JP2015536651A - インサイチュハイブリダイゼーションを行うための方法およびキット - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2012年10月31日に出願された米国仮特許出願第61/720,665号の利益を主張する。上記出願の全教示は、参照により本明細書中に援用される。
本願は、本明細書と同時に提出された以下のASCIIテキストファイル:
a) ファイル名:43731005002SEQLIST.txt;2013年9月27日に作成、3KBのサイズ
に含まれる配列表を、参照により援用する。
インサイチュハイブリダイゼーション法は、医学的状態、特に癌の患者のスクリーニングおよび試験に広く使用されている。成功裡のインサイチュハイブリダイゼーション法は、部分的に、適切で、かつ正確に計量された濃度のハイブリダイゼーションプローブの使用に依存する。ハイブリダイゼーションプローブを不正確に高いまたは低い濃度で使用する場合、患者の誤診などの不正確な結果が頻繁に起こる。
一態様において、本発明は、固相表面上の生物学的試料中に標的核酸が存在するかどうかを決定する方法を提供する。この態様において、該方法は、a)固相表面上の試料を、乾燥繊維状マトリックスと接触させる工程、ここで、標的核酸を検出するための標識された核酸プローブは、該マトリックスに埋め込まれるかまたは吸着され、該標識された核酸プローブは、標的核酸中の1つ以上の異なるヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む;b)該マトリックスを水和して、該マトリックスからプローブを放出させる工程;c)該試料と該プローブを、試料中に存在する場合に標的核酸へのプローブの特異的なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分なストリンジェントな条件下でインキュベートする工程;d)該試料を洗浄して、ハイブリダイズしないプローブおよび非特異的にハイブリダイズしたプローブを除去する工程;ならびにe)標識された核酸プローブが該試料にハイブリダイズしたかどうかを決定することにより、標的核酸が該試料中に存在するかどうかを決定する工程を含む。
定義
そうではないと定義されない限り、本明細書中で使用される全ての科学技術的な用語は、本発明が属する分野の通常の技術を有する者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
一態様において、本発明は、固相表面上の生物学的試料中に標的核酸が存在するかどうかを決定する方法を提供する。この態様において、該方法は、a)固相表面上の試料と、乾燥繊維状マトリックスを接触させる工程、ここで、標的核酸を検出するための標識された核酸プローブが、該マトリックスに埋め込まれるかまたは吸着され、該標識された核酸プローブが、標的核酸中の1つ以上の異なるヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む;b)該マトリックスを水和して、該マトリックスからプローブを放出する工程;c)該試料とプローブを、試料中に存在する場合、標的核酸へのプローブの特異的なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分なストリンジェントな条件下でインキュベートする工程;d)試料を洗浄して、ハイブリダイズしないプローブおよび非特異的にハイブリダイズしたプローブを除去する工程;ならびにe)該標識された核酸プローブが該試料にハイブリダイズしたかどうかを決定することにより、該試料中に標的核酸が存在するかどうかを決定する工程を含む。
特定の態様において、本発明は、スライド上に固定された細胞の試料中の染色体を数える方法に関する。好ましくは、細胞は、上皮細胞(例えば、尿路上皮細胞、末梢血細胞)、***細胞、卵母細胞、極体、割球、未分化胚芽細胞またはそれらの組み合わせである。一態様において、該細胞は、顕微鏡スライドガラスに固定される。
別の態様において、本発明は、試料中の標的核酸を検出するためのキットに関する。該キットは、標的核酸を検出するための標識された核酸プローブを含む乾燥繊維状マトリックス、および該マトリックスからプローブを放出するための水和バッファを含む。標識された核酸プローブは、該マトリックスに埋め込まれるかまたは吸着され、標的核酸中の1つ以上のヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。
材料および方法
繊維状マトリックス上にプローブを含む組成物の調製
1/2インチ穴あけパンチを使用して、定性1(セルロース)およびGF/A(ガラス繊維)Whatmanフィルターディスクを切断した。第3、第6、第7および第20染色体に特異的な未希釈オリゴヌクレオチドプローブの混合物を、6〜9μLの体積で、それぞれの型のディスクの中心に沈積した。オーブン中でディスクを30分間、60℃で加熱した。ディスクを、光から離して室温で保存した。
末梢血由来の細胞遺伝学的スライドを、等温変性溶液(Cellay, Inc., Cambridge, MA)を使用して、室温で10分間変性させ、その後、85%および100%のアルコールでそれぞれ1分間脱水し、風乾した。プローブが埋めこまれた濾紙のディスクを上述のように調製して、それぞれのスライドの所望のハイブリダイゼーション領域中の細胞上においた。埋め込まれたプローブなしで、ハイブリダイゼーション溶液(10%デキストラン、30%ホルムアミド、2xSSC)中、カバーガラス下、37℃、または20%デキストラン、30%ホルムアミド、6.0mM NaOHのハイブリダイゼーションバッファ中で水和した濾紙ディスク上に埋め込まれたプローブあり、室温のいずれかでハイブリダイゼーションを行った。室温法について、水に希釈した適切な体積のハイブリダイゼーションバッファを、Pasteurピペットを使用して、それぞれの濾紙ディスクの先端に添加した。次いで、スライドを、37℃、10分の加熱、または室温、10分の静置のいずれかに供した。ハイブリダイゼーション後、スライドを室温で5分間、撹拌しながら2xSSC中で洗浄して、ディスクを取り出し、次いで等温洗浄溶液(Cellay, Inc., Cambridge, MA)中、室温ハイブリダイゼーションで5分間洗浄し、ハイブリダイズしないプローブおよび非特異的にハイブリダイズしたプローブを除去した。スライドを、2xSSC中で簡単にすすぎ、乾燥後、アンチフェード試薬、DAPIおよびカバーガラスで封入した。封入したスライドを少なくとも10分間スライドホルダーに入れ、その後分析した。
それぞれの蛍光(fluor)についての信号対雑音比を測定した後、信号対雑音比を平均化して、95%信頼での平均の標準誤差を、以下のように計算した:
上述の手順を使用して、濾紙ディスクに埋め込まれた染色体特異的プローブのパネルを、ヒト末梢血細胞中の染色体特異的標的核酸の検出のために、インサイチュハイブリダイゼーション法において成功裡に使用した(図1Aおよび1B)。ハイブリダイゼーションを、埋め込まれたプローブなし、高温(37℃)または濾紙ディスク上に埋め込まれたプローブを使用して室温のいずれかで行った場合、これらの方法は同様の結果を生じた(図2; 高温(青色、対照) 対 室温(緑色、ディスク)の比較)。
Claims (35)
- 標的核酸が、固相表面上の生物学的試料中に存在するかどうかを決定する方法であって、該方法は、
a) 固相表面上の該試料と、乾燥繊維状マトリックスを接触させる工程、ここで、標的核酸を検出するための標識された核酸プローブが、該マトリックスに埋め込まれるか、または吸着され、該標識された核酸プローブが、該標的核酸中の1つ以上の異なるヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む;
b) 該マトリックスを水和して、該マトリックスから該プローブを放出させる工程;
c) 該試料と該プローブを、標的核酸が試料中に存在する場合、該標的核酸へのプローブの特異的なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分なストリンジェントな条件下でインキュベートする工程;
d) 該試料を洗浄して、ハイブリダイズしないプローブおよび非特異的にハイブリダイズしたプローブを除去する工程;ならびに
e) 該標識された核酸プローブが該試料にハイブリダイズしたかどうかを決定することにより、該標的核酸が試料中に存在するかどうかを決定する工程
を含む、方法。 - 該繊維状マトリックスが、ガラス繊維、羊毛繊維、合成繊維または植物繊維を含む、請求項1記載の方法。
- 該繊維状マトリックスが、セルロース系物質を含む、請求項1または2記載の方法。
- 該セルロース系物質が、セルロース、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロース、レーヨンおよびビスコースからなる群より選択される、請求項3記載の方法。
- サケ***DNA、ブロッキング試薬および抗菌剤またはそれらの組み合わせからなる群より選択される1つ以上のさらなる試薬が、該マトリックスに埋め込まれるかまたは吸着される、請求項1〜4いずれか記載の方法。
- 工程b)において該マトリックスを水和するために、約30%のホルムアミド、約10%〜約20%の硫酸デキストランおよび2XSSCを含む水性ハイブリダイゼーションバッファが、該マトリックスに添加される、請求項1〜5いずれか記載の方法。
- 該標識された核酸プローブが、DNAオリゴヌクレオチドプローブである、請求項1〜6いずれか記載の方法。
- 該DNAオリゴヌクレオチドプローブが、約20〜約50ヌクレオチドの長さを有する、請求項7記載の方法。
- 該DNAオリゴヌクレオチドプローブが、約30ヌクレオチドの長さを有する、請求項8記載の方法。
- 該DNAオリゴヌクレオチドプローブが、合成により生成される、請求項7、8または9記載の方法。
- 該標識された核酸プローブが、少なくとも1つの直接標識を含む、請求項1〜10いずれか記載の方法。
- 該直接標識が蛍光体(fluor)である、請求項11記載の方法。
- 該生物学的試料が、該固相支持体に結合されるかまたは固定される、請求項1〜12いずれか記載の方法。
- 該生物学的試料が表皮細胞を含む、請求項1〜13いずれか記載の方法。
- 該表皮細胞が、尿路上皮(urothelial)細胞および末梢血細胞またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項14記載の方法。
- 該生物学的試料が、***細胞、卵母細胞、極体、割球および未分化胚芽細胞またはそれらの組み合わせからなる群より選択される細胞を含む、請求項1〜13いずれか記載の方法。
- 該方法の工程c)が、約19℃〜約25℃の範囲の温度で行われる、請求項1〜5および7〜16のいずれか一項記載の方法。
- 工程b)においてマトリックスを水和するために、約1.0〜5.0mMのNaOHを含み、約10〜約13の範囲のpHを有するハイブリダイゼーションバッファが、該マトリックスに添加される、請求項17記載の方法。
- 該生物学的試料が、スライドガラス上に固定される、請求項1〜18いずれか記載の方法。
- スライド上に固定された細胞の試料中の染色体を数える方法であって、該方法が、
a) 該スライド上の試料と、ガラス繊維を含む乾燥繊維状マトリックスを重ねる工程、ここで、該試料中の1つ以上の標的染色体配列を検出するための蛍光標識された合成DNAオリゴヌクレオチドプローブが、該マトリックスに埋め込まれるかまたは吸着され、該プローブが、1つ以上の標的染色体配列中のヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む;
b) 該マトリックスをハイブリダイゼーションバッファで水和して、該マトリックスから該プローブを放出させる工程;
c) 該試料と該プローブを、標的染色体配列が試料中に存在する場合、該標的染色体配列へのプローブの特異的なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分なストリンジェントな条件下でインキュベートする工程;
d) 該試料を洗浄して、ハイブリダイズしなかったプローブおよび非特異的にハイブリダイズしたプローブを除去する工程;ならびに
e) 該試料中の標的染色体配列にハイブリダイズした標識された核酸プローブを検出することにより、該試料中の標的染色体配列を有する染色体を数える工程
を含む、方法。 - 該ストリンジェントな条件が、約19℃〜約25℃の範囲の温度で、該試料と該プローブをインキュベートすることを含む、請求項20記載の方法。
- サケ***DNA、ブロッキング試薬および抗菌剤またはそれらの組み合わせからなる群より選択される1つ以上のさらなる試薬が、該マトリックスに埋め込まれるかまたは吸着される、請求項20または21記載の方法。
- 該DNAオリゴヌクレオチドプローブが、約30ヌクレオチドの長さを有する、請求項20〜22いずれか記載の方法。
- 該試料中の細胞が、上皮細胞、***細胞、卵母細胞、極体、割球もしくは未分化胚芽細胞またはそれらの組み合わせである、請求項20〜23いずれか記載の方法。
- 試料中の標的核酸を検出するためのキットであって、該キットが
a) 該標的核酸を検出するための標識された核酸プローブを含む乾燥繊維状マトリックス、ここで、該標識された核酸プローブが該マトリックスに埋め込まれるかまたは吸着され、該標識された核酸プローブが、該標的核酸中の1つ以上のヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む;
b) 該マトリックスから該プローブを放出させるための水和バッファ
を含む、キット。 - 該繊維状マトリックスが、ガラス繊維、羊毛繊維、合成繊維または植物繊維を含む、請求項25記載のキット。
- 該繊維状マトリックスが、セルロース系物質を含む、請求項25または26記載のキット。
- 該セルロース系物質が、セルロース、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロース、レーヨンおよびビスコースからなる群より選択される、請求項25記載のキット。
- サケ***DNA、ブロッキング試薬および抗菌剤またはそれらの組み合わせからなる群より選択される1つ以上のさらなる試薬が、該マトリックスに埋め込まれるかまたは吸着される(sorbed)、請求項25〜28いずれか記載のキット。
- 該水和バッファが、約30%のホルムアミド、約10%〜約20%の硫酸デキストランおよび2XSSCを含む、請求項25〜29いずれか記載のキット。
- 該水和バッファが、約1.0〜5.0mMのNaOHを含み、約10〜約13の範囲のpHを有する、請求項25〜29いずれか記載の方法。
- 該標識された核酸プローブが、合成DNAオリゴヌクレオチドプローブである、請求項25〜31いずれか記載のキット。
- 該DNAオリゴヌクレオチドプローブが、約20〜約50ヌクレオチドの長さを有する、請求項32記載のキット。
- 該DNAオリゴヌクレオチドプローブが、約30ヌクレオチドの長さを有する、請求項33記載のキット。
- 該標識された核酸プローブが、少なくとも1つの蛍光標識を含む、請求項25〜34いずれか記載のキット。
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