CN101048515B

CN101048515B - 核酸分析方法

Info

Publication number: CN101048515B
Application number: CN2005800373472A
Authority: CN
Inventors: 森安义; 平野刚史
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 2004-08-31
Filing date: 2005-08-19
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2025-08-19
Also published as: WO2006025264A1; JPWO2006025264A1; HK1110629A1; EP1795612A4; CN101048515A; EP1795612B1; EP1795612A1; JP4791966B2; ES2401879T3; US20090226892A1

Abstract

本发明涉及用于核酸分析的完整***，通过它，提取、扩增和检测核酸的步骤都能够在单个固相支持物上进行。具体而言，本发明涉及核酸分析方法，包括向含有用于核酸扩增的试剂的多孔支持物添加含核酸的样本，并连续地进行样本的核酸提取、目标核酸的扩增反应，以及核酸扩增反应或其产物的检测。

Description

核酸分析方法

技术领域

本发明涉及在多孔支持物上使用的核酸扩增方法，此外还涉及使用该方法进行核酸提取、扩增和检测的完整***。

背景技术

近来，对DNA测试的需求正在提高。为了满足这样的需求，亟待开发简单和紧凑的***，借助这种***可以连续地进行从样本提取、扩增核酸并对这种扩增进行检测。

对于酶和血液成分的生物化学分析，已经开发了基于干燥化学(drychemistry)的简单的固相测试***(参见，例如专利文件1)。在这种***中，在基质中以干燥状态提供反应所必需的试剂，从而随着添加的样本的湿气的应用而发生反应，所述湿气充当溶剂。在基于干燥化学的测试***的情况中，仅通过将微量的样本点到固相上就可以容易地测量目标成分。因而，由于这种***具有实际应用价值，已被广泛应用于生物化学领域。

然而，为了将上述干燥化学***应用于核酸测试，需要克服一些障碍。首先，核酸提取、扩增和检测已经通过不同的***方便地进行了。因而，难以将这些***整合到单个***中。特别是，复杂的高温循环对于通过PCR等进行的核酸扩增是必需的。此外，试剂例如模板核酸、酶、底物和引物必需高度自由地加入反应***。因而，总的来说固相反应***不适合于核酸测试。

同时，也有一些涉及下述方法的报道，其中可使核酸吸附到由无纺布、滤纸、羟磷灰石等制成的过滤物上，通过LAMP法扩增(参见专利文件2和3)。根据这种方法使核酸吸附到固相支持物上并向其添加LAMP反应溶液来进行核酸扩增。

LAMP法是由本发明的发明人开发的核酸扩增方法，它不需要PCR所必需的复杂的温度控制。因而，可以以很高的扩增效率合成具有特别的反向重复结构的长链扩增产物(由相同链上间隔地反向的重复组成)(参见，非专利文件1和专利文件4)。本发明的发明人还报道了在亲水性基质上检测核酸扩增的方法，包括使核酸沉淀剂与LAMP扩增产物结合(参见专利文件5)。然而，这种方法的目的是解决关于杂交分析时B/F分离的难题。因此，这种方法不是为了建立一种***，借助这种***能够在固相上连续地进行核酸提取、扩增和检测。

[专利文件1]JP Patent Publication(Kokai)No.5-80049A(1993)

[专利文件2]JP Patent Publication(Kokai)No.2004-201607A

[专利文件3]WO03/6650

[专利文件4]WO00/28082

[专利文件5]日本专利公开(Kokai)No.2004-141159A

[非专利文件1]Tsugunori Notomi et al.，″Loop-mediatedisothermal amplification of DNA，″Nucleic Acids Res.，vol.28，No.12：e63，(2000)

发明内容

在过去的研究中，本发明的发明人已经建立了一种技术，其中在固相上进行样本的核酸提取，使得目标核酸被引入到固相上。本发明人还建立了一种方法，其中将LAMP产物-聚乙烯亚胺(ポリエチレンイミン)(PEI)复合物提供到固相上从而进行序列特异性检测。因而，如果有可能在固相上发生LAMP反应，提取、扩增和检测的所有步骤都可以在固相上进行，由此可以构建用于核酸分析的完整***。

具体而言，本发明的目的是构建用于核酸分析的完整***，由此使提取、扩增和检测核酸的步骤都能够在固相支持物上进行。

本发明的发明人已经证实了通过加热已经施加了微量LAMP反应溶液的一小片滤纸到预定温度，即发生LAMP反应。进一步的，证实了通过将LAMP反应溶液分为几个成分，将这些成分施加到多片滤纸上，将这些纸片相互重叠，即发生LAMP反应。根据这些结果，他们进行了关于完整***的模型实验，所述完整***组合了固相提取方法、固相LAMP反应和固相PEI检测。从而，成功地检测了目标核酸。由此完成了本发明。

具体地，本发明涉及核酸分析方法，包括向多孔支持物添加含核酸的样本，所述多孔支持物预先含有用于核酸扩增的试剂，然后进行目标核酸的扩增。

根据如上所述的方法，有可能在上述多孔支持物上连续地进行自含核酸样本的核酸提取、目标核酸的核酸扩增反应、以及检测核酸扩增反应或其产物。

在这种情况下，在初始阶段，多孔支持物可以进一步含有用于核酸提取的试剂和用于核酸检测的试剂。

在一个实施方案中，本发明的方法是核酸分析方法，包括在由两个或多个层构成的多孔支持物上进行以下步骤：

1)使用含有用于核酸提取的试剂的多孔支持物层提取核酸；

2)使用含有用于核酸扩增的试剂的多孔支持物层进行目标核酸的核酸扩增反应；以及

3)使核酸探针与核酸扩增反应的产物杂交，使核酸沉淀剂作用于已经产生的杂交物以形成凝集物，使用获得的凝集物检测样本中的目标核酸。

根据如上所述的方法，在初始阶段，所述多孔支持物可以含有核酸沉淀剂和/或核酸探针。

根据本发明的方法，所述多孔支持物可以由两个或多个多孔支持物构成，所述多孔支持物在初始阶段含有用于核酸扩增的试剂、用于核酸提取的试剂和/或用于核酸检测的试剂。

在一个实施方案中，用于核酸扩增的试剂可以分别保持在两个或多个多孔支持物内，在进行扩增时，使这些多孔支持物相互接触。例如，引物和其他用于核酸扩增的试剂可以分别保持在不同的多孔支持物中。同样，聚合酶和其他用于核酸扩增的试剂可以分别保持在不同的多孔支持物中。或可选择地将聚合酶、引物和其他用于核酸扩增的试剂分别保持在不同的多孔支持物中。在上述方法中，优选将聚合酶以干燥的状态保持在所述多孔支持物内。

根据本发明的方法，所述核酸扩增反应优选LAMP反应。

根据本发明的方法，可以使用的多孔支持物由选自滤纸、尼龙膜、纤维素酯、纤维素、无纺物、纺织品、棉花、聚氨基甲酸酯和烧结塑料的至少一种材料制成。

此外，可以使用的核酸沉淀剂是选自羟磷灰石、聚乙烯亚胺、硫酸鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸和二乙氨乙基葡聚糖的至少一种。

根据本发明，提供了用于连续进行核酸提取、扩增和检测的核酸分析***，这种***至少包括一个多孔支持物，所述多孔支持物在初始阶段含有用于核酸扩增的试剂、用于核酸提取的试剂和/或用于核酸检测的试剂。

在所述多孔支持物所含有的试剂的实例包括，但不限于：

i)引物或标记的引物；

ii)核酸探针或标记的探针；

iii)核酸沉淀剂；

iv)DNA聚合酶；和

v)用作DNA聚合酶的底物的核苷酸或标记核苷酸。

根据本发明，提供了能够连续进行核酸提取、扩增和检测的固相***。本发明的***可以在临床实践或实验室中实现简单的DNA分析或DNA测试，作为相对于干燥化学的核酸分析的应用实例。

附图的简要说明

附图1显示了滤纸上的LAMP反应的示意图。

附图2显示了滤纸上的LAMP反应的结果(CK20：钙荧光素荧光检测)。

附图3(A)和3(B)显示了滤纸上的LAMP反应的结果(PSA：钙荧光素荧光检测)。附图3(A)显示了滤纸上的钙荧光素荧光的目测检测的结果(1和2：滤纸方法(阴性)；3和4：滤纸方法(阳性)；5：溶液方法(阴性)；和6：溶液方法(阳性))。附图3(B)显示了滤纸上的扩增反应溶液的3％琼脂糖电泳分析的结果(1和2：滤纸方法(阴性)；3和4：滤纸方法(阳性)；5：溶液方法(阴性)；和6：溶液方法(阳性))。

附图4(A)和4(B)显示了基于两片法和Bst滤纸方法的组合、在滤纸上的LAMP反应的结果(PSA钙荧光素荧光检测)。附图4(A)显示了滤纸上的钙荧光素荧光的目测检测的结果(上段：滤纸方法；下段：溶液方法)。在上段和下段中，最左侧的两个条带来自相互重叠的无Bst的滤纸片，最右侧的两个条带来自相互重叠的含有Bst的滤纸片。附图3(B)显示了使用扩增反应溶液的3％琼脂糖电泳的结果(1和2：滤纸方法(阴性)；3和4：滤纸方法(阳性)；5：溶液方法(阴性)；和6：溶液方法(阳性))。

附图5(A)和5(B)显示了基于两片法和引物滤纸方法的组合、在滤纸上的LAMP反应的结果(PSA钙荧光素荧光检测)。附图5(A)显示了滤纸上的钙荧光素荧光的目测检测的结果(上段：滤纸方法；下段：溶液方法)。在上段和下段中，最左侧的两个条带来自相互重叠的无引物的滤纸片(阴性)，最右侧的两个条带来自相互重叠的含有引物的滤纸片(阳性)。附图5(B)显示了使用扩增反应溶液的3％琼脂糖电泳的结果(1和2：滤纸方法(阴性)；3和4：滤纸方法(阳性)；5：溶液方法(阴性)；和6：溶液方法(阳性))。

附图6(A)和6(B)显示了根据三片法在滤纸上的LAMP反应的结果(HCV转录RNA钙荧光素荧光检测)。附图6(A)显示了在滤纸上钙荧光素荧光的目测检测的结果(1和2：三片滤纸方法(阴性)；3和4：三片滤纸方法(阳性)；5：一片滤纸方法(阴性)；6：一片滤纸方法(阳性)；7：溶液方法(阴性)；和8：溶液方法(阳性))。附图6(B)显示了使用扩增反应溶液的3％琼脂糖电泳的分析结果(1和2：三片滤纸方法(阴性)；3和4：三片滤纸方法(阳性)；5：一片滤纸方法(阴性)；6：一片滤纸方法(阳性)；7：溶液方法(阴性)；和8：溶液方法(阳性))。

附图7显示了在滤纸上进行的提取、扩增和检测的结果(1：HBV样本扩增的结果；2：HCV样本扩增的结果；3：阴性对照(不含有HBV目标核酸))。

附图8显示了基于三片滤纸方法、5μl溶液反应和25μl通常规模的反应的HBV样本扩增的结果。在图中，符号“△”(Paper_20)的三条线代表三片滤纸方法的测量结果，符号“○”的三条线代表5μl(5μl_20)溶液反应的测量结果，符号“□”(25μl_20)的三条线代表25μl一般尺度反应的测量结果。并且，没有符号的两条线(对于Paper_N、5μl_N和25μl_N)代表对照的测量结果。

附图9显示了根据使用一片法在滤纸上(PSA)的PCR反应的电泳分析结果(M：100-bp ladder；1：滤纸方法(阴性)；2：模板DNA10⁶拷贝/试管(滤纸方法(阳性))；3：模板DNA 10⁸拷贝/试管(滤纸方法(阳性))；4：溶液方法(阴性)；5：模板DNA 10⁶拷贝/试管(溶液方法(阳性))；和6：模板DNA 10⁸拷贝/试管(溶液方法(阳性))。

本说明书包含作为本申请优先权基础的特愿2004-252767的说明书中所公开的内容。

进行发明的最佳方式

1.术语定义

目标核酸：本说明书中术语“目标核酸”表示待检测的核苷酸序列或核酸分子。

多孔支持物：在本说明书中术语“多孔支持物”表示多孔的亲水性固相支持物。这种支持物由滤纸、尼龙膜、纤维素酯等制成。

样本：在本说明书中术语“样本”包括任何类型的含核酸的样品，例如血液或外周白细胞样品，或从这种样品提取的核酸。

核酸扩增反应：在本说明书中术语“核酸扩增反应”包括PCR法、ICAN法、SDA法、NASBA法或LAMP法等已知的核酸扩增反应。

用于核酸扩增的试剂：在本说明书中术语“用于核酸扩增的试剂”包括核酸扩增反应所必需的任何类型的试剂，并含有DNA聚合酶、核苷酸底物、引物、探针等等。

用于核酸提取的试剂：在本说明书中术语“用于核酸提取的试剂”包括核酸提取所必需的任何类型的试剂。

用于核酸检测的试剂：在本说明书中术语“用于核酸检测的试剂”包括核酸检测所必需的任何类型的试剂，例如发光试剂、荧光试剂、嵌入剂或核酸沉淀剂。

引物：在本说明书中术语“引物”表示与待扩增的目标核酸特异性杂交的寡核苷酸或标记的寡核苷酸。

核酸探针：在本说明书中术语“核酸探针”表示用于目标核酸的序列的检测的、与目标核酸特异性杂交的核酸片段。此外，如下所述，核酸探针可以是肽核酸或锁定核酸。

核酸沉淀剂：在本说明书中术语“核酸沉淀剂”表示吸附到核酸上以形成凝集物的试剂，例如聚乙烯亚胺。

此外，以下和在实施例中将更详细地描述上述各术语的具体实例。

2.在多孔支持物上的核酸提取

在多孔支持物上的核酸提取可以根据以下实施例3中描述的方法来进行。例如，在蛋白变性剂共存的情况下将醇类(例如，乙醇和异丙醇)添加到样本，引起核酸沉淀，从而可以在多孔支持物上进行沉淀。

3.在多孔支持物上的核酸扩增

多孔支持物上提取的核酸直接进行核酸扩增反应。核酸扩增反应可以根据用于核酸扩增的已知方法，例如PCR法、ICAN法、SDA法、NASBA法或LAMP法来进行。

特别地，用于本发明的核酸扩增反应优选的是LAMP反应。LAMP(环-介导的等温扩增)方法是由本发明的发明人开发的核酸扩增方法。根据该方法，DNA或RNA可以在等温条件下(约65℃)以低成本快速扩增，使用两种、四种或六种类型的特异性引物(内部引物对、附带外部引物对的内部引物对，或附带外部引物对和环引物对的内部引物对)、具有链置换活性的聚合酶，和用作底物的核苷酸。LAMP法可参见参考文件：Notomi，T et al.：Nucleic Acids Res.28(12)：e63(2000)；WO00/28082；和Eiken Chemical Co.，Ltd.的网站(http://www.eiken.co.jp/)的详细描述。

根据LAMP法，在扩增产物的相同链上的多个位点，延伸反应和扩增反应同时进行。因而，在等温条件下超指数(superexponentially)实现DNA扩增，从而可以高扩增效率地合成具有特别的反向重复结构(由相同链上间隔地反向的重复组成的结构)的长链扩增产物。

在LAMP法中，使用被称为内部引物、外部引物和环引物的特异性引物。

内部引物是LAMP法所必需的。当从每个模板DNA的链中选择出存在于3′侧的任意序列X2c和存在于相对X2c的5′侧的任意序列X1c时，内部引物从3′侧到5′侧按该顺序包含序列X2(与上述X2c互补)和序列X1c(与上述X1c相同)。(该引物具有X1c+X2的结构。)

术语“外部引物”表示两种引物(分别与双链中的一条互补)，各具有与相对内部引物的外侧(即，模板的3′侧)的任意序列X3c互补的序列，并能够与X3c退火。

通过LAMP法获得的扩增产物的相同链上产生的、相互补的序列相互退火形成环时，在其3’端含有与环内序列互补的碱基的引物称为“环引物”。如上所述的外部引物和环引物不是LAMP法所必需的。然而，借助于这些引物，可以以改善的效率进行扩增反应。

LAMP反应在例如50℃到75℃、优选的55℃到70℃进行1分钟到10小时，优选的5分钟到4小时。在这种温度下，内部引物可以与模板核酸上与之互补的序列结合成稳定的碱基配对，具有链置换活性的聚合酶可以保持酶活性。

此外，LAMP反应优选的在与实现优选的酶反应pH值的缓冲剂、维持酶的催化活性和退火所必需的盐和酶保护剂共存下进行。进一步的，根据需要使用熔解温度(Tm)调节物等等来进行反应。所使用的这种缓冲剂的实例包括具有中性-弱碱性缓冲作用的Tris-HCl。可以根据使用的DNA聚合酶来调节pH值。可以充分地添加用于保持酶活性和调整DNA熔解温度的盐的实例包括KCl、NaCl和(NH₄)₂SO₄。使用的酶保护剂的实例包括牛血清白蛋白和糖类。此外，一般可以使用的熔解温度调节物的实例包括甜菜碱、脯氨酸、二甲基亚砜和甲酰胺。

可以用充分标记的物质来标记内部引物或核苷酸底物。标记的物质的实例包括荧光染料(例如，FITC和ROC)、酶、蛋白质、放射性同位素、化学发光物质(例如，DNP)、生物素和DIG(地高辛)。

4.多孔支持物上的目标核酸检测

根据已知的方法使用标记的核酸探针、荧光试剂等等，可以容易地在多孔支持物上检测扩增的目标核酸。使用核酸探针和核酸沉淀剂的方法是特别优选的，因为籍此可方便地通过目测确认扩增产物。

(1)核酸探针

用于检测的核酸探针是具有与目标核酸的至少一部分互补的序列的寡核苷酸探针。它的链长度一般约5到50个碱基，优选的约10到30个碱基。

特别地，当使用核酸沉淀剂时，特别优选的是这种探针具有相对短的链。核酸沉淀剂具有易于吸附到长链核酸的性质。因此，为了实现良好的B/F分离而防止沉淀剂吸附到释放的探针，一般而言核酸探针具有相对短的链是必需的。然而，不考虑探针长度，通过调节反应条件，例如通过调节核酸沉淀剂反应的温度到接近探针的Tm，可以实现良好的B/F分离。

可以用充足的标记物质来标记如上所述的核酸探针。标记的物质的实例包括荧光染料(例如FITC和ROC)、酶、蛋白质、放射性同位素、化学发光物质(例如，DNP)、生物素和DIG(地高辛)。此外，这种核酸探针可以是肽核酸(Nielsen，P.E.et al.，Science 254，1497-1500(1991))或锁定核酸(WO99/14226和日本专利公开(Kohyo)2002-521310A)。

(2)核酸沉淀剂

用于本发明的核酸沉淀剂没有特别的限制，只要它吸附于核酸以形成凝集物即可。然而，选择性地与长链核酸而不是短链核酸结合的沉淀剂是优选的。具体地，已知的核酸沉淀剂的实例包括表面活性剂、二羟基苯、十二烷基硫酸钠、二异丁基磺基琥珀酸钠、十四烷基硫酸钠、二羟基苯、Sarkosyl、含SO₄、PO₄、Cl或HCOO的碱金属盐和铵盐。根据本发明，其优选的实例是羟磷灰石、聚乙烯亚胺、硫酸鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸和二乙氨乙基葡聚糖(DEAE葡聚糖)。聚乙烯亚胺的特别优选的实例具有约40或更低的聚合度。

根据这种性质来确定所使用的核酸沉淀剂的浓度和数量。例如，对于具有14的聚合度的聚乙烯亚胺来说，优选的浓度是约0.1到2M，优选的数量是每25μl反应溶液约4到200μg。

根据这种沉淀剂的性质来确定适合于核酸沉淀剂的反应溶液的pH值。然而，一般地，pH值优选的是6到10。这是因为当反应溶液的pH值过高时探针不太可能与核酸杂交。另一方面，当反应溶液的pH值过低时核酸质子化引起B/F分离低下。

此外，根据这种沉淀剂的性质还可确定添加核酸沉淀剂时反应溶液的离子强度。然而，一般地，离子强度优选的是0.15mol/l或更低。当离子强度过高时，沉淀剂和核酸之间的静电相互作用被抑制，导致凝集物的不充分形成。

进一步的，添加核酸沉淀剂时的温度优选的约20℃到70℃。并且，该温度可以与核酸扩增时的恒定温度相同。

(3)使用核酸沉淀剂的检测

如上所述的核酸探针和核酸沉淀剂可以添加到经历了扩增的多孔支持物，或它们可以在初始阶段点样到多孔支持物的适当的位点上。当在初始阶段将核酸探针添加到多孔支持物、随后进行扩增反应时，如上所述的扩增步骤和杂交步骤可以几乎同时发生。扩增产物与核酸探针的杂交条件没有特别的限制。然而，一般地，杂交在50℃到70℃进行5分钟。

就固相上的移动性而言，由扩增核酸、核酸探针和核酸沉淀剂构成的凝集物明显不同于释放的核酸。因此，它们可以容易地相互分离。

通过标记核酸探针或扩增产物可以容易地检测凝集物。检测包括定性检测和定量检测。例如，是否存在目标序列等的定性检测可以通过目测凝集物来容易地进行。同时，根据使用商业上可获得的设备，例如“Polarion”荧光平板读取器(TECAN)测量信号强度，可以进行定量检测。

5.核酸分析***

根据本发明，提供了用于连续进行核酸提取、扩增和检测的核酸分析***，其包括至少一个多孔支持物，所述多孔支持物在初始阶段含有用于核酸扩增的试剂、用于核酸提取的试剂和/或用于核酸检测的试剂。

多孔支持物含有的试剂的实例包括，但不特别限于：

i)引物或标记的引物；

ii)核酸探针或标记的核酸探针；

iii)核酸沉淀剂；

iv)DNA聚合酶；和

v)用作DNA聚合酶的底物的核苷酸或标记的核苷酸。

对LAMP扩增而言，期望的是，上述引物进一步含有外部引物和/或环引物或标记的环引物，以及内部引物。

此外，如上所述，核酸沉淀剂优选的是选自由羟磷灰石、聚乙烯亚胺、硫酸鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸和二乙氨乙基葡聚糖的至少一种。

进一步的，本发明的***可以作为试剂盒提供，其包含熔解温度调节物(例如，甜菜碱和三甲胺N-氧化物)、可以获得酶反应的优选条件的缓冲液，和/或根据需要检测合成反应产物所必需的其他试剂。

本发明的***可以以一定方式构建，从而用于核酸扩增的试剂分别保持在两个或多个多孔支持物内，在使用(或扩增)时使它们相互接触。这种***的实例包括，其中引物和其他用于核酸扩增的试剂分别保持在不同的多孔支持物内的***；其中聚合酶和其他用于核酸扩增的试剂分别保持在不同的多孔支持物内的***；和其中聚合酶、引物和其他用于核酸扩增的试剂分别保持在不同的多孔支持物内的***。在这些***中，考虑到维持稳定性，优选聚合酶以干燥状态保持在多孔支持物内。

实施例

以下参考实施例更详细地说明本发明，但本发明的范围不限于此。

除非另作说明，实施例中所用的LAMP反应溶液和测试材料如下：

(1)LAMP反应溶液

[表1]

LAMP反应溶液的基本组分

Tris-HCl(pH 8.8) 20mM

KCl 10mM

(NH₄)₂SO₄ 10mM

MgSO₄ 8mM

Tween20 0.1％

Betain 0.8M[0.6M]

dNTPs 5.6mM[7.6mM]

内部引物 3.2μM

外部引物 0.8μM

环引物(LOOP引物) 1.6μM

Bst聚合酶 8U/试管

BSA 2％

(酶混合物1μl/试管)

：针对HCV扩增***

()：针对CK20或HCV扩增***

(2)目标核酸、引物和标记探针

a)PSA(PSA cDNA GenBank ID：M26663(克隆到pBR322中))

FIP TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG(SEQ ID NO：1)

RIP TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG(SEQ ID NO：2)

F3TGCTTGTGGCCTCTCGTG(SEQ ID NO：3)

R3GGGTGTGTGAAGCTGTG(SEQ ID NO：4)

b)CK20(GenBank ID：BC031559)

FIP：CAATTTGCAGGACACACCGAGATTGAAGAGCTGCGAAGTC(SEQID NO：5)

BIP：CTGCTGAGGACTTCAGACTGACTTGGAGATCAGCTTCCAC(SEQID NO：6)

F3：CGA CTACAGTGCATATTACAGAC(SEQ ID NO：7)

B3：GTAGGGTTAGGTCATCAAAGAC(SEQ ID NO：8)

LpF：GCAGTTGAGCATCCTTAATAATCT(SEQ ID NO：9)

LpB：GACTGAGAGAGGAATACGTC(SEQ ID NO：10)

c)HCV样本(“Nisseki”原生质体的封装样本(Akita)：ABC No.62：约2300KlU/ml；1.15×10⁴拷贝/μl)

FIP：GGTTKATCCAAGAAAGGACCCAGTCGCCATAGTGGTCTGCGGA(SEQ ID NO：11)

BIP：CCGCAAGACTGCTAGCCGAGGCAAGCACCCTATCAGGC(SEQ IDNO：12)

F3：GGCGTTAGTATGAGTGTCGTAC(SEQ ID NO：13)

B3：CATGGTGCACGGTCTACG(SEQ ID NO：14)

Loop R：TTGGGTTGCGAAAGG(SEQ ID NO：15)

d)HBV样本“Nisseki”原生质体的封装样本No.79：63100拷贝/ml)

FIP：GATAAAACGCCGCAGACACATCCTTCCAACCTCTTGTCCTCCAA(SEQ ID NO：16)

BIP：CCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTTGACAAACGGGCAACATACCTT(SEQ ID NO：17)

F3：CAAAATTCGCAGTCCCCAAC(SEQ ID NO：18)

B3：GGTGGTTGATGTTCCTGGA(SEQ ID NO：19)

Loop R：GTTGGTTCTTCTGGACTACC(SEQ ID NO：20)

标记的HBV探针(3’ROX-标记)：CAGCGATAGCCAGGACAAAG(SEQID NO：21)

(3)滤纸

对于滤纸材料，使用切成边长3mm的正方形或直径4mm的圆形的定性滤纸No.1(由ToyoRoshi Kaisha，Ltd.生产)(以下称为“滤纸片”)。

[实施例1]将滤纸加入LAMP反应溶液的实验

首先，根据以下方法在使用CK20的***中检查在LAMP反应期间添加滤纸(纤维素)的影响。

1.实验方法

将50μl LAMP反应溶液(表1)添加到0.2-ml PCR管中。将预先编号的滤纸片加入其中。CK20用作目标核酸。使用热循环仪在63℃加热60分钟进行LAMP扩增。使用ABI-7700(Applied Biosystems)测量钙荧光素(FAM Dye layer)以确认是否存在扩增。

2.实验结果

附图2显示了结果。如附图2所示，甚至在添加20片滤纸之后，仍确认发生了扩增反应。因为每个滤纸片(3-mm正方形)能够保持多达3μl的液体，20片滤纸能够保持不低于50μl液体。也就是说，已经确认了不仅当添加滤纸到反应溶液时(过量的反应溶液)并且当向滤纸提供反应溶液时(过量的滤纸)，均发生LAMP反应。

[实施例2]滤纸上的LAMP反应

1.实验方法

添加0到20片滤纸(3-mm正方形)来进行反应。通过使用热循环仪将PCR管加热到规定温度来进行LAMP反应。通过向其添加钙荧光素(Dojindo Laboratories)以检测荧光(ABI-7700(使用FAM Dyelayer)，Applied Biosystems)来确认是否存在扩增。然后，将10μlLoading Dye(6×)(Promega生产)添加到这些滤纸片。使这些滤纸片保持5分钟，然后进行3％琼脂糖电泳。从而，确认目标核酸的LAMP扩增。根据如下所述的不同的方法进行滤纸上的LAMP反应。

1.1一片法

将含有表1所列所有成分的3μl LAMP反应溶液提供于单片滤纸，接下来进行LAMP反应。

1.2两片法

在引物、酶、底物和镁离子存在于单一溶液中的情况下，长期的保存可能引起引物二聚体化等非特异性反应。故将引物或酶以及剩余的试剂在不同的滤纸上展开，必要时将其相互重叠，使用PSA***检查是否可发生LAMP反应。

(1)引物滤纸方法

将仅不含引物的3μl LAMP反应溶液(RM：1.67倍浓度)和2μl 2.5倍浓缩的引物溶液提供于独立的滤纸片。通过使这些滤纸片互相重叠进行LAMP反应。此外，调节每种成分的浓度以使得当两个滤纸片相互重叠时达到5μl的总液体体积状态下的预定浓度。

(2)Bst滤纸方法

仅不含Bst的LAMP反应溶液(RM：1.67倍浓度)(3μl)和4倍稀释的Bst(或酶混合物)贮存液(2μl)提供给独立的滤纸片。通过互相重叠这些片来进行LAMP反应。此外，调节每种成分的浓度以使得当两个片相互重叠时达到5μl的总液体体积状态下的预定浓度。

1.3三片法

为了组合滤纸反应方法和滤纸提取法，必须在带有目标核酸的滤纸上进行LAMP反应。这意味着包括3片滤纸(含有目标核酸的滤纸、RM滤纸和Bst滤纸(或酶混合物滤纸))的滤纸反应是必需的。因此，在使用HCV的***中根据以下方法实施了三片法。

将不含Bst和目标核酸的3μl LAMP反应溶液(RM：1.67倍浓度)、1μl 2倍稀释的Bst溶液(或酶混合物)和1μl任意浓度的目标核酸溶液单独地提供给3片滤纸。纸片相互重叠从而进行LAMP反应。此外，以一定方式调节每种成分的浓度使得当三个片相互重叠时达到5μl的总液体体积状态下的预定的浓度。

2.实验结果和论述

2.1一片法

附图3显示了使用PSA(6×10^-20M)作为目标核酸于65℃下在滤纸上进行60分钟的LAMP反应的结果。如附图3所示，仅在含有目标核酸时观察到钙荧光素荧光。因而，确认了LAMP扩增。此外，根据3％琼脂糖电泳分析，获得了给定大小的阶梯图谱。因而，确认了有可能在滤纸上进行LAMP反应。

2.2两片法

附图4显示了根据引物滤纸方法使用PSA(6×10^-20M)作为目标核酸于65℃下进行60分钟的LAMP反应的结果。此外，附图5显示了根据Bst滤纸方法使用PSA(6×10^-20M)作为目标核酸于65℃下进行60分钟的LAMP反应的结果。

根据附图4和5，甚至在将引物和酶提供于不同的滤纸片的情况下，仍确认了通过相互重叠滤纸片发生了给定的LAMP反应。也就是说，以及确认了引物和Bst小于滤纸的孔洞，因而它们可以自由地在滤纸片之间迁移。

这个实验的目的是确认物质(引物或酶)在两片滤纸之间迁移的可能性。因而，阴性对照的反应条件是缺乏引物或酶而不缺乏目标核酸。(两片之一被称为水点(water spot)滤纸。)

已知Bst可以在滤纸上稳定地配制。因而，认为可以根据Bst滤纸方法配制LAMP试剂。同时，通过将引物提供给独立的滤纸片，RM滤纸可以对任何***方便地标准化。因此，这个例子可以应用于同时检测多个物品或目标。

2.3三片法

附图6显示了根据三片法使用HCV转录RNA(6×10^-18M)作为目标核酸于63℃下进行60分钟的LAMP反应的结果。同样，根据三片法，确认了给定水平的LAMP扩增。因此，确认了有可能构建一种***，其中带有已经通过滤纸提取的目标核酸的滤纸与其上已经配制了LAMP试剂的两个独立的滤纸片重叠。

发明人已经确认了当使用滤纸实施核酸提取方法时，目标核酸穿过滤纸而不承载于滤纸上，其中实施过滤操作时不利用异丙醇的的作用。这揭示了用异丙醇沉淀(或聚集)的目标核酸的大小大于滤纸的孔洞大小；然而，溶解的目标核酸的大小小于滤纸的孔洞大小。此外，已经揭示了在溶解的目标核酸和滤纸(纤维素)之间不存在吸附之类的特异性相互作用。从而，据估计，溶解的目标核酸可以在一定程度上在滤纸片之间自由地迁移，从而在三个重叠的滤纸片中含有的溶液一同作为含目标核酸的给定LAMP反应溶液(即，一片法中使用的相同的溶液)起作用。

[实施例3]使用滤纸的完整***的模型实验

根据以下方案进行了使用滤纸的完整***的模型实验。

1.实验方法

(1)使用的样本是已经用磷酸盐缓冲液稀释1000倍的HCV样本(″Nisseki″原生质体的封装样本(Akita)；ABC No.；约2300KlU/ml；1.15×104拷贝/μl)的溶液，或用正常血浆(No.39)10倍稀释的HBV样本(″Nisseki″原生质体No.79的封装样本；63100拷贝/ml)的溶液。将100μl样本与300μl裂解缓冲液(含68％硫氰酸胍、3％DTT和10mM Tris(pH 8.0))混合，将混合物放置10分钟。然后，向其中添加400μl的100％异丙醇，然后使用注射器过滤通过一片滤纸(直径：4mm；No.1)。

(2)使用注射器使500μl 70％乙醇通过携带目标核酸的滤纸进行洗涤。

(3)将滤纸放置5分钟除去其上的乙醇。

(4)选择获得的滤纸作为目标核酸滤纸，它与RM滤纸或Bst(或酶混合物)滤纸重叠。使它们相互重叠并放入PCR管中，以63℃加热1小时。

(5)将经历了上述反应的滤纸与一片点了1.2μl含0.75M KCl、0.25M单体浓度的聚乙烯亚胺(PEI：聚合度14)溶液的滤纸重叠。然后放置1分钟。向这些滤纸添加含100nM ROX标记的HBV探针的溶液(100μl)，使探针与LAMP产物-PEI复合物的杂交。随后将展开了LAMP产物-PEI复合物的滤纸在荧光发光器(302nm)上目测观察。此外，在探针检测时HCV扩增产物用作阴性对照(不相关的LAMP产物)。进一步的，不含目标核酸的HBV扩增***用作LAMP反应时的阴性对照。

2.实验结果和讨论

使用滤纸上提取的HBV作为目标核酸，依次连续地进行了基于三片法的扩增反应和PEI检测(附图7)。结果，使用实际的HBV样本在滤纸上成功地进行了一系列遗传测试(包括序列特异性检测)。具体地，扩增的HBV样本的样品(附图7-1)专有地展现了ROX的红色荧光。在不相关的LAMP产物(HCV样本：FT 7-2)和阴性对照(附图7-3)的情况下，观察到来自滤纸的轻微的荧光。

基于上述结果，已经揭示了有可能在滤纸等多孔固体载体上诱导与在液相中诱导的LAMP反应的一样的LAMP反应。此外，还确认了，将反应***的不同成分施加于不同的滤纸片，然后将它们彼此重叠也可以产生LAMP反应。这表明，有可能在滤纸上连续地进行提取、扩增和检测的所有步骤。如果这些步骤可以组合到单个装置上，这种方法可以应用到用于核酸检测(分析)的简单和便宜的完整***。

根据这项研究，已经确认的是，使用包含滤纸作为基础载体的完整***，可以避免试剂的微量混合，装置中的溶液递送***可以用简单的载体移动***来替换，可以使试剂稳定。

[实施例4]三片法的敏感性

1.实验方法

为了评估三片法的敏感性，通过以下基于实施例1到3的三种方法进行HBV样本(20拷贝/试管)的扩增和检测。

(1)三片滤纸方法：5μl(RM 3μl+1/2Bst 1μl+模板1μl)

(2)溶液反应：5μl(RM 3μl+1/2Bst 1μl+模板1μl)

(3)通常规模的反应：25μl

使用“FluoDia T70”荧光平板读取器(Ex：486nm和Em：530nm，Otsuka Electronics Co.，Ltd)对样品(3个试管)进行检测。此外，充当对照的不含样本的样品(2试管)按类似方式进行扩增和检测。

2.实验结果和讨论

附图8显示了结果。从而，对于溶液反应来说，在3个试管中的2个观察到扩增。因此，认为在实施例4的条件下敏感性的限度是20拷贝/试管。同时，根据三片滤纸方法，在3个试管中的3个观察到扩增。因此，已经确认的是，本发明的滤纸的敏感性相等于或高于溶液方法的敏感性。

[实施例5]滤纸上的PCR反应

根据实施例2的一片法，使用PSA(6×10^-20M)作为目标核酸，分别向每个滤纸片添加3μl的PCR反应溶液进行PCR反应。(扩增区具有178bp的大小。)根据表2中给出的PCR反应溶液成分，使用PSA LAMP引物的外部引物(SEQ ID NO：3和4)作为PCR引物，根据TAKARA LA Taq标准方法，进行35个95℃30秒、58℃30秒和70℃30秒的循环来实施PCR反应。

[表2]

PCR反应溶液成分

引物各0.5μM

LA Taq 2.5U

10×LA PCR缓冲液II 1μl

25mM MgCl₂ 2.5mM

2.5mM每种dNTP 各0.4mM

Betain 0.5M

BSA 0.9％

总计 10μl

用10×加样染料(loading dye)充满经历了反应的三片滤纸，随后电泳。确认了扩增。为了比较，在类似的PCR条件下进行标准的溶液PCR。溶液PCR在10μl的范围进行。所有的PCR产物进行电泳。

如附图9中所示，同样对于在滤纸上进行的PCR来说，确认了相应于扩增区域的大小的条带，其与溶液PCR的情况一样。因此，已经确认了与使用PCR的方法以及LAMP方法一样，可以在滤纸上进行核酸扩增。

在此引用的所有出版物、专利和专利申请均作为参考并入本申请的说明书。

工业实用性

本发明涉及用于连续进行核酸提取、扩增和检测的简单的核酸检测装置。这种装置能够在临床实践或实验室中用于简单的DNA分析或DNA测试。

序列表的自由文本

SEQ ID NO：1-人工序列的描述：用于PSA的FIP引物

SEQ ID NO：2-人工序列的描述：用于PSA的RIP引物

SEQ ID NO：3-人工序列的描述：用于PSA的F3引物

SEQ ID NO：4-人工序列的描述：用于PSA的R3引物

SEQ ID NO：5-人工序列的描述：用于CK20的FIP引物

SEQ ID NO：6-人工序列的描述：用于CK20的RIP引物

SEQ ID NO：7-人工序列的描述：用于CK20的F3引物

SEQ ID NO：8-人工序列的描述：用于CK20的R3引物

SEQ ID NO：9-人工序列的描述：用于CK20的LpF引物

SEQ ID NO：10-人工序列的描述：用于CK20的LpR引物

SEQ ID NO：11-人工序列的描述：用于HCV的FIP引物

SEQ ID NO：12-人工序列的描述：用于HCV的RIP引物

SEQ ID NO：13-人工序列的描述：用于HCV的F3引物

SEQ ID NO：14-人工序列的描述：用于HCV的R3引物

SEQ ID NO：15-人工序列的描述：用于HCV的环引物

SEQ ID NO：16-人工序列的描述：用于HBV的FIP引物

SEQ ID NO：17-人工序列的描述：用于HBV的RIP引物

SEQ ID NO：18-人工序列的描述：用于HBV的F3引物

SEQ ID NO：19-人工序列的描述：用于HBV的R3引物

SEQ ID NO：20-人工序列的描述：用于HBV的环引物

SEQ ID NO：21-人工序列的描述：用于HBV的探针

Claims

1.一种核酸分析方法，包括向含有用于核酸扩增的试剂的多孔支持物添加含核酸的样本，使目标核酸进行LAMP反应，其中所述用于核酸扩增的试剂分别保持在两个或以上的多孔支持物内，在扩增时，使所述多孔支持物相互接触。

2.根据权利要求1的核酸分析方法，包括在所述多孔支持物上连续地进行从样本提取核酸、目标核酸的扩增反应，以及对核酸扩增反应或其产物的检测。

3.一种核酸分析方法，包括在有两个或以上的层构成的多孔支持物上进行以下步骤：

1)利用含有用于核酸提取的试剂的多孔支持物层提取核酸；

2)利用含有用于核酸扩增的试剂的多孔支持物层进行目标核酸的核酸扩增反应；以及

3)使核酸探针与核酸扩增反应的产物杂交，使核酸沉淀剂作用于产生的杂交物以形成凝集物，利用获得的凝集物检测样本中的目标核酸。

4.根据权利要求3的核酸分析方法，其中所述多孔支持物含有核酸沉淀剂和/或核酸探针。

5.根据权利要求1到4的任一项的核酸分析方法，其中所述多孔支持物由含有用于核酸扩增的试剂的两个或以上的多孔支持物构成。

6.根据权利要求5的核酸分析方法，其中引物和其他用于核酸扩增的试剂分别保持在不同的多孔支持物内。

7.根据权利要求5的核酸分析方法，其中聚合酶和其他用于核酸扩增的试剂分别保持在不同的多孔支持物内。

8.根据权利要求5的核酸分析方法，其中聚合酶、引物和其他用于核酸扩增的试剂分别保持在不同的多孔支持物内。

9.根据权利要求5的核酸分析方法，其中干燥状态的聚合酶保持在所述多孔支持物内。

10.根据权利要求6的核酸分析方法，其中干燥状态的聚合酶保持在所述多孔支持物内。

11.根据权利要求7的核酸分析方法，其中干燥状态的聚合酶保持在所述多孔支持物内。

12.根据权利要求8的核酸分析方法，其中干燥状态的聚合酶保持在所述多孔支持物内。

13.根据权利要求1的核酸分析方法，其中所述多孔支持物由选自滤纸、尼龙膜、纤维素酯、纤维素、无纺布、织物、棉花、聚氨基甲酸酯和烧结塑料的至少一种材料制成。

14.根据权利要求4的核酸分析方法，其中所述核酸沉淀剂是选自羟基磷灰石、聚乙烯亚胺、硫酸鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸和二乙氨乙基葡聚糖的至少一个成员。

15.一种用于连续进行核酸提取、扩增和检测的核酸分析产品，其中所述用于核酸扩增的试剂分别保持在两个或以上的多孔支持物内，在扩增时，使所述多孔支持物相互接触。