KR20220004985A

KR20220004985A - Cd40 활성화 특성을 가진 재조합 단백질

Info

Publication number: KR20220004985A
Application number: KR1020217035066A
Authority: KR
Inventors: 이브 레비; 발렌티나 세글리아; 산드라 주라브스키; 제라드 주라브스키
Original assignee: 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔); 위니베르씨떼 빠리-에스뜨 끄레떼이으 발 드 마른느; 베일러 리서치 인스티튜트; 아시스땅스 퍼블리끄-오삐또 드 빠리
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2020-03-26
Publication date: 2022-01-12
Also published as: JP2022527506A; WO2020193718A1; CN113811547A; US20220175920A1; EP3947454A1

Abstract

본 발명은 CD40 활성화 단백질의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, CD40 리간드에 융합 또는 연결된 CD40 작용제 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지닌 재조합체 단백질이 본원에 개시되어 있다. 또한 특히 전달된 항원, 예를 들면, 바이러스 또는 암 항원에 대해 지시된 면역 반응을 유도하기 위한, 이러한 CD40 활성화 단백질의 유리한 용도가 개시되어 있다.

Description

CD40 활성화 특성을 가진 재조합 단백질

본 발명은 CD40 활성화 단백질(activating protein)의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, CD40 리간드(CD40L)에 융합되거나 연결된 이의 항원-결합 단편을 지닌 CD40 작용제(agonist) 항체를 기반으로 한 재조합 단백질이 본원에 개시되어 있다. 또한 특히 바이러스 또는 암 항원과 같은 전달된 항원에 대해 지시된 면역 반응을 유도하기 위한, 이러한 CD40 활성화 단백질의 유리한 용도가 개시되어 있다.

CD40은 항원-제시 세포(antigen-presenting cell)(APC) 및 B 세포 상에 발현된 강력한 활성화 종양 괴사 인자 수용체 상과 구성원(superfamily member)이다. 수지 세포(DC)는 항원을 내재화시키고 병원체-관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular pattern: PAMP)을 활성화시킴으로써 감염에 반응하므로, 항원-특이적인 T 세포에 대한 이의 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)(MHC) 분자에서 외부 항원을 나타내며, 활성화된 T 세포 상에 발현된 CD40 리간드(CD40L)를 통해 DC 성숙의 주기를 개시하고, 이는 이후 병원체에 대한 세포 및 체액성 항원-특이적인 T 및 B 세포 반응을 지시한다[Elgueta et al., 2009]. 작용성 항-CD40 항체는 APC를 직접 활성화시켜 고유의 항원, 예컨대, 종양 관련된 항원(TAA)에 대해, 또는 백신에 대한 보조제(adjuvant)로서 면역 반응을 자극시킨다는 인식을 기반으로 임상 개발중이다[Dahan et al., 2016, Thompson et al., 2015, reviewed by Vonderheide and Glennie, 2017]. 화학적 접합[Bar et al., 2003], 비-공유결합성 조립(non-covalent assembly)[Flamar et al., 2013], 또는 직접적인 융합[Flamar et al., 2014]에 의한 항-CD40 항체에 항원을 직접 연결시키는 것은 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 설정의 광범위한 배열에서 매우 낮은 항원 용량에서 강력한 항원-특이적인 세포 및 체액성 면역력을 유발한다[Flamar et al., 2013, Flamar et al., 2014, Yin et al., 2016, Yin et al., 2017]. 특히, CD40에 대한 항원-표적화는 다른 DC 수용체를 표적화함으로써 특징화된 말기 엔도소옴으로의 신속한 항원 도입에 대해 분명한 바와 같이, 조기 엔도솜 구획 내 축적으로 인하여, 다른 수용체를 표적화하는 것과 비교하여 우수한 세포성 T 세포 반응을 유발한다[Yin et al., 2016, Chattergee et al., 2012].

가장 강력한 작용제 활성을 갖는 CD40-반응성 모노클로날 항체를 확인하기 위한 주요 스크리닝, 예컨대, 사이토킨 분비 또는 사람 DC에서 CD86 표면 발현의 유도 이후에, 임상 후보물 항-CD40 항체의 작용제 효능 및 활용을 극대화시키는 것은 전형적으로 H 및 L 쇄 조합 영역의 친화성 성숙[Mangsbo et al., 2014], 및 불변 영역(constant region)과 FcR의 가교-결합을 향상시키는 것[Dahan et al., 2016]을 포함한다. 스크리닝은 또한 Fc 상호작용에 대한 어떠한 요구없이 강력한 작용제를 확인할 수 있으며[He at al., 2016], 이는 FcγRIIA 상호작용이 유지되는 경우 사람 혈소판 활성화에 문제가 될 수 있다[Dahan et al., 2016]. 작용성 항-CD40 항체는 CD40L 상호작용 영역을 오버랩하는 부위에 결합할 수 있거나, 이의 리간드-결합 영역으로부터 분명한 부위와 상호작용할 수 있지만[Gladue et al., 2011, Dahan et al., 2016, He et al., 2016], 이러한 차이가 임상 관련성을 가지는지의 여부는 명확하지 않다.

CD40의 강력한 활성화는 시험관 내(in vitro)에서 CD40-표적화를 통한 항원의 효율적인 제I 부류 및 제II 부류 제시에 요구되지 않지만[Chattergee et al., 2012, Flamar et al., 2014], 생체 내(in vivo) 효능은 폴리 IC와 같은 톨-유사 수용체(Toll-like receptor)(TLR) 활성화제의 공-투여를 필요로 한다[Zurawski et al., 2017, Cheng et al., 2017]. 그러나, 이러한 시험관 내 및 생체 내 연구는 완전한 CD40 작용제 활성을 지닌 항-CD40 항체-항원 복합체 또는 융합체를 활용하지 않았으며, 비-사람 영장류에서 펩타이드-기반 예방접종을 위해 폴리 IV와 조합된 작용적 항-CD40 항체의 명확한 이점[Thompson et al., 2015]은 항원의 CD40-표적화가 완전한 작용적 항-CD40 표적화 비히클에 의해 추가로 개선될 수 있음을 시사한다. 작용제 CD40-표적화 비히클로서 높은 효능을 지닌 단일 분자를 제공할 필요성이 추가로 존재한다. 항-CD40 항체 및 항-CD40 항체-항원 융합 단백질 둘 다의 CD40 활성화 효능을 향상시키기 위한 특정의 작용성 항-CD40 비히클과 가용성 CD40L 공동-작동의 특성이 본원에 개시되어 있다. 항-CD40 항체 및 CD40L 작용제 단편 둘 다를 단일 실체로 조합시키는 방법이 공-투여된 2개의 별개의 제제를 사용하여 관찰된 것과 적어도 유사하거나 심지어 보다 우수한 효능을 부여함이 또한 본원에 개시되어 있다. 이러한 CD40 활성화 단백질은 치료요법에서 및 투여된 항원에 대해 지시된 보조제 면역 반응에 대해 큰 가치가 있을 수 있다.

본 발명은 적어도 다음의 단백질 도메인을 포함하는 CD40 활성화 단백질에 관한 것이다:

(i) CD40 작용제 항체 또는 이의 항원-결합 단편(αCD40); 및

(ii) CD40L의 CD40 결합-도메인(CD40L).

구체적인 구현예에서, 상기 CD40 작용제 항체는 사람 CD40에 특이적으로 결합하며 다음 특성 중 적어도 하나 이상을 갖는다:

(i) 유동 세포분석적 분석에 의해 또는 CFSE-표지된 세포의 반복된 희석물의 분석에 의해 시험관 내에서 측정된 바와 같이, B 세포의 증식을 유도하거나;

(ii) 수지 세포 활성화 검정으로 시험관 내에서 측정한 바와 같이 사이토킨, 예를 들면, IL-6, IL-12 및/또는 IL-15의 분비를 유도한다.

구체적인 구현예에서, CD40L의 상기 CD40 결합-도메인은 SEQ ID NO: 14를 포함하는 CD40L의 단편이다.

구체적인 구현예에서, CD40L의 상기 CD40 결합-도메인은 상기 CD40 작용제 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄 또는 중쇄의 C-말단에 융합된다.

구체적인 구현예에서, 상기 CD40 활성화 단백질은 CD40 작용제 IgG 항체, 바람직하게는 Fc-널(null) 및 디-설파이드 안정화된 IgG4 또는 돌연변이된 사일런트(silent) IgG 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함한다.

구체적인 구현예에서, 상기 CD40 활성화 단백질은 CD40L과 상기 CD40 작용제 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 이의 항원-결합 단편 사이에 펩타이드 링커, 바람직하게는 SEQ ID NO: 15의 가요성 링커(flexible linker) FlexV1를 추가로 포함한다.

구체적인 구현예에서, 상기 CD40 작용제 항체는 다음의 항체 중에서 선택된다:

(i) SEQ ID NO: 27의 HCDR1, SEQ ID NO: 28의 HCDR2, SEQ ID NO: 29의 HCDR3, SEQ ID NO: 30의 LCDR1, SEQ ID NO: 31의 LCDR2 및 SEQ ID NO: 32의 LCDR3을 포함하는 사람화된 항체;

(ii) SEQ ID NO: 21 및 SEQ ID NO: 22 각각의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 사람화된 항체;

(iii) CD40 발현 세포에 대한 결합에 대해 (i) 또는 (ii)에서 확인된 항체 중 적어도 하나와 경쟁하는 항체; 또는

(iv) (i) 또는 (ii)에서 확인된 항체 중 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.

구체적인 구현예에서, 하나 이상의 항원은 상기 CD40 작용제 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 또는 경쇄에 융합된다.

전형적으로, 상기 하나 이상의 항원은 CD40 작용제 항체의 중쇄 또는 경쇄에 (펩타이드 연결을 통해 직접적으로, 또는 예컨대, 독커린-코헤신 기술(dockerin-cohesin technology)를 통해 비-공유결합적으로 융합된 바이러스, 세균, 또는 암 항원이다.

구체적인 구현예에서, CD40 활성화 단백질은 화학식 αCD40Light-PL-CD40L의 경쇄 및 화학식 αCD40Heavy-(PL-Ag)x의 중쇄를 포함하고, 여기서,

· αCD40Light는 상기 CD40 작용제 항체의 경쇄이고;

· αCD40Heavy는 상기 CD40 작용제 항체의 중쇄이고;

· PL은 동일하거나 상이한, 결합 또는 펩타이드 링커, 바람직하게는 SEQ ID NO: 15의 FlexV1이고;

· Ag는 동일하거나 상이한 바이러스 또는 암 항원이고;

· x는 1 내지 20의 정수, 예를 들면, 3, 4, 또는 5이고;

· CD40L은 CD40의 리간드의 결합 도메인, 예를 들면, SEQ ID NO: 14를 포함하는 CD40L의 CD40-결합 도메인이고;

· -는 결합이다.

구체적인 구현예에서, 상기 바이러스 항원은 HIV 펩타이드 항원, 바람직하게는 HIV-1 항원, 예를 들면, SEQ ID NO: 48의 GNG 또는 SEQ ID NO: 57의 HIV5pep로부터 선택된다.

본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 CD40 활성화 단백질 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 백신으로서 사용하기 위한 CD40 활성화 단백질에 관한 것이다. 특히, 상기 CD40 활성화 단백질은 대상체에서 T 세포 특이적인 반응, 특히 바이러스 항원에 대한 CD8+ T 세포 특이적인 반응을 향상시키는데 사용될 수 있다.

상기 CD40 활성화 단백질은 또한 대상체(subject) 내에서 B 세포 증식을 유발하고, 및/또는 수지 세포의 사이토킨 증식을 유도하는데 사용될 수 있다.

상세한 설명

정의

본 개시내용을 보다 용이하게 이해할 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 추가의 정의는 상세한 설명 전체에 나타나 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CD40"은 당해 분야에서 이의 일반적인 의미를 가지며 SEQ ID NO: 13의 CD40을 포함하는 사람 CD40 폴리펩타이드 수용체를 지칭한다. 구체적인 구현예에서, CD40은 UniProtKB-P25942에 의해 보고된 사람 기본 서열(canonical sequence)이다(또한 사람 TNR5로 지칭됨). 특정의 항-CD40 항체에 의해 인식된 CD40의 엑토도메인(ectodomain)은 전형적으로 SEQ ID NO: 13의 21번 위치와 193번 위치의 잔기 사이에 포함될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CD40L"은 당해 분야에서 이의 일반적인 의미를 가지며, 예를 들면, UniProtKB-P25942에 의해 보고된 바와 같이, SEQ ID NO: 14의 이의 CD40-결합 도메인을 포함하는 사람 CD40L 폴리펩타이드를 지칭한다. CD40L은 가용성 폴리펩타이드로서 발현될 수 있으며 CD40 수용체의 천연 리간드이다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "단백질"은 하나 이상의 직쇄(또한 "폴리펩타이드 쇄"로서 지칭됨) 내에 정렬된 아미노산으로 이루어지고 원형으로 폴딩된 임의의 유기 화합물을 지칭한다. 이러한 폴리펩타이드 쇄에서 아미노산은 인접한 아미노산 잔기의 카복실과 아미노 그룹 사이에서 펩타이드 결합에 의해 함께 결합된다. 용어 "단백질"은 또한 제한없이, 펩타이드, 단일 쇄 폴리펩타이드 또는 주로 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 임의의 복합체 단백질을 포함한다. 이는 또한 제한없이, 당단백질 또는 다른 공지된 해독 후 변형을 포함한다. 이는 또한 천연 단백질의 공지된 천연 또는 인공의 화학적 변형, 예를 들면, 제한없이, 당가공(glycoengineering), 페길화(pegylation), 헤실화(hesylation) 등, 비-천연 아미노산의 혼입, 화학적 접합 또는 다른 분자에 대한 아미노산 변형 등을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, "복합체 단백질"은 보다 구체적으로 적어도 2개의 폴리펩타이드 쇄로 제조된 단백질을 지칭하고, 여기서 상기 적어도 2개의 폴리펩타이드 쇄는 비-공유결합성 결합 또는 공유결합성 결합을 통해, 예를 들면, 이황화물 브릿지 또는 펩타이드 결합에 의해 적절한 조건 하에서 함께 연합된다.

"헤테로이량체성 단백질"은 적어도 2개의 폴리펩타이드 쇄로 제조되어, 복합체 단백질을 형성하는 단백질을 지칭하고, 여기서 상기 2개의 폴리펩타이드 쇄는 상이한 아미노산 서열을 갖는다.

용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 당단백질, 뿐만 아니라 비-당단백질을 명확하게 포함한다.　구체적인 구현예에서, 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 유전자에 의해 암호화될 수 있고 세포 발현 시스템 및 DNA 재조합 수단, 에를 들면, 포유동물 숙주 세포 발현 시스템을 사용하여 해독될 수 있는 임의의 폴리펩타이드 또는 단백질을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "재조합체 단백질"은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 단백질, 예를 들면, (a) 사람 면역글로불린 유전자에 대한 유전자이식(transgenic) 또는 염색체이식(transchromosomal) 동물(예컨대, 마우스)로부터 단리된 항체 또는 이로부터 제조된 하이브리도마(하기에 추가로 기술됨), (b) 상응하는 단백질을 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터, 예컨대, 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 단리된 융합 단백질을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "융합 단백질"은 유전적 융합에 의해, 예를 들면, 명백한 단백질의 별개의 기능성 도메인을 암호화하는 적어도 2개의 유전자 단편의 유전적 융합에 의해 수득되거나 수득가능한 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 재조합체 단백질을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역 글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부위, 즉, 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다.

설치류 및 영장류의 천연 항체에서, 2개의 중쇄는 이황화물 결합에 의해 서로 연결되어 있으며, 각각의 중쇄는 이황화물 결합에 의해 경쇄에 연결되어 있다. 2개 유형의 경쇄, 람다(1) 및 카파(k)가 존재한다. 항체 분자의 기능적 활성을 측정하는 5개의 주요 중쇄 부류(또는 동형)이 존재한다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 각각의 쇄는 명백한 서열 도메인을 함유한다. 대표적인 IgG 항체에서, 경쇄는 2개의 도메인인, 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)을 포함한다. 중쇄는 4개의 도메인인, 하나의 가변 도메인(VH) 및 3개의 불변 도메인(총괄적으로 CH로 지칭된, CH1, CH2 및 CH3)를 포함한다. 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 둘 다의 가변 영역은 항원에 대한 결합 인식 및 특이성을 측정한다. 경쇄(CL) 및 중쇄(CH)의 불변 영역 도메인은 중요한 생물학적 특성, 예를 들면, 항체 쇄 연합, 분비, 경-태반 이동성(trans-placental mobility), 상보체 결합, 및 Fc 수용체(FcR)에 대한 결합을 부여한다.

Fv 단편은 면역글로불린의 Fab 단편의 N-말단 부분이며 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 가변 부위로 이루어진다. 항체의 특이성은 항체 결합 부위와 항원성 결정인자 사이에 구조적 상보성에 있다. 항체 조합 부위(combining site)는 주로 초가변성 또는 상보성 결정 인자(CDR)로부터 유래된 잔기로 제조된다. 때때로, 초가변성 또는 골격 영역(FR)로부터의 잔기는 항체 결합 부위에 관여할 수 있거나, 전체적인 도메인 구조 및 따라서 조합 부위에 영향을 미친다. 상보성 결정 영역 또는 CDR은 천연의 면역글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화성 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열을 지칭한다. 면역글로불린 각각의 경쇄 및 중쇄는 각각 L-CDR1, L-CDR2, L- CDR3 및 H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3을 지정하는 3개의 CDR을 갖는다. 따라서. 항원-결합 부위는 전형적으로 각각의 중쇄 및 경쇄 V 영역으로부터의 CDR 세트를 포함하는, 3개의 CDR을 갖는다. 골격 영역(FR)은 CDR 사이에 삽입된 아미노산 서열을 지칭한다. 따라서, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 전형적으로 다음 서열의 4개의 골결 영역 및 3개의 CDR을 포함한다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

항체 가변 도메인내 잔기는 카밧(Kabat) 등에 의해 고안된 시스템에 따라 편리하게 번호매김(numbering)된다. 이러한 시스템은 문헌: Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA(Kabat et al., 1992, 이후 "Kabat et al.")에 나타나 있다. 카밧 잔기 지정은 서열 번호 서열내 아미노산 잔기의 선형 번호매김과 항상 직접적으로 상응하지 않는다. 실제 선형 아미노산 서열은 염기성 가변 도메인 구조의 골격 또는 상보성 결정 영역(CDR)에 상관없이, 구조적 구성성분의 단축, 또는 삽입에 상응하는 엄격한 카밧 번호매김에서보다 더 적거나 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 잔기의 정확한 카밧 번호매김은 "표준" 카밧 번호매김된 서열을 지닌 항체의 서열내 상동성의 잔기의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다. 중쇄 가변 도메인의 CDR은 카밧 번호매김 시스템에 따라 잔기 31 내지 35번(H-CDR1), 잔기 50 내지 65번(H-CDR2) 및 잔기 95 내지 102번(H-CDR3)에 위치한다. 경쇄 가변 도메인의 CDR은 카밧 번호매김 시스템에 따라 잔기 24 내지 34번(L-CDR1), 잔기 50 내지 56번(L-CDR2) 및 잔기 89 내지 97번(L-CDR3)에 위치한다. 이후 기술된 작용제 항체의 경우, CDR은 www.bioinf.org.uk(항체 페이지내 ≪　How to identify the CDRs by looking at a sequence　≫ 제목의 단락 참고)으로부터의 CDR 발견 알고리즘을 사용하여 측정하였다. 일부 작용제 항체의 예측된 CDR, 예를 들어, 11B6, 12E2, 12B4, CP(Pfizer의 CP-870,893) 또는 24A3은 하기 실시예에 기술되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 항체의 "항원-결합 단편"(또는 단순히 "항체 단편")은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 전체 길이 또는 하나 이상의 단편(예컨대, CD40의 엑토도메인)을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전체 길이의 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 항체의 용어 "항원-결합 단편"내 포함된 결합 단편의 예는 Fab 단편, V_L, V_H, C_L 및CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; F(ab)₂ 단편, 힌지 영역에서 이황화물 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; V_H 및CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암(arm)의 V_L 및V_H 도메인으로 이루어진 Fv 단편; V_H 도메인으로 이루어진, dAb 단편(Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), 또는 이러한 항원-결합 단편을 포함하는 임의의 융합 단백질을 포함한다.

또한, Fv 단편의 2개의 도메인인, V_L 및V_H는 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 이는 재조합 방법, 이를 V_L 및V_H 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일 쇄 Fv(scFv)로서 공지됨); 참고: 예컨대, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; 및 Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883)를 형성하는 단일 쇄 단백질로서 제조되도록 하는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 단편"내에 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 항체 단편은 당해 분야의 기술자에게 공지된 통상의 기술을 사용하여 수득되며, 단편은 완전한 항체와 동일한 방식으로 활용하기 위해 스크리닝된다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "IgG Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단을 정의하기 위해 사용된다. 사람 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 IgG 항체의 카복실-말단에 대해 위치 C226 또는 P230을부터의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 정의된다. Fc 영역내 잔기의 번호매김은 카밧의 EU 지수의 것이다. Fc 영역의 C-말단 라이신(잔기 K447)은, 예를 들면, 항체의 생산 또는 정제 동안 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 존재하거나 존재하지 않는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "K_assoc" 또는 "K_a"는 특수한 항체-항원 상호작용의 연합 속도를 지칭하는 반면, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "K_dis" 또는 "K_d"는 특수한 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "K_D"는 K_d 대 K_a(즉, K_d/K_a)의 비로부터 수득된, 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도되며 몰 농도(M)로 나타낸다. 항체에 대한 K_D 값은 당해 분야에 잘 확립된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 단백질 또는 항체의 K_D를 측정하는 방법은 표면 플라스몬 공명을 사용함으로써, 예를 들면, 바이오센서 시스템, 예를 들면, Biacore^® 시스템을 사용함에 의한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "결합 특이성"은 항원 재조합체 폴리펩타이드, 예를 들면, 재조합체 CD40 폴리펩타이드에, 예를 들면, 실시예에서 측정된 바와 같이, 표면 플라스몬 공명(SPR) 측정에 의해 측정된 것으로서, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하의 K_D로 검출가능하게 결합하는 항체의 능력을 지칭한다.

"특수한 항원과 교차-반응하지 않는" 항체는 이러한 항원에 100 nM 이상의 K_D, 또는 1 mM 이상의 K_D, 또는 10 mM 이상의 K_D로 결합하는 항체를 지칭하는 것으로 의도되며, 상기 친화성은 예를 들면 실시예에 개시된 바와 같이, 유사한 표면 플라스몬 공명(SPR) 측정을 사용하여 측정된다. 특정의 구현예에서, 항원과 교차반응하지 않는 이러한 항체는 표준 결합 검정에서 이러한 단백질에 대해 필수적으로 검출불가능한 결합을 나타낸다.

본 발명에 따른 단리된 CD40 활성화 단백질은 CD40과 관련하여 결합 특이성을 갖고 CD40 수용체와 관련하여 활성화 또는 작용제 특성을 갖는 단백질이다. CD40 활성화 단백질은 다른 항원, 예를 들면, 다른 종으로부터의 관련된 CD40 분자에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 구체적인 구현예에서, 단리된 CD40 활성화 단백질은 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 포함하지 않을 수 있다.

"항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이성을 갖는 항체"는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용된다.

특이성은 또한 특이적인 항원에 대한 결합 대 다른 관련되지 않은 분자(특이적인 항원이 CD40 폴리펩타이드인 경우)에 대한 비특이적인 결합에서 예컨대, 약 10:1, 약 20:1, 약 50:1, 약 100:1, 10.000:1 이상 까지의 친화성/항원항체결합력을 또한 나타낼 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "친화성"은 에피토프에 대한 항체의 결합의 강도를 의미한다.

본 발명은 특정의 CD40 작용제 항체(WO 2010/104748에 기술된 바와 같은 작용제 mAb 11B6 또는 12B4로부터 유래된)와 CD40L의 융합 단백질이 상응하는 작용제 항체 단독 또는 이러한 작용제 항체와 가용성 CD40L(sCD40L)의 조합된 투여와 비교하여 보다 우수한 CD40 활성화 특성을 나타낸다는 예측하지 못한 발견에 관한 것이다.

본원에 사용된 바와 같은, "사람화된 항체"는 사람 세포에 의해 제조될 수 있는 보다 밀접하게 닮은 항체로 변경된 가변 및 불변 영역을 갖는 비-사람 세포에 의해 제조된 항체를 광범위하게 포함하는 것으로 지칭된다. 예를 들면, 사람 배선 면역글로불린 서열 내에서 발견된 아미노산을 포함하도록 사람 항체 아미노산 서열을 변경시킴에 의해. 사람화된 항체는, 예를 들면 CDR 내에, 사람 배선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예컨대, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적인 돌연변이유발에 의해 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 항체는 사람 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예컨대, 시험관 내 무작위 또는 부위-특이적인 돌연변이유발에 의해 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 특히, 용어 "사람화된 항체"는 Fc IgG 영역의 사일런트 변이체를 포함하는 항체를 포함한다.

구체적인 구현예에서, 용어 "사람화된 항체"는 쥐(murine) 항체의 6개의 CDR, 그러나 사람화된 골격 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다.

보다 구체적으로, 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "사람화된 항체"는 다른 포유동물 종(species), 예를 들면, 마우스의 배선(germline)으로부터 유래된 CDR 서열이 사람 골격 서열 위에 이식된 항체를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, ≪　CD40 작용제　≫ 항체는 세포-기반 검정, 예를 들면, B 세포 증식 검정에서 CD40L의 부재하에 CD40 매개된 신호전달 활성을 증가시키는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 검정은 하기 실시예에 보다 상세히 기술되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "사일런트(silent)" 항체는 ADCC 활성이 없거나 낮은 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "ADCC" 또는 "항체 의존성 세포 세포독성" 활성은 세포 고갈 활성을 지칭한다. ADCC 활성은 문헌에 기술된 바와 같은 ADCC 검정에 의해 측정될 수 있다.

사일런스된 효과기 기능(silenced effector function)은 항체의 Fc 영역내 돌연변이에 의해 수득될 수 있으며 당해 분야에 기술되었다: Strohl 2009 (LALA & N297A); Baudino 2008, D265A (Baudino et al., J. Immunol. 181 (2008): 6664-69, Strohl, CO Biotechnology 20 (2009): 685-91). 사일런트 Fc IgG1 항체의 예는 IgG1 Fc 아미노산 서열내 L234A 및 L235A 돌연변이를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, ≪　CD40 활성화　≫　특성을 지닌 단백질 또는 항체는 CD40 매개된 신호전달 활성을 증가시킬 수 있는 단백질 또는 항체를 지칭한다. 특히, 본원에 사용된 바와 같은, CD40 활성화 특성을 지닌 단백질은 다음 특성 중 적어도 하나 이상을 갖는다:

(i) 유동 세포분석법적 분석에 의해 시험관 내에서 측정된 것으로서, 예컨대, CFSE-표지된 세포의 반복된 희석물의 분석에 의해, 예를 들면, 하기 실시예에 기술된 B 세포 증식 검정으로 측정된 것으로서, B 세포의 증식을 유도한다;

(ii) 하기 실시에에 기술된 수지 세포 활성화 검정으로 시험관 내에서 측정된 것으로서, 사이토킨, 예를 들면, IL-6, IL-12, 또는 IL-15의 분비를 유도한다.

구체적인 구현예에서, 본 발명의 상기 CD40 활성화 단백질은 CD40 수용체의 천연 리간드인, CD40L의 가용성 버젼과 동일한 활성화 특성을 갖는다.

구체적인 구현예에서, 상기 CD40 활성화 단백질은 삼량체 형태가 아닌 CD40L의 CD40 결합 도메인을 포함한다.

구체적인 구현예에서, 본 발명의 상기 CD40 활성화 단백질은 CD40 결합과 관련하여 4가이다.

구체적인 구현예에서, 상기 CD40 활성화 단백질은 바람직하게는 2가 항체의 각각의 아암의 C-말단 부분인, 각각의 아암의 경쇄 또는 중쇄를 통해, 상기 2가 항체의 각각의 아암에 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 결합된 CD40L의 하나의 단량체성 CD40 결합 도메인을 지닌 2가 CD40 작용제 항체를 포함한다.

다른 구체적인 구현예에서, 본 발명의 상기 CD40 활성화 단백질은 다음의 CD40 작용제(부분적인 작용제 포함) 중에서 전형적으로 선택된 참고 CD40 작용제 항체와 적어도 유사한 활성화 특성을 갖는다: 11B6, 12B4, CP-870,893 또는 24A3, 전형적으로 11B6 항체 또는 사람화된 버젼.

다른 구체적인 구현예에서, 본 발명의 상기 CD40 활성화 단백질은 적어도 유사한 활성화 특성을 가지며, 가용성 CD40L의 공지된 삼량체 버변인, 메가 sCD40L보다 심지어 적어도 10배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 활성일 수 있따.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 ≪　메가(Mega) sCD40L　≫은 MEGACD40L®로서 시판되고 Kornbluth et al., 2012에 기술된, 아디포넥틴(Adiponectin)/ACRP30/AdipoQ의 콜라겐 도메인을 통해 연결된 삼량체성 CD40 리간드 분자를 지칭한다.

다른 구체적인 구현예에서, 본 발명의 상기 CD40 활성화 단백질은 상기 CD40 활성화 단백질 속에 존재하는 동일한 CD40 작용제 항체(또는 이의 항원-결합 단편)과 가용성 CD40L의 조합된 조성물과 적어도 동일한 활성화 특성을 갖는다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어, "최적화된"은 뉴클레오타이드 서열이 변경되어 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로 진핵 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소 세포(Chinese Hamster Ovary cell)(CHO) 또는 사람 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 암호화함을 의미한다. 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 가공되어 출발 뉴클레오타이드 서열에 의해 원래 암호화된 아미노산을 완전히 또는 가능한 많이 보유한다. 최적화된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 또한 최적화된 것으로 지칭된다.

본원에 사용된 바와 같은, 2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트(percent identity)는 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭(gap)의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수(즉, 동일성% = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100)이다. 2개의 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 퍼센트의 측정은 하기 기술된 바와 같은, 수학적 알고리즘을 사용하여 달성할 수 있다.

2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 니들만 및 분쉬 알고리즘(Needleman and Wunsch algorithm)(NEEDLEMAN, and Wunsch)을 사용하여 측정할 수 있다.

2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는, 또한 예를 들면, EMBOSS Needle(쌍식 정렬; www.ebi.ac.uk에서 이용가능)과 같은 알고리즘을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들면, EMBOSS Needle는 BLOSUM62 매트릭스, 10의 "갭 오픈 패널티(gap open penalty)", 0.5의 "갭 연장 패널티(gap extend penalty)", 거짓 "말단 갭 패널티(end gap penalty)", 10의 "말단 갭 오픈 패널티(end gap open penalty)" 및 0.5의 "말단 갭 연장 패널티(end gap extend penalty)"와 함께 사용될 수 있다. 일반적으로, "동일성 퍼센트"는 일치하는 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나누고 이에 100을 곱한 함수이다. 예를 들면, 10개의 서열 위치 중 6개가 정렬 후 2개의 비교한 서열 사이에서 동일한 경우, 동일성은 60%이다. 동일성%는 전형적으로 분석이 수행된 질의 서열의 전체 길이에 걸쳐 전형적으로 측정된다. 동일한 1차 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 가진 2개의 분자는 임의의 화학적 및/또는 생물학적 변형과 관계없이 동일하다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체"는 임의의 사람 또는 비사람 동물을 포함한다. 용어 "비사람 동물"은 모든 척추동물, 예컨대, 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들면, 비사람 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, "수지 세포"(DC)는 림프구 또는 비-림프구 조직에서 발견된 형태학적으로 유사한 세포 유형의 다양한 집단의 임의의 수를 지칭한다. 이러한 세포는 이의 구별된 형태학 및 고 수준의 표면 MHC-제II 부류 발현에 의해 특징화된다. 이러한 세포는 다수의 조직원으로부터, 및 편리하게는, 하기 실시예에 기술된 바와 같은 말초 혈액으로부터 단리될 수 있다.

본 발명의 CD40 활성화 단백질

(i) CD40 작용제 항체(αCD40) 또는 이의 항원-결합 단편; 및

(ii) 전형적으로 SEQ ID NO: 14의 CD40L의 결합 도메인(CD40L), 또는 SEQ ID NO: 14에 대해 적어도 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 이의 기능성 단편.

특정의 구현예에서, CD40L의 CD40 결합 도메인(바람직하게는 단량체성 형태)는 임의로 링커, 예를 들면, 펩타이드성 또는 화학적 링커를 통해 상기 CD40 작용제 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄 또는 중쇄의 C-말단에 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 부착된다. 일 구현예에서, CD40L의 CD40 결합-도메인은 CD40 작용제 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄의 C-말단에 비-공유결합으로 부착된다.

특정의 구현예에서, CD40L의 CD40 결합 도메인은 임의로 링커(linker), 예를 들면, 펩타이드 링커를 통해, L은 상기 CD40 작용제 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄 또는 중쇄의 C-말단에 융합된다. 전형적으로, CD40L의 CD40 결합-도메인은 임의로 링커, 예를 들면, 펩타이드성 링커를 통해, CD40 작용제 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄의 C-말단에 융합된다.

다른 구체적인 구현예에서, 상기 CD40L의 CD40 결합 도메인은 화학적 커플링을 사용하여 CD40 작용제 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 접합시킨다. 항체를 이의 접합체 모이어티(moiety)에 부착 또는 접합시키는 수개의 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 모이어티를 항체에 접합시키는데 사용된 링커 유형의 예는 하이드라존, 티오에테르, 에스테르, 디설파이드 및 펩타이드 합유 링커, 예를 들면, 발린-시트룰린 링커를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 라이소솜 구획내에서 낮은 pH에 의한 절단에 민감성이거나 프로테아제, 예를 들면, 종양 조직 내에서 우선적으로 발현된 프로테아제, 예를 들면, 카텝신(에컨대, 카텝신 B, C, D)에 의한 절단에 대해 민감성인 링커가 선택된다. 링커의 유형 및 치료제를 항체에 접합시키는 방법의 추가의 논의에 대해서는 또한 항체 약물 접합체에 대한 검토에 관한 문헌: Panowski et al., 2013을 참고한다.

특정의 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 상기 CD40 활성화 단백질은 화학식 αCD40Light-PL-CD40L의 경쇄 및 화학식 αCD40Heavy의 중쇄를 포함하는 항체-유사 단백질이고, 여기서,

· αCD40Light는 CD40 작용제 항체의 경쇄이고;

· αCD40Heavy는 CD40 작용제 항체의 중쇄이고;

· PL은 동일하거나 상이한, 결합 또는 펩타이드, 바람직하게는 SEQ ID NO: 15의 FlexV1이고;

· CD40L은 예를 들면 SEQ ID NO: 14를 포함하는 CD40 리간드의 CD40-결합 도메인, 또는 SEQ ID NO: 14에 대해 적어도 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 이의 기능성 단편이다.

보다 구체적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 상기 CD40 활성화 단백질은 화학식 αCD40Light-PL-CD40L의 경쇄 및 화학식 αCD40Heavy-PL-BP1의 중쇄를 포함하는 항체-유사 단백질이고, 여기서,

· αCD40Light는 CD40 작용제 항체의 경쇄이고;

· αCD40Heavy는 CD40 작용제 항체의 중쇄이고;

· BP1는 상기 결합 쌍 BP1/BP2의 제2 구성원 BP2에 대한 비-공유결합성 커플링을 허용하는 결합쌍 BP1/BP2의 제1 구성원이다.

다른 구체적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 상기 CD40 활성화 단백질은 화학식 αCD40Heavy-PL-CD40L의 중쇄 및 화학식 αCD40Light-PL-BP1의 경쇄를 포함하는 항체-유사 단백질이고, 여기서,

· αCD40Light는 CD40 작용제 항체의 경쇄이고;

· αCD40Heavy는 CD40 작용제 항체의 중쇄이고;

· BP1는 상기 결합 쌍 BQP/BP2의 제2 구성원 BP2에 대한 비-공유결합성 커플링을 허용하는 결합 쌍 BP1/BP2의 제1 구성원이다.

임의의 결합 쌍, 전형적으로 당해 분야에 공지된 폴리펩타이드 도메인의 결합 쌍은 DC40 활성화 단백질의 상기 구현예를 위해 사용될 수 있다. 상기 결합 쌍 BP1/BP2는 제한없이 하기 기술된 바와 같은, 독커링 도메인(dockering domain)/코헤신 도메인(cohesin domain), 또는 mSA2/바이오틴을 포함한다.

보다 구체적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 상기 CD40 활성화 단백질은 화학식 αCD40Light-PL-CD40L의 경쇄 및 화학식 αCD40Heavy-PL-Doc의 중쇄를 포함하는 항체-유사 단백질이고, 여기서,

· αCD40Light는 CD40 작용제 항체의 경쇄이고;

· αCD40Heavy는 CD40 작용제 항체의 중쇄이고;

· Doc는 예를 들면 SEQ ID NO: 111, 또는 이의 임의의 기능성 변이체를 포함하는, US20160031988A1 및 US20120039916A1에 기술된 바와 같은 코헤신 융합 단백질에 대한 비-공유결합성 커플링을 허용하는 독커린 도메인 또는 다중 도메인이다.

다른 구체적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 상기 CD40 활성화 단백질은 화학식 αCD40Light-PL-CD40L의 경쇄 및 화학식 αCD40Heavy-PL-mSA2의 중쇄를 포함하는 항체-유사 단백질이고, 여기서,

·αCD40Light는 CD40 작용제 항체의 경쇄이고;

· αCD40Heavy는 CD40 작용제 항체의 중쇄이고;

· mSA2는 예를 들면 SEQ ID NO: 168, 또는 이의 임의의 기능성 변이체를 포함하는, 림(Lim) 등의 문헌(Biotechnology Bioeng 2013, 110, 57-67)에 기술된 바와 같은 바이오틴 표지된 또는 융합 단백질에 대해 비-공유결합성 커플링을 허용하는 단량체성 스트렙타비딘 2 도메인이다.

다른 구체적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 상기 CD40 활성화 단백질은 화학식 αCD40Heavy-PL-CD40L의 중쇄 및 화학식 αCD40Light의 경쇄를 포함하는 항체-유사 단백질이고, 여기서,

· αCD40Light는 CD40 작용제 항체의 경쇄이고;

·αCD40Heavy는 CD40 작용제 항체의 중쇄이고;

· CD40L는 SEQ ID NO: 14, 또는 SEQ ID NO: 14에 대해 적어도 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 이의 기능성 단편을 포함하는 CD40 리간드의 CD40-결합 도메인이다.

다른 보다 구체적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 상기 CD40 활성화 단백질은 화학식 αCD40Heavy-PL-CD40L의 중쇄 화학식 αCD40Light-PL-Doc의 경쇄를 포함하는 항체-유사 단백질이고, 여기서,

· αCD40Light는 CD40 작용제 항체의 경쇄이고;

· αCD40Heavy는 CD40 작용제 항체의 중쇄이고;

다른 구체적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 상기 CD40 활성화 단백질은 화학식 αCD40Heavy-PL-CD40L의 중쇄 및 화학식 αCD40Light-PL-mSA2의 경쇄를 포함하는 항체-유사 단백질이고, 여기서,

· αCD40Light는 CD40 작용제 항체의 경쇄이고;

· αCD40Heavy CD40 작용제 항체의 중쇄이고;

· mSA2는 예를 들면 SEQ ID NO: 168, 또는 이의 임의의 기능성 변이체를 포함하는, 림(Lim) 등의 문헌(Biotechnology Bioeng 2013, 110, 57-67)에 기술된 바와 같은 바이오틴 표지된 또는 융합 단백질에 대한 비-공유결합성 커플링을 허용하는 단량체성 스트렙타비딘 2 도메인이다.

αCD40Light, αCD40Heavy, 및 CD40L의 바람직한 구현예는 다음 단락에 추가로 기술되어 있다.

특정의 구현예에서, 상기 CD40 활성화 단백질은 상기 CD40 작용제 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 상응하는 중쇄 또는 경쇄에 대한 비-공유결합성 커플링에 의해 융합 또는 접합 또는 커플링된 하나 이상의 항원 ≪　Ag　≫을 추가로 포함한다. 상기 항원은 예를 들면, CD40 활성화 단백질의 폴리펩타이드 쇄의 C-말단 끝에서, 및 임의로 펩타이드 링커, 예를 들면, 하기 기술된 바와 같은 FlexV1, f1, f2, f3, 또는 f4를 통해 CD40 활성화 단백질의 폴리펩타이드 쇄에 직접 접합될 수 있다. 이는 또한 독커린 도메인과의 커플링을 위해 코헤신 융합 단백질 내에, 및/또는 단량체성 스트렙타비딘 2 도메인과의 커플링을 위해 바이오틴 융합 단백질 내에 포함된 바와 같이, 비-공유결합성 커플링에 의해 커플링될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 ≪　항원　≫ 또는 ≪　Ag　≫는 이것이 전체 미생물 또는 이의 부위, 및 다양한 유형: (예컨대, 펩타이드, 단백질, 당단백질, 다당류, 당지질, 리포펩타이드 등)을 포함하는지의 여부에 상관없이, 백신내에서 사용될 수 있는 임의의 항원을 지칭한다. 따라서, 용어 "항원"은 항원의 수용체에서 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 개시할 수 있는 분자를 지칭한다. 항원은 일반적으로 예방접종이 유리한 치료일 수 있는 질환을 유발하는 병원체에 의해 암호화된 주요 분자이다.

구체적인 구현예에서, Ag는 펩타이드 콘카타머(concatamer)이다. Ag는 또한 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 이의 서열은 DNA 면역화로 지칭된 면역화 기술의 경우에, 폴리뉴클레오타이드가 투여된 개체에 의한 발현이 요구되는 항원을 암호화하도록 선택된다.

전형적으로, 본원에 사용된 바와 같이, Ag는 바이러스 또는 다른 감염성 질환 항원, 또는 암 항원으로부터 선택된다.

특정의 구현예에서, Ag는 세균, 바이러스, 기생충, 및 진균 항원으로부터 선택된 감염성 질환 항원으로부터 선택된다. 전형적으로, Ag는 적어도 하나의 바이러스 항원??. 예를 들면, 적어도 하나의 바이러스 항원은 아데노바이러스, 레트로바이러스, 피코르나바이러스, 헤르페스바이러스, 로타바이러스, 한타바이러스, 코로나바이러스, 토가바이러스, 플라비르바이러스, 라브도바이러스, 파라믹소바이러스, 오르토믹소바이러스, 부니아바이러스, 아레나바이러스, 레오바이러스, 파릴로마바이러스, 파르보바이러스, 폭스바이러스, 헤파드나바이러스, 로토바이러스 또는 스폰기포름 바이러스로부터의 펩타이드를 포함한다. 다른 양태에서, 적어도 하나의 바이러스 항원은 HIV, CMV, 간염 A, B, 및 C, 인플루엔자; 홍역, 소아마비, 두창, 루벨라(rubella), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial, herpes simplex), 바리셀라 조스터(varicella zoster), 엡슈타인-바르(Epstein-Barr), 일본 뇌염(Japanese encephalitis), 광견병, 독감(flu), 또는 감기 바이러스 중 적어도 하나로부터의 펩타이드를 포함한다.

구체적인 구현예에서, 상기 바이러스 항원은 다음 항원성 도메인 중 하나 이상으로부터 선택된다: HIV-1 Gag p24(SEQ ID NO: 45), Nef(SEQ ID NO: 46), 및 Gag p17(SEQ ID NO: 47)(GNG로 불리는 3개의 항원의 조합을 포함함, 하기 상세한 아미노산 서열 참고) 또는 HVP16 E6 및 HPV16 E7 항원의 조합(HPV 16 E6/E7)(또한 HPV로 지칭됨, 하기 상세한 아미노산 서열 참고).

GNG 서열은 다음의 화학식의 것이다:(C-말단으로부터 N-말단으로):

FlexV1-LE-gag17-VDf3-VD-nef-EF-f4-QF p24-6xHis](가요성 링커 서열)

여기서,

FlexV1은 SEQ ID NO: 15의 펩타이드 링커이고,

LE는 Leu-Glu의 디펩타이드이고;

Gag17은 다음의 아미노산 서열: MGARASILSGGELDRWEKIRLRPGGNKQYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKS (SEQ ID NO: 47)의 HIV-1 바이러스 항원이고;

VD는 발린 및 아스파트산의 디펩타이드 링커이고;

f3는 다음의 아미노산 서열:　TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO: 53)의 펩타이드 링커이고;

nef는 다음의 아미노산 서열 MGGKWSKRSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAVSRDLEKHGAITSSNTAANNADCAWLEAQEEEEVGFPVRPQVPLRPMTYKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSQKRQDILDLWVYHTQGYFPDWQNYTPGPGIRYPLTFGWCFKLVPVEPEKVEEANEGENNSLLHPMSLHGMDDPEREVLVWKFDSRLAFHHMARELHPEYYKDC (SEQ ID NO: 46)의 HIV-1 바이러스 항원이고;

EF는 글루탐산 및 페닐알라닌의 디펩타이드 링커이고;

f4는 가요성 링커 TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA　(SEQ ID NO: 54)이고;

QF는 글루타민 및 페닐알라닌의 디펩타이드 링커이고;

P24는 다음의 아미노산 서열 AQQAAADTGHSNQVSQNYPIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVG (SEQ ID NO: 45)의 HIV-1 바이러스 항원이고;

6-His는 HHHHHH의 C-말단 헥사히스티딘 태그(hexahistidine tag)이다.

GNG의 전체 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 48로 이루어진다.

대안적인 GNG 서열, 예를 들면 동일한 HIV-1 펩타이드 서열을 가지지만 다른 펩타이드 링커를 가진 GNG 서열을 사용할 수 있다.

HPV는 다음의 화학식의 것이고:

Flex-v1-HPV16E6-HPV16E7-f1,

여기서 FlexV1은 상술한 바와 같고,

HPV16E6-HVP16E7은 다음의 아미노산 서열: MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVGDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSVYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEASMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCK (SEQ ID NO: 55)을 갖고,

f1은 다음의 아미노산 서열 ASSSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSPAS (SEQ ID NO: 56)의 가요성 링커이고

HPV의 전체 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 57로 이루어진다.

다른 구체적인 구현예에서, 상기 바이러스 항원은 다음의 HIV 항원성 도메인 중 하나 이상으로부터 선택된다: SEQ ID NO: 16의 Gag p17 (17-35), SEQ ID NO: 17의 Gag p17-p24 (253-284) 및 SEQ ID NO: 18의 Nef (116-145), SEQ ID NO: 19의 Pol 325-344 (RT 158-188) 및 SEQ ID NO: 20의 Nef (66-97).

바람직한 구현예에서, 상기 바이러스 항원은 다음의 5개의 HIV 항원성 도메인의 조합으로부터 선택되고: SEQ ID NO: 16의 Gag p17(17-35), SEQ ID NO: 17의 Gag p17-p24(253-284) 및 SEQ ID NO: 18의 Nef(116-145), SEQ ID NO: 19의 Pol 325-344(RT 158-188) 및 SEQ ID NO: 20의 Nef (66-97), 또한 다음의 화학식의 HIV5pep 서열에 포함된 바와 같다:

FlexV1 - gag p17(17-35) - f1 - gag p17-p24(253-284) - f2 - nef(116-145) - f3 - nef(66-97) - f4 - Pol 325-344(RT158-188), 여기서,

FlexV1, f1, f2, f3, f4는 상술한 바와 같다.

HIV5pep 아미노산 서열의 구체적인 구현에는 SEQ ID NO: 112에 기술되어 있다.

다른 구체적인 구현예에서, Ag는 CEA, 전립선 특이적인 항원(PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 및 12, MUC-관련 단백질(Mucin)(MUC- 1, MUC-2 등), GM2 및 GD2 강글리오사이드, ras, myc, 타이로시나제, MART(흑색종 항원), MARCO-MART, 사이클린 Bl, 사이클린 D1, Pmel 17(gpl00), GnT-V 인트론 V 서열(N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라제 V 인트론 V 서열), 전립선 Ca psm, 전립선 혈청 항원(PSA), PRAME(흑색종 항원), β-카테닌, MUM-I-B(흑색종 편재성(ubiquitous)의 돌연변이된 유전자 생성물), GAGE(흑색종 항원) 1, BAGE(흑색종 항원) 2-10, C-ERB2(Her2/neu), EBNA(엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr Virus) 핵 항원) 1-6, gp75, 사람 파필로마 바이러스(사람 papilloma virus)(HPV) E6 및 E7, p53, 폐 내성 단백질(LRP), Bcl-2, 및 Ki-67로부터 선택된 종양 관련된 항원으로부터 선택된다. 다른 양태에서, Ag는 백혈병 및 림프종, 신경학적 종양, 예를 들면, 성상세포종 또는 교모세포종, 흑색종, 유방 암, 폐 암, 두경부 암, 위장 종양, 위 암, 결장 암, 간 암, 췌장 암, 비뇨생식 종양, 예를 들면, 자궁경부, 자궁, 난소 암, 질 암, 고환 암, 전립선 암 또는 음경 암, 골 종양, 혈관 종양, 또는 입술의 암, 코인두, 인두 및 구강, 식도, 직장, 담낭, 담도계(biliary tree), 후두, 폐 및 기관지, 방광, 신장, 뇌 및 신경계의 다른 부분, 갑상선, 호지킨 질환(Hodgkin's disease), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 다발 골수종 및 백혈병으로부터의 항원을 포함하는 종양-관련 항원으로부터 선택된다. 이러한 종양 관련 항원은 공지된 또는 잠재적인 T 세포 에피토프를 함유하는 환자-특이적인 종양 돌연변이된 단백질을 포함한다.

구체적인 구현예에서, 본 발명의 CD40 활성화 단백질은 2개의 이종이량체를 포함하는 복합체 단백질에 관한 것이고, 각각의 이종이량체는 예를 들면 하나 이상의 이황화물 결합을 통해 서로 안정하에 연합된, 아미노산의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄로 이루어진다. 전형적으로, 중쇄는 적어도 VH 영역을 포함하고, 바람직하게는 CD40 작용제 항체의 적어도 CH1-VH 영역 및 경쇄는 적어도 VL 영역, 바람직하게는 적어도 상기 CD40 작용제 항체의 CL-VL 영역을 포함한다. 적어도, 상기 중쇄 또는 경쇄는 임의로 링커, 예를 들면, 펩타이드성 링커를 통해 적어도 CD40L의 CD40 결합 도메인에 융합 또는 접합된다.

구체적인 구현예에서, 본 발명의 상기 CD40 활성화 단백질은 CD40 작용제 IgG 항체의 중쇄 및 경쇄, 예를 들면, 동형 불변 영역 또는 IgG Fc 영역, 바람직하게는 IgG4 또는 돌연변이된 사일런트 IgG Fc를 포함한다.

보다 구체적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 상기 CD40 활성화 단백질은 경쇄 화학식 αCD40Light-PL-CD40L의 경쇄 및 화학식 αCD40Heavy-(PL-Ag)x의 중쇄를 포함하는 항체-유사 단백질이고, 여기서,

· αCD40Light는 CD40 작용제 항체의 경쇄이고;

· αCD40Heavy는 CD40 작용제 항체의 중쇄이고;

· Ag는 동일하거나 상이한 바이러스 또는 암 항원이고;

· x는 1 내지 20, 예를 들면 3, 4, 또는 5의 정수이고;

· CD40L은 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 14에 대해 적어도 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 이의 기능성 단편을 포함하는 CD40의 리간드의 결합 도메인이고;

· -는 공유결합성 결합이다.

다른 보다 구체적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 상기 CD40 활성화 단백질은 화학식 αCD40Heavy-PL-CD40L의 중쇄 및 화학식 αCD40Light-(PL-Ag)x의 경쇄를 포함하는 항체-유사 단백질이고, 여기서,

· αCD40Light는 CD40 작용제 항체의 경쇄이고;

· αCD40Heavy는 CD40 작용제 항체의 중쇄이고;

· Ag는 동일하거나 상이한, 바이러스 또는 암 항원이고;

· x는 1 내지 20, 예를 들면 3, 4, 또는 5의 정수이고;

· CD40L은 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 14에 대해 적어도 90%, 95% 또는 100% 동일성을 지닌 이의 기능성 단편을 포함하는 CD40의 리간드의 결합 도메인이고;

· -은 공유결합성 결합이다.

구체적인 구현예에서, PL은 바람직하게는 세포 생산에서 최적의 활성화 특성및 수율을 보증하는 펩타이드 링커이다.

구체적인 구현예에서, -(PL-Ag)x는 상기 CD40 활성화 항체-유사 단백질의 중쇄의 카복시 말단에 위치한다.

전형적으로, 상기 CD40 활성화 단백질의 구현예의 개략적인 표시는 도 1에 나타낸다. αCD40Light, αCD40Heavy, 및 CD40L의 바람직한 구현예는 다음 단락에 추가로 기술되어 있다.

특정의 구현예에서, 펩타이드 링커는 글리코실화 부위를 포함할 수 있거나 2차 구조를 도입할 수 있다. 또한, 이러한 링커는 융합 단백질의 발현 효능 및 안정성을 증가시킬 수 있고 그 결과 수지 세포에 대한 항원 표시의 효능을 증가시킬 수 있다. 이러한 링커는 flexV1, f1, f2, f3 및/또는 f4 링커를 포함한다. 이러한 예 및 다른 것은 WO 2010/104747에 논의되어 있고, 이의 내용은 본원에 참고로 포함된다. 특히, flexV1는 SEQ ID NO: 15의 폴리펩타이드이다.

보다 구체적인 구현예에서, 상기 CD40 활성화 단백질은 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 12로 이루어진 PAB3405 CD40 작용제 항체를 포함한다.

다른 구체적인 구현예에서, 상기 CD40 활성화 단백질은 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4로 이루어진 PAB3408 CD40 작용제 항체를 포함한다.

다른 구체적인 구현예에서, 상기 CD40 활성화 단백질은 SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄로 이루어진다.

보다 구체적인 구현예에서, 상기 CD40 활성화 단백질은 SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 8을 포함하는 경쇄로 이루어진다.

다른 구체적인 구현예에서, 상기 CD40 활성화 단백질은 SEQ ID NO: 9를 포함하는 중쇄 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 10을 포함하는 경쇄로 이루어진다.

다른 구체적인 구현예에서, 상기 CD40 활성화 단백질은 SEQ ID NO: 11을 포함하는 중쇄 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 12를 포함하는 경쇄로 이루어진다.

다른 구체적인 구현예에서, 상기 CD40 활성화 단백질은 SEQ ID NO: 109의 경쇄 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 110의 중쇄 폴리펩타이드로 이루어진다.

상기 정의한 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 예를 들면 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 지닌 CD40 활성화 단백질은 또한 본 개시내용의 부분이다.

본 발명의 융합 단백질을 제조하는데 사용하기 위한 CD40 작용제

기술자는 당해 분야에 이미 공지된 CD40 작용제 항체를 사용하거나 항체 스크리닝 기술을 사용하여 새로이(de novo) 신규한 CD40 활성화 항체를 생성할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 CD40 활성화 단백질에서 사용하기 위한 상기 CD40 작용제 항체(또는 이의 항원-결합 단편)는 다음의 유리한 특성 중 하나 이상을 갖는다:

(i) 이는, 예를 들면 하기 실시예에 기술된 바와 같은 SPR 결합 검정에 의해 측정된 바와 같이, CD40 엑토도메인(ectodomain)에 대해 500 nM 이하, 예를 들면 50 내지 500 nM의 K_D로 결합하고;

(ii) 이는, 예를 들면 하기 실시예에 기술된 B 세포 증식 검정으로 측정된 바와 같이, 유동 세포분석법적 분석에 의해 시험관내에서 측정한 것으로서, B 세포의 증식을 유도하고; 및/또는

(iii) 이는 하기 실시예에 기술된 수지 세포 활성화 검정으로 시험관 내에서 측정된 바와 같이 사이토킨, 예를 들면 IL-6, IL-12, 또는 IL-15의 분비를 유도한다.

구체적인 구현예에서, 상기 CD40 작용제 항체는 다음 특성 중 하나 이상을 갖는다:

(i) 이는 하기 실시예에 기술된 바와 같이, SPR에 의해 측정된 것으로서, CD40 엑토도메인에 500 nM 이하, 예를 들면 50 내지 500 nM의 K_D로 결합하고;

(ii) 상기 작용체 항체를 사용한 B 세포 증식 검정에서 측정된 것으로서 B 세포의 증식이 예를 들면 하기 실시예에 기술된 바와 같은 검정을 사용하여, 가용성 CD40L의 준최적 용량의 존재하에서, 전형적으로 적어도 10배, 또는 적어도 100배까지 추가로 증가할 수 있고; 및/또는

(iii) 사이토킨, 예를 들어, IL-6, IL-12, 또는 IL-15의 분비는 예를 들면, 하기 실시예에 기술된 검정을 사용하여, 수지 세포 활성화 검정에서 시험관 내 측정된 바와 같이, 가용성 CD40L의 존재하에 전형적으로 적어도 10배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 1000배 강화될 수 있다.

구체적인 구현예에서, CD40 작용제 항체는 동일한 세포-기반 검정은 동일한 세포-기반 검정에서 측정된 바와 같이 참고 CD40 작용제 항체의 CD40 매개된 신호전달 활성과 적어도 유사한 세포-기반 검정에서 CD40L의 부재하에서 CD40 매개된 신호전달 활성을 갖는 항체이고, 상기 참고 CD40 작용제 항체는 다음의 CD40 작용제 항체 중에서 전형적으로 선택된다: 하기 기술된 바와 같은 mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 및 mAb6.

구체적인 구현예에서, 상기 CD40 작용제 항체는 CD40에 대한 결합에 대해 sCD40L과 경쟁하지 않는다.

구체적인 구현예에서, 가용성 사람 CD40L의 불변 준최적량(6 nM)의 존재하에서, CD40 작용제 항체는 CD40 작용제 항체 mAb5(CP-870,893)에 대해 측정된 EC50이 1 내지 200배, 바람직하게는 1 내지 150배, 또는 1 내지 100배인 EC50을 갖는다(실시에에 기술된 B 세포 증식 검정에서 측정됨).

다른 구체적인 구현예에서, 가용성 사람 CD40L의 불변 준최적량(6 nM)의 존재하에서, CD40 작용제 항체는 mAb 1(11B6) 항체의 EC50 이하인 EC50을 갖는다(실시예에 기술된 B 세포 증식 검정에서 측정됨).

B 세포 증식 검정에서 측정된 바와 같은 상대적인 EC50 값은 또한 실시예에 기술되어 있다 (도 2 및 도 3에 대한 표들 참조).

신규한 CD40 작용제 항체를 선택하기 위하여, 항체를 스크리닝하는 다양한 방법이 당해 분야에 기술되어 있다. 항체 DNA 암호화 라이브러리를 생성하고, 항체 생산을 위해 적절한 시스템에서 DNA 라이브러리를 발현시키고, 친화성 선택 기준으로 표적에 결합하는 항체 후보물을 발현하는 클론을 선택하고 선택된 클론의 상응하는 암호화 서열을 회수하는 이러한 방법은 생체내 시스템, 예를 들면, 항원 면역화 및 시험관내 시스템에서 완전한 사람 항체를 생산한 수 있는 유전자이식 마우스로 나눌 수 있다.

이러한 시험관 내 기술은 디스플레이 기술로서 알려져 있고, 제한없이, 파아지 디스플레이, RNA 또는 DNA 디스플레이, 리보소옴 디스플레이, 효모 또는 포유동물 세포 디스플레이를 포함한다. 이는 당해 분야에 잘 기술되어 있다(검토를 위해서는, 예를 들면: Nelson et al., 2010 Nature Reviews Drug discovery, "Development trends for human monoclonal antibody therapeutics" (Advance Online Publication) 및 Hoogenboom et al. in Method in Molecular Biology 178:1-37, O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001 참고). 하나의 구체적인 구현예에서, 사람 재조합체 CD40 작용제 항체는 CD40 결합 및 작용제 특성을 지닌 사람 재조합 항체 라이브러리를 스크리닝 하는 파아지 디스플레이 방법을 사용하여 단리한다.

V_H 및V_L유전자 또는 관련된 CDR 영역의 레퍼토리는 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝되거나 DNA 합성기로 합성하고 파아지 라이브러리내에서 무작위로 재조합시킬 수 있고, 이는 이후 항원-결합 클론에 대해 스크리닝할 수 있다. 사람 항체를 단리하기 위한 이러한 파아지 디스플레이 방법은 당해 분야에 확립되어 있거나 하기 실시예에 기술되어 있다. 예를 들면: 미국 특허 Nos. 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698 (Ladner et al.); 미국 특허 Nos. 5,427,908 및 5,580,717 (Dower et al.); 미국 특허 Nos. 5,969,108 및 6,172,197 (McCafferty et al.); 및 미국 특허 Nos. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 (Griffiths et al) 참고.

특정의 구현예에서, CD40에 대해 지시된 사람 항체는 마우스 시스템보다는 사람 면역계의 부분을 수반하는 유전자이식 또는 염색체이식 마우스를 사용하여 확인할 수 있다. 이러한 유전자이식 및 염색체이식 마우스는 본원에 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 지칭된 마우스를 포함하고, 본원에서 "사람 Ig 마우스"로 총괄적으로 지칭된다.

HuMAb mouse^®(Medarex, Inc.)는 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자자리를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재정렬되지 않은 사람 중쇄(μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 암호화하는 사람 면역글로불린 유전자 미니유전자자리(minilocus)를 함유한다(예컨대: Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859 참고).

다른 구현예에서, 사람 CD40 작용제 항체는 전이유전자 및 전이염색체 상에서 사람 면역글로불린 서열을 수반하는 마우스, 예를 들면, 사람 중쇄 전이유전자 및 사람 경쇄 전이염색체를 수반하는 마우스를 사용하여 유발시킬 수 있다. 본원에서 "KM 마우스"로서 지칭된 이러한 마우스는 PCT 공보 WO 02/43478 (Ishida et al.)에 기술되어 있다.

모노클로날 항체(mAb)는 또한 통상적인 모노클로날 항체 방법, 예컨대, 문헌: Kohler and Milstein의 표준 체세포 하이브리드화 기술(1975 Nature 256: 495)에 의해 생산할 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위한 많은 기술은, 예컨대 B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성 형질전환을 사용할 수 있다.

하이브리도마를 제조하기 위한 동물 시스템은 쥐 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마 생산은 잘 확립된 과정이다. 면역화 프로토콜 및 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리를 위한 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 융합 파트너(예컨대, 쥐 골수종 세포) 및 융합 과정은 또한 공지되어 있다.

키메라 또는 사람화된 항체는 상술한 바와 같이 제조된 쥐 모노클로날 항체의 서열을 기반으로 제조할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 암호화하는 DNA는 목적한 쥐 하이브리도마로부터 수득될 수 있고 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 비-쥐(예컨대, 사람) 면역글로불린 서열을 함유하도록 가공될 수 있다. 예를 들면, 키메라 항체를 생성하기 위하여, 쥐 가변 영역을 사람 불변 영역에 당해 분야에 공지된 방법(참고: 예컨대, 미국 특허 No. 4,816,567 (Cabilly et al.))을 사용하여 연결시킬 수 있다. 사람화된 항체를 생성하기 위하여, 쥐 CDR 영역을 사람 골격내에 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 삽입시킬 수 있다. 예컨대, 미국 특허 No. 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et　al.) 참고.

모노클로날 항체를 상기 정의된 바와 같이 이의 CD40 작용제 특성에 대해 추가로 스크리닝하거나 최적화할 수 있는 것으로 또한 고려된다. 특히, 모노클로날 항는 본원에 제공된 모노클로날 항체 또는 사람화된 항체의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR의 아미노산 서열내에 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 변경을 가질 수 있는 것으로 고려된다. 항체의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 VJ 또는 VDJ 영역의 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5, 또는 CDR6의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10번 위치에서 아미노산은 보존된 또는 비-보존된 아미노산을 사용한 삽입, 결실, 또는 치환을 가질 수 있다. 치환될 수 있거나 치환을 구성할 수 있는 이러한 아미노산은 상기 개시되어 있다.

본 발명의 CD40 활성화 단백질을 제조하는데 사용하기 위해 당해 분야에 공지된 CD40 작용제 항체는 재조합체 CD40 작용제 항체 mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 및 mAb6를 포함하고, 이는 아래의 표 1 및 표 2에 기술된 바와 같이 이의 가변 중쇄 및 경쇄 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열에 의해 구조적으로 특성화된다.

mAb1 - mAb6의 가변 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열

항체	VH 아미노산 서열	VL 아미노산 서열
mAb1 [11B6 VH/VkV2]	SEQ ID NO:21	SEQ ID NO:22
mAb2 [11B6 VHV3/VkV2]	SEQ ID NO:23	SEQ ID NO:22
mAb3 [12B4]	SEQ ID NO:58	SEQ ID NO:59
mAb4 [24A3]	SEQ ID NO:60	SEQ ID NO:61
mAb5 [CP870893]	SEQ ID NO:62	SEQ ID NO:63
mAb 6 [12E12]	SEQ ID NO:64	SEQ ID NO:65

mAb1 - mAb6의 가변 중쇄 및 경쇄 뉴클레오타이드(nt) 암호화 서열

항체	VH Nt 암호화 서열	VL Nt 암호화 서열
mAb1 [11B6 VH/VkV2]	SEQ ID NO:24	SEQ ID NO:25
mAb2 [11B6 VHV3/VkV2]	SEQ ID NO:26	SEQ ID NO:25
mAb3 [12B4]	SEQ ID NO:66	SEQ ID NO:67
mAb4 [24A3]	SEQ ID NO:68	SEQ ID NO:69
mAb5 [CP870,893]	SEQ ID NO:70	SEQ ID NO:71
mAb 6 [12E12]	SEQ ID NO:72	SEQ ID NO:73

사용될 수 있는 다른 CD40 작용제 항체는 상기 정의된 6개의 mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 또는 mAb6DML 6개의 CDR을 포함하는 임의의 키메라 또는 사람화된 항체를 포함한다.

본 개시내용에 따른 일부 CD40 작용제 항체의 VH CDR1(또한 HCDR1으로 명명됨), VH CDR2(또한 HCDR2로 명명됨), VH CDR3(또한 HCDR3으로 명명됨), VL CDR1(또한 LCDR1로 명명됨), VL CDR2(또한 LCDR2로 명명됨), VL CDR3(또한 HCDR3로 명명됨)가 표 3에 나타나 있다.

표 3에서, 본 개시내용의 항체의 CDR 영역은 카밧 번호매김(Kabat et al., 1992, 이하 "Kabat et al.")을 사용하여 기술된다.

카밧 번호매김에 따른 mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 및 mAb6의 CDR 영역

오리지날 항체	HCDR1	HCDR2	HCDR3	LCDR1	LCDR2	LCDR3
mAb1 [11B6 VH/VkV2]	SEQ ID NO: 27	SEQ ID NO: 28	SEQ ID NO: 29	SEQ ID NO: 30	SEQ ID NO: 31	SEQ ID NO: 32
mAb2 [11B6 VHV3/VkV2]	SEQ ID NO: 27	SEQ ID NO: 28	SEQ ID NO: 29	SEQ ID NO: 30	SEQ ID NO: 31	SEQ ID NO: 32
mAb3 [12B4]	SEQ ID NO: 74	SEQ ID NO: 75	SEQ ID NO: 76	SEQ ID NO: 77	SEQ ID NO: 78	SEQ ID NO: 79
mAb4 [24A3]	SEQ ID NO: 80	SEQ ID NO: 81	SEQ ID NO: 82	SEQ ID NO: 83	SEQ ID NO: 84	SEQ ID NO: 85
mAb5 CP870893	SEQ ID NO: 86	SEQ ID NO: 87	SEQ ID NO: 88	SEQ ID NO: 89	SEQ ID NO: 90	SEQ ID NO: 91
mAb6 [12E12]	SEQ ID NO: 92	SEQ ID NO: 93	SEQ ID NO: 94	SEQ ID NO: 95	SEQ ID NO: 96	SEQ ID NO: 97

구체적인 구현예에서, CD40 작용제 항체는 다음 항체로부터 선택된다:

(i) mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 또는 mAb6의 6개의 CDR을 포함하는 사람화된 항체;

(iii) (i) 또는 (ii)에서 확인된 항체 중 적어도 하나와 CD40 발현 세포에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체,

특히, 구체적인 구현예에서, CD40 작용제 항체는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 잔기 36 내지 59번(CD40의 CDR1 영역)을 포함하거나 이로 이루어진 에피토프 영역에 결합한다. 보다 구체적으로, 이는 CD40의 아미노산 잔기 50 내지 58번을 포함하거나 이로 이루어진 에피토프 영역에 결합한다. 특정의 구현예에서, CD40 작용제 항체는 적어도 다음의 아미노산 잔기에 직접 접촉한다: E56 및 E58. 다른 구현예에서, CD40 작용제 항체는 적어도 다음의 아미노산 잔기와 직접 접촉한다: D50 및 E58.

CD40 작용제 항체의 다른 예는 WO 2010/009346, WO 2010/104747 및 WO 2010/104749에 기술되어 있다. 개발시 다른 항-CD40 작용제 항체는 다음을 포함한다:

CP-870,893 - Pfizer에 의해 개발된 완전한 사람 IgG2　CD40 작용제 항체. 이는 CD40와 3.48Х10^-10　M의 K_D로 결합하지만, CD40L의 결합을 차단하지 않는다(예컨대, 미국 특허 No. 7,338,660 참고).

SGN-40은 마우스 항체 클론 S2C6로부터 Seattle Genetics에 의해 개발된 사람화된 IgG1 항체이고, 이는 면역원으로서 사람 방광 암종 세포주를 사용하여 생성되었다. 이는 CD40에 1.0Х10^-9　M의 KD로 결합하며 CD40과 CD40L 사이의 상호작용을 향상시킴을 통해 작동하므로, 부분적인 작용제 효과를 나타낸다(Francisco J A, et al., Cancer Res, 60: 3225-31, 2000).

또한, APEXIGEN에 의한 US20120301488A1은 다른 항-CD40 작용성 mAb를 기술한다. AbbVie Biotherapeutics Inc의 US 특허 출원 20170342159호는 다른 작용제 항체를 기술한다.

Celldex에 의한 작용제 CD40 항체인, CDX-1140는 다른 작용제 항체이다.

임의의 다른 공지된 항체는 본 출원에 나타낸 방법을 사용하여 연결된 CD40L과 잠재적으로 조합시켜 이의 생물학적 활성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 CD40 활성화 단백질을 암호화하는 핵산 분자

또한 본 발명의 CD40 활성화 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 본원에 개시된다.

핵산 분자의 예는 앞서의 단락에 개시된 바와 같이, 및 임의로, 숙주 세포 종에 따라 코돈 편향을 고려하여, CD40 활성화 항체-유사 단백질의 가변 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 암호화하는 것이다.

전형적으로, 본 발명의 CD40 활성화 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2로 이루어진 CD40 작용제 항체의 암호화 서열, 예를 들면 SEQ ID NO: 33 및 SEQ ID NO: 34 각각의 핵산을 포함한다.

구체적인 구현예에서, CD40 활성화 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4로 이루어진 CD40 작용제 항체의 암호화 서열, 예를 들면 SEQ ID NO: 35 및 SEQ ID NO: 36 각각의 핵산을 포함한다.

다른 구체적인 구현예에서, CD40 활성화 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄를 포함하는 암호화 서열, 예를 들면, SEQ ID NO: 37 및 SEQ ID NO: 38 각각의 핵산을 포함한다.

다른 구체적인 구현예에서, CD40 활성화 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 8을 포함하는 경쇄의 암호화 서열, 예를 들면 SEQ ID NO: 39 및 SEQ ID NO: 37 각각의 핵산을 포함한다.

다른 구체적인 구현예에서, CD40 활성화 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 9를 포함하는 중쇄 폴리펩타이드의 암호화 서열 및 SEQ ID NO: 10의 경쇄의 암호화 서열, 예를 들면 SEQ ID NO: 41 및 SEQ ID NO: 42 각각의 핵산을 포함한다.

다른 구체적인 구현예에서, CD40 활성화 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 중쇄 폴리펩타이드의 암호화 서열 및 SEQ ID NO: 12를 포함하는 경쇄의 암호화 서열, 예를 들면 SEQ ID NO: 43 및 SEQ ID NO: 44 각각의 핵산을 포함한다.

다른 구체적인 구현예에서, CD40 활성화 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 110을 포함하는 중쇄 폴리펩타이드의 암호화 서열 및 SEQ ID NO: 109를 포함하는 경쇄의 폴리펩타이드, 예를 들면 SEQ ID NO: 114 및 SEQ ID NO: 113 각각의 핵산을 포함한다.

상기 정의된 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 예를 들면, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 지닌 본 발명의 CD40 활성화 단백질을 암호화하는 핵산은 또한 본 개시내용의 부분이다.

본 발명은 또한 포유동물 세포, 예를 들면, CHO 또는 HEK 세포주에서 단백질 발현을 위해 최적화된 후자의 서열로부터 유래된 핵산 분자에 관한 것이다.

핵산은 전체 세포, 세포 분해물 속에 존재할 수 있거나, 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태인 핵산일 수 있다. 핵산은 표준 기술, 예를 들면, 알칼린/SDS 처리, CsCl 밴딩(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당해 분야에 잘 공지된 다른 것(Ausubel et al., 1988)에 의해, 다른 세포 구성성분 또는 다른 오염물질, 예컨대, 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제하는 경우 "단리"되거나 "실질적으로 순수"하다. 본 개시내용의 핵산은 예를 들면, DNA 또는 RNA일 수 있고 인트론성 서열을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 구현예에서, 핵산은 벡터, 예를 들면, 파아지 디스플레이 벡터, 또는 재조합 플라스미드 벡터 내에 존재할 수 있다.

본 개시내용의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들면, VH 및 VL 분절을 암호화하는 DNA 단편을 수득하는 경우, 이러한 DNA 단편은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작하여, 예를 들면, 가변 영역 유전자를 완전한 길이의 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다.

CD40 활성화 단백질을 생산하는 트랜스펙토마(transfectoma)의 생성

본 발명의 CD40 활성화 단백질은, 예를 들면, 당해 분야에 잘 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법(Morrison, 1985)의 조합을 사용하여 숙주 세포 트랜스펙토마를 생산할 수 있다.

예를 들면, CD40 활성화 단백질을 발현시키기 위하여, 상기 CD40 활성화 단백질을 암호화하는 DNA를 표준 분자 생물학 또는 생화학 기술(예컨대, DNA 화학적 합성, PCR 증폭 또는 목적한 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 cDNA 클로닝)로 수득할 수 있고 DNA는 발현 벡터 내로 삽입함으로써 유전자가 전사 및 해독 제어 서열에 작동적으로 연결되도록 할 수 있다. 본 문맥에서, 용어 "작동적으로 연결된"은 유전자가 벡터내로 연결되어 벡터내 전사 및 해독 제어 서열이 CD40 활성화 단백질의 전사 및 해독을 조절하는 이의 의도된 기능을 제공하도록 함을 의미하기 위해 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 혼화성이 되도록 선택된다. CD40 활성화 단백질이 명백한 폴리펩타이드, 예를 들면 상기 단락에 개시된 바와 같은 CD40 활성화 항체-유사 단백질의 중쇄를 암호화하는 하나의 서열 및 상기 CD40 활성화 항체-유사 단백질의 경쇄를 암호화하는 다른 것을 포함하는 경우, 유전자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄는 별개의 벡터내로 삽입될 수 있거나, 보다 전형적으로, 유전자 둘 다는 동일한 발현 벡터내로 삽입된다. 유전자는 표준 방법(예컨대, 단백질 유전자 및 벡터 상의 상보성 제한 부위의 연결, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 블런트 말단 연결)에 의해 발현 벡터내로 삽입된다.

신호 펩타이드, 예를 들면, 면역글로불린 신호 펩타이드 또는 이종 신호 펩타이드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩타이드)를 발현 세포 밖으로 폴리펩타이드의 분비를 위해 사용할 수 있다.

또한, 본원에 개시된 재조합체 발현 벡터는 숙주 세포내에서 CD40 활성화 단백질의 발현을 제어하는 조절 서열을 수반한다. 용어 "조절 서열"은 각각의 유전자의 전사 또는 해독을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 성분(예컨대, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 발현 벡터의 설계, 예를 들면, 조절 서열의 선택은 형질전환될 숙주 세포의 선택, 목적한 단백질의 발현 수준 등과 같은 요인에 의존할 수 있음이 당해 분야의 기술자에 의해 인식될 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열은 포유동물 세포 내에서 고 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 성분, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스(예컨대, 아데노바이러스 주요 레이트 프로모터(adenovirus major late promoter)(AdMLP)), 및 폴리오마(polyoma)로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 비바이러스 조절 서열, 예를 들면, 우비퀴틴 프로모터 또는 P-글로빈 프로모터를 사용할 수 있다. 여전히 또한, 조절 성분은 상이한 공급원으로부터의 서열, 예를 들면, SRa 프로모터 시스템으로 구성되며, 이는 SV40 얼리 프로모터로부터의 서열 및 사람 T 세포 백혈병 바이러스 제1형의 긴 말단 반복체를 함유한다.

추가로, 본 개시내용의 재조합체 발현 벡터는 추가의 서열, 예를 들면, 숙주 세포내에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예컨대, 복제 오리진) 및 선택가능한 마커 유전자를 수반할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 촉진한다(참고: 예컨대, 미국 특허 Nos. 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 (모두 Axel et al.)). 예를 들면, 전형적으로 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포 상에서, 약물, 예를 들면, G418, 하이드로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 선택가능한 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭을 지닌 dhfr- 숙주에서 사용하기 위한) 및 neo 유전자(G418 선택을 위한)를 포함한다.

CD40 활성화 단백질의 발현을 위해, 발현 벡터는 표준 기술에 의해 숙주 세포내로 형질감염된다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 도입하는데 일반적으로 사용된 광범위한 기술, 예컨대, 전기천공(electroporation), 인산칼슘 침전, DEAD-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 결합 단백질을 원핵 또는 진핵 숙주 세포내에서 발현시키는 것이 이론적으로 가능하다. 진핵 세포, 예를 들면, 포유동물 숙주 세포, 효모 또는 사상 진균(filamentous fungi) 내에서 재조합체 단백질의 발현이 논의되어 있는데 이는 이러한 진핵 세포, 및 특히 포유동물 세포가 원핵 세포보다 더 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 조립 및 분비하는 경향이 있기 때문이다.

하나의 구체적인 구현예에서, 본 개시내용에 따른 클로닝 또는 발현 벡터는 적합한 프로모터 서열에 작동적으로 연결된, 앞서의 단락에 기술된 바와 같은 핵산 중 하나 이상을 포함한다.

본 개시내용의 재조합체 항체를 발현시키기 위한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary)(CHO 세포), 예를 들면, DHFR 선택가능한 마커와 함께 사용된 dhfr- CHO 세포(Urlaub and Chasin, 1980에 기술된 바와 같음), CHOK1 dhfr+ 세포주, NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포, 예를 들면 GS Xceed^TM 유전자 발현 시스템(Lonza)과 함께 GS CHO 세포주, 또는 HEK 세포를 포함한다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합체 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포내로 도입된 경우, 항체는 숙주 세포를 숙주 세포 내에서 항체를 발현시키기에 충분한 기간 동안 배양하고, 임의로, 숙주 세포가 성장한 배양 배지 내로 항체를 분비시킴으로써 생산된다. 항체는 예를 들면, 표준 단백질 정제 방법을 사용한 이의 분비 후 배양 배지로부터 회수 및 정제할 수 있다.

하나의 구체적인 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 선행 단락에 개시된 바와 같은 CD40 활성화 단백질의 암호화 서열을 갖는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포이다.

후자의 숙주 세포는 이후에 상기 CD40 활성화 단백질의 발현 및 생산에 적합한 조건 하에서 추가로 배양시킬 수 있다.

약제학적 조성물

다른 양태에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된, CD40 활성화 단백질를 함유하는 조성물, 예컨대 약제학적 조성물을 제공한다.

본원에 개시된 약제학적 조성물은 또한 조합 치료요법, 즉, 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 조합 치료요법은 적어도 하나의 항-바이러스제, 소염제, 백신 보조제 및/또는 다른 항-증식제와 조합된, 본 개시내용의 CD40 활성화 단백질을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 혼용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항세균 및 항진균제, 증장성 제제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 상피 투여(예컨대, 주사 또는 주입에 의한)용으로 적합하여야 한다. 일 구현예에서, 담체는 피하 투여용으로 적합하여야 한다. 투여 경로에 따라서, 활성 화합물, 즉, CD40 활성화 단백질은 물질 속에 코팅되어 화합물을 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 보호할 수 있다.

멸균 포스페이트-완충된 염수는 약제학적으로 허용되는 담체의 하나의 예이다. 다른 적합한 담체는 당해 분야에서 잘 공지된 것이다(Remington and Gennaro, 1995). 제형은 또한 하나 이상의 부형제, 방부제, 가용화제, 완충제, 바이러스 표면에서 단백질 손실을 방지하기 위한 알부민 등을 추가로 포함할 수 있다.

약제학적 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 요법은 치료될 상태, 질병의 중증도, 환자의 연령, 체중, 및 성별 등에 천연적으로 의존한다.

본 개시내용의 약제학적 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 안내 투여 등을 위해 제형화될 수 있다.

바람직하게는, 약제학적 조성물은 비히클(vehicle)을 함유하며, 이는 주사될 수 있는 제형에 대해 약제학적으로 허용가능하다. 이는 특히 등장성, 멸균성, 염수 용액(인산일나트륨 또는 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 이러한 염의 혼합물), 또는 첨가시 멸균수 또는 생리학적 염수의 경우에 따라, 주사가능한 용액의 구성을 허용하는 무수, 특히 동결-건조된 조성물일 수 있다.

투여용으로 사용된 용량은 다양한 매개변수의 함수로서, 및 사용된 투여 방식, 관련 병리학, 또는 대안적으로 목적한 치료 기간의 함수로서 채택될 수 있다.

약제학적 조성물을 제조하기 위하여, 유효량의 CD40 활성화 단백질을 약제학적으로 허용되는 담체 또는 수성 매질 속에 용해하거나 분산시킬 수 있다.

주사가능한 용도에 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 참깨 오일, 땅콩 오일 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말 또는 동결건조물을 포함한다. 모든 경우에, 이러한 형태는 멸균성이어야만 하고 용이한 주사가능성이 존재하는 정도까지 유동성이어야만 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야만 하고 미생물, 예를 들면, 세균 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야만 한다.

유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서 활성 화합물의 용액은 표면활성제, 예를 들면, 하이드록시프로필셀룰로즈와 적합하게 혼합된 물 속에서 제조할 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이의 혼합물 및 오일 속에서 제조할 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건 하에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 방지하는 방부제를 함유한다.

제형에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 염은 산 부가 염(단백질의 유리 아미노 그룹으로 형성됨)을 포함하고 이는 무기산, 예를 들면, 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예를 들면, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등으로 형성된다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 산화철, 및 유기 염기, 예를 들면, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도될 수 있다.

담체는 또한, 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 코팅, 예를 들면, 레시틴을 사용함으로써, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 표면활성제의 사용에 의해 유지시킬 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 이룰 수 있다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들면, 슈가 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능항 조성물의 연장된 흡수는 조성물 속에서 흡수 지연제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 달성할 수 있다.

멸균 주사가능한 용액은 상기 열거한 다양한 다른 성분이 들어있는 적절한 용매 속에서 필요량의 활성 화합물을 혼입시킨 다음, 여과된 멸균에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균 활성 성분을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 요구된 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조한다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이전의 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가의 목적한 성분의 분말을 수득하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.

직접 주사하기 위한 보다 또는 고도로 농축된 용액의 제조가 또한 고려되며, 여기서 용매로서 DMSO의 사용은 극도로 신속한 침투로 고 농도의 활성 성분을 작은 종양 면적에 전달하는 것으로 고려된다.

제형화시, 용액은 치료학적으로 효과적인 투여량 제형 및 양과 혼화성인 방식으로 투여될 것이다. 제형은 다양한 투여량 형태, 예를 들면, 상술한 주사가능한 용액의 유형으로 용이하게 투여되나, 약물 방출 캡슐 등이 또한 사용될 수 있다.

수용액으로 비경구 투여하기 위해서, 예를 들면, 용액은 필요한 경우 적합하게 완출될 수 있고 액체 희석제는 우선 충분한 염수 또는 글루코스와 등장성이 될 수 있다. 이러한 특수한 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여용으로 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시내용의 측면에서 당해 분야의 기술자에게 공지될 것이다. 예를 들면, 하나의 투여량을 1 ml의 등장성 NaCl 용액 속에 용해하고 1000 ml의 대량피하주사 유액(hypodermoclysis fluid)에 가하거나 목적한 주입 부위에 주사할 수 있다(참고: 예를 들면, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580). 투여량에서 일부 변화는 필수적으로 치료되는 대상체의 상태에 따라 발생할 것이다. 투여에 관여하는 대상체는 어떠한 상태에서도, 개개 대상체에 적절한 용량을 결정할 것이다.

CD40 활성화 단백질은 치료학적 혼합물 내에서 투여량 당 약 0.0001 내지 1.0 밀리그램, 또는 약 0.001 내지 0.1 밀리그램, 또는 약 0.1 내지 1.0 또는 심지어 1.0 내지 약 10 밀리그램을 포함하도록 제형화될 수 있다. 다중 용량을 또한 투여할 수 있다.

백신 조성물

본 발명은 또한 본 발명의 CD40 활성화 단백질 및 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 백신에 관한 것이다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "백신"은 사람 또는 동물에게 투여되어 면역 반응을 유도할 수 있는 조성물을 의미하는 것으로 의도되며; 이러한 면역 반응은 항체의 생산 또는 단순히 특정 세포, 특히 항원-제시 세포, T 림프구 및 B 림프구의 활성화를 생성할 수 있다. 특정의 구현예에서 백신은 백신으로 제공된 항원과 관련하여 환자에서 중화 항체의 생산을 초래하는 면역 반응을 생산할 수 있다. 백신은 예방학적 목적 또는 치료학적 목적, 또는 둘 다를 위한 조성물일 수 있다.

백신은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 수성 매질 속에 용해 또는 분산된, 유효량의 본 발명의 CD40 활성화 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 접종물로서 또한 지칭될 수 있다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 임의의 통상의 매질 또는 제제가 활성 성분과 비혼화성인 한, 치료학적 조성물 속에서 이의 사용이 고려된다. 보충적인 활성 성분을 또한 조성물 내로 혼입시킬 수 있다. 본 개시내용의 백신 조성물은전통적인 약제학적 제제를 포함할 수 있다. 분산제는 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이의 혼합물 및 오일 속에서 제조할 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건 하에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 방지할 방부제를 함유한다.

또한, 바람직한 경우, 백신은 소량의 보조 물질, 예를 들면, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 및/또는 백신의 효능을 향상시키는 보조제를 함유할 수 있다. 효과적일 수 있는 보조제의 예는 수산화알루미늄, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, MTP-PE 및 RIBI를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 이는 2% 스쿠알렌/트윈 80 유액 속에 세균으로부터 추출된 3개의 구성성분인, 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 디마이콜레이트 및 세포 벽 골격(MPL+TDM+CWS)을 함유한다. 보조제의 다른 예는 DDA(디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드), 프루언트 완전 및 불완전 보조제(Freund's complete and incomplete adjuvant) 및 QuilA를 함유한다. 또한, 면역 조절 물질, 예를 들면, 림코킨(예컨대, IFN-[감마], IL-2 및 IL-12) 또는 합성 IFN-[감마] 유도인자, 예를 들면, 폴리 I:C 또는 폴리 ICLC(힐토놀)을 본원에 기술된 보조제와 함께 사용할 수 있다.

특정의 구현예에서, 보조제는 폴리 ICLC, CpG, LPS, 임뮤노퀴드(Immunoquid), PLA, GLA 또는 사이토킨 보조제, 예를 들면, IFNα 중에서 선택될 수 있다. 다른 구현예에서, 보조제는 톨-유사 수용체 작용제(TLR)일 수 있다. 사용될 수 있는 TLR 작용제의 예는 TLR1 작용제, TLR2 작용제, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR5 작용제, TLR6 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제 또는 TLR9 작용제를 포함한다.

활성 면역원성 성분으로서 CD40 활성화 단백질의 백신 제제는 주사가능하게, 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조될 수 있고; 감염 전에 용액, 또는 현탁액, 또는 액체에 적합한 고체 형태를 또한 제조할 수 있다. 제제는 리포좀 속에 유화, 캡슐화될 수 있다. 활성 면역원성 성분은 흔히 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 혼용성인 담체와 혼합된다.

본 발명의 CD40 활성화 단백질의 사용 방법

CD40 활성화 단백질 속에 존재하는 항원(들)에 대한 면역 반응을 유발시킴으로써, 본 발명의 CD40 활성화 단백질은 특히 암 또는 감염성 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약물로서 유용할 수 있다.

일부 구현예에서, CD40 활성화 단백질은 본 발명의 CD40 활성화 단백질을 대상체에게 투여함을 포함하여, 대상체에서 바이러스 감염 또는 암 질환으로부터 치료 또는 예방하기 위한 방법에서 사용될 수 있다.

여전히 추가의 양태는 이를 필요로 하는 상기 대상체에게 본 발명의 CD40 활성화 단백질 또는 백신을 투여함을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 바이러스 또는 종양 관련 항원에 대해 B 세포 및/또는 T 세포 반응을 유발 및/또는 향상시키는 방법에 관한 것이다.

추가의 양태는 이를 필요로 하는 대상체에서 항원에 대한 IgG 결합 항체 반응을 유도하는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 본 발명의 CD40 활성화 단백질 또는 본 개시내용의 백신 조성물을 투여함을 포함한다.

일부 구현예에서, 방법은 면역자극제의 투여를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 면역자극제는 백신 또는 치료학적 조성물에 순차적으로 또는 동시에 투여된다.

일부 구현예에서, 면역자극제는 백신 조성물을 대상체에게 주사하기 전에 백신 조성물고 일시적으로 혼합된다.

또한, 본 개시내용의 방법은 또한 하나 이상의 보조제의 투여를 포함할 수 있다. 보조제는 하나 이상의 백신 구성성분, 예를 들면, 항원 또는 CD40 활성화 단백질에 직접 또는 간접적으로 부착 또는 접합될 수 있다. 다른 구현예에서, 보조제가 백신 조성불과는 별도로 제공되거나 투여될 수 있다. 특정의 구현예에서 보조제는 폴리 ICLC, CpG, LPS, 임뮤노퀴드, PLA, GLA 또는 사이토킨 보조제, 예를 들면, IFNα이다. 다른 구현예에서, 보조제는 톨-유사 수용체 작용제(TLR)일 수 있다. 사용될 수 있는 TLR 작용제의 예는 TLR1 작용제, TLR2 작용제, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR5 작용제, TLR6 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제 또는 TLR9 작용제를 포함한다.

일부 구현예에서, 투여는 피내, 근육내, 또는 피하 투여를 포함한다.

일부 구현예에서, 바이러스 백신, 예컨대, 바이러스 항원을 포함하는 CD40 활성화 단백질은 환자에게 이러한 본원에 기술된 바와 같은 바이러스 백신을 투여함을 포함하여 적어도 하나의 바이러스 에피토프에 대한 면역 반응을 강화시키는 방법에서 사용된다.

일부 구현예에서, 이러한 바이러스 백신은 본 개시내용의 이러한 바이러스 백신을 상기 바이러스에 의해 감염되지 않은 건강한 대상체에게 투여함을 포함하여, 상기 바이러스에 의해 감염된 건강한 대상체를 예방하기 위해 사용된다(예방적 치료). 다른 구현예에서, 본 개시내용의 바이러스 백신은 환자에게 상기 바이러스 백신을 투여함을 포함하여, 바이러스 감염의 조기 단계에서 환자를 치료하는 방법에서 사용된다.

적어도 하나의 바이러스 항원은 숙주, 바람직하게는 사람 환자 또는 영장류에서 체액성 및/또는 세포 면역 반응 중 적어도 하나를 유발하는 것으로 고려된다

본 발명에 따른 백신 또는 약제학적 조성물의 투여는 표적 조직이 최대(또는 일부 경우에 최소) 면역 반응을 위한 부위에 항원의 전달을 극대화시키기 위한 경로를 통해 이용가능한 한 임의의 일반적인 경로를 통할 것이다. 백신의 투여는 일반적으로 정위(orthotopic), 경피, 점막, 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사에 의할 것이다. 다른 전달 부위는 경구, 비강, 볼내, 직장, 질내 또는 국소를 포함한다. 본 개시내용의 백신은 바람직하게는 주사에 의해, 예를 들면, 피하 또는 근육내 투여된다.

본 발명의 백신 또는 약제학적 조성물은 투여량 제형과 혼용성인 방식으로, 및 예방학적으로 및/또는 치료학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 투여될 양은 치료되는 대상체, 예를 들면, 대상체의 면역계가 항체를 합성하는 능력, 및 목적한 예방 또는 치료 정도에 의존한다. 적합한 투여량 범위는 약 0.1 mg 내지 1000 mg의 범위, 예를 들면, 약 1 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 약 10 mg 내지 50 mg의 범위로, 예방접종 당 수백 마이크로그램의 활성 성분의 차수이다.

투여되기에 필요한 활성 성분의 정확한 양은 숙련의의 판단에 의존하며 각각의 대상체에 대해 특이적일 수 있다. 치료학적 유효량의 본 발명의 CD40 활성화 단백질이 특히 투여 스케쥴, 투여된 항원의 단위 용량, CD40 활성화 단백질이 다른 치료제와 함께 투여되는지의 여부에 상관없이, 수용체의 면역 상태 및 건장, 및 특수한 CD40 활성화 ㄷㄴ백질의 치료학적 활성에 의존할 것임은 당해 분야의 기술자에게 명백할 것이다.

투여되는데 요구되는 활성 성분의 정밀한 양은 숙련의의 판단에 의존하며 각각의 대상체에게 특유할 수 있다. 치료학적 유효량의 본 발명의 CD40 활성화 단백질이 특히 투여 스케쥴, 투여된 항원의 단위 용량, CD40 활성화 단백질이 다른 치료제와 함께 투여되는지의 여부에 상관없이, 수용체의 면역 상태 및 건강, 및 특수한 CD40 활성화 단백질의 치료학적 활성에 의존할 것이다.

백신은 전형적으로 단일 용량 스케쥴 또는 다중 용량 스케쥴로 제공될 수 있다. 다중 용량 스케쥴은 예방접종의 주요 과정이 예컨대, 1 내지 10회의 별개의 용량에 이은 면역 반응을 유지 및/또는 보강하는데 필요한 후속적인 사간 간역, 예를 들면, 제2 용량에 대해 1 내지 4개월, 및 필요한 경우, 수개월 후 후속적인 용량(들)을 포함할 수 있다. 1 내지 5년, 일반적으로 3년의 간격에서 주기적인 부스터(booster)가 목적한 보호성 면역성의 수준을 유지하는데 바람직할 수 있다. 면역화 과정은 항원과 동시배양된 말초 혈액 림프구(PBL)의 시험관내 증식 검정, 및 프라임된 림프구로부터 방출된 IFN-[감마]의 수준을 측정함을 수반할 수 있다. 검정은 통상의 표지, 예를 들면, 방사뉴클레오타이드, 효소, 형광성 표지 등을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 기술은 당해 분야의 기술자에게 공지되어 있고 미국 특허 제3,791,932호, 제4,174,384호 및 제3,949,064호에서 찾을 수 있다.

백신은 하나 이상의 "단위 용량"으로 제공될 수 있다. 단위 용량은 이의 투여, 즉, 적절한 경로 및 치료 요법과 관련하여 목적한 반응을 생산하도록 계산된 백신의 예정된 양을 함유하는 것으로 정의된다. 투여될 양, 및 특수한 경로 및 제형은 임상 분야의 기술자의 기술내에 있다. 치료될 대상체, 특히, 대상체의 면역계의 상태 및 목적한 보호를 평가할 수 있다. 단위 용량은 단일 주사로서 투여될 필요가 없지만 설정된 기간에 걸쳐 연속적인 주입을 포함할 수 있다. 전달된 백신의 양은 대상체 당 약 0.001 내지 약 0.05 mg/kg의 체중, 예를 들면 0.1 내지 5 mg에서 변할 수 있다.

추가의 양태는 본 개시내용의 CD40 활성화 단백질, 본 개시내용의 핵산, 본 개시내용의 발현 벡터, 또는 본 개시내용의 숙주 세포, 및; 임의로 키트(kit)의 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트는 본원에 기술된 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 대상체에서 T 세포 반응 및/또는 B 세포 반응을 유발시키기 위함이며; 여기서 키트는 본 개시내용의 CD40 활성화 단백질 또는 본 개시내용의 백신을 포함한다.

본 발명을 다음의 실시예로 추가로 설명할 것이다. 그러나, 이러한 실시예는 본 발명이 영역을 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

도 1: 항-CD40 11B6-사람 CD40 IgG4에 의해 예시된 항-수용체 항체-리간드 융합 개념을 나타내는 카툰(cartoon). 관련 도메인이 나타나 있다: V_L은 경쇄 가변 영역이고; V_H는 중쇄 가변 영역이고; C_H는 H 쇄 불변 영역 1 내지 3이고; C_L은 경쇄 불변 영역이고; 링커 서열 및 주요 이황화물 결합은 회색 선으로 나타낸다. 본 발명은 H 쇄 C-말단에 융합된 리간드를 포함하는 융합체의 대안의 형태 및 다양한 항체 형태 및 동형을 예상하였다.
도 2. 일정한 저 용량의 가용성 사람 CD40L의 존재 및 부재하에 항온처리된 항-CD40 항체의 용량 범위에 대한 사람 B 세포의 증식 반응. 사람 PBMC를 사람 IL-4, 사람 IL-21, 및 용량 범위의 다양한 사람 IgG4 동형-일치된 항체(좌측에서 우측으로 나타냄: 10, 1, 0.1, 0.01 nM)와 함게 항온처리하고, 증식의 정도를 CFSE 희석물의 6일 후에 유동 세포분석법적 분석으로 측정하였다. 검정색으로 채워진 원 기호를 지닌 곡선은 항체 용량에 대한 반응이고, 회색으로 채워진 사각형 기호를 지닌 곡선은 100 ng/ml(6 nM)의 가용성 사람 CD40L의 존재하에서 항체 용량에 대한 반응이다. 데이타는 항체 또는 sCD40L(범위 6±4%)의 부재하에서 또는 항체의 부재하에서 그러나 sCD40L(11±7%)의 존재하에서 최대 증식(80±22%) 대 기본선 반복물에 대해 표준화시킨 상이한 공여체에서 평균 7개(11B6, 12B4, CP, IgG4) 또는 3개(12E12, 24A3)의 별도의 실험을 나타낸다.
도 3. 일정한 저 용량의 가용성 CD40L의 존재 및 부재하에서 항?꼐低?된 항-CD40 IgG4 항체의 용량 범위에 대한 사람 MDDC의 사이토킨 분비 반응. 사람 MCDC를 용량 범위(좌측에서 우측으로 나타냄: 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 nM)의 각각의 항-CD40 mAb와 함께 항온처리하고 사이토킨 분비의 정도를 2일 후에 측정하였다. 최대 반응은 100%에서 설정하였다. 검정색 원 기호를 지닌 곡선은 항체 단독에 대한 반응이고, 회색 사각형 기호를 지닌 곡선은 1 μg/ml의 가용성 사람 CD40L(60 nM)의 존재하에서 항체에 대한 반응이다. 데이타는 시험한 각각의 사이토킨(패널 A, IL-12 p40, 561 ng/ml; 패널 B, IL-15, 62 ng/ml)의 최대 분비에 대해 표준화된 단일 실험을 나타낸다. 유사한 용량 반응 경향성이 IL-6 분비(446 pg/ml 최대, 및 sCD40L에 대한 30 pg/ml 반응)에 대해 관찰되었다.
도 4. CD40L 결합의 항-CD40 항체 억제. 항-사람 CD40 마우스(좌측 패널) 또는 사람 IgG4(우측 패널) mAb의 적정 시리즈(titration series)를 일정한 양(2 μg/ml)의 사람 CD40 엑토도메인 사람 Fc(좌측 패널) 또는 마우스 Fc(right 패널) 융합 단백질에 2 μg/ml에 가하고 혼합물을 빙상에서 1시간 동안 항온처리한 다음 동일한 용적의 200K 사람 CD40L 안정하게 형질감염된 L 세포에 가하고, 빙상에서 1시간 동안 항온처리하고, 세척하고, 염소 항-마우스(상부 패널) 또는 항-사람(하부 패널) IgG-PE 시약과 함께 항온처리하고, 다시 세척하고, FACS 배열 장치에서 분석하였다. 결합의 상실은 시험 mAb가 세포 표면 CD40L에 대한 결합을 방해하는 방식으로 가용성 CD40에 결합함을 나타낸다.
도 5. 일정한 저 용량의 가용성 CD40L의 존재 및 부재하에서 항온처리된 용량 범위의 항-CD40 HIV5pep 항원 융합 단백질에 대한 사람 B 세포의 증식 반응. 사람 PBMC를 사람 IL-4, 사람 IL-21, 및 용량 범위의 mAb 또는 융합 단백질(좌측에서 우측으로 나타냄: 10, 1, 0.1 nM)과 함께 항온처리한 다음, 증식의 정도를 6일 후 CFSE 희석의 유동 세포분석법적 분석으로 측정하였다. 실선의 회색 사각형 기호를 지닌 곡선은 100 ng/ml (6 nM)의 가용성 사람 CD40L의 존재하에서 모 hIgG4 항체에 대해 반응성이고, 빈 원형 기호를 지닌 곡선은 항체-HIV5pep 융합 단백질 용량에 대해 반응성이고, 및 회색의 채워진 원형 기호를 지닌 곡선은 100 ng/ml(6 nM)의 가용성 사람 CD40L의 존재하에서 용량의 항체-HIV5pep 융합 단백질에 대해 반응성이다. 데이타는 sCD40L(6%의 범위)의 부재하에서 또는 항체의 부재하에서 그러나 sCD40L(12.5%)의 존재하에서 최대 증식(58%) 대 기본선 반복물에 대해 표준화된 단일 실험을 나타낸다. 참고를 위해 융합된 항원의 부재하에서 및 가해진 sCD40L의 존재 및 부재하에서 이러한 항체에 의해 유발된 증식석 B 세포 반응은 도 2에 반복하여 나타낸다.
도 6. 융합된 HIV5pep 항원의 존재 및 부재하에서 및 일정한 더 용량의 가용성 CD40L의 존재 및 부재하에서 항온처리된 용량 범위의 항-CD40 IgG4 항체에 대한 사람 MDDC의 세포 표면 활성화 마커 반응. 100 ng/ml(6 nM)의 가용성 사람 CD40L의 존재 또는 부재하에서 용량 범위(좌측에서 우측으로 나타냄: 10, 1, 0.1 nM)의 각각의 항-CD40 mAb 및 항-CD40.HIV5pep 융합 단백질 항체를 지닌 사람 MDDC 및 유동 세포분석법으로 측정된 CD86 및 DR의 높은 발현을 지닌 세포의 퍼센트. 검정색으로 채워진 원형 기호를 지닌 곡선은 항체 단독에 대해 반응성이고, 회색 사각형 기로로 채워진 곡선은 가용성 사람 CD40L의 존재하에서 항체에 대해 반응성이고, 빈 원형 기호를 지닌 곡선은 HIV5pep 단독에 융합된 항체에 대해 반응성이고, 회색의 채워진 원형 기호를 지닌 곡선은 가용성 사람 CD40L의 존재하에서 HIV5pep에 융합된 항체에 대해 반응성이다. 데이타는 단일의 대표적인 실험으로부터 수득한다.
도 7. sCD40의 존재 및 부재하에서 항온처리된 HIV-1-감염된 공여체 PBMC 배양물 속에서 HIV-1-특이적인 T 세포의 CD40-표적화된 HIV5pep의 확장. HIV-1⁺ 공여체 PBMC를 용량 범위의 항-CD40.HIV5pep 융합 단백질(좌측으로부터 우측으로 1, 0.1, 0.01 nM)과 함께 저 용량의 sCD40L(100 ng/ml; 6 nM) 및 IL-2의 존재 및 부재하에서 9일 동안 배양한 후, 5개의 HIV-1 Gag, Nef, 및 Pol 롱(long) 펩타이드로 6시간 동안 BFA와 함께 자극시킨 다음, ICS로 분석하였다. 데이타는 펩타이드 자극에 대한 반응시 IFNγ를 생산하는 항원-특이적인 CD8⁺ 및CD4⁺ T 세포의 배양의 말기에서의 퍼센트를 나타낸다. Y 축은 IFN⁺ CD3⁺ CD4⁺ 또는CD3⁺ CD8⁺ 세포의 퍼센트를 나타낸다.
도 8. 직접 융합된 CD40L의 존재 또는 부재하에서 일정한 저 용량의 가용성 CD40L과 함께 항온처리한 용량 범위의 항-CD40 hIgG4 mAb에 대한 사람 B 세포의 증식 반응. 사람 PBM를 사람 IL-4, 사람 IL-21과 함께, 및 용량 범위의 mAb 또는 융합 단백질(좌측에서 우측으로 나타냄: 10, 1, 0.1, 0.01 nM)과 함께 항온처리한 다음, 증식의 정도를 6일 후 CFSE 희석물의 유동 세포분석법적 분석으로 측정하였다. 검정색으로 채워진 원형 기호를 지닌 곡선은 hIgG4 항체 용량에 대해 반응성이고, 회색으로 채워진 사각형 기호를 지닌 곡선은 100 ng/ml(6 nM)의 가용성 사람 CD40L의 존재하에서 hIgG4 항체 용량에 대해 반응성이고, 검정으로 채워진 사각형 기호를 지닌 곡선은 직접 융합된 CD40L을 지닌 hIgG4 항체의 용량에 대해 반응성이다. 데이타는 항체 또는 sCD40L(10%)의 부재하에서 또는 항체의 부재하에서 그러나 sCD40L의 존재하에서(44.5%) 최대 증식(95%) 대 기본선 반복물에 대해 표준화된 단일 실험을 나타낸다. 도 2 및 5는 Ab 및 Ab + sCD40L에 대해 반복된 데이타를 함유한다.
도 9. 직접 융합된 사람 CD40L의 존재 및 부재하에서 및 일정한 저 용량의 가용성 CD40L의 존재 또는 부재하에서 항온처리된 용량 범위의 항-CD40 IgG4 항체에 대한 사람 MDDC의 사이토킨 분비 반응. 사람 MCDC를 용량 범위(좌측에서 우측으로 나타냄: 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 nM)의 각각의 항-CD40 mAb 또는 대조군 mAb와 함께 배양하고 사이토킨 분비의 정도를 2일 후에 측정하였다. 검정색으로 채워진 원형 기호를 지닌 곡선은 항체 단독에 대한 반응이고, 회색으로 채워진 사각형 기호를 지닌 곡선은 1 μg/ml(6 nM)의 가용성 사람 CD40L의 존재하에서 항체에 대한 반응이고, 검정색으로 채워진 사각형 기호를 지닌 곡선은 사람 CD40L에 직접 융합된 항체에 대한 반응이다. 데이타는 시험한 각각의 사이토킨의 최대 분비에 대해 표준화된 단일 실험을 나타낸다. 좌측 편 패널의 경우, 최대 값은 다음과 같다: IL-6, 469 ng/ml; IL-12p40, 561 ng/ml; IL-15, 62 ng/ml. 우측 편 패널의 경우 최대 값은 다음과 같다: IL-6, 6192 ng/ml; IL-12p40, 5776 ng/ml; IL-15, 194 ng/ml. Ab 및 Ab + sCD40 L에 대한 데이타는 도 3에 나타낸 것과 동일함에 주목한다.
도 10a. HIV5pep 항원에 대한 H 쇄 C-말단에서 및/또는 L 쇄 C-말단에 융합된 사람 CD40L로 융합된 항-CD40 11B6 mAb의 용량 범위에 대한 사람 B 세포 및 MDDC의 반응. 사람 PBMC 또는 MDDC를 용량 범위(좌측에서 우측으로 나타냄: 10, 1, 0.1 nM)의 각각의 IgG4 mAb와 함께 항온처리하고 B 세포 증식(좌측 패널) 또는 MDDC 사이토킨 분비(우측 패널)의 정도를 측정하였다. 이는 B 세포 증식의 최대 정도가 4% 기본선과 함께 31%인 반면, 사이토킨 생산 데이타가 실험 내에서 IL-6(610 pg/ml), IL-15(2,250 pg/ml), TNFα(27,500 pg/ml), IL-12 p40(9,900 pg/ml), 및 IL-12 p70(3,300 pg/ml)에 대한 최대 생산 퍼센트의 평균인 경우 단일 실험의 결과이다.
도 10b. 항체 또는 항체 융합 단백질의 용량 범위에 대한 사람 B 세포의 증식 반응. 사람 PBMC를 사람 IL-4, 사람 IL-21과 함께, 및 용량 범위(좌측에서 우측으로, 10, 1, 0.1, 0.01 nM)에서 항온처리하고 증식의 정도를 6일 후에 CFSE 희석의 유동 세포분석법적 분석으로 측정하였다. 곡선은 항체 용량에 대해 반응성이다. 데이타는 최대 증식에 대해 각각 표준화된 2개의 공여체에 대한 평균 값을 나타낸다(31% 및 28%의 B 세포가 최대 신호에 대한 반응시 반복된 반면, 기본선 세포는 단지 3.5% 및 3.6%이었다). 11B6-HIV5pep + sCD40L 적정 시리즈는 일정한 용량의 1 μg/ml(60 nM) 가용성 CD40L로 보충된 11B6-HIV5pep이었다.
도 10c. H 쇄 C-말단에 융합된 HIV5pep 항원의 존재 및 부재하에서 용량 범위의 Mega sCD40L 및 항-CD40 11B6-CD40L mAb에 대한 사람 MDDC의 반응. 사람 MDDC를 용량 범위(좌측에서 우측으로: 10, 1, 0.1, 0.01 nM)의 각각의 IgG4 mAb 또는 Mega sCD40L와 함께 항온처리하고 사이토킨 분비 정도를 24시간 째에 측정하였다. 나타낸 결과는 2개의 상이한 공여체를 사용한 3개 실험에 걸친 데이타를 평균낸 것이고 여기서 최대 정도의 사이토킨 생산은 최대 신호에 대해 표준화시킨 다음 IL-12 p40, TNFα, 및 IL-15 분비에 대해 평균내었다. 평균낸 최대 생산 값은 IL-12 p40(14,236 pg/ml), TNFα(37,145 pg/ml), 및 IL-15(295 pg/ml)이었다. 오차 바아는 평균의 표준 편차이다. 11B6-CD40L-HIV5pep는앞서 기술된 바와 같이 IgG4 H 쇄 말단에서 5개의 연결된 HIV-1 항원 영역을 수반하나(Flamar et al., 2013) 11B6-CD40L-HIV5pep^k는 놉-인-홀(knob-in-hole) 기술을 사용하여 하나의 H 쇄 상에 5개의 항원 영역 중 2개 및 다른 H 쇄 상에 3개를 갖는다(Flamar et al., 2018; Ridgway et al., 1996).
도 11. L 쇄 C-말단에 융합되거나 일정한 저 용량의 가용성 CD40L과 함께 공-배양된 사람 CD40L의 존재 및 부재하에서 HIV-1 Gag p24, Nef, 및 Gag p17 또는 HPV16 E6/E7 항원에 대한 H 쇄 C-말단에 융합된 용량 범위의 항-CD40 또는 대조군 항체에 대한 사람 B 세포의 증식 반응. 사람 PBMC를 사람 IL-4, 사람 IL-21과 함께 항온처리하고, 용량 범위(좌측에서 우측으로 나타냄: 10, 1, 0.1, 0.01 nM) 및 증식 정도를 6일 후에 CFSE 희석물의 유동 세포분석법적 분석으로 측정하였다. 검정색으로 채워진 원형 기호를 지닌 곡선은 나타낸 항체 또는 항체-항원 융합 단백질의 용량에 대한 반응이고, 회색으로 채워진 사각형 기호를 지닌 곡선은 1 μg/ml(60 nM)의 가용성 사람 CD40L의 존재하에서 나타낸 항체 또는 항체-항원 융합 단백질의 용량에 대한 반응이고, 삼각형 기호를 지닌 녹색 곡선은 항체-CD40L 또는 항체-CD40L-항원 융합 단백질의 용량에 대한 반응이다. 데이타는 항체(10%)의 부재하에서 최대 증식(95%) 대 기본선 증식에 대해 표준화된 단일 실험을 나타낸다.
도 12. 직접 융합된 사람 CD4L의 존재 및 부재하에서 용량 범위의 항-CD40 또는 항-CD40-GNG 융합 항체에 대한 사람 MDDC의 사이토킨 분비 반응. 사람 MCDC를 용량 범위(좌측에서 우측으로: 10, 1, 0.1 nM)의 각각의 mAb와 함께 배양하고 사이토킨 분비의 정도를 2일 후에 측정하였다. 빈 원형 기호를 지닌 곡선은 항체 또는 항체-항원 융합 단백질에 대한 용량 반응이고, 검정색으로 채워진 사각형 기호를 지닌 곡선은 사람 CD40L에 직접 융합된 항체 또는 항체-항원 융합 단백질에 대한 용량 반응이다. 데이타는 시험한 각각의 사이토킨의 최대 분비에 대해 표준화된 단일 실험을 나타낸다. 최대 값은 다음과 같다: IL-10, 30 ng/ml; IL-12p40, 359 ng/ml; IL-15, 36 ng/ml, TNFα, 6134 ng/ml).
도 13. HIV-1-감염된 공여체 PBMC 배양물 속에서 HIV-1 특이적인 T 세포의 가용성 CD40L 또는 융합된 CD40L 확장의 존재 및 부재하에서 CD40-표적화된 Gag p17-Nef-Gag p24. HIV-1⁺ 공여체 PBMC를 9일 동안 IL-2 및 항-CD40-GNG 및 대조군 IgG4-GNG 융합 단백질(0.1 nM)와 함께 가용성 CD40L(0.1 nM) 또는 직접 연결된 CD40L의 존재 및 부재하에서 배양한 다음, Gag 및 Nef 오버랩핑 펩타이드로 6시간 동안 BFA와 함께 자극시킨 다음, ICS로 분석하였다. 상부 패널은 공여체 A17에 대한 데이타를 나타내고, 하부는 공여체 A15에 대한 데이타이다.
도 14. 융합된 CD40L을 지닌 CD40-표적화된 HIV5pep 항원은 HIV-1-감염된 공여체 PBMC 배양물에서 HIV-1-특이적인 CD8 ⁺ T 세포 반응을 우선적으로 확장시킨다. HIV-1⁺ 공여체 PBMC를 9일 동안 IL-2 및 항-CD40 HIV5pep 융합 단백질(1 nM; KIH 단백질의 경우 2 nM)과 함께 배양한 다음, 5개의 HIV-1 gag, nef, 및 pol 영역각각에 대해 특이적인 롱 펩타이드(long peptide)로 6시간 동안 BFA와 함께 자극시킨 다음, ICS로 분석하였다. 각가 4개의 나타낸 단백질을 사용한 실험으로부터의 이러한 조합된 데이타를 4개의 공여체에서 시험하였다. A. 각각의 점은 αCD40 11B6-CD40L.HIV5pep KIH Gen 2 및 αCD40 11B6-CD40L.HIV5pep Gen 1(X 축)을 αCD40 12E12.HIV5pep KIH Gen 2(X 축) 및 αCD40 12E12.HIV5pep Gen 2(Y 축)에 대해 비교하는 각각의 공여체에서 유발된 각각의 롱 펩타이드에 대해 특이적인 각각의 반응에 대한 IFNγ⁺ TNFα⁺ HIV5pep-특이적인 CD8⁺(사각형) 또는 CD4⁺(다이아몬드형) T 세포에 대한 값%를 나타낸다. 하나의 공여체에서 nef66 반응에 대해 높은 값은 나타내지 않는다(58,44 대 35,44). B. HIV5pep KIH 작제물 대 비-KIH 작제물의 비교는 HIV5pep-특이적인 CD4⁺ 또는CD8⁺ T 세포 반응에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
도 15. HIV-1-감염된 공여체 PBMC 배양물에서 HIV-1-특이적인 T 세포의 시험관내 확장을 통해 시험된 융합된 CD40L의 존재 및 부재하에서 CD40-표적화된 HIV5pep 항원. HIV-1⁺ 공여체 환자 1 PBMC를 9일 동안 IL-2 및 항-CD40 HIV5pep 융합 단백질(1 nM)과 함께 배양한 다음, 5개의 HIV-1 gag, nef, 및 pol 영역중 각각에 대해 특이적인 롱 펩타이드로 6시간 동안 BFA와 함께 자극시킨 다음, 세포내 사이토킨 염색(ICS)에 의해 분석하였다. 이는 도 14에 나타낸 공여체 중 하나에서 시험한 4개의 나타낸 단백질 중 2개를 사용한 실험으로부터의 ICS 데이타이다. PSApep 및 sol은 각각 비-관련 펩타이드 및 용매 음성 대조군을 나타내고 PMA는 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 및 이오노마이신에 의한 폴리클로날 자극을 나타낸다. 각각의 ICS 패널의 경우 Y 축은 INF 염색 강도를 나타내고, X 축은 TNFα 염색 강도를 나타낸다.
도 16. 융합된 CD40L의 존재 및 부재하에서 CD40-표적화된 HIV-1 gp140 항원은 사람 CD40 유전자이식 마우스에서 gp140-특이적인 혈청 IgG 반응을 유발한다. 타코닉(Taconic) CD40 동형접합성 유전자이식 마우스(계통 12692)를 (그룹 1, G1) HIV-1 gp140에 직접 융합된 항-CD40 11B6-CD40L, (그룹 2, G2) 코헤신-gp140으로 복합체화된 항-CD4011B6-CD40L-독커린, (그룹 3, G3) 코헤신 gp140으로 복합체화된 항-CD4011B6-독커린, 또는 (그룹 4, G4) 코헤신 gp140의 복강내 주사를 통해 예방접종하였다. 용량은 비-표적화 대조군 그룹 3(2 μg 또는

3 몰 당량)을 제외하고는, 몰 등가의 1 μg의 그룹 2 백신이 되도록 표준화하였다. 예방접종은 1일, 14일, 및 21일째에 13일(D13), 27일(D27) 및 34일(D34)에 취한 작을 혈액 채취물을 사용하여 수행하였다. 그래프는 항-마우스 IG-HRP 시약이 검출 시약인 것을 제외하고는, 문헌: Zurawski et al., 2016에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 항-gp140 IgG 반응성에 대해 분석한 혈청의 일련 희석물을 나타낸다 그룹 크기는 G1, n=3 및 G2-4, n=4)이었다. 방향성 오차 바아(Directional error bar)는 평균의 S.E.이다.
도 17. 사람 CD40 유전자이식 마우스에서 B 세포 상에서 항-CD40 CP 및 항-CD40 11B6-CD40L의 효과. CP-870,893 hIgG4(CP) 및 항-CD40 11B6-CD40L(11B6-CD40L)를 마우스에게 투여하였다. 야생형(WT, 백색 바아) 또는 야생형(hCD40 타코닉 계통, 검정색 바아) 또는 CD40 KO(ImmuRx hCD40 균주, 회색 바아) C57BL/6 배경의 사람 CD40 BAC 유전자이식 마우스에게 (복강내로) CP-870,893 hIgG4(CP, 10 μg

0.5 mg/Kg) 또는 몰 등가의 항-CD40 11B6-CD40L(11B6-CD40L)을 주사하고 24시간 후 희생시켰다. 혈액을 PBMC 제조를 위해 수집하고, 세포를 림프절 및 비장을 제거한 피부로부터 제조한 다음, 세포를 유동 세포분석법으로 분석하였다. B 세포 활성화는 활성화 마커 CD69의 분석으로 특성화하였다. 데이타는 6개 그룹 각각에서 2개의 동물에 대한 평균이다.
도 18. 항-CD40 11B6에 대한 CD40L의 융합은 FAS 전이막(transmembrane) 및 세포내 도메인에 융합된 CD40 엑토도메인에 의해 지시된 세포 사멸의 효능 및 잠재능 둘 다를 증가시킨다. 사람 CD40-FAS 융합 작제물로 안정하게 형질감염시킨 CHO 세포를 48시간 동안 항-CD40 IgG4 항체의 희석 시리즈와 함께 항온처리하였다. 이후에, 세포를 세포 생존능의 지시인자인, MTT와 함께 미토콘드리아 감소 활성의 비색 검출을 위해 MTT와 함께 항온처리하였다. 형질감염되지 않은 CHO 세포는 임의의 이러한 시험한 제제(나타내지 않음)에 의해 영향받지 않는다.
도 19. CD40 엑토도메인 융합 단백질을 발현하는 CHO 세포에 대한 항-CD40 mAb 결합의 분석. FAS 전이막 및 세포내 잔기에 융합된 사람 CD40 또는 CD40 엑토도메인을 발현하는 발현 플라스미드로 안정하게 형질감염된 CHO 세포(250K)를 점 당 250K(특이적인 세포형과 함께)로 최종 0.1 μM(11개의 웰에 걸쳐 3x 희석)에서 출발하는 희석 시리즈의 항-cd40 항체와 함께 항온처리하였다. 결합은 1시간 동안 빙상에 수행한 다음, 1X PBS, 2% FCS, 2 mM EDTA(또한 결합 완충액)으로 2회 세척하고, 염소 항-사람 IgG PE(Prozyme: 피코링크(Phycolink) 염소 항-hIgG-RPE)로 1:500의 희석에서 항온처리한 다음, 상기 완충액으로 2회 세척하였다. 샘플을 FACS 배열(BD Biosciences) 상에서 분석하고: 계산된 %P1은 PE(모) 막대그래프 만으로 상기 배경 세포에서 게이트 세트를 사용하였다. P1 게이트에서 샘플/특이적인 현상으로부터의 모든 현상은 기술된 %P1 값을 제공한다. WT CD40-FAS CHO는 FAS에 융합된 야생형(돌연변이되지 않은) CD40 엑토도메인을 발현하는 세포이다. CD40 R27A 및 E28A FAS는 돌연변이된 CD40 엑토도메인을 지닌 세포이다.
도 20. 가요성 링커 영역의 존재 및 부재하에서 H 또는 L 쇄 C-말단에 융합된 직접 융합된 사람 CD40L을 지닌 용량 범위의 항-CD40 11B6 IgG4 항체에 대한 사람 골수-유래된 수지 세포(MDDC)의 사이토킨 분비 반응. 사람 MDDC를 용량 범위(좌측에서 우측으로: 10, 1, 0.1, 0.01 nM)의 각각의 항-CD40 11B6-CD40L 동형과 함께 배양하고 사이토킨 분비의 정도를 24시간 후 측정하였다. 데이타는 시험내에서 최대 값에 대해 표준화하고 2개의 상이한 공여체로 반복된 반응에 대해 평균낸 시험한 각각의 사이토킨에 대한 값의 요약을 나타낸다. 오차 바아는 평균의 표준 오차이다. 하기 각각의 적정 시리즈를 나타낸 카툰은 L 쇄 또는 H 쇄 CD40L 융합 동형을 나타내고 F는 Flex V1 링커의 존재를 나타낸다.
도 21. 항-CD40 11B6에 융합된 CD40L의 과작동체 활성은 FAS 전이막 및 세포내 도메인에 융합된 CD40 엑토도메인에 의해 지시된 세포 사멸의 효능 및 잠재능에 의해 정의된 바와 같이 CD40L 위치선정과는 독립적이다. FAS 전이막 및 세포내 잔기에 융합된 사람 CD40 엑토도메인을 발현시키기 위한 작제물(Mam-cetHS-puro[hCD40--Ecto hFas-TM-IC], SEQ ID NO: 151)로 안정하게 형질감염된 CHO 세포를 48시간 동안 항-CD40 IgG4 항체의 희석 시리즈와 함께 항온처리하였다. 이후에 세포를 MTT와 함게 미토콘드리아 감소 활성의 비색 검출을 위해 항온처리하였다. 그래프에서 h는 사람화된 11B6 mAb를 나타내고, m은 원래의 마우스 V 영역을 나타낸다.
도 22. 당해 도는 경쇄 또는 중쇄의 C-말단에서 항원의 존재 및/또는 가요성 링커의 존재하에서 각각의 융합 단백질의 구조를 나타내는 카툰을 나타낸다.
도 23. 항-CD40 11B6-CD40L은 CD40 집단 형성을 향상시킨다. 사람 CD40-mCherrry CHO 세포를 배양 배지 속에서 1시간 동안 단독으로(상부 패널), 10nM 항-CD40 12E12과 함께(중간 패널) 또는 10 nM 항-CD40 11B6-CD40L과 함께(하부 패널) 37℃에서 커버 슬라이드 상에서 항온처리하였다. 이후에, 세포를 1% PFA로 고정시키고, 세척하고 상부 반투명 슬라이드(super frosted slide) 위에 ProLong Gold antifade 시약과 DAPI를 사용하여 올려두었다. 영상을 UTSW에서 취한 올려둔 영상과 함께 취하고 빔 부위당 무리의 적량화를 위해 FIJI 소프트웨어(ImageJ로부터의 개방 공급원)를 사용하여 분석하였다. 각각의 그룹 당 평균 5개 세포를 각각의 세포당 3개의 32x32 사각형을 분석하는 공간 영상 상관 분광법(spatial image correlation spectroscopy)을 수행함으로써 분석하였다. 사용된 프로토콜은 FIJI 소프트웨어의 자가교정 및 영상 수학적 기능의 장점을 취하여 공초점 현미경의 빔 부위의 함수로서 표지된 수용체의 형광성 강도를 정량화하고, 세포 표면에서 표적 분자 응집(무리화) 상태의 적량적 척도를 제공한다(Parslow et al., 2018, J Vis Exp. 2018;(138):57164.). MDDC를 6시간 동안 배양 배지 속에서 37℃에서 100nM 항-CD40 11B6-CD40L-Dock_Coh-eGFP 또는 100nM 항-CD40 23E12-Dock_Coh-eGFP가 있는 커버 슬라이드 위에서 항온처리하였다. 이후에, 세포를 세척하고, 고정시키고, 투과시키고, 항-EEA1 또는 항-Lamp1에 대해 염색하고, 세척하고 상부 반투명 슬라이드 위에 ProLong Gold antifade 시약과 DAPI를 사용하여 올려두었다. 영상을 함께 취하고 앞서 기술한 바와 같이 빔 부위당 무리의 정량화를 위해 FIJI 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 영상 당 4개의 32x32 사각형을 사용하여, 항-CD40 11B6-CD40L 처리에 대해 8개의 영상, 및 각각 4 또는 5개의 32x32 사각형을 사용하여 항-CD40 12E12 처리에 대한 7개의 영상을 분석에 사용하였다(우측). 좌측과 우측의 규모 차이는 상이한 시점에서 취하고, 상이한 세포형의 것인(비교불가) 사진 사이에서 형광성의 차이에 기인한다. 그러나, 처리 사이의 통계적 유의성은 사용된 상이한 세포형에서 동일하다(p 값 < 0.0001).
도 24. 항-CD40 11B6-CD40L은 CD40-매개된 내재화를 향상시킨다. 사람 CD40-CHO 세포를 배양 배지 속에서 다양한 시간 동안 100 nM mCherry-표지된 항-CD40 12E12 (A), 항-CD40 11B6-CD40L (B) 또는 항-CD40 11B6 (C)와 함께 37℃ 또는 0℃에서 항온처리하였다. 이후에, 세포를 PBS로 세척하거나 등장성 산 스트리핑된 완충액(isotonic acid stripping buffer)(pH 2.5)으로 1분 동안 항온처리하고, 중화시킨 다음 PBS로 세척하였다. 이후에, 전체 또는 산-내성인(즉, 내재화된) 표지를 형광성으로 측정하였다. 30 내지 270분 시점으로부터 총 결합에 대한 신호를 평균내고 100%로 설정하여 3개의 독립된 반복된 실험 사이의 데이타를 표준화하였다. 세포 단독 또는 항-CD40 mAb에 접합되지 않은 100 nM mCherry를 사용한 배경 형광성 값은 2±1%이었다. 0 시점에서 검출가능한 결합은 초기 ~6분의 원심분리 동안 발행하는 결합 및 세척 단계를 반영한다.
도 25: 데이타는 Ala-돌연변이유발 연구로부터 유도되었다. 밑줄은 CD40의 4개의 CDR 구조적 상동성 영역이다. 일부 돌연변이에 대한 잔사 번호가 나타나 있다. 회색 강조부분은 변화된 잔기를 나타낸다. P는 Pfizer CP mAb이고; E는 12E12이고; B는 11B6이고; L은 11B6-CD40L이며; -는 시험한 임의의 mAb에서 효과가 없음을 의미하고; 하기 작은 문자는 감소된 결합을 나타내고; CAPS내 문자는 결합이 없음을 의미한다.
도 26. HIV-1-감염된 공여체 PBMC 배양물 속에서 HIV-1 특이적인 T 세포의 CD40-표적화된 GNG 항원에 의한 확장. HIV-1⁺ 공여체 PBMC를 용량 범위의 항-CD40-GNG 융합 단백질(좌측에서 우측으로 1, 0.1, 0.01 nM)과 함께 저 용량의 sCD40L(100 ng/ml; 6 nM) 및 IL-2의 존재 및 부재하에서 9일 동안 배양한 다음, 혼주물 HIV-1 Gag p17, Nef, 및 Gag p24 펩타이드로 6시간 동안 자극시키고, ICS로 분석하였다. 데이타는 항원-특이적인 (A) CD4⁺ 및(B) 펩타이드 자극에 대한 반응시 IFNγ + TNFα를 생산하는 CD8⁺ T 세포의 배양 말기에서 퍼센트를 나타낸다.
도 27. HIV-1-감염됨 공여체 PBMC 배양물 속에서 HIV-1 특이적인 T 세포의 CD40-표적화된 GNG 항원에 의한 확장. HIV-1⁺ 공여체 PBMC를 용량 범위의 항-CD40-GNG 융합 단백질(좌측에서 우측으로 1, 0.1, 0.01 nM)과 함께 저 용량의 sCD40L(100 ng/ml; 6 nM) 및 IL-2의 존재 및 부재하에서 9일 동안 배양한 다음, 혼주물 HIV-1 Gag p17, Nef, 및 Gag p24 펩타이드로 6시간 동안 자극시킨 다음, ICS로 분석하였다. 데이타는 항원-특이적인 (A) CD4⁺ 및(B) 펩타이드 자극에 대한 반응시 IFNγ + TNFα를 생산하는 CD8⁺ T 세포의 배양 말기에서의 퍼센트를 나타낸다. 패널 C 및 D는 각각 3개의 최고 용량까지 3명의 환자로부터 항원-특이적인 CD4⁺ 및CD8⁺ T 세포 수집된 반응을 시험한 모든 3개의 펩타이드 영역에 가하고 각각의 환자에 대한 최고 반응에 대해 표준화한 다음 평균냄을 나타낸다. 나타낸 유의적인 차이는 웰치스 교정(Welch's correction)을 사용한 쌍을 이루지 않은 시험을 기반으로 하였다.
도 28. 항-CD40-CD40L 표적화된 HIV5pep 항원은 HIV-1-감염된 공쳐체 PBMC 배양물 속에서 많은 HIV-1-특이적인 CD8 ⁺ T 세포 반응을 우선적으로 확장시킨다. HIV-1⁺ 공여체 PBMC를 9일 동안 IL-2 및 항-CD40 HIV5pep 융합 단백질(1 nM; KIH 단백질의 경우 2 nM)와 함께 배양한 다음, 5개의 HIV-1 gag, nef, 및 pol 영역 각각에 대해 특이적인 롱 펩타이드로 6시간 동안 BFA와 함께 자극시킨 다음 ICS로 분석하였다. 이는 4개의 공여체에서 시험한 나타낸 단백질 쌍 각각을 사용한 실험으로부터 수집분석한 데이타이다. 각각의 점은 항-CD40 11B6-CD40L-HIV5pep KIH Gen 2 및 항-CD40 11B6-CD40L-HIV5pep Gen 1(Y 축)을 항-CD40 12E12-HIV5pep KIH Gen 2 및 항-CD40 12E12-HIV5pep Gen 2(X 축)에 대해 비교하는 각각의 공여체에서 유발된 각각의 롱 펩타이드에 대해 특이적인 각각의 반응에 대한 IFNγ⁺ + TNFα⁺ HIV5pep-특이적인 CD8⁺(패널 A, 검정색으로 채워진 사각형) 또는 CD4⁺(패널 B, 빈 회색 원형) T 세포에 대한 값%를 나타낸다. 패널 A는 확장된 배양물의 ≤20%인 반응을 강조하며 nef66 펩타이드에 대한 강력한 환자 2 반응(항-CD40 11B6-CD40L-HIV5pep 백신에 의해 유발된 38±7% 대 항-CD40-HIV5pep 백신에 의해 유발된 48±10%)을 배제시켰다. 패널 B는 전체 데이타세트를 나타낸다.

실시예:

1. 방법

MDDC 제조 방법 - 프로토콜

1 M의 사람 혈액 단핵구/mL를 6웰 플레이트(well plate)(웰 당 2 mL) 내에서 RPMI 배지 + 10% FBS + 10 ng/mL 사람 IL-4 + 100 ng/mL 사람 GM-CSF 속에서 배양하였다.

배지의 1/2을 2일 및 4일째에 동일한 농도의 IL-4 및 GM-CSF를 유지하면서 교환하였다. 세포를 5일째에 스크래핑(scraping)하지 않지만 약하게 세척하면서 수거하고 96 웰 v 바닥 플레이트 속에서 200 uL 속에서 웰당 100,000개의 세포로 플레이팅하였다. 전형적으로, 1M DC는 2M 단핵구로부터 유래되었다. 상이한 농도의 항-CD40 mAb 또는 항-CD40 IgG4 융합 단백질 및 10 ng/mL의 IL-4 및 100 ng/mL GM-CSF를 가하고, 24 또는 48시간 후 상층액을 분비된 사이토킨에 대해 시험하고 세포를 세포 표면 활성화 마커에 대해 염색하였다.

표면 플라스몬 공명(SPR) 결합 검정 - 프로토콜

표면 플라스몬 공명(SPR) 검정 결합 측정을 SensiQ Pioneer 장치(SensiQ Technologies, Inc., 미국 오클라호마주 오클라오마 시 소재)에서 수행하였다. 단백질 A 또는 단백질 G(100 μg/mL in 10 mM NaAc pH4.5)를 아민 커플링된 화학을 사용하여 COOH2 또는 COOH5 센서 칩(sensor chip) 상에 25℃에서 제조업자의 추천된 프로토콜에 따라 고정시켰다. 작동 완충액은 10 mM HEPES, 3.4 mM EDTA, 0.005% 트윈 20, 8.8 g/L NaCl, pH 7.5이었다. 후속적으로, 채널 1을 사용하여 항-CD40 mAb를 125 nM(주사 속도, 4분 동안 10 μL/min)의 농도에서 주사하고; 채널 1-2를 사용하여 희석 시리즈의 코헤신-사람 CD40 엑토도메인 단백질(P3398)(2분 동안 25 uL/min에서 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.6, 0.8 nM)을 주사하고; 최종적으로, 표면을 20 mM NaOH를 1분(25 μL) 동안 주사함을 통해 재생시켰다. 결합 데이타는 Qdat 소프트웨어(SensiQ Technologies, Inc.)로 분석하였다.

T 세포 확장 - 프로토콜

해동 및 세척한 후, 2M PBMC를 37℃에서 1 mL cRPMI + 10% AB 혈청 중 중 O₂의 존재하에서 24웰 평편 바닥 플레이트 속에서 배양하였다. 세포를 상이한 농도(1 nM, 0.1 nM 및 0.01 nM)의 aCD40 abs 또는 대조군으로 처리하였다. 배양 말기에 충분한 T 세포를 갖기 위하여, 조건을 3회 수행하였다. 2일째에, 1 mL의 cRPMI + 10% AB 혈청 및 IL-2를 100 U/mL의 최종 농도에서 각각의 웰에 가하였다. 배지의 1/2을 4일 및 6일째에 새로운 IL-2로 농도를 2배로 하지 않으면서 교환하였다. 세포를 수거하여 2mM EDTA가 들어있는 PBS 속에서 2회 세척하는 경우, 세포는 10일까지 휴지되도록 하였다. 세포를 후속적으로 cRPMI + 10% AB 혈청 속에 필요한 조건과 조건당 200 μL의 최종 용적 사이에 동세포의 동일한 분포를 허용하는 용적으로 재현탁시키고, 계수하고 이를 O/N으로 37℃에서 O₂의 존재하에 50 mL의 튜브 속에서 휴지시켰다.

11일 째에, 세포를 96 웰 플레이트 V 바닥 속에 플레이팅하고 2 μM 펩타이드 또는 대조군으로 1시간 동안 37℃에서 O₂의 존재하에 재-자극시켰다. 1시간 후, 50 μL의 용적의 cRPMI + 10% AB 혈청 중 0.175 μL의 Golgi Stop 및 0.45 μL의 Brefeldin을 각각의 웰에 가하고 세포를 추가로 4시간 동안 항온처리하였다. 후속적으로, 세포를 스핀 다운(spin down)시키고 ICS 염색을 다음의 항체를 사용하여 수행하였다: αCD3 BV711, αCD4 Pe-Cy7, αCD8 Pacific Blue, αCD56 Pe-Cy5, αCD16 APC-H7, αCD45 Pacific Orange, αNKG2C Alexa Fluor 700, αNKG2D PECF594, αCD69 FITC, αTNF-a APC, αINF-γ PE. Aqua를 가시성 염료로 사용하였다. 염색 후, 세포를 BD 고정액(fixative) 속에 재현탁시키고 BD LSR II 유동 세포분석기에서 분석하였다.

B 세포 증식 검정 - 프로토콜

사람 PBMC를 벤조나이드 1:10을 사용하여 RPMI 배지(5 mL 중 1 μL) 속에서 해동시키고, 세포를 PBS 속에서 2회 세척하고 재현탁시켜 PBS 속에서 Cf 10M/mL를 갖도록 한 다음, CSFE Cf 1.25 μM(Ci=5 mM)로 7분 동안 RT에서 암실 속에서 염색하였다. 표지화를 10 mL FBS를 가하여 정지시키고 세포를 5분 동안 냉각 상태에 둔 다음, PBS 속에서 2회 세척하고, 10% FBS가 들어있는 RPMI 배지 속에 재현탁시켜 웰당 1M 세포/mL를 분배하였다. 사람 IL-4(10 ng/mL) 및 사람 IL-21(5 ng/mL)를 세포에 다양한 양의 항-CD40 mAb 또는 항-CD40 IgG4 융합 단백질과 함께 가하였다. 6일. CD19 APC: 1 μl; CD27 APC-H7: 1 μl; CD38 PE-Cy7: 0.5 μl; 살아있는/죽은 Aqua: 1 μl.

수지 세포 활성화 검정 - 프로토콜

1 M 사람 혈액 단핵구/mL를 6 웰 플레이트(웰 당 2 mL) 속에서 RPMI 배지 + 10% FBS + 10 ng/mL 사람 IL-4 + 100 ng/mL 사람 GM-CSF 속에서 배양하였다. 배지의 1/2을 2일 및 4일째에 동일한 농도의 IL-4 및 GM-CSF를 유지시키면서 교환하였다. 세포를 5일째에 스크랩핑없이 수거하고 약하게 세척하고 96 웰 v 바닥 플레이트 속에서 200 μL으로 웰당 100,000개 세포에서 수거하였다. 전형적으로, 1M DC를 2M 단핵구로부터 유래되었다. 상이한 농도의 항-CD40 mAb 또는 항-CD40 IgG4 융합 단백질 및 10 ng/mL IL-4 및 100 ng/mL GM-CSF를 가하고, 24 또는 48시간 후, 상층액을 분비된 사이토킨에 대해 시험하고 세포를 세포 표면 활성화 마커에 대해 염색하였다.

HIV5 롱 펩타이드를 사용한 T 세포 확장 검정: ICS - 프로토콜

모든 배양은 cRPMI 중 10% AB(여과되지 않음) 속에서 수행한다:

cRPMI

Hepes (1M) [500 ml당 12.5 ml]

NEAA (10X) [500 ml당 5 ml]

2ME (1000X) [500 ml 당 450 μl; 최종 50uM]

Na피루베이트 (10X) [500 ml당 5 ml]

Pen Strep (10,000U/10,000U) [500 ml당 5 ml]

pH를 NaOH를 사용하여 7.4로 만듬.

세포를 10%AB cRPMI(세포의 초기 희석물 중 50 U 벤조나제가 들어있는)으로 해동시킨다.

1X PBS, 2 mM EDTA로 2회 세척한다. 세포를 10% AB cRPMI 속에서 2X10e6/ml의 농도로 50 ml의 느슨하게 마개를 씌운 튜브 속에서 재현탁시키고 세포를 밤새 37℃, C0₂ 5%에서 휴지(rest)되도록 하였다.

다음날(0일): 재계수(recount)하고 생존능/밀도를 기반으로, 2X10e6/ml(웰당)^*로 조절한다.

0일: 세포를 24웰 플레이트 속에서 플레이팅한다:

시험 분자 조건당 약 6개 웰에 대한 표적(따라서 T 세포 확장 말기에 충분한 세포를 가지며 - 또한 재-자극용 대조군으로서, 시험 분자의 부재하에서 '세포 만'의 세트가 필요하다)

· (4개의 상이한 시험 분자 및 음성 세포 만의 대조군을 시험하는 경우, 전형적으로 이는 6X10e7개의 공여체 PBMC를 필요로 할 것이다)

세포를 24 웰 플레이트 속에 2X10e6/웰(설정시 1 ml)^*에서 10% AB cRPMI 속에서 플레이팅한다.

시험 분자를 1nM "최종(final)"에서 가한다^**

· 이는 50 ul 용적에서 수행하여 1 ml의 세포에 가할 수 있다.

· 또는 세포 용적을 '동일한 용적'의 세포 및 시험 분자(500 μl+500 ul)의 첨가를 위해 조절한다^*

· ** 시험 분자에 대한 범위를 30 nM 내지 0.1 nM 사이에서 시험하였다: 본 발명자의 비교 백신 평가를 위해, 본 발명자는 최종 1 nM을 사용한다.

· 농축된 스톡으로부터 신선하게 하고 저 단백질 농도에서 저장하지 않는다.

2일: 배양 설정 및 단백질 자극 후, IL2를 함유하는 10%AB cRPMI 1ml를 가하였다(따라서 웰 속의 최종 IL-2 농도는 100 U/ml이다)

4일: 1 ml를 제거하고 1 ml의 10%AB cRPMI 중 100 U/ml IL2를 가한다.

6일: 1 ml를 제거하고 1 ml의 10%AB cRPMI 중 100 U/ml IL2를 가한다.

8일: 시험 분자 조건(시험 분자에 따라, 세포 수 및 유형/형태가 변할 것이다)당 모든 혼주물을 수거한다. IL2(1XPBS, 2mM EDTA로 2회 세척)를 세척 제거한다. 세포를 10% AB cRPMI 속에 2X10e6/ml의 농도에서 50 ml의 느슨하게 뚜껑을 씌운 튜브 속에 재현탁시키고 세포를 밤새, 37℃, C0₂ 5%에서 유지시켰다.

9일: 동일한 양의 세포(공여체당 축적된 총 세포 당)를 여과(CD40L 작제물을 지닌 세포 응집물), 계수 및 분배하여 펩타이드로 재-자극되도록 한다. (세포 수/생존능은 PBMC 공여체당 변할 것이다; 펩타이드 조건은 동일하게 남는다) 전형적으로, 세포는 공여체에 따라, 시험 시점 당 약 1 내지 5백만개이다. 세포를 100 ul 용적에서 플레이팅할 것이다.

96 웰-V-바닥 플레이트 속에서 펩타이드 자극의 설정:

V-바닥 96 웰 플레이트 속에서 100 μl의 세포(100 μl당 ~1-5x10e6) + 100 μl의 펩타이드(또는 용매/대조군 SEB): (각각의 공여체에 따라 나눈 7개 조건)

용매(사용된 최대량의 펩타이드의 최고 용적), 10 uM에서 펩타이드(는 2uM 내지 10 uM을 사용할 수 있다), 2 μg/ml에서 SEB. 37℃, C0₂ 5%에서 1시간.

37℃, C0₂ 5%에서 1시간 자극 후, 0.175 μl Golgi stop/0.45 ul의 BrefeldinA: (BD Golgi Stop, Cat 51-2092KZ; BrefeldinA, Cat 420601)를 함유하는 50 μl의 10% AB cRPMI 배지를 가한다.

37℃, C0₂ 5%에서 4시간 후, 세포내 염색(staining)을 진행한다.

세포내 염색 프로토콜:

· 96웰 V 바닥 플레이트 내에서, 펩타이드 재-자극 후, Golgi/BFA 블록을 지속한다:

· 세포(1X w/ 200 μl 1XPBS)를 세척한다: (Cfg 1600 RPM 10 min; 세척물을 제거하기 위한 플릭 플레이트(flick plate))

· 세포를 50 μL의 Aqua^*(필요한 샘플당 1ul Aqua/50 μl의 1X PBS) 속에 20분 동안 4℃에서 재현탁시킨다.

· 세포(FACS 완충액을 사용하여 200 μl로 1회) 세척한다): (Cfg 1600 RPM 10 min; 세척물을 제거하기 위한 플릭 플레이트)

· 세포를 세포 표면 마커의 칵테일(cocktail): (αCD3 Per-CP 3 μL, αCD4 PE-Cy7 0.5 μL 및 αCD8 Pacific Blue 1 μL) 속에서 50 μL/샘플의 총 용적으로 FACS 완충액 속에서 30분 동안 얼음 속에서 염색한다.

· 세포(FACS 완충액으로 2회)를 세척한다: (Cfg 1600 RPM 10 min; 세척물을 제거하기 위한 플릭 플레이트)

· 세포를 200 μL의 Cytofix/Cytoperm^** 용액 속에 20분 동안 4℃에서 재현탁시킨다.

· 후속적으로, 세포를 회전시킨 다음, 세포를 1회 여과된(.45 μm) Perm/Wash^** 용액 속에서 2회 세척한다

· 세포를 항-사이토킨의 칵테일 속에서 염색한다: 50 μL의 Perm/Wash^**/샘플 속에서 (αTNFα APC 1 μL 및 αINF PE 2 μL).

· 실온에서 30분 동안 항온처리한다

· 세포를(Perm/Wash^** 완충액으로 2회) 세척한다: (Cfg 1600 RPM 10 min; 세척물을 제거하기 위한 플릭 플레이트)

· BD 고정액(샘플 당 ~200 μl) 속에서 재현탁시킨다.

^**BD 고정/투과 키트 제품번호 #554714

FACS 완충액: PBS + 2% FCS 또는 BSA + 2 mM EDTA

BD 고정 안정화 고정액 3X 농축물: 수중 1:3 제품 번호 #338036

*Aqua 살아있는/죽은 Invitrogen L34966(튜브당 50 ul의 DMSO로 재구성시킴. 1 μl/샘플을 사용)

CD40 수용체 무리 형성 검정 - 프로토콜.

사람 CD40-eGFP 또는 사람 CD40-mCherry 융합 단백질을 안정하게 발현하는 ExpiCHO-S 세포(Thermo Fisher)를 CD40 무리 형성을 연구하기 위한 모델로서 사용하였다. 세포를 CD CHO/M5 배지(Gibco) 속에서 1E6개의 세포/mL의 농도에서 직경이 25 mm인 둥근 커버 슬라이드가 있는 6 웰 플레이트(Electron Microscopy Science) 속에서 37℃로 10 nM 항-CD40 항체의 존재하에서 항온처리하였다. 1시간 후 커버 슬라이드를 PBS로 2회 세척한 다음 1% PFA(Thermo Fisher) 속에서 10분 동안 실온에서 재현탁시켰다. PBS 속에서 2회 이상 세척 후, 최종적으로 커버 슬라이드를 상부 반투명 현미경 슬라이드(Fisherbrand) 위에 ProLong Gold antifade 시약과 DAPI(Invitrogen)를 사용하여 올려두었다. 슬라이드를 암실 속에서 실온에서 o/n으로 두었다. 다음 날, 슬라이드를 Leica TCS SP5 공초점 현미경으로 영상을 찍고 후속적으로 ImageJ 소프트웨어로 분석하였다.

항-CD40 mAb 내재화 검정 프로토콜.

사람 CD40 cDNA 삽입체(NM_001250.6 잔기 31 내지 864, C928)를 수반하는 CET 1019 HS-puro-SceI 벡터(Millipore Sigma)로 안정하게 형질감염시킨 CHO 세포를 푸로마이신 선택되는 CD CHO/M5 배지(Gibco) 속에서 성장시켜 대량의 안정하게 형질감염된 세포 집단을 확립하였다. 세포를 V 바닥 96웰 플레이트 속에서 1% BSA(50 μl 중 250K) 및 H-쇄 C-말단에서 flex V1 Doc Var1 모듈(Flamar et al., 2012)에 Cohesin-mCherry 융합 단백질(C3808, ML을 암호화하는 코돈에 이어 암호화된 분비된 단백질의 정제를 위한 C-태그 친화성 매트릭스 CaptureSelect^TM(Thermo Fisher, 191307005) 정제에 사용된 KEPEA 서열에 다음에 셀룰로솜-스캐폴딩(cellulosomal-scaffolding) 단백질 A[훈가테이클로스트리디움 서모셀륨(Hungateiclostridium thermocellum)] WP_065674352.1 잔기 1044-1213와 f1 유연성 링커 AVY25163.1 잔기 580-608 내지 mCherry ANF29837.1 잔기 330-562로부터의 코헤신 도메인에 융합된 LDITH6 잔기)과 비-공유결합성 연합으로 융합된 100 nM의 각각의 시험 mAb가 들어있는 배양 배지 속에서 분배시켰다. 시험한 항체는 이러한 세포 상의 CD40 결합 부위를 100 nM에서 포화시켰다(데이타는 나타내지 않음), 30분 간격에서, 표지된 항체 복합체를 세포 배양 항온처리기내에서 37℃에서 유지시킨 세포에 가하고, 마지막(0) 시점에 동량의 빙냉된 PBS를 모든 시점에서 1600 rpm으로 6분 동안 원심분리하고 플릭킹(flicking)으로 액체를 제거하면서 가하였다. 다음에 110 μl의 냉 PBS를 1회 과정으로 열(총 결합 분석을 위해)에 가하고 100 μl의 빙냉 0.1M 글리신, 0.1 M NaCl pH 2.5를 평행한 시간 과정의 열에 가하였다(즉, 세포 표면 결합된 mAb를 선택적으로 제거하기 위한 산 스트리핑 처리). 1분 후, 10 μl의 1M 트리스 HCl pH 9를 산 처리 열에 가하여 산을 중화시키고 추가로 100 μl의 냉 PBS를 모든 열에 가한 후 1600 rpm에서 6분 동안 플릭킹으로 액체를 제거하면서 원심분리하였다. mCherry 형광성은 이러한 프레임에서 산 처리에 의해 절충되지 않음에 주목한다(데이타는 나타내지 않음). PBS 속에서 최종 세척 후, 세포를 100 μl의 PBS 속에 재현탁시키고 75 μl를 형광성 판독을 위해 SpectraMax Paradigm 장치(Molecular Devices) 속에서 Ex 570_Em 625 nM에서 Black Fluor Micro 2 플레이트(Thermo Fisher) 내로 분배하였다.

예시된 서열 명명 규칙(SEQUENCE NAMING CONVENTION):

11B6-5

PAB3405

· rAB-pIRES2[mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C-]

· rAB-IRES2-CI2[mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]

C3677 rAB-pIRES2[mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C

SEQ ID NO　:1

EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQAHGQGLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYVYWGQGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS-

+ C3862 rAB-IRES2-CI2

C3682 rAB-IRES2-CI2[mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]

SEQ ID NO　:2

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECAS-

PAB3408

11B6-8

· rAB-pIRES2[mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v3-LV-hIgG4H-C]

· rAB-IRES2-CI2[mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]

C3678 rAB-pIRES2[mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v3-LV-hIgG4H-C]

SEQ ID NO　:3

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGQGLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYVYWGQGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS

C3682 rAB-IRES2-CI2[mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]

SEQ ID NO　:4

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECAS

이들 둘로부터 CD40L이 부착된 두 개의 변형이 유도되었다:

PAB3470

· rAB-cetHS-puro[mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C-Flex-v1-hCD40Ligand]

· rAB-cetHS-puro[mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C]

C3724rAB-cetHS-puro[mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C-Flex-v1-hCD40Ligand]

SEQ ID NO　:5

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL

+ C3725 rAB-cetHS-puro[mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C]

SEQ ID NO　:6

PAB3471

· rAB-cetHS-puro[mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v3-LV-hIgG4H-C]

C3724 rAB-cetHS-puro[mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C-Flex-v1-hCD40Ligand]

SEQ ID NO　:5

+ C3726 rAB-cetHS-puro[mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v3-LV-hIgG4H-C]

SEQ ID NO　:8

우리는 HIV-5pep를 부착하기 위하여 PAB3470을 선택하였다.

PAB3499 (no CD40L)

· rAB-cetHS-puro[mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2 -LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Pep-gag17-f1-gag253-f2-nef116-f3-nef66-f4-pol158]

· rAB-cetHS-puro[mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]

C3735 rAB-cetHS-puro[mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Pep-gag17-f1-gag253-f2-nef116-f3-nef66-f4-pol158]

SEQ ID NO　:9

EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQAHGQGLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYVYWGQGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASEKIRLRPGGKKKYKLKHIVASSSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSPASNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDASPTSTPADSSTITPTATPTATPTIKGASHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLASTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPASVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAASAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYAS

+ C3739 rAB-cetHS-puro[mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]

SEQ ID NO　:10

PAB3498

· rAB-cetHS-puro[mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Pep-gag17-f1-gag253-f2-nef116-f3-nef66-f4-pol158]

SEQ ID NO　:11

+ C3524 rAB-cetHS-puro[mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C-Flex-v1-hCD40Ligand]

SEQ ID NO　:12

SEQ ID NO:13　: CD40L

MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ

리더 또는 시그널 서열 1-20;

엑토도메인 잔기 21 - 193;

전이막 서열 194 - 215;

세포질 서열 216 - 277.

이는, 서열 변이도 기술하는 UniProtKB - P25942 (TNR5_HUMAN)에 의해 보고된 '기본' 서열('canonical' sequence)로서 선택된 동형이다.

다른 CD40 항체들: HC 및 KC를 위한 가변 도메인 서열들(Variable domain sequences)

H 체인 V 영역의 말단에서 아미노산은 보통 리신(Lysine)이나, 더 전형적으로는 세린(Serine)에 의해 대체될 수 있다(CP 서열에서와 같이 - 이는 활성에 영향을 미치지 않는다).

12B4 HC [manti-CD40_12B4.2C10_H-LV-hIgG4H-C]

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYVLHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYPAYSGYAMDYWGQGTSVTVSSAK (SEQ ID NO　:98)

12B4 KC [manti-CD40_12B4.2C10_K-LV-hIgGK-C]

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCHHGNTLPWTFGGGTK (SEQ ID NO　:99)

12E12 HC [manti-CD40_12E12.3F3_H-V-hIgG4H-C]

EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAK (SEQ ID NO　:100)

12E12 KC [manti-CD40_12E12.3F3_K-V-hIgGK-C]

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIGNLEPEDIATYYCQQFNKLPPTFGGGTK (SEQ ID NO　:101)

12E12 H2 사람화 HC [hAnti-CD40VH2-LV-hIgG4H-C]

EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQAPGKGLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLPFHAMDYWGQGTLVTVSSAK (SEQ ID NO　:102)

12E12 H3 사람화 HC [hAnti-CD40VH3-LV-hIgG4H-C]

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQAPGKGLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLPFHAMDYWGQGTLVTVSSAK (SEQ ID NO　:103)

12E12 K2 사람화 KC [hAnti-CD40VK2-LV-hIgGK-C]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQFNKLPPTFGGGTK (SEQ ID NO　:104)

Pfizer HC [manti-hCD40_CP870893H-LV-hIgG4H-C]

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSAS (SEQ ID NO　:105)

Pfizer KC [manti-hCD40_CP870893K-LV-hIgGK-C]

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTK (SEQ ID NO　:106)

24A3 HC [manti-hCD40_24A3.3F1_H-LV-hIgG4H-C]

DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYSWHWIRQFPGNKLEWMGYIYYSGSTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYFCARFYYGYSFFDYWGQGTTLTVSSAK (SEQ ID NO　:107)

24A3 KC [manti-hCD40_24A3.3F1_K-LV-hIgGK-C]

QIVLTQSPAFMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTK (SEQ ID NO　:108)

11B6 hCD40L 사람화 HC fused to a dockerin domain - which when paired with 11B6 hCD40L 사람화 KC [mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C-Flex-v1-hCD40Ligand] makes 사람화 11B6-CD40L-Dockerin for non-covalent coupling to any cohesin-antigen fusion.

완전한 서열(Complete sequence) (C3724)

11B6 hCD40L 사람화 HC [mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C-CthermoDockerin] (C3737)

플렉스 링커(Flex linkers) 아미노산 서열:

QTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNP (flexV1, SEQ ID NO　:15)

ASSSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSPAS (f1, SEQ ID NO　:56)

PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (f2, SEQ ID NO　:130)

TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (f3, SEQ ID NO　:53)

TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (f4, SEQ ID NO　:54)

2. 결과

부분적인 작용제 항-CD40 항체를 포함하는 일부 작용제는 CD40 활성화를 위해 가용성 CD40L과 상승작용(synergize)할 수 있다.

B 세포 상에서 발현된 CD40은, 사이토킨 인터류킨-4 및 인터류킨-21을 분비하는 항원-활성화된 CD4⁺ 헬퍼 T 세포 상에 발현된 CD40L에 의해 관여(engate)되는 경우, 전형적으로 림프구 기관의 배 중심(germinal center)에 국한된 현상인, B 세포의 증식을 구동한다. 본 발명자는 IL-4 및 IL-21의 존재하에서 사람 말초 B 세포의 증식을 구동하는데 있어서 이의 효능에 대한 사람 IgG4 및 사람 κ 경쇄로서 포맷팅된 항-사람 CD40 항체의 일치된 패널을 시험하였다(도 2). 이러한 항체는 CP>12E12≥2B4>11B6>24A3(CP는 다양한 임상 시험에서 시험된 Pfizer Inc. 항체인 CP-870,893이다)의 순위 순으로 >100- 범위의 작용제 효능을 포함하였다(Vonderheide et al., 2013).

고정된 준최적 농도의 가용성 CD40L(sCD40L)의 존재하에서 당해 검정을 반복하는 것은 12B4 및 12E12 항체의 용량-반응에 있어서 효과를 가지지 않고, CP 항체의 효능을 약간 증가시키지만, 11B6 및 24A3 항체와 상승작용하여 이의 효능을 크게(≥100배) 증가시킨다(도 2). 이러한 2개의 약한 CD40 작용제 신호의 상승적 협업은 이러한 특이적인 mAb와 CD40의 상호작용은 CD40L과의 생산적 상호작용, 또는 이의 역을 강화시킨다. 단일세포 상에서 명백한 수용체를 활성화시키는 물질 사이의 상승작용은 잘 공지된 현장인데, 예컨대, 협업 효과는 작용성 항-CD40 mAb와 FcRII 사이에서 관찰될 수 있지만(Dahan, et al., 2016), 이러한 경우 2개의 활성화제가 일부 수용체 유형에서 작용성이다.

항체(hIgG4)	11B6	12B4	12E12	CP	24A3
EC₅₀(nM) B cell	≥10	>0.1 <1	>0.1 <1	>0.01 <0.1	>10
EC₅₀/ EC₅₀CP	≥100	10	10	1	≥1000
EC₅₀ w/sCD40L (nM)	≥0.1	>0.1 <1	>0.1 <1	>0.01 <0.1	≥1 <10
△w/sCD40L (fold)	≥100	0	0	0	100

도 2에 대한 표. 최대 B 세포 증식의 50%(EC₅₀)에 대한 유효 용량의 한계는 나노몰 값(nM)으로 제공된다. 또한. CP-870,893(CP) 강력한 작용제 항체에 대한 EC₅₀ 값; 일정한 준최적량(6 nM)의 가용성 사람 CD40L의 존재하에서 EC₅₀값; 및 일정한 준최적량(6 nM)의 가용성 사람 CD40L의 존재하에서 EC₅₀ 값에 있어서 배 차이(fold difference)(△)가 계산된다.

전초 수지 세포(Sentinel dendritic cell)(DC)는, 외부 항원 및 병원체-유래된 위험한 신호에 노출되는 경우, 이의 주요 조직적합성 분자(major histocompatibility molecule)(MHC)를 동족의 항원-특이적인 T 세포에 대해 프로세싱 및 제시된다(Hivroz et al., 2012). 수지 세포 상에서 발현된 CD40는 인접한 항원-활성화된 T 세포 상에 발현된 CD40L과 상호작용하며, 이러한 현상은 부분적으로 세포 표면 DC 활성화 분자(예컨대, CD68 및 HLA)의 발현을 증가시키고 DC에 의한 염증성 사이토킨의 분비를 야기함을 통해, 면역성을 개시하는데 있어 중요하다(Ma and Clark, 2009). 따라서, 본 발명자는 돌연변이된 사람 단핵구-유래된 DC(MDDC)에서 사이토킨 분비를 개시하는 이의 능력에 대해 항-CD40 사람 IgG4 mAb의 패널을 검정하였다. B 세포 증식 검정과 같이, 이러한 항체는 유사한 순위 순서 CP>12B4≥2E12>11B6>24A3로 유사한 >200배 범위의 효능 이상의 사이토킨 생산을 유발하였다(도 3). 준-최적 용량의 sCD40L을 사용하여 검정한 경우, 12B4 및 12E12 항체의 용량-반응에서 효과가 존재하지 않았다. 그러나, 저 용량의 sCD40L은 CP 항체의 효능을

100배 까지 증가시켰지만, DC 활성화에 대한 강력한 상승작용(≥100배)이 sCD40L와 11B6 및 24A3 항체 사이에서 관찰되었다(도 3). 항체 단독과 항체 및 sCD40L 사이의 효능에 있어서의 차이는 B 세포 증식 검정을 사용하여 관찰된 것보다 더 컸고, 이는 MDDC에서 이러한 2개의 작용제 유형 사이에 협업에 대해 보다 큰 잠재능을 나타낸다.

항체(hIgG4)	11B6	12B4	12E12	CP	24A3
EC₅₀(nM) 사이토킨	>>10	>10	>>10	0.1	>>10
EC₅₀/ EC₅₀CP	>1000	≥100	>1000	1	>1000
EC₅₀ w/sCD40L (nM)	≥0.1	>10 ≥100	>>10 >0.1 <1	≥0.01	≥10
△w/sCD40L (배수)	>1000	0	0	100	>1000

도 3에 대한 표. MDDC에 의한 IL-40 p40 또는 IL-15의 최대 분비의 50%(EC₅₀)에 대한 유효 용량에 대한 한계는 나노몰 값(nM)으로 제공된다. 또한 CP-870,893(CP) 강력한 작용제 항체에 대한 EC₅₀값, 일정한 준최적량(6 nM)의 가용성 사람 CD40L의 존재하에서의 EC₅₀값; 및 일정한 준최적량(60 nM)의 가용성 사람 DC40L의 존재하에서 EC₅₀ 값에 있어서의 배 차이(△)를 계산한다.

본 발명자가 연구한 항-사람 CD40 mAb의 패널은 모두 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정된 것으로서, 11B6>12B4>12E12>24A3>CP의 온-속도(on-rate)에 대한 순위 순서 및 12B4>11B6>24A3>12E12>CP의 오프-속도(off-rate)에 대한 순위 순서로, CD40에 비교적 높은 친화성으로 결합한다. 작용성 항-CD40 항체를 사용한 앞서의 연구는 이러한 동력학적 매개변수와 활성화 가능성 사이에 명백한 상관관계가 없음을 나타내었고(Hagar et al., 2003) 이러한 연구 내에서 mAb에 대한 SPR 데이타는 이러한 결론에 따른다.

mAb	11B6	12B4	12E12	CP	24A3
Kd (nM)	217	100	33	71	97
Ka (M^-1s^-1)	3.0E+05	2.5E+05	1.5E+05	4.6E+04	8.3E+04
kd (s^-1)	6.4E-02	2.7E-02	4.6E-03	2.2E-03	8.0E-03

표 6. 고정된 항-사람 CD40 IgG4 mAb와 액체 상 가용성 사람 CD40 엑토도메인 사이의 상호작용에 대한 동력학적 매개변수 및 친화성 상수. 면역화된 항체를 사용한 가용성 액체 상 사람 CD40 엑토도메인의 동력학의 표면 플라스몬 공명 분석을 물질 및 방법에 기술된 바와 같이 수행하였다.

sCD40L과 CD40의 항-CD40 mAb 활성화 사이의 상승작용에 대한 한 가지 가능한 메카니즘은 CD40 엑토도메인 상의 별도의 부위에 대한 이의 접근을 통해 이루어질 수 있다. 작용성 항-CD40L mAb CDX-1140이 CD40L로부터 구별되는 부위에서 CD40과 상호작용하며 sCD40L과 이러한 mAb 사이의 유사한 상승작용이 관찰되었다(He et al., 2016).

따라서, 본 발명자는 L 세포의 표면에서 발현된 CD40L에 대한 CD40의 결합을 방지하는 이의 능력에 대해 본 발명자의 항-사람 CD40 IgG4 항체의 패널을 시험하였다. 화학량론적 양의 12B4 및 12E12 항체는 세포 표면 CD40L에 대한 CD40 결합을 방지한 반면, >20배 더 높은 수준의 CP 항체가 심지어 CD40L에 대한 CD40 결합을 부분적으로 차단하기 위해 요구된 밤녕, 11B6 및 24A3 항체는 심지어 최고의 mAb 용량에서 CD40에 대한 CD40L 결합에 있어서 최소의 효과를 가졌다(도 4).

이러한 데이타는 원래의 마우스 항체와 같이 또는 hIgG4로서 재포맷된 이러한 mAb에 대해 일치하였다. 이이의 친화성 상수를 기반으로 (표 6) 이러한 항체 모두는 1 μg/ml의 주요 차별화 종도에서 CD40 결합 부위를 완전히 점유할 수 있으며 여기서 12E12 및 12B4 mAb는 CD40L 결합을 완전히 차단한다. 이러한 데이타는 12B4 및 12E12 mAb가 CD40-CD40L 상호작용에 절대적으로 요구되는 CD40 상의 부위에 결합하는 반면, CP, 11B6, 및 24A3 mAb는 CD40-CD40L 상호작용을 최소로 방해하면서 CD40 부위에 결합함을 나타낸다.

따라서 B 세포 및 DC 활성화에 대한 sCD40L과 항-CD40 mAb 사이의 상승작용은 CD40L의 명백한 부분에 대한 이러한 작용제 둘 다의 동시 접근과 관련되어 있다.

작용성 항-CD40 mAb에 융합된 항원은 CD40 활성화 효능을 저하(dull)시키지만, 일부 항-CD40 mAb-항원 융합체는 sCD40L과 함께 상승작용하여 CD40 활성화 효능을 회복한다.

키메라 또는 사람화된 작용성 항체의 C-말단에 대한 항원의 융합은 모 항체의 작용성 특성을 저하시키거나 제거할 수 있다[Flamar et al., 2013]. 이의 H 및/또는 L 쇄 C-말단에 이식된 Gag, Nef, 및 Pol 유전자 영역으로부터의 HIV-1 롱 T 세포 에피토프가 풍부한 펩타이드의 연결된(concatenated) 스트링의 존재 및 부재하에서 사람 IgG4 동형에 일치하는 항-CD40 항체의 패널[Flamar et al., 2013]을 사람 B 세포 증식 및 사람 수지 세포 활성화를 유발하는데 있어서 이의 상대적인 효능에 대해 시험하였다.

작용성 11B6, 12B4, 12E12, 및 CP IgG4 mAb는 글리코실화된 가요성 링커가 편재된 연결된 5개의 HIV-1 롱 펩타이드 영역을 이의 H 쇄 C-말단에 이식시키는 경우 B 세포 증식을 유발시키기 위한 매우 약한 작용제가 되었다(도 5). 준최적 수준의 sCD40L의 첨가는 11B6-HIV5pep 및 CP-HIV5pep mAb의 B 세포 증식 효능을 자가 '네이키드(naked)' 항-CD40 11B6 및 sCD40L과 함께 항온처리한 CP mAb의 특징적인 수준까지 회복시켰지만, 12B4-HIV5pep 또는 12E12-HIV5pep mAb에서 유의적인 효과를 가지지 않았다(도 5).

이러한 동일한 4개의 항-CD40-HIV5pep 융합 단백질은 MDDC에서 활성화 마커의 상향-조절에 대해 매우 낮은 잠재능을 가지고, 준최적 수준의 sCD40L은 11B6-HIV5pep 및 CP-HIV5pep의 효능을 강화시켰지만, 12B4-HIV5pep 또는 12E12-HIV5pep 융합 단백질에서 효과를 가지지 않았다(도 6). 그러나, sCD40L 강화 정도는 11B6 및 CP '네이키드' mAb로 관찰된 것보다 ~5 내지 10배 더 낮았다(도 6).

sCD40L은 항-CD40.HIV5pep과 협업하여 HIV-1 감염된 개체로부터의 PBMC 속에서 항원-특이적인 기억 CD8 ⁺ T 세포를 확장시킨다.

PBMC 및 DC-T 세포 공-배양 시스템은 DC-표적화 표현형 백신 작제물을 입증하고, 특히 표적에 대해 가장 우수한 수용체를 선택하기 위해, 특히 세포 T 세포 반응을 위해(Yin et al., 2016), 뿐만 아니라 광범위한 HLA 유형에 걸쳐 CD4⁺ 및CD8⁺ T 세포 둘 다에 대한 T 세포 펩타이드 특이성을 유발하기 위해 선택된 융합 항원의 효능을 확인하는데 유용하다(Flamar et al., 2013). 이러한 시험을 기반으로, CD40-표적화가 특히 관심을 끌었지만, 조기 엔도소옴 DC 구획내로 특징적인 항원 내재화와 함께 수반된 CD40의 활성화의 잠재적인 기여는 촛점이 맞춰지지 않았다(Chattergee et al., 2012; Yin et al., 2016).

본 발명자는 저 용량의 sCD40L의 존재 및 부재하에서 HIV-1⁺ 공여체 PBMC 배양물 속의 HIV-1 항원-특이적인 T 세포 확장을 위해 HIV5pep에 융합된 항-CD40 mAb의 효능을 시험하였다. 항원-특이적인 CTL 확장의 놀라운 증강이 준=최적 수준의 sCD40L과 항-CD40 11B6 및 CP HIV5pep 백신의 공-투여를 통해 관찰되었지만, 항-CD40 12E12 및 12B4 HIV5pep 백신으로는 관찰되지 않았다(도 7).

작용제 항-CD40 항체에 융합된 CD40L은 CD40 활성화를 극대화할 수 있다.

sCD40L과 작용성 항-CD40 mAb 사이의 상승적 협력은 예컨대, mAb에 의해 이미 점유된 DC 상에서 CD40에 대한 활성화된 T 세포 접근을 허용함으로써, 생체내에서 유효한 특성일 수 있다. 대안적으로, 작용성 항-CD40 mAb 및 sCD40L은 시험관 내에서 관찰된 향상된 CD40을 통한 가능한 치료학적 이점을 위해 생체내에서 동시에 전달될 수 있다.

삼량체성 sCD40L은 전임상 연구에서 효능을 나타내었으며(Stone et al., 2009) sCD40L을 상승작용적 작용성 mAb와 조합하는 실제 임상적 입증을 위해 앞으로 이용가능하게 될 수 있다.

본원에서, 본 발명자는 sCL40L을 작용성 mAb와 직접적인 융합에 의해 단일제제 고 활성 작용제를 확립하는 명백한 잠재적인 이점으로 물리적으로 관련시키는 새로운 개념을 탐구하였다. 이러한 목적을 위해, 사람 CD40L의 전체 엑토도메인을 항-CD40 mAb의 L 쇄 C-말단에 글리코실화가 풍부한 가요성 링커 서열(flex V1 또는 ASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPAS (SEQ ID NO: 15)로 불림; Flamar et al., 2013)을 통해 융합시켰다. 이러한 '2가' 항-CD40-CD40L mAb는 동족성 분비된 생성물로서 293 및 CHO 세포 내에서 효율적으로 발현되었다(데이타는 나타내지 않음).

CD40L에 융합된 항-CD40 IgG4 mAbs 11B6 및 12B4를 B 세포 증식을 유발시키는데 있어서 이의 효능에 대해 융합되지 않은 mAb에 대해 시험하였다. 이러한 CD40L 융합된 mAb 둘 다는 당해 검정에서 매우 강력하고, 중최적 sCD40L과 공-투여된 매우 강력한 CP mAb의 효능과 일치하였다(참고: 도 2). 둘 다의 경우에서, CD40L 부가물은 모 mAb의 효능을 크게 증가시켰고(11B6의 경우 >1,000배 및 12B4의 경우 >100) 11B6 mAb에 대한 증가는 sCD40L과 공-투여하는 경우 >10배 더 풍부하였다(도 8). 대조군 IgG4 mAb에 융합된 CD40L 또한 B 세포 증식을 유도하는데 활성이었지만 11B6 및 12B4-CD40L 융합 단백질보다 ~10배 더 낮았고(도 8), 이는 CD40L을 항-CD40 항체 결합을 사용하여 직접 연결시킴을 통한 조합의 이점을 강조한다.

CD40L에 융합된 항-CD40 IgG4 mAb의 전체 패널을 DC 활성화를 유발시키는데 있어서 이의 효능에 대한 융합되지 않은 mAb에 대해 시험하였다. 놀랍게도, 12E12를 제외한 모든 mAb에 대한 CD40L의 직접적인 연결은 연결되지 않은 sCD40을 11B6, CP, 및 24A3 mAb에 가하여 관찰된 상승효과와 비교하여 이의 효능을 현저히 증가시켰다(즉, 최대 반응)(도 9). 또한, B 세포 증식 검정과 일치하게, CD40 점유에 대해 CD40L과 직접 경쟁하는 mAb 12B4는 또한 CD40L 융합으로부터 크게 유리하였다(도 9). 대조군(비-DC 결합) IgG4에 직접 융합된 hCD40L은 MDDC에서 단지 최소의 활성을 가졌으며, 이는 CD40L-항CD40 mAb 융합 시도가 DC 활성화에 우선적으로 효과적임을 시사한다.

작용성 항-CD40 mAb 11B6에 CD40L을 직접 연결시키는 것은 친화성 및 활성화 효능을 증가시킨다.

본 발명자는 SPR 분석을 사용하여 이의 L 쇄 C-말단에 융합된 CD40L의 항-CD40 11B6 및 항-CD40 12E12 mAb를 단백질 A/G 표면위에 고정시키고 액체 상 속에서 이들 위에 가용성 사람 CD40 엑토도메인을 취입시킴에 의한 이의 CD40 결합 역학에 있어서의 영향을 프로브(probe)하였다. 항-CD40 12E12 mAb 상에서 CD40L 부가물은 모 항-CD40 12E12 mAb와 비교하여 온- 또는 오프-속도에서 항체를 유의적으로 변경시키지 않았다(데이타는 나타내지 않음). 항-CD40 12E12 mAb는 CD40에서 CD40L 결합 부위와 경쟁하므로 이는 예측되었으며, L 쇄에 유사한 방식으로 융합된 CD40L을 지닌 사람 IgG4 대조군 mAb는 이러한 양식으로 CD40에 대해 검출가능한 결합을 나타내지 않았다(데이타는 나타내지 않음). 대조적으로, 항-CD40 11B6 mAb에서 CD40L 부가물은 모 항-CD40 11b6 mAb와 비교하여 항체 오프-속도를 유의적으로 변경시켰다(데이타는 나타내지 않음). 구체적으로, 온-속도는 미미하게 영향을 받은 반면, 오프-속도는 ~15배까지 감소하였고, 이는 CD40에 대한 결합에 있어서 항-CD40 mAb와 CD40L 사이의 협동성을 나타낸다.

항언 융합에 의해 저하된 항-CD40 mAb의 작용성 특성은 이의 경쇄 C-말단에 대한 CD40L의 직접적인 융합을 통해 회복될 수 있다.

항-CD40 mAb의 작용성 특성은 일부 항원에 대한 융합을 통해 감소되거나 제거될 수 있다. 예를 들면, H 쇄 C-말단에 융합된 HIV5pep 항원은 11B6, 12B4, 또는 12E12 mAb 비히클에 의해 수반되는 경우 작용성 특성을 크게 감소시키지만, 공투여된 sCD40L은 항-CD40 11B6 HIV5pep 융합 단백질의 활성을 강화시킨다(도 5 및 6). 유사한 방식으로, 항-CD40 11B6- HIV5pep 단백질의 L 쇄에 대한 CD40L의 융합은 B 세포 증식 및 MDDC 사이토킨 생산에 대한 활성을 강화시킨다(도 10a). 도 10b는H 쇄 C-말단에서 HIV5pep 항원을 지닌 항-CD40 11B6(도 L2에서 11B6-HIV5pep)은 B 세포 증식 검정에 의해 측정된 바와 같이 CD40 활성화에 대해 최소의 효능을 갖는다. 그러나, 저 용량의 sCD40L(11B6-HIV5pep + sCD40L)의 첨가 또는 L 쇄 C-말단에 대한 사람 CD40L의 융합(11B6-CD40L-HIV5pep)은 매우 강력한 CD40 활성화를 CP-970,893 IgG4 항체에 의해 달성될 수 있는 것보다 더 큰 정도로 생성한다.

항체(hIgG4)	11B6-CD40L	11B6-HIV5pep + sCD40L	11B6- HIV5pep	11B6-CD40L-HIV5pep	IgG4-CD40L
EC₅₀(nM) B 세포	>0.1 <1	>1 <10	>10	>0.1 <1	>10

도 10b를 위한 표. 최대 B 세포 증식의 50%(EC₅₀)에 대한 유효한 용량에 대한 제한은 나노몰 값(nM)으로 제공된다.

CD40L에 직접 융합된 항- CD40 11B6 mAb는 가용성 CD40L의 고도로 활성인 이량체-삼량체 형태와 비교하여 우수한 작용제이다.

MEGACD40L^®(Mega sCD40L)은 광범위하게 사용된(Kornbluth et al., 2012) 고도의 활성　단백질이며 여기서 2개의 이량체성 CD40 리간드 분자는 아디포넥틴/ACRP30/AdipoQ의 콜라겐 도메인을 통해 인공적으로 연결된다(참고: Miconnet and Pantaleo, Vaccine 2008). 도 10c는 H 쇄 C-말단에 융합된 HIV5pep 항원의 존재 및 부재하에서 용량 범위의 메가 sCD40L 및 항-CD40 11B6-CD40L mAb에 대한 사람 MDDC의 반응을 나타낸다. 항-CD40 11B6-CD40L은 당해 검정에서 사이토킨 분비를 유발시키는데 있어서 메가 sCD40L보다

100배 더 활성일 뿐만 아니라 10 nM 항-CD40 11B6와 함께 공-투여된 메가 sCD40L보다

100배 더 활성이며, 이는 항-CD40 11B6과 CD40L의 물리적 연결이 이러한 매우 높은 활성에 필수적이었음을 나타낸다. 중요하게도, H 쇄 C-말단을 통해 HIV5pep 항원에 연결된 항-CD40 11B6-CD40L은 또한 메가 sCD40L보다

10배 더 활성이었다.

항체(hIgG4)	11B6-CD40L-HIV5pep ^k	11B6-CD40L-HIV5pep	Mega sCD40L	11B6-CD40L
EC₅₀(nM) IL-12 p40	>0.1 ≤1	>0.1 ≤1	>1 <10	>0.01 ≤0.1
EC₅₀/ 11B6-CD40L	10	10	100	1
EC₅₀(nM) TNFα	>0.1 ≤1	>0.1 ≤1	>1 <10	>0.01 ≤0.1
EC₅₀/11B6-CD40L	10	10	100	1
EC₅₀(nM) IL-15	>0.1 ≤1	>0.1 ≤1	1 ≤10	>0.01 ≤0.1
EC₅₀/ 11B6-CD40L	10	10	100	1

도 10c를 위한 표. 최대 사이토킨 분비의 50%(EC₅₀)를 위한 유효 용량에 대한 한계는 나노몰 값(nM)으로 제공된다.

작용성 항-CD40 mAb L 쇄 C-말단에 대한 CD40L 융합이 다른 항원에 융합되어 있으면서, 또한 이의 작용제 효능을 증가시키는지의 여부를 시험하기 위하여, 본 발명자는 L 쇄에 직접 융합된 CD40L의 존재 또는 부재하에서 연결된 HIV-1 Gag p24 Nef Gag p17(GNG로 명명됨) 또는 HPV 16 E6/E7(HPV로 명명됨) 항원에 대한 이의 H 쇄 C-말단에 융합된 경우 이의 작용 활성을 비교하였다. 이러한 2개의 항원은 모 11B6 mAb의 B 세포 CD40 활성화의 낮은 효능을 유의적으로 저하시키지 않지만 CD40L L 쇄 융합은 공-투여된 sCD40과 동일한 수준으로 활성화를 강화시켰다(도 11). H 쇄 C-말단에서 GNG에 및 L 쇄 C-말단에서 CD40L에 융합된 11B6 mAb는 융합된 항원의 부재하에서 11B6-CD40L mAb와 비교하여 MDDC 활성화에 대해 동등하였고, 11B6 및 11B8-GNG 둘 다는 sCD40L과는 강력하게 상승작용한 반면, 11B6-CD40L-GNG는 11B6-GNG + sCD40에 대해 효능에 있어 동등하였다(도 11). 이러한 데이타는 L 쇄에 융합된 CD40L이 11B6-HPV + sCD40로 관찰된 전체 작용제 활성을 회복시켰다는 점에서 HPV 항원에 융합된 11B6와 유사하였다(도 11). 이러한 11B6-CD40L-항원 융합은 12B4-CD40L mAb, 뿐만 아니라 CD mAb + sCD40L로 관찰된 강력한 작용제 활성에 대해 동등하였다. 흥미롭게도, 12E12-HPV mAb는 sCD40L 작용을 방해하였지만, 항-CD40 12E12-CD40L-HPV mAb 양식은 강력한 작용제 활성을 회복하였다(도 11).

항-CD40 11B6-CD40L-GNG 단백질을 사용한 B 세포 증식에서 관찰된 완전한 '고' 작용제 활성은 11B6-GNG의 매우 약한 작용제 활성과는 대조적으로 11B6-CD40L-GNG에 대한 MDDC의 높은 사이토킨 분비 반응에 의해 재현되었다(도 12). 11B6-CD40L 분자의 효능은 표준 전체 작용제 항-CD40 CP IgG4 항체보다 현저히 더 높다.

CD40L에 직접 연결된 항- CD40.Gag p17-Nef-Gag p24 백신은 시험관내에서 특이적인 기억 CD8 ⁺ T 세포 반응을 증가시킨다.

연결된 CD40L을 지닌 항-CD40 11B6-GNG mAb의 증진된 작용제 특성이 HIV-1-특이적인 T 세포 확장의 효능에 영향을 미치는지의 여부를 직접 시험하기 위해, HIV-1-감염된 공여체 PBMC를 저 용량의 항-CD40 11B6-GNG-CD40L 및 다양한 대조군 GNG 융합 mAb와 함께 9일 동안 IL-2를 공급하면서 항온처리한 후 Gag p17, Gag p24, 및 Nef로부터의 펩타이드의 혼주물로 자극시켰다. 공여체 둘 다에서 직접 연결된 CD40L 또는 공0투여된 sCD40L을 지닌 11B6-GNG mAb는 현저히 보다 우수한 Nef-특이적인 CD8⁺ T 세포 반응을 유발하였다(도 13).

연결된 CD40L을 지닌 항-CD40 11B6-HIV5pep mAb의 증진된 작용제 특성이 HIV-1-특이적인 T 세포 확장의 효능에 영향을 미쳤는지의 여부를 직접 시험하기 위하여, HIV-1-감염된 공여체 PBMC를 저 용량의 항-CD40 11B6-GNG-CD40L 및 다양한 대조군 GNG 융합 mAb와 함께 9일 동안 IL-2를 공급하면서 항온처리한 후 HIV5pep의 5개의 Gag p17, Gag p24, Nef, 및 Pol 에피토프 구성성분에 상응하는 개개의 롱 펩타이드로 자극하였다. 유발된 HIV-1 펩타이드-특이적인 T 세포 반응에 대한 일반적인 경향성은 직접적으로 연결된 CD40L을 지닌 11B6-HIV5pep mAb가 보다 우수한 HIV-1-특이적인 CD8⁺ T 세포 반응 및 보다 적은 HIV-1-특이적인 CD4⁺ T 세포 반응을 유발한다는 것이다(도 14).

항-CD40 DC 표적화 백신과 sCD40L을 조합하는 시험관내 배양 시스템은 세포 치료요법 적용을 위한, 예컨대, 생체외(ex vivo) 확장된 CTL의 수율을 향상시키는 잠재적인 가치를 갖는다. 그러나, 생체내 백신 치료요법에서 이는 잠재적으로 복잡한 투여/약동학, GMP 생산, 및 허가 쟁점과 관련된 2개의 상이한 단백질 제제의 공-투여 필요성에 의해 구속된다. CD40L을 항-CD40 DC-표적화 mAb에 직접 연결시키는 신규한 2가 항체 양식은 이러한 쟁점을 해결한다.

HIV-1-감염된 공여체 PBMC 배양물 속에서 HIV-1-특이적인 T 세포의 CD40-표적화된 GNG 항원에 의한 확장.

HIV-1⁺ 공여체 PBMC를 저 용량의 sCD40L(100 ng/ml; 6 nM) 및 IL-2의 존재 및 부재하에서 9일 동안 용량 범위의 항-CD40-GNG 융합 단백질(좌측에서 우측으로 1, 0.1, 0.01 nM)과 함께 배양한 다음 혼주물 HIV-1 Gag p17, Nef, 및 Gag p24 펩타이드로 6시간 동안 자극시킨 다음 ICS로 분석하였다. 데이타는 펩타이드 자극에 대한 반응시 IFNγ + TNFα를 생산하는 항원-특이적인 (A) CD4⁺ 및(B) CD8⁺ T 세포의 배양 말기에 퍼센트를 나타낸다(참고: 도 26). 유사한 데이타가 2개의 다른 공여체로부터 PBMC를 사용하여 관찰되었다(도 27).

항- CD40-CD40L 표적화된 HIV5pep 항원은 HIV-1-감염된 공여체 PBMC 배양물에서 많은 HIV-1-특이적인 CD8 ⁺ T 세포 반응을 우선적으로 확장시킨다

HIV-1⁺공여체 PBMC를 9일 동안 IL-2 및 항-CD40 HIV5pep 융합 단백질(1 nM; KIH 단백질의 경우 2 nM)와 함께 배양한 다음, 5개의 HIV-1 gag, nef, 및 pol 영역 각각에 대해 특이적인 롱 펩타이드와 BFA로 자극시킨 다음 ICS로 분석하였다. 도 28은 4명의 공여체에서 시험한 나타낸 단백질 쌍 각각을 사용한 실험으로부터 수집한 데이타를 나타낸다. 각각의 점은 항-CD40 11B6-CD40L-HIV5pep KIH Gen 2 및 항-CD40 11B6-CD40L-HIV5pep Gen 1(Y 축)을 항-CD40 12E12-HIV5pep KIH Gen 2 및 항-CD40 12E12-HIV5pep Gen 2(X 축)에 대해 비교하여 각각의 공여체 내에서 유발된 각각의 롱 펩타이드에 대해 특이적인 각각의 반응에 대한 IFNγ⁺ + TNFα⁺ HIV5pep-특이적인 CD8⁺(패널 A, 검정색으로 채워진 사각형) 또는 CD4⁺(패널 B, 빈 회색 원형) T 세포에 대한 값%를 나타낸다. 패널 A는 확장된 배양물의 ≤20%인 반응을 강조하며 항-CD40 11B6-CD40L-HIV5pep 백신에 의해 유발된 nef66 펩타이드에 대한 강력한 환자 2 반응(38±7%) 대 항-CD40-HIV5pep 백신에 의해 유발된 48±10%는 배제하였다. 패널 B는 전체 데이타세트를 나타낸다.

항-CD40 11B6에 대한 CD40L의 융합은 생체내 마우스 모델에서 보조제가 없는 항체 반응을 증강시킨다.

백신 효능을 증가시키기 위해 CD40L 융합체를 항-CD40 11B6 항체에 조합시키는 것의 가능성을 시험하기 위하여, 사람 CD40 유전자이식 마우스를 CD40L 경쇄 융합체의 존재 및 부재하에서, HIV-1 Env gp140에 커플링된 항-CD40 11B6 전달 비히클로 예방접종하였다. gp140에 직접 융합된 항-CD40 11B6-CD40L을 사용한 예방접종을 코헤신-gp140 융합 단백질에 비-공유결합적으로 커플링된 항-CD40 11B6-CD40L을 사용한 예방접종, 코헤신-gp140 융합 단백질에 비-공유결합으로 커플링된 항-CD40 11B6, 및 비-CD40 표적화된 코헤신-gp140과 비교하였다. 코헤신-gp140 융합 단백질에 비-공유결합으로 커플링된 항-CD40 11B6-CD40L 및 gp140에 직접 융합된 항-CD40 11B6-CD40L 둘 다는 단일 예방접종 1주일 후의 조기 검출된 혈청 항-gp140 IgG 역가를 유발하였고, 백신 둘 다는 후속적인 2회 예방접종 후 유사한 정도로 반응을 증가시킨다(도 16). 코헤신-gp140에 비-공유결합으로 연결된 항-CD40 11B6을 사용한 예방접종은 두번째 예방접종 후에만 검출된 혈청 항-gp140 IgG 역가를 유발하였고, 반응은 세번째 예방접종 후 추가로 증가하였지만, 역가는 2개의 항-CD40 11B6-CD40L-기반 백신과 비교하여 유의적으로 감소하였다. 비-표적화된 코헤신-gp140은 CD40-표적화된 백신과 비교하여 3배 몰 과량의 gp140을 사용한 3회 예방접종 후에서도 어떠한 검출가능한 항-gp140 IgG 반응도 유발하는데 실패하였다. 이러한 결과는 비-사람 영장류 모델에서의 결과 측면에서 고려될 수 있으며, 여기서 항-CD40 12E12-gp140 예방접종은 보조제 폴리 IC와 공-투여된 동일한 백신과 비교하여 단지 보통의 항-gp140 IgG 반응을 유발하였다(Zurawski et al., 2016). 마우스 데이타는 항-CD40 11B6-gp140 작제물에 연결된 CD40L이 이러한 단백질 백신에 대해 '보조제-유사' 특성을 부여하는 경향성을 시사한다.

항- CD40 11B6-CD40L은 생체내 마우스 모델에서 CD40의 강력한 활성화를 유발한다.

화학치료요법을 받는 암 환자에서 CP-870,893 주입은 증가된 혈장 염증성 사이토킨(즉, 사이토킨 방출 증후군), 공-자극 분자의 증가된 B 세포 발현, 및 B 세포의 일시적인 고갈에 의해 검출된 면역 활성화를 개시한다(Beatty et al., 2013). 0.3 mg/kg이 이러한 항-CD40 작용제 만을 제공받은 환자에서 검출된 한계이지만, 이러한 환자에서, 용량-제한 독성은 0.2 mg/kg인 것으로 측정되었다(Vonderheide et al., 2016). 생체내에서 항-CD40 11B6-CD40L의 생물학적 활성을 평가하기 위하여, 본 발명자는 10 μg(

0.5 mg/Kg)의 용량에서 CP-870,893 hIgG4 및 항-CD40 11B6-CD40L의 단-기간(24시간) 효과를 시험하였다. 야생형(타코닉 균주) 또는 CD40 KO (ImmuRx strain) C57BL/6 배경에서 야생형 또는 사람 CD40 BAC 유전자이식 마우스에게 CP-870,893 hIgG4 또는 몰 당량의 항-CD40 11B6-CD40L를 주사(복강내)하고 24시간 후 희생시켰다. 혈액을 사이토킨(Luminex®를 통한 혈청)의 검정을 위해 수집하고 PBMC, 림프절을 제거한 피부, 및 비장으로부터의 세포를 유동 세포분석기로 분석하였다. B 세포를 활성화 마커 CD69, MHC-II, OX40L 및 CD86의 분석으로 특성화하였다. 결과는 도 17에 나타내며 CP-870,893 hIgG4는 이러한 시험에서 활성이 최소이거나 없는 반면, 항-CD40 11B6-CD40L는 활성화와 관련된 풍부한 B 세포 고갈 뿐만 아니라 순환시 검출된 것으로서 사이토킨 분비를 유발함을 나타낸다. 이러한 데이타는 CP-870,893와 비교하여 매우 낮은 용량의 항-CD40 11B6-CD40L이 예컨대, 암 치료요법에서 보조제로서 임상적으로 사용된 경우에 요구될 수 있음을 예측한다.

항-CD40 11B6에 대한 CD40L의 융합은 FAS 전이막 및 세포내 도메인에 융합된 CD40 엑토도메인에 의해 지시된 세포 사멸의 효능 및 잠재능 둘 다를 증가시킨다.

FAS(CD95)는 세포내 '사멸 도메인'을 함유하는 종양 괴사 인사 수용체(TNF-R) 계열에 속하며 이의 생리학적 리간드, FASL에 대한 반응시 세포자멸사를 개시할 수 있다(Strasser et al., 2009). 본 발명자는 사람 FAS 잔기 187-350에 융합된 사람 CD40 엑토도메인 잔기 21-193을 발현하는 융합 단백질을 작제하고 FAS 전이막 및 세포내 도메인에 연결된 CD40 엑토도메인을 발현하는 안정하게 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 확립하였다. CD40 작용제는 테트라졸륨 염 MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드)의 미토콘드리아 환원의 상실로 측정된 바와 같이 이러한 세포의 사멸을 유발한다(Mossman, 1983). 이러한 검정에서 항-CD40 11B6 IgG4 및 항-CD40 12E12 IgG4는 유사한 효능(MTT 환원시 최대 감소에 의해 측정된 것으로서) 및 유사한 효능(각각 EC₅₀

2.5 nM 및 1 nM)을 나타내지만, 항-CD40 11B6-CD40L IgG4는 증가된 효능(즉, MTT 감소에서 보다 큰 최대 감소) 및 유의적으로 증가된 효능(EC50

2.5 pM)을 갖는다(도 18). 이러한 데이타는 B 세포에서 관찰된 항-CD4011B6-CD40L 효능의 우수성의 시험 및 DC 검정으로부터 유출된 결론을 재-강화시킨다.

항- CD40 11B6-CD40L은 CD40-매개된 무리화 및 내재화를 향상시킨다

본 발명자는 항-CD40 11B6-CD40L 대 항-CD40 12E12의 CD40-매개된 내재화의 속도 및 정도를 비교하였다. 이러한 2개의 항체는 SPR 분석을 기반으로 CD40에 대한 이의 결합에 잘 일치하지만(각각 12 및 28 nM의 KD, 도 24), 이는 CD40 활성화 효능에 있어서 현저히 상이하다(도 9,18). 리간드 결합(engagement)은 CD40 내재화 및 하부 신호전달(downstream signaling)가 이어오는 현상인, 세포 막에서 가교-결합된 CD40 지질 래프트(raft)(무리)의 형성을 초래하므로(Wang et al. 2015), 본 발명자는 세포 표면 CD40을 무리화하고 내재화시키는 항-CD40 11B6-CD40L 대 항-CD40 12E12의 능력을 비교하였다.

본 발명자는 우선 세포 막에서 가교결합된 CD40 지질 래프트(무리)의 형성을 유도하는 이러한 2개의 항-CD40 항체의 능력을 비교하였다. 본 발명자는 공초점 현미경을 통한 무리 형성을 가시화하는 모델로서 사람 CD40-eGFP 융합 단백질 또는 사람 CD40-mCherry 융합을 발현시키는 CHO 세포를 사용하였다. 37℃에서 1시간 동안 10 nM 항-CD4011B6-CD40L을 사용하여 세포를 처리하는 것은 항-CD40 12E12를 사용한 동일한 치료와 비교하여 보다 강력한 CD40 무리를 유도하였다(도 23). 이러한 데이타는 CD40 무리화가 CD40 활성화에 대한 초기 개시인자(trigger)인 경향이 있으므로, 항-CD40 11B6-CD40L 항체의 증가된 신호전달 효능과 일치한다.

이후에, 본 발명자는 모델로서 사람 CD40을 발현하는 CHO 세포를 사용하여 비-공유결합으로 부착된 mCherry 모듈의 항-CD40-매개된 결합 및 내재화를 검정하였다. 항체 둘 다의 결합은 신속하고 ~30분 내에 37℃ 및 0℃에서 포화에 이른다(도 24 A 및 B). 냉 등장성 산 완충액(pH 2.5) 속에서 세포를 1분 동안 처리하는 것은 결합이 0℃에서 수행된 경우 세포-관련된 항-CD40 12E12 표지의 ~75%를 제거하였다(도 24 A). 결합이 37℃에서 수행된 경우, 37℃에서 보다 큰 표지 보유로의 경향성(잔사 표지 29±3% 대 26±3%, n.s.)이 존재하며, 이는 아마도 약한 내재화를 반영한다. 대조적으로, 항-CD40 11B6-CD40L 결합을 0℃에서 수행한 경우, 산 스트립핑(acid stripping)은 항-CD40 12E12 mAb로 관찰한 26±3%에 대해 세포-관련된 표지의 ~60% 만을 제거하였고, 2개의 mAb 사이의 이러한 차이는 유의적이며(p<0.0001, 도 24 B), 이는 항-CD40 11B6-CD40L 내재화가 심지어 0℃에서도 용이하게 검출될 수 있음을 나타낸다. 항-CD40 11B6-CD40L 표지의 내재화는 37℃에서 훨씬 더 크며, 산-내성 표지는 4.5 기간에 걸쳐 50 내지 90%로 증가하였다(도 24 B). 따라서, 항-CD40 11B6-CD40L은 항-CD40 12E12 보다 훨씬 더 큰 정도로 내재화하며, 심지어 0℃에서도 유의적인 내재화가 검출가능하다. 이러한 특성은 CD40L에 대한 융합없이 항-CD40 11B6의 결합 및 내재화 특성이 항-CD40 12E12 mAb와 매우 유사하였으므로 CD40L 부가물의 단독 결과이다(도 24 C).

항- CD40 11B6은 항-CD40 12E12 및 항-CD40 CP로부터 명백한 CD40 상의 에피토프를 인식한다.

문헌: Yu et al. (2018)에서는 작용제 항-CD40 mAb와 CD40과의 이의 상호작용 부위의 관계의 지식을 요약하였다. 예를 들면 항-CD40 CP는 CD40 CRD1 영역 내에서 결합하고(즉, 제거된 경우 결합이 없음) 또한 결합은 잔기 23-37가 결실되거나 잔기 27-28 RE가 AA로 대체된 경우 상실된다. 또한, 문헌: Singh et al. (1998)은 CD40에서 음으로 하전된 잔기 Glu74, Asp84, 및 Glu117의 개개의 치환이 CD40L 결합을 파괴하였음을 보고하였다. 이러한 맵핑은 CD40L 대 CP 항체에 대한 CD40에서의 상호작용의 명백한 부위를 나타낸다. 문헌: Wan et al., 2012의 방법을 사용하여, 잔기 R27 및 E28을 A로 개별적으로 대체하고 돌연변이된 CD40 엑토도메인을 항-CD40 CP, 항-CD40 12E12, 및 항-CD40 11B6(±CD40L)에 대한 결합에 대해 시험하였다. 예측된 바와 같이, R27A 및 E28A 돌연변이는 항-CD40 CP mAb에 대한결합을 없애거나 크게 감소시켰다(도 19). 그러나, 이러한 돌연변이는 항-CD40 11B6 또는 12E12 mAb의 결합에 영향을 미치지 않았다. 데이타는항-CD40 11B6 또는 12E12 mAb로부터 항-CD40 CP mAb의 CD40에서 결합 부위를 명확하게 차별화시킨다.

항-CD40 작용성 항체 12E12 및 11B6의 에피토프 맵핑

2개의 시도를 사용하여 2개의 청구된 항체(12E12 및 11B6)에 대한 상호작용/결합에 중요한 CD40 잔기를 정의할 뿐 아니라 다른 작용성 항체 CP-870,893(본원에서 CP로 지칭됨)로부터 이를 차별화시켰다. 첫번째 시도는 PepScan(네덜란드 기반 회사) "정밀한 에피토프 맵핑(Precision Epitope Mapping)" 플랫폼을 기반으로 한다. 두번째 시도는 항체 결합 분석에 커플링된 사람 CD40 엑토도메인의 선택된 친수성 잔기의 Ala-스캐닝 돌연변이유발을 수행함으로써 PepScan 데이타를 구축하였다.

이러한 접근법을 사용하는 경우, 목표는 이러한 3개의 항체에 대해 특이적인 CD40에서 에피토프내 차이를 확인하는 것이었다.

6개의 12E12 결합 펩타이드 영역을 Pepscan 분석으로부터 확인하였고 Ala 돌연변이유발은 모든 그러나 이러한 펩타이드 중 하나(이는 고로로 하전된 잔기를 가지지 않는다)에서 하전된 잔기를 포함하였다:

9개의 11B6 결합 펩타이드 영역을 강조하고 Ala 돌연변이유발은 이러한 9개의 펩타이드(고도로 하전된 잔기를 가지지 않는 것은 제외) 중 8개에서 하전된 잔기를 포함하였다:

Ala-돌연변이유발 연구로부터 유도된 데이타를 도 25에 요약한다. CD40의 4개의 CDR 구조적 상동성에 밑줄쳐져 있다. 돌연변이 중 일부에 대한 잔기 번호가 나타나 있다. 회색 강조는 하전되지 않은 잔기를 나타낸다. P는 Pfizer CP mAb이고; E는 12E12이고; B는 11B6이고; L은 11B6-CD40L이고; -는 시험된 임의의 mAb에서 효과가 없음을 의미하고; 서열 아래의 소문자는 감소된 결합을 나타내고; CAPS 내 문자는 결합이 없음을 의미한다.

모든 3개의 mAb가 CDR1 영역내에서 명확한 에피토프 구성성분을 가졌음에도 불구하고, 돌연변이유발은 CP, 11B6, 및 12E12 결합에 대한 에피토를 높은 신뢰도로 구별하지 못하였다. 이러한 CP 상호작용은 잔기 R27 및 E28 내 변화에 의해 파괴되었고(발표된 정도를 입증함); 11B6 상호작용은 잔기 K29, 뿐만 아니라 E56 및 E58과의 상호작용을 포함하였고; 조합된 11B6-CD40L 결합은 K46A 변화에 의해 없어졌고; 12E12 상호작용은 D50 및 E58에 의존적이었다. 따라서, 데이타는 이러한 3개의 mAb에 대한 에피토프의 일부 오버랩을, 그러나 주요 완전한 부위에서의 명백한 차이를 나타낸다.

본 개시내용의 융합 단백질의 다른 예

다음의 대안적인 융합 단백질 A1 내지 A5를 제조하였다. 도 22는 경쇄 또는 중쇄의 C-말단에서 항원을 사용하거나, 및/또는 가요성 링커의 존재하에서, 각각의 융합 단백질의 구조를 나타내는 카툰을 나타낸다.

실시예 A1　: L 쇄 C-말단에서 CD40L을 지닌 항-CD40 11B6

PAB3588 C3334 (SEQ ID NO: 131) x C3792 (SEQ ID NO: 133)

[manti-CD40_11B6.1C3_H-LV-hIgG4H-C-Nhe-Not][manti-CD40_11B6.1C3_Syn_K-LV-hIgGK-C-hCD40Ligand]

실시예 A2　: H 쇄 C-말단에 Flex-CD40L을 지닌 항-CD40 사람화된 11B6

PAB3618 C3823 (SEQ ID NO: 135) x C3739 (SEQ ID NO: 137)

[mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-hCD40Ligand][mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]

실시예 A3: L 쇄 C-말단에 Flex-CD40L을 지닌 항-CD40 사람화된 11B6

PAB3475 C3724 (SEQ ID NO: 139) x C3726 (SEQ ID NO: 141)

[mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C-Flex-v1-hCD40Ligand][mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v3-LV-hIgG4H-C]

실시예 A4　: H 쇄 C-말단에서 CD40L을 지닌 항-CD40 사람화된 11B6

PAB3615 C3821 (SEQ ID NO: 143) x C3739 (SEQ ID NO: 137)

[mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C-hCD40Ligand][mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]

실시예 A5　: L 쇄 C-말단에서 Flex-CD40L을 지닌 항-CD40 사람화된 11B6

PAB3470 C3724 (SEQ ID NO: 139) x C3725 (SEQ ID NO: 145)

[mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C-Flex-v1-hCD40Ligand][mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C]

초 작용제 특성은 L 쇄의 C-말단 또는 H 쇄의 C-말단에서 CD40L의 위치 및가요성 링커 결합 서열의 존재 또는 부재에 상관없이 관찰된다.

사람 MDDC를 용량 범위(도 20에서 좌측에서 우측으로: 10, 1, 0.1, 0.01 nM)의 각각의 항-CD40 11B6-CD40L 동형과 함께 배양하고 사이토킨 분비의 정도를 24시간 후 측정하였다. 도 20에서 데이타는 실험내 최대 값에 대해 표준화시키고 2개의 상이한 공여체를 사용하여 반복된 반응에 대해 평균낸 시험한 각각의 사이토킨에 대한 값의 요약을 나타낸다. 오차 바아는 평균의 표준 오차이다. 하기 각각의 적정 시리즈를 나타낸 카툰은 L 쇄 또는 H 쇄 CD40L 융합 동형을 나타내고 F는 Flex V1 링커의 존재를 나타낸다. 결과는 이러한 시리즈에 걸쳐 각각의 용량에 대한 값 사이에 유의적인 차이가 없음을 나타낸다.

항-CD40 항체에 융합된 CD40L의 초작용제 활성은 FAS 전이막 및 세포내 도메인에 융합된 CD40 엑토도메인에 의해 지시된 세포 사멸의 효능 및 잠재능에 의해 정의된 바와 같이 CD40L 위치선정과는 독립적이다.

FAS(CD95)는 세포내 '사멸 도메인'을 함유하는 종양 괴사 인자 수용체(TNF-R) 계열에 속하며 이의 생리학적 리간드인, FASL에 대한 반응시 세포자멸사를 개시할 수 있다(Strasser et al., 2009). 본 발명자는 사람 FAS 잔기 187-350에 융합된 사람 CD40 엑토도메인 잔기 21-193을 발현하는 융합 단백질을 작제하고 FAS 전이막 및 세포내 도메인에 연결된 CD40 엑토도메인을 발현하는 안정하게 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 확립하였다. CD40 작용제는 테트라졸륨 염 MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드)의 미토콘드리아 감소의 상실에 의해 측정된 바와 같이, 이러한 세포의 사멸을 유발한다(Mossman, 1983). FAS 및 CD40는 동일한 TNF-R 계열 내에 속하며 수용체 활성화 메카니즘(세포에 대해 외부)은 유사하지만, 세포내 신호전달 경로, 즉, 세포자멸사 대 선택된 사이토킨 및 세포 표면 마커 활성화는 상이하다. 이러한 융합 작제물은 형질감염된 CHO 세포를 기반으로 CD40 활성화의 분석을 위한 편리한 대리 검정 양식을 제공한다. 이러한 검정에서 항-CD40 11B6 IgG4 및 항-CD40 12E12 IgG4는 유사한 효능(MTT 환원에서 최대 감소에 의해 측정됨) 및 유사한 잠재능(각각 EC₅₀

2.5 nM 및 1 nM)을 나타내지만, 항-CD40 11B6-CD40L IgG4는 증가된 효능(즉, MTT 환원에 있어서 보다 큰 최대 감소) 및 유의적으로 증가된 효능(EC50

2.5 pM)을 갖는다(도 21). 따라서, 부분 작용제 항-CD40 11B6 mAb에 대한 CD40L 융합은 3개의 명백한 CD40를 지닌 세포형에 대한 잠재능 및 효능을 크게 증가시킬 수 있다.

본 발명을 실행하기 위한 유용한 서열들

SEQ ID	유형	간략한 설명
1	aa	PAB3405 중쇄 C3677 [mAnti-CD40-11B6.1.C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C]의 아미노산 서열
2	aa	PAB3405 경쇄 C3862 [mAnti-CD40-11B6.1C3-Vk-v2-LV-hIgGK-C]의 아미노산 서열
3	aa	PAB3408 중쇄 C3678 [mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v3-LV-hIgG4H-C]의 아미노산 서열
4	aa	PAB3408 경쇄 C3682 [mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]의 아미노산 서열
5	aa	PAB3470 및 PAB3471 경쇄 C3724 [mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C-Flex-v1-hCD40Ligand]의 아미노산 서열
6	aa	PAB3470 중쇄 C3725 [mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C]의 아미노산 서열
7	aa	사람 CD40의 뉴클레오타이드 암호화 서열 (SEQ ID NO　:13)
8	aa	PAB3471 중쇄 C3726 [mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v3-LV-hIgG4H-C]의 아미노산 서열
9	aa	PAB3499 중쇄 C3735 [mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2-L-V-hIgG4H-C-Flex-v1-Pep-gag17-f1-gag253-f2-nef116-f3-nef66-f4-pol158]의 아미노산 서열
10	aa	PAB3499 경쇄 C3739 [mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]의 아미노산 서열
11	aa	PAB3498 중쇄 C3735 [mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2-L-V-hIgG4H-C-Flex-v1-Pep-gag17-f1-gag253-f2-nef116-f3-nef66-f4-pol158]의 아미노산 서열
12	aa	PAB3498 경쇄 C3524 [mAnti-CD40-11B6.1C3-Vk-v2-LV-hIgGK-C-Flexv1-hCD40L]의 아미노산 서열
13	aa	사람 CD40의 전체 아미노산 서열
14	aa	사람 CD40L의 CD40 바인딩 도메인의 아미노산 서열
15	aa	FlexV1 펩타이드 링커의 아미노산 서열
16	aa	Gag p17의 아미노산 서열 (17-35)
17	aa	Gag p17-p24의 아미노산 서열 (253-284)
18	aa	Nef의 아미노산 서열 (116-145)
19	aa	Pol 325-344의 아미노산 서열 (RT 158-188)
20	aa	Nef의 아미노산 서열 (66-97)
21	aa	사람화 11B6의 가변 중쇄 영역 (VH) (v2)의 아미노산 서열
22	aa	사람화 11B6 VL의 가변 경쇄 (VL) Vk (v2)의 아미노산 서열
23	aa	사람화 11B6의 가변 중쇄 영역 VH (v3)의 아미노산 서열
24	nt	뉴클레오타이드 서열 암호화 SEQ ID NO:21
25	nt	뉴클레오타이드 서열 암호화 SEQ ID NO:22
26	nt	뉴클레오타이드 서열 암호화 SEQ ID NO:23
27	aa	사람화 11B6 VH V2의 HCDR1의 아미노산 서열
28	aa	사람화 11B6 VH V2의 HCDR2의 아미노산 서열
29	aa	사람화 11B6 VH V2의 HCDR3의 아미노산 서열
30	aa	사람화 11B6 VkV2의 LCDR1의 아미노산 서열
31	aa	사람화 11B6 VkV2의 LCDR2의 아미노산 서열
32	aa	사람화 11B6 VkV2의 LCDR3의 아미노산 서열
33	nt	PAB3405 중쇄의 뉴클레오타이드 서열
34	nt	PAB3405 경쇄의 뉴클레오타이드 서열
35	nt	SEQ ID NO:3의 암호화 서열
36	nt	SEQ ID NO:4의 암호화 서열
37	nt	SEQ ID NO:5의 암호화 서열
38	nt	SEQ ID NO:6의 암호화 서열
39	nt	SEQ ID NO:8의 암호화 서열
40	aa	mAb 12E12 HC [manti-CD40_12E12.3F3_H-V-hIgG4H-C]의 아미노산 서열
41	nt	SEQ ID NO:9의 암호화 서열
42	nt	SEQ ID NO:10의 암호화 서열
43	nt	SEQ ID NO:11의 암호화 서열
44	nt	SEQ ID NO:12의 암호화 서열
45	aa	GNG에 사용되는 바와 같은 Gag p24의 아미노산 서열
46	aa	GNG에 사용되는 바와 같은 Nef의 아미노산 서열
47	aa	GNG에 사용되는 바와 같은Gag p17의 아미노산 서열
48	aa	실시예에 사용되는 바와 같은 GNG의 아미노산 서열
49	nt	GNG에 사용되는 바와 같은 Gag p24의 뉴클레오타이드 서열
50	nt	GNG에 사용되는 바와 같은 Nef의 뉴클레오타이드 서열
51	nt	GNG에 사용되는 바와 같은 Gag p17 의 뉴클레오타이드 서열
52	nt	실시예에 사용되는 바와 같은 GNG의 뉴클레오타이드 서열
53	aa	가요성 링커 f3의 아미노산 서열
54	aa	가요성 링커 f4의 아미노산 서열
55	aa	HPV 서열에 사용되는 바와 같은 HV16E6HPV16E7의 아미노산 서열
56	aa	가요성 링커 f1의 아미노산 서열
57	aa	HPV 서열의 전체 아미노산 서열
58	aa	mAb3 (12B4)의 VH 아미노산 서열
59	aa	mAb3 (12B4)의 VL 아미노산 서열
60	aa	mAb4 (24A3 HC) [manti-hCD40_24A3.3F1_H-LV-hIgG4H-C]의 VH 아미노산 서열
61	aa	mAb4 (24A3 KC) [manti-hCD40_24A3.3F1_K-LV-hIgGK-C]의 VL 아미노산 서열
62	aa	mAb5 (CP) [manti-hCD40_CP870893H-LV-hIgG4H-C]의 VH 아미노산 서열
63	aa	mAb5 (CP) [manti-hCD40_CP870893K-LV-hIgGK-C]의 VL 아미노산 서열
64	aa	mAb6 (12E12 H3 사람화 HC [hAnti-CD40VH3-LV-hIgG4H-C])의 VH 아미노산 서열
65	aa	mAb6 (사람화 K2 12E12)의 VL 아미노산 서열
66	nt	SEQ ID NO:58의 암호화 서열
67	nt	SEQ ID NO:59의 암호화 서열
68	nt	SEQ ID NO:60의 암호화 서열
69	nt	SEQ ID NO:61의 암호화 서열
70	nt	SEQ ID NO:62의 암호화 서열
71	nt	SEQ ID NO:63의 암호화 서열
72	nt	SEQ ID NO:64의 암호화 서열
73	nt	SEQ ID NO:65의 암호화 서열
74	aa	mAb3 (12B4)의 HCDR1 아미노산 서열
75	aa	mAb3 (12B4)의 HCDR2 아미노산 서열
76	aa	mAb3 (12B4)의 HCDR3 아미노산 서열
77	aa	mAb3 (12B4)의 LCR1 아미노산 서열
78	aa	mAb3 (12B4)의 LCDR2 아미노산 서열
79	aa	mAb3 (12B4)의 LCDR3 아미노산 서열
80	aa	mAb4 (24A3)의 HCDR1 아미노산 서열
81	aa	mAb4 (24A3)의 HCDR2 아미노산 서열
82	aa	mAb4 (24A3)의 HCDR3 아미노산 서열
83	aa	mAb4 (24A3)의 LCDR1 아미노산 서열
84	aa	mAb4 (24A3)의 LCDR2 아미노산 서열
85	aa	mAb4 (24A3)의 LCDR3 아미노산 서열
86	aa	mAb5 (CP)의 HCDR1 아미노산 서열
87	aa	mAb5 (CP)의 HCDR2 아미노산 서열
88	aa	mAb5 (CP)의 HCDR3 아미노산 서열
89	aa	mAb5 (CP)의 LCDR1 아미노산 서열
90	aa	mAb5 (CP)의 LCDR2 아미노산 서열
91	aa	mAb5 (CP)의 LCDR3 아미노산 서열
92	aa	mAb6 (사람화 12E12)의 HCDR1 아미노산 서열
93	aa	mAb6 (사람화 12E12)의 HCDR2 아미노산 서열
94	aa	mAb6 (사람화 12E12)의 HCDR3 아미노산 서열
95	aa	mAb6 (사람화 12E12)의 LCDR1 아미노산 서열
96	aa	mAb6 (사람화 12E12)의 LCDR2 아미노산 서열
97	aa	mAb6 (사람화 12E12)의 LCDR3 아미노산 서열
98	aa	12B4 HC [manti-CD40_12B4.2C10_H-LV-hIgG4H-C]
99	aa	12B4 KC [manti-CD40_12B4.2C10_K-LV-hIgGK-C]
100	aa	12E12 HC [manti-CD40_12E12.3F3_H-V-hIgG4H-C]
101	aa	12E12 KC [manti-CD40_12E12.3F3_K-V-hIgGK-C]
102	aa	12E12 H2 사람화 HC [hAnti-CD40VH2-LV-hIgG4H-C]
103	aa	12E12 H3 사람화 HC [hAnti-CD40VH3-LV-hIgG4H-C]
104	aa	12E12 K2 사람화 KC [hAnti-CD40VK2-LV-hIgGK-C]
105	aa	Pfizer HC [manti-hCD40_CP870893H-LV-hIgG4H-C]
106	aa	Pfizer KC [manti-hCD40_CP870893K-LV-hIgGK-C]
107	aa	24A3 HC [manti-hCD40_24A3.3F1_H-LV-hIgG4H-C]
108	aa	24A3 KC [manti-hCD40_24A3.3F1_K-LV-hIgGK-C]
109	aa	완전한 서열 (C3724) FlexV1 hCD40L
110	aa	11B6 hCD40L 사람화 HC [mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C-CthermoDockerin] (C3737) (CthermoDockerin)
111	aa	CthermoDockerin의 아미노산 서열
112	aa	HIV5pep의 아미노산 서열
113	nt	SEQ ID NO:109의 암호화 서열
114	nt	SEQ ID NO:110의 암호화 서열
115	nt	SEQ ID NO:112의 암호화 서열
116	aa	C3336 rAB-cetHS-puro-CI2[manti-CD40_11B6.1C3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-HPV16E6-HPV16E7-f1]
117	aa	C3735 rAB-cetHS-puro[mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Pep-gag17-f1-gag253-f2-nef116-f3-nef66-f4-pol158]
118	nt	SEQ ID NO:117의 암호화 서열
119	aa	12E12 KC [manti-CD40_12E12.3F3_K-V-hIgGK-C]
120	nt	SEQ ID NO:119의 암호화 서열
121	aa	C3678 [mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v3-LV-hIgG4H-C]
122	aa	C3682 [mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]
123	aa	C3724 [mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C-Flex-v1-hCD40Ligand]
124	aa	인플루엔자 매트릭스 단백질 1에 융합된 C566 Ecoli-pET28 [Cohesin-var1-FluM1-6xHis] Cohesin mutant (Cys to Ala change; C38A)
125	nt	SEQ ID NO:124의 암호화 서열
126	nt	SEQ ID NO:40의 암호화 서열
127	aa	SEQ ID NO:102의 암호화 서열
128	nt	SEQ ID NO:121의 암호화 서열
129	nt	SEQ ID NO:122의 암호화 서열
130	aa	플렉스 링커 아미노산 서열
131	aa	C3334 [manti-CD40_11B6.1C3_H-LV-hIgG4H-C-Nhe-Not]
132	nt	SEQ ID NO:130의 암호화 서열
133	aa	C3792 [manti-CD40_11B6.1C3_Syn_K-LV-hIgGK-C-hCD40Ligand]
134	nt	SEQ ID NO:132의 암호화 서열
135	aa	C3823 [mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-hCD40Ligand]
136	nt	SEQ ID NO:134의 암호화 서열
137	aa	C3739 [mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]
138	nt	SEQ ID NO:136의 암호화 서열
139	aa	C3724 [mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C-Flex-v1-hCD40Ligand]
140	nt	SEQ ID NO:138의 암호화 서열
141	aa	C3726 [mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v3-LV-hIgG4H-C]
142	nt	SEQ ID NO:140의 암호화 서열
143	aa	C3821 [mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C-hCD40Ligand]
144	nt	SEQ ID NO:142의 암호화 서열
145	aa	C3725 [mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C]
146	nt	SEQ ID NO:144의 암호화 서열
147	aa	C3678 [mAnti-CD40-11B6.1C3-VH-v3-LV-hIgG4H-C]
148	nt	SEQ ID NO:146의 암호화 서열
149	aa	C3682 [mAnti-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]
150	nt	SEQ ID NO:148의 암호화 서열
151	aa	Mam-cetHS-puro[hCD40--Ecto hFas-TM-IC]
152	nt	SEQ ID NO:151의 암호화 서열
153	aa	Pepscan으로부터 확인된 12E12 결합 펩타이드 영역
154	aa	Pepscan으로부터 확인된 12E12 결합 펩타이드 영역
155	aa	Pepscan으로부터 확인된 12E12 결합 펩타이드 영역
156	aa	Pepscan으로부터 확인된 12E12 결합 펩타이드 영역
157	aa	Pepscan으로부터 확인된 12E12 결합 펩타이드 영역
158	aa	Pepscan으로부터 확인된 12E12 결합 펩타이드 영역
159	aa	Pepscan으로부터 확인된 11B6 결합 펩타이드 영역
160	aa	Pepscan으로부터 확인된 11B6 결합 펩타이드 영역
161	aa	Pepscan으로부터 확인된 11B6 결합 펩타이드 영역
162	aa	Pepscan으로부터 확인된 11B6 결합 펩타이드 영역
163	aa	Pepscan으로부터 확인된 11B6 결합 펩타이드 영역
164	aa	Pepscan으로부터 확인된 11B6 결합 펩타이드 영역
165	aa	Pepscan으로부터 확인된 11B6 결합 펩타이드 영역
166	aa	Pepscan으로부터 확인된 11B6 결합 펩타이드 영역
167	aa	Pepscan으로부터 확인된 11B6 결합 펩타이드 영역
168	aa	단량체성 스트렙타비딘 2 도메인
169	nt	단량체성 스트렙타비딘 2 도메인의 뉴클레오타이드 암호화 서열
170	aa	C3948:rAB-cetHS-puro[hIgG4H-Flex-v1-S.Aureusmono-Streptavidin-EPEA]
171	nt	C3948의 암호화 서열

본 발명을 실행하기 위한 유용한 서열들

SEQ ID NO　:	완전한 서열
1	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQAHGQGLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYVYWGQGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS
2	DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECAS
3	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGQGLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYVYWGQGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS
4	DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECAS
5	DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL
6	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQAHGQGLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYVYWGQGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS
7	ATGGTTCGTCTGCCTCTGCAGTGCGTCCTCTGGGGCTGCTTGCTGACCGCTGTCCATCCAGAACCACCCACTGCATGCAGAGAAAAACAGTACCTAATAAACAGTCAGTGCTGTTCTTTGTGCCAGCCAGGACAGAAACTGGTGAGTGACTGCACAGAGTTCACTGAAACGGAATGCCTTCCTTGCGGTGAAAGCGAATTCCTAGACACCTGGAACAGAGAGACACACTGCCACCAGCACAAATACTGCGACCCCAACCTAGGGCTTCGGGTCCAGCAGAAGGGCACCTCAGAAACAGACACCATCTGCACCTGTGAAGAAGGCTGGCACTGTACGAGTGAGGCCTGTGAGAGCTGTGTCCTGCACCGCTCATGCTCGCCCGGCTTTGGGGTCAAGCAGATTGCTACAGGGGTTTCTGATACCATCTGCGAGCCCTGCCCAGTCGGCTTCTTCTCCAATGTGTCATCTGCTTTCGAAAAATGTCACCCTTGGACAAGCTGTGAGACCAAAGACCTGGTTGTGCAACAGGCAGGCACAAACAAGACTGATGTTGTCTGTGGTCCCCAGGATCGGCTGAGAGCCCTGGTGGTGATCCCCATCATCTTCGGGATCCTGTTTGCCATCCTCTTGGTGCTGGTCTTTATCAAAAAGGTGGCCAAGAAGCCAACCAATAAGGCCCCCCACCCCAAGCAGGAACCCCAGGAGATCAATTTTCCCGACGATCTTCCTGGCTCCAACACTGCTGCTCCAGTGCAGGAGACTTTACATGGATGCCAACCGGTCACCCAGGAGGATGGCAAAGAGAGTCGCATCTCAGTGCAGGAGAGACAG
8	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGQGLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYVYWGQGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS
9	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQAHGQGLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYVYWGQGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASEKIRLRPGGKKKYKLKHIVASSSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSPASNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDASPTSTPADSSTITPTATPTATPTIKGASHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLASTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPASVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAASAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYAS
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12	DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL
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14	MQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL
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16	EKIRLRPGGKKKYKLKHIV
17	NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD
18	HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL
19	AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY
20	VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL
21	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQAHGQGLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYVYWGQGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS
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23	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGQGLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYVYWGQGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS
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26	GAGGTCCAGCTGGTGCAATCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACTCCTTCACTGGCTACTACATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATTGGAAGGATTAATCCTTACAATGGTGCTACTAGCTACAACCAGAACTTCAAGGACAGAGTCACCTTGACTGTAGACAAGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACGGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGAGGACTACGTGTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGCTGA
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28	RINPYNGATSYNQNFKDR
29	EDYVY
30	RSSQSLVHSNGNTYLH
31	KVSNRFS
32	SQSTHVPWT
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39	GATGTTGTGATGACCCAATCTCCACTCTCCCTGCCTGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCAGCAGAGACCAGGCCAGTCTCCAAGGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGTTGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTTGGACGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGCATGCAGAAGGGAGACCAGAACCCTCAGATCGCAGCTCACGTCATCTCCGAGGCTTCTTCCAAGACCACCTCCGTGCTCCAGTGGGCTGAAAAGGGATACTACACCATGAGCAACAACCTGGTGACACTGGAGAACGGCAAGCAGCTCACAGTCAAGCGGCAGGGCCTTTACTACATCTATGCCCAGGTGACCTTCTGCTCCAACAGGGAGGCCTCCAGCCAGGCCCCTTTCATTGCCTCTCTGTGTCTCAAGAGCCCAGGCAGATTCGAGAGGATTCTCCTGCGCGCCGCCAATACACACAGCTCAGCCAAACCCTGCGGGCAACAGTCAATTCACCTGGGGGGGGTCTTTGAGTTGCAGCCAGGGGCCAGTGTCTTCGTGAACGTGACAGATCCCAGTCAGGTGAGCCATGGCACTGGCTTTACTAGCTTTGGGTTGCTGAAACTGTGA
40	EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAK
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48	ASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASLEMGARASILSGGELDRWEKIRLRPGGNKQYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSVDTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPVDMGGKWSKRSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAVSRDLEKHGAITSSNTAANNADCAWLEAQEEEEVGFPVRPQVPLRPMTYKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSQKRQDILDLWVYHTQGYFPDWQNYTPGPGIRYPLTFGWCFKLVPVEPEKVEEANEGENNSLLHPMSLHGMDDPEREVLVWKFDSRLAFHHMARELHPEYYKDCEFTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAQFAQQAAADTGHSNQVSQNYPIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGHHHHHH
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108	QIVLTQSPAFMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTK
109	DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL
110	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQAHGQGLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYVYWGQGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASNSPQNEVLYGDVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVSTLPSSKAEKNADVNRDGRVDSSDVTILSRYLIRVIEKLPI
111	NSPQNEVLYGDVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVSTLPSSKAEKNADVNRDGRVDSSDVTILSRYLIRVIEKLPI
112	EKIRLRPGGKKKYKLKHIVASSSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSPASNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDASPTSTPADSSTITPTATPTATPTIKGASHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLASTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPASVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAASAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYAS
113	GATGTTGTGATGACCCAATCTCCACTCTCCCTGCCTGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCAGCAGAGACCAGGCCAGTCTCCAAGGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGTTGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTTGGACGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGCATGCAGAAGGGAGACCAGAACCCTCAGATCGCAGCTCACGTCATCTCCGAGGCTTCTTCCAAGACCACCTCCGTGCTCCAGTGGGCTGAAAAGGGATACTACACCATGAGCAACAACCTGGTGACACTGGAGAACGGCAAGCAGCTCACAGTCAAGCGGCAGGGCCTTTACTACATCTATGCCCAGGTGACCTTCTGCTCCAACAGGGAGGCCTCCAGCCAGGCCCCTTTCATTGCCTCTCTGTGTCTCAAGAGCCCAGGCAGATTCGAGAGGATTCTCCTGCGCGCCGCCAATACACACAGCTCAGCCAAACCCTGCGGGCAACAGTCAATTCACCTGGGGGGGGTCTTTGAGTTGCAGCCAGGGGCCAGTGTCTTCGTGAACGTGACAGATCCCAGTCAGGTGAGCCATGGCACTGGCTTTACTAGCTTTGGGTTGCTGAAACTGTGA
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119	DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIGNLEPEDIATYYCQQFNKLPPTFGGGTK
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128	GAGGTCCAGCTGGTGCAATCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACTCCTTCACTGGCTACTACATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATTGGAAGGATTAATCCTTACAATGGTGCTACTAGCTACAACCAGAACTTCAAGGACAGAGTCACCTTGACTGTAGACAAGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACGGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGAGGACTACGTGTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGCTGA
129	GATGTTGTGATGACCCAATCTCCACTCTCCCTGCCTGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCAGCAGAGACCAGGCCAGTCTCCAAGGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGTTGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTTGGACGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGCTAGCTGA
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167	PTACREKQYLINSQ
168	EFASAEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGTKLEWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQDTFTKVKPSAASGSEPEA
169	GAGTTTGCTTCTGCTGAAGCTGGAATCACAGGCACATGGTATAATCAGCACGGCTCTACCTTTACAGTGACAGCCGGAGCTGATGGAAACCTGACCGGCCAGTATGAGAACAGAGCCCAGGGAACAGGATGTCAGAATAGTCCTTATACACTGACAGGCAGATATAACGGAACAAAGCTGGAGTGGAGAGTGGAGTGGAATAACTCTACAGAGAACTGTCACTCTAGAACAGAGTGGAGAGGCCAGTACCAGGGCGGCGCTGAGGCTAGAATTAACACACAGTGGAACCTGACATACGAGGGAGGCTCTGGACCTGCTACAGAACAGGGCCAGGATACATTCACAAAGGTGAAGCCTTCTGCTGCCTCTGGATCT
170	RLQLQESGPGLLKPSVTLSLTCTVSGDSVASSSYYWGWVRQPPGKGLEWIGTINFSGNMYYSPSLRSRVTMSADMSENSFYLKLDSVTAADTAVYYCAAGHLVMGFGAHWGQGKLVSVSPASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASEFASAEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGTKLEWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQDTFTKVKPSAASGSEPEA
171	ATGGACCTCCTGTGCAAGAACATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCGGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGCCTGCTGAAGCCTTCGGTGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCGGGTGACTCCGTCGCCAGTAGTTCTTATTACTGGGGCTGGGTCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGGACTCGAGTGGATAGGGACTATCAATTTTAGTGGCAATATGTATTATAGTCCGTCCCTCAGGAGTCGAGTGACCATGTCGGCAGACATGTCCGAGAACTCCTTCTATCTGAAATTGGACTCTGTGACCGCAGCAGACACGGCCGTCTATTATTGTGCGGCAGGACACCTCGTTATGGGATTTGGGGCCCACTGGGGACAGGGAAAACTGGTCTCCGTCTCTCCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGCGAGTTTGCTTCTGCTGAAGCTGGAATCACAGGCACATGGTATAATCAGCACGGCTCTACCTTTACAGTGACAGCCGGAGCTGATGGAAACCTGACCGGCCAGTATGAGAACAGAGCCCAGGGAACAGGATGTCAGAATAGTCCTTATACACTGACAGGCAGATATAACGGAACAAAGCTGGAGTGGAGAGTGGAGTGGAATAACTCTACAGAGAACTGTCACTCTAGAACAGAGTGGAGAGGCCAGTACCAGGGCGGCGCTGAGGCTAGAATTAACACACAGTGGAACCTGACATACGAGGGAGGCTCTGGACCTGCTACAGAACAGGGCCAGGATACATTCACAAAGGTGAAGCCTTCTGCTGCCTCTGGATCTGAGCCTGAGGCTTGA

(특정 항체 서열에 대해서는, CDRs이 볼드체로 강조되어 있다)

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SEQUENCE LISTING <110> INSERM (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE) UNIVERSITE PARIS EST CRETEIL VAL DE MARNE BAYLOR RESEARCH INSTITUTE ASSISTANCE PUBLIQUE HOPITAUX DE PARIS <120> RECOMBINANT PROTEINS WITH CD40 ACTIVATING PROPERTIES <130> IP20214043FR <160> 171 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ala His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser Ala Lys Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys 115 120 125 Ser Arg Ser Thr 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accgtctcct cagccaaaac gaagggccca 360 tccgtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg agcacctccg agagcacagc cgccctgggc 420 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 480 accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 540 agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacgaaga cctacacctg caacgtagat 600 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagt ccaaatatgg tcccccatgc 660 ccaccctgcc cagcacctga gttcgaaggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa 720 cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg 780 agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat 840 gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 900 accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 960 ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagagcca 1020 caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1080 tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1140 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1200 tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc 1260 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctctgggt 1320 aaagctagct ga 1332 <210> 25 <211> 666 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant <400> 25 gatgttgtga tgacccaatc tccactctcc ctgcctgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcttgca ggtctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 taccagcaga gaccaggcca gtctccaagg ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgaaga tgttggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttcct 300 tggacgttcg gcggagggac caagctcgag atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta tgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgtgct 660 agctga 666 <210> 26 <211> 1332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant <400> 26 gaggtccagc tggtgcaatc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcttc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata ctccttcact ggctactaca tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gattggaagg attaatcctt acaatggtgc tactagctac 180 aaccagaact tcaaggacag agtcaccttg actgtagaca agtccacgag cacagcctac 240 atggagctca gcagcctgag gtctgaggac acggcagtct attactgtgc aagagaggac 300 tacgtgtact ggggccaagg caccacggtc accgtctcct cagccaaaac gaagggccca 360 tccgtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg agcacctccg agagcacagc cgccctgggc 420 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 480 accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 540 agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacgaaga cctacacctg caacgtagat 600 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagt ccaaatatgg tcccccatgc 660 ccaccctgcc cagcacctga gttcgaaggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa 720 cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg 780 agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat 840 gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 900 accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 960 ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagagcca 1020 caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1080 tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1140 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1200 tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc 1260 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctctgggt 1320 aaagctagct ga 1332 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant <400> 27 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His 1 5 10 <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant <400> 28 Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys 1 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caccacggtc accgtctcct cagccaaaac gaagggccca 360 tccgtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg agcacctccg agagcacagc cgccctgggc 420 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 480 accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 540 agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacgaaga cctacacctg caacgtagat 600 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagt ccaaatatgg tcccccatgc 660 ccaccctgcc cagcacctga gttcgaaggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa 720 cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg 780 agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat 840 gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 900 accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 960 ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagagcca 1020 caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1080 tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1140 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1200 tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc 1260 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctctgggt 1320 aaagctagct ga 1332 <210> 34 <211> 666 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant <400> 34 gatgttgtga tgacccaatc tccactctcc ctgcctgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcttgca ggtctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 taccagcaga gaccaggcca gtctccaagg ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgaaga tgttggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttcct 300 tggacgttcg gcggagggac caagctcgag atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta tgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgtgct 660 agctga 666 <210> 35 <211> 1332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant <400> 35 gaggtccagc tggtgcaatc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcttc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata ctccttcact ggctactaca tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gattggaagg attaatcctt acaatggtgc tactagctac 180 aaccagaact tcaaggacag agtcaccttg actgtagaca agtccacgag cacagcctac 240 atggagctca gcagcctgag gtctgaggac acggcagtct attactgtgc aagagaggac 300 tacgtgtact ggggccaagg caccacggtc accgtctcct cagccaaaac gaagggccca 360 tccgtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg agcacctccg agagcacagc cgccctgggc 420 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 480 accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 540 agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacgaaga cctacacctg caacgtagat 600 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagt ccaaatatgg tcccccatgc 660 ccaccctgcc cagcacctga gttcgaaggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa 720 cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg 780 agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat 840 gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 900 accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 960 ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagagcca 1020 caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1080 tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1140 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1200 tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc 1260 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctctgggt 1320 aaagctagct ga 1332 <210> 36 <211> 666 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant <400> 36 gatgttgtga tgacccaatc tccactctcc ctgcctgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcttgca ggtctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 taccagcaga gaccaggcca gtctccaagg ctcctgatct 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gcggagggac caagctcgag atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta tgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgtgct 660 agctga 666 <210> 43 <211> 2205 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant <400> 43 gaggtccagc tggtgcaatc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggata ctccttcact ggctactaca tgcactgggt gaagcaggcc 120 catggacaag ggcttgagtg gattggaagg attaatcctt acaatggtgc tactagctac 180 aaccagaact tcaaggacag agccaccttg actgtagaca agtccacgag cacagcctac 240 atggagctca gcagcctgag gtctgaggac acggcagtct attactgtgc aagagaggac 300 tacgtgtact ggggccaagg caccacggtc accgtctcct cagccaaaac gaagggccca 360 tccgtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg agcacctccg agagcacagc cgccctgggc 420 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tccagagcag catgaccaag atcctggagc ccttccggaa gcagaacccc 2160 gacatcgtga tctaccagta catggacgac ctgtacgcta gctga 2205 <210> 44 <211> 1200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant <400> 44 gatgttgtga tgacccaatc tccactctcc ctgcctgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcttgca ggtctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 taccagcaga gaccaggcca gtctccaagg ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgaaga tgttggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttcct 300 tggacgttcg gcggagggac caagctcgag atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta tgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgtgct 660 agtcagaccc ccaccaacac catcagcgtg acccccacca acaacagcac ccccaccaac 720 aacagcaacc ccaagcccaa ccccgctagc atgcagaagg gagaccagaa ccctcagatc 780 gcagctcacg tcatctccga ggcttcttcc aagaccacct ccgtgctcca gtgggctgaa 840 aagggatact acaccatgag caacaacctg gtgacactgg agaacggcaa gcagctcaca 900 gtcaagcggc agggccttta ctacatctat gcccaggtga ccttctgctc caacagggag 960 gcctccagcc aggccccttt cattgcctct ctgtgtctca agagcccagg cagattcgag 1020 aggattctcc tgcgcgccgc caatacacac agctcagcca aaccctgcgg gcaacagtca 1080 attcacctgg ggggggtctt tgagttgcag ccaggggcca gtgtcttcgt gaacgtgaca 1140 gatcccagtc aggtgagcca tggcactggc tttactagct ttgggttgct gaaactgtga 1200 <210> 45 <211> 240 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 45 Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn Gln Val Ser Gln 1 5 10 15 Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala 20 25 30 Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys 35 40 45 Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly 50 55 60 Ala Thr Pro Gln Asp 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ggggggacat 240 caagcagcca tgcaaatgtt aaaagagacc atcaatgagg aagctgcaga atgggataga 300 gtgcatccag tgcatgcagg gcctattgca ccaggccaga tgagagaacc aaggggaagt 360 gacatagcag gaactactag tacccttcag gaacaaatag gatggatgac acataatcca 420 cctatcccag taggagaaat ctataaaagg tggataatcc tgggattaaa taaaatagta 480 agaatgtata gccctaccag cattctggac ataagacaag gaccaaagga accctttaga 540 gactatgtag accgattcta taaaactcta agagccgagc aagcttcaca agaggtaaaa 600 aattggatga cagaaacctt gttggtccaa aatgcgaacc cagattgtaa gactatttta 660 aaagcattgg gaccaggagc gacactagaa gaaatgatga cagcatgtca gggagtgggg 720 <210> 50 <211> 618 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 50 atgggaggca aatggagtaa aagaagtgtt gtgggttggc caactgtgag agaaagaatg 60 agaagggctg aaccagccgc tgatggtgta ggtgctgtgt cacgagatct ggaaaaacac 120 ggagcaataa catcctctaa taccgccgca aataacgcag actgtgcctg gctcgaagct 180 caagaagaag aagaagtcgg attccccgtg cgaccccaag ttcccctcag accaatgact 240 tataaaggcg ctctggatct tagccacttt cttaaagaaa aaggaggact ggaaggactt 300 atttattcac aaaaaagaca agacatcctc gatttgtggg tatatcatac tcaaggttat 360 ttcccagact ggcaaaatta tactcctgga cccggcattc gatatcccct tacctttgga 420 tggtgcttta aacttgtccc cgtcgaacct gaaaaagtag aagaagcaaa tgaaggcgaa 480 aataattcac tgctccaccc tatgtcactg cacggaatgg atgaccccga acgcgaagtt 540 ctggtatgga aatttgattc aagacttgct tttcaccaca tggctagaga acttcacccc 600 gaatattata aagactgt 618 <210> 51 <211> 333 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 51 atgggtgcga gagcgtcaat attaagcggt ggcgaattag atagatggga aaaaattcgg 60 ttaaggccag ggggaaacaa acaatataaa ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag 120 ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata 180 ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat 240 acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa aggatagaga taaaagacac caaggaagct 300 ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa agt 333 <210> 52 <211> 1965 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant <400> 52 gctagtcaga cccccaccaa caccatcagc gtgaccccca ccaacaacag cacccccacc 60 aacaacagca accccaagcc caaccccgct agcctcgaga tgggtgcgag agcgtcaata 120 ttaagcggtg gcgaattaga tagatgggaa aaaattcggt taaggccagg gggaaacaaa 180 caatataaat taaaacatat agtatgggca agcagggagc tagaacgatt cgcagttaat 240 cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac tgggacagct acaaccatcc 300 cttcagacag gatcagaaga acttagatca ttatataata cagtagcaac cctctattgt 360 gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt tagacaagat agaggaagag 420 caaaacaaaa gtgtcgatac cgtgaccccc accgccaccg ccacccccag cgccatcgtg 480 accaccatca cccccaccgc caccaccaag cccgtcgaca tgggaggcaa atggagtaaa 540 agaagtgttg tgggttggcc aactgtgaga gaaagaatga gaagggctga accagccgct 600 gatggtgtag gtgctgtgtc acgagatctg gaaaaacacg gagcaataac atcctctaat 660 accgccgcaa ataacgcaga ctgtgcctgg ctcgaagctc aagaagaaga agaagtcgga 720 ttccccgtgc gaccccaagt tcccctcaga ccaatgactt ataaaggcgc tctggatctt 780 agccactttc ttaaagaaaa aggaggactg gaaggactta tttattcaca aaaaagacaa 840 gacatcctcg atttgtgggt atatcatact caaggttatt tcccagactg gcaaaattat 900 actcctggac ccggcattcg atatcccctt acctttggat ggtgctttaa acttgtcccc 960 gtcgaacctg aaaaagtaga agaagcaaat gaaggcgaaa ataattcact gctccaccct 1020 atgtcactgc acggaatgga tgaccccgaa cgcgaagttc tggtatggaa atttgattca 1080 agacttgctt ttcaccacat ggctagagaa cttcaccccg aatattataa agactgtgaa 1140 ttcaccaacg gcagcatcac cgtggccgcc accgccccca ccgtgacccc caccgtgaac 1200 gccaccccca gcgccgccca attcgcacag caagcagcag ctgacacagg acacagcaat 1260 caggtcagcc aaaattaccc tatagtgcag aacatccagg ggcaaatggt acatcaggcc 1320 atatcaccta gaactttaaa tgcatgggta aaagtagtag aagagaaggc tttcagccca 1380 gaagtgatac ccatgttttc agcattatca gaaggagcca ccccacaaga tttaaacacc 1440 atgctaaaca cagtgggggg acatcaagca gccatgcaaa tgttaaaaga gaccatcaat 1500 gaggaagctg cagaatggga tagagtgcat ccagtgcatg cagggcctat tgcaccaggc 1560 cagatgagag aaccaagggg aagtgacata gcaggaacta ctagtaccct tcaggaacaa 1620 ataggatgga tgacacataa tccacctatc ccagtaggag aaatctataa aaggtggata 1680 atcctgggat taaataaaat agtaagaatg tatagcccta ccagcattct ggacataaga 1740 caaggaccaa aggaaccctt tagagactat gtagaccgat tctataaaac tctaagagcc 1800 gagcaagctt cacaagaggt aaaaaattgg atgacagaaa ccttgttggt ccaaaatgcg 1860 aacccagatt gtaagactat tttaaaagca ttgggaccag gagcgacact agaagaaatg 1920 atgacagcat gtcagggagt ggggcatcac catcaccatc actga 1965 <210> 53 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant <400> 53 Thr Val Thr Pro Thr Ala Thr Ala Thr Pro Ser Ala Ile Val Thr Thr 1 5 10 15 Ile Thr Pro Thr Ala Thr Thr Lys Pro 20 25 <210> 54 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant <400> 54 Thr Asn Gly Ser Ile Thr Val Ala Ala Thr Ala Pro Thr Val Thr Pro 1 5 10 15 Thr Val Asn Ala Thr Pro Ser Ala Ala 20 25 <210> 55 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant <400> 55 Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro 1 5 10 15 Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp 20 25 30 Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu 35 40 45 Val Gly Asp Phe Ala Phe Arg 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tgggggaggc ttagtgcagc ccggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcaa cctctggatt cactttcagt gactattaca tgtattgggt tcgccaggcc 120 ccaggcaagg gcctggagtg ggtcgcatac attaattctg gtggtggtag cacctattat 180 ccagacactg taaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga acagcctgag ggccgaggac acagccgtgt attactgtgc aagacggggg 300 ttaccgttcc atgctatgga ctattggggt caaggaaccc tggtcaccgt ctcctcagcc 360 aaa 363 <210> 73 <211> 309 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant <400> 73 gatatccaga tgacacagag cccttcctcc ctgtctgcct ctgtgggaga cagagtcacc 60 atcacctgca gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 ggcaaggccg ttaaactcct gatctattac acatcaattt tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tataccctca ccatcagctc cctgcagcct 240 gaagatttcg ccacttacta ttgtcagcag tttaataagc ttcctccgac gttcggtgga 300 ggcaccaaa 309 <210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant <400> 74 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val Leu His 1 5 10 <210> 75 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tacgagaaac acaaagtcta tgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgtgct 660 agtcagaccc ccaccaacac catcagcgtg acccccacca acaacagcac ccccaccaac 720 aacagcaacc ccaagcccaa ccccgctagc atgcagaagg gagaccagaa ccctcagatc 780 gcagctcacg tcatctccga ggcttcttcc aagaccacct ccgtgctcca gtgggctgaa 840 aagggatact acaccatgag caacaacctg gtgacactgg agaacggcaa gcagctcaca 900 gtcaagcggc agggccttta ctacatctat gcccaggtga ccttctgctc caacagggag 960 gcctccagcc aggccccttt cattgcctct ctgtgtctca agagcccagg cagattcgag 1020 aggattctcc tgcgcgccgc caatacacac agctcagcca aaccctgcgg gcaacagtca 1080 attcacctgg ggggggtctt tgagttgcag ccaggggcca gtgtcttcgt gaacgtgaca 1140 gatcccagtc aggtgagcca tggcactggc tttactagct ttgggttgct gaaactgtga 1200 <210> 114 <211> 1557 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant <400> 114 gaggtccagc tggtgcaatc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggata ctccttcact ggctactaca tgcactgggt gaagcaggcc 120 catggacaag ggcttgagtg gattggaagg attaatcctt acaatggtgc tactagctac 180 aaccagaact tcaaggacag agccaccttg actgtagaca agtccacgag cacagcctac 240 atggagctca gcagcctgag gtctgaggac acggcagtct attactgtgc aagagaggac 300 tacgtgtact ggggccaagg caccacggtc accgtctcct cagccaaaac gaagggccca 360 tccgtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg agcacctccg agagcacagc cgccctgggc 420 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 480 accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 540 agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacgaaga cctacacctg caacgtagat 600 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagt ccaaatatgg tcccccatgc 660 ccaccctgcc cagcacctga gttcgaaggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa 720 cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg 780 agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat 840 gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 900 accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 960 ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagagcca 1020 caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1080 tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1140 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1200 tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc 1260 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctctgggt 1320 aaagctagca attctcctca aaatgaagta ctgtacggag atgtgaatga tgacggaaaa 1380 gtaaactcca ctgacttgac tttgttaaaa agatatgttc ttaaagccgt ctcaactctg 1440 ccttcttcca aagctgaaaa gaacgcagat gtaaatcgtg acggaagagt tgactccagt 1500 gatgtcacaa tactttcaag atatttgata agggtaatcg agaaattacc aatataa 1557 <210> 115 <211> 789 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant <400> 115 gagaagatcc ggctgcggcc cggcggcaag aagaagtaca agctgaagca catcgtggct 60 agtagcagcg tgagccccac caccagcgtg caccccaccc ccaccagcgt gccccccacc 120 cccaccaaga gcagccccgc tagtaacccc cccatccccg tgggcgagat ctacaagcgg 180 tggatcatcc tgggcctgaa 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atacatgaca tcattctcga atgtgtttac tgtaagcagc agttgttgcg aagagaagtg 240 ggagacttcg ctttcagaga cctgtgtatc gtatatcgcg atggcaatcc ttatgccgtc 300 tgcgataaat gcctcaagtt ttactccaag atcagcgagt accggcacta ctgttactct 360 gtgtatggga ctaccctcga acagcagtat aacaagccgc tgtgcgatct ccttatccgg 420 tgcattaact gccagaagcc actgtgtcct gaggctagta tgcacgggga tacccccaca 480 ctccacgaat acatgcttga tttgcaacct gaaacgaccg acctgtacgg ctatggtcag 540 ctgaatgact ccagcgagga agaggatgag attgacggac cggcaggcca ggccgagcca 600 gaccgggctc attataacat cgtgactttc tgctgtaagg ctagtagcag cgtgagcccc 660 accaccagcg tgcaccccac ccccaccagc gtgcccccca cccccaccaa gagcagcccc 720 gctagctga 729 <210> 117 <211> 734 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant <400> 117 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ala His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Thr Ser 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780 aaggacactc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc 840 caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaggt gcataatgcc 900 aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 960 gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc 1020 ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agagccacag 1080 gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1140 ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1200 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1260 agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg 1320 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa 1380 gctagctga 1389 <210> 133 <211> 370 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 133 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp 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tccaagacca cctccgtgct ccagtgggct 1560 gaaaagggat actacaccat gagcaacaac ctggtgacac tggagaacgg caagcagctc 1620 acagtcaagc ggcagggcct ttactacatc tatgcccagg tgaccttctg ctccaacagg 1680 gaggcctcca gccaggcccc tttcattgcc tctctgtgtc tcaagagccc aggcagattc 1740 gagaggattc tcctgcgcgc cgccaataca cacagctcag ccaaaccctg cgggcaacag 1800 tcaattcacc tggggggggt ctttgagttg cagccagggg ccagtgtctt cgtgaacgtg 1860 acagatccca gtcaggtgag ccatggcact ggctttacta gctttgggtt gctgaaactg 1920 tga 1923 <210> 137 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 137 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 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gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1200 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1260 agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg 1320 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa 1380 gctagcatgc agaagggaga ccagaaccct cagatcgcag ctcacgtcat ctccgaggct 1440 tcttccaaga ccacctccgt gctccagtgg gctgaaaagg gatactacac catgagcaac 1500 aacctggtga cactggagaa cggcaagcag ctcacagtca agcggcaggg cctttactac 1560 atctatgccc aggtgacctt ctgctccaac agggaggcct ccagccaggc ccctttcatt 1620 gcctctctgt gtctcaagag cccaggcaga ttcgagagga ttctcctgcg cgccgccaat 1680 acacacagct cagccaaacc ctgcgggcaa cagtcaattc acctgggggg ggtctttgag 1740 ttgcagccag gggccagtgt cttcgtgaac gtgacagatc ccagtcaggt gagccatggc 1800 actggcttta ctagctttgg gttgctgaaa ctgtga 1836 <210> 145 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion Protein <400> 145 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile 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Asn Ser Thr Glu Asn Cys His Ser Arg Thr Glu Trp Arg 65 70 75 80 Gly Gln Tyr Gln Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Asn 85 90 95 Leu Thr Tyr Glu Gly Gly Ser Gly Pro Ala Thr Glu Gln Gly Gln Asp 100 105 110 Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Gly Ser Glu Pro Glu 115 120 125 Ala <210> 169 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 169 gagtttgctt ctgctgaagc tggaatcaca ggcacatggt ataatcagca cggctctacc 60 tttacagtga cagccggagc tgatggaaac ctgaccggcc agtatgagaa cagagcccag 120 ggaacaggat gtcagaatag tccttataca ctgacaggca gatataacgg aacaaagctg 180 gagtggagag tggagtggaa taactctaca gagaactgtc actctagaac agagtggaga 240 ggccagtacc agggcggcgc tgaggctaga attaacacac agtggaacct gacatacgag 300 ggaggctctg gacctgctac agaacagggc caggatacat tcacaaaggt gaagccttct 360 gctgcctctg gatct 375 <210> 170 <211> 607 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 170 Arg Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Val 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Val Ala Ser Ser 20 25 30 Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Thr Ile Asn Phe Ser Gly Asn Met Tyr Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Arg Ser Arg Val Thr Met Ser Ala Asp Met Ser Glu Asn Ser Phe 65 70 75 80 Tyr Leu Lys Leu Asp Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ala Gly His Leu Val Met Gly Phe Gly Ala His Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Lys Leu Val Ser Val Ser Pro Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ala 435 440 445 Ser Gln Thr Pro Thr Asn Thr Ile Ser Val Thr Pro Thr Asn Asn Ser 450 455 460 Thr Pro Thr Asn Asn Ser Asn Pro Lys Pro Asn Pro Ala Ser Glu Phe 465 470 475 480 Ala Ser Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln His Gly 485 490 495 Ser Thr Phe Thr Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Asn Leu Thr Gly Gln 500 505 510 Tyr Glu Asn Arg Ala Gln Gly Thr Gly Cys Gln Asn Ser Pro Tyr Thr 515 520 525 Leu Thr Gly Arg Tyr Asn Gly Thr Lys Leu Glu Trp Arg Val Glu Trp 530 535 540 Asn Asn Ser Thr Glu Asn Cys His Ser Arg Thr Glu Trp Arg Gly Gln 545 550 555 560 Tyr Gln Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Asn Leu Thr 565 570 575 Tyr Glu Gly Gly Ser Gly Pro Ala Thr Glu Gln Gly Gln Asp Thr Phe 580 585 590 Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Gly Ser Glu Pro Glu Ala 595 600 605 <210> 171 <211> 1902 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 171 atggacctcc tgtgcaagaa catgaagcac ctgtggttct tcctcctgct ggtggcggct 60 cccagatggg tcctgtcccg gctgcagctg caggagtcgg gcccaggcct gctgaagcct 120 tcggtgaccc tgtccctcac ctgcactgtc tcgggtgact ccgtcgccag tagttcttat 180 tactggggct gggtccgtca gcccccaggg aagggactcg agtggatagg gactatcaat 240 tttagtggca atatgtatta tagtccgtcc ctcaggagtc gagtgaccat gtcggcagac 300 atgtccgaga actccttcta tctgaaattg gactctgtga ccgcagcaga cacggccgtc 360 tattattgtg cggcaggaca cctcgttatg ggatttgggg cccactgggg acagggaaaa 420 ctggtctccg tctctccagc ttccaccaag ggcccatccg tcttccccct ggcgccctgc 480 tccaggagca cctccgagag cacagccgcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 540 gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 600 gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 660 agcttgggca cgaagaccta cacctgcaac gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg 720 gacaagagag ttgagtccaa atatggtccc ccatgcccac cctgcccagc acctgagttc 780 gaagggggac catcagtctt cctgttcccc ccaaaaccca aggacactct catgatctcc 840 cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag 900 ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960 cagttcaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020 aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccgtcctc catcgagaaa 1080 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gagccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140 caggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc 1200 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaggctaac cgtggacaag 1320 agcaggtggc aggaggggaa tgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380 cactacacac agaagagcct ctccctgtct ctgggtaaag ctagtcagac ccccaccaac 1440 accatcagcg tgacccccac caacaacagc acccccacca acaacagcaa ccccaagccc 1500 aaccccgcta gcgagtttgc ttctgctgaa gctggaatca caggcacatg gtataatcag 1560 cacggctcta cctttacagt gacagccgga gctgatggaa acctgaccgg ccagtatgag 1620 aacagagccc agggaacagg atgtcagaat agtccttata cactgacagg cagatataac 1680 ggaacaaagc tggagtggag agtggagtgg aataactcta cagagaactg tcactctaga 1740 acagagtgga gaggccagta ccagggcggc gctgaggcta gaattaacac acagtggaac 1800 ctgacatacg agggaggctc tggacctgct acagaacagg gccaggatac attcacaaag 1860 gtgaagcctt ctgctgcctc tggatctgag cctgaggctt ga 1902

Claims

적어도 하기의 단백질 도메인(protein domain):
(i) CD40 작용제 항체 또는 이의 항원-결합 단편(αCD40); 및,
(ii) CD40L의 CD40 결합-도메인(CD40L),
을 포함하는, CD40 활성화 단백질.
제1항에 있어서,
상기 CD40 작용제 항체가 사람 CD40에 특이적으로 결합하고 다음 특성 중 적어도 하나 이상을 갖는 CD40 활성화 단백질:
(i) 유동 세포분석법적 분석(flow cytometric analysis)에 의해 시험관 내(in vitro)에서 측정하여, B 세포의 증식을 유도함; 또는
(ii) 수지 세포 활성화 검정을 사용하여 시험관 내에서 측정하여, 사이토킨, 예를 들면, IL-6, IL-12 및/또는 IL-15 사이토킨의 분비를 유도함.
제1항 또는 제2항에 있어서,
CD40L의 상기 결합-도메인이 SEQ ID NO: 14를 포함하는 CD40L의 단편인 CD40 활성화 단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
CD40L의 상기 결합-도메인이 상기 CD40 작용제 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄 또는 중쇄의 C-말단에 융합된 CD40 활성화 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
CD40 작용제 IgG 항체, 바람직하게는 IgG4 또는 돌연변이된 사일런트(silent) IgG 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 CD40 활성화 단백질.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
CD40L과 상기 CD40 작용제 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄 또는 중쇄 사이에 펩타이드 링커, 바람직하게는 SEQ ID NO: 15의 가요성 링커(flexible linker) FlexV1을 추가로 포함하는 활성화 단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD40 작용제 항체가 다음의 항체로부터 선택된 활성화 단백질:
a. SEQ ID NO: 27의 HCDR1, SEQ ID NO: 28의 HCDR2, SEQ ID NO: 29의 HCDR3, SEQ ID NO: 30의 LCDR1, SEQ ID NO: 31의 LCDR2 및 SEQ ID NO: 32의 LCDR3을 포함하는 사람화된 항체;
b. SEQ ID NO: 21 및 SEQ ID NO: 22 각각의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 사람화된 항체;
c. CD40 발현 세포에 대한 결합에 대해 (i) 또는 (ii)에서 확인된 항체 중 적어도 하나와 경쟁하는 항체; 또는,
d. (i) 또는 (ii)에서 확인된 항체 중 하나와 동일한 에피토프(epitope)에 결합하는 항체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 항원이 상기 CD40 작용제 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 또는 경쇄에 융합된 CD40 활성화 단백질.
제8항에 있어서,
하나 이상의 바이러스 또는 암 항원이 CD40 작용제 항체의 중쇄 또는 경쇄에 융합된 CD40 활성화 단백질.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
화학식 αCD40Light-PL-CD40L의 경쇄 및 화학식 αCD40Heavy-(PL-Ag)x의 중쇄를 포함하는 CD40 활성화 단백질로서, 여기서
αCD40Light가 상기 CD40 작용제 항체의 경쇄이고;
αCD40Heavy가 상기 CD40 작용제 항체의 중쇄이고;
PL이 동일하거나 상이한, 결합 또는 펩타이드 링커, 전형적으로 SEQ ID NO: 15의 FlexV1이고;
Ag가 동일하거나 상이한 바이러스 또는 암 항원이고;
x가 1 내지 20, 예를 들면 3, 4, 또는 5의 정수이고;
CD40L이 SEQ ID NO: 14를 포함하는 CD40의 리간드의 결합 도메인이고;
-는 결합인, CD40 활성화 단백질.
제10항에 있어서,
상기 바이러스 항원이 HIV 펩타이드 항원, 바람직하게는 HIV-1 항원, 예를 들면, SEQ ID NO: 48의 GNG 또는 SEQ ID NO: 57의 HIV5pep로부터 선택된 CD40 활성화 단백질.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 CD40 활성화 단백질 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
백신으로서 사용하기 위한 CD40 활성화 단백질.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
대상체에서 T 세포 특이적인 반응, 특히 바이러스 항원에 대해 CD8⁺ T 세포 특이적인 반응을 향상시키는데 사용하기 위한 CD40 활성화 단백질.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
대상체내에서 B 세포 증식을 유발하고/유발하거나, 수지 세포의 사이토킨 증식을 유도하는데 사용하기 위한 CD40 활성화 단백질.