CN104593252B - 基于移液器枪头的集样品预处理和扩增于一体的核酸分析***及其应用 - Google Patents

基于移液器枪头的集样品预处理和扩增于一体的核酸分析***及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于移液器枪头的集样品预处理和扩增于一体的核酸分析***及其应用。本发明主要是利用集成在移液器枪头上的核酸提取卡进行样本的前处理,利用核酸的固相萃取法进行提取;结合手持式加热台对核酸反应液进行核酸扩增;并利用紫外灯对检测的结果进行肉眼可视化判读,实现了对核酸样本的实时检测和现场检测。本发明的核酸分析***可广泛应用于环境检测、疾病诊断、检验检疫和法医鉴定等领域中的核酸检测分析。

Description

基于移液器枪头的集样品预处理和扩增于一体的核酸分析系 统及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和核酸分析检测领域,尤其是涉及一种基于移液器枪头的集样品预处理和扩增以及检测于一体的核酸检测分析***及其在核酸分析中的应用。
背景技术
基于核酸检测分析的分子诊断技术已经被广泛的应用于临床分析检测,为疾病诊断、预防及预后的评价等提供了技术上的有力支撑。近年来发展了多种核酸检测分析方法,但是现有的核酸检测分析方法大都是针对于已经处理好的样本进行核酸扩增检测,无法实现现场快速分析检测。
近年来随着经济的快速发展,人口流动的迅速增加,流行疾病的发生频率和概率逐年增加。因此,对于流行性疾病的检验检疫要求越来越高。集成样品前处理于一体的快速、现场的核酸诊断技术已经引起了科研工作者的广泛兴趣。现有的集成样品前处理于一体的核酸检测分析的***主要存在样品预处理复杂、扩增所需的仪器设备昂贵需要专业人员操作等缺点,因此不适用于基层单位快速检测分析。
中国专利CN102676692A公开了一种手足口病毒EV71核酸检测试剂盒,其提供的是一种结合序列依赖性等温扩增和核酸等温信号方法技术用于手足口病毒EV71的核酸检测试剂盒;中国专利CN102827929A公开了一种核酸检测方法,该方法提供了一种滚环扩增技术用于核酸等温扩增,并在核酸扩增完成后在体系中添加磁珠,是扩增产物聚集,然后转移至滤纸上,用肉眼观察滤纸表面判读待测是否有目标核酸分子。然而上述核酸检测方法都无法实现集成样品预处理和核酸扩增及检测于一体,因此如何开发一种集成样品预处理及核酸等温扩增、检测分析于一体,并且操作简单的核酸检测分析***及方法是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种集样品预处理和扩增于一体的核酸分析***及其应用,特别是一种基于移液器枪头的集样品预处理和扩增于一体的核酸分析***及其应用。本发明通过采用集成在移液器枪头上的核酸提取卡进行核酸的提取,并在移液器枪头内进行核酸的等温扩增,利用检测装置对结果进行判断,可实现现场快速实时检测分析。
为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种基于移液器枪头的集样品预处理和扩增于一体的核酸分析***,其包括集成在移液器枪头上的核酸提取卡。
本发明采用的核酸提取卡可以是任何DNA或RNA提取卡。可以是武汉昌美、天津维诺来博、南京爱贝生物、北京华兴瑞安科技有限公司的等所有公司研发的核酸提取保存卡。
优选地采用General Electric Company生产的FTA核酸提取卡。
本发明中,所述的核酸提取卡位于移液器枪头中。
优选地,所述的核酸提取卡靠近移液器枪头的底部尖端;进一步优选地,所述的核酸提取卡位于靠近移液器枪头底部尖端1-2cm的位置处。
本发明中,所述的核酸提取卡由预先固定了核酸提取试剂的多孔的纤维材料制备而成。
优选地,所述的核酸提取卡是利用基于固相萃取的核酸处理技术而制备成的带有透气性膜结构的卡片,其尺寸大小经裁剪与移液器枪头进行匹配。
本发明的核酸提取卡含有预先固定的样本核酸提取和保存的所有试剂,并且此核酸提取卡的纤维对核酸具有一定的吸附作用,以充分满足核酸的固相萃取过程。
本发明中,所述的核酸分析***还包括加热装置和检测装置。
优选地,所述的加热装置为微型化加热台、手持式加热台或加热片。
优选地,所述的检测装置为紫外灯。
第二方面,本发明还提供了一种核酸分析方法,包括以下步骤:
(1)集成本发明第一方面所述的核酸提取卡于移液器枪头上,利用所述的核酸提取卡实现待测样品中核酸的提取;
(2)利用微型手持式加热台对提取的核酸进行扩增;
(3)采用检测装置对结果进行检测分析。
本发明中,步骤(1)具体包括以下步骤:
(1)将所述的核酸提取卡经过剪裁后,使其集成在移液器的枪头上;
(2)移液器与移液器枪头连用,将待测样品吸取到所述的核酸提取卡上进行核酸提取,然后吹出,进而吸取清洗液进行清洗,纯化提取的核酸。
本发明中,所述的待测样品是原始液体样品或固体组织样品。
优选地,所述的固体组织样品为利用手持式组织研磨器研磨的固体组织样品。
本发明中,步骤(2)具体包括以下步骤:
(1)吸取一定量的核酸扩增反应液到移液器枪头中与核酸提取卡接触;
(2)对所述的移液器枪头底部进行热封,在所述移液器枪头的上部采用油封的方式对核酸扩增进行封装后,采用加热装置对提取的核酸进行扩增。
优选地,所述的扩增为等温扩增。
优选地,采用环介导等温扩增法对样本进行扩增。
优选地,所述的等温扩增在微型手持式加热台或加热片上实现。
优选地,采用电池提供动力的掌上加热器,可以脱离有线电源的限制,有利于实现现场的扩增检测。
本发明中,所述的方法具体包括以下步骤:
(1)将本发明第一方面所述的核酸提取卡经过剪裁后,使其集成在移液器的枪头上;
(2)移液器与移液器枪头连用,将待测样品吸取到所述的核酸提取卡上进行核酸提取,然后吹出,进而吸取清洗液进行清洗、纯化提取的核酸;
(3)吸取一定量的核酸扩增反应液到移液器枪头中与核酸提取卡接触;
(4)对所述的移液器枪头底部进行热封,在所述移液器枪头的上部采用油封的方式对核酸扩增进行封装后,采用加热装置对提取的核酸进行扩增;
(5)采用紫外灯对结果进行检测分析。
第三方面,本发明还提供了一种根据本发明第一方面所述的核酸分析***在环境检测、疾病诊断、检验检疫或法医鉴定中应用。
与现有技术相比,本发明至少具有以下有益效果:
(1)本发明的核酸分析***集样品前处理、扩增和检测于一体,可实现对于原始样本(包括液体及固体组织样本)的实时、现场快速检测分析;
(2)本发明中集成核酸提取卡的移液器枪头具有价格低廉,易于操作,无需专业人员即可以实现液体精确操控等优点;在此枪头上可以实现快速、操作方便的核酸提取,结合小型的手持式加热及检测装置,可以实现现场检测,特别适用于现场及基层单位应用。
附图说明
图1是本发明的核酸分析***示意图;
图2是本发明的核酸分析***工作流程图;
图3是本发明的核酸分析***用于马铃薯致病菌的检测;
其中,图3-a)为带有致病菌的马铃薯样本,图3-b)为切取的待检样本,图3-c)为利用组织研磨器研磨的组织液,图3-d)为肉眼可视化的结果读出图片,图3-d)中的1、2、3分别为空白对照,阴性对照和阳性样本。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
图1示出了基于移液器枪头的集样品预处理和扩增于一体的核酸分析***的结构示意图,图2示出了所述核酸分析***的工作流程图。
本实施中核酸的整个分析主要包括如下的步骤:
(1)样本的预处理
样本主要包括固体的组织样本和液体样本。对于液体的样本,可以直接用移液器吸取;对于固体组织样本用手持式组织研磨器进行研磨,研磨成可以用移液器吸取的组织液,备用。
用移液器结合集成了核酸提取卡的移液器枪头吸取样本,液体样本接触核酸提取卡。等待一定时间完成核酸在卡上自动提取后,吹出废液,然后吸取清洗液,并吹出废液,完成核酸提取过程。较为纯净的核酸被保留在了核酸提取卡上,备用。
(2)核酸的扩增
对于核酸的扩增,主要是用附带已经提取了核酸的移液器枪头吸取核酸扩增反应液,使得核酸扩增反应液接触保留了核酸的核酸提取卡;然后对枪头进行密封,进而将密封了的枪头放置于迷你加热台上进行加热扩增。
(3)结果判读
核酸的反应液中已经预加了扩增指示试剂,当扩增后,用紫外灯激发后,会产生肉眼可见的荧光信号,可以实现肉眼可视化的结果判读。
实施例2
本实施中将核酸分析***用于检验检疫中马铃薯致病菌的检测,具体步骤如下:
首先要对植物组织上可疑的斑点处组织进行处理,包括切下该组织,并将其收集到样品袋中,进行编号登记;然后利用组织研磨器对登记的组织进行研磨处理,对处理完成的组织研磨液保存,备用。
利用实施例1中的移液器枪头吸取2μL的组织研磨液接触核酸提取卡,静置30min,完成核酸的提取;吹出废液,并吸取清洗液对样本进行清洗,在核酸提取卡上保留得到较为纯净的核酸。
用该枪头吸取含有致病菌特异性的引物的核酸扩增反应液,使其接触到核酸提取卡上的核酸,并将此枪头密封,然后放到加热台上进行加热核酸扩增。等待45min时间,完成核酸扩增后,利用手持式的紫外灯对检测的结果进行肉眼可视化判读。
检测结果如图3所示,由图3可以看出,采用实施例1的核酸分析***可以在90min内实现样品进结果出的实时快速检测。
实施例3
本实施例中将核酸分析***用于多通量的人药物代谢基因的检测分析,其主要的步骤如下:
该体系可以结合多通道的移液器对人的药物代谢基因CYP2C19基因的CYP2C19*2和CYP2C19*3两个单碱基突变位点进行多人份的检测分析。具体步骤主要为:(1)将采集得到的两个样本分别编号为1#和2#,分别分为4份,利用8通道的移液器进行双人份的同时检测分析,其中每四个通道对一个样品进行检测。吸取2μL样本进行核酸提取过程;(2)对于一个样本的四个通道分别吸取含有针对药物代谢CYP2C19基因*2和*3突变位点野生型和突变型特异性引物的核酸扩增液,然后将枪头封装,将枪头放到加热台上进行加热扩增;(3)利用紫外灯对结果进行判读,判别药物基因的突变位点及突变类型。
结果显示1#样本2*突变位点结果为野生型阳性而突变型阴性,3*突变位点结果为野生型阴性而突变型阳性,即1#样本存在CYP2C19*3基因突变;而2#样本2*突变位点结果为野生型阴性而突变型阳性,3*突变位点结果为野生型阳性而突变型阴性,即2#样本存在CYP2C19*2基因突变。
实施例4
本实施例用于埃博拉病毒合成实际样本的检测分析,其主要的步骤如下:
埃博拉病毒合成实际样本的制备,即将埃博拉病毒的靶标DNA序列连接到pUC57载体上构成,***位点为Small。
利用本发明的枪头吸取一定量合成的埃博拉病毒的合成阳性样本,静置一定时间,完成核酸的提取。吹出废液,并吸取清洗液对样本进行清洗,在核酸提取卡上保留得到较为纯净的核酸。
用该枪头吸取含有埃博拉病毒的特异性引物的核酸扩增反应液,使其接触到核酸提取卡上的核酸,并将此枪头密封,然后放到迷你加热器上进行加热核酸扩增。等待一定的时间,完成核酸扩增后,利用手持式的紫外灯对检测的结果进行肉眼可视化判读。
结果显示,人工合成埃博拉阳性样本扩增后的液体有明显的荧光阳性信号存在。
实施例5
本发明用于前哨***活检。前哨***是原发肿瘤细胞在引流区域***转移过程中首先累及的一个***。细胞角蛋白(CK19)的异常表达与肿瘤的转移有密切关系,可以作为预测腋窝***有无肿瘤转移的重要指标。其主要的步骤如下:
利用本发明的枪头吸取一定量的肿瘤转移病人的淋巴液,静置一定时间,完成淋巴液中肿瘤细胞的mRNA的提取。吹出废液,并吸取清洗液对样本进行清洗,在核酸提取卡上保留得到较为纯净的核酸。
用该枪头吸取含有CK19的特异性引物的核酸扩增反应液,使其接触到核酸提取卡上的核酸,并将此枪头密封,然后放到迷你加热器上进行加热核酸扩增。等待一定的时间,完成核酸扩增后,利用手持式的紫外灯对检测的结果进行肉眼可视化判读,从而判读有无肿瘤***转移。
结果显示,肿瘤转移病人的淋巴液中有CK19基因过表达现象。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法,但本发明并不局限于上述工艺步骤,即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (13)

1.一种基于移液器枪头的集样品预处理和扩增于一体的核酸分析***,其特征在于,其包括集成在移液器枪头上的核酸提取卡;所述的核酸提取卡是由预先固定了核酸提取试剂的多孔的纤维材料制备而成;所述的核酸提取卡是利用基于固相萃取的核酸处理技术而制备成的带有透气性膜结构的卡片,其尺寸大小经裁剪与移液器枪头进行匹配;
所述的核酸分析***还包括加热装置和检测装置。
2.如权利要求1所述的核酸分析***,其特征在于,所述的核酸提取卡内置在移液器的枪头中。
3.如权利要求2所述的核酸分析***,其特征在于,所述的核酸提取卡靠近移液器枪头的底部尖端。
4.如权利要求3所述的核酸分析***,其特征在于,所述的核酸提取卡位于靠近移液器枪头底部尖端1-2cm的位置处。
5.如权利要求1所述的核酸分析***,其特征在于,所述的加热装置为电池提供动力的加热台或加热片。
6.如权利要求1所述的核酸分析***,其特征在于,所述的检测装置为手持式紫外灯。
7.一种核酸分析方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)集成如权利要求1-6任一项中所述的核酸提取卡于移液器枪头上,利用所述的核酸提取卡实现待测样品中核酸的提取;
(2)利用微型手持式加热台对提取的核酸进行扩增;
(3)采用检测装置对结果进行检测分析。
8.如权利要求7所述的核酸分析方法,其特征在于,步骤(1)具体包括以下步骤:
(1)将所述的核酸提取卡经过剪裁后,使其集成在移液器的枪头上;
(2)移液器与移液器枪头连用,将待测样品吸取到所述的核酸提取卡上进行核酸提取,然后吹出,进而吸取清洗液进行清洗,纯化提取的核酸。
9.如权利要求7或8所述的核酸分析方法,其特征在于,所述的待测样品是原始液体样品或固体组织样品。
10.如权利要求7所述的核酸分析方法,其特征在于,步骤(2)具体包括以下步骤:
(1)吸取一定量的核酸扩增反应液到移液器枪头中与核酸提取卡接触;
(2)对所述的移液器枪头底部进行热封,在所述移液器枪头的上部采用油封的方式对核酸扩增进行封装后,采用微型手持式加热台对提取的核酸进行扩增。
11.如权利要求10所述的核酸分析方法,其特征在于,步骤(2)所述的扩增为等温扩增。
12.如权利要求7所述的核酸分析方法,其特征在于,所述的方法具体包括以下步骤:
(1)将权利要求1-6任一项中所述的核酸提取卡经过剪裁后,使其集成在移液器的枪头上;
(2)移液器与移液器枪头连用,将待测样品吸取到所述的核酸提取卡上进行核酸提取,然后吹出,进而吸取清洗液进行清洗,纯化提取的核酸;
(3)吸取一定量的核酸扩增反应液到移液器枪头中与核酸提取卡接触;
(4)对所述的移液器枪头底部进行热封,在所述移液器枪头的上部采用油封的方式对核酸扩增进行封装后,采用微型手持式加热台对提取的核酸进行扩增;
(5)采用紫外灯对结果进行检测分析。
13.根据权利要求1-6任一项所述的核酸分析***在环境检测中的应用。
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