DE102010038330A1

DE102010038330A1 - Verfahren, Vorrichtung und Testkit für Molekularbiologische Reaktionen

Info

Publication number: DE102010038330A1
Application number: DE102010038330A
Authority: DE
Inventors: wird später genannt werden Erfinder
Original assignee: AJ Innuscreen GmbH
Current assignee: AJ Innuscreen GmbH
Priority date: 2010-07-23
Filing date: 2010-07-23
Publication date: 2012-03-01
Also published as: US20130280695A1; EP2596129A1; WO2012010708A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung, ein Verfahren und ein Testkit zur Durchführung molekularbiologischer Reaktionen, wobei sich die verschiedenen Komponenten für die molekularbiologische Reaktionen vor dem Reaktionsstart auf einem festen Träger in unterschiedlichen, räumlich getrennten, Kompartimenten befinden. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Träger um eine poröse Filterscheibe aus Polyethylen. Anwendungsgebiete sind die Amplifikation von Nukleinsäuren, z. B. PCR oder RealTime-PCR, die reverse Transkription von RNA in DNA Enzym-Substrat-, Antigen-Antikörper Wechselwirkungen oder die Proteinsynthese.

Description

Gegenstand der Erfindung sind Reagenzienkomponenten für die Durchführung molekulargenetischer Untersuchungen, insbesondere unter Feldbedingungen. Diese Reagenzienformulierungen sind auch bei Umgebungstemperatur lagerstabil. Mögliche Anwendungsgebiete sind die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die reverse Transkription (RT) Enzym-Substrat-, Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen, und die Proteinsynthese.
Stand der Technik
Die Untersuchung diagnostisch relevanter biologischer Proben wie Serum, Plasma, Blut, Urin, Tupferproben oder Organabriebe zum Nachweis infektiöser Erreger hat in den letzten Jahren enorm an Bedeutung gewonnen. Virusinfektionen wie HIV, HCV oder HBV sind weltweit auf dem Vormarsch. Darüber hinaus sind auch bakterielle Infektionen weltweit verstärkt vertreten, u. a. auch als Ergebnis beginnender klimatischer Veränderungen. Das Auftreten neuer, z. T. tödlich verlaufender Krankheiten mit einem extrem hohen Infektionspotential (Schweres Akutes Atemwegssyndrom (SARS), Vogelgrippe) zeigt immer deutlicher, dass in Zukunft eine schnelle und vor Ort durchführbare Diagnostik entscheidend für die Verhinderung von Epidemien sein wird. Darüber hinaus spielen einfach handhabbare, zuverlässige und zugleich relativ preiswerte diagnostische Systeme vor allem für Entwicklungsländer eine bedeutende Rolle bei der Bekämpfung der Ausbreitung von Infektionskrankheiten. Die derzeitig vor allem für die Detektion viraler Infektionskrankheiten (HIV, HCV, HBV, Dengue, u. a. m.) eingesetzten Tests basieren mehrheitlich auf einer invasiven Probennahme und auf die Durchführung von Real-Time-PCR's. Diese Tests sind an extrem teure gerätetechnische Voraussetzungen und Reagenzien gebunden. Die Durchführung dieser Methode kann nur durch geschultes Fachpersonal in Speziallaboratorien erfolgen.
Ein weiterer Schwerpunkt betrifft die Durchführung von diagnostischen Tests in Bezug auf die Früherkennung von bioterroristischen Anschlägen (Pocken, Pest, Anthrax). In diesem Kontext ist es extrem wichtig, mobile Detektionssysteme einsetzten zu können. Einige wenige mobile Detektionssysteme sind mittlerweile verfügbar. Allerdings sind deren Applikationsfelder zurzeit noch sehr begrenzt. Diese Systeme basieren dabei prinzipiell auf der Umsetzung klassischer diagnostischer Verfahren, welche unter Laborbedingungen standardisiert eingesetzt werden. Nach Isolierung der Nukleinsäuren erfolgen eine spezifische Amplifizierungsreaktion und ein spezifischer Nachweis der PCR-Produkte.
Problematisch für den Einsatz der klassischen labordiagnostischen Nachweisverfahren unter Feldbedingungen ist dabei aber, dass unter Feldbedingungen keine Kühlkapazitäten verfügbar sind und dass die umfangreichen Schritte der Pipettierung von Reaktionsansätzen (z. B. für eine PCR) ebenfalls unter Feldbedingungen nicht durchführbar sind. Diese Reaktionen sind in der Regel nur vom Fachpersonal durchzuführen.
Der Erfindung lag deshalb unter anderem die Aufgabe zugrunde, alle für molekulardiagnostische Detektionsverfahren benötigten kritischen Reagenzienkomponenten in einer Form zur Verfügung zu stellen, die:

1. eine sehr einfache Handhabung der Herstellung von Reaktionsansätzen erlauben und
2. auch ohne Kühlung und unter Umgebungstemperaturbedingungen einsetzbar sind.

Für molekulargenetische Nachweisverfahren ist eine Reihe von unterschiedlichsten Komponenten erforderlich. Dabei handelt es sich z. B. um Amplifizierungspuffer, Salze, Enzyme, dNTPs, Nukleinsäuren etc. Um die Reproduzierbarkeit und Funktionalität der Nachweisreaktion gewährleisten zu können, müssen sämtliche Komponenten für die Nachweisreaktion, einschließlich der Biomoleküle, möglichst über einen längeren Zeitraum stabil vorliegen. Eine Zusammenstellung mehrerer Lösungen (Kitkomponenten) ist nur so lange haltbar wie seine empfindlichste Komponente. Bei dieser kritischen Komponente handelt es sich häufig um Biokatalysatoren oder Proteine, die entsprechend der Anwendung in nativer und/oder aktiver Form vorliegen müssen. Hochproblemtisch sind auch Nukleotide (dNTPs), die oftmals einen einsatzlimitierenden Faktor darstellen, da sie sehr schnell inaktiv werden.
Um eine längere Haltbarkeit solcher Biomoleküle zu gewährleisten, werden diese häufig gekühlt verschickt und bei ≤ 4°C gelagert. Dabei führt häufiges Einfrieren und Auftauen zum Aktivitätsverlust bzw. zur Zerstörung des Biomoleküls. Ursache dafür ist die Ausbildung von Eiskristallen im Lösungsmittel, welche die Proteine spalten können. Um die Bildung von Eiskristallen zu verhindern, werden häufig 50% des wässrigen Lösungsmittels durch Glyzerin ersetzt. Dies kann jedoch nur dann zugegeben werden, wenn die Aktivität der Biomoleküle nicht beeinflusst wird und Glyzerin die nachfolgenden Anwendungen nicht stört oder hemmt. Alternativ zu Glyzerin können auch Polydextrose, Mannitol oder Sorbit als Feuchthaltemittel eingesetzt werden, da sie Wasser funktionell ersetzen. Diese Art der Stabilisierung ist ebenfalls häufig an eine Kühlungsmöglichkeit gebunden, so dass der Abbau des Biomoleküls über einen längeren Zeitraum nicht ausgeschlossen werden kann. Eine erfolgreiche Lagerung von Enzym (vorzugsweise eine Taq HOT Start Polymerase), Primer, Sonde, dNTPs und eine interne Positivkontrolle ist in der US Patentanmeldung US 02005 006 98 98 A1 beschrieben. Hier wurden die entsprechenden Chemikalien zusammen mit HEPES auf ein Kügelchen mit Mannitol aufgebracht, welches für die PCR in Wasser gelöst und anschließend eingesetzt wird. Ein ähnliches Prinzip findet sich auch in der Natur: Aufgrund einer hohen Konzentration nichtreduzierender Zucker gelingt es einigen Organismen (Mikroorganismen, Pflanzen, Tiere), eine fast vollständige Dehydration (Anhydrobiose) zu überstehen und nach der Rehydration den normalen Stoffwechsel fortzusetzen (Teramoto N, Sachinvala ND, Shibata M. Trehalose and trehalose-based polymers for environmentally benign, biocompatible and bioactive materials. Molecules. 2008 Aug 21; 13(8):1773-816). Bei dem Zucker handelt es sich in der Regel um Trehalose, einem Zweifachzucker aus zwei Molekülen Glukose, welcher umgangssprachlich als natürliches Frostschutzmittel” bezeichnet wird. Es wird angenommen, dass Trehalose Wassermoleküle funktionell substituiert und so die molekulare Integrität des Biomoleküls erhält. Ein entsprechendes Patent ( US Patent 4891319 ) beschreibt den Schutz von Proteinen und anderen biologischen Molekülen durch Zugabe von Trehalose zu einer wässrigen Lösung. Eine erfolgreiche Stabilisierung unter Erhalt der Aktivität der Komponenten ist so beispielsweise über 6 Monate bei 40°C für Blutgerinnungsfaktoren gelungen ( US Patent 7501493 ) sowie für andere Moleküle (Paz-Alfaro KJ, Ruiz-Granados YG, Uribe-Carvajal S, Sampedro JG. Trehalose-mediated thermal stabilization of glucose oxidase from Aspergillus niger. J Biotechnol. 2009 May 20;141(3-4):130-6. Epub 2009 Mar 25 und Morana A, Stiuso P, Colonna G, Lamberti M, Carteni M, De Rosa M. Stabilization of S-adenosyl-L-methionine promoted by trehalose. Biochim Biophys Acta. 2002 Nov 14;1573(2):105-8). Entsprechend erfolgreich konnten auch Primer und Nukleinsäuren in Trehalose stabil gelagert werden, wie im Patent DE 10 2006 056 790 B3 beschrieben. Nachteil einer Lagerstabilisierung mit Zuckern ist, dass eine geringe Anwesenheit von Wasser bzw. ein unvollständiges Trocknen der Reagenzien die Gefahr einer Kontamination mit Bakterien oder Pilzen birgt.
Eine weitere Möglichkeit einer längeren Lagerstabilität bietet der generelle Entzug von Wasser. So können Biomoleküle gefriergetrocknet und vor Gebrauch wieder rehydriert werden. Allerdings müssen auch hier die getrockneten Biomoleküle kühl gelagert werden. In diesem Zusammenhangen seien auch die 2,6 nm großen, lyophilisierten Partikel der Firma Cepheid (Sunnyvale, CA) erwähnt. Hier werden dNTPs, Polymerase, Magnesiumchlorid und Puffer in einem Partikel kombiniert und können nach Zugabe von Wasser und Primern für weitere Applikationen (PCR) verwendet werden. Cepheid greift dafür auf ein von ABAXIS Inc. entwickeltes Verfahren der Gefriertrocknung zurück, der sogenannten „Orbos Technology” (http://www.abaxis.com/about_us/history.html). Nachteil der Methode des Eintrocknens ist der recht hohe Geräteaufwand für eine Gefriertrocknung.
Darüber hinaus wäre es sinnvoll, auch Primer und Sonden mit eintrocknen zu können. Dies ist jedoch in dieser Form nicht möglich, da das Mischen von Primer und Sonde zu Primer-Dimeren und anderen Artefakten führen würde, wodurch eine einwandfreie anschließende PCR nicht mehr gewährleistet werden kann. Darüber hinaus würde dies bei einer Reihe von Amplifizierungsreaktionen und insbesondere Reaktionen, welche eine Amplifizierungsreaktion mit einer Sondenhybridisierung koppeln, zu falsch-positiven Ergebnissen führen. Die Dimerbildung stellt daher bei der Stabilisierung von PCR-Ansätzen ein wesentliches Problem dar, da mehrere einzelne Reaktionsgefäße notwendig wären um den optimalen Reaktionsablauf gewährleisten zu können. Eine solche Lösung ist allerdings für Feldversuche unhandlich, birgt eine Verwechslungs- und Kontaminationsgefahr und erschwert die Handhabbarkeit des gesamten Systems. Prinzipiell nachteilig ist auch, dass diese Gemische auf Grund der Beimischung von Lagerstabilisatoren stark hygroskopisch (wasseranziehend) wirken, sodass die Aktivität und Lagerstabilität der Komponenten rasch bei unsachgemäßer Lagerung abnimmt. Um dem entgegenzuwirken, kann das eingetrocknete Gemisch mit einer Paraffinschicht überzogen. Durch Zugabe einer wässrigen Lösung und durch Erwärmung schmilzt die Paraffinschicht, die getrockneten Substanzen lösen sich auf und sind für die PCR-Methode zugänglich. Diese Methode wird im EU Patent DE 10 2004 021 822 B3 offenbart. Hier werden die für die PCR notwendigen Reagenzien direkt an der Kavität eingetrocknet, wo auch die PCR Reaktion stattfindet.
Weitere lagerstabile bzw. präformulierte Reaktionsmixturen sind kommerziell von der Firma GE Healthcare verfügbar. Bei der Produktlinie „Ready-to-go” handelt es sich um teilweise stabilisierte Komponenten für die PCR. So sind auf kleinen Kügelchen Taq-Polymerase, dNTPs und Amplifikationspuffer aufgebracht. Diese Kügelchen sind bei Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum stabil. Der Nachteil dieser Methode ist, dass Primer und Sonde frisch vom Kunden zugegeben werden müssen, was diese Methode ungeeignet macht für die Anwendung außerhalb eines Labors. Dieser Nachteil wird bei einer von Klatser et al. (Klatser PR, Sjoukje Kuijper, van Ingen CW, Kolk AHJ. Stabilized, Freeze-dried PCR Mix for detection of Mycobacteria. J Clin Microb, 1998 Jun 36(6):1798-1800 1998) entwickelten Methode ausgeglichen. Hierbei werden Primer, Puffer, dNTPs, Uracil-DNA-Glykosylase und Polymerase mit 5% Trehalose gefriergetrocknet. Wurden die Ansätze bei 4 oder 20°C gelagert, waren sie bis zu einem Jahr nach der Trocknung noch aktiv. Eine Lagerung bei 37°C verkürzte die Lagerzeit auf 3 Monate bzw. bei 56°C auf 1 Woche. Die Autoren verwendeten 2 verschieden Polymerasen. Dabei stellte sich heraus, die ein höherer Gehalt an Glycerol die Lagerstabilität negativ beeinflusst, da Glycerol hygroskopisch wirkt. Nachteilig hierbei ist aber, dass Trehalose eine Reihe von Amplifizierungsreaktionen und insbesondere Reaktionen, welche eine Amplifizierungsreaktion mit einer Sondenhybridisierung koppeln, inhibiert. Damit ist ein solches Mittel in keiner Weise universell einsetzbar. Ein ähnliches Verfahren wurde auch im Patent DE 10 2006 056 790 B3 offengelegt. Hier wurden sämtliche Komponenten in einem geeigneten Gefäß eingetrocknet und kurz vor der PCR mit Wasser in Lösung gebracht. Auch hier wurde das eingetrocknete Gemisch durch einen Kohlenwasserstoffwachs zur besseren Lagerstabilität überzogen. Diese Methode wurde auch durch Wolff et al. für eine nested PCR in einem Reaktionsgefäß beschrieben (Wolff C, Hörnschemeyer D, Wolff D, Kleesiek K. Single-tube nested PCR with room-temperature-stable reagents. PCR Methods Appl. 1995 4:376-379). Laut der Patentschrift DE 60 2004 002 48/5 T2 kann die durch Trehalose vermittelte Stabilisierung der Reagenzien noch erhöht werden, indem wie in diesem Fall Prionex zugegeben wurde, ein Polypeptid aus porcinem Hautkollagen. Hier betrug die Stabilität der Reagenzien statt 30 Tage bei 37°C vier Mal solange nach Zugabe des Polypeptids als mit Trehalose allein.
Ein weiteres Verfahren zur Stabilisierung von Biomolekülen besteht darin, diese an einen Formträger zu binden. Über eine Kopplungsreaktion mit einer Aminogruppe bindet das Biomolekül stabil und dauerhaft an das Trägermaterial und kann so für Nachweisreaktionen genutzt werden. Diese Methode ist patentiert und offengelegt (European Patent Application EP 0511559 ). Eine abgewandelte, ebenfalls patentierte Methode zur stabilen Immobilisierung von Antikörpern ( U.S. Patent 4,948,836 ) und Oligonukleotiden (Deutsches Patent DE 10053553 C2 ) ist ebenfalls beschrieben. Die Trocknung erfolgt teilweise nach Inkubation in einer Protein-Zuckerlösung. Dieses Verfahren ist sehr umständlich und zeitaufwendig und kann in dieser Form nicht für eine Mischung verschiedener Substanzen, wie sie für eine PCR notwendig sind, realisiert werden.
Die für ein molekulargenetisches Nachweisverfahren (beispielsweise PCR oder reverse Transkription) notwendigen Komponenten sind Nukleotidtriphosphate (dNTPs), Primer, ggf. Sonde, Puffer und ein Enzym (Taq oder Reverse Transkriptase), wobei letzteres die Reaktion katalysiert. Eine der kritischen Komponenten für die Lagerstabilität der einzelnen Lösungen sind die dNTPs, die bei einem physiologischen pH-Wert (pH 7,0 bis 7,5) zu entsprechenden Diphosphaten und Monophosphaten zerfallen. So nimmt unter physiologischen Bedingungen der Gehalt an funktionellen dNTPs nach 10 Tagen bei 37°C bereits um 2–3% ab. Um diesem entgegenzuwirken, können die dNTPs bei Anwesenheit eines entsprechenden Stabilisators gelagert werden. Insbesondere die Stabilität von Adenosintriphosphat konnte unter Anwesenheit von EDTA (pH 8,3 bis 9,2), Guanidin/Aminoguanidin (pH 9,0 bis 10,0) oder Glyzerol/Hydrogenphosphat (pH 3,7) als Stabilisatoren bestätigt werden (JP 64/003444/DERWENT 66-11664F, JP71/038270/DERWENT 71-722169 bzw. JP71/033592/DERWENDT 71-631879, FR4078/DERWNDT 66-22085F). Eine stabile Langzeitlagerung ohne die Notwendigkeit eines Stabilisators wird im Patent EP 0941370 B1 offengelegt. Hier wird die Stabilität der dNTPs bei einem pH-Wert zwischen 8,0 bis 10,0 beschrieben, wobei der Wert sowohl durch Zugabe von Basen, als auch durch Zugabe von Puffern (Tris-Puffer, Natriumcarbonat-Puffer, Phosphatpuffer) eingestellt werden kann.
Die Analyse des Standes der Technik zeigt damit eindrucksvoll, dass es eine Vielzahl von Offenbarungen gibt, welche sich mit der Stabilisierung von Reaktionskomponenten für molekulargenetische Nachweisverfahren beschäftigen. Dabei handelt es sich aber immer um Lösungsansätze, welche keine universelle Anwendung der eigentlichen Nachweisreaktion garantieren können oder nicht den gesamten erforderlichen Reaktionsmix stabilisieren können.
Aufgabe der Erfindung
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die im Stand der Technik genanten Nachteile zu beseitigen.
Lösung der Aufgabe
Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst. Erfindungsgemäß wurde mit der vorliegenden Erfindung ein molekulardiagnostisches Detektionsverfahren bereitgestellt, dass alle benötigten kritischen Reagenzienkomponenten in einer Form enthält, welche:

1. eine sehr einfache Handhabung eines molekulargenetischen Nachweisverfahrens erlaubt und
2. auch ohne Kühlung unter Umgebungstemperaturbedingungen universell einsetzbar sind.

Insbesondere die räumliche Trennung der Komponenten, die bei der Amplifizierung bzw. reversen Transkription beteiligt sind, ist bei keiner der bisher offenbarten Lösung berücksichtigt worden. Das erfindungsgemäße Mittel berücksichtigt aber gerade die räumliche Trennung der Komponenten, welche für die Reaktionen benötigt werden und ermöglicht so einen Schutz der beteiligten Komponenten voneinander. Diese Herangehensweise macht so einen unerwünschten Start von nichtspezifischen Reaktionen (z. B. Bildung von Primerdimären, unspezifische Amplifizierung bei den suboptimalen Bedingungen etc.) unmöglich.
Die Erfindung wird nachfolgend beschrieben:
Für eine PCR-basierte Amplifizierungsreaktion (Standard PCR oder Real-Time PCR) benötige Polymerase, Primer oder Primer und Sonden werden auf eine poröse Filterscheibe (z. B. aus Polyethylen) verbracht. Die Verwendung eines solchen Materials zeigt überraschenderweise eine Reihe von Vorteilen. Es ist möglich die Komponenten als Einzelkomponente an destingten Orten auf der Filterscheibe zu positionieren und damit kompartimentiert zu lagern. Damit kommen die zu kombinierenden Komponenten nicht in Kontakt zueinander. Dies hat den Vorteil, dass eine unerwünschte Reaktion der Komponenten untereinander vermieden werden kann. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass durch das Eindringen der Komponenten in die Poren der Filterscheibe ein viel besser Schutz gegenüber schädigenden Umwelteinflüssen besteht, was sich günstig auf eine Lagerung bei Umgebungstemperatur ohne Aktivitätsverlust auswirkt. Nach Verbringung aller jeweils benötigten Komponenten auf die poröse Filterscheibe werden die Komponenten eingetrocknet (z. B. Inkubation bei 37°C für 1 h) oder aber auch lyophilisiert. Nachfolgend wird die Filterscheibe trocken gelagert. Das Freisetzen der verbrachten Reaktionskomponenten erfolgt dadurch, dass man der Filterscheibe eine wässrige Lösung zuführt, welche alle weiteren für die Amplifizierungsreaktion/Detektionsreaktion benötigten Reaktionskomponenten in der jeweils optimalen Konzentration enthält (dNTPs, Amplifikationspuffer, Magnesium und ggf. weitere Additive). Diese wässrige Lösung kann vorab als Mastermix vorbereitet werden und kann auch schon die zu untersuchende Nukleinsäure enthalten. Vorzugsweise wird der wässrigen Lösung ein Detergenz (z. B. ein Octylphenolethoxylate oder Polysorbat) zugegeben. Dieses Detergenz verbessert die Freisetzung der auf der Filterscheibe befindlichen Komponenten. Nach kurzer Inkubation wird der Ansatz in ein PCR-Reaktionsgefäß überführt und die Reaktion durchgeführt.
Neben der Verbringung einer Polymerase, Primern bzw. Primern und Sonde kann auf die Filterscheibe zusätzlich auch die benötigte Menge an dNTPs kompartimentiert und damit räumlich getrennt von den anderen Reaktionskomponenten verbracht werden. Die Herstellung der lagerstabilen Filterscheibe und die Lagerung erfolgt wie beschrieben. Das Freisetzen der verbrachten Reaktionskomponenten erfolgt wiederum dadurch, dass man der Filterscheibe eine wässrige Lösung zuführt, welche alle weiteren für die Amplifizierungsreaktion/Detektionsreaktion benötigten Reaktionskomponenten in der jeweils optimalen Konzentration enthalten. Diese wässrige Lösung kann vorab vorbereitet werden und kann auch schon die zu untersuchende Nukleinsäure enthalten. Vorteilhaft bei dieser Ausführungsform ist, dass auch die dNTPs lagerstabil auf der Filterscheibe verbracht wurden. Damit muss diese Komponente der wässrigen Lösung zur Freisetzung der Reaktionskomponenten nicht mehr enthalten sein. Das erleichtert die Durchführung einer Nachweisreaktion, z. B. unter Feldbedingungen zusätzlich, da die wässrige Lösung nur noch Amplifikationspuffer, Magnesium und ggf. weitere Additive, vorzugsweise das schon aufgeführte Detergenz, enthält. Eine solche Lösung ist auch unter Umgebungstemperatur problemlos lagerbar. In Kombination mit der lagerstabilen Filterscheibe steht damit ein Mittel zur Verfügung, was den Zielstellungen der Erfindung in idealster Weise gerecht wird.
Das erfindungsgemäße Mittel kann aber auch für die Durchführung einer reversen Transkriptasereaktion zur Untersuchung einer Ziel-RNA eingesetzt werden. Dazu werden auf die Filterscheibe kompartimentiert die Reverse Transkriptase, dNTPs, der konzentrierte Puffer und für die Reaktion benötigte Primer (z. B. Random Primer) verbracht. Die Ablösung der Komponenten erfolgt dann wieder mit einer wässrigen Lösung, welche alle anderen benötigten Reaktionskomponenten enthält (umzuschreibende RNA; ggf. ein Detergenz und RNA-stabilisierende Reagenzien). Neben der Stabilisierung der Reagenzien hat diese Methode noch einen weiteren Vorteil: Die Menge der eingesetzten RNA kann dadurch beträchtlich erhöht werden, da die notwendigen Komponenten nicht als wässrige Lösung zugegeben sondern direkt in der umzuschreibenden RNA gelöst werden. Dies erhöht die Sensitivität der Testmethode.
Im Fall einer sog. One-Step PCR (cDNA Synthese und PCR im gleichen Reaktionsgefäß) werden auf der Filterscheibe der Reaktionspuffer, der Enzymmix, die dNTPs und die für die Reaktion benötigten Primer und Sonde kompartimentiert verbracht und stabilisiert. Das Ablösen der Komponenten erfolgt wie auch im Fall einer Two-Steg PCR (cDNA Synthese und PCR in verschiedenen Reaktionsgefäßen) mit einer wässrigen Lösung, welche die zu untersuchende RNA enthält.
Darüber hinaus kann die Kompartimentierung und lagerstabile Immobilisierung einzelnen Reaktionskomponenten bei unterschiedlichen Gemischen und enzymkatalysierten Reaktionen eingesetzt werden. Sie ist immer dann ideal, wenn die benötigten Reaktionspartner vor einer Reaktion nicht miteinander in Wechselwirkung treten dürfen.
Das Verbringen von unterschiedlichen Reaktionskomponenten, die für eine Reaktion benötigt werden, in räumlich voneinander getrennter Anordnung kann auch ohne poröses Material auf räumlich getrennten Arealen eines Gefäßes erfolgen. Wie auch im Fall der Filterscheibe werden die einzelnen Komponenten durch Herauswaschen mit einer wässrigen Lösung unmittelbar vor dem Anfang der Reaktion zusammengebracht. Eine kleine Einschränkung besteht dabei darin, dass die erfindungsgemäße Filterscheibe einen größeren Schutz gegenüber exogener Faktoren bietet (z. B. Sauerstoff, Feuchtigkeit, Licht).
Definitionen
Unter dem Begriff ”molekularbiologische Reaktionen” (im folgenden „Reaktion” genannt) versteht man eine Zusammenwirkung von biologischen Molekülen. „Biologische Moleküle” umfassen jedwede Substanzen und Verbindungen im wesentlichen biologischen Ursprungs, die über Eigenschaften verfügen, welche im Rahmen wissenschaftlicher, diagnostischer und/oder pharmazeutischer Anwendungen relevant sind.
Umfasst sind nicht nur native Moleküle, wie sie aus natürlichen Quellen isoliert werden können, sondern auch davon abgeleitete Formen, Fragmente und Derivate, sowie rekombinante Formen und artifizielle Moleküle, sofern sie mindestens eine Eigenschaft der nativen Moleküle aufweisen.
Darunter fallen die Amplifizierung, Detektion oder Umschreibung von Nukleinsäuren, Enzym-Substrat-, Antigen-Antikörper Wechselwirkungen und die Proteinsynthese. Dazu zählen beispielsweise die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) von DNA und die RT (reverse Transkription) von RNA in DNA.
Unter „Primer” oder ”Sonden” versteht der Fachmann Oligonukleotide, wobei Primer für eine Amplifizierung oder reverse Transkription notwendig sind. Die Sondern können markiert sein. Markierungen von Sonden sind dem Fachmann bekannt.
Unter dem Begriff ”Enzyme” fallen Polymerase und reverse Transkriptase und andere in der Molekularbiologie verwendbare Enzyme wie Peroxydasen, Dehydrogenasen, Phosphatasen etc..
dNTPs sind Desoxyribosenucleotidtriphosphate. Es sind dies die Bausteine, die während einer PCR angefügt werden, um einen neuen Strang zu synthetisieren. Beispiele sind: dATP (Adenosintriphosphat), dUTP (Uracyl), dCTP (Cytidin), dTTP (Thymidin) und dGTP (Guanosin).
Der Begriff ”Puffer” steht für Reaktionspuffer. Dem Fachmann sind entsprechende Reaktionspuffer bekannt.
Weitere bekannte Komponenten zur Durchführung einer Reaktion sind z. B. Salze und Puffersubstanzen, z. B. Magnesiumverbindungen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen beschrieben. Diese stellen dabei keine Einschränkung der Erfindung dar.
Ausführungsbeispiele
Ausführungsbeispiel 1
Herstellung eines kompartimentierten lagerstabilen Reaktionansatzes und Verwendung in einem Lagerversuch zur Amplifikation einer humanspezifischen Targetsequenz
A. Herstellung eines kompartimentierten lagerstabilen Reaktionansatzes
Als poröse Träger wurden Polyethylen Filterscheiben verwendet.
Auf unterschiedlichen Zonen der Filterscheibe erfolgte die Zugabe folgender Komponenten (1):
1 zeigt eine Filterscheibe mit unterschiedlichen Zonen und PCR-Materialien.
1 Ligand-modifizierte Hot-Start Taq DNA Polymerase stabilisiert mit 10% Sorbitol und 3,75% FCS im Endansatz
2 dNTPs
3 Primer (sense)
4 Primer (antisense)
Die Komponenten wurden in der Menge, die einem 100 μl-PCR-Ansatz entspricht, aufgetragen.
Die Lösungen wurden auf die Filterscheibe gebracht und für ca. 2 h unter physiologischen Temperaturbedingungen (37°C) getrocknet. Nach erfolgter Eintrocknung wurden die Filterscheiben in ein 2 ml Schraubgefäß überführt, mit einem Deckel fest verschlossen und bei Raumtemperatur für 3 Monate gelagert und nach dieser Lagerzeit in einer Vergleichsreaktion mit frisch zugegebenen Reaktionskomponenten getestet.
B. Amplifikation einer humanspezifischen Targetsequenz mit frischen Reagenzien bzw. unter Nutzung der erfindungsgemäß hergestellten Reaktionsansatzes nach Lagerung für 3 Monate
Die Amplifikationsreaktion erfolgte mittels eines SpeedCyclers (Analytik Jena AG).
Ansätze:
1) ”Frisch”

5 μl DNA (human)
10 μl Amplifikationspuffer, incl. Magnesiumchlorid (10×)
2 μl dNTPs (12,5 mM, jeweils)
0,7 μl Primer (sense; 50 pmol)
0,7 μl Primer (antisense; 50 pmol)
5 Units Taq Polymerase
Auffüllen mit Wasser auf Finalvolumen von 100 μl

2) ”Lagerstabile Filterscheibe”

5 μl DNA (human)
10 μl Amplifikationspuffer, incl. Magnesiumchlorid (10×)
Auffüllen mit Wasser auf Finalvolumen von 100 μl

Die DNA-Puffer-Mischung wurde auf die Filterplatte im 2 ml-Röhrchen gegeben und 1 min gevortext. Die jeweils 100 μl vom PCR-Ansatz wurden auf 6 Wells einer SpeedCycler-Platte zu je 15 μl verteilt. Nach Durchführung der Amplifikations-Reaktion wurden die Amplifikationsprodukte auf einem Agarosegel ausgewertet (2).
2 zeigt PCR Produkte nach Amplifikation genomischer DNA mit frischen und lagerstabilen Reagenzien.
M...DNA Marker
Spuren 1–6...Amplifikationsprodukte unter Verwendung der lagerstabil beschichteten Filterscheibe (Ansatz 1)
Spuren 7–12...Amplifikationsprodukte unter Verwendung frisch zugegebener Reaktionskomponenten (Ansatz 2)
Das Beispiel illustriert eindrucksvoll, dass die Verwendung der lagerstabil beschichteten Filterscheibe nach Lagerung von 3 Monaten bei Raumtemperatur keinerlei Aktivitätsverlust im Vergleich zu frisch zugegeben Reaktionskomponenten zeigt.
Ausführungsbeispiel 2
Herstellung eines kompartimentierten lagerstabilen Reaktionansatzes und Verwendung in einem Lagerversuch zur Amplifikation und Hybridisierung einer Salmonella enterica spezifischen Targetsequenz.
Die kompartimentierten Reagenzien wurden für die Durchführung eines sondenbasierten-LFA-Assays präpariert. Bei der Durchführung des Assays ist es essentiell, das die FITC-markierte Sonde und der Biotin-markierte Primer keine Dimerisationsprodukte vor der Reaktion bilden. Erfindungsgemäß soll die kompartimentierte Verbringung der einzelnen Reaktionskomponenten einen irregulären Reaktionsstart verhindern und damit das Auftreten von falsch-positiven Ergebnissen verhindern.
A. Herstellung eines kompartimentierten lagerstabilen Reaktionsansatzes
Als poröse Träger wurden Polyethylen Filterscheiben verwendet.
Auf unterschiedlichen Zonen der Filterscheibe erfolgte die Zugabe folgender Komponenten (3):
3 zeigt die Aufsicht auf eine Filterscheibe. Kompartimentierung lagerstabiler Komponenten für einen sondenbasierten LFA-Assay.
1 dNTPs
2 FITC markierte Sonde
3 Primer 1, unmarkiert
4 Primer 2, Biotin markiert
5 Ligand-modifizierte Hot-Start Taq DNA Polymerase stabilisiert mit 10% Sorbitol und 3,75% FCS im Endansatz
Die Reagenzien wurden in der Menge, die einem 100 μl-PCR-Ansatz entsprechen, aufgetragen. Die Lösungen wurden auf die Filterscheibe pipettiert und für ca. 2 h unter physiologischen Temperaturbedingungen von 37°C getrocknet.
Nach erfolgter Eintrocknung wurden die Filterscheiben in ein 2 ml Schraubgefäß platziert, mit einem dafür vorgesehenen Deckel fest verschlossen und bei RT für 3 Monate gelagert und in einer Vergleichsreaktion mit frisch zugegebenen Reaktionskomponenten getestet.
B. Amplifikation einer humanspezifischen Targetsequenz
Die Amplifikationsreaktion erfolgte mittels eines SpeedCyclers (Analytik Jena AG).
Ansätze:
1) ”Frisch”

10 μl Amplifikationspuffer, incl. Magnesiumchlorid (10×)
2 μl dNTPs (12,5 mM, jeweils)
0,35 μl Primer (unmarkiert; 50 pmol)
0,7 μl Primer (Biotin markiert; 50 pmol)
0,7 μl Sonde (FITC markiert; 50 pmol)
5 Units Taq Polymerase
Auffüllen mit Wasser auf Finalvolumen von 100 μl.

2 × 15 μl des Ansatzes wurden als Negativkontrolle abpipettiert, zu dem Rest des Mastermixes wurden 5 μl S. enterica-DNA zugegeben und davon wurden 2 × 15 μl des PCR Ansatzes in das Well einer PCR-Platte für den SpeedCycler gegeben.
2) ”Lagerstabile Filterscheibe”

10 μl Amplifikationspuffer, incl. Magnesiumchlorid (10×)
Auffüllen mit Wasser auf ein Finalvolumen von 100 μl

Die DNA-Puffer-Mischung wurde auf die Filterscheibe im 2 ml-Röhrchen gegeben, mit einem Deckel verschlossen und 1 min gevortext. 2 × 15 μl des Ansatzes wurden als Negativkontrolle abpipettiert, zu dem Rest des Mastermixes wurden 5 μl S. enterica-DNA zugegeben und davon wurden 2 × 15 μl des PCR Ansatzes in das Well einer PCR-Platte für den SpeedCycler gegeben.
3) „Frisch + Primer/Sonde Mix”
Bei diesem Ansatz wurden Primer und Sonde in der gegebenen Menge (siehe „Frisch”-Ansatz) 2 Stunden vor der Reaktion zusammengemischt und bei Raumtemperatur gelagert, um die Dimerbildung zu begünstigen. 2 × 15 μl des Ansatzes wurden als Negativkontrolle abpipettiert, zu dem Rest des Mastermixes wurden 5 μl S. enterica-DNA zugegeben und davon wurden 2 × 15 μl des PCR Ansatzes in das Well einer PCR-Platte für den SpeedCycler gegeben.
Nach Durchführung der Amplifikations/Hybridisierungs-Reaktion mittels eines SpeedCyclers wurden die jeweils 2 gleichen Ansätze zusammengemischt. Eine Hälfte wurde auf einen Agarosegel aufgetragen (4A). Die andere Hälfte wurde auf einen Lateral-Flow-Streifen aufgetragen (4B).
4 zeigt einen Amlifikations-Hybridiserungs-Reaktion (RAH Technologie) nach Auswertung des PCR-Ansatzes auf dem Gel (A) und auf einem LFA (B).
1 ... Ansatz 1 (Frisch), Positive PCR; 2 ... Ansatz 1, Negativkontrolle; 3 ... Ansatz 2 (lagerstabile Filterscheibe), Positive PCR; 4 ... Ansatz 2, Negativkontrolle; 5 ... Ansatz 3 (Frisch + Primer/Sonde Mix), Positive PCR; 6 ... Ansatz 3, Negativkontrolle
Dieses Beispiel zeigt, dass eine lange Inkubation von Primer und Sonde bei Raumtemperatur zur Bildung von Dimeren zwischen der markierten Sonde und dem markierten Primer führen kann. Dieses Phänomen ist zwar auf dem Agarosegel nicht sichtbar (die Negativkontrolle bleibt negativ), führt aber zu falschpositiven Testergebnissen auf einem Lateral-Flow-Streifen, wo alle doppeltmarkierten Dimere sichtbar werden und so ein falsch-positives Testergebnis vermitteln. Bei einer kompartimentierten Immobilisierung können die benötigten Reaktionskomponenten bereits in den vorgegebenen Mengen zusammengebracht werden. Die Möglichkeit eines unerwünschten Reaktionsstarts oder der Dimerbildung bestehen aber infolge der räumlichen Trennung der Komponenten nicht.
Ausführungsbeispiel 3
Herstellung eines kompartimentierten lagerstabilen Reaktionansatzes und Verwendung dessen zur OneStep cDNA-Synthese und Amplifikation von einem Influenza A Virus.
A. Herstellung eines kompartimentierten lagerstabilen Reaktionsansatzes
Als poröse Träger wurden Polyethylen Filterscheiben verwendet.
Auf unterschiedlichen Zonen der Filterscheibe erfolgte die Zugabe folgender Komponenten (5):
5 zeigt die Aufsicht auf eine Filterscheibe. Kompartimentierung lagerstabiler Komponenten für eine OneStep PCR.
1. FITC markierte Sonde
2. Primer 1, unmarkiert
3. Primer 2, Biotin markiert
4. Affinityscript Enzymmix für OneStep RT-PCR (ggf. stabilisiert)
5. Darüber hinaus wurde Puffer, dNTPs enthaltend, auf dem Boden des Reaktionsgefäßes eingetrocknet (Herculase^® II RT-PCR 2× Mastermix, Agilent).
Die Chemikalien wurden in der Menge, die einem 10 μl-Ansatz entsprechen, aufgetragen. Die Lösungen wurden auf die Filterscheibe bzw. auf dem Boden eines 2 ml Schraubgefäßes gebracht, mit einem Deckel verschraubt und für ca. 2 h bei physiologischen Temperaturbedingungen von 37°C getrocknet.
Nach erfolgter Eintrocknung wurden die Filterscheiben in einem 2 ml Schraubgefäß platziert und bei RT für 3 Monate gelagert und einer Vergleichsreaktion mit frisch zugegebenen Reaktionskomponenten getestet.
B. OneStep RT-PCR einer Influenza A – spezifischen Targetsequenz
Die Amplifikationsreaktion erfolgte mittels eines SpeedCyclers (Analytik Jena AG).
RNA-Proben:
Es wurde eine Verdünnungsreihe an RNA-Proben aus angezüchteten Influenza-A-Viren hergestellt. Die Proben wurden so verdünnt, dass 12 μl RNA jeweils 10⁵, 10⁴, 10³, 10² und 10¹ Viruspartikeln entsprachen.
Ansätze:
1) ”Frisch”

12 μl Virus-RNA
50 μl Herculase^® II RT-PCR 2× Mastermix (Agilent)
0,35 μl Primer (unmarkiert; 50 pmol)
0,7 μl Primer (Biotin markiert; 50 pmol)
0,7 μl Sonde (FITC markiert; 50 pmol)
1 μl Affinityscript Enzymmix (Agilent)
Auffüllen mit Wasser auf ein Finalvolumen von 100 μl

2) ”Lagerstabile Filterscheibe”

12 μl Virus-RNA
Auffüllen mit Wasser auf Finalvolumen von 100 μl

Die RNA-Lösung wurde auf die Filterplatte im 2 ml-Röhrchen gegeben und 1 min gevortext.
Nach Durchführung der OneStep RT-PCR und einer anschließenden Hybridisierung der Sonde mittels eines SpeedCyclers wurden die Reaktionsprodukte auf Lateral-Flow-Streifen aufgetragen (6).
6 zeigt unterschiedliche Virusverdünnungen wurden mit frisch angesetzten Komponenten (frisch) oder lagerstabilen Komponenten (eingetrocknet) auf einer Filterscheibe in einer OneStep RT-PCR amplifiziert und auf einem Lateral-Flow-Streifen nachgewiesen.
Das Beispiel illustriert, dass die Verwendung der lagerstabil beschichteten Filterscheibe auch bei einer OneStep RT-PCR-Reaktion keinerlei Aktivitätsverlust im Vergleich zu frisch zugegeben Reaktionskomponenten zeigt.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 020050069898 A1 [0007]
US 4891319 [0007]
US 7501493 [0007]
DE 102006056790 B3 [0007, 0010]
DE 102004021822 B3 [0009]
DE 60200400248/5 T2 [0010]
EP 0511559 [0011]
US 4948836 [0011]
DE 10053553 C2 [0011]
EP 0941370 B1 [0012]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Teramoto N, Sachinvala ND, Shibata M. Trehalose and trehalose-based polymers for environmentally benign, biocompatible and bioactive materials. Molecules. 2008 Aug 21; 13(8):1773-816 [0007]
Paz-Alfaro KJ, Ruiz-Granados YG, Uribe-Carvajal S, Sampedro JG. Trehalose-mediated thermal stabilization of glucose oxidase from Aspergillus niger. J Biotechnol. 2009 May 20;141(3-4):130-6. Epub 2009 Mar 25 [0007]
Morana A, Stiuso P, Colonna G, Lamberti M, Carteni M, De Rosa M. Stabilization of S-adenosyl-L-methionine promoted by trehalose. Biochim Biophys Acta. 2002 Nov 14;1573(2):105-8 [0007]
http://www.abaxis.com/about_us/history.html [0008]
Klatser PR, Sjoukje Kuijper, van Ingen CW, Kolk AHJ. Stabilized, Freeze-dried PCR Mix for detection of Mycobacteria. J Clin Microb, 1998 Jun 36(6):1798-1800 1998 [0010]
Wolff C, Hörnschemeyer D, Wolff D, Kleesiek K. Single-tube nested PCR with room-temperature-stable reagents. PCR Methods Appl. 1995 4:376-379 [0010]

Claims

Vorrichtung zur Durchführung einer molekularbiologischen Reaktion, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen für eine Reaktion benötigten Komponenten sich zwar am gleichen Reaktionsort befinden, jedoch vor der Reaktion auf einem Trägermaterial räumlich voneinander getrennt sind, so dass eine unerwünschte Zusammenwirkung der Einzelkomponenten vor dem Reaktionsstart unmöglich ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den molekularbiologische Reaktionen um a) Amplifikation von Nukleinsäuren, z. B. PCR oder RealTime-PCR oder b) reverse Transkription von RNA in DNA oder c) Enzym-Substrat.-Wechselwirkungen oder d) Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen oder e) Proteinsynthesen handelt.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem festen Träger um einen porösen Träger, vorzugsweise eine poröse Filterscheibe, handelt.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem festen Träger um eine Oberfläche handelt auf die die Reaktionskomponenten räumlich getrennt aufgetragen werden.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger aus Polyethylen besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich f) Primer und Enzyme oder g) Primer, Enzyme und Sonde oder h) Primer, Enzyme, Sonde und dNTPs oder i) Primer, Enzyme, Sonde, dNTPs und Puffer oder j) Enzym und Coenzym oder k) zwei oder mehrere unterschiedliche Antikörper auf dem Träger in unterschiedlichen, räumlich getrennten, Kompartimenten befinden.
Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Komponenten für die Reaktion auf dem Träger in unterschiedlichen Kompartimenten immobilisiert sind.
Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten durch Wasserentzug oder Wassersubstitution, vorzugsweise durch Eintrocknen oder Gefriertrocknung, auf dem Träger stabilisiert werden.
Verfahren zur Durchführung einer Reaktion, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Bereitstellen des festen Trägers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 b) Hinzugabe einer Flüssigkeit mit dem nachzuweisenden Biomolekül und ggf. anderen für die Reaktion benötigten Substanzen c) Inkubation und Durchführung der Reaktion nach bekannten Verfahren.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit reines Wasser, eine Lösung, eine Detergenzhaltige Lösung, eine die zu testende Probe enthaltende Lösung, eine weitere Reaktionskomponenten enthaltende Lösung ist.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Detergenz Nichtionische Tenside verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass für den Fall, dass der Träger nicht alle für die Reaktion benötigte Sunstanzen enthält, sich diese Komponenten in der Lösung befinden.
Molekulardiagnostisches Testkit, umfassend einerseits einen festen Trägers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und andererseits eine Lösung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12.
Testkit nach Anspruch 13, dass es weitere bekannte Komponenten zur Durchführung und Auswertung einer molekulardiagnostischen Reaktion enthält.
Verwendung des Testkits gemäß Anspruch 13 oder 14 zur Durchführung molekulardiagnostischen Tests, insbesondere unter Feldbedingungen.