答以及由CpG ODN PF3512676介导的任意应答。
因而，本发明不限于使用本发明的组合仅用于新辅助疗法；相反，本发明包括整个治疗谱，包括、但不限于，癌症的辅助疗法、一线疗法、二线疗法和/或三线疗法。这是因为，本文公开的数据表明，在治疗过程中的任意时间点，包含抗-CTLA-4抗体的免疫疗法可以单独地或与至少一种其它试剂组合地提供治疗益处。也就是说，通过施用本发明的抗-CTLA-4抗体，可以增强介导肿瘤特异性抗原释放的方法的效力，例如细胞毒性疗法(例如，放射，化疗，等)，其中这样的抗原暴露于免疫***。实际上，本文公开的数据还表明，所述抗体和CpG ODNPF3512676的组合施用会介导协同效应，用于治疗癌症，更具体地，***癌，乳腺癌，CRC，黑素瘤，胰腺癌，肺癌，NSCLC，NHL，RCC，以及其它癌症。因此，本发明提供了用于治疗癌症的重要的新治疗剂，从而增强患者的免疫***，以提供抗肿瘤效果。
在另一个实施方案中，共同施用CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗体组合来增强和/或延长对肿瘤的免疫应答。这是因为，本发明的CpG ODN PF3512676(作为尤其是TLR9激动剂)的抗肿瘤作用和抗-CTLA-4抗体-介导的CTLA-4/B7信号传递的阻断之间可能存在相互作用，这导致比任一种单独的试剂更有效的抗肿瘤效果。因而，不希望受任何特定理论的约束，CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗体的组合可以在肿瘤内诱导比预期更强大的免疫应答。不希望受任何特定理论的约束，由例如B淋巴细胞的激活和提高的抗原呈递细胞(例如，DC)功能介导的CpG ODN PF3512676抗肿瘤效果介导的肿瘤抗原的释放，以及由TLR9的激活介导的其它免疫增强效应，可以增加抗-CTLA-4的免疫治疗效应，包括减少或破坏对这样的抗原的免疫耐受性。这可能是因为，已经证实施用抗体阻断CTLA-4和CpG ODN PF3512676的免疫激活会破坏耐受性(例如，逆转或阻止对肿瘤抗原的无反应性或耐受性)，从而使肿瘤细胞对免疫攻击更敏感。相反，部分地依赖于CTLA-4的调节性T细胞(Treg)的抑制作用，可能限制CpG免疫疗法的有效性，所以用抗-CTLA-4抗体阻断这些效应应当会提高CpG的效能。因而，CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗体的组合可以提供潜在的累加或协同效应，从而提供对癌症的重要的新的治疗性处理。
在一个实施方案中，本发明提供了使用抗-CTLA-4抗体-CpG ODNPF3512676组合来产生或增加抗肿瘤应答的组合物和方法，其中CpGODN PF3512676会增强一定量抗体的抗肿瘤应答，所述抗体量在单独使用时，对于诱导相同水平的抗肿瘤应答是次优的。在某些实施方案中，当CpG ODN PF3512676不与引起抗肿瘤应答的抗体联合使用时，单独施用CpG ODN PF3512676不会产生或增加抗肿瘤应答。在替代实施方案中，CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗体都可以单独地和/或在联合施用时引起抗肿瘤应答。
在某些实施方案中，CpG ODN PF3512676可以以累加方式增强抗-CTLA-4抗体的作用(或者反之亦然)。在一个优选的实施方案中，CpGODN PF3512676会以协同方式增强抗-CTLA-4抗体的作用(或者反之亦然)。在另一个实施方案中，抗-CTLA-4抗体会以累加方式增强CpG ODNPF3512676的作用。优选地，以协同方式增强作用。因而，在某些实施方案中，本发明包括疾病治疗或预防方法，其能提供比施用单独的CpG ODN PF3512676和单独的抗-CTLA-4抗体更好的治疗特性。
本发明包括具有累加效力或累加治疗效应、同时减少或避免不希望的或不利的效应的联合治疗。本发明也包括协同组合，其中治疗效力大于累加，同时减低或避免不希望的或不利的效应。在某些实施方案中，本发明的方法允许治疗或预防疾病和病症，其中通过使用更低剂量和/或更低频率剂量的抗-CTLA-4抗体和/或CpG ODN PF3512676来降低由施用单独的抗-CTLA-4抗体和/或CpG ODN PF3512676造成的不希望的或不利的效应的发生率，同时维持或增强治疗效力，优选地增加患者依从性，改善治疗和/或降低不希望的或不利的效应，由增强的抗肿瘤应答来改善治疗。
V.其它联合治疗
基于本文提供的公开内容，包括给患者施用抗-CTLA-4抗体的免疫增强作用，和共同施用这样的抗体与CpG ODN PF3512676的组合的组合累加或协同效应，本领域技术人员会明白，本发明包括许多联合治疗，其中抗体-CpG ODN PF3512676与至少一种其它治疗剂相组合地施用给患者，从而提供治疗益处。尽管本领域技术人员在获知本文提供的教导后会容易地明白许多这样的组合，现在讨论几种组合。但是，本发明绝不限于这些组合，它们在本文中仅仅用于解释目的。
抗体-CpG ODN PF3512676和其它治疗剂的共同施用(联合治疗)包括共同施用抗-CTLA-4抗体、CpG ODN PF3512676和一种或多种其它治疗剂，也包括共同施用2种或多种分开的药物组合物，一种包含抗-CTLA-4抗体，另一种包含CpG ODN PF 3512676，且其它包含至少一种其它治疗剂。另外，尽管共同施用或联合(共同)疗法通常指抗体、CpG ODN PF3512676和其它治疗剂彼此同时施用，它也包括同时、先后或分开给药该治疗的单个组分。另外，当静脉内施用抗体且经口(例如，化疗剂)或通过皮下或肌肉内注射施用抗癌剂时，应当理解，所述组合优选地作为2种、3种或多种分开的药物组合物来施用。
当哺乳动物进行其它化疗时，本领域众所周知的化疗剂可以与抗-CTLA-4和CpG ODN PF3512676组合使用。另外，可以使用生长因子抑制剂，生物反应修饰剂，烷基化试剂，嵌入抗生素，长春花生物碱，紫杉烷，选择性***受体调控剂(SERMs)，血管发生抑制剂，以及许多治疗剂，下面描述了它们中的一些。
血管发生抑制剂
前面在本文别处已经讨论了血管发生抑制剂与抗-CTLA-4抗体的组合应用。此外，血管发生抑制剂包括、但不限于，贝伐单抗(AVASTIN；Genentech)，VEGF的一种人源化抗体。它可以与5FU组合使用，并用于结肠或直肠的转移性癌患者的一线治疗。直接靶向血管发生因子或它们的受体的试剂会通过打断自分泌受体信号传递，提供在受体-感受性血液恶性肿瘤中的更大活性的前景。贝伐单抗会持续中和循环VEGF，且可以用于治疗骨髓增生异常综合征(MDS)，淋巴瘤，急性髓细胞白血病(AML)，和实体瘤。受体酪氨酸激酶(RTKI)，包括PTK787/ZK222584(Novartis)，正接受治疗AML和其它受体-感受性血液恶性肿瘤的评估。本发明也包括癌症的治疗，例如，肾癌，乳腺癌，非霍奇金淋巴瘤，结肠直肠癌，等，其中使用抗-CTLA-4抗体和CpG ODN PF3512676的组合以及至少一种其它血管发生抑制剂，这样的抑制剂是本领域众所周知的，或可以在将来开发。
因而，抗血管发生剂，例如MMP-2(基质-金属蛋白酶2)抑制剂，MMP-9(基质-金属蛋白酶9)抑制剂，和COX-II(环氧合酶II)抑制剂，可以与本发明的抗体-CpG ODN PF3512676组合联合使用。有用的COX-II抑制剂的实例包括CELEBREXTM(塞来考昔)，伐地考昔，罗非考昔，帕瑞考昔，地拉考昔，SD-8381，ABT-963，艾托考昔，lumiracoxib，BMS-347070，NS-398，RS 57067，美洛昔康。有用的基质金属蛋白酶抑制剂的实例描述在国际专利公开号WO 96/33172；WO 96/27583；WO98/07697，WO 98/03516，WO 98/34918，WO 98/34915，WO 98/33768，WO 98/30566，WO 90/05719，WO 99/52910，WO 99/52889，WO 99/29667，欧洲专利申请号780386(1997年6月25日公开)，97304971.1(1997年7月8日提交)，99308617.2(1999年10月29日提交)，606046(1994年7月13日公开)，931788(1999年7月28日公开)，99302232.1(1999年3月25日提交)，国际申请PCT/I B98/01113(1998年7月21日提交)，英国专利申请号9912961.1(1999年6月3日提交)，美国临时专利申请号60/148，464(1999年8月12日提交)，和美国专利号5,863,949，和5,861,510中。
优选的MMP-2和MMP-9抑制剂是具有微小的抑制MMP-1活性或没有该活性的那些。更优选的是相对于其它基质-金属蛋白酶(即，MMP-1，MMP-3，MMP-4，MMP-5，MMP-6，MMP-7，MMP-8，MMP-10，MMP-11，MMP-12，和MMP-13)会选择性地抑制MMP-2和/或MMP-9的那些。
信号转导抑制剂
可将本文所述的治疗和信号转导抑制剂一起使用，例如可抑制EGFR(表皮生长因子受体)反应的试剂，例如EGFR抗体、EGF抗体，和作为EGFR抑制剂的分子；VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂，例如VEGF受体和可抑制VEGF的分子；和erbB2受体抑制剂，例如可结合erbB2受体的有机分子或抗体，例如HERCEPTIN(Genentech，Inc.，San Francisco，CA)。
在例如国际专利公开号WO 95/19970，WO 98/14451，WO 98/02434，和美国专利号5,747,498中描述了EGFR抑制剂，这些物质可用于此处所描述的本发明。EGFR抑制剂包括，但不限于，单克隆抗体C225、抗-EGFR 22Mab(ImClone Systems Inc.，New York，NY)和ABX-EGF(Abgenix Inc.，remont，CA)、化合物ZD-1839(AstraZeneca)、BIBX-1382(Boehringer  Ingelheim)、MDX-447(Medarexjnc，Annandale，NJ)、和OLX-103(Merck & Co.，Whitehouse Station，NJ)，、VRCTC-310(Ventech Research)和EGF融合毒素(SeragenInc.，Hopkinton，MA)。这些EGFR抑制剂和其它EGFR抑制剂可用于本发明。
旨在抑制表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶(TK)的化合物，代表了在本发明的方法中有效的一类相对新的抗肿瘤药。许多人类癌症在细胞表面上表达EGFR家族的成员。当配体与EGFR结合时，会引起细胞反应级联，导致细胞***增加，并影响癌发生和进展的其它方面，包括血管生成、转移扩散、和抑制细胞凋亡。EGFR-TK抑制剂可以选择性地靶向EGFR家族(EGFR(也称为HER1或ErbB-1)、HER2/neu(也称为ErbB-2)、HER3(也称为ErbB-3)或HER4(也称为ErbB-4))中的一员，或者可以靶向其中的两个或多个。适用于本发明的EGFR-TK抑制剂包括gefitinib(IRESSA)，erlotinib(TARCEVA)，CI-1033(Pfizer)，GW2016(GlaxoSmithKline)，EKB-569(Wyeth)，PKI-166(Novartis)，CP-724，714(Pfizer)，和BIBX-1382(Boeringer-1ngelheim)。其它EGFR-TK抑制剂在2001年6月18日提交的美国专利申请号09/883,752中有所描述。
除了SU11248(Sugen Inc.，San Francisco，CA)以外，VEGF抑制剂也可以与抗体和CpG ODN PF3512676组合联合使用。VEGF抑制剂描述在例如国际专利申请号PCT/IB99/00797(1999年5月3日提交)、国际专利公开号WO 99/24440；WO 95/21613；WO 99/61422；WO98/50356；WO 99/10349；WO 97/32856；WO 97/22596；WO 98/54093；WO 98/02438；WO 99/16755；WO 98/02437；美国专利号5,834,504；5,883,113；5,886,020；和5,792,783。在本发明中有用的一些特殊的VEGF抑制剂的其它例子是IM862(Cytranlnc.，Kirkland，WA)；IMC-1C11 Imclone抗体，Genentech，Inc.，SanFrancisco，CA的抗-VEGF单克隆抗体；以及angiozyme，来自Ribozyme(Boulder，CO)和Chiron(Emeryville，CA)的一种合成核酶。
此外，ErbB2受体抑制剂，例如GW-282974(Glaxo Wellcome pic)，和单克隆抗体AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc.，Woodlands，TX)和2B-1(Chiron)，可以联合抗体-CpG ODN PF3512676组合，例如在国际专利公开号WO 98/02434；WO 99/35146；WO 99/35132；WO98/02437；WO 97/13760；WO 95/19970；美国专利号5,587,458，和5,877,305中描述的那些。在本发明中有用的ErbB2受体抑制剂还描述在EP 1029853(在2000年8月23日公开)和国际专利公开第WO 00/44728号(2000年8月3日公开)。在前述PCT申请、美国专利、和美国临时申请中所述的erbB2受体抑制剂化合物和物质、以及抑制erbB2受体的其它化合物和物质，可以与根据本发明的抗体一起使用。
本发明的治疗还可以与其它在治疗异常细胞生长或癌症中有用的试剂一起使用，包括但不限于，能够增强抗肿瘤免疫应答的其它试剂，例如其它的不同的CTLA4抗体、以及其它也能够阻断CTLA-4的试剂；以及抗增殖剂，例如法呢基蛋白转移酶抑制剂(例如，BMS 214662)，和αvβ3抑制剂例如αvβ3抗体VITAXIN，αvβ5抑制剂，p53抑制剂等。
在将本发明的抗体与其它免疫调节剂联合给药时，免疫调节剂可以选自例如树突细胞激活剂，以及抗原呈递的增强剂、T-细胞向性的增强剂、肿瘤相关的免疫抑制因子的抑制剂，例如TGF-β(转化生长因子β)和IL-10。
IGF-1R抑制剂
本发明包括下述方法，其包含CpG ODN PF3512676与免疫疗法(抗-CTLA-4)的组合与其它试剂和疗法进一步组合。也就是说，本领域技术人员基于本文提供的公开内容能明白，CpG ODN PF3512676疗法和抗-CTLA-4抗体联合治疗可以进一步与许多治疗、手术、放射和其它治疗剂相组合，来治疗患者。
有许多治疗剂，且已经描述在例如，美国专利申请公开号2004/0005318，2003/0086930，2002/0086014，和国际公开号WO03/086459，它们都通过参考引用并入本文，以及其它。这样的治疗剂包括、但不限于，拓扑异构酶I抑制剂；其它抗体(美罗华，曲妥单抗等)；化疗剂例如、但不限于，imatinib(GLEEVEC，GLIVEC，或STI571；Novartis)，sorafenib(BAY 43-9006；Bayer PharmaceuticalsCorp./Onyx Pharmaceuticals)，受体酪氨酸激酶抑制剂，选择性***受体调控剂(SERMs)，紫杉烷，长春花生物碱，替莫唑胺，血管发生抑制剂，EGFR抑制剂，VEGF抑制剂，ErbB2受体抑制剂，抗增殖剂(例如法呢基蛋白转移酶抑制剂和αvβ3抑制剂、αvβ5抑制剂、p53抑制剂等)，免疫调控剂，细胞因子，肿瘤疫苗；肿瘤特异性抗原；树突细胞和干细胞疗法；烷化剂，叶酸拮抗剂；嘧啶拮抗剂；蒽环类抗生素；铂化合物；共刺激分子(例如，CD4，CD25，PD-1，B7-H3，4-1BB，OX40，ICOS，CD30，HLA-DR，MHCII，和LFA)。
放射疗法
放射疗法可以与CpG ODN PF3512676/抗-CTLA-4抗体联合治疗共同施用。放射疗法可以根据已知的用于治疗乳腺癌的放射疗法来进行。用于放射疗法的剂量和方案可以由本领域的技术人员轻易地确定，并且是基于疾病的阶段以及本领域已知的其它因素。
治标剂
本发明还包括，除了第一和第二成分外，在施用一种或多种这些成分的同时或先后，施用其它治疗剂。该治疗剂包括镇痛药、癌症疫苗、抗血管剂、抗增殖剂、止吐剂和止泻剂。优选的止吐剂包括盐酸昂丹司琼、盐酸格拉司琼和甲氧氯普胺。优选的止泻剂包括地芬诺酯和阿托品(LOMOTIL)、洛哌丁胺(IMMODIUM)和奥曲肽(SANDOSTATIN)。
基于干细胞的疗法
本文公开的抗体-CpG ODN PF3512676疗法组合可以与干细胞移植相组合，为癌症患者提供治疗益处。干细胞移植可以根据本领域已知的方法进行。有些这样的方法描述在Appelbaum in Harrison′sPrinciples of Internal Medicine，Chapter 14，Braunwald等，编，第15版，McGraw-Hill Professional(2001)，它通过参考引用并入本文。因而，本发明的方法涉及已接受干细胞移植的哺乳动物中的癌症治疗，该方法包括给哺乳动物施用一定量的人抗-CTLA-4抗体与CpG ODN PF3512676组合，该抗体-CpG ODN PF3512676疗法组合与干细胞移植进一步组合，对治疗癌症有效。
当所述方法包含干细胞移植时，可在哺乳动物的免疫***已从移植中恢复后，例如在移植后1至12个月的时间段，施用第一剂抗体-CpGODN PF3512676治疗试剂组合。在某些实施方案中，在移植后的1至3个月、或1至4个月的时间段，施用第一剂。患者可接受干细胞移植和预备治疗。
本发明也涉及哺乳动物中的癌症的治疗方法，其包括步骤(i)在哺乳动物中进行干细胞移植，和(ii)施用有效量的人抗-CTLA-4抗体与有效量的CpG ODN PF3512676组合。优选地，所述哺乳动物是人。干细胞移植可以是同种异体干细胞移植或自体干细胞移植。此外，细胞移植包括淋巴细胞从相同患者和/或HLA-匹配供体的过继转移。
此外，本发明的方法可以与放射疗法和干细胞移植相组合，以及与本文所述的、本领域已知的或将来开发的任意治疗的任意组合相组合。
如本文前面别处指出的，当抗-CTLA-4抗体与标准的癌症治疗(例如，尤其是，化疗方案)相组合时，可以减少施用的化疗剂的剂量(Mokyr，M.等Cancer Research 58：5301-5304(1998))。这是因为，本文公开的用于治疗癌症的抗-CTLA-4抗体和免疫增强核苷酸(例如CpG ODN PF3512676)的组合应用，可以介导细胞死亡，或以其它方式提供CTLA-4阻断和核苷酸的TLR9激动作用之间的协同效应。不希望受任何特定理论的约束，被抗-CTLA-4抗体、CpG ODN PF3512676、或其组合增强或延长的免疫应答介导的肿瘤细胞死亡，可能在抗原呈递途径中产生增加水平的肿瘤特异性抗原，且抗-CTLA-4抗体会介导对其增强的免疫应答，从而CpG ODN PF3512676和抗体的共同施用会介导针对肿瘤抗原的免疫应答的累加或协同的增加。可以通过肿瘤特异性抗原的细胞死亡释放导致与抗-CTLA-4-CpG ODN PF3512676协同增强免疫应答的其它联合治疗是，放射，手术，化疗，和施用本领域熟知的和本文例示的多种抗肿瘤剂，以及其它。这些方案和本文别处所述的其它方案中的每一种，会通过肿瘤细胞死亡(这可能将肿瘤抗原供给宿主抗原呈递途径)，在宿主中建立肿瘤特异性抗原的来源。因此，本文公开的联合治疗可以提供增加的肿瘤特异性抗原的来源，从而提供增加的对肿瘤的免疫应答，这又为患者提供治疗益处。
VI.给药方案
可调整给药方案以提供最适合的想要的反应。例如，可施用单次推注，在一段时间可施用几个分开的剂量，或可根据治疗状况的紧急按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外施用的组合物以方便施用和统一剂量是特别有利的。此处使用的剂量单位形式是指物理上分开的单位，其适合作为用于被治疗的哺乳动物受试者的单位剂量；每一个单位含有经计算可产生想要的治疗效果的预先确定量的活性化合物以及所需的药物载体。本发明的剂量单位的规格受制于并直接依赖于(a)抗体的独特性质和要达到的特定治疗性或预防性效果，和(b)配制这种活性化合物用于治疗个体内的敏感性领域内内在的限制。
因而，本领域技术人员基于本文提供的公开内容会明白，根据治疗领域众所周知的方法可以调节剂量和给药方案。也就是说，可以容易地确立最大耐受剂量，也可以确定为患者提供可检测的治疗益处的有效量，正如可确定施用每种试剂来为患者提供可检测的治疗益处的暂时需要。因此，尽管本文例示了某些剂量和给药方案，这些实例绝不限制在实践本发明时可以为患者提供的剂量和给药方案。此外，本领域技术人员在获知本文提供的教导后会明白，通过本领域已知的评判癌症治疗效能的多种方法，和本文包括的这些方法，以及将来开发的方法，可以评判治疗益处，例如、但不限于，可检测的肿瘤大小和/或转移的减少，和复发时间的增加，以及许多其它参数。
要注意的是，剂量值可根据待缓和的病症的类型和严重性来变化，并且可包括单一或多个剂量。可以进一步理解，对于任何特定受试者，应该根据个体所需和施用或监督该组合物给药的人的专业判断来随着时间调整具体的给药方案，这里所列的剂量范围只是用于示例，而并非要限制要求保护的组合物的范围或实施。例如，可以基于药代动力学的或药效学的参数来调节剂量，这可以包括临床效应，例如毒性效应和/或实验室值。因而，本发明包括患者内的剂量增加，如本领域技术人员所确定的。确定抗体的适宜剂量和给药方案，是相关领域众所周知的，且本领域技术人员在获知本文公开的教导后可以理解。
ODN给药
根据本领域众所周知的标准给药方案，可以施用CpG ODNPF3512676。用于粘膜或局部递送的CpG ODN PF3512676施用剂量通常是约1μg-100mg/给药，这取决于应用可每天、每周或每月给予，和其间的任何其它时间量。更典型地，粘膜或局部剂量范围是约100μg-50mg/给药，最典型约1-10mg，施用2-4次，间隔数天或数周。
用于诱导全身免疫应答目的的肠胃外递送的本文所述化合物的施用剂量可典型地是有效粘膜剂量的2-1,000倍，更典型地2-100倍，最典型地5-50倍。
当与其它治疗剂(例如本发明的抗体)组合施用CpG ODNPF3512676时，或在专门的递送载体中时，用于诱导免疫应答的肠胃外(包括皮下)递送的CpG ODN PF3512676的剂量范围通常是约10μg-1000mg/给药，这取决于应用可每天、每周或每月给予，和其间的任何其它时间量。更典型地，用于这些目的的肠胃外剂量范围是约1-500mg/给药，最典型约5-100mg，施用2-4次，间隔数天或数周。但是，在有些实施方案中，可以以上述典型剂量的5-10,000倍的范围，使用用于这些目的的肠胃外剂量。
在有些实施方案中，以共10-40mg的量，每周施用ODN一次。可以以每次5或10mg的剂量施用ODN，从而导致多次推注或注射，这取决于要施用的总量。例如，如果要施用的总量是10mg，这可以通过例如2×5mg注射剂量来施用。作为另一个实例，如果要施用的总量是40mg，这可以通过例如4×10mg注射剂量来施用。
抗体给药
根据本发明施用的抗体的治疗有效量的示例性非限制性范围是，至少约0.1mg/kg，至少约0.3mg/kg，至少约1mg/kg，至少约5mg/kg，至少约6mg/kg，至少约10mg/kg，至少约15mg/kg，至少约20mg/kg，至少约30mg/kg，或至少约50mg/kg。例如，抗体的治疗有效量范围可以是约0.1-30mg/kg，或例如约0.3-25mg/kg，或例如约1-20mg/kg，或例如约3-20mg/kg，或例如约5-20mg/kg，或例如约10-20mg/kg，或约3-15mg/kg，或约5-15mg/kg，或约10-15mg/kg。
在另一个实施方案中，抗体的施用剂量是至少0.3mg/kg，优选至少1mg/kg，更优选至少3mg/kg，更优选至少5mg/kg，优选至少6mg/kg，更优选至少10mg/kg，更优选至少15mg/kg，和更优选至少20mg/kg。
此外，通过静脉内输注施用的抗体的剂量范围是约0.1mg/kg-50mg/kg，更优选约0.3mg/kg-20mg/kg，更优选约1mg/kg-15mg/kg、更优选约3mg/kg-15mg/kg，更优选约6mg/kg-15mg/kg。在一个实施方案中，以作为无菌水溶液的静脉内制剂施用抗体，所述溶液含有在适当缓冲***中的约5-20mg/ml抗体。
此外，示例性的剂量增加方案可以用于确定最大耐受剂量(MTD)，评判与施用抗体-CpG ODN PF3512676联合治疗有关的剂量限制毒性(DLT)(如果存在)等，其包含施用递增的剂量，例如、但不限于约0.1mg/kg，0.3mg/kg，1mg/kg，3mg/kg，6mg/kg，7mg/kg，10mg/kg，12mg/kg，15mg/kg，或超过15mg/kg，或其任意组合，更优选地，施用0.1mg/kg，0.3mg/kg，1mg/kg，3mg/kg，6mg/kg，10mg/kg，15mg/kg或20mg/kg的连续剂量，并评判患者的毒性(如果存在)，以及治疗效力，以及其它参数。这样的测定剂量方案的毒性和效能的研究是本领域众所周知的。
施用时间
CpG ODN PF3512676可以与本发明的抗-CTLA-4抗体基本上同时或先后施用。当同时施用时，ODN和抗体可以在相同或分开的制剂中，尽管它们在同时施用。术语″基本上同时″是指，化合物在彼此相隔数分钟内施用(例如，彼此相隔10分钟内)，且意在包括间断给药和连续给药，但是如果连续给药，间隔时间仅仅是短时间段(例如，医学从业人员分别施用2种化合物所需的时间)。本文使用的同时施用和基本上同时施用可互换使用。先后施用指在时间上分开施用ODN和抗体。施用这些化合物之间的时间间隔有意地长于彼此紧接着、没有故意延迟地分别施用2种药物所需的时间。因而，共同施用包括施用抗体和CpG ODN PF3512676的任意时间组合，使得二者的施用会介导对患者的治疗益处，它可检测地大于在没有另一种试剂的情况下施用任一种试剂。
CpG ODN可以在施用抗体之前、同时或之后(或其任意组合)施用，反之亦然。CpG ODN可以每天(包括每天施用一次或多次)、隔天、每3天、每4天、每5天、每6天、或每周、每月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、或每年施用。抗体可以每天、隔天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周、每2周、每月、或每20天、每25天、每28天、每30天、每40天、每50天、每2个月、每70天、每80天、每3个月、每6个月、或每年施用。可以施用单个剂量或多个剂量的抗体。或者，可以施用至少一个剂量、或至少3、6、或12个剂量。例如可以施用多个剂量。ODN和抗体的施用可以交替。
在一个实施方案中，部分剂量通过静脉推注给药，剩余的通过抗体制剂的输注给药。例如，抗体的静脉内注射可以以推注实现，剩余的预定抗体剂量可以通过静脉内注射给药。预定剂量的抗体可以在例如约1.5小时至约5小时的期间内给药。
在一个实施方案中，CpG ODN PF3512676和抗体共同施用，其中CpG ODN PF3512676以本文所述的剂量施用，优选肠胃外(例如，通过皮下或静脉内途径)。在另一个实施方案中，首先施用抗-CTLA-4抗体来阻断会限制CpG ODN的效能的抑制作用。在该实施方案中，抗-CTLA-4抗体的给药优选地在CpG ODN之前1周-1天，最优选在CpG ODN之前2-3天。
在另一个实施方案中，首先施用CpG ODN来引发免疫***，以具有对抗-CTLA-4抗体和任意其它免疫疗法或可与其联合施用的其它疗法(例如，肿瘤疫苗等)更好的免疫激活应答。在该实施方案中，CpG ODN的给药优选地在抗-CTLA-4抗体之前1周-1天，最优选在抗-CTLA-4抗体之前2-3天。
尽管在施用CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗体之间可以使用任意合适的静止期，本发明不需要等待期，抗体和CpG ODN PF3512676可以基本上同时地共同施用。因而，在一个实施方案中，抗体作为单次注射来施用，CpG ODN PF3512676在抗体之前或之后约1-7天施用。
在多天或多周周期中，抗体或抗体片段可以与CpG ODN PF3512676一起施用。多天周期是2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多天的周期，或2，3，4或更多周的周期。抗体或其片段可以在这样的周期的首日施用，随后在多周周期的每周的首日施用CpG ODN PF3512676。例如，CpG ODN PF3512676可以在3周周期的第1，7和14天施用。3周周期可以重复1、2、3次或更多次。在整个治疗之前，可以施用单独的ODN或抗体，例如用于引发免疫***或使受试者对随后的治疗更有反应。
如通过本领域公知的方法所确定的，可以提供额外周期的抗体和CpG ODN PF3512676。但是，本发明不限于施用CpG ODN PF3512676与抗-CTLA-4抗体组合的这些或任何特定剂量或给药方案。相反，相关领域普通技术人员使用众所周知的方法，可以容易地确定施用抗体和CpG ODN PF3512676的最佳剂量、途径和方案。
抗体-CpG ODN PF3512676组合可以作为新辅助疗法，在手术、放疗或任何其它治疗之前施用，以便敏化肿瘤细胞或以其它方式赋予患者治疗益处。另外，该组合可以作为新辅助疗法在局部治疗(例如，手术，放射，或二者)后共同施用。
此外，该组合可以作为二线疗法来施用，例如、但不限于，一旦任意一线疗法已经失败。或者，该组合可以与一线疗法同时施用，和或在一线疗法期间的任意点，其可以在初始治疗后施用。
这是因为，一旦一线疗法已经失败，一旦全身性的辅助疗法已经失败等，抗-CTLA-4抗体和CpG ODN PF3512676的组合可以提供治疗益处。因而，本发明包括联合施用抗体和CpG ODN PF3512676，含或不含其它疗法，包括、但不限于，激素(例如，抗雄激素，芳香酶抑制剂，等)，放疗，和任意其它治疗剂(化疗，信号抑制疗法，以及其它)等，本领域技术人员基于本文提供的公开内容会明白。
VII.药物组合物
本发明也涉及制品(例如适合静脉内施用的剂型)，其包含对治疗癌症有效量(例如，至少1mg/kg，至少3mg/kg，至少5mg/kg，至少10mg/kg，至少15mg/kg，或至少20mg/kg)的人抗-CTLA-4抗体和治疗有效量的CpG ODN PF3512676。在某些实施方案中，制品包含装载人抗-CTLA-4抗体、CpG ODN PF3512676的一个或多个容器和用于治疗癌症的标签和/或说明书。
本发明包括制备和使用如下药物组合物，其包括本发明的人抗-CTLA-4抗体作为活性成分，并联合或不联合CpG ODN PF3512676。该药物组合物可以由单独的每种活性成分组成，作为至少一种活性成分的组合(例如，有效剂量的抗-CTLA-4、有效剂量的CpG ODNPF3512676)，以适合患者给药的形式，或者该药物组合物可含有活性成分和一种或多种药学可接受的载体、一种或多种附加(活性和/或非活性)成分、或其某些组合。
CpG ODN PF3512676可以直接施用给受试者，或可以与核酸递送复合物联合施用。核酸递送复合物是指与靶向工具(例如导致更高的结合靶细胞的亲和力的分子)结合的(例如离子地或共价地结合；或包裹在其中)核酸分子。核酸递送复合物的实例包括与甾醇(例如胆固醇)、脂质(例如阳离子脂质，病毒颗粒或脂质体)、或靶细胞特异性结合剂(例如由靶细胞特异性受体识别的配体)结合的寡核苷酸。优选的复合物在体内足够稳定，以防止在被靶细胞内化之前显著的解偶联。但是，复合物可以在适当条件下在细胞内切割，使核酸以功能形式释放。
已经描述了用于将抗原和寡核苷酸递送至表面的递送载体或递送装置。CpG ODN PF3512676和/或抗原和/或其它治疗剂可以单独施用(例如，在盐水或缓冲液中)，或使用本领域已知的任意递送载体。例如，已经描述了下述递送载体：Cochleates；Emulsomes，ISCOM；脂质体；活细菌载体(例如，沙门氏菌，大肠杆菌，Bacilluscalmatte-guerin，志贺氏菌，乳杆菌)；活病毒载体(例如，痘苗病毒，腺病毒，单纯疱疹)；微球；寡核苷酸疫苗；聚合物；聚合物环；蛋白体；氟化钠；转基因植物；病毒颗粒；病毒样颗粒，和阳离子脂质，肽，或与多阴离子寡核苷酸具有电荷相互作用的其它载体。其它递送载体是本领域已知的，有些其它实例在下面载体的讨论中提供。
在一个实施方案中，肠胃外(例如，静脉内)施用在含水溶液中的抗体，而通过皮下注射施用CpG ODN PF3512676。CpG ODN PF3512676的优选制剂和剂型描述在美国专利申请公开号US2004/0198680，它的公开内容整体通过参考引用并入本文。但是，基于本文提供的公开内容，技术人员可以理解本发明不限于这些或任何其它制剂、剂量、给药途径等。相反，本发明包括施用抗体与CpG ODN PF3512676组合的任何制剂或方法，包括但不限于，经过不同的给药途径分别以不同制剂分开施用每种活性剂，例如，静脉内施用抗-CTLA-4抗体，同时皮下共同施用CpG ODN PF3512676，以及其它。因此，接下来的讨论描述了各种不同的制剂，用于实施本发明的方法，包括联合CpG ODNPF3512676的任意抗-CTLA-4抗体的给药，但是本发明不限于这些制剂，而是包括本领域技术人员在具有本文所提供的用于本发明的方法的教导后能轻易确定的任何制剂。
可将用于本发明的抗体掺入适合施用给受试者的药物组合物中。一般地，该药物组合物包含抗体和药学可接受的载体。如此处所用的，“药学可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学可接受的载体的例子包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、海藻糖、甘油、乙醇等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，优选地在组合物中包含等渗剂，例如，糖类、多元醇例如甘露糖醇、山梨醇或氯化钠。药学可接受的物质例如润湿剂或少量辅助物质例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，会增加抗体或抗体部分的保质期或效力。
所述抗体可以各种形式存在。这些形式包括，例如，液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射和可输注的溶液)、分散体或悬浮物、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的形式依赖于想要的施用和治疗应用模式。一般优选的组合物以可注射的或可输注的溶液的形式存在，例如和用于利用其它抗体进行的人被动免疫的组合物相似的组合物。优选的施用模式是肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)模式。在优选的实施方案中，通过静脉内输注或注射施用抗体。在其它优选的实施方案中，通过肌内或皮下注射施用抗体。
在生产和贮存条件下，治疗性组合物一般必须是无菌的和稳定的。可将组合物配制为溶液、微乳、分散体、脂质体或其它适合高药物浓度的有序结构。可通过将抗体以所需要的量掺入具有上面例举的成分之一或其组合的合适溶剂中，如所要求的，然后进行过滤灭菌来制备无菌的可注射溶液。一般地，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，所述载体包含基本的分散介质和所需要的来自上述成分的其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，由事先无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何额外的所需成分的粉末。可通过例如使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过保持所要求的颗粒大小以及通过使用表面活性剂来保持溶液的合适的流动性。可通过将延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐或明胶包括入组合物中带来可注射组合物的延长吸收。
可通过各种本领域已知的方法施用抗体和/或CpG ODNPF3512676，所述方法包括，但不限于，口服、肠胃外、粘膜、经吸入、局部、***、鼻和直肠。对于许多治疗性应用，优选的施用途径/模式是经皮下、肌内、静脉内或输注。如果需要，可使用无针注射。如本领域技术人员所意识到的，施用的途径和/或模式将依所想要的结果而发生变化。
可调整给药方案以提供最适合的想要的反应。例如，可施用单次推注，在一段时间可施用几个分开的剂量，或可根据治疗状况的紧急按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外施用的组合物以方便施用和统一剂量是特别有利的。此处使用的剂量单位形式是指物理上分开的单位，其适合作为用于被治疗的哺乳动物受试者的单位剂量；每一个单位含有经计算可产生想要的治疗效果的预先确定量的活性化合物以及所需的药物载体。本发明的剂量单位的规格受制于并直接依赖于(a)抗体的独特性质和要达到的特定治疗性或预防性效果，和(b)配制这种活性化合物用于治疗个体内的敏感性领域内内在的限制。
要注意的是，剂量值可根据待缓和的病症的类型和严重性来变化，并且可包括单一或多个剂量。可以进一步理解，对于任何特定受试者，应该根据个体所需和施用或监督该组合物给药的人的专业判断来随着时间调整具体的给药方案，这里所列的剂量范围只是用于示例，而并非要限制要求保护的组合物的范围或实施。
在一个实施方案中，抗体作为含有5或10mg/ml抗体、以及乙酸钠、聚山梨酯80和氯化钠的无菌水溶液(pH范围在大约5至6)，以静脉内制剂的形式给药。优选地，静脉内制剂是含有5或10mg/ml抗体、以及20mM乙酸钠、0.2mg/ml聚山梨酯80和140mM氯化钠的无菌水溶液(pH为5.5)。
在一个实施方案中，部分剂量通过静脉内推注给药，剩余的通过抗体制剂的输注给药。例如，0.01mg/kg抗体静脉注射可以以推注实现，剩余的预定抗体剂量可以通过静脉注射给药。预定剂量的抗体可以在例如1.5小时至2小时至5小时的期间内给药。
本文所描述的药物组合物的制剂可以通过药学领域己知或以后将开发的方法来制备。通常，该制备方法包括如下步骤：将活性成分加入载体或一种或多种其它助剂，随后，如果需要或希望，将产品定型或包装成为希望的单一或多剂量单位。
本发明的药物组合物可以作为单一单位剂量、或作为多个单一单位剂量制备、包装或销售。如此处所使用的，“单位剂量”是含有预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常相当于要给予受治疗者的活性成分的剂量或该剂量的适宜部分，例如，该剂量的一半或三分之一。
本发明的药物组合物中的活性成分、药学可接受的载体和任何附加成分的相对量，根据要治疗的受治疗者的身份、大小和病症而变化，并进一步根据组合物的给药途径而变化。作为例子，该组合物可含有介于0.1％到100％(w/w)的活性成分。
除了活性成分之外，本发明的药物组合物可以进一步含有一种或多种其它的药物活性剂。特别预期的附加活性剂包括止吐剂、止泻剂、化疗剂、细胞因子等。
本发明的药物组合物的控释或持续释放制剂可以使用传统技术来制备。
如本文所使用的，药物组合物的“胃肠外给药”包括以下任何给药途径，其特征在于：物理地突破受治疗者的组织，并将药物组合物经过组织的破口给药。因此胃肠外给药包括但不限于，药物组合物通过注射组合物、通过手术切口应用组合物、通过穿透组织的非手术伤口应用组合物等的给药。特别地，预计胃肠外给药包括但不限于，皮下、腹膜内、肌内、胸骨内注射、以及肾透析输注技术。
适合胃肠外给药的药物组合物的制剂，包含活性成分与药学上可接受的载体组合，例如无菌水或无菌等渗盐水。这样的制剂可以以适合推注给药或连续给药的形式来制备、包装或销售。注射制剂可以单位剂量形式制备、包装或销售，例如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。用于胃肠外给药的制剂包括但不限于，悬液、溶液、在油性或水性媒介中的乳液、糊剂、以及可植入的持续释放或生物可降解的制剂，如下所讨论的。这类制剂可进一步含有一种或多种附加成分，包括但不限于助悬剂、稳定剂或分散剂。在胃肠外给药的制剂的一个实施方案中，在重配组合物的胃肠外给药之前，活性成分以干(即，粉末或颗粒)形式提供，以与合适的媒介(例如，无菌无热原水)进行重配。
本发明的组合物可以通过本领域已知的各种方法给药。给药的途径和/或模式取决于预期的结果而变化。活性化合物可以与保护化合物防止快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入剂、透皮贴剂、和微囊化递送***。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多关于这类制剂的制备方法描述在，例如Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1978)。药物组合物优选在GMP条件下生产。
药物组合物可以以无菌可注射水性或油性悬液或溶液的形式制备、包装或销售。该悬液或溶液可以根据已知技术来配制，并且可含有除了活性成分之外的添加成分，例如本文所述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。该无菌注射制剂可以使用无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂例如水或1，3-丁二醇来制备。其它可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于，林格氏溶液、等渗氯化钠溶液、和例如合成的单酸或二酸甘油酯的不挥发性油。其它有用的胃肠外给药的制剂包括如下制剂：其含有微晶形式、脂质体制剂形式的活性成分，或作为生物可降解聚合物***的成分。用于持续释放或植入的组合物可以含有药学上可接受的聚合性或疏水性材料，例如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物、或微溶盐。
本发明的抗-CTLA-4抗体/CpG ODN PF3512676活性成分组合可以施用给动物，优选人。施用的每种活性成分的准确剂量根据许多因素而变化，包括但不限于，动物的类型和要治疗的疾病状态的类型、动物的年龄和给药途径。
本发明的抗体-CpG ODN PF3512676组合可以与多种其它化合物(尤其是抗激素治疗剂、细胞因子、化疗和/或抗病毒药物)共同给药。或者，化合物可以在抗体-CpG ODN PF3512676组合之前一小时、一天、一周、一月或甚至更长时间给药，或其任意排列。而且，化合物可以在给予放射、干细胞移植、或给予任何治疗剂(例如细胞因子、化疗化合物等)之后一小时、一天、一周、一月或甚至更长时间给药，或其任意排列。频率和给药方案对于本领域技术人员而言显而易见，并且取决于许多因素，例如但不限于，要治疗的疾病的类型和严重程度、动物的年龄和健康状况、要给予的化合物的特性、不同化合物的给药途径等。提供了展示共同施用抗体-CpG ODN PF3512676来治疗癌症的方法的几个有教益的实施例，但是本发明绝不限于这些实施例，它们仅仅用于解释本发明包括的方法。
VIII.药盒
本发明包括各种用于治疗癌症的药盒，所述药盒包括治疗有效量的本发明的人抗-CTLA-4抗体和治疗有效量的CpG ODN PF3512676，以及施药器和指导材料，该指导材料描述了该组合实现本发明方法的应用。尽管在下文描述了示例性的药盒，根据本发明公开的内容，其它有用的药盒的内容物对于本领域技术人员是显而易见的。这些药盒中的每一种均包括在本发明内。
木发明包括用于治疗有此需要的患者的肾细胞癌的药盒。该药盒包括本发明的人抗-CTLA-4抗体和CpG ODN PF3512676。该药盒还包括施药器，包括但不限于注射器，用于将药盒的成分给予患者。而且，该药盒含有指导材料，其列出关于应用该药盒治疗患者的乳腺癌的有关信息。
更优选地，该药盒包括至少一种抗-CTLA-4抗体，其选自4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，12.9.1.1，和MDX-010，更优选地，抗体是4.13.1，11.2.1，和MDX-010。
本发明包括，含有抗-CTLA-4抗体和CpG ODN PF3512676的任意组合的药盒。尽管这样的药盒是优选的，本发明不限于该特定组合。此外，所述药盒可以包含许多用于治疗癌症的其它试剂。这样的试剂如前面所述，包括化疗化合物，癌症疫苗，除了CpG ODN PF3512676以外的TLR激动剂，其它CpG ODN，受体酪氨酸激酶抑制剂(例如、但不限于，SU11248)，用于治疗异常细胞生长或癌症的试剂，通过结合IGF-1R来抑制肿瘤生长的抗体或其它配体，化疗剂(紫杉烷，长春花生物碱，铂化合物，嵌入抗生素，以及其它)，和细胞因子，以及其它，以及用于治疗例如在治疗过程中产生的任意毒性的治标剂，例如、但不限于，止泻剂，止吐剂，等。
通过参考以下实验实施例来进一步详细描述本发明。这些实施例仅仅用于解释目的，不是用于限制，除非另有说明。因此，本发明决不能被解释为限于以下实施例，而应被解释为包括从本文所提供的教导而显而易见的任何和所有变化。
实施例1：
抗-CTLA-4抗体与CpG ODN PF3512676组合用于治疗乳腺癌
在手术/放疗(如果存在)后，按照确立的方案，给至少一个病损可通过常规CT扫描或螺旋CT扫描精确地二维测量的患有转移性乳腺癌的患者施用CpG ODN PF3512676。简而言之，以0.02-20mg/kg，最优选皮下约0.2mg/kg和静脉内2mg/kg的剂量，皮下或静脉内施用CpG ODN PF3512676。
在CpG ODN PF3512676治疗之前7天或之后7天之间，以约10mg/kg的剂量，另外给患者施用单次静脉内输注(100mL/小时)本文所述的抗-CTLA-4抗体11.2.1。28天后重复抗体治疗，不升高抗-CTLA-4抗体剂量，此后在没有不可耐受的毒性或疾病进展的情况下，每28天重复一次，最多12个循环。
在输注抗-CTLA-4之前至少1.5小时，可给患者预先给药抗组胺药(H1)。但是，尽管可以施用预先给药，优选地，通常不对患者预先治疗。更优选地，给经历输注反应的患者施用抗组胺药(H1)和/或其它治疗措施。
在治疗过程中和之后，在适当时给予止吐剂和止泻剂以及其它治标疗法。
根据所确定的，与人抗-CTLA-4抗体11.2.1先后或同时施用CpGODN PF3512676一次或反复多次。
抗-CTLA-4抗体提供在带有橡胶塞子和铝封的10ml透明玻璃小瓶内。每个小瓶含有5mg/ml(标称装量为50mg/小瓶)抗-CTLA-4抗体的无菌水溶液，所述水溶液含有20mM乙酸钠、0.2mg/ml聚山梨酯80、和140mM氯化钠，pH 5.5。
CpG ODN PF3512676以多种不同浓度提供在药学可接受的无菌的无防腐剂的磷酸盐缓冲盐水溶液中，用于肠胃外给药。
如临床上要求的那样，对于所有患者，在给药前评估ECOG性能状态、生命体征以及体重，用药后可以重复评估生命体征。在第一天进行身体检查(包括眼科评估和自身免疫体征)。获得用于血液学板(血细胞比容、RBC计数、WBC计数、分类)、化学(碱性磷酸酶、钙、氯、GGT、LDH、镁、磷、随机葡萄糖、钠、尿素、尿酸)、尿分析(血、蛋白)、其它(活化部分凝血激酶时间[APTT]、凝血酶原时间(PT)、自身抗体板、C反应蛋白、TSH、T3、T4、淀粉酶、脂肪酶、血清C3、C4、血清Ig水平)的样品。
测定人抗-人抗体(HAHA)滴度基线，并在用药前获得药代动力学(PK)标本。
测量下列端点：PK参数、HAHA、反应速率和进展时间。进展时间和总的生存率用Kaplan-Meier乘积极限法计算。
等同方案
尽管本发明参照特定的实施方案被公开，但很明显，本领域技术人员可设计本发明的其它实施方案和变化，而不背离本发明的真实实质和范围。所附的权利要求应当理解为包括所有这些实施方案和等同的变化。
本文引用的每篇专利、专利申请和公开出版物的公开内容，整体通过参考引用并入本文。
序列表
<110>Coley Pharmaceutical Group，Inc.
Pfizer Inc.
<120>用于癌症治疗的抗-CTLA-4抗体和含有CpG基序的合成寡脱氧核苷酸联合治疗
<130>C1037.70063WO00
<140>unassigned
<141>herewith
<150>US 60/697082
<151>2005-07-07
<160>37
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1380
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>1
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<400>2
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Ser His Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
                85                  90                  95
Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly His Phe Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
        115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
    130                 135                 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
145                 150                 155                 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
                165                 170                 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
            180                 185                 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
    210                 215                 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys
225                 230                 235                 240
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
                245                 250                 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
            260                 265                 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
        275                 280                 285
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
    290                 295                 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser
305                 310                 315                 320
Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
                325                 330                 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
        355                 360                 365
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
    370                 375                 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
385                 390                 395                 400
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser
                405                 410                 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
            420                 425                 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
        435                 440                 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455                 460
<210>3
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>3
Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
1               5                   10                  15
Gly Phe Thr Phe Ser Ser His Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
            20                  25                  30
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn
        35                  40                  45
Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
    50                  55                  60
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly His Phe Gly Pro Phe
    85                  90                  95
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
100                 105                 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
                115                 120                 125
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
    130                 135                 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145                 150                 155                 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165
<210>4
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>4
Gly Phe Thr Phe Ser Ser His Gly Met His
1               5                   10
<210>5
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>5
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1               5                   10                  15
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>6
Gly Gly His Phe Gly Pro Phe Asp Tyr
1               5
<210>7
<211>708
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>7
atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga     60
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc    120
ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agcagcttct tagcctggta ccagcagaga    180
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca    240
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag    300
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta cctcaccctg gacgttcggc    360
caagggacca aggtggaaat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg    420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc    480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc    540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg    600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag    660
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag                 708
<210>8
<211>235
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>8
Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1               5                   10                  15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser
            20                  25                  30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Ile Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala
    50                  55                  60
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro
65                  70                  75                  80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                85                  90                  95
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
            100                 105                 110
Gly Thr Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
        115                 120                 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
    130                 135                 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145                 150                 155                 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val  Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
            180                 185                 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
        195                 200                 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
    210                 215                 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>9
<211>141
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>9
Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
1               5                   10                  15
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr
            20                  25                  30
Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser
        35                  40                  45
Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
    50                  55                  60
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
65                  70                  75                  80
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln
                85                  90                  95
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
            100                 105                 110
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
        115                 120                 125
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
    130                 135                 140
<210>10
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>10
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser Phe Leu Ala
1               5                   10
<210>11
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>11
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>12
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>12
Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>13
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc     60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agtcatggca tccactgggt ccgccaggct    120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagaaa taaagactat    180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240
ttgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagtggcc    300
ccactggggc cacttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc    360
accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca    420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac    480
tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccagctg tcctacagtc ctcaggactc    540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc    600
tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt    660
tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc    720
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg    780
tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg    840
tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcagttcaa cagcacgttc cgtgtggtca    900
gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct    960
ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa gggcagcccc   1020
gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca   1080
gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca   1140
atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cacctcccat gctggactcc gacggctcct   1200
tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct   1260
catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt   1320
ctccgggtaa atga                                                     1334
<210>14
<211>444
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>14
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Ala Pro Leu Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            180                 185                 190
Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys
    210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225                 230                 235                 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
                245                 250                 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
            260                 265                 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
        275                 280                 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
    290                 295                 300
Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305                 310                 315                 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
                325                 330                 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
            340                 345                 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
        355                 360                 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
    370                 375                 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385                 390                 395                 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
405                 410                 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
                420                 425                 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            435                 440
<210>15
<211>153
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>15
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
1               5                   10                  15
Ser Ser His Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
            20                  25                  30
Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Asp Tyr Ala
        35                  40                  45
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
    50                  55                  60
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
65                  70                  75                  80
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Ala Pro Leu Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Gly
                85                  90                  95
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
            100                 105                 110
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
        115                 120                 125
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
    130                 135                 140
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145                 150
<210>16
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>16
Gly Phe Thr Phe Ser Ser His Gly Ile His
1               5                   10
<210>17
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>17
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val
1               5                   10                  15
<210>18
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>18
Val Ala Pro Leu Gly Pro Leu Asp Tyr
1               5
<210>19
<211>645
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>19
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc     60
ctctcctgca gggccagtca gagtgtcagc agctacttag cctggtacca gcagaaacct    120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccagca gggccactgg catcccagac    180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct    240
gaggattttg cagtgtatta ctgtcaacag tatggtaggt caccattcac tttcggccct    300
gggaccaaag tagatatcaa gcgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca    360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat    420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag    480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg    540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc    600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag                    645
<210>20
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<223>合成肽
<400>20
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>21
<211>146
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>21
Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
1               5                   10                  15
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
            20                  25                  30
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser
        35                  40                  45
    50                  55                  60
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val
65                  70                  75                  80
Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly
                85                  90                  95
Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
            100                 105                 110
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
        115                 120                 125
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
    130                 135                 140
Val Asp
145
<210>22
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>22
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                  10
<210>23
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>23
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>24
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>24
Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Pro Phe Thr
1               5                   10
<210>25
<211>1413
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>25
atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag     60
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc    120
tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca    180
ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca    240
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg    300
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatccgagg    360
ggagctaccc tttactacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc    420
accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg    480
agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg    540
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc    600
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc    660
ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag     720
acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga     780
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct     840
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg     900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac     960
agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag    1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc    1080
aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag    1140
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc    1200
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg    1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg    1320
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg    1380
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga                                 1413
<210>26
<211>451
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>26
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
            100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
        115                 120                 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
    130                 135                 140
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145                 150                 155                 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
                165                 170                 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
            180                 185                 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys
        195                 200                 205
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu
    210                 215                 220
Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala
225                 230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
                245                 250                 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
            260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
        275                 280                 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
    290                 295                 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305                 310                 315                 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile
                325                 330                 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
            340                 345                 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
        355                 360                 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
    370                 375                 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385                 390                 395                 400
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
                405                 410                 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
            420                 425                 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
        435                 440                 445
Pro Gly Lys
    450
<210>27
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>27
Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
1               5                   10                  15
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
            20                  25                  30
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn
        35                  40                  45
Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
    50                  55                  60
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu
                 85                 90                  95
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
        115                 120                 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
    130                 135                 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145                 150                 155                 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His
                165
<210>28
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>28
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His
1               5                   10
<210>29
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>29
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1               5                   10                  15
<210>30
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>30
Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10                  15
<210>31
<211>714
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>31
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc     60
agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga    120
gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attaacagct atttagattg gtatcagcag    180
aaaccaggga aagcccctaa actcctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc    240
ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg    300
caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagtatt acagtactcc attcactttc    360
ggccctggga ccaaagtgga aatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc    420
ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac    480
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac    540
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc    600
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat    660
cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta gtga          714
<210>32
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe
                 85                 90                  95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>33
<211>139
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>33
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
1               5                   10                  15
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln
        35                  40                  45
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
    50                  55                  60
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
65                  70                  75                  80
Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys
                85                  90                  95
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
            100                 105                 110
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
        115                 120                 125
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
    130                 135
<210>34
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>34
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp
1               5                   10
<210>35
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>35
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210>36
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>36
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr
1               5
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>37
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt    24

Claims (18)

1. 治疗需要这样的治疗的患者的癌症的方法，所述方法包括，给所述患者施用治疗有效量的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合部分，与治疗有效量的CpG ODN PF3512676相组合。
2. 权利要求1的方法，其中每天、隔天、每周2次或每周1次施用所述CpG ODN PF3512676。
3. 权利要求1或2的方法，其中所述治疗是选自下述的疗法：新辅助疗法，辅助疗法，一线疗法，二线疗法，和三线疗法。
4. 权利要求1，2或3的方法，其中所述人抗-CTLA-4抗体的所述治疗有效量范围是约0.1mg/kg-50mg/kg。
5. 权利要求4的方法，其中所述人抗-CTLA-4抗体的所述治疗有效量范围是约0.3mg/kg-20mg/kg。
6. 权利要求5的方法，其中所述人抗-CTLA-4抗体的所述治疗有效量选自：至少1mg/kg，至少3mg/kg，至少6mg/kg，至少10mg/kg，和至少15mg/kg。
7. 权利要求1-5或6的方法，其中所述癌症选自：乳腺癌，***癌，卵巢癌，胰腺癌，黑素瘤，肺癌，急性髓细胞白血病，结肠直肠癌，肾细胞癌，皮肤T-细胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，胃癌，头颈部癌，肝癌，子***，脑癌，和肉瘤。
8. 权利要求1-6或7的方法，其中所述抗-CTLA-4抗体或其抗原结合部分是选自下述的至少一种抗体：
(a)具有约10-8或更大的对CTLA-4的结合亲和力的人抗体，且其会抑制CTLA-4与B7-1之间的结合和CTLA-4与B7-2之间的结合；
(b)具有包括至少一种人CDR序列的氨基酸序列的人抗体，所述人CDR序列对应源自选自以下的抗体的CDR序列：4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，12.9.1.1，和10D1；
(c)具有选自4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，12.9.1.1，和10D1的抗体的重链和轻链的氨基酸序列的人抗体；
(d)抗体或其抗原结合部分，其与至少一种具有选自4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，12.9.1.1，和10D1的抗体的氨基酸序列的抗体竞争结合CTLA-4；和
(e)抗体或其抗原结合部分，其与至少一种具有选自4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，12.9.1.1，和10D1的抗体的氨基酸序列的抗体交叉竞争结合CTLA-4。
9. 权利要求1-7或8的方法，其中所述抗体是具有选自4.1.1，4.13.1，11.2.1，和10D1的抗体的氨基酸序列的人抗体。
10. 权利要求9的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，其中所述重链的重链可变域和所述轻链的轻链可变域的氨基酸序列选自：
(a)SEQ ID NO：3的氨基酸序列和SEQ ID NO：9的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：15的氨基酸序列和SEQ ID NO：21的氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：27的氨基酸序列和SEQ ID NO：33的氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO：1的核酸序列编码的氨基酸序列和SEQ ID NO：7的核酸序列编码的氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO：13的核酸序列编码的氨基酸序列和SEQ ID NO：19的核酸序列编码的氨基酸序列；
(f)SEQ ID NO：25的核酸序列编码的氨基酸序列和SEQ ID NO：31的核酸序列编码的氨基酸序列；和
(g)抗体10D1的可变域的氨基酸序列。
11. 权利要求9的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分是选自下述的抗体：
(a)包含SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO.11和SEQ ID NO：12所述氨基酸序列的抗体；
(b)包含SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所述氨基酸序列的抗体；和
(c)包含SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所述氨基酸序列的抗体。
12. 权利要求9的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分包含具有SEQ ID NO：27所述氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：33所述氨基酸序列的轻链可变区。
13. 权利要求9的方法，其中所述抗体选自：
(a)包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8所述氨基酸序列的抗体；
(b)包含SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：20所述氨基酸序列的抗体；
和
(c)包含SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：32所述氨基酸序列的抗体。
14. 权利要求1-12或13的方法，其中在施用所述CpG ODNPF3512676之前1-7天，施用所述抗体。
15. 权利要求1-13或14的方法，其中在所述抗体后约1到100天，施用所述CpG ODN PF3512676。
16. 权利要求1-14或15的方法，其中皮下施用所述CpG ODNPF3512676。
17. 权利要求1-15或16的方法，其中以1mg-50mg/天的量，施用所述CpG ODN PF3512676。
18. 用于治疗癌症的药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合部分，和治疗有效量的CpG ODNPF3512676，以及药学可接受的载体。
CNA2006800325204A 2005-07-07 2006-06-30 用于癌症治疗的抗-CTLA-4抗体和含有CpG基序的合成寡脱氧核苷酸联合治疗 Pending CN101268101A (zh)

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