CN101014619B - 优化的Fc变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及优化的Fc变体、其生产方法、包含优化的Fc变体的Fc多肽、以及使用优化的Fc变体的方法。
Description
本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2004年5月5日提交的USSN60/568,440；2004年7月20日提交的60/589,906；2004年11月9日提交的60/627,026；2004年11月10日提交的60/626,991；2004年11月12日提交的60/627,774；2003年12月22日提交的60/531,752；和2003年12月22日提交的60/531,891的权益；且是2004年3月26日提交的USSN 10/822,231的部分继续；是2003年9月26日提交的10/672,280的部分继续；是2003年3月3日提交的10/379,392的部分继续，所有这些均完整引入作为参考。
发明领域
本发明涉及新的经优化的Fc变体、生产它们的工程化方法、及其应用，特别是用于治疗目的。
发明背景
抗体是结合特定抗原的免疫学蛋白质。在大多数哺乳动物包括人和小鼠中，抗体由成对的重链和轻链多肽链构成。每条链由个别免疫球蛋白(Ig)结构域组成，因此这样的蛋白质使用通称免疫球蛋白。每条链由称为可变区和恒定区的两种不同区组成。轻链和重链可变区在抗体间显示明显的序列多样性，并负责结合靶抗原。恒定区显示较小的序列多样性，并负责结合许多天然蛋白质以引发重要的生化事件。人类有五种不同类别的抗体，包括IgA(其包括亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(其包括亚类IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4)、和IgM。这些抗体类别之间的区别性特征是其恒定区，尽管可变区中可能存在细微差异。图1显示了IgG1抗体，本文用作例子来描述免疫球蛋白的一般结构特征。IgG抗体为四聚体蛋白质，由两条重链和两条轻链组成。IgG重链由四个免疫球蛋白结构域组成，以VH-CH1-CH2-CH3的顺序从N-到C-末端连接，称为重链可变区、重链恒定区1、重链恒定区2、和重链恒定区3。IgG CH1、CH2、和CH3结构域也分别称为恒定区伽马1(Cγ1)、恒定区伽马2(Cγ2)、和恒定区伽马3(Cγ3)。IgG轻链由两个免疫球蛋白结构域组成，以VL-CL的顺序从N-到C-末端连接，分别称为轻链可变区和轻链恒定区。
抗体的可变区包含分子的抗原结合决定簇，因此决定了抗体对其靶抗原的特异性。可变区如此命名是因为它与相同类别内的其它抗体在序列上差别最明显。大多数序列可变性发生于互补决定区(CDR)。总计有6个CDR，每条重链和轻链各三个，称为VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、和VLCDR3。CDR外的可变区称为框架(FR)区。尽管不像CDR那样多变，但不同抗体间FR区中的确存在序列可变性。总体上，抗体的这种特征性构造提供了稳定的支架(FR区)，免疫***能够在其上探测到实质性的抗原结合多样性(CDR)以获得对大批抗原的特异性。对于来自不同生物体的多种可变区片段，可获得许多高分辨率的结构，一些是非结合的，一些与抗原复合。抗体可变区的序列和结构特征已很好的表征(Morea et al.，1997，Biophys Chem 68：9-16；Morea et al.，2000，Methods 20：267-279，引入作为参考)，而且抗体的保守性特征已使大量抗体工程技术的开发成为可能(Maynard et al.，2000，Annu Rev Biomed Eng 2：339-376，引入作为参考)。例如，有可能将来自一种抗体例如鼠抗体的CDR移植到另一种抗体例如人抗体的框架区上。本领域称为“人源化”的这一过程使得由非人抗体生成免疫原性更低的抗体治疗剂成为可能。包含可变区的片段能在没有抗体其它区时存在，包括例如包含VH-Cγ1和VH-CL的抗原结合片段(Fab)、包含VH和VL的可变区片段(Fv)、包含在同一条链中连接在一起的VH和VL的单链可变区片段(scFv)、以及多种其它可变区片段(Little et al.，2000，ImmunolToday 21：364-370，引入作为参考)。
抗体的Fc区与许多Fc受体和配体相互作用，赋予一系列称为效应器功能的重要的功能性能力。对于IgG，如图1所示，Fc区包含Ig结构域Cγ2和Cγ3以及通向Cγ2的N末端铰链。针对IgG类的一个重要的Fc受体家族为Fc伽马受体(FcγR)。这些受体介导抗体与免疫***的细胞分支(arm)之间的通讯(Raghavan et al.，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12：181-220；Ravetch etal.，2001，Annu Rev Immunol 19：275-290)。在人类中，该蛋白质家族包括FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb、和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)、和FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis et al.，2002，Immunol Lett 82：57-65，引入作为参考)。这些受体典型的具有胞外域、跨膜区、和胞内域，其中胞外域介导与Fc的结合，胞内域可能介导细胞内的一些信号事件。这些受体表达于多种免疫细胞中，包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯(Langerhans)细胞、天然杀伤(NK)细胞、和γδT细胞。Fc/FcγR复合体的形成将这些效应细胞募集到结合抗原的部位，典型的导致细胞内的信号事件和重要的后续免疫反应诸如炎症介导物的释放、B细胞活化、胞吞作用、吞噬作用、和细胞毒性攻击。介导细胞毒性和吞噬细胞的效应器功能的能力是抗体破坏靶细胞的潜在机制。其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞裂解的细胞介导的反应称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(Raghavan et al.，1996，Annu Rev Cell Dev Biol12：181-220；Ghetie et al.，2000，Annu Rev Immunol 18：739-766；Ravetch et al.，2001，Annu Rev Immunol 19：275-290，引入作为参考)。其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞的吞噬作用的细胞介导的反应称为抗体依赖性细胞介导的吞噬(ADCP)。已经解析了人FcγR胞外域的许多结构，包括FcγRIIa(pdb登录号1H9V)(Sondermann etal.，2001，J Mol Biol 309：737-749)(pdb登录号1FCG)(Maxwell et al.，1999，NatStruct Biol 6：437-442)、FcγRIIb(pdb登录号2FCB)(Sondermann et al.，1999，Embo J 18：1095-1103)；和FcγRIIIb(pdb登录号1E4J)(Sondermann et al.，2000，Nature 406：267-273，引入作为参考)。所有FcγR结合Fc上的相同区域，位于Cγ2结构域N末端和前面的铰链，如图2所示。此相互作用在结构上得到很好的表征(Sondermann et al.，2001，J Mol Biol 309：737-749，引入作为参考)，并且已经解析了与人FcγRIIIb胞外域结合的人Fc的几种结构(pdb登录号1E4K)(Sondermann et al.，2000，Nature 406：267-273)(pdb登录号1IIS和1IIX)(Radaev et al.，2001，J Biol Chem 276：16469-16477，引入作为参考)，同样解析了人IgE Fc/FcγεRIα复合物的结构(pdb登录号1F6A)(Garman et al.，2000，Nature 406：259-266，引入作为参考)。
不同IgG亚类对FcγR具有不同亲和力，典型的，与IgG2和IgG4相比，IgG1和IgG3基本上更好的结合所述受体。所有FcγR结合IgGFc上的相同区域，然而具有不同的亲和力：高亲和力结合物FcγRI对IgG1的Kd为10-8M-1，而低亲和力受体FcγRII和FcγRIII通常分别以10-6和10-5结合。FcγRIIIa和FcγRIIIb的胞外域96％相同，然而FcγRIIIb没有胞内信号域。另外，尽管FcγRI、FcγRIIa/c、和FcγRIIIa是免疫复合物触发的活化的正调节物，特征为具有含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的胞内域，而FcγRIIb具有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，因此是抑制性的。因此，前者称为活化受体，而FcγRIIb称为抑制受体。所述受体在不同免疫细胞上的表达样式和水平方面也有所不同。另一复杂性水平是人蛋白质组中许多FcγR多态性的存在。具有临床意义的特别相关的多态性是V158/F158 FcγRIIIa。与F158同种异型相比，人IgG1以更高亲和力结合V158同种异型。已经证明这种亲和力差异，以及推测的其对ADCC和/或ADCP的影响是抗CD20抗体rituximab(
IDEC Pharmaceuticals Corporation的注册商标)功效的重要决定因素。V158同种异型患者对rituximab治疗反应良好；然而，更低亲和力F158同种异型患者反应很弱(Cartron et al.，2002，Blood99：754-758，引入作为参考)。大约10-20％的人是V158/V158纯合的，45％是V158/F158杂合的，35-45％的人是F158/F158纯合的(Lehrnbecher et al.，1999，Blood 94：4220-4232；Cartron et al.，2002，Blood 99：754-758，引入作为参考)。因此80-90％的人为弱反应者，即他们具有至少一个F158 FcγRIIIa等位基因。
Fc上交叠但分开的部位，如图1所示，用作与补体蛋白质C1q的接触面。Fc/C1q结合以与Fc/FcγR结合介导ADCC相同的方式介导补体依赖性细胞毒性(CDC)。C1q与丝氨酸蛋白酶C1r和C1s形成复合物，以形成C1复合物。C1q能够结合六个抗体，尽管结合两个IgG就足以激活补体级联反应。类似于Fc与FcγR的相互作用，不同IgG亚类对C1q具有不同亲和力，典型的，与IgG2和IgG4相比，IgG1和IgG3基本上更好的结合所述FcγR。对于Fc/C1q复合物，目前没有可获得的结构；然而，诱变研究已将人IgG上C1q的结合部位定位到牵涉残基D270、K322、K326、P329、和P331、以及E333的区域(Idusogie et al.，2000，J Immunol 164：4178-4184；Idusogie et al.，2001，J Immunol 166：2571-2575，引入作为参考)。
如图1所示，Fc上Cγ2和Cγ3结构域之间的部位介导与初生儿受体FcRn的相互作用，其结合将内吞的(endocytosed)抗体从内体(endosome)再循环回血流(Raghavan et al.，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12：181-220；Ghetieet al.，2000，Annu Rev Immunol 18：739-766，引入作为参考)。与因全长分子的尺寸大而排除肾脏过滤偶联，该过程导致范围为一至三周的良好抗体血清半衰期。Fc与FcRn的结合在抗体输送中也扮演关键角色。Fc上FcRn的结合部位也是细菌蛋白质A和G结合的部位。在蛋白质纯化过程中采用蛋白质A或蛋白质G亲和层析，典型的利用这些蛋白质的紧密结合作为纯化抗体的手段。因此，Fc上该区域的保真度对抗体的临床特性及其纯化二者都是重要的。可获得的大鼠Fc/FcRn复合物的结构(Martin et al.，2001，Mol Cell7：867-877，引入作为参考)，以及Fc与蛋白质A和G的复合物的结构(Deisenhofer，1981，Biochemistry 20：2361-2370；Sauer-Eriksson et al.，1995，Structure 3：265-278；Tashiro et al.，1995，Curr Opin Struct Biol 5：471-481，引入作为参考)提供了对Fc与这些蛋白质的相互作用的了解。
Fc区的关键特征是发生在N297的保守性N连接糖基化，如图1所示。该碳水化合物，或者有时称为寡糖，对抗体扮演了至关重要的结构与功能角色，是抗体必须用哺乳动物表达***生产的基本原因之一。尽管不想局限于一种理论，但相信此碳水化合物的结构效果可能是稳定或溶解Fc，决定Cγ3与Cγ2结构域之间的特定角度或柔性水平，保持两个Cγ2结构域不跨越中心轴互相聚集，或者上述的组合。Fc与FcγR和C1q的有效结合需要该修饰，并且N297碳水化合物的组成改变或其消除影响与这些蛋白质的结合(et al.，1999，Nat Biotechnol 17：176-180；Davies et al.，2001，Biotechnol Bioeng 74：288-294；Mimura et al.，2001，J Biol Chem276：45539-45547；Radaev et al.，2001，J Biol Chem 276：16478-16483；Shieldset al.，2001，J Biol Chem 276：6591-6604；Shields et al.，2002，J Biol Chem277：26733-26740；Simmons et al.，2002，J Immunol Methods 263：133-147，引入作为参考)。然而该碳水化合物与FcγR的特异性接触很小，若有的话(Radaevet al.，2001，JBiol Chem 276：16469-16477，引入作为参考)，表明N297碳水化合物在介导Fc/FcγR结合中的功能角色可能是通过其在决定Fc构象中扮演的结构角色来发挥的。这得到了四种不同Fc糖型(glycoform)的一组晶体结构的支持，其显示寡糖的组成影响Cγ2的构象及作为结果的Fc/FcγR接触面的构象(Krapp et al.，2003，J Mol Biol 325：979-989，引入作为参考)。
以上讨论的抗体的特征-对靶物的特异性、介导免疫效应器机制的能力、和长血清半衰期-使抗体成为有力的治疗剂。单克隆抗体在治疗上用于多种病症包括癌症、炎症、和心血管疾病的治疗。目前有超过十种抗体产品在出售，有数百种在开发。除了抗体之外，在研究和治疗中发现有越来越多作用的抗体样蛋白质是Fc融合物(Chamow et al.，1996，TrendsBiotechnol 14：52-60；Ashkenazi et al.，1997，Curr Opin Immunol 9：195-200，引入作为参考)。Fc融合物是其中一种或多种多肽与Fc可操作连接的蛋白质。Fc融合物将抗体的Fc区及因此其有利的效应器功能和药动学与受体、配体、或其它一些蛋白质或蛋白质结构域的靶物结合区组合起来。后者的角色是介导靶物识别，因此其在功能上类似于抗体可变区。由于Fc融合物与抗体的结构和功能交叠，因此本发明中有关抗体的讨论直接扩展到Fc融合物。
抗体破坏肿瘤细胞有许多可能的机制，包括通过阻断所需生长途径的抗增殖、导致凋亡的胞内信号、受体增强的下调和/或周转(turnover)、CDC、ADCC、ADCP、以及适应性免疫反应的促进(Cragg et al.，1999，CurrOpin Immunol 11：541-547；Glennie et al.，2000，Immunol Today 21：403-410，引入作为参考)。抗肿瘤功效可能起因于这些机制的组合，并且它们在临床治疗中的相对重要性似乎是癌症依赖的。不考虑此抗肿瘤武器兵工厂，抗体作为抗癌药的效力是不能令人满意的，特别是考虑到它们的高成本。患者肿瘤反应数据显示单克隆抗体在治疗效果中只提供了较之正常单药剂细胞毒性化疗剂的少量改善。例如，仅有一半复发性低级非霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤患者对抗CD20抗体rituximab有反应(McLaughlin et al.，1998，J ClinOncol 16：2825-2833，引入作为参考)。在166名临床患者中，6％显示完全反应，42％显示部分反应，中值反应持续时间为大约12个月。用于治疗转移性乳癌的抗HER2/neu抗体trastuzumab(
Genentech的注册商标)功效更低。用trastuzumab治疗222名受测患者时，总反应率仅为15％，其中8个完全反应，26个部分反应，中值反应持续时间和存活期为9至13个月(Cobleigh et al.，1999，J Clin Oncol 17：2639-2648，引入作为参考)。目前，对于抗癌疗法，死亡率的任何微小改善均认为是成功。因此，存在增强抗体破坏靶癌细胞的能力的重大需要。
FcγR介导的效应器功能在抗体抗癌活性中的角色已在小鼠中论证(Clynes et al.，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95：652-656；Clynes et al.，2000，Nat Med 6：443-446，引入作为参考)，并且Fc与某些FcγR之间相互作用的亲和力与基于细胞的测试中的靶向细胞毒性有关(Shields et al.，2001，J BiolChem 276：6591-6604；Presta et al.，2002，Biochem Soc Trans 30：487-490；Shields et al.，2002，J Biol Chem 277：26733-26740，引入作为参考)。此外，已经观察到人临床功效与其FcγRIIIa的高(V158)或低(F158)亲和力多态型同种异型之间的关联(Cartron et al.，2002，Blood 99：754-758，引入作为参考)。
已经针对不同目的对Fc进行了诱变研究，其中有典型的变成丙氨酸(称为丙氨酸扫描)或者由序列同源性替代指导的替代(Duncan et al.，1988，Nature 332：563-564；Lund et al.，1991，J Immunol 147：2657-2662；Lund et al.，1992，Mol Immunol 29：53-59；Jefferis et al.，1995，Immunol Lett 44：111-117；Lund et al.，1995，Faseb J 9：115-119；Jefferis et al.，1996，Immunol Lett54：101-104；Lund et al.，1996，J Immunol 157：4963-4969；Armour et al.，1999，Eur J Immunol 29：2613-2624；Shields et al.，2001，J Biol Chem276：6591-6604)(US 5,624,821；US 5,885,573；PCT WO 00/42072；PCT WO99/58572)，全部引入作为参考。大多数替代降低或消除与FcγR的结合。然而，在获得具有更高FcγR亲和力的Fc变体方面已经获得了一些成功。(参见例如US 5,624,821和PCT WO 00/42072)。例如，Winter及其同事在小鼠IgG2b抗体的位置235替代人氨基酸(谷氨酸到亮氨酸的突变)，将小鼠抗体与人FcγRI的结合增强了100倍(Duncan et al.，1988，Nature 332：563-564)(US5,624,821)。Shields等用丙氨酸扫描诱变来定位对FcγR结合重要的Fc残基，随后用非丙氨酸突变替代挑选的残基(Shields et al.，2001，J Biol Chem276：6591-6604；Presta et al.，2002，Biochem Soc Trans 30：487-490)(PCT WO00/42072)，加入作为参考。
还用通过在改造或变体细胞系中表达抗体而产生的改造糖型实现了Fc对FcγR增强的亲和力(
et al.，1999，Nat Biotechnol 17：176-180；Davieset al.，2001，Biotechnol Bioeng 74：288-294；Shields et al.，2002，J Biol Chem277：26733-26740；Shinkawa et al.，2003，J Biol Chem 278：3466-3473，引入作为参考)。该方法已造成抗体结合FcγRIIIa和介导ADCC能力的增强。
抗体的另一种主要缺点是它们需要生产要求(Garber，2001，NatBiotechnol 19：184-185；Dove，2002，Nat Biotechnol 20：777-779，引入作为参考)。抗体必须在哺乳动物细胞中表达，并且目前市售的抗体连同其它高需求生物治疗剂本质上耗费了所有可用的生产能力。开发中的数百种生物制剂中，大多数是抗体，急需更有效且更廉价的生产方法。抗体生产能力不足的后续影响是三重的。首先，它显著提高生产商的商品成本，该成本转移到患者身上。第二，它阻碍已批准的抗体产品的工业生产，限制高需求治疗剂对患者的可用性。最后，因为临床试验需要大量尚不能盈利的蛋白质，供给不足阻碍增长中的抗体供应渠道向市场发展。
已经在企图缓和该问题的尝试中探索了替代性生产方法。正在寻求转基因植物和动物作为可能更廉价且能力更高的生产***(Chadd et al.，2001，Curr Opin Biotechnol 12：188-194，引入作为参考)。然而，这样的表达***却可能生成明显不同于人糖蛋白的糖基化样式。这可能导致效应器功能降低乃至缺乏，因为如以上所讨论的，碳水化合物结构能显著影响FcγR和补体结合。非人糖型的潜在更大问题可能是免疫原性；碳水化合物是对免疫***而言抗原性的关键来源，非人糖型的存在有引发中和治疗剂的抗体的重大机会，或者更糟的是引起不良免疫反应。因此，由转基因植物和动物生成的抗体的功效和安全性仍不确定。细菌表达是解决抗体生产问题的另一种有吸引力的办法。细菌例如大肠杆菌中的表达提供了有成本效益且能力高的蛋白质生产方法。对于复杂的蛋白质诸如抗体，细菌表达有许多障碍，包括这些复杂分子的折叠与组装、正确二硫化物形成、以及缺乏糖基化时的溶解度、稳定性、和功能性，因为在细菌中表达的蛋白质是不糖基化的。已经在大肠杆菌中成功表达了结合抗原的全长未糖基化抗体(Simmons et al.，2002，J Immunol Methods 263：133-147，引入作为参考)，因此，在缺乏真核陪伴机制时由细菌表达的抗体有可能折叠、装配、和形成正确二硫化物。然而，由细菌表达的抗体用作治疗剂的最终效用仍然受糖基化缺乏的阻碍，它导致缺乏效应器功能并可能导致弱稳定性和溶解度。对于在高浓度配制，对于临床应用要求的长时段，这很可能更成问题。
总之，需要具有增强的治疗特性的抗体。
发明概述
本发明提供了优化了许多治疗学相关特性的Fc变体。这些Fc变体通常包含于变体蛋白质内，其优选包含抗体或Fc融合蛋白。
本发明的一个目的是提供新的Fc位置，在此可以进行氨基酸修饰以生成优化的Fc变体。所述Fc位置包括230、240、244、245、247、262、263、266、273、275、299、302、313、323、325、328、和332，其中Fc区残基的编号为Kabat中的EU索引(EU index)。本发明描述了在任何所述新的Fc位置的任何氨基酸修饰，目的是生成优化的Fc变体。
本发明的又一目的是提供本文已经表征的Fc变体。在一个实施方案中，所述Fc变体在选自下组的位置包含至少一个氨基酸替代：221、222、223、224、225、227、228、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、246、247、249、255、258、260、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、278、280、281、282、283、284、285、286、288、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、313、317、318、320、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、和337，其中Fc区残基的编号为Kabat中的EU索引。在一个优选的实施方案中，所述Fc变体包含至少一个选自下组的替代：D221K、D221Y、K222E、K222Y、T223E、T223K、H224E、H224Y、T225E、T225K、T225W、P227E、P227G、P227K、P227Y、P228E、P228G、P228K、P228Y、P230A、P230E、P230G、P230Y、A231E、A231G、A231K、A231P、A231Y、P232E、P232G、P232K、P232Y、E233A、E233D、E233F、E233G、E233H、E233I、E233K、E233L、E233M、E233N、E233Q、E233R、E233S、E233T、E233V、E233W、E233Y、L234A、L234D、L234E、L234F、L234G、L234H、L234I、L234K、L234M、L234N、L234P、L234Q、L234R、L234S、L234T、L234V、L234W、L234Y、L235A、L235D、L235E、L235F、L235G、L235H、L235I、L235K、L235M、L235N、L235P、L235Q、L235R、L235S、L235T、L235V、L235W、L235Y、G236A、G236D、G236E、G236F、G236H、G236I、G236K、G236L、G236M、G236N、G236P、G236Q、G236R、G236S、G236T、G236V、G236W、G236Y、G237D、G237E、G237F、G237H、G237I、G237K、G237L、G237M、G237N、G237P、G237Q、G237R、G237S、G237T、G237V、G237W、G237Y、P238D、P238E、P238F、P238G、P238H、P238I、P238K、P238L、P238M、P238N、P238Q、P238R、P238S、P238T、P238V、P238W、P238Y、S239D、S239E、S239F、S239G、S239H、S239I、S239K、S239L、S239M、S239N、S239P、S239Q、S239R、S239T、S239V、S239W、S239Y、V240A、V240I、V240M、V240T、F241D、F241E、F241L、F241R、F241S、F241W、F241Y、F243E、F243H、F243L、F243Q、F243R、F243W、F243Y、P244H、P245A、K246D、K246E、K246H、K246Y、P247G、P247V、D249H、D249Q、D249Y、R255E、R255Y、E258H、E258S、E258Y、T260D、T260E、T260H、T260Y、V262A、V262E、V262F、V262I、V262T、V263A、V263I、V263M、V263T、V264A、V264D、V264E、V264F、V264G、V264H、V264I、V264K、V264L、V264M、V264N、V264P、V264Q、V264R、V264S、V264T、V264W、V264Y、D265F、D265G、D265H、D265I、D265K、D265L、D265M、D265N、D265P、D265Q、D265R、D265S、D265T、D265V、D265W、D265Y、V266A、V266I、V266M、V266T、S267D、S267E、S267F、S267H、S267I、S267K、S267L、S267M、S267N、S267P、S267Q、S267R、S267T、S267V、S267W、S267Y、H268D、H268E、H268F、H268G、H268I、H268K、H268L、H268M、H268P、H268Q、H268R、H268T、H268V、H268W、E269F、E269G、E269H、E269I、E269K、E269L、E269M、E269N、E269P、E269R、E269S、E269T、E269V、E269W、E269Y、D270F、D270G、D270H、D270I、D270L、D270M、D270P、D270Q、D270R、D270S、D270T、D270W、D270Y、P271A、P271D、P271E、P271F、P271G、P271H、P271I、P271K、P271L、P271M、P271N、P271Q、P271R、P271S、P271T、P271V、P271W、P271Y、E272D、E272F、E272G、E272H、E272I、E272K、E272L、E272M、E272P、E272R、E272S、E272T、E272V、E272W、E272Y、V273I、K274D、K274E、K274F、K274G、K274H、K274I、K274L、K274M、K274N、K274P、K274R、K274T、K274V、K274W、K274Y、F275L、F275W、N276D、N276E、N276F、N276G、N276H、N276I、N276L、N276M、N276P、N276R、N276S、N276T、N276V、N276W、N276Y、Y278D、Y278E、Y278G、Y278H、Y278I、Y278K、Y278L、Y278M、Y278N、Y278P、Y278Q、Y278R、Y278S、Y278T、Y278V、Y278W、D280G、D280K、D280L、D280P、D280W、G281D、G281E、G281K、G281N、G281P、G281Q、G281Y、V282E、V282G、V282K、V282P、V282Y、E283G、E283H、E283K、E283L、E283P、E283R、E283Y、V284D、V284E、V284L、V284N、V284Q、V284T、V284Y、H285D、H285E、H285K、H285Q、H285W、H285Y、N286E、N286G、N286P、N286Y、K288D、K288E、K288Y、K290D、K290H、K290L、K290N、K290W、P291D、P291E、P291G、P291H、P291I、P291Q、P291T、R292D、R292E、R292T、R292Y、E293F、E293G、E293H、E293I、E293L、E293M、E293N、E293P、E293R、E293S、E293T、E293V、E293W、E293Y、E294F、E294G、E294H、E294I、E294K、E294L、E294M、E294P、E294R、E294S、E294T、E294V、E294W、E294Y、Q295D、Q295E、Q295F、Q295G、Q295H、Q295I、Q295M、Q295N、Q295P、Q295R、Q295S、Q295T、Q295V、Q295W、Q295Y、Y296A、Y296D、Y296E、Y296G、Y296H、Y296I、Y296K、Y296L、Y296M、Y296N、Y296Q、Y296R、Y296S、Y296T、Y296V、N297D、N297E、N297F、N297G、N297H、N297I、N297K、N297L、N297M、N297P、N297Q、N297R、N297S、N297T、N297V、N297W、N297Y、S298D、S298E、S298F、S298H、S298I、S298K、S298M、S298N、S298Q、S298R、S298T、S298W、S298Y、T299A、T299D、T299E、T299F、T299G、T299H、T299I、T299K、T299L、T299M、T299N、T299P、T299Q、T299R、T299S、T299V、T299W、T299Y、Y300A、Y300D、Y300E、Y300G、Y300H、Y300K、Y300M、Y300N、Y300P、Y300Q、Y300R、Y300S、Y300T、Y300V、Y300W、R301D、R301E、R301H、R301Y、V302I、V303D、V303E、V303Y、S304D、S304H、S304L、S304N、S304T、V305E、V305T、V305Y、W313F、K317E、K317Q、E318H、E318L、E318Q、E318R、E318Y、K320D、K320F、K320G、K320H、K320I、K320L、K320N、K320P、K320S、K320T、K320V、K320W、K320Y、K322D、K322F、K322G、K322H、K322I、K322P、K322S、K322T、K322V、K322W、K322Y、V323I、S324D、S324F、S324G、S324H、S324I、S324L、S324M、S324P、S324R、S324T、S324V、S324W、S324Y、N325A、N325D、N325E、N325F、N325G、N325H、N325I、N325K、N325L、N325M、N325P、N325Q、N325R、N325S、N325T、N325V、N325W、N325Y、K326I、K326L、K326P、K326T、A327D、A327E、A327F、A327H、A327I、A327K、A327L、A327M、A327N、A327P、A327R、A327S、A327T、A327V、A327W、A327Y、L328A、L328D、L328E、L328F、L328G、L328H、L328I、L328K、L328M、L328N、L328P、L328Q、L328R、L328S、L328T、L328V、L328W、L328Y、P329D、P329E、P329F、P329G、P329H、P329I、P329K、P329L、P329M、P329N、P329Q、P329R、P329S、P329T、P329V、P329W、P329Y、A330E、A330F、A330G、A330H、A330I、A330L、A330M、A330N、A330P、A330R、A330S、A330T、A330V、A330W、A330Y、P331D、P331F、P331H、P331I、P331L、P331M、P331Q、P331R、P331T、P331V、P331W、P331Y、I332A、I332D、I332E、I332F、I332H、I332K、I332L、I332M、I332N、I332P、I332Q、I332R、I332S、I332T、I332V、I332W、I332Y、E333F、E333H、E333I、E333L、E333M、E333P、E333T、E333Y、K334F、K334I、K334L、K334P、K334T、T335D、T335F、T335G、T335H、T335I、T335L、T335M、T335N、T335P、T335R、T335S、T335V、T335W、T335Y、I336E、I336K、I336Y、S337E、S337H、和S337N，其中Fc区残基的编号为Kabat中的EU索引。这组变体有时称为本发明的“单一变体组(the single variant set)”。
本发明的另一方面是提供与亲本Fc多肽例如Fc区SEQ ID NO：X相比具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个或更多氨基酸替代的Fc变体(和包含这些变体的蛋白质)。在有些实施方案中，1、2、3和4个替代特别有用。
本发明的又一方面是提供与亲本Fc多肽例如SEQ ID NO：X的Fc区相比展示改变的Fc配体结合且由在高严谨条件下与编码人Fc多肽的基因杂交的核酸编码的Fc变体(和包含这些变体的蛋白质)。高严谨条件是本领域已知的；参见例如美国专利6,875,846，在此引入作为参考，特别是对于高严谨条件。编码人Fc多肽的基因通常为更大基因的片段，且也是本领域已知的，以及由于遗传密码的简并性而将编码天然发生的Fc多肽的基因，即便其本身不是天然发生的。
本发明的另一方面是提供展示改变的ADCC活性，特别是增强的ADCC活性的变体Fc多肽。在有些方面，这些变体包含位置239的氨基酸替代，任选位置239和332的氨基酸替代，且任选可以包含上述单一变体组中概括的任何其它替代，以构建包含多重替代的变体。
本发明的又一目的是提供本文已经表征的Fc变体，其中所述Fc变体选自下组：D221K、D221Y、K222E、K222Y、T223E、T223K、H224E、H224Y、T225E、T225K、T225W、P227E、P227G、P227K、P227Y、P228E、P228G、P228K、P228Y、P230A、P230A/E233D、P230A/E233D/I332E、P230E、P230G、P230Y、A231E、A231G、A231K、A231P、A231Y、P232E、P232G、P232K、P232Y、E233A、E233D、E233F、E233G、E233H、E233I、E233K、E233L、E233M、E233N、E233Q、E233R、E233S、E233T、E233V、E233W、E233Y、L234A、L234D、L234E、L234F、L234G、L234H、L234I、L234I/L235D、L234K、L234M、L234N、L234P、L234Q、L234R、L234S、L234T、L234V、L234W、L234Y、L235A、L235D、L235D/S239D/A330Y/I332E、L235D/S239D/N297D/I332E、L235E、L235F、L235G、L235H、L235I、L235K、L235M、L235N、L235P、L235Q、L235R、L235S、L235T、L235V、L235W、L235Y、G236A、G236D、G236E、G236F、G236H、G236I、G236K、G236L、G236M、G236N、G236P、G236Q、G236R、G236S、G236T、G236V、G236W、G236Y、G237D、G237E、G237F、G237H、G237I、G237K、G237L、G237M、G237N、G237P、G237Q、G237R、G237S、G237T、G237V、G237W、G237Y、P238D、P238E、P238F、P238G、P238H、P238I、P238K、P238L、P238M、P238N、P238Q、P238R、P238S、P238T、P238V、P238W、P238Y、S239D、S239D/A330L/I332E、S239D/A330Y/I332E/L234I、S239D/A330Y/I332E/V266I、S239D/D265F/N297D/I332E、S239D/D265H/N297D/I332E、S239D/D265I/N297D/I332E、S239D/D265L/N297D/I332E、S239D/D265T/N297D/I332E、S239D/D265Y/N297D/I332E、S239D/E272I/A330L/I332E、S239D/E272I/I332E、S239ID/E272K/A330L/I332E、S239D/E272K/I332E、S239D/E272S/A330L/I332E、S239D/E272S/I332E、S239D/E272Y/A330L/I332E、S239D/E272Y/I332E、S239D/F241S/F243H/V262T/V264T/N297D/A330Y/I332E、S239D/H268D、S239D/H268E、S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/I332E/A327D、S239D/I332E/A330I、S239D/I332E/A330Y、S239D/I332E/E272H、S239D/I332E/E272R、S239D/I332E/E283H、S239D/I332E/E283L、S239D/I332E/G236A、S239D/I332E/G236S、S239D/I332E/H268D、S239D/I332E/H268E、S239D/I332E/K246H、S239D/I332E/R255Y、S239D/I332E/S267E、S239D/I332E/V264I、S239D/I332E/V264I/A330L、S239D/I332E/V264I/S298A、S239D/I332E/V284D、S239D/I332E/V284E、S239D/I332E/V284E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239D/K274E/A330L/I332E、S239D/K274E/I332E、S239D/K326E/A330L/I332E、S239D/K326E/A330Y/I332E、S239D/K326E/I332E、S239D/K326T/A330Y/I332E、S239D/K326T/I332E、S239D/N297D/A330Y/I332E、S239D/N297D/I332E、S239D/N297D/K326E/I332E、S239D/S267E/A330L/I332E、S239D/S267E/I332E、S239D/S298A/K326E/I332E、S239D/S298A/K326T/I332E、S239D/V240I/A330Y/I332E、S239D/V264T/A330Y/I332E、S239D/Y278T/A330L/I332E、S239D/Y278T/I332E、S239E、S239E/D265G、S239E/D265N、S239E/D265Q、S239E/I332D、S239E/I332E、S239E/I332N、S239E/I332Q、S239E/N297D/I332E、S239E/V264I/A330Y/I332E、S239E/V264I/I332E、S239E/V264I/S298A/A330Y/I332E、S239F、S239G、S239H、S239I、S239K、S239L、S239M、S239N、S239N/I332D、S239N/I332E、S239N/I332E/A330L、S239N/I332E/A330Y、S239N/I332N、S239N/I332Q、S239P、S239Q、S239Q/I332D、S239Q/I332E、S239Q/I332N、S239Q/I332Q、S239Q/V264I/I332E、S239R、S239T、S239V、S239W、S239Y、V240A、V240I、V240I/V266I、V240M、V240T、F241D、F241E、F241E/F243Q/V262T/V264E/I332E、F241E/F243Q/V262T/V264E、F241E/F243R/V262E/V264R/I332E、F241E/F243R/V262E/V264R、F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E、F241E/F243Y/V262T/V264R、F241L、F241L/F243L/V262I/V264I、F241L/V262I、F241R/F243Q/V262T/V264R/I332E、F241R/F243Q/V262T/V264R、F241W、F241W/F243W、F241W/F243W/V262A/V264A、F241Y、F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E、F241Y/F243Y/V262T/V264T、F243E、F243L、F243L/V262I/V264W、F243L/V264I、F243W、P244H、P244H/P245A/P247V、P245A、K246D、K246E、K246H、K246Y、P247G、P247V、D249H、D249Q、D249Y、R255E、R255Y、E258H、E258S、E258Y、T260D、T260E、T260H、T260Y、V262E、V262F、V263A、V263I、V263M、V263T、V264A、V264D、V264E、V264E/N297D/I332E、V264F、V264G、V264H、V264I、V264I/A330L/I332E、V264I/A330Y/I332E、V264I/I332E、V264K、V264L、V264M、V264N、V264P、V264Q、V264R、V264S、V264T、V264W、V264Y、D265F、D265F/N297E/I332E、D265G、D265H、D265I、D265K、D265L、D265M、D265N、D265P、D265Q、D265R、D265S、D265T、D265V、D265W、D265Y、D265Y/N297D/I332E、D265Y/N297D/T299L/I332E、V266A、V266I、V266M、V266T、S267D、S267E、S267E、S267E/A327D、S267E/P331D、S267E/S324I、S267E/V282G、S267F、S267H、S267I、S267K、S267L、S267L/A327S、S267M、S267N、S267P、S267Q、S267Q/A327S、S267R、S267T、S267V、S267W、S267Y、H268D、H268E、H268F、H268G、H268I、H268K、H268L、H268M、H268P、H268Q、H268R、H268T、H268V、H268W、E269F、E269G、E269H、E269I、E269K、E269L、E269M、E269N、E269P、E269R、E269S、E269T、E269V、E269W、E269Y、D270F、D270G、D270H、D270I、D270L、D270M、D270P、D270Q、D270R、D270S、D270T、D270W、D270Y、P271A、P271D、P271E、P271F、P271G、P271H、P271I、P271K、P271L、P271M、P271N、P271Q、P271R、P271S、P271T、P271V、P271W、P271Y、E272D、E272F、E272G、E272H、E272I、E272K、E272L、E272M、E272P、E272R、E272S、E272T、E272V、E272W、E272Y、V273I、K274D、K274E、K274F、K274G、K274H、K274I、K274L、K274M、K274N、K274P、K274R、K274T、K274V、K274W、K274Y、F275L、F275W、N276D、N276E、N276F、N276G、N276H、N276I、N276L、N276M、N276P、N276R、N276S、N276T、N276V、N276W、N276Y、Y278D、Y278E、Y278G、Y278H、Y278I、Y278K、Y278L、Y278M、Y278N、Y278P、Y278Q、Y278R、Y278S、Y278T、Y278V、Y278W、Y278W、Y278W/E283R/V302I、Y278W/V302I、D280G、D280K、D280L、D280P、D280W、G281D、G281D/V282G、G281E、G281K、G281N、G281P、G281Q、G281Y、V282E、V282G、V282G/P331D、V282K、V282P、V282Y、E283G、E283H、E283K、E283L、E283P、E283R、E283R/V302I/Y278W/E283R、E283Y、V284D、V284E、V284L、V284N、V284Q、V284T、V284Y、H285D、H285E、H285K、H285Q、H285W、H285Y、N286E、N286G、N286P、N286Y、K288D、K288E、K288Y、K290D、K290H、K290L、K290N、K290W、P291D、P291E、P291G、P291H、P291I、P291Q、P291T、R292D、R292E、R292T、R292Y、E293F、E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本发明的又一目的是提供以更高亲和力结合一种或多种FcγR的Fc变体。在一个实施方案中，所述Fc变体具有比亲本Fc多肽高1倍以上的对FcγR的亲和力。在一个备选的实施方案中，所述Fc变体具有比亲本Fc多肽高5倍以上的对FcγR的亲和力。在一个优选的实施方案中，所述Fc变体具有比亲本Fc多肽高约5倍与300倍之间的对FcγR的亲和力。
本发明的又一目的是提供具有大于1∶1的FcγRIIIa倍数∶FcγRIIb倍数比的Fc变体。在一个实施方案中，所述Fc变体具有大于11∶1的FcγRIIIa倍数∶FcγRIIb倍数比。在一个优选的实施方案中，所述Fc变体具有11∶1与86∶1之间的FcγRIIIa倍数∶FcγRIIb倍数比。
本发明的又一目的是提供在存在效应细胞时更有效的介导效应器功能的Fc变体。在一个实施方案中，所述Fc变体介导ADCC，其大于由亲本Fc多肽介导的ADCC。在一个优选的实施方案中，所述Fc变体介导ADCC，其比由亲本Fc多肽介导的ADCC大5倍以上。在一个多半优选的实施方案中，所述Fc变体介导ADCC，其比由亲本Fc多肽介导的ADCC大5倍与1000倍之间。
本发明的又一目的是提供以更弱亲和力结合一种或多种FcγR的Fc变体。本发明的又一目的是提供在存在效应细胞时以更低效率介导ADCC的Fc变体。
本发明的又一目的是提供与无糖基化形式的亲本Fc多肽相比具有改善的功能和/或溶解特性的Fc变体。本文改善的功能性包括但不限于对Fc配体的结合亲和力。本文改善的溶解特性包括但不限于稳定性和溶解度。在一个实施方案中，所述Fc变体以糖基化形式亲本Fc多肽的约0.5倍内的亲和力结合FcγR。在一个备选的实施方案中，所述无糖基化Fc变体以与糖基化亲本Fc多肽可比的亲和力结合FcγR。在一个备选的实施方案中，所述Fc变体以高于糖基化形式亲本Fc多肽的亲和力结合FcγR。
本发明还提供了改造优化的Fc变体的方法。本发明的又一目的是提供用于获得优化的Fc变体的试验性生产和筛选方法。
本发明提供了编码本文描述的Fc变体的分离核酸。本发明提供了包含所述核酸的载体，任选的是所述核酸与控制序列可操作连接。本发明提供了包含所述载体的宿主细胞，以及用于生产和任选回收Fc变体的方法。
本发明提供了新的Fc多肽，包括抗体、Fc融合物、分离的Fc、和Fc片段，其包含本文公开的Fc变体。所述新的Fc多肽可用于治疗性产品。
本发明提供了包含Fc多肽和生理学或制药学可接受载体或稀释剂的组合物，所述Fc多肽包含本文描述的Fc变体。
本发明设想了Fc多肽的治疗和诊断用途，所述Fc多肽包含本文公开的Fc变体。
附图简述
图1.抗体结构与功能。显示了全长人IgG1抗体的模型，它是使用来自pdb登录号1CE1(James et al.，1999，J Mol Biol 289：293-301)的人源化Fab结构和来自pdb登录号1DN2(DeLano et al.，2000，Science 287：1279-1283)的人IgG1Fc结构建模的。没有显示连接Fab和Fc区的柔性铰链。IgG1是异二聚体的同二聚体，由两条轻链和两个重链组成。标示了构成所述抗体的Ig结构域，包括轻链的VL和CL，以及重链的VH、C伽马1(Cγ1)、C伽马2(Cγ2)、和C伽马3(Cγ3)。标示了Fc区。标示了相关蛋白质的结合位点，包括可变区中的抗原结合位点，以及Fc区中FcγR、FcRn、C1q及蛋白质A和G的结合位点。
图2.Fc/FcγRIIIb复合物结构1IIS。Fc显示为灰色条带图样，而FcγRIIIb显示为黑色条带。N297碳水化合物显示为黑色棒状。
图3a-3b.人IgG免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4的氨基酸序列的比对。图3a提供了CH1(Cγ1)和铰链结构域的序列，而图3b提供了CH2(Cγ2)和CH3(Cγ3)结构域的序列。根据IgG1序列的EU索引为位置编号，而IgG1与其它免疫球蛋白IgG2、IgG3、和IgG4之间的差异以灰色显示。在许多位置存在多态性(Kim et al.，2001，J.Mol.Evol.54：1-9)，因此在所呈现的序列和现有技术中的序列之间可能存在微小差异。标示了Fc区可能的起点，本文定义为EU位置226或230。
图4.在本发明的Fc变体中进行氨基酸修饰的残基，定位到Fc/FcγRIIIb复合物结构1IIS上。Fc显示为灰色条带图样，而FcγRIIIb显示为黑色条带。试验文库残基显示为黑色，N297碳水化合物显示为灰色。
图5.293T细胞中alemtuzumab的Fc变体和野生型(WT)蛋白质的表达。包含alemtuzumab重链基因(WT或变体)的质粒与包含alemtuzumab轻链基因的质粒共转染。转染后5天收获培养基。对于每个转染的样品，将10ul培养基上样到SDS-PAGE凝胶上用于Western分析。用于Western的探针为缀合有过氧化物酶的山羊抗人IgG(Jackson Immuno-Research，catalog#109-035-088)。WT：野生型alemtuzumab；1-10：alemtuzumab变体。H和L分别指抗体重链和轻链。
图6.用蛋白质A层析纯化alemtuzumab。在293T细胞中表达WTalemtuzumab蛋白质，并在转染后5天收获培养基。用PBS 1∶1稀释所述培养基，并用蛋白质A(Pierce，Catalog#20334)纯化。O：纯化前的原始样品；FT：流出液(floW through)；E：洗脱液；C：浓缩的最终样品。左图显示了简单蓝染色的SDS-PAGE凝胶，而右图显示了用缀合有过氧化物酶的山羊抗人IgG标记的western印迹。
图7.脱糖基化抗体的生产。在293T细胞中表达alemtuzumab的野生型和变体，并用蛋白质A层析纯化。将抗体与肽-N-糖苷酶(PNGase F)在37℃保温24小时。对于每种抗体，平行操作模拟处理样品(-PNGase F)。WT：野生型alemtuzumab；#15、#16、#17、#18、#22：分别为alemtuzumab变体F241E/F243R/V262E/V264R、F241E/F243Q/V262T/V264E、F241R/F243Q/V262T/V264R、F241E/F243Y/V262T/V264R、和I332E。PNGaseF处理样品较之模拟处理样品的迁移更快代表重链脱糖基化。
图8.由293T细胞表达的alemtuzumab结合其抗原。在IPTG诱导下，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达与GST融合的抗原性CD52肽。未诱导的和诱导的样品均在SDS-PAGE凝胶上跑电泳，并转移至PVDF膜。为进行western分析，将来自Sotec(a-CD52，Sotec)(终浓度2.5ng/ul)的alemtuzumab或经转染293T细胞的培养基(Campath，Xencor)(alemtuzumab终浓度大约0.1-0.2ng/ul)用作一抗，而将缀合有过氧化物酶的山羊抗人IgG用作二抗。M：染色前标记；U：GST-CD52的未诱导样品；I：GST-CD52的诱导样品。
图9.人V158FcγRIIIa胞外区的表达和纯化。在293T细胞中转染带标签的FcγRIIIa，3天后收获含有分泌的FcγRIIIa的培养基并用亲和层析纯化。1：培养基；2：流出液；3：洗涤液；4-8：系列洗脱液。显示了简单蓝染色的SDS-PAGE凝胶和western二者结果。为进行western印迹，用抗GST抗体探查膜。
图10.通过AlphaScreenTM测定法测定的从试验文库挑选的alemtuzumab Fc变体与人V158FcγRIIIa的结合，描述于实施例2。在存在竞争物抗体(Fc变体或WT alemtuzumab)时，通过发光信号降低观测到特征性抑制曲线。磷酸盐缓冲盐水(PBS)单独用作阴性对照。对于每条特定曲线，将结合数据标准化为最大和最小发光信号，其分别由低和高抗体浓度时的基线所提供。曲线呈现了采用非线性回归时所述数据对单一位点竞争模型(one site competition model)的拟合。这些拟合为每种抗体提供了IC50，对于WT和S239D，以点线显示。
图11a和11b.显示挑选的alemtuzumab(图11a)和trastuzumab(图11b)Fc变体与人Val158FcγRIIIa结合的AlphaScreen测试。对于每种特定抗体，所述结合数据标准化为上下基线，而曲线呈现了所述数据与单一位点竞争模型的拟合。PBS用作阴性对照。
图12.显示挑选的alemtuzumab Fc变体与人FcγRIIb结合的AlphaScreen测试。对于每种特定抗体，所述结合数据标准化为上下基线，而曲线呈现了所述数据与单一位点竞争模型的拟合。PBS用作阴性对照。
图13.显示挑选的alemtuzumab Fc变体与人R131 FcγRIIa结合的AlphaScreen测试。对于每种特定抗体，所述结合数据标准化为上下基线，而曲线呈现了所述数据与单一位点竞争模型的拟合。
图14.测量挑选的alemtuzumab Fc变体与人FcRn结合的AlphaScreen测试，描述于实施例2。对于每种特定抗体，所述结合数据标准化为上下基线，而曲线呈现了所述数据与单一位点竞争模型的拟合。PBS用作阴性对照。
图15.测量挑选的alemtuzumab Fc变体与细菌蛋白质A结合的AlphaScreen测试，描述于实施例2。对于每种特定抗体，所述结合数据标准化为上下基线，而曲线呈现了所述数据与单一位点竞争模型的拟合。PBS用作阴性对照。
图16a-16b.比较挑选的alemtuzumab Fc变体与人V158FcγRIIIa(图16a)和人FcγRIIb(图16b)结合的AlphaScreen测试。对于每种特定抗体，所述结合数据标准化为上下基线，而曲线呈现了所述数据与单一位点竞争模型的拟合。PBS用作阴性对照。
图17a-17b.测量trastuzumab的背景中挑选的Fc变体与人V158FcγRIIIa(图17a和17b)和人FcγRIIb(图17c)结合的AlphaScreen测试。对于每种特定抗体，所述结合数据标准化为上下基线，而曲线呈现了所述数据与单一位点竞争模型的拟合。PBS用作阴性对照。
图18.测量rituximab的背景中挑选的Fc变体与人V158 FcγRIIIa结合的AlphaScreen测试。对于每种特定抗体，所述结合数据标准化为上下基线，而曲线呈现了所述数据与单一位点竞争模型的拟合。PBS用作阴性对照。
图19.测量cetuximab的背景中挑选的Fc变体与人V158 FcγRIIIa结合的AlphaScreen测试。对于每种特定抗体，所述结合数据标准化为上下基线，而曲线呈现了所述数据与单一位点竞争模型的拟合。PBS用作阴性对照。
图20a-20b.显示挑选的alemtuzumab Fc变体与人FcγRIIIa的V158(图20a)和F158(图20b)同种异型结合的AlphaScreen测试。对于每种特定抗体，所述结合数据标准化为上下基线，而曲线呈现了所述数据与单一位点竞争模型的拟合。PBS用作阴性对照。
图21a-21d.图21a和21b显示了来自挑选的alemtuzumab Fc变体与V158 FcγRIIIa(图21a)和F158 FcγRIIIa(图21b)的结合，SPR Kd与AlphaScreen IC50之间的相关性。图21c和21d显示了对于挑选的alemtuzumab Fc变体与V158 FcγRIIIa(图21c)和F158 FcγRIIIa(图21d)的结合，较之WT的SPR和AlphaScreen倍数提高之间的相关性。结合数据列于表3。数据中的线代表数据的线性拟合，r2值指示这些拟合的显著性。
图22a和22b.显示挑选的alemtuzumab Fc变体与人V158 FcγRIIIa结合的AlphaScreen测试。对于每种特定抗体，所述结合数据标准化为上下基线，而曲线呈现了所述数据与单一位点竞争模型的拟合。PBS用作阴性对照。
图23a-23b.alemtuzumab的背景中挑选的Fc变体基于细胞的ADCC测试。使用DoHH-2淋巴瘤靶细胞和50倍过量的人PBMC，利用基于
EuTDA的细胞毒性测定法(Perkin Elmer，MA)测量ADCC，描述于实施例3。图23a的条形图显示了指定alemtuzumab抗体于10ng/ml时的原始荧光数据。PBMC条指示不存在抗体时细胞毒性的基础水平。图23b显示了对于指定的alemtuzumab抗体，ADCC对抗体浓度的剂量依赖，对于每一条特定曲线，标准化至最小和最大荧光信号，其分别由低和高抗体浓度时的基线所提供。曲线呈现了采用非线性回归时所述数据与S形剂量-反应模型的拟合。
图24a-24c.trastuzumab的背景中挑选的Fc变体基于细胞的ADCC测试。使用BT474和Sk-Br-3乳癌靶细胞和50倍过量的人PBMC，利用基于
EuTDA的细胞毒性测定法测量ADCC，描述于实施例3。图24a的条形图显示了指定trastuzumab抗体于1ng/ml时的原始荧光数据。PBMC条指示不存在抗体时细胞毒性的基础水平。图24b和24c显示了对于指定的trastuzumab抗体，ADCC对抗体浓度的剂量依赖，对于每一条特定曲线，标准化至最小和最大荧光信号，其分别由低和高抗体浓度时的基线所提供。曲线呈现了采用非线性回归时所述数据与S形剂量-反应模型的拟合。
图25a-25c.rityximab的背景中挑选的Fc变体基于细胞的ADCC测试。使用WIL2-S淋巴瘤靶细胞和50倍过量的人PBMC，利用基于
EuTDA的细胞毒性测定法测量ADCC，描述于实施例3。图25a的条形图显示了指定的rituximab抗体于1ng/ml时的原始荧光数据。PBMC条指示不存在抗体时细胞毒性的基础水平。图25b和25c显示了对于指定的rituximab抗体，ADCC对抗体浓度的剂量依赖，对于每一条特定曲线，标准化至最小和最大荧光信号，其分别由低和高抗体浓度时的基线所提供。曲线呈现了采用非线性回归时所述数据与S形剂量-反应模型的拟合。
图26a-26b.显示效力和功效增强的挑选的trastuzumab(图26a)和rituximab(图26b)Fc变体基于细胞的ADCC测试。两项测试均使用纯合F158/F158 FcγRIIIa PBMC作为效应细胞且25倍过量于靶细胞，靶细胞对于trastuzumab测试为Sk-Br-3细胞而对于rituximab测试为WIL2-S细胞。数据依据所述测试的绝对最小裂解和所述测试的绝对最大裂解标准化，所述绝对最小裂解由仅存在PBMC(无抗体)时靶细胞的荧光信号提供，所述绝对最大裂解由存在Triton X1000时靶细胞的荧光信号提供，描述于实施例3。
图27.显示挑选的alemtuzumab Fc变体与人V158 FcγRIIIa结合的AlphaScreen测试。对于每种特定抗体，所述结合数据标准化为上下基线，而曲线呈现了所述数据与单一位点竞争模型的拟合。PBS用作阴性对照。
图28.ADCC。与WT trastuzumab相比，挑选的Fc变体trastuzumab抗体基于细胞的ADCC测试。使用纯化的人外周血单核细胞(PBMC)作为效应细胞，而使用Sk-Br-3乳癌细胞作为靶细胞。通过使用细胞毒性检测试剂盒(LDH，Roche Diagnostic Corporation，Indianapolis，IN)测量LDH活性来监测裂解。样品运行三份以提供误差评估(n＝3，+/-S.D.)。该图显示了不同抗体浓度时ADCC的剂量依赖，对于所述测试，标准化为最小和最大裂解水平。曲线呈现了采用非线性回归时所述数据与S形剂量-反应模型的拟合。
图29a-29b.针对表达不同水平Her2/neu靶抗原的不同细胞系，挑选的trastuzumab Fc变体基于细胞的ADCC测试。ADCC测定法如实施例5所述进行，利用表达放大至低水平Her2/neu受体的不同细胞系，包括Sk-Br-3(1×106个拷贝)、SkOV3(～1×105)、OVCAR3(～1×104)、和MCF-7(～3×103个拷贝)。图29a提供了显示每种细胞系Her2表达水平的western印迹；将等量细胞溶解产物上样到SDS-PAGE凝胶上，并用trastuzumab检测Her2。以25倍过量于靶细胞使用同种异型为纯合F158/F158 FcγRIIIa的人PBMC。图29b的条形图提供了WT和Fc变体针对指定细胞系的ADCC数据，标准化为由最小裂解(仅PBMC)和最大裂解(Triton X1000)提供的最小和最大荧光信号。
图30.trastuzumab的背景中挑选的Fc变体基于细胞的ADCC测试，其中使用天然杀伤(NK)细胞作为效应细胞，并测量LDH释放以监测细胞裂解。同种异型为杂合F158/F158 FcγRIIIa的NK细胞4倍过量于Sk-Br-3乳癌靶细胞，并使用LDH细胞毒性检测试剂盒按照厂商的方案(Roche DiagnosticsGmbH，Penzberg，Germany)测量细胞毒性水平。该图显示了对于指定的trastuzumab抗体，ADCC对抗体浓度的剂量依赖，对于每一条特定曲线，标准化至最小和最大荧光信号，其分别由低和高抗体浓度时的基线所提供。曲线呈现了采用非线性回归时所述数据与S形剂量-反应模型的拟合。
图31.挑选的变体基于细胞的ADCP测试。采用与流式细胞术偶联的共标记策略，如实施例7所述进行ADCP测定法。使用分化的巨噬细胞作为效应细胞，而使用Sk-Br-3细胞作为靶细胞。吞噬百分比指共标记细胞(巨噬细胞+Sk-Br-3)相对于群体中Sk-Br-3总数(吞噬的+未吞噬的)的数目。
图32a-32c.挑选的Fc变体介导补体结合与活化的能力。图32a显示了测量挑选的alemtuzumab Fc变体结合C1q的AlphaScreen测试。对于每种特定抗体，所述结合数据标准化为上下基线，而曲线呈现了所述数据与单一位点竞争模型的拟合。图32b和31c显示了基于细胞的测试，它测量挑选的rituximab Fc变体介导CDC的能力。使用Alamar Blue实施CDC测定法，以监测人血清补体(Quidel，San Diego，CA)对经过Fc变体和WT rituximab调理的WIL2-S淋巴瘤细胞的裂解。对于指定的rituximab抗体，显示了补体介导的裂解对抗体浓度的剂量依赖，对于每一条特定曲线，标准化至最小和最大荧光信号，其分别由低和高抗体浓度时的基线所提供。曲线呈现了采用非线性回归时所述数据与S形剂量-反应模型的拟合。
图33a-33c.猕猴(macaque)中由Fc变体增强的B细胞损耗，描述于实施例9。图33a显示了用抗CD20WT和S239D/I332E rituximab抗体处理期间，食蟹猴(Macaca Fascicularis)体内残余的B细胞百分比，利用标志物CD20+和CD40+测得。图33b显示了处理期间猴子体内残余的天然杀伤(NK)细胞百分比，利用标志物CD3-/CD16+和CD3-/CD8+测得。图33c显示了CD20+B细胞水平对S239D/I332E rituximab处理的剂量反应。数据以3只猴子/样品的平均值提供。
图34a和34b.测量挑选的alemtuzumab(图34a)和trastuzumab(图34b)Fc变体与小鼠FcγRIII结合的AlphaScreen测试，描述于实施例10。对于每种特定抗体，所述结合数据标准化为上下基线，而曲线呈现了所述数据与单一位点竞争模型的拟合。PBS用作阴性对照。
图35.trastuzumab背景中挑选的Fc变体基于细胞的ADCC测试，其中使用小鼠PBMC作为效应细胞。利用基于
EuTDA的细胞毒性测定法测量ADCC，其中使用Sk-Br-3乳癌靶细胞和8倍过量的小鼠PBMC。该条形图显示了指定trastuzumab抗体于10ng/ml时的原始荧光数据。PBMC条指示不存在抗体时细胞毒性的基础水平，而TX指示存在Triton X1000时的完全细胞裂解。
图36.测量在293T和CHO细胞中表达的挑选的trastuzumab Fc变体结合人V158 FcγRIIIa的AlphaScreen测试，描述于实施例11。对于每种特定抗体，所述结合数据标准化为上下基线，而曲线呈现了所述数据与单一位点竞争模型的拟合。PBS用作阴性对照。
图37a-37b.Fc变体与改造糖型的协同作用。图37a呈现了AlphaScreen测试，显示293T、CHO、和Lec-13CHO细胞中表达的WT和Fc变体(V209、S239/I332E/A330L)trastuzumab对V158 FcγRIIIa结合。对于每种抗体，所述结合数据标准化为上下基线，而曲线呈现了所述数据与单一位点竞争模型的拟合。PBS用作阴性对照。图37b呈现了基于细胞的ADCC测试，显示239T、CHO、和Lec-13CHO表达的WT和V209 trastuzumab介导ADCC的能力。用Sk-Br-3乳癌靶细胞，利用前述基于
EuTDA的细胞毒性测定法测量ADCC。所述数据显示了对于指定trastuzumab抗体，ADCC对抗体浓度的剂量依赖，对于每一条特定曲线，标准化至最小和最大荧光信号，其分别由低和高抗体浓度时的基线所提供。曲线呈现了采用非线性回归时所述数据与S形剂量-反应模型的拟合。
图38.显示无糖基化alemtuzumab Fc变体与人V158 FcγRIIIa结合的AlphaScreen测试。对于每种特定抗体，所述结合数据标准化为上下基线，而曲线呈现了所述数据与单一位点竞争模型的拟合。PBS用作阴性对照。
图39.比较挑选的糖基化(实心符号，实线)和脱糖基化(空心符号，点线)alemtuzumab Fc变体结合人V158 FcγRIIIa的AlphaScreen测试。对于每种特定抗体，所述结合数据标准化为上下基线，而曲线呈现了所述数据与单一位点竞争模型的拟合。
图40a-40c.显示改善的抗CD20抗体的序列。rituximab的轻链和重链序列分别列于图40a和图40b，由US 5,736,137的翻译序列3获得。图40b中的相关位置以粗体显示，包括S239、V240、V264I、H268、E272、K274、N297、S298、K326、A330、和I332。图40c显示了改善的抗CD20抗体重链序列，可变位置以粗体表示并指定为X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、Z1、和Z2。序列下面的表提供了这些位置可能的替代。改善的抗CD20抗体序列至少包含一个选自X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、和X9可能替代的非WT氨基酸。这些改善的抗CD20抗体序列还可包含替代Z1和/或Z2。这些位置按照Kabat中的EU索引编号，因此与所述序列中的先后顺序不对应。
图41描绘了构建并经实验测试的一组Fc变体。
图42描绘了SEQ ID NO：5；特定的Xaa残基如表10所示。
发明详述
为了更完全的理解本发明，下文列出了一些定义。这些定义意味着涵盖语法等同物。
本文所用“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞的裂解。
本文所用“ADCP”或抗体依赖性细胞介导的吞噬指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞的吞噬。
本文“氨基酸修饰”指多肽序列中的氨基酸替代、***、和/或删除。本文优选的氨基酸修饰是替代。本文“氨基酸替代”或“替代”指用另一种氨基酸置换亲本多肽序列中特定位置的一种氨基酸。例如，替代I332E指位置332的异亮氨酸替换为谷氨酸的变体多肽，此处指Fc变体。在有些实施方案中，不需要确定WT类别。例如，替代332E指位置332突变为谷氨酸的变体多肽。
本文“抗体”指由一种或多种多肽组成的蛋白质，其中所述多肽基本上由整个或部分公认的免疫球蛋白基因编码。所述公认的免疫球蛋白基因，例如在人中，包括卡帕(κ)、拉姆达(λ)、和重链遗传基因座，其共同包含无数的可变区基因，以及恒定区基因谬(μ)、德尔塔(δ)、伽马(γ)、西格马(σ)、和阿尔法(α)，其分别编码IgM、IgD、IgG、IgE、和IgA同种型。本文抗体意图包括全长抗体和抗体片段，并且可以指来自任何生物体的天然抗体、改造抗体、或用于试验、治疗、或下文进一步定义的其它目的的重组生产的抗体。术语“抗体”包括本领域已知的抗体片段，诸如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv、或抗体的其它抗原结合子序列，或是通过修饰完整抗体而生成的或是利用重组DNA技术从头合成的。特别优选包括本文描述的Fc变体的全长抗体。术语“抗体”包括单克隆和多克隆抗体。抗体可以是拮抗剂、激动剂、中和性的、抑制性的、或刺激性的。本发明的抗体可以是非人的、嵌合的、人源化的、或完全是人的，如下文更详细描述的。
“抗体”的定义明确包括无糖基化的抗体。本文所用“无糖基化抗体”指缺乏附着于Fc区位置297的碳水化合物的抗体，其中编号依照Kabat的EU***。所述无糖基化抗体可以是脱糖基化抗体，即已经例如化学或酶学去除了Fc碳水化合物的抗体。或者，所述无糖基化抗体可以是非糖基化或未糖基化抗体，即表达时就没有Fc碳水化合物的抗体，例如通过突变编码糖基化样式的一个或多个残基或者通过在不将碳水化合物附着于蛋白质的生物体例如细菌中表达。
“抗体”的定义明确包括包含Fc变体部分的全长抗体。本文“全长抗体”指构成天然生物学形式抗体的结构，包括可变区和恒定区。例如，在大多数哺乳动物包括人和小鼠中，IgG类的全长抗体为四聚体，由两对相同的两条免疫球蛋白链组成，每一对具有一条轻链和一条重链，每条轻链包含免疫球蛋白结构域VL和CL，每条重链包含免疫球蛋白结构域VH、Cγ1(CH1)、Cγ2(CH2)、和Cγ3(CH3)。在有些哺乳动物中，例如在骆驼和美洲驼(llama)中，IgG抗体可以仅由两条重链组成，每条重链包含附着于Fc区的可变区。本文所用“IgG”指属于基本上由公认的免疫球蛋白伽马基因编码的抗体类别的多肽。在人类中，此类别包含IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4。在小鼠中，此类别包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。
本文所用“氨基酸”和“氨基酸种类(identity)”指20种天然发生的氨基酸之一，或者可能存在于特定的确定位置的任何非天然类似物。本文“蛋白质”指至少两个共价附着的氨基酸，包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。蛋白质可以由天然发生的氨基酸和肽键组成，或者由合成的肽模拟物结构即“类似物”诸如类肽(peptoid)组成(参见Simon et al.，1992，Proc Natl Acad Sci USA89(20)：9367，引入作为参考)，特别是当要为患者施用LC肽时。因此本文所用“氨基酸”、或“肽残基”指天然发生的和合成的两种氨基酸。例如，为了本发明目的，认为高苯丙氨酸(homophenylalanine)、瓜氨酸(citrulline)和正亮氨酸(norleucine)是氨基酸。“氨基酸”还包括亚氨基酸残基，诸如脯氨酸和羟脯氨酸。侧链可以为(R)或(S)构型。在优选的实施方案中，氨基酸为(S)或L-构型。如果使用非天然发生的侧链，则可以使用例如非氨基酸替代物以防止或阻滞体内降解。
本文所用“效应器功能”指由抗体Fc区与Fc受体或配体相互作用引起的生化事件。效应器功能包括但不限于ADCC、ADCP、和CDC。本文所用“效 应细胞”指表达一种或多种Fc受体并介导一种或多种效应器功能的免疫***细胞。效应细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞、天然杀伤(NK)细胞、和γγT细胞，并且可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、和猴。本文“文库”指一组任何形式的Fc变体，包括但不限于纯化或非纯化形式的一系列核酸或氨基酸序列、可变位置的一系列核酸或氨基酸替代、包含编码文库序列的核酸的物理文库、或包含Fc变体蛋白质的物理文库。
本文所用“Fc”或“Fc区”指包含抗体恒定区但不排除第一恒定区免疫球蛋白结构域的多肽。因此，Fc指IgA、IgD、和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域以及这些结构域的柔性铰链N-末端。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，如图1所示，Fc包含免疫球蛋白结构域C伽马2和C伽马3(Cγ2和Cγ3)以及C伽马1(Cγ1)和C伽马2(Cγ2)之间的铰链。尽管Fc区的边界可以变化，但人IgG重链Fc区通常定义为包含残基C226或P230至其羧基末端，其中所述编号依照Kabat的EU索引。Fc可以指单独的该区域，或者指Fc多肽背景中的该区域，如下所述。本文所用“Fc多肽”指包含整个或部分Fc区的多肽。Fc多肽包括抗体、Fc融合物、分离的Fc、和Fc片段。
本文所用“Fc融合物”指其中一种或多种多肽或小分子与Fc区可操作连接的蛋白质或其衍生物。本文Fc融合物与现有技术中使用的术语“免疫粘附素”、“Ig融合物”、“Ig嵌合物”、和“受体球蛋白”(有时带破折号)同义(Chamowet al.，1996，Trends Biotechnol 14：52-60；Ashkenazi et al.，1997，Curr OpinImmunol 9：195-200，引入作为参考)。Fc融合物将免疫球蛋白的Fc区与融 合伴侣组合起来，所述融合伴侣通常可以为任何蛋白质或小分子。Fc融合物的非Fc部分即融合伴侣的作用可以是介导靶物结合，因此其在功能上类似于抗体的可变区。
本文所用“Fc伽马受体”或“FcγR”指结合IgG抗体Fc区的蛋白质家族的任何成员，其基本上由FcγR基因编码。在人类中，该家族包括但不限于FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb、和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)、和FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)，以及任何未发现的人FcγR或FcγR同种型或同种异型。FcγR可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)、和FcγRIII-2(CD16-2)、以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型或同种异型。
本文所用“Fc配体”或“效应器配体”指来自任何生物体的结合抗体Fc区以形成Fc/Fc配体复合物的分子，优选多肽。Fc配体与Fc的结合优选引发一种或多种效应器功能。Fc配体包括但不限于Fc受体，FcγR、FcαR、FcεR、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白质A、链球菌蛋白质G、和病毒FcγR。Fc配体还包括Fc受体同系物(FcRH)，其为与FcγR同源的Fc受体家族(Davis et al.，2002，Immunological Reviews190：123-136，引入作为参考)。Fc配体可以包括结合Fc的未发现的分子。
本文所用“IgG”指属于基本上由公认的免疫球蛋白伽马基因编码的抗体类别的多肽。在人类中，此类别包含IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4。在小鼠中，此类别包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。本文“免疫球蛋白(Ig)”指由基本上由免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。免疫球蛋白包括但不限于抗体。免疫球蛋白可以具有许多结构形式，包括但不限于全长抗体、抗体片段、和各个免疫球蛋白结构域。本文“免疫球蛋白(Ig)结构域”指免疫球蛋白的区域，其作为蛋白质结构领域熟练技术人员确认的独特结构实体存在。Ig结构域典型的具有特征性β-三明治折叠拓扑学。IgG类抗体中已知的Ig结构域为VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL、和CL。
本文所用“亲本多肽”或“前体多肽”(包括Fc亲本或前体)指随后遭到修饰以生成变体的多肽。所述亲本多肽可以是天然发生的多肽，或者是天然发生的多肽的变体或改造型式。亲本多肽可以指多肽本身、包含所述亲本多肽的组合物、或者编码它的氨基酸序列。相应的是，本文所用“亲本Fc 多肽”指进行修饰以生成变体的Fc多肽，本文所用“亲本抗体”指进行修饰以生成变体抗体的抗体。
如上文所概括的，Fc分子的某些位置可以改变。本文所用“位置”指蛋白质序列中的定位。位置可以连续编号，或者依照已确定的格式，例如Kabat中的EU索引。例如，位置297指人抗体IgG1中的位置。相应位置通常通过与其它亲本序列比对来确定，如上文所概括的。
本文所用“残基”指蛋白质中的位置及其相关的氨基酸种类。例如，天冬酰胺297(也称为Asn297，还称为N297)为人抗体IgG1中的残基。
本文所用“靶抗原”指由给定抗体可变区特异性结合的分子。靶抗原可以是蛋白质、碳水化合物、脂质、或其它化学合成物。
本文所用“靶细胞”指表达靶抗原的细胞。
本文所用“可变区”指包含一种或多种Ig结构域的免疫球蛋白区域，所述一种或多种Ig结构域基本上分别由构成卡帕、拉姆达、和重链免疫球蛋白遗传基因座的任何Vκ、Vλ、和/或VH基因编码。
本文所用“变体多肽”指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本多肽序列的多肽序列。该亲本多肽可以是天然发生的或野生型(WT)多肽，或者可以是WT多肽的修饰型式。变体多肽可以指多肽本身、包含所述多肽的组合物、或者编码它的氨基酸序列。优选的是，与亲本多肽相比，所述变体多肽具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比约一个至约十个氨基酸修饰，优选约一个至约五个氨基酸修饰。本文变体多肽序列优选与亲本多肽序列拥有至少约80％的同源性，最优选至少约90％的同源性，更优选至少约95％的同源性。相应的是，本文所用“Fc变体”指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本Fc序列的Fc序列。Fc变体可以仅包含Fc区，或者可以在抗体、Fc融合物、分离的Fc、Fc片段、或基本上由Fc编码的其它多肽的背景中存在。Fc变体可以指Fc多肽本身、包含Fc变体多肽的组合物、或者编码它的氨基酸序列。
本发明的Fc变体依照构成它们的氨基酸修饰定义。这样，例如I332E为相对于亲本Fc多肽具有替代I332E的Fc变体。同样，S239D/A330L/I332E(也称为239D/330L/332E)定义相对于亲本Fc多肽具有替代S239D、A330L、和I332E(239D、330L、和332E)的Fc变体。注意其中提供替代的顺序是任意的，也就是说，例如S239D/A330L/I332E为与S239D/I332E/A330L等等相同的Fc变体。对于本发明中讨论的所有位置，编号均依照EU索引或EU编号方案(Kabat et al.，1991，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，5th Ed.，United States Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，引入作为参考)。EU索引或Kabat中的EU索引指EU抗体的编号(Edelman et al.，1969，Proc Natl Acad Sci USA 63：78-85，引入作为参考)。
本发明致力于可用于多种背景的优化的Fc变体。如上文所概括的，当前的抗体疗法面临许多问题。本发明提供了用于增强抗体抗肿瘤效力的有前景的手段，它通过增强其介导细胞毒性效应器功能诸如ADCC、ADCP、和CDC的能力而实现。本发明显示，具有为结合某些FcγR而优化的Fc区的抗体可以更好的介导效应器功能，并由此更有效的破坏患者的癌细胞。活化与抑制受体之间的平衡是重要的考虑事项，最理想的效应器功能可能由这样的Fc引发，所述Fc对活化受体例如FcγRI、FcγRIIa/c、和FcγRIIIa具有增强的亲和力，但对抑制性受体FcγRIIb具有减弱的亲和力。另外，由于FcγR能介导抗原呈递细胞的抗原摄取和加工，因而增强的Fc/FcγR亲和力也能提高抗体治疗剂引发适应性免疫反应的能力。例如，本申请中公开的几种突变，包括S298A、E333A、和K334A，显示对活化受体FcγRIIIa的结合增强并且对抑制性受体FcγRIIb的结合减弱。可以组合这些突变以获得显示累加的结合改善的双重和三重突变变体。一种具体的变体是S298A/E333A/K334A三重突变体，其对F158 FcγRIIIa的结合增强大约1.7倍，对FcγRIIb的结合降低5倍，且ADCC增强2.1倍。
虽然需要更强的效应器功能，但是对于有些抗体治疗剂，可能需要减弱或消除的效应器功能。对于其作用机理牵涉阻断或拮抗但不杀死携带靶抗原的细胞的治疗性抗体来说，通常就是这样的。在这些情况中，不希望损耗靶细胞，并且可能认为是副作用。例如，抗CD4抗体阻断T细胞上CD4受体的能力使它们成为有效的抗炎药，但其募集FcγR受体的能力也指导针对靶细胞的免疫攻击，导致T细胞损耗(Reddy et al.，2000，J Immunol164：1925-1933，引入作为参考)。对于放射性标记的抗体，称为放射性缀合物，和缀合有毒素的抗体，称为免疫毒素来说，效应器功能也可能是问题。这些药物可用于破坏癌细胞，但经由Fc与FcγR相互作用的免疫细胞募集将健康的免疫细胞引导到所述致命有效负载(辐射或毒素)附近，导致正常淋巴组织与靶向的癌细胞一起损耗(Hutchins et al.，1995，Proc Natl Acad Sci USA 92：11980-11984；White et al.，2001，Annu Rev Med 52：125-145，引入作为参考)。可能能够通过利用募集补体或效应细胞能力较弱的IgG同种型例如IgG2和IgG4来规避该问题。一种替***法是开发减弱或消除结合的Fc变体(Alegre et al.，1994，Transplantation 57：1537-1543；Hutchins et al.，1995，Proc Natl Acad Sci USA 92：11980-11984；Armour et al.，1999，Eur J Immunol29：2613-2624；Reddy et al.，2000，J Immunol 164：1925-1933；Xu et al.，2000，Cell Immunol 200：16-26；Shields et al.，2001，J Biol Chem 276：6591-6604)(US6,194,551；US 5,885,573；PCT WO 99/58572)，均引入作为参考。减小或消除效应器功能的一个重要考虑事项是其它重要的抗体特性不受干扰。应当改造Fc变体，不仅消除对FcγR和/或C1q的结合，还要保持抗体稳定性、溶解度、和结构完整性，以及与其它重要Fc配体诸如FcRn和蛋白质A和G相互作用的能力。
此外，本发明利用能增强Fc/FcγR亲和力和效应器功能的改造糖型。具有有利溶解特性和介导效应器功能能力的无糖基化Fc将意义重大的使上述替代性生产方法成为可能。通过克服无糖基化Fc的结构和功能缺点，可以在细菌以及转基因植物和动物中生产抗体，其免疫原性风险减弱，且具有可用于其中需要细胞毒性的临床应用诸如癌症的效应器功能。本发明描述了蛋白质工程方法用于开发具有效应器功能的稳定的可溶性Fc变体的应用。目前，本领域还不存在这样的Fc变体。
本发明的Fc变体
本发明的Fc变体可用于许多Fc多肽。包含本发明Fc变体的Fc多肽本文称为“本发明的Fc多肽”。本发明的Fc多肽包括在更大多肽的背景中包含本发明Fc变体的多肽，诸如抗体或Fc融合物。即本发明的Fc多肽包括包含本发明Fc变体的抗体和Fc融合物。本文所用“本发明的抗体”指包含本发明Fc变体的抗体。本文所用“本发明的Fc融合物”指包含本发明Fc变体的Fc融合物。本发明的Fc多肽还包括包含很少或不包含Fc区之外其他多肽序列的多肽，称为分离的Fc。本文所用“本发明的分离的Fc”指包含本发明的Fc变体，并且包含很少或不包含Fc区之外其他多肽序列的Fc多肽。本发明的Fc多肽还包括Fc区的片段。本文所用“本发明的Fc片段”指包含本发明Fc变体的Fc片段。如下所述，任何前述本发明Fc多肽可以融合一种或多种融合伴侣或缀合伴侣以提供所需功能特性。
不论亲本Fc多肽背景如何，都可以在其中构建Fc变体。也就是说，亲本Fc多肽的唯一标准是它包含Fc区。本文描述的亲本Fc多肽可以衍生自广泛的来源，并且可以基本上由来自任何生物体的一种或多种Fc基因编码，包括但不限于人，啮齿类包括但不限于小鼠和大鼠，兔类诸如兔(rabbit)和野兔(hare)，骆驼科(camelidae)诸如骆驼、美洲驼、和单峰驼，以及非人灵长类包括但不限于原猴类(Prosimian)、阔鼻猴亚目(Platyrrhini)(新世界猴)、猴型总科(Cercopithecoidea)(旧世界猴)、和人型总科(Hominoidea)包括长臂猿、较小的和巨大的猿，最优选人。本发明的亲本Fc多肽可以是基本上由属于任何抗体类别的免疫球蛋白基因编码，所述类别包括但不限于属于IgG(包括人亚类IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)、IgA(包括人亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、或IgM抗体类别的序列。最优选的是，本发明的亲本Fc多肽包含属于人IgG抗体类别的序列。例如，亲本Fc多肽可以是亲本抗体，例如人IgG1抗体、人IgA抗体、或小鼠IgG2a或IgG2b抗体。所述亲本抗体可以是非人的、嵌合的、人源化的、或完全人的，正如下文所详述的。亲本Fc多肽可以通过某些方式进行修饰或改造，例如亲本抗体可以进行亲和力成熟，或者可以具有改造糖型，都如下面所更完整描述的。或者，亲本Fc多肽可以是Fc融合物，例如其中融合伴侣靶向细胞表面受体的Fc融合物。或者，亲本Fc多肽可以是分离的Fc区，包含很少或不包含Fc区以外的其他多肽序列。亲本Fc多肽可以是天然存在的Fc区，或者可以是现有的Fc多肽改造后变体。重要的是亲本Fc多肽包含Fc区，该区可然后突变以生成Fc变体。
本发明的Fc变体可以是抗体，在本文中称为“本发明的抗体”。本发明的抗体可以包含基本上由属于任何抗体类别的免疫球蛋白基因编码的免疫球蛋白序列，所述类别包括但不限于IgG(包括人亚类IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)、IgA(包括人亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、或IgM抗体类别。最优选的是，本发明的抗体包含属于人IgG抗体类别的序列。本发明的抗体可以是非人的、嵌合的、人源化的、或完全人的。正如本领域熟练技术人员将领会的，抗体的这些不同类型反映了“人性(humanness)”的程度或在人体内的潜在免疫原性水平。关于这些概念的描述，参见Clark et al.，2000及其引用的参考文献(Clark，2000，Immunol Today 21：397-402，引入作为参考)。嵌合抗体包含非人抗体的可变区，例如小鼠或大鼠起源的VH和VL结构域，与人抗体的恒定区可操作连接(见例如美国专利4,816,567，引入作为参考)。所述非人可变区可以是衍生自上述任何生物体，优选哺乳动物，最优选啮齿类或灵长类。在一个实施方案中，本发明的抗体包含猴可变区，例如Newman et al.，1992，Biotechnology 10：1455-1460；US 5,658,570；和US 5,750,105中所述，引入作为参考。在一个优选的实施方案中，可变区衍生自非人来源，但它的免疫原性已经通过蛋白质工程而降低。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是人源化的(Tsurushita&Vasquez，2004，Humanization of Monoclonal Antibodies，Molecular Biology of B Cells，533-545，Elsevier Science(USA)，引入作为参考)。本文所用“人源化”抗体指抗体包含人框架区(FR)和非人(通常为小鼠或大鼠)抗体的一个或多个互补决定区(CDR)。提供CDR的非人抗体称为“供体”，提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。人源化主要依赖将供体CDR移植到受体(人)VL和VH框架上(Winter US 5,225,539，引入作为参考)。这种策略称为“CDR移植”。常常需要将选择的受体框架残基“回复突变(backmutation)”成相应的受体残基以恢复在最初的移植构建物中丧失的亲和力(US 5,530,101；US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 6,180,370；US 5,859,205；US 5,821,337；US6,054,297；US 6,407,213，引入作为参考)。本领域知道用于人源化的许多其它方法(Tsurushita&Vasquez，2004，Humanization of MonoclonalAntibodies，Molecular Biology of B Cells，533-545，Elsevier Science(USA)，引入作为参考)，并且任何这样的方法可以在本发明中用于修饰Fc变体以降低免疫原性。最理想的是，人源化抗体还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区，典型的为人免疫球蛋白的，因此将典型的包含人Fc区。在一个最优选的实施方案中，使用2004年12月3日提交的，题为“Methods of GeneratingVariant Proteins with Increased Host String Content and Compositions Thereof”(生成宿主串内容增加的变体蛋白质及其组合物的方法)的USSN11/004,590中描述的方法来降低本发明Fc变体的免疫原性，引入作为参考。在一个备选的实施方案中，本发明的抗体可以是完全人的，即抗体的序列完全或基本上是人的。本领域知道用于生成完全人的抗体的许多方法，包括利用转基因小鼠(Bruggemann et al.，1997，Curr Opin Biotechnol 8：455-458，引入作为参考)或人抗体库结合筛选方法(Griffiths et al.，1998，Curr OpinBiotechnol 9：102-108，引入作为参考)。
本发明的Fc变体可以是Fc融合物，在本文中称为“本发明的Fc融合 物”。本发明的Fc融合物包含与一种或多种融合伴侣可操作连接的Fc多肽。融合伴侣的作用典型的为但不总是介导Fc融合物与靶抗原的结合(Chamowet al.，1996，Trends Biotechnol 14：52-60；Ashkenazi et al.，1997，Curr OpinImmunol 9：195-200，引入作为参考)。例如，已批准的药物alefacept(作为
销售)是由与人IgG1 Fc区连接的人白细胞功能抗原-3(LFA-3)的胞外CD2结合部分组成的免疫抑制性Fc融合物。已批准的药物etanercept(作为
销售)是包含与人IgG1 Fc连接的人肿瘤坏死因子受体(TNFR)的胞外配体结合部分的Fc融合物。实际上任何蛋白质、多肽、肽、或小分子都可以连接Fc以生成Fc融合物。融合伴侣包括但不限于受体和胞外受体结构域、粘着分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子、或有些其它蛋白质或蛋白质结构域。融合伴侣还可以作为化学引诱物发挥作用。未发现的配体或受体可以充当本发明Fc变体的融合伴侣。小分子可以充当融合伴侣，并且可以包括将Fc融合物引导至治疗靶的任何治疗剂。这样的靶物可以是任何分子，优选与疾病有牵连的胞外受体。作为许多已批准小分子药物的靶物的两个表面受体家族是G-蛋白偶联受体(GPCR)和离子通道，包括K+、Na+、Ca+通道。当前全世界销售的所有药物几乎70％靶向GPCR。因此本发明的Fc变体可以与靶向例如一种或多种GABA受体、嘌呤能受体、肾上腺素能受体、组胺能受体、阿片样物质受体、趋化因子受体、谷氨酸受体、烟碱性受体、5HT(血清素)受体、和***受体的小分子融合。融合伴侣可以是靶向治疗上有用的靶物的蛋白质的小分子模拟物。可以充当Fc融合伴侣的具体药物的具体范例可以在L.S.Goodman et al.，Eds.，Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics(McGraw-Hill，New York，ed.9，1996，引入作为参考)中找到。融合伴侣不仅包括结合现有药物的已知靶物的小分子和蛋白质，而且包括尚未作为药物靶物存在的孤儿受体。基因组和蛋白质组计划的完成正在证明是药物发现的推动力，并且这些计划发现了一批孤儿受体。证明这些新的分子是药物靶物并开发靶向它们的蛋白质和小分子治疗剂有着巨大潜力。设想这样的蛋白质和小分子治疗剂作为采用本发明Fc变体的Fc融合伴侣。本发明的Fc融合物可以包含基本上由属于任何抗体类别的免疫球蛋白基因编码的免疫球蛋白序列，所述类别包括但不限于IgG(包括人亚类IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)、IgA(包括人亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、或IgM抗体类别。最优选的是，本发明的Fc融合物包含属于人IgG抗体类别的序列。下文定义和描述的各种接头，可以用于共价连接Fc与融合伴侣以生成Fc融合物。
本发明的Fc变体可用于分离的Fc，即包含很少或不包含Fc区域以外其它多肽序列且包含本发明Fc变体的Fc多肽。本发明的分离的Fc指这样的分子，其中该分子的期望功能，例如期望的治疗性功能仅位于Fc区中。因而本发明的分离的Fc的治疗性靶物很可能牵涉一种或多种Fc配体。包含Fc变体的分离的Fc可能不需要另外的共价多肽序列来实现其预期结果。在一个优选的实施方案中，所述单独的Fc包含90-100％的Fc区，带有很少或没有“额外的”序列。因而，例如，本发明的分离的Fc可以包含残基C226或P230至人IgG1的羧基末端，其中编号依照Kabat中的EU索引。在一个实施方案中，本发明的分离的Fc可以不含Fc区以外的额外序列。然而，还设想分离的Fc还可以不含另外的多肽序列。例如，分离的Fc可以在包含Fc变体Fc区以外还包含其它多肽序列标签从而能够表达、纯化等等。
本发明的Fc变体可用于Fc区片段，即包含Fc片段的Fc多肽，所述Fc片段包含本发明的Fc变体。显然，本发明的Fc片段的一个必要条件是它包含Fc变体进行氨基酸修饰的位置。本发明的Fc片段可以包含Fc区的1-90％，优选10-90％，最优选30-90％。因此例如，本发明的Fc片段可以包含Fc变体IgG1Cγ2结构域、Fc变体IgG1Cγ2结构域和绞链区、Fc变体IgG1Cγ3功能区、等等。在一个实施方案中，本发明的Fc片段另外包含融合伴侣，使其有效成为Fc片段融合物。就像分离的Fc，Fc片段可以包含或不含额外的多肽序列。
本发明的Fc变体可以基本上由来自任何生物体的基因编码，优选哺乳动物，包括但不限于人，啮齿类包括但不限于小鼠和大鼠、兔类包括但不限兔(rabbit)和野兔(hare)，骆驼科包括但不限于骆驼、美洲驼、和单峰驼，以及非人灵长类包括但不限于原猴类、阔鼻猴亚目(新世界猴)、猴型总科(旧世界猴)、和人型总科包括长臂猿、较小的和巨大的猿。在一个最优选的实施方案中，本发明的Fc变体基本上是人的。本发明的Fc变体可以是基本上由属于任何抗体类别的免疫球蛋白基因编码。在一个最优选的实施方案中，本发明的Fc变体包含属于IgG抗体类别的序列，包括人亚类IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4。在一个备选的实施方案中，本发明的Fc变体包含属于IgA(包括人亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG、或IgM抗体类别的序列。本发明的Fc变体可以包含多于一条蛋白质链。也就是说，本发明可用于这样的Fc变体，它是单体或寡聚体，包括同型或异型寡聚体。
在最优选的实施方案中，本发明的Fc多肽基于人IgG序列，因此使用人IgG序列作为“基本”序列，其它序列与起进行比较，包括但不限于来自其它生物体的序列例如啮齿类和灵长类序列，以及来自其他免疫球蛋白类别诸如IgA、IgE、IgG、IgD、IgM等等的序列。设想尽管本发明的Fc变体在一个亲本Fc变体的背景中进行改造，该变体可以在另一个、第二亲本Fc变体的背景中进行改造或“转移”到其中。这是通过确定第一和第二Fc变体之间的“等同”或“对应”残基和替代来完成的，这通常基于两种Fc变体序列之间的序列或结构同源性。为了建立同源性，将本文中概括的第一Fc变体的氨基酸序列与第二Fc变体的序列直接进行比较。在比对序列后，使用本领域已知的一种或多种同源比对程序(例如使用物种之间的保守残基)，容许必需的***和删除来维持比对(即避免保守残基通过任意的删除和***而消除)，确定与第一Fc变体一级序列中的特定氨基酸等同的残基。保守残基的比对应优选保留100％这样的残基。然而，大于75％或低至50％的保守残基的比对也足以确定等同的残基了。对于结构已经测定的Fc变体，还可以通过在三级结构水平上确定第一和第二Fc变体之间的结构同源性来确定等同的碱基。在这种情况中，等同的残基定义为那些亲本或前体的特定氨基酸残基的两个或更多主链原子的原子坐标(N对N，CA对CA，C对C和O对O)在比对后在0.13nm内，优选在0.1nm内。比对是在最佳模型已经确定方向和位置以给出蛋白质的非氢蛋白质原子的原子坐标的最大交叠之后实现的。无论等同或对应的残基是如何确定的，并且不管其中构建Fc变体的亲本Fc变体的种类，想要传达的是本发明发现的Fc变体可以改造到与所述Fc变体具有显著序列或结构同源性的任何第二亲本Fc变体中。因此，例如，如果通过使用上文所述方法或用于确定等同残基的其它方法生成了其中亲本抗体是人IgG1的变体抗体，那么可以在人IgG2亲本抗体、人IgA亲本抗体、小鼠IgG2a或IgG2b亲本抗体等等中改造所述变体抗体。再则，如上所述，亲本Fc变体的背景不影响将本发明的Fc变体转移到其它亲本Fc变体中的能力。例如，可以将在靶向一种表位的人IgG1抗体中改造的变体抗体转移到靶向不同表位的人IgG2抗体中，转移到包含靶向仍然不同表位的人IgG1 Fc区的Fc融合物中，诸如此类。
本发明的Fc变体可用于广泛的产品。在一个实施方案中，本发明的Fc变体是治疗性、诊断性或研究性试剂，优选治疗性的。或者，本发明的Fc变体可用于农业或工业用途。本发明的抗体可用于抗体组合物，它是单克隆的或多克隆的。本发明的Fc变体可以是激动剂、拮抗剂、中和性的、抑制性的或刺激性的。在一个优选的实施方案中，本发明的Fc变体用于杀死携带靶抗原的靶细胞，例如癌细胞。在一个备选的实施方案中，本发明的Fc变体用于阻断、拮抗或激动(agonize)靶抗原。在一个备选的实施方案中，本发明的Fc变体用于阻断、拮抗或激动靶抗原并杀死携带靶抗原的靶细胞。
靶物
事实上任何抗原可以作为本发明的Fc变体的靶物，包括但不限于属于下列靶物的蛋白质、亚基、结构域、基序、和/或表位：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-异-PGF2a、8-氧合-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活素(activin)、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、激活素RIB ALK-4、激活素RIIA、激活素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗剂、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗-Id、ASPARTIC、心房尿钠肽(atrial natriuretic factor)、av/b3整联蛋白、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴细胞刺激物(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2、BMP-2a、BMP-3成骨蛋白、BMP-4、BMP-2b、BMP-5、BMP-6、Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a，OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、铃蟾肽、骨衍生神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、补体因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌关联抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)毒素、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤关联抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、腐烂加速因子、des(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)、Dhh、地高辛(digoxin)、DNAM-1、DNA酶、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、内皮缩血管肽受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot、嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)1、EpCAM、肝配蛋白(ephrin)B2/EphB4、EPO、ERCC、E-选择蛋白、ET-1、因子IIa、因子VII、因子VIIIc、因子IX、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纤维蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、促卵泡激素、Fractalkine、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌抑素(myostatin))、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、胰高血糖素、Glut 4、糖蛋白IIb/IIIa(GP IIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生长激素释放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(HGF)、Hep Bgp120、类肝素酶(heparanase)、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑素瘤关联抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心脏肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干扰素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰岛素A链、胰岛素B链、***1、整联蛋白α2、整联蛋白α3、整联蛋白α4、整联蛋白α4/β1、整联蛋白α4/β7、整联蛋白α5(αV)、整联蛋白α5/β1、整联蛋白α5/β3、整联蛋白α6、整联蛋白β1、整联蛋白β2、干扰素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、层粘连蛋白5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜伏的TGF-1、潜伏的TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、路易斯(Lewis)-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择蛋白、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面活性剂(lung surfactant)、***、淋巴毒素β受体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金属蛋白酶、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白(Mucl)、MUC18、穆勒氏(Muellerian)抑制性物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-钙粘着蛋白、NCA 90、NCAM、NCAM、中性溶酶(neprilysin)、神经营养蛋白-3，-4，或-6、Neurturin、神经元生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、甲状旁腺素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙粘着蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、胰岛素原、松弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、***特异性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛肽A链、松弛肽B链、肾素、呼吸道合胞体病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清清蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤关联糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T-细胞受体(例如T-细胞受体α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β泛特异性的、TGF-βRI(ALK-5)、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、促甲状腺素、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R，TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RIICD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配体、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a Conectin、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、转运受体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、肿瘤关联抗原CA 125、表达Lewis Y相关碳水化合物的肿瘤关联抗原、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙粘着蛋白、VE-钙粘着蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整联蛋白、冯维勒布兰德(von Willebrands)因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、以及激素和生长因子的受体。
本领域熟练技术人员将领会，上述靶物名单不仅指具体的蛋白质和生物分子，而且还指包含它们的生化途径。例如，提到将CTLA-4作为靶抗原暗示构成T细胞共刺激途径的配体和受体，包括CTLA-4、B7-1、B7-2、CD28，以及结合这些蛋白质的任何其它未发现的配体或受体也是靶物。因此本文所用靶物不仅指具体的生物分子，而且还指与所述靶物和所述靶物所属生化途径的成员相互作用的一组蛋白质。本领域熟练技术人员还将领会，任何上述靶抗原、结合它们的配体或受体、或它们相应生化途径的其他成员可以与本发明的Fc变体可操作连接以生成Fc融合物。因此，例如靶向EGFR的Fc融合物可以通过可操作连接Fc变体与EGF、TGF-β、或任何其它已发现的或未发现的结合EGFR的配体来构建。因此，本发明的Fc变体可以与EGFR可操作连接以生成结合EGF、TGF-β、或任何其它已发现的或未发现的结合EGFR的配体的Fc融合物。因而实际上不论是配体、受体、或有些其它蛋白质或蛋白质结构域，任何多肽，包括但不限于上述靶物和构成它们相应生化途径的蛋白质，都可以与本发明的Fc变体可操作连接以开发Fc融合物。
选择正确的靶抗原用于抗体疗法是一个复杂的过程并且涵盖许多变量。对于抗癌治疗而言，希望采用其表达限制于癌细胞的靶物。已证明尤其服从抗体疗法的有些靶物是具有信号功能的那些。其它治疗性抗体通过抑制受体与其关联配体间的结合来阻断受体的信号而发挥其作用。治疗性抗体的另一种作用机制是引起受体下调。尽管许多在治疗上有效的抗体部分通过经由它们的靶抗原发信号而起作用，但情况不总是这样。例如，有些靶物类别诸如细胞表面糖型不产生任何生物学信号。然而，改变的糖型常常与疾病状态诸如癌症有关。另一种重要的靶物类型是作为正常功能或响应抗体结合而内在化的那些。在靶物是可溶性的而非细胞表面结合的情况中，效应器功能的募集不会导致任何细胞死亡。
已证明尤其服从抗体疗法的有些靶物是具有信号功能的那些。例如，Her2/neu抗原的抗体交联可产生导致癌细胞死亡的凋亡信号。在有些情况中，诸如CD30抗原，与游离抗体的这种集聚可能不足以引起体外凋亡。对于体外试验，充分的集聚可以通过交联抗体或通过将其以高密度固定在表面诸如微量滴定板的孔上来介导。然而，在体内这种效果可能是通过抗体与Fc配体，例如邻近细胞上表达的FcγR的结合来介导的。因此更紧的结合Fc配体的抗体Fc变体可能更有效的集聚发信号的靶物并导致凋亡诱导的增强。这样的机制可以通过实验来测试，其通过添加具有或没有对表达期望的发信号靶物的细胞结合增强的Fc配体的抗体，和/或添加Fc受体和能够集聚Fc受体的相应抗体来进行。用于集聚Fc受体的备选方式包括固定在珠上，和在非效应器细胞系中过表达。在允许凋亡发生之后，测量靶物表达细胞的相对凋亡将能够定量测定效果。
通过其与靶物相互作用而引起细胞死亡的抗体可以具有另外的益处。由这些垂死细胞释放的信号吸引巨噬细胞及免疫***的其它细胞。然后这些细胞能以抗体介导的方式摄取死亡的或垂死的细胞。已经证明这导致抗原的交叉呈递和针对靶细胞的宿主免疫应答的潜力。关于抗原靶物Her2和CD20，已经报导了响应抗体疗发的这样的自身抗体。为此使Fc变体具有改变的受体特异性以特异性刺激交叉呈递和免疫应答而非不希望得到的耐受诱导结果可能是有利的。
其它治疗性抗体通过抑制受体与其关联配体之间的相互作用，最终阻断该受体的信号来发挥其效果。此类抗体用于治疗许多疾病状态。在这种情况中，利用不募集任何宿主免疫功能的抗体可能是有利的。此类抗体的次要效果可能是实际上经由受体集聚而诱导自身发信号。在这种情况中，期望的阻断信号的治疗效果将被抗体介导的信号消除。如上所述，这种集聚可以通过抗体与含Fc受体的细胞的相互作用而增强。在这种情况中，使用较不紧密或根本不结合Fc受体的Fc变体将是更可取的。此类抗体不会介导信号，因此它的作用机理将限于阻断受体/配体相互作用。对此最适合的信号受体将可能是只会由一抗二聚化但基本上不集聚的单体受体。多聚体受体可能由一抗显著集聚，而且可能不要求通过Fc受体结合的另外集聚。
治疗性抗体的另一种潜在作用机理是受体下调。例如，***受体可能就是这种情况。细胞生长依靠经由受体的连续信号，而在其缺乏时细胞停止生长。针对该受体的抗体的一种效果是下调其表达并因此消除信号。细胞从细胞毒性疗法恢复需要刺激这种受体。这种受体的下调阻止这些细胞恢复并使细胞毒性疗法基本上更有效。对于这是主要作用机制的抗体而言，降低Fc受体结合可能阻止因对Fc受体的非靶物结合而对抗体的扣留。
尽管许多在治疗上有效的抗体部分通过经由它们的靶抗原发信号起作用，但情况不总是这样。例如，有些靶物类别，诸如细胞表面糖型不产生任何生物学信号。然而，改变的糖型常常与疾病状态诸如癌症有关。在其它情况中，抗体与相同靶抗原的不同表位的相互作用可能赋予不同的信号效应。在此类很少或没有通过抗体或Fc融合物结合靶抗原而引发信号的情况中，本发明的Fc多肽可用于为在其它情况中没有效果的分子提供新的功效机制。
已经用于生成对此类无信号靶物的治疗性抗体的一种方法是将抗体与胞毒剂诸如放射性同位素、毒素、或加工底物以便在肿瘤附近产生胞毒剂的酶偶联。作为细胞毒性模块的替换物，本发明的Fc变体可提供增加的免疫功能的募集，它们固有的对宿主毒性较低同时仍有效破坏目标癌细胞。此类Fc变体可以是例如在募集NK细胞或在活化吞噬作用或起动CDC方面更有效。或者，如果使用胞毒剂，使用提供减少或改变的Fc配体结合的Fc变体也许是有利的。这可能降低或消除试剂对表达Fc受体的免疫细胞的细胞毒素作用，从而降低对患者的毒性。此外，Fc配体结合的降低可能有助于将对毒性试剂或酶产生的免疫反应降至最低。如上所述，细胞死亡可导致宿主免疫细胞的募集；在这种情况中，如果除了细胞毒性模块之外，治疗性抗体具有增强的Fc受体结合亲和力或改变的受体特异性，那么抗体介导的交叉呈递可以随免疫反应而非免疫耐受而增加。
另一种重要的靶物类型是作为它们生物学功能的正常部分或者响应抗体结合而内在化的那些靶物。对于此类靶物，已经在偶联胞毒剂诸如RNA酶、蓖麻毒素和加利车霉素方面付出许多努力，它们只能在内在化之后发挥它们的效果。对于此类试剂，Fc配体结合可能由于Fc配体对治疗剂的非生产性扣留而降低功效。在这种情况中，使用提供降低的Fc配体亲和力的Fc变体也许是有益的。反之，在其结合呈现于细胞上的靶抗原之前与Fc配体预关联的抗体可用于抑制靶物的内在化。在这种情况中，提高Fc配体亲和力可能有助于改善预关联及因此效应细胞和宿主免疫应答的募集。
在靶物是可溶性的而非细胞表面结合的情况中，效应器功能的募集不会直接导致细胞死亡。然而，在刺激对靶物的宿主抗体的生成中可能是有用处的。对有些疾病状态，成功的治疗可能需要施用治疗性抗体达极长的一段时间。此类疗法可能是极为昂贵的或麻烦的。在这些情况中，宿主免疫应答的刺激和抗体的产生可能导致治疗功效的改善。这作为疫苗疗法的佐剂可能是适用的。介导此类效应的抗体Fc变体可能具有提高的对Fc配体的亲和力或改变的Fc配体特异性。
批准用于临床试验、或开发的许多抗体和Fc融合物可受益于本发明的Fc变体。这些抗体和Fc融合物在本文中称为“临床产品和备选物”。因此在一个优选的实施方案中，本发明的Fc多肽可用于一系列临床产品和备选物。例如，许多靶向CD20的抗体可受益于本发明的Fc多肽。例如，本发明的Fc多肽可用于这样的抗体，该抗体基本上类似于rituximab(
IDEC/Genentech/Roche)(见例如US 5,736,137)，批准用于治疗非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤的嵌合抗CD20抗体；HuMax-CD20，当前正在由Genmab开发的抗CD20，US 5,500,362中描述的抗CD20抗体，AME-133(AppliedMolecular Evolution)，hA20(Immunomedics，Inc.)，HumaLYM(Intracel)，和PRO70769(PCT/US2003/040426，题目为“Immunoglobulin Variants andUses Thereof”(免疫球蛋白变体与其应用))。许多靶向表皮生长因子受体家族成员，包括EGFR(ErbB-1)、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)的抗体可受益于本发明的Fc多肽。例如，本发明的Fc多肽可用于这样的抗体，该抗体基本上类似于trastuzumab(Genentech)(见例如US 5,677,171)，批准用于治疗乳癌的人源化抗Her2/neu抗体；pertuzumab(rhuMab-2C4，OmnitargTM)，当前正在由Genentech开发；US 4,753,894中描述的抗Her2抗体；cetuximab(
Imclone)(US 4,943,533；PCT WO 96/40210)，在临床试验中用于多种癌症的嵌合抗EGFR抗体；ABX-EGF(US 6,235,883)，当前正在由Abgenix-Immunex-Amgen开发；HuMax-EGFr(USSN 10/172,317)，当前正在由Genmab开发；425、EMD55900、EMD62000、和EMD72000(MerckKGaA)(US 5,558,864；Murthy et al.，1987，Arch Biochem Biophys.252(2)：549-60；Rodeck et al.，1987，J Cell Biochem.35(4)：315-20；Kettleborough et al.，1991，Protein Eng.4(7)：773-83)；ICR62(Institute ofCancer Research)(PCT WO 95/20045；Modjtahedi et al.，1993，J.Cell Biophys.22(1-3)：129-46；Modjtahedi et al.，1993，Br J Cancer.67(2)：247-53；Modjtahediet al，1996，Br J Cancer，73(2)：228-35；Modjtahedi et al，2003，Int J Cancer，105(2)：273-80)；TheraCIM hR3(YM Biosciences，Canada和Centro deImmunologia Molecular，Cuba)(US 5,891,996；US 6,506,883；Mateo et al，1997，Immunotechnology，3(1)：71-81)；mAb-806(Ludwig Institue for CancerResearch，Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluth et al.，2003，Proc Natl Acad SciUSA.100(2)：639-44)；KSB-102(KS Biomedix)；MR1-1(IVAX，NationalCancer Institute)(PCT WO 0162931A2)；及SC100(Scancell)(PCT WO01/88138)。在另一个优选的实施方案中，本发明的Fc多肽可用于alemtuzumab(
Millenium)，当前批准用于治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病的人源化单克隆抗体。本发明的Fc多肽可用于基本上类似于其它临床产品和备选物的多种抗体或Fc融合物，所述其它临床产品和备选物包括但不限于muromonab-CD3(Orthoclone
)，由OrthoBiotech/Johnson&Johnson开发的抗CD3抗体，ibritumomab tiuxetan
由IDEC/Schering AG开发的抗CD20抗体，gemtuzumabozogamicin
由Celltech/Wyeth开发的抗CD33(p67蛋白)抗体，alefacept
由Biogen开发的抗LFA-3Fc融合物，abciximab由Centocor/Lilly开发，basiliximab
由Novartis开发，palivizumab
由MedImmune开发，infliximab
由Centocor开发的抗TNFα抗体，adalimumab
由Abbott开发的抗TNFα抗体，HumicadeTM，由Celltech开发的抗TNFα抗体，etanercept
由Immunex/Amgen开发的抗TNFαFc融合物，ABX-CBL，由Abgenix正在开发的抗CD147抗体，ABX-IL8，由Abgenix正在开发的抗IL8抗体，ABX-MA1，由Abgenix正在开发的抗MUC18抗体，Pemtumomab(R1549，90Y-muHMFG1)，由Antisoma开发的抗MUC1抗体，Therex(R1550)，正在由Antisoma开发的抗MUC1抗体，AngioMab(AS1405)，正在由Antisoma开发，HuBC-1，正在由Antisoma开发，Thioplatin(AS1407)，正在由Antisoma开发，
(natalizumab)，正在由Biogen开发的抗α-4-β-1(VLA-4)和α-4-β-7抗体，VLA-1mAb，正在由Biogen开发的抗VLA-1整联蛋白抗体，LTBR mAb，正在由Biogen开发的抗淋巴毒素β受体(LTBR)抗体，CAT-152，正在由Cambridge Antibody Technology开发的抗TGF-β2抗体，J695，正在由Cambridge Antibody Technology和Abbott开发的抗IL-12抗体，CAT-192，正在由Cambridge Antibody Technology和Genzyme开发的抗TGFβ1抗体，CAT-213，正在由Cambridge Antibody Technology开发的抗嗜酸性粒细胞趋化因子1抗体，LymphoStat-BTM，正在由Cambridge Antibody Technology和Human Genome Sciences Inc.开发的抗Blys抗体，TRAIL-R1mAb，正在由Cambridge Antibody Technology和Human Genome Sciences，Inc.开发的抗TRAIL-R1抗体，AvastinTM(bevacizumab，rhuMAb-VEGF)，正在由Genentech开发的抗VEGF抗体，抗HER受体家族抗体，正在由Genentech开发，抗组织因子(ATF)，正在由Genentech开发的抗组织因子抗体，XolairTM(Omalizumab)，正在由Genentech开发的抗IgE抗体，RaptivaTM(Efalizumab)，正在由Genentech和Xoma开发的抗CD11a抗体，MLN-02抗体(从前的LDP-02)，正在由Genentech和Millenium Pharmaceuticals开发，HuMax CD4，正在由Genmab开发的抗CD4抗体，HuMax-IL15，正在由Genmab和Amgen开发的抗IL15抗体，HuMax-Inflam，正在由Genmab和Medarex开发，HuMax-Cancer，正在由Genmab和Medarex以及OxfordGcoSciences开发的抗类肝素酶I抗体，HuMax-Lymphoma，正在由Genmab和Amgen开发，HuMax-TAC，正在由Genmab开发，IDEC-131，正在由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD40L抗体，IDEC-151(Clenoliximab)，正在由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD4抗体，IDEC-114，正在由IDECPharmaceuticals开发的抗CD80抗体，IDEC-152，正在由IDECPharmaceuticals开发的抗CD23抗体，抗巨噬细胞迁移因子(MIF)抗体，正在由IDEC Pharmaceuticals开发，BEC2，正在由Imclone开发的抗独特型抗体，IMC-1C11，正在由Imclone开发的抗KDR抗体，DC101，正在由Imclone开发的抗flk-1抗体，抗VE钙粘着蛋白抗体，正在由Imclone开发的，CEA-CideTM(labetuzumab)，正在由Immunomedics开发的抗癌胚抗原(CEA)抗体，LymphoCideTM(Epratuzumab)，正在由Immunomedics开发的抗CD22抗体，AFP-Cide，正在由Immunomedics开发，MyelomaCide，正在由Immunomedics开发，LkoCide，正在由Immunomedics开发，ProstaCide，正在由Immunomedics开发，MDX-010，正在由Medarex开发的抗CTLA4抗体，MDX-060，正在由Medarex开发的抗CD30抗体，MDX-070，正在由Medarex开发，MDX-018，正在由Medarex开发，OsidemTM(IDM-1)，正在由Medarex与Immuno-Designed Molecules开发的抗Her2抗体，HuMaxTM-CD4，正在由Medarex与Genmab开发的抗CD4抗体，HuMax-IL15，正在由Medarex与Genmab开发的抗IL15抗体，CNTO 148，正在由Medarex与Centocor/J&J开发的抗TNFα抗体，CNTO1275，正在由Centocor/J&J开发的抗细胞因子抗体，MOR101和MOR102，正在由MorphoSys开发的抗细胞间粘附分子-1(ICAM-1)(CD54)抗体，MOR201，正在由MorphoSys开发的抗成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)抗体，(visilizumab)，正在由Protein Design Labs开发的抗CD3抗体，HuZAFTM，正在由Protein Design Labs开发的抗γ干扰素抗体，抗α5β1整联蛋白，正在由Protein Design Labs开发，抗IL-12，正在由Protein Design Labs开发，ING-1，正在由Xoma开发的抗Ep-CAM抗体，和MLN01，正在由Xoma开发的抗β2整联蛋白抗体，所有参考文献引入作为参考。
Fc多肽用于上述抗体和Fc融合物临床产品和备选物的应用并不意味着限于其精确组成。本发明的Fc多肽可以掺入上述临床备选物和产品，或掺入基本上与它们类似的抗体和Fc融合物。本发明的Fc多肽可以掺入上述临床备选物和产品人源化的、亲和力成熟的、改造的、或以有些其它方式修饰的型式。此外，不必使用上述临床产品和备选物的整个多肽来构建包容本发明Fc多肽的新抗体或Fc融合物；例如，可以只使用临床产品或备选抗体的可变区、基本上类似的可变区、或可变区人源化的、亲和力成熟的、改造的、或以有些其它方式修饰的型式。在另一个实施方案中，本发明的Fc多肽可用于与上述临床产品和备选物之一结合相同表位、抗原、配体、或受体的抗体或Fc融合物。
在一个实施方案中，本发明的Fc多肽可用于治疗自身免疫、炎症、或移植适应症。与此类疾病相关的靶抗原及临床产品和备选物包括但不限于抗α4β7整联蛋白抗体诸如LDP-02，抗β2整联蛋白抗体诸如LDP-01，抗补体(C5)抗体诸如5G1.1，抗CD2抗体诸如BTI-322、MEDI-507，抗CD3抗体诸如OKT3、SMART抗CD3，抗CD4抗体诸如IDEC-151、MDX-CD4、OKT4A，抗CD11a抗体，抗CD14抗体诸如IC14，抗CD18抗体，抗CD23抗体诸如IDEC 152，抗CD25抗体诸如Zenapax，抗CD40L抗体诸如5c8、Antova、IDEC-131，抗CD64抗体诸如MDX-33，抗CD80抗体诸如IDEC-114，抗CD 147抗体诸如ABX-CBL，抗E-选择蛋白抗体诸如CDP850，抗gpIIb/IIIa抗体诸如ReoPro/Abcixima，抗ICAM-3抗体诸如ICM3，抗ICE抗体诸如VX-740，抗FcR1抗体诸如MDX-33，抗IgE抗体诸如rhuMab-E25，抗IL-4抗体诸如SB-240683，抗IL-5抗体诸如SB-240563、SCH55700，抗IL-8抗体诸如ABX-IL8，抗干扰素γ抗体，抗TNF(TNF、TNFα、TNFa、TNF-阿尔法)抗体诸如CDP571、CDP870、D2E7、Infliximab、MAK-195F，和抗VLA-4抗体诸如Antegren。
本发明的Fc变体可用于TNF抑制剂分子以提供增强的特性。已经证明，与FcγRIIIa关联的效应器功能可以负面的影响用于治疗具有高亲和力多态性(本文别处讨论的158F：V)的类风湿性关节炎或银屑病关节炎患者的某些TNF抑制剂分子的效力，反之亦然(Z.Tutuncu et al.，2004，“FcRPolymorphisms and Treatment Outcomes in Patients with Inflammatory ArthritisTreated with TNF Blocking Agents”，于2004年10月18日在San Antonio，TX召开的2004ACR会议上口头报告；摘要公开于Arthritis&Rheumatism，2004年9月，引入作为参考)。通常，对于自身免疫状况诸如类风湿性关节炎或银屑病关节炎，将TNF抑制剂与相对于亲本提供降低的对一种或多种FcγR结合的Fc变体组合起来提高疗法的效力。理想的是，减低或甚至消除对一种或多种FcγR例如FcγRIIIa的结合，与TNF抑制剂分子一起将产生最佳的结果。
有用的TNF抑制剂分子包括在哺乳动物中抑制TNF-α作用的任何分子。适宜的例子包括Fc融合物
(etanercept)及抗体(adalimumab)和
(infliximab)。使用本发明的Fc变体进行改造以降低Fc结合的单克隆抗体(诸如Remicade和Humira)可能转变成更有功效。在开发这些药物中并未考虑Humira、Remicade、和Enbrel的效应器功能，更不用说效应器功能的调节了。对比当前的商业化产品，通过在作用于自身免疫状况的抗体或Fc融合物的背景中使用降低对一种或多种FcγR结合的本发明的Fc变体，可以提高功效。有用的TNF抑制剂分子优选包括优势负面TNF(Dominant Negative TNF)分子(如2000年3月2日提交的USSN 09/798,789中定义的；2001年10月15日提交的09/981,289；2002年9月30日提交的10/262,630；及2004年10月12日提交的10/963,994，都引入作为参考)。优势负面TNF分子(DN-TNF)不具有内在的效应器活性，并且起“挽救”跨膜TNF(tmTNF)的作用(即如果杀死含有tmTNF的细胞对于类风湿性或银屑病关节炎的疾病结果具有负面影响的话)。优选与降低或消除FcγR对受体结合的Fc变体关联的DN-TNF分子。
在一个实施方案中，本发明的Fc多肽发挥治疗功能，完全或部分通过ADCC活性来实现。与此类应用相关的靶抗原及临床产品和备选物可包括但不限于：抗CD20抗体诸如Bexocar、
和PRO70769，抗CD33抗体诸如Smart M195，抗CD22抗体诸如LymphocideTM，抗CD30抗体诸如AC-10和SGN-30，抗EGFR抗体诸如ABX-EGF、Cetuximab、IMC-C225、Merck Mab 425，抗EpCAM抗体诸如Crucell氏抗EpCAM，抗HER2抗体诸如Herceptin和MDX-210，以及抗CEA抗体诸如cantumab和Pentacea。
在一个实施方案中，本发明的Fc多肽发挥治疗功能，完全或部分通过CDC活性来实现。与此类应用相关的靶抗原及临床产品和备选物可包括但不限于：抗CEA抗体诸如cantumab和Pentacea，抗CD20抗体诸如Bexocar、
和PRO70769，抗EpCAM抗体诸如Crucell氏抗EpCAM和Edrecolomab，以及抗CD52抗体诸如
(alemtuzumab)。
在一个实施方案中，本发明的Fc多肽针对在血液学谱系中表达的抗原。与此类应用相关的靶抗原及临床产品和备选物可包括但不限于：抗CD33抗体诸如Smart M195，抗CD40L抗体诸如AntovaTM、IDEC-131，抗CD44抗体诸如Blvatuzumab，抗CD52抗体诸如
(alemtuzumab)，抗CD80抗体诸如IDEC-114，抗CTLA-4抗体诸如MDX-101，抗CD20抗体诸如Bexocar、
和PRO70769，抗CD22抗体诸如LymphocideTM，抗CD23抗体诸如IDEC-152，抗CD25抗体诸如(daclizumab)，以及抗MHC(HLA-DR)抗体诸如apolizumab。
在一个实施方案中，本发明的Fc多肽针对实体瘤中表达的抗原。与此类应用相关的靶抗原及临床产品和备选物可包括但不限于：抗EpCAM抗体诸如Crucell氏抗EpCAM和Edrecolomab，抗CEA抗体诸如cantumab和Pentacea，抗EGFR抗体诸如ABX-EGF、Cetuximab、IMC-C225、Merck Mab425，抗Muc1抗体诸如BravaRex、TriAb，抗Her2抗体诸如MDX-210，抗GD-2神经节苷脂抗体诸如3F8和TriGem，抗GD-3神经节苷酯抗体诸如mitumomab，抗PSMA抗体诸如MDX-070，抗CA125抗体诸如oregovomab，抗TAG-72抗体诸如MDX-220，以及抗MUC-1抗体诸如cantuzumab。
在一个优选的实施方案中，本发明Fc变体的靶物自身是一种或多种Fc配体。本发明的Fc多肽可用于调节免疫***的活性，以及在某些情况中以更受控制的、特异的和高效的方式模仿IVIg疗法的效果。IVIg是有效的高剂量静脉内投递免疫球蛋白。通常，已将IVIg用于下调自身免疫状况。已有假设，IVIg的治疗性作用机制牵涉高频率的Fc受体连接(J.Bayry et al.，2003，Transfusion Clinique et Biologique 10：165-169；Binstadt et al.，2003，JAllergy Clin.Immunol，697-704)。事实上，特发性血小板减少性紫癜(ITP)的动物模型显示了分离的Fc是IVIg的活性部分(Samuelsson et al，2001，Pediatric Research 50(5)，551)。为了在治疗中使用，从数千名供体收集免疫球蛋白，其具有与从人类收集非重组生物治疗剂相关的所有伴随问题。当IVIg作为重组蛋白生产而非从供体收集时，本发明的Fc变体应充当IVIg的所有角色。
IVIg的免疫调节效果可能依赖于与一种或多种Fc配体的生产性相互作用，该配体包括但不限于FcγR、补体蛋白和FcRn。在有些实施方案中，具有对FcγRIIb增强的亲和力的本发明Fc变体可用于促进抗炎活性(Samuelsson et al.，2001，Science 291：484-486)和/或降低自身免疫性(Hogarth，2002，Current Opinion in Immunology，14：798-802)。在其它实施方案中，具有对一种或多种FcγR增强的亲和力的本发明Fc多肽可通过其自身或结合另外的修饰用于降低自身免疫性(Hogarth，2002，Current Opinionin Immunology，14：798-802)。在备选的实施方案中，具有对FcγRIIIa增强的亲和力但细胞内法信号能力降低的本发明Fc变体可用于通过竞争性干扰FcγRIIIa结合而降低免疫***活化。Fc变体的背景显著影响期望的特异性。例如，提供对一种或多种活化FcγR结合增强的Fc变体在抗体、Fc融合物、分离的Fc、或Fc片段的背景中通过担当FcγR拮抗剂可提供最佳免疫调节效果(van Mirre et al.，2004，J.Immunol.173：332-339)。然而，两种或多种Fc变体的融合或缀合可提供不同效果，而且对于这样的Fc多肽，利用提供对抑制性受体增强的亲和力的Fc变体可能是最佳的。
本发明的Fc变体可用作免疫调节治疗剂。结合或阻断免疫***细胞上的Fc受体可用来影响免疫学状况中的免疫应答，该免疫状况包括但不限于特发性血小板减少性紫癜(ITP)和类风湿性关节炎(RA)等。通过使用本发明亲和力增强的Fc变体，典型的IVIg应用中需要的剂量可以减少而同时获得基本上类似的治疗效果。Fc变体可提供对FcγR增强的结合，包括但不限于FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb、和/或FcγRI。具体而言，对FcγRIIb的结合增强将根据需要提高该受体的表达或抑制活性，并改善功效。或者，阻断对活化受体诸如FcγRIIIb或FcγRI的结合可改善功效。另外，调节Fc变体对FcRn和/或还有补体的亲和力也可带来益处。
在一个实施方案中，提供对抑制性受体FcγRIIb增强的结合的Fc变体提供对IVIg治疗方法的增强。具体而言，可以使用以比亲本Fc多肽更大亲和力结合FcγRIIb受体的本发明Fc变体。这样的Fc变体将因此发挥FcγRIIb拮抗剂的功能，并将预计增强IVIg作为自身免疫病治疗剂及还有作为B细胞增殖调节剂的有益效果。另外，这样的FcγRIIb增强型Fc变体还可以进一步修饰以具有对其它受体相同或有限的结合。在另外的实施方案中，具有增强的FcγRIIb亲和力的Fc变体可以与降低或消除对其它受体结合的突变结合起来，从而在治疗性使用中进一步潜在的将副作用最小化。
本发明Fc变体的此类免疫调节应用还可用于肿瘤学适应症的治疗，尤其是抗体疗法牵涉抗体依赖性细胞毒性机制的那些。例如，增强对FcγRIIb亲和力的Fc变体可用于拮抗该抑制性受体，例如通过对Fc/FcγRIIb结合位点的结合但不会触发，或降低细胞信号，潜在增强基于抗体的抗癌疗法的效果。这样的Fc变体，行使FcγRIIb拮抗剂的功能，可阻断FcγRIIb的抑制特性，或如同在IVIg的情况中一样降低其抑制功能。FcγRIIb拮抗剂可用作与任何其它疗法，包括但不限于抗体相结合的辅助疗法(co-therapy)，在ADCC相关细胞毒性的基础上起作用。这种类型的FcγRIIb拮抗型Fc变体优选是分离的Fc或Fc片段，尽管在备选的实施方案中可以使用抗体和Fc融合物。
优化的特性
本发明提供了为许多治疗性相关特性优化的Fc变体。Fc变体相对于亲本Fc多肽包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰提供一种或多种优化的特性。本发明的Fc变体由于至少一个氨基酸修饰而与亲本Fc多肽在氨基酸序列上有所不同。因此，本发明的Fc变体与亲本相比具有至少一个氨基酸修饰。或者，本发明的Fc变体与亲本相比可具有多于一个氨基酸修饰，例如与亲本相比约1个到50个的氨基酸修饰，优选约1个到10个氨基酸修饰，最优选约1个到约5个氨基酸修饰。因此，Fc变体的序列与亲本Fc多肽的序列基本上是同源的。例如，本文中的变异的Fc变体序列将具有与亲本Fc变体序列约80％的同源性，优选至少约90％的同源性，最优选至少约95％的同源性。
本发明的Fc变体可以为多种特性优化。经改造或预测而展示一种或多种优化特性的Fc变体在本文中称为“优化的Fc变体”。可以优化的特性包括但不限于对FcγR增强或减弱的亲和力。在一个优选的实施方案中，本发明的Fc变体经优化而具有对人活化FcγR增强的亲和力，优选FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIA和FcγRIIIb，最优选FcγRIIIa。在一个备选的优选实施方案中，Fc变体经优化而具有对人抑制性受体FcγRIIb减弱的亲和力。这些优选的实施方案预期在人中提供具有增强的治疗特性的Fc多肽，例如增强的效应器功能和更大的抗癌效力。在一个备选的实施方案中，本发明的Fc变体经优化而具有对人FcγR减弱或消除的亲和力，包括但不限于FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIA和FcγRIIIb。这些实施方案预期在人中提供具有增强的治疗特性的Fc多肽，例如减弱的效应器功能和减弱的毒性。在其它实施方案中，本发明的Fc变体提高对一种或多种FcγR增强的亲和力，而对一种或多种其它FcγR减弱的亲和力。例如，本发明的Fc变体可具有对FcγRIIIa增强的亲和力，而对FcγRIIb减弱的亲和力。或者，本发明的Fc变体可具有对FcγRIIa和FcγRI增强的结合，而对FcγRIIb减弱的结合。在另一个实施方案中，本发明的Fc变体可具有对FcγRIIb增强的亲和力，而对一种或多种活化FcγR减弱的亲和力。
优选的实施方案包括对Fc结合人FcγR的优化，然而在备选的实施方案中本发明的Fc变体具有对来自非人生物体的FcγR增强或减弱的亲和力，包括但不限于啮齿类和非人灵长类。为结合非人FcγR优化的Fc变体可用于实验。例如，小鼠模型可用于多种疾病，从而能够对给定的药物备选物测试诸如功效、毒性和药动学等特性。正如本领域所知道的，可以将癌细胞移植或注射到小鼠中以模拟人类的癌症，这一过程称为异种移植。测试包含为一种或多种小鼠FcγR优化的Fc变体的蛋白质可提供关于这种蛋白质的功效、其作用机制等等的有用信息。本发明的Fc变体还可为无糖基化形式的增强的功能性和/或溶解特性而优化。在一个优选的实施方案中，本发明的无糖基化Fc变体以比亲本Fc变体的无糖基化形式更大的亲和力结合Fc配体。所述Fc配体包括但不限于FcγR、C1q、FcRn、及蛋白质A和G，而且可来自任何来源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔或猴，优选人。在一个备选的优选实施方案中，Fc变体经优化比亲本Fc变体的无糖基化形式更稳定和/或更易溶解。
本发明的Fc变体可包含调节与FcγR以外Fc配体的相互作用的修饰，包括但不限于补体蛋白、FcRn和Fc受体同系物(FcRH)。FcRH包括但不限于FcRH1、FcRH2、FcRH3、FcRH4、FcRH5和FcRH6(Davis et al.，2002，Immunol.Reviews 190：123-136)。
优选的是，本发明Fc变体的Fc配体特异性将决定其治疗效用。用于治疗目的的给定Fc变体的效用将取决于靶抗原的表位或形式以及所治疗的疾病或适应症。对于有些靶物和适应症来说，增强的FcγR介导的效应器功能可能是优选的。这可能对于抗癌Fc变体而言是特别有利的。因此，可使用这样的Fc变体，该Fc变体包含提供对活化FcγR增强的亲和力和/或对抑制性FcγR减弱的亲和力的Fc变体。对于有些靶物和适应症而言，利用对不同活化FcγR提供不同选择性的Fc变体可能是更为有利的；例如，在有些情况中，可能希望对FcγRIIa和FcγRIIIa增强的结合，而非FcγRI，然而在其它情况中，可能优选只对FcγRIIa增强的结合。对某些靶物和适应症而言，可能优选利用增强FcγR介导的和补体介导的两种效应器功能的Fc变体，而对于其它情况，利用增强FcγR介导的或补体介导的任一效应器功能的Fc变体可能是有利的。对某些靶物或癌症适应症而言，减弱或消除一种或多种效应器功能可能是有利的，例如通过敲除与C1q、一种或多种FcγR、FcRn、或一种或多种其它Fc配体的结合。对其它靶物和适应症而言，可能优选利用对抑制性FcγRIIb提供增强的结合，但对活化FcγR提供WT水平、减弱的、或消除的结合的Fc变体。这可能是特别有用的，例如当Fc变体的目标是以某种方式抑制炎症或自身免疫病，或调节免疫***。
显然，决定给定Fc变体治疗给定疾病的最有利选择性的一项重要参数是Fc变体的背景，也就是所使用的是什么类型的Fc变体。因此，给定Fc变体的Fc配体选择性或特异性将提供不同特性，取决于它是否包含具有偶联的融合或缀合伴侣的抗体、Fc融合物、或Fc变体。例如，如果包含毒素、放射性核苷酸或其它缀合物的Fc变体具有对一种或多种Fc配体减弱或消除的结合，那么所述毒素、放射性核苷酸或其它缀合物对正常细胞的毒性可能会变小。作为另一个例子，为了抑制炎症或自身免疫病，可能优选利用对活化FcγR具有增强的亲和力的Fc变体，诸如结合这些FcγR以及防止它们活化。相反，包含具有增强的FcγRIIb亲和力的两个或多个Fc区域的Fc变体可能在免疫细胞表面上共招致(co-engage)受体，从而抑制这些细胞的增殖。而在有些情况中，Fc变体可在一种细胞类型上招致其靶抗原而在与靶抗原分开的细胞上招致FcγR，在其它情况中，在与靶抗原相同的细胞的表面上招致FcγR可能是有利的。例如，如果抗体靶向细胞上的抗原，该细胞还表达一种或多种FcγR，那么利用增强或减弱对该细胞表面上FcγR的结合的Fc变体可能是有利的。这是有可能的，例如当Fc变体作为抗癌药使用，而且同一细胞表面上靶抗原和FcγR的共招致促进细胞内导致生长抑制、凋亡或其它抗增殖效果的信号事件时。或者，当Fc变体在以某种方式用于调节免疫***时，抗原和FcγR在同一细胞上的共招致可能是有利的，其中靶抗原和FcγR的共招致提供了一些增殖性的或抗增殖的效果。同样，包含两个或多个Fc区域的Fc变体可能从调节FcγR选择性或特异性从而在同一细胞表面上共招致FcγR的Fc变体获益。
可调节本发明Fc变体的Fc配体特异性以创建可能适于特定靶抗原、适应症、或患者群的不同效应器功能谱。表1描述了受体结合谱的几个优选实施方案，包括对各种受体的结合的改进、降低或无影响，其中此类改变在某些背景中可能是有益的。此表中的受体结合谱可通过增加或减少指定受体的程度而改变。另外，指定的结合变化可以在对其它受体诸如C1q或FcRn的另外结合变化的背景中，例如通过与消除对C1q的结合以关闭补体活化结合起来，或通过与增强对C1q的结合以增加补体活化结合起来。具有其它受体结合谱的其它实施方案是可能的，列出的受体结合谱是例示性的。
表1
| 亲和力增加 | 亲和力降低 | 细胞活性 | 治疗活性 |
| 只有FcγRI | - | 树突状细胞活性和摄取以及后续抗原呈递增强单核细胞和巨噬细胞对抗体的响应增强 | 基于细胞的针对靶物的免疫应答增强 |
| FcγRIIIa | - | 广泛细胞类型的ADCC和吞噬作用增强 | 靶细胞溶解增加 |
| FcγRIIIa | FcγRIIb | 广泛细胞类型的ADCC和吞噬作用增强 | 靶细胞溶解增加 |
| FcγRIIbFcγRIIc | - | 除NK细胞外所有携带FcγR细胞类型活性降低NK细胞通过FcγRIIc受体信号可能活化 | 对NK细胞可及靶细胞选择性的靶细胞溶解增加 |
| FcγRIIbFcγRIIIa | - | 可能的NK细胞介导的ADCC的NK细胞特异性活化和增强 | 对NK细胞可及靶细胞选择性的靶细胞溶解增加 |
| FcγRIIIb | - | 嗜中性粒细胞介导的吞噬作用增强 | 嗜中性粒细胞可及细胞的靶细胞破坏增强 |
| 亲和力增加 | 亲和力降低 | 细胞活性 | 治疗活性 |
| FcαR | - | 嗜中性粒细胞介导的吞噬作用增强 | 嗜中性粒细胞可及细胞的靶细胞破坏增强 |
| FcγRIFcγRIIaFcγRIIIa | FcγRIIb | 树突状细胞活性和摄取以及后续抗原对T细胞的呈递增强单核细胞和巨噬细胞对抗体的响应增强 | 基于细胞的针对靶物的免疫应答增强 |
| FcγRIIb | FcγRIFcγRIIaFcγRIIIa | 单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、NK、树突状和其它携带伽马受体细胞的活性降低 | 细胞介导的针对携带靶物细胞的细胞毒性消除或降低 |
FcγR不同多态形式的存在还提供了影响本发明Fc变体治疗效用的另一个参数。尽管给定Fc变体对不同种类FcγR的特异性和选择性显著影响Fc变体靶向给定抗原以治疗给定疾病的能力，Fc变体对这些受体的不同多态形式的特异性或选择性可部分决定哪种研究或临床前试验可能适于测试，以及最终决定哪种患者群可能对治疗响应或不响应。因此，本发明Fc变体对Fc配体多态性，包括但不限于FcγR、C1q、FcRn和FcRH多态性的特异性或选择性可用于指导正确研究和临床前试验、临床试验设计、患者选择、剂量依赖、和/或关注临床试验的其它方面的选择。
另外的修饰
除了包含本发明的Fc变体之外，本发明的Fc多肽可包含一个或多个另外的修饰。所述修饰可以是氨基酸修饰，或者可以是氨基酸修饰以外的修饰，诸如通过酶或化学方法进行的修饰。设想了另外的氨基酸修饰和氨基酸修饰以外的修饰的组合。此类另外的修饰很可能提供对Fc多肽的有些改进，例如增强其稳定性、溶解度、功能、或临床应用。本发明设想了通过偶联本发明的Fc多肽与另外的修饰进行的多种改进。
本发明的Fc变体可以与Fc区中提供与一种或多种Fc配体改变的或优化的相互作用的其它氨基酸修饰组合，所述配体包括但不限于FcγR、C1q或其它补体蛋白、FcRn、FcR同系物(FcRH)、和/或尚未发现的Fc配体。需要注意的是，本发明的Fc多肽自身可具有尚未知道的与一种或多种Fc配体例如FcRH相互作用的有用特性。另外的修饰可提供对Fc配体改变的或优化的亲和力和/或特异性。另外的修饰可提供改变的或优化的效应器功能，包括但不限于ADCC、ADCP、CDC和/或血清半衰期。这样的组合可以提供累加的、协同的、或新的特性。在一个实施方案中，本发明的Fc变体可以与已知的Fc变体组合(Duncan et al.，1988，Nature 332：563-564；Lundet al.，1991，J Immunol 147：2657-2662；Lund et al.，1992，Mol Immunol29：53-59；Alegre et al.，1994，Transplantation 57：1537-1543；Hutchins et al.，1995，Proc Natl Acad Sci USA 92：11980-11984；Jefferis et al.，1995，ImmunolLett 44：111-117；Lund et al.，1995，Faseb J 9：115-119；Jefferis et al.，1996，Immunol Lett 54：101-104；Lund et al.，1996，J Immunol 157：4963-4969；Armouret al.，1999，Eur J Immunol 29：2613-2624；Idusogie et al.，2000，J Immunol164：4178-4184；Reddy et al.，2000，J Immunol 164：1925-1933；Xu et al.，2000，Cell Immunol 200：16-26；Idusogie et al.，2001，J Immunol 166：2571-2575；Shields et al.，2001，J Biol Chem 276：6591-6604；Jefferis et al.，2002，ImmunolLett 82：57-65；Presta et al.，2002，Biochem Soc Trans 30：487-490；Hinton et al.，2004，J Biol Chem 279：6213-6216)(US 5,624,821；US 5,885,573；US 6,194,551；PCT WO 00/42072；PCT WO 99/58572；US 2004/0002587A1；US 6,737,056；PCT US2004/000643；USSN 10/370,749；和PCT/US2004/005112)，都引入作为参考。例如，如同在US 6,737,056、PCT US2004/000643、USSN 10/370,749和PCT/US2004/005112中所描述的，替代S298A、S298D、K326E、K326D、E333A、K334A和P396L提供优化的FcγR结合和/或增强的ADCC。此外，如同在Idusogie et al.，2001，J.Immunology 166：2571-2572中所公开的，引入作为参考，替代K326W、K326Y和E333S提供对补体蛋白C1q的增强结合和增强的CDC。最后，如同在Hinton et al.，2004，J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216中所描述的，引入作为参考，替代T250Q、T250E、M428L和M428F提供对FcRn的增强结合和改良的药动学。
由于对FcγR、C1q和FcRn的结合位点居于Fc区中，因此IgG间在Fc区的不同很可能促成FcγR和C1q介导的效应器功能的不同。还有可能的是可以在Fc变体的其它非Fc区进行修饰，包括例如抗体的Fab和铰链区，或Fc融合物的Fc融合伴侣。例如，如同在USSN 11/090,981中所公开的，在此引入作为参考，抗体的Fab和铰链区可影响效应器功能诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。因此，设想了本发明Fc变体的Fc区以外的修饰。例如，本发明的抗体可包含抗体VL、CL、VH、CH1和/或铰链区中的一个或多个氨基酸修饰。
其它修饰可以在Fc变体中提供另外的或新的结合决定簇结合，例如另外的或新的Fc受体结合位点，例如2003年12月22日提交的，题为“Fcvariants with novel Fc receptor binding sites”(具有新的Fc受体结合位点的Fc变体)的USSN 60/531,752中所描述的。在一个实施方案中，可以改造一种抗体同种型的Fc变体使其结合不同同种型的Fc受体。当对各自Fc受体的Fc结合位点不显著交叠时，这可能特别适用。例如，可以将结合FcγRI的IgA的结构决定簇改造到IgG Fc变体中。
本发明的Fc变体可包含调节Fc变体的体内药动学特性的修饰。这些包括但不限于增强对新生儿Fc受体FcRn的亲和力的修饰(USSN10/020354；WO2001US0048432；EP2001000997063；US6277375；USSN 09/933497；WO1997US0003321；US6737056；WO2000US0000973；Shields et al.，2001，JBiol Chem 276(9)：6591-6604；Zhou et al.，2003，J Mol Biol.，332：901-913)。这些进一步包括以pH特异性方式修饰FcRn亲和力的修饰。在期望增强体内半衰期的有些实施方案中，优选在较低pH(5.5-6)相对于较高pH(7-8)特异性增强FcRn亲和力的修饰(Hinton et al.，2004，J Biol Chem 279(8)：6213-6216；Dall’Acqua et al.，2002J Immuno 169：5171-5180；Ghetie et al.，1997，Nat Biotechnol 15(7)：637-640；WO2003US0033037；WO2004US0011213)。例如，如同在Hinton et al.，2004，“Engineered HumanIgG Antibodies with Longer Serum Half-lives in Primates”J Biol Chem 279(8)：6213-6216中所描述的，替代T250Q、T250E、M428L和M428F提供对FcRn的增强结合和改良的药动学。另外优选的修饰是在较低pH相对于较高pH保持野生型Fc的改良结合的那些。在期望快速体内清除的备选实施方案中，优选降低对FcRn的亲和力的修饰(US6165745；WO1993US0003895；EP1993000910800；WO1997US0021437；Medesan et al.，1997，J Immunol158(5)：2211-2217；Ghetie&Ward，2000，Annu Rev Immunol 18：739-766；Martin et al.，2001，Molecular Cell 7：867-877；Kim et al.，1999，Eur J Immunol29：2819-2825)。增强FcRn的优选变体描述于USSN 60/627,763，2004年11月12日提交；60/642,886，2005年1月11日提交；60/649,508，2005年2月2日提交；60/662,468，2005年3月15日提交；以及60/669,311，2005年4月6日提交，题为“Fc Variants with Altered Binding to FcRn”(具有改变的对FcRn结合的Fc变体)，都在此引入作为参考。
另外的修饰可包含氨基酸修饰，其中将Fc多肽中的残基修饰成同源Fc多肽中的相应残基。效应器功能诸如ADCC、ADCP、CDC和血清半衰期在不同类别的抗体包括例如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG和IgM之间显著不同(参考文献：Michaelsen et al.，1992，MolecularImmunology 29(3)：319-326)。人IgG1是最常用于治疗目的的抗体，而在此背景中主要进行了其中构建了显示增强的效应器功能的变体的改造研究。如上所述，有可能在彼此具有显著序列或结构同源性的Fc多肽中确定对应或等同的残基。出于同样原因，有可能使用此类方法在Fc多肽中改造另外的氨基酸修饰以提供另外的优化特性，例如如同2004年10月21日提交的USSN 60/621,387中所描述的。在一个实施方案中，可以进行氨基酸修饰，即以另一同源Fc多肽中的一个或多个残基替换本发明Fc多肽中的一个或多个残基。在一个备选的实施方案中，构建了杂合Fc多肽，即以同源Fc多肽的相应区域替换本发明Fc多肽的一个或多个区域。例如，有些研究探索了IgG1、IgG2、IgG3和IgG4变体以调查它们之间效应器功能差异的决定因素。见例如Canfield&Morrison，1991，J Exp Med 173：1483-1491；Chappel et al.，1991，Proc Natl Acad Sci USA 88(20)：9036-9040；Chappel et al.，1993，J Biol Chem 268：25124-25131；Tao，Canfeld，and Morrison，1991，J ExpMed 173：1025-1028；Tao et al.，1993，J Exp Med 178：661-667；Redpath et al.，1998.Human Immunology，59：720-727。
在一个实施方案中，本发明的Fc变体包含一种或多种经改造的糖型。本文所用“经改造的糖型”指共价附着于Fc变体的碳水化合物，其中所述碳水化合物组成在化学上不同于亲本Fc变体的。经改造的糖型可用于广泛目的，包括但不限于增强或减弱效应器功能。经改造的糖型可通过本领域已知的多种方法产生(
et al.，1999，Nat Biotechnol 17：176-180；Davies etal.，2001，Biotechnol Bioeng 74：288-294；Shields et al.，2002，J Biol Chem277：26733-26740；Shinkawa et al.，2003，J Biol Chem 278：3466-3473)；(US6,602,684；USSN 10/277,370；USSN 10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCTWO 01/29246A1；PCT WO 02/31140A1；PCT WO 02/30954A1)；(PotelligentTM技术[Biowa，Inc.，Princeton，NJ]；GlycoMAbTM糖基化改造技术[GLYCARTbiotechnology AG，Züirich，Switzerland])。这些技术中的许多是以控制共价附着于Fc区的岩藻糖化和/或二分寡糖的水平为基础的，例如通过在经过改造或其它方式(例如Lec-13CHO细胞或大鼠杂交瘤YB2/0细胞)的各种生物体或细胞系中表达，通过调节牵涉糖基化途径的酶(例如FUT8[α1，6-岩藻糖基转移酶]和/或β1-4-N-乙酰葡糖胺转移酶III[GnTIII])，或通过在Fc变体表达后修饰碳水化合物。经改造的糖型典型的指不同的碳水化合物或寡糖；因此Fc变体例如抗体或Fc融合物可包含经改造的糖型。或者，经改造的糖型可以指包含不同碳水化合物或寡糖的Fc变体。
本发明的Fc变体可包含提供优化特性的一种或多种修饰，所述特性本质上具体涉及效应器功能。所述修饰可以是氨基酸修饰，或者可以是通过酶或化学方法进行的修饰。此类修饰很可能提供Fc变体中的有些改进，例如增强的其稳定性、溶解度、功能或临床应用。本发明设想了通过偶联本发明的Fc变体与另外的修饰而进行的各种改进。
在一个优选的实施方案中，本发明的Fc变体可包含减弱在人体中的免疫原性的修饰。在一个最优选的实施方案中，本发明Fc变体的免疫原性是使用2004年12月3日提交的，题为″Methods of Generating Variant Proteinswith Increased Host String Content and Compositions Thereof″(生成宿主串内容增加的变体蛋白质及其组合物的方法)的USSN 11/004,590中描述的方法减弱的。在备选的实施方案中，本发明的抗体是人源化的(Clark，2000，Immunol Today 21：397-402)。本文所用“人源化”抗体指包含人框架区(FR)和来自非人(通常为小鼠或大鼠)抗体的一个或多个互补决定区(CDR)的抗体。提供CDR的非人抗体称为“供体”，提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。人源化主要依靠将供体CDR移植到受体(人)VL和VH框架上(WinterUS 5225539)。这种策略称为“CDR移植”。常常需要将选定的受体框架残基“回复突变”成相应供体残基以恢复在最初的移植构建物中丧失的亲和力(US 5530101；US 5585089；US 5693761；US 5693762；US 6180370；US5859205；US 5821337；US 6054297；US 6407213)。人源化抗体任选还将包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，典型的是人免疫球蛋白的，并且因此将典型的包含人Fc区。本领域众所周知用于将非人抗体人源化和重建的多种技术和方法(见Tsurushita&Vasquez，2004，Humanization of MonoclonalAntibodies，Molecular Biology ofB Cells，533-545，Elsevier Science(USA)，及其引用的参考文献)。人源化方法包括但不限于Jones et al.，1986，Nature321：522-525；Riechmann et al.，1988，Nature 332：323-329；Verhoeyen et al.，1988，Science，239：1534-1536；Queen et al.，1989，Proc Natl Acad Sci USA86：10029-33；He et al.，1998，J Immunol 160：1029-1035；Carter et al.，1992，Proc Natl Acad Sci USA 89：4285-9；Presta et al.，1997，Cancer Res57(20)：4593-9；Gorman et al.，1991，Proc Natl Acad Sci USA 88：4181-4185；O’Connor et al.，1998，Protein Eng 11：321-8中描述的方法。人源化或降低非人抗体可变区免疫原性的其它方法可包括表面重建法，例如Roguska et al.，1994，Proc Natl Acad Sci USA 91：969-973中所描述的。在一个实施方案中，以选择为基础的方法可用于抗体可变区的人源化和/或亲和力成熟，包括但不限于Wu et al.，1999，J.Mol.Biol.294：151-162；Baca et al.，1997，J.Biol.Chem.272(16)：10678-10684；Rosok et al.，1996，J.Biol.Chem.271(37)：22611-22618；Rader et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：8910-8915；Krauss et al.，2003，Protein Engineering 16(10)：753-759中描述的方法。其它人源化方法可牵涉仅部分CDR的移植，包括但不限于USSN 09/810,502；Tan etal.，2002，J.Immunol.169：1119-1125；De Pascalis et al.，2002，J.Immunol.169：3076-3084中描述的方法。以结构为基础的方法可用于人源化和亲和力成熟，例如USSN 10/153,159及相关专利中所描述的。
减弱免疫原性的修饰可包括减弱衍生自亲本序列的经加工肽对MHC蛋白质的结合的修饰。例如，将改造氨基酸修饰使得没有或具有最小数目预测以高亲和力结合任何普遍MHC等位基因的免疫表位。本领域知道在蛋白质序列中鉴定MHC结合表位的几种方法，它们可用于评价本发明Fc变体中的本文。见例如WO 98/52976；WO 02/079232；WO 00/3317；USSN09/903,378；USSN 10/039,170；USSN 60/222,697；USSN 10/339788；PCT WO01/21823；以及PCT WO 02/00165；Mallios，1999，Bioinformatics 15：432-439；Mallios，2001，Bioinformatics 17：942-948；Sturniolo et al.，1999，NatureBiotech.17：555-561；WO 98/59244；WO 02/069232；WO 02/77187；Marshallet al.，1995，J.Immunol.154：5927-5933；及Hammer et al.，1994，J.Exp.Med.180：2353-2358。以序列为基础的信息可用于确定对给定肽-MHA相互作用的结合评价(见例如Mallios，1999，Bioinformatics 15：432-439；Mallios，2001，Bioinformatics 17：942-948；Sturniolo et al.，1999，Nature Biotech.17：555-561)。有可能使用以结构为基础的方法，其中在计算上将给定肽置于给定MHC分子的肽结合槽中并测定相互作用能(例如见WO 98/59244和WO02/069232)。此类方法可称为“穿孔(threading)”法。或者，可使用纯粹的实验方法；例如可以在实验上对衍生自目的蛋白质的一组重叠肽测试减弱T细胞活化和/或免疫应答其它方面的能力(见例如WO 02/77187)。在一个优选的实施方案中，使用矩阵法对沿着蛋白质序列的每9个残基框计算MHC结合倾向得分(见Sturniolo et al.，见上文；Marshall et al.，1995，J.Immunol.154：5927-5933；及Hammer et al.，1994，J.Exp.Med.180：2353-2358)。还有可能只考虑这些残基的子集的得分，或者还考虑目的9残基框之前或之后肽残基的种类。该矩阵包括对与不同人MHC II型分子中的肽结合口袋相互作用的特定氨基酸的结合得分。在最优选的实施方案中，矩阵中的得分是从实验性肽结合研究获得的。在一个备选的实施方案中，给定氨基酸对给定口袋的结合的得分是从实验表征的等位基因外推至该袋内衬具有相同或相似残基的另外的等位基因。将通过外推产生的矩阵称为“虚的矩阵(virtualmatrix)”。在一个备选的实施方案中，可以改造另外的氨基酸修饰以减弱完整分子与B细胞受体和循环抗体相互作用的倾向。
本发明的抗体和Fc融合物可在Fc区以外的一个或多个区域中包含提供最佳特性的氨基酸修饰，例如抗体Fab区或Fc融合伴侣。在一个实施方案中，本发明抗体的可变区可以是亲和力成熟的，也就是说已经在抗体的VH和/或VL结构域中进行了氨基酸修饰以增强抗体对其靶抗原的结合。同样的，可以在Fc融合伴侣中进行修饰以增强Fc融合物对其靶抗原的亲和力。这些类型的修饰可改善与靶抗原结合的结合和/或解离动力学。其它修饰包括改进对靶抗原较之备选靶物的选择性的那些。这些包括改进对靶细胞较之非靶细胞上表达的抗原的选择性的修饰。可以通过另外的修饰来提供对靶物识别特性的其它改进。此类特性可包括但不限于具体的动力学性质(即结合和解离动力学)、对特定靶物较之备选靶物的选择性、以及对靶物的特定形式较之备选形式的选择性。例子包括全长较之剪接变体，只在某些细胞类型诸如肿瘤细胞上表达的抗原的异常形式，细胞表面较之可溶形式，对各种多态性变体的选择性，或对靶物的特定构象形式的选择性。
本发明的Fc变体可包含一个或多个修饰以提供减弱或增强的Fc变体内在化。在一个实施方案中，本发明的Fc变体可用于或与另外的修饰结合以减弱Fc变体经由与一种或多种Fc配体的相互作用而发生的细胞内在化。该特性可预计增强效应器功能，以及潜在的降低本发明Fc变体的免疫原性。或者，本发明Fc变体的Fc变体可直接使用或与另外的修饰结合以增强Fc变体经由与一种或多种Fc配体的相互作用而发生的细胞内在化。例如，在一个优选的实施方案中，使用Fc变体提供对FcγRI增强的结合，FcγRI在树突状细胞上表达并在免疫应答早期具有活性。该策略可通过结合或在Fc变体中或在附着的融合物或缀合物伴侣中促进MHC分子对Fc肽片段的识别和呈递的其它修饰选一步增强。预计这些策略增强靶抗原加工并因此改善靶抗原的抗原性(Bonnerot and Amigorena，1999，Immunol Rev.172：279-84)，促进人免疫***的适应性免疫应答以及更大靶细胞杀伤。当所靶向的抗原从细胞表面脱落时，这些策略可能是特别有利的。这些观念的另外应用随着独特型疫苗免疫疗法而出现，其中使用患者淋巴瘤细胞产生的克隆特异性抗体对患者接种疫苗。
在一个优选的实施方案中，为了改善本发明Fc变体的生物物理特性而进行修饰，包括但不限于稳定性、溶解度和寡聚状态。修饰可包括例如提供更有利的Fc变体中分子内相互作用诸如提供更高稳定性的替代，或为了更高溶解度用极性氨基酸替代暴露的非极性氨基酸。USSN 10/379,392中描述了许多优化目标和方法，可用于改造另外的修饰以进一步优化本发明的Fc变体。本发明的Fc变体还可结合另外的修饰以降低寡聚状态或大小，使得肿瘤穿透增强，或根据需要提高体内清除速率。
本发明Fc变体的其它修饰包括能够获得特异形成或同型二聚体或同型多聚体分子的那些。此类修饰包括但不限于将改造的二硫化物，以及可提供产生共价同型二聚体或同型多聚体的机制的化学修饰或聚集方法。例如，Kan et al.，2001，J.Immunol.，2001，166：1320-1326；Stevenson et al.，2002，Recent Results Cancer Res.159：104-12；US 5,681,566；Caron et al.，1992，JExp Med 176：1191-1195；及Shopes，1992，J Immunol 148(9)：2918-22中描述了此类分子的改造方法及组合物。本发明变体的另外修饰包括能够获得特异性形成或异型二聚体、异型多聚体、双功能和/或多功能分子的那些。此类修饰包括但不限于CH3结构域中的一个或多个氨基酸替代，其中所述替代降低同型二聚体形成并增加异型二聚体形成。例如，Atwell et al.，1997，JMol Biol 270(1)：26-35；及Carter et al.，2001，J Immunol Methods 248：7-15中描述了此类分子的改造方法及组合物。另外的修饰包括铰链区和CH3结构域中的修饰，其中所述修饰降低形成二聚物的倾向。
在另外的实施方案中，本发明的Fc变体包含除去蛋白水解降解位点的修饰。这些可包括例如降低生产产量的蛋白酶位点以及在体内降解所施用蛋白质的蛋白酶位点。在一个优选的实施方案中，进行另外的修饰以除去共价降解位点，诸如脱酰胺(即谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基脱酰胺为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基)、氧化和蛋白水解降解位点。特别要除去的脱酰胺位点是那些具有增强的脱酰胺倾向的位点，包括但不限于后面接着甘氨酸的天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基(分别为NG和QG基序)。在这样的情况中，任一残基的替代能显著降低脱酰胺的倾向。常见的氧化位点包括甲硫氨酸和半胱氨酸残基。能导入或除去的其它共价修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的氨基的甲基化[T.E.Creighton，Proteins：Structure and MolecularProperties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，pp.79-86(1983)]、N-末端胺的乙酰化、以及任何C-末端羧基的酰胺化。另外的修饰还可包括但不限于翻译后修饰，诸如N-连接或O-连接的糖基化和磷酸化。
修饰可包括那些改善常用于生产生物制品的宿主或宿主细胞的表达和/或纯化产率的修饰。这些包括但不限于多种哺乳动物细胞系(如CHO)、酵母细胞系、细菌细胞系和植物。另外的修饰包括除去或降低重链形成链间二硫键能力的修饰。另外的修饰包括除去或降低重链形成链内二硫键能力的修饰。
本发明的Fc变体可包含包括利用了使用例如Schultz及其同事开发的技术掺入的非天然氨基酸的修饰，所述技术包括但不限于Cropp&Shultz，2004，Trends Genet.20(12)：625-30；Anderson et al.，2004，Proc Natl Acad SciUSA 101(2)：7566-71；Zhang et al.，2003，303(5656)：371-3；及Chin et al.，2003，Science 301(5635)：964-7描述的方法。在有些实施方案中，这些修饰使上文讨论的多种功能、生物物理、免疫学或生产特性的操作能实现。在另外的实施方案中，这些修饰使用于其它目的的另外的化学修饰能实现。在此设想了其它修饰。例如，Fc变体可连接多种非蛋白质性质的聚合物之一，如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。可进行另外的氨基酸修饰使Fc变体的特异性或非特异性化学或翻译后修饰能实现。这样的修饰包括但不限于PEG化和糖基化。可用于实现PEG化的特异性替代包括但不限于引入新的半胱氨酸残基或非天然氨基酸使得有效的且特异性的偶联化学能用于附着PEG或其它聚合物模块。特异性糖基化位点的引入可通过将新的N-X-T/S序列引入本发明的Fc变体来实现。
本发明的Fc变体可融合或缀合一种或多种其它分子或多肽。缀合和融合伴侣可以是是任何分子，包括小分子化学化合物和多肽。例如，Trail et al.，1999，Curr.Opin.Immunol.11：584-588中描述了多种抗体缀合物和方法。可能的缀合伴侣包括但不限于细胞因子、胞毒剂、毒素、放射性同位素、化疗剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂及其它治疗活性剂。在有些实施方案中，缀合伴侣更可视为有效负载，也就是说缀合的目的在于通过Fc变体将缀合伴侣靶向投递至靶细胞，例如癌细胞或免疫细胞。因此，例如毒素与抗体或Fc融合物的缀合将所述毒素的投递靶向表达靶抗原的细胞。
在一个实施方案中，本发明的Fc变体与细胞因子融合或缀合。本文所用“细胞因子”指由一种细胞群释放的，作为细胞间介质作用于其它细胞的蛋白质的通称。例如，如同Penichet et al.，2001，J Immunol Methods 248：91-101中所描述的，细胞因子可与抗体融合以提供一批期望特性。这样的细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子以及传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和***(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏(mullerian)抑制性物质；小鼠***相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；***-I和II；***(EPO)；骨诱导因子；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(CM-CSF)、和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；C5a；以及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。当用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物学活性等同物。
在一个备选的实施方案中，本发明的Fc多肽融合、缀合或可操作连接毒素，包括但不限于小分子毒素和细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体。例如，Thrush et al.，1996，Ann.Rev.Immunol.14：49-71中描述了多种免疫毒素和免疫毒素方法。小分子毒素包括但不限于加利车霉素、美登素(US 5,208,020)、单端孢菌素和CC1065。在本发明的一个实施方案中，Fc多肽缀合一个或多个美登素分子(如每个抗体分子约1个-约10个美登素分子)。例如，可将美登素转化为May-SS-Me，其可还原为May-SH3并与经过修饰的Fc多肽反应(Chari et al.，1992，Cancer Research 52：127-131)以生成美登素-抗体或美登素-Fc融合物缀合物。另一种感兴趣的缀合物包含缀合有一个或多个加利车霉素分子的Fc多肽，例如抗体或Fc融合物。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。可以使用加利车霉素的结构类似物，包括但不限于γ1 1、α2 1、α3、N-乙酰基-γ1 1、PSAG和Θ1 1(Hinman et al.，1993，Cancer Research 53：3336-3342；Lode et al.，1998，Cancer Research 58：2925-2928)(US 5,714,586；US 5,712,374；US5,264,586；US 5,773,001)。多拉司他汀(dolastatin)10类似物，诸如auristatin E(AE)和单甲基auristatin E(MMAE)可作为缀合物供本发明Fc变体之用(Doronina et al.，2003，Nat Biotechnol 21(7)：778-84；Francisco et al.，2003Blood 102(4)：1458-65)。有用的酶活毒素包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲毒素、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素以及单端孢菌素类。参见例如PCT WO 93/21232，在此引入作为参考。本发明还设想了本发明的Fc变体与具有核酸水解活性的化合物例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶(DNA酶)之间的缀合物。
在一个备选的实施方案中，本发明的Fc变体可融合、缀合或可操作连接放射性同位素以形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合的抗体和Fc融合物。实例包括但不限于At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32以及Lu的放射性同位素。参见例如参考文献。
在又一个实施方案中，本发明的Fc变体可缀合“受体”(如链霉亲合素)用于肿瘤预靶向(pretargeting)，其中对患者施用Fc变体-受体缀合物，接着使用清除剂从循环中除去未结合的缀合物，然后施用与胞毒剂(如放射性核苷酸)缀合的“配体”(如亲合素)。在一个备选的实施方案中，Fc变体缀合或可操作连接酶以便采用抗体依赖性酶介导的前药疗法(ADEPT)。可通过将Fc变体与转化前药(如肽基化疗剂，参见PCT WO 81/01145)为有活性的抗癌药物的前药活化酶缀合或可操作连接来使用ADEPT。参见例如PCT WO88/07378和US 4,975,278。可用于ADEPT的免疫缀合物的酶组分包括能以这样一种方式作用于前药使其转化为更具活性的细胞毒性形式的任何酶。可用于本发明方法的酶包括但不限于可将含磷酸盐/酯的前药转化为游离药物的碱性磷酸酶；可将含硫酸盐/酯的前药转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；可将无毒5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可将含肽的前药转化为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；可转化含D-氨基酸替代的前药的D-丙氨酰羧肽酶；可将糖基化前药转化为游离药物的碳水化合物切割酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可将α-内酰胺衍生的药物转化为游离药物的β-内酰胺酶；以及青霉素酰胺酶，诸如可将在其胺的氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转化为游离药物的青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗体，本领域也称作“抗体酶”，将本发明的前药转化为游离的活性药物(参见例如Massey，1987，Nature 328：457-458)。可制备用于将抗体酶投递至肿瘤细胞群的Fc变体-抗体酶缀合物。设想了本发明Fc变体的多种另外的缀合物。下文描述了多种化疗剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂和其它治疗剂，可用作Fc变体缀合物。
还设想了融合和缀合伴侣是Fc多肽。因此Fc变体可以是包含两个或多个Fc区的多聚体Fc多肽。这样的分子的优点在于它以单一蛋白质分子提供Fc受体的多个结合位点。在一个实施方案中，可使用化学改造方法连接Fc区。例如，可通过源自铰链中半胱氨酸残基的硫醚键连接Fab和Fc，产生诸如FabFc2的分子(Kan et al.，2001，J.Immunol.，2001，166：1320-1326；Stevenson et al.，2002，Recent Results Cancer Res.159：104-12；US 5,681,566)。可使用二硫化物改造和/或化学交联连接Fc区，例如Caron et al.，1992，J.Exp.Med.176：1191-1195；及Shopes，1992，J.Immunol.148(9)：2918-22中所描述的。在一个优选的实施方案中，可通过遗传学方法连接Fc区。例如已经在抗体的Fab和Fc区之间融合有多个Cγ2结构域(White et al.，2001，ProteinExpression and Purification 21：446-455)。在一个优选的实施方案中，如同2003年12月22日提交的，题为“Fc polypeptides with novel Fc receptor bindingsites”(具有新的Fc受体结合位点的Fc多肽)的USSN 60/531,752中所描述的，通过遗传学方法连接Fc变体中的Fc区，产生串联连接的Fc区。串联连接的Fc多肽可包含两个或多个Fc区，优选1-3个，最优选2个Fc区。可能有利的是研究多种工程构建物以便获得具有最有利结构和功能特性的同型或异型串联连接的Fc变体。串联连接的Fc变体可以是同型串联连接的Fc变体，即一种同种型的Fc变体通过遗传学方法融合另一个相同同种型的Fc变体。因为在串联连接的Fc多肽上有多个FcγR、C1q和/或FcRn结合位点，因此预计可增强效应器功能和/或药动学。在一个备选的实施方案中，可串联连接不同同种型的Fc变体，称为异型串联连接的Fc变体。例如，因为靶向FcγR和FcαRI受体的能力，故结合FcγR和FcαRI二者的Fc变体可提供显著的临床改善。
本领域技术人员将领会，事实上融合物和缀合物的概念和定义是重叠的。Fc变体作为融合物或缀合物的命名并不旨在将其限制在本发明的任何具体实施方案中。相反，宽松的使用这些术语以传达宽泛的概念，即任何本发明的Fc变体可通过遗传学方法、化学方法或其它方法与一种或多种多肽或分子连接以提供某些期望特性。
融合和缀合伴侣可与本发明Fc变体的任何区域连接，包括N-或C-末端，或两个末端之间的某些残基。在一个优选的实施方案中，融合或缀合伴侣连接在Fc变体的N-或C-末端，最优选N-末端。多种接头可用于本发明以共价连接Fc变体与融合或缀合伴侣以产生Fc融合物。本文中“接头”、“接头序列”、“间隔区”、“拴序列(tethering sequence)”或其语法等同物指连接两个分子并通常有助于以优选的构造放置两个分子的分子或分子群(诸如单体或聚合物)。有多种策略可用于将分子共价连接到一起。这些策略包括但不限于蛋白质或蛋白质结构域的N-和C-末端之间的多肽连接、经由二硫键的连接、以及经由化学交联剂的连接。在该实施方案的一个方面，接头是通过重组技术或肽合成产生的肽键。对于要连接两条多肽链的具体情况而言，合适接头的选择取决于多个参数，包括但不限于两条多肽链的本质(如它们是否天然寡聚化)、如果知道的话所要连接的N-和C-末端之间的距离、和/或接头对蛋白水解和氧化的稳定性。此外，接头可含有提供柔性的氨基酸残基。因此，接头肽可主要包括如下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。接头肽应具有足够的长度以这样一种方式连接两个分子，即它们确保相对于彼此的正确构象，使得它们保持期望的活性。对于该目的而言，合适的长度包括至少1个且不超过50个氨基酸残基。优选的是，接头长约1-30个氨基酸，最优选长约1-20个氨基酸的接头。此外，选择用于包含在接头肽中的氨基酸残基应展示不显著干扰多肽活性的特性。因此，接头肽大体上应不展示将与多肽活性不一致的电荷，或干扰内部折叠，或与一个或多个单体中的氨基酸残基形成将严重妨碍受体单体结构域结合的键或其它相互作用。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸多聚体(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸多聚体、丙氨酸-丝氨酸多聚体、和其它柔性接头诸如shaker钾通道的拴序列，以及本领域技术人员所理解的大量其它柔性接头。优选甘氨酸-丝氨酸多聚体，因为这两种氨基酸结构相对简单，因此可能能够作为组件间的中性拴序列。其次，丝氨酸是亲水的，因此能使球状甘氨酸链增溶。再次，已证明类似的链有效的连接重组蛋白诸如单链抗体的亚基。也可通过对已知三维结构的数据库筛选能桥接两条多肽链间缺口的天然存在基序以鉴定合适的接头。在一个优选的实施方案中，当在人患者中施用时，接头没有免疫原性。因此，可选择这样的接头使得它们具有低免疫原性或认为具有低免疫原性。例如，可选择在人中天然存在的接头。在一个最优选的实施方案中，接头具有抗体铰链区的序列，即连接抗体Fab和Fc区的序列；或者接头具有包含部分铰链区的序列或基本上类似于抗体铰链区的序列。获得合适接头的另一种方法是通过随机诱变来优化简单的接头如(Gly4Ser)n。或者，一旦确定了合适的多肽接头，可创建另外的接头多肽以选择与要连接的结构域具有更优化的相互作用的氨基酸。可用于本发明中的其它类型的接头包括人工多肽接头和内含肽(intein)。在另一个实施方案中，设计二硫键以连接两个分子。在另一个实施方案中，接头是化学交联剂。例如，可使用多种双功能蛋白质偶联剂，包括但不限于3-(2-吡啶基二巯基)-丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如盐酸二甲基己二酰亚胺酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯/盐类(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)以及双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可如Vitetta et al.，1971，Science 238：1098中所述制备蓖麻毒素免疫毒素。化学接头可能能螯合上同位素。例如，碳14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂(参见PCT WO 94/11026)。接头可以是可切割的，便于在细胞中释放细胞毒性药物。例如，可使用酸不稳定接头、对肽酶敏感的接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari et al.，1992，Cancer Research 52：127-131)。或者，多种非蛋白质性质的聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物，可用作为接头，即可用于连接本发明的Fc变体与融合或缀合伴侣以生成Fc融合物，或连接本发明的Fc变体与缀合物。
改造方法
设计策略、计算筛选方法和文库生成方法描述于题为“Optimized FcVariants and Methods for their Generation”(优化的Fc变体及其生成方法)的USSN 10/672,280和USSN 10/822,231中，在此明确引入作为参考。这些策略、手段、技术和方法可单独或以不同组合应用以生成优化的Fc变体。
Fc变体的实验生产
本发明提供了用于生产和实验测试Fc变体的方法。所描述的方法并不旨在将本发明限制于操作的任何特定应用或理论。相反，所提供的方法旨在一般性举例说明能生产及实验测试一种或多种Fc变体以获得不同的Fc变体。《Antibody Engineering》，Duebel和Kontermann编，Springer-Verlag，Heidelberg，2001；及Hayhurst和Georgiou，2001，Curr Opin Chem Biol5：683-689；Maynard和Georgiou，2000，Annu Rev Biomed Eng 2：339-76；Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow&Lane，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1988中描述了抗体分子生物学、表达、纯化和筛选的一般方法。
在本发明的一个实施方案中，创建编码Fc变体的核酸，然后可将其克隆到宿主细胞中，如果需要的话表达并鉴定。因此，可制备编码每种蛋白质序列的核酸，特别是DNA。这些实践是使用众所周知的流程进行的。例如，《Molecular Cloning-A Laboratory Manual》，第3版(Maniatis，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York，2001)，以及《Current Protocols inMolecular Biology》(John Wiley&Sons)中描述了可用于本发明的多种方法。本领域技术人员将领会，对于包含大量序列的文库，产生精确的序列可能费钱且费时。因此，有多种技术可用于有效产生本发明的文库。可用于本发明的这样的方法描述于或参考US 6,403,312；USSN 09/782,004；USSN 09/927,790；USSN 10/218,102；PCT WO 01/40091；和PCT WO02/25588。这样的方法包括但不限于基因装配方法、基于PCR的方法和利用PCR变型的方法、基于连接酶链式反应的方法、合并寡聚物方法诸如那些用于合成改组的、易错扩增方法和使用具有随机突变寡聚物的方法、经典的定点诱变方法、盒式诱变、以及其它扩增和基因合成方法。如本领域所公知的，有用于基因装配、诱变、载体亚克隆等等的多种市售试剂盒和方法，这样的商品可用于本发明以产生编码Fc变体的核酸。
通过在适当的条件下培养经含有编码Fc变体核酸的核酸、优选表达载体转化的宿主细胞以诱导或引起蛋白质的表达可生产本发明的Fc变体。适于表达的条件将随表达载体和宿主细胞的选择而改变，并可通过常规实验方法为本领域技术人员所容易确定。可使用多种适合的宿主细胞，包括但不限于哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞以及酵母。例如，可从美国典型培养物保藏中心获得的
细胞系目录描述了多种可用于本发明的细胞系。
在一个优选的实施方案中，在哺乳动物表达***中表达Fc变体，包括其中使用诸如逆转录病毒或腺病毒的病毒将表达构建物导入哺乳动物细胞的***。可使用任何哺乳动物细胞，特别优选的是人、小鼠、大鼠、仓鼠以及灵长类细胞。合适的细胞还包括已知的研究细胞，包括但不限于JurkatT细胞、NIH3T3、CHO、BHK、COS、HEK293、PER C.6、HeLa、Sp2/0、NS0细胞及其变体。在另一个备选的优选实施方案中，文库蛋白质可在细菌细胞中表达。细菌表达***是本领域众所周知的，包括大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)和链锁状链球菌(Streptococcus lividans)。在备选的实施方案中，在昆虫细胞(如Sf21/Sf9、Trichoplusia ni Bti-Tn5b1-4)或酵母细胞(如酿酒酵母(S.cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia)等)中生产Fc变体。在一个备选的实施方案中，使用无细胞翻译***在体外表达Fc变体。可得到衍生自原核(如大肠杆菌)和真核(如小麦胚芽、兔网织红细胞)细胞的体外翻译***，并可根据目的蛋白质的表达水平和功能特性进行选择。例如，本领域技术人员将领会，体外翻译是某些展示技术所需要的，例如核糖体展示。此外，可通过化学合成方法生产Fc变体。还有动物(如牛、绵羊或山羊奶、含胚鸡卵、整个昆虫幼虫等)和植物(如玉米、烟草、浮萍等)的转基因表达***。
可将编码本发明Fc变体的核酸掺入表达载体以便表达蛋白质。许多表达载体可用于蛋白质表达。表达载体可包括自我复制的染色体外载体或整合入宿主基因组的载体。构建与宿主细胞类型相容的表达载体。因此可用于本发明的表达载体包括但不限于那些使蛋白质能在哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、酵母以及体外***中表达的载体。本领域公知，可从市场上或以其它方式获得可用于本发明以表达Fc变体的多种表达载体。
表达载体通常包含与控制或调节序列、选择标记、任何融合伴侣和/或附加元件可操作连接的蛋白质。本文中”可操作连接”指核酸置于与另一核酸序列功能性关系中。一般来说，这些表达载体包括与编码Fc变体的核酸可操作连接的转录和翻译调节核酸，且通常适合于用于表达蛋白质的宿主细胞。一般而言，转录和翻译调节序列可包括启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活子序列。本领域也公知，表达载体通常含有选择基因或标记以容许对含有表达载体的经转化宿主细胞的选择。选择基因为本领域众所周知且可随所使用的宿主细胞而改变。
Fc变体可能与融合伴侣可操作连接，以使所表达的蛋白质的靶向、纯化、筛选、展示等能实现。融合伴侣可通过接头序列与Fc变体序列连接。接头序列通常包含少数氨基酸，一般少于10个，尽管也可使用更长的接头。一般而言，所选择的接头序列应具有柔性并能抗降解。本领域技术人员将领会，许多序列可用作为接头。例如，常用的接头序列包含氨基酸序列GGGGS。融合伴侣可以是靶向或信号序列，引导Fc变体和任何关联融合伴侣到期望的细胞部位或细胞外介质。本领域公知，某些信号序列可将蛋白质靶向分泌到培养基中或位于细胞的内外膜之间的周质空间。融合伴侣也可以是编码使纯化和/或筛选能实现的肽或蛋白质的序列。这样的融合伴侣包括但不限于多组氨酸标签(His标签)(例如H6和H10或用于固定化金属亲和层析(IMAC)***(如Ni+2亲和柱)的其它标签)、GST融合物、MBP融合物、Strep标签、细菌酶BirA的BSP生物素化靶序列、以及受抗体靶向的表位标签(例如c-myc标签、flag标签等等)。本领域技术人员将领会，此类标签可用于纯化、筛选或两者。例如，Fc变体可使用His标签通过将其固定在Ni+2亲和柱上而得到纯化，接着在纯化后同样的His标签可用于将抗体固定在Ni+2包被的板上以进行ELISA或其它结合测定(如下所述)。融合伴侣可使利用选择方法筛选Fc变体成为可能(参见下文)。能用于多种选择方法的融合伴侣为本领域众所周知，所有这些融合伴侣都可供本发明使用。举例来说，通过将Fc变体文库的成员与基因III蛋白融合，可采用噬菌体展示(Kay et al.，Phage display of peptides and proteins：a laboratory manual，Academic Press，San Diego，CA，1996；Lowman et al.，1991，Biochemistry 30：10832-10838；Smith，1985，Science 228：1315-1317)。融合伴侣能使Fc变体得到标记。或者，融合伴侣可结合表达载体上的特定序列，能使该融合伴侣和相关Fc变体与编码它们的核酸共价或非共价连接。例如，USSN09/642,574；USSN 10/080,376；USSN 09/792,630；USSN 10/023,208；USSN09/792,626；USSN 10/082,671；USSN 09/953，351；USSN 10/097,100；USSN60/366,658；PCT WO 00/22906；PCT WO 01/49058；PCT WO 02/04852；PCTWO 02/04853；PCT WO 02/08023；PCT WO 01/28702；和PCT WO 02/07466描述了这样的融合伴侣和技术，可供本发明使用。
本领域众所周知向宿主细胞中导入外源核酸的方法，所述方法可随所使用的宿主细胞而变化。技术包括但不限于右旋糖苷介导的转染、磷酸钙沉淀、氯化钙处理、polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、病毒或噬菌体感染、多核苷酸包囊于脂质体中、以及直接将DNA显微注射入细胞核。在哺乳动物细胞的情况中，转染可以是瞬时的或稳定的。
在一个优选的实施方案中，Fc变体在表达后得到纯化或分离。可以本领域技术人员公知的多种方式分离或纯化蛋白质。标准的纯化方法包括层析技术，包括离子交换、疏水相互作用、亲和、尺寸或凝胶过滤、以及反相，在大气压或高压下使用诸如FPLC和HPLC的***进行。纯化方法还包括电泳、免疫学、沉淀、透析以及层析聚焦技术。超滤和渗滤技术与蛋白质浓缩结合也是有用的。本领域众所周知，许多天然蛋白质结合Fc和抗体，这些蛋白质可供本发明用于纯化Fc变体。例如，细菌蛋白质A和G结合Fc区。同样的，细菌蛋白质L结合某些抗体的Fab区，当然就像抗体的靶抗原。纯化通常能通过特定的融合伴侣得到进行。例如，如果使用GST融合物，则Fc变体可使用谷胱甘肽树脂进行纯化，如果使用His标签，则可使用Ni+2亲和层析，或如果使用flag标签，则可使用固定化抗flag抗体。关于合适的纯化技术的常规指导，参见Protein Purification：Principles andPractice，第3版，Scopes，Springer-Verlag，NY，1994。必需的纯化程度将随Fc变体的筛选或用途而改变。在有些情况中无需纯化。例如在一个实施方案中，如果Fc变体是分泌的，那么可直接从培养基进行筛选。本领域众所周知，有些选择方法并不涉及蛋白质纯化。因此，举例来说，如果Fc变体文库制成噬菌体展示文库，则可不进行蛋白质纯化。
实验测定法
Fc变体可使用多种方法进行筛选，包括但不限于使用体外测定法、体内和基于细胞的测定法以及选择技术的那些方法。在筛选流程中可利用自动化和高通量筛选技术。筛选可使用融合伴侣或标记物。上文已讨论了融合伴侣的使用。本文中“标记的”指本发明的Fc变体具有一种或多种附在其上使筛选中的检测成为可能的元件、同位素或化合物。一般而言，标记物分成三类：a)免疫标记物，可以是掺入作为融合伴侣的表位，该表位受抗体所识别，b)同位素标记物，可以是放射性或重同位素，以及c)小分子标记物，可包括荧光和比色染料，或诸如生物素的使其它标记方法实现的分子。标记物可以掺入到化合物中的任何位置，并可在蛋白质表达过程中在体外或体内掺入。
[158]在一个优选的实施方案中，在体外测定法中筛选Fc变体的功能和/或生物物理特性。对于筛选感兴趣的特性而言，体外测定法可给予广阔的动态范围。可筛选的Fc变体特性包括但不限于稳定性、溶解度和对Fc配体，例如FcγR的亲和力。可同时或单独筛选多种特性。根据测定法的需要，蛋白质可以是纯化的或未纯化的。在一个实施方案中，筛选是对于Fc变体与已知或认为结合Fc变体的蛋白质或非蛋白质分子的结合的定性或定量结合测定法。在一个优选的实施方案中，筛选是用于测量与靶抗原结合的结合测定法。在一个备选的优选实施方案中，筛选是对于Fc变体与Fc配体的结合的测定法，包括但不限于FcγR家族、新生儿受体FcRn、补体蛋白C1q、以及细菌蛋白质A和G。所述Fc配体可来自任何生物体，优选人、小鼠、大鼠、兔和猴。可使用多种本领域公知的多种方法进行结合测定法，包括但不限于基于FRET(荧光共振能量转移)和BRET(生物发光共振能量转移)的测定法、AlphaScreenTM(放大的发光邻近均质测定法)、闪烁邻近测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、SPR(表面激元共振，也称为
)、等温滴定量热法、差示扫描量热法、凝胶电泳以及包括凝胶过滤的层析。这些和其它方法可利用Fc变体的某些融合伴侣或标记物。测定法可采用多种检测方法，包括但不限于显色的、荧光的、发光的或同位素标记物。
Fc变体的生物物理特性，例如稳定性和溶解度，可使用本领域已知的多种方法进行筛选。可通过测量折叠和解折叠状态之间的热力学平衡来测定蛋白质稳定性。例如，可使用化学变性剂、加热或pH使本发明的Fc变体解折叠，该转换可使用包括但不限于圆二色谱法、荧光光谱法、吸收光谱法、NMR光谱法、热量测定法以及蛋白水解法的方法来监测。本领域技术人员将领会，还可使用这些和其它技术来监测折叠和解折叠转换的动力学参数。可使用本领域公知的许多方法，定量或定性测定Fc变体的溶解度和总体结构完整性。可供本发明用于鉴定Fc变体生物物理特性的方法包括凝胶电泳、等电聚焦、毛细管电泳、层析诸如大小排阻层析、离子交换层析和反相高效液相层析、肽作图、寡糖作图、质谱法、紫外吸收光谱法、荧光光谱法、圆二色谱法、等温滴定量热法、差示扫描量热法、分析性超速离心法、动态光散射法、蛋白水解法以及交联法、浊度测量法、过滤阻滞测定法(filter retardation assays)、免疫测定法、荧光染料结合测定法、蛋白质染色测定法、显微镜检法以及通过ELISA或其它结合测定法对聚集体的检测。也可使用采用X-射线晶体学技术和NMR光谱法的结构分析。在一个实施方案中，可通过测定在规定的某一段时间后蛋白质溶解的量来测量稳定性和/或溶解度。在该测定法中，蛋白质可以暴露或不暴露于某些极端条件，例如提高的温度、低pH或存在变性剂。因为行使功能通常需要稳定、可溶的和/或适当折叠/结构的蛋白质，前述功能和结合测定法也提供了执行上述测量的方法。例如，可对包含Fc变体的溶液测定其结合靶抗原的能力，接着在提高的温度暴露一段或多段规定的时间，然后再次测定与抗原的结合。因为预期解折叠和聚集的蛋白质无法结合抗原，所以保留的活性量提供了对Fc变体的稳定性和溶解度的量度。
在一个优选的实施方案中，使用一种或多种基于细胞的或体外测定法筛选文库。对于这样的测定法，通常外源添加纯化的或未纯化的Fc变体，使得细胞暴露于属于文库的单个变体或成组的变体。这些测定通常但不总是基于抗体或Fc融合物结合靶抗原并介导某些生化事件的能力的生物学，所述生化事件例如效应器功能像细胞溶解、吞噬、配体/受体结合抑制、生长和/或增殖的抑制、凋亡等等。这样的测定法常常牵涉监测细胞对Fc变体的应答，例如细胞存活、细胞死亡、细胞吞噬、细胞溶解、细胞形态的变化、或转录激活诸如天然基因或报道基因的细胞表达。例如，这样的测定法可测量Fc变体引发ADCC、ADCP或CDC的能力。对于某些测定法而言，可能需要添加除靶细胞之外的另外的细胞或组分，例如血清补体或效应细胞诸如外周血单核细胞(PBMC)、NK细胞、巨噬细胞等。这样的另外的细胞可来自任何生物体，优选人、小鼠、大鼠、兔和猴。交联或单体的抗体和Fc融合物可引起表达抗体的靶抗原的某些细胞系凋亡，或它们可通过已添加到测定法中的免疫细胞介导对靶细胞的攻击。用于监测细胞死亡或生存力的方法为本领域所公知，包括使用染料、荧光团、免疫化学、细胞化学和放射性试剂。例如，胱天蛋白酶测定法或膜联蛋白荧光缀合物可能能测量凋亡，放射性底物的摄取或释放(如铬-51释放测定法)或荧光染料诸如alamar蓝的代谢减少可能能监测细胞生长、增殖或活化。在一个优选的实施方案中，使用了基于EuTDA的细胞毒性测定法(Perkin Elmer，MA)。或者，可通过测量一种或多种天然胞内蛋白质例如乳酸脱氢酶的释放来监测死亡或损伤的靶细胞。转录激活还可在基于细胞的测定法中用作测定功能的方法。在这种情况中，可通过测定可能上调或下调的天然基因或蛋白质来监测应答，例如可测量某些白介素的释放，或者可通过萤光素酶或GFP-报道基因构建物读出结果。基于细胞的测定法还可牵涉细胞应答Fc变体存在的形态学改变的测量。用于上述测定法的细胞类型可以是原核或真核的，并可使用本领域公知的多种细胞系。或者，使用经编码Fc变体的核酸转化或转染的细胞进行基于细胞的筛选。
体外测定法包括但不限于结合测定法、ADCC、CDC、细胞毒性、增殖、过氧化物/臭氧释放、效应细胞的趋化性，效应器功能降低的抗体对上述测定的抑制；活性范围诸如大于100x改善或大于100x减少，由这样的受体谱预期的受体活化和测定结果。
临床前试验和动物模型
可在细胞、组织以及完整生物体实验中鉴定本发明Fc变体的生物学特性。本领域公知，通常在动物中测试药物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、犬、猫、猪和猴，以便测量药物对疾病或疾病模型治疗的功效，或测量药物的药动学、毒性及其它特性。所述动物可称为疾病模型。至于本发明的Fc变体，在使用动物模型以评估候选多肽在人中的功效的潜力时面临特定的挑战——这是因为，至少部分是因为对人Fc受体的亲和力具有特定影响的Fc变体可能对直向同源动物受体不具类似的亲和力影响的事实。与真实直向同源物的正确分派(assignment)相关的不可避免的不确定性(Mechetinaet al.，Immunogenetics，200254：463-468)，以及某些直向同源物并不仅仅存在于动物中的事实(例如人有FcγRIIa而小鼠没有)进一步加剧了这些问题。常常在小鼠中测试治疗剂，包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、异种移植小鼠和转基因小鼠(包括敲进和敲除)。例如，意在作为抗癌治疗剂的本发明的抗体或Fc融合物可在小鼠癌症模型中测试，例如异种移植小鼠。在该方法中，将肿瘤或肿瘤细胞系移植或注射入小鼠，随后用治疗剂处理小鼠以测定抗体或Fc融合物减缓或抑制癌生长和转移的能力。一种备选的方法是使用SCID鼠模型，其中给免疫缺陷小鼠注射人PBL，赋予小鼠半功能性的且人的免疫***——具有合适的一组人FcγR——随后注射靶向所注射人肿瘤细胞的抗体或Fc多肽。在这样的模型中，靶向期望抗原(诸如SkOV3卵巢癌细胞上的her2/neu)的Fc多肽在小鼠中与人PBL相互作用以招致破坏肿瘤的效应器功能。这样的实验可提供有意义的数据用于确定所述Fc变体用作治疗剂的可能性。任何生物体，优选哺乳动物，皆可用于测试。例如因为猴与人的遗传相似性，所以它们可以是合适的治疗模型，因此可用于测试本发明Fc多肽的功效、毒性、药动学或其它特性。对于批准作为药物而言，最终必需在人体中测试本发明的Fc变体，因此当然要考虑这些实验。因此本发明的Fc变体可在人体中测试以确定它们的治疗功效、毒性、药动学和/或其它临床特性。
在动物模型或人中，本发明的Fc变体可赋予Fc多肽治疗剂以优良的性能。如本说明书中所描述的，例如可选择这样的Fc变体的受体结合谱以增加细胞毒性药物的效力或靶向特定效应器功能或效应细胞以改善药物作用的选择性。此外，可选择能减少某些或所有效应器功能的受体结合谱，由此减少这种Fc多肽药物的副作用或毒性。例如，可选择具有与FcγRIIIa、FcγRI和FcγRIIa结合减弱的Fc变体以消除大多数细胞介导的效应器功能，或者可选择具有与C1q结合减弱的Fc变体以限制补体介导的效应器功能。在某些背景中，已知这样的效应器功能具有潜在的毒性作用，因此消除它们可增加Fc多肽药物的安全性，而这种改善的安全性可在动物模型中鉴定。在某些背景中，已知这样的效应器功能介导期望的治疗活性，因此增加它们可增加Fc多肽药物的活性或效力，而这种改善的活性或效力可在动物模型中鉴定。
可在多种同位肿瘤模型中测试优化的Fc变体。在像胰腺、***和乳腺癌的攻击性癌症的病理生理学和疗法研究中，这些临床相关动物模型是重要的。免疫剥夺的小鼠，包括但不限于无胸腺裸鼠或SCID小鼠，常常用于评估从器官内(如胰腺、***或乳腺)注射供体患者的人肿瘤细胞或片段的部位扩散的局部和***肿瘤。
在优选的实施方案中，可对本发明的Fc变体评估在各种人类疾病的临床相关动物模型中的功效。在许多情况中，相关模型包括特定肿瘤抗原的各种转基因动物。相关转基因模型诸如表达人Fc受体(如FcγRIIIa包括γ链、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb等)的那些可用于评估和测试本发明Fc多肽的功效。通过导入在小鼠或其它啮齿类动物中直接或间接介导效应器功能的人基因对Fc变体的评估可使在肿瘤毒性或其它疾病诸如自身免疫病和RA中的功效的生理学研究得以实现。人Fc受体诸如FcγRIIIa可具有多态性，诸如在位置158(如所述的为V或F)，其使特定的人多态性及组合导入啮齿类动物进一步得以实现。牵涉多态性特异FcγR的多种研究并不局限于本节中，但涵盖本申请全文中大体上指定的FcγR的所有讨论和应用。在这样的转基因模型中，本发明的Fc变体可赋予Fc多肽以优良的活性。具体而言，具有对人FcγRIIIa介导的活性优化的结合谱的变体可能在转基因CD16(FcγRIII)小鼠中显示优良的活性。对于具有对人Fc受体如FcγRIIa、FcγRI等优化的结合谱的Fc变体，在这些相应受体的转基因小鼠中可观察到类似的功效改善。对于具有对多种人受体优化的结合谱的Fc变体，转入相应多种受体的转基因小鼠将显示改善的活性，例如表1中所概述的。
以转基因动物模型的形式将靶肿瘤抗原诸如人CD20导入啮齿类动物B细胞可用于提供对功效更相关的评估。同样的，靶抗原不必限于完全人的构建物，但可以是包含靶抗原相关人表位的融合蛋白。在一个优选的实施方案中，Fc多肽的测试可包括转基因模型***，其包括但不限于人靶抗原和人Fc受体的组合(如CD16和介导效应器功能的其它相关受体)，以评估功效和破坏肿瘤的活性。
在一个优选的实施方案中，可对靶向Her2抗原的本发明Fc多肽(如mu4D5的Fc变体或其人源化类似物)评估在乳腺癌的临床相关小鼠模型中的功效。相关模型的实例包括但不限于：1)HER2/neu(neu-N)-转基因小鼠，其衍生自亲本FVB/N小鼠品系并转入大鼠的原癌基因HER2/neu(neu)；和2)在鼠乳腺肿瘤病毒启动子下过表达人HER2的转基因小鼠(Finkle et al.，2004，Clin Cancer Res.10(7)：2499-511)。在这些模型中显示优良功效的本发明Fc多肽代表了用于进一步开发的有希望的候选物。
因为与使用动物模型来鉴定候选治疗性抗体在人类患者中的潜在功效有关的困难和不确定性，所以某些本发明的变体多肽可作为替代物用于评估在人中的潜在功效。这样的替代物分子将优选在动物***中模拟FcγR和/或相应候选人Fc变体的补体生物学。这种模拟最有可能通过特定Fc变体与动物较之人受体之间的相对结合亲和力而得到证实。例如，如果使用小鼠模型来评估对人FcγRIIIa具有增强亲和力的Fc变体在人中的潜在功效，那么合适的替代变体将对小鼠FcγRIII-2(小鼠CD16-2)具有增强的亲和力。或者，如果使用小鼠模型来评估对人抑制性受体FcγRIIb具有降低亲和力的Fc变体在人中的潜在功效，那么合适的替代变体将对小鼠FcγRII具有降低的亲和力。还应当注意，可在人Fc变体、动物Fc变体或两者的背景中创建替代Fc变体。
在一个优选的实施方案中，Fc变体的测试可包括在灵长类动物(如猿猴模型)中的功效研究以利于评估怀有靶抗原的特定靶细胞的损耗。另外的灵长类动物模型包括但不限于自身免疫、移植和癌症治疗研究中的恒河猴模型以及Fc多肽。
进行毒性研究以确定在标准药理学图谱中无法评估的或仅在重复施用试剂后发生的Fc多肽相关效应。大多数毒性测试在两种物种(一种啮齿类动物和一种非啮齿类动物)中进行以确保在新的治疗性实体导入人之前不忽略任何不期望的不利效应。一般而言，这些模型可测量多种毒性，包括基因毒性、慢性毒性、免疫原性、生殖/发育毒性以及致癌性。前述参数包括食物消耗、体重、抗体形成、临床化学的标准测量以及标准器官/组织的宏观和微观检查(如心脏毒性)。另外的测量参数是注射部位创伤和中和抗体的测量，如果有的话。传统上，对裸露的或缀合的单克隆抗体治疗剂评估与正常组织的交叉反应性、免疫原性/抗体产生、放射性标记种类的缀合或接头毒性和“旁观者”毒性。虽然如此，这样的研究可能必须对特定内容加以个别考虑并遵循ICH S6(上文也标注的生物技术产品的安全研究)的指导。同样的，普遍原则在于产品充分的得到鉴定并除去杂质/污染物，在开发过程中测试物质是可比较的，并符合GLP。
可在多种动物***中研究本发明Fc变体的药动学(PK)，最相关的是非人灵长类动物诸如猕猴、恒河猴。单次或重复静脉内/皮下施用6000倍的剂量范围(0.05-300mg/kg)可使用血浆浓度和清除来评估半衰期(几天到几周)，并可测量稳定状态下的分布容量和***吸收水平。这样的测量参数的实例通常包括最大实测血浆浓度(Cmax)、达到Cmax的时间(Tmax)、血浆浓度-时间曲线的时间0到无穷大的面积[AUC(0-inf)]以及表观消除半衰期(T1/2)。另外的测量参数可包括静脉内施药后所获得的浓度-时间数据的区室分析以及生物利用度。已经为Rituxan和Zevalin建立了使用猕猴的药理学/毒理学研究的实例，其中对CD20的单克隆抗体有交叉反应性。也可在啮齿类动物模型中进行生物分布、剂量测定(对于放射性标记的抗体或Fc融合物)和PK研究。这样的研究将评估在施用的所有剂量下的耐受、对局部组织的毒性、对啮齿类异种移植动物模型的优先定位、靶细胞(如CD20阳性细胞)的损耗。
在动物***或人中本发明的Fc变体可赋予Fc多肽治疗剂以优良的药动学。例如，对FcRn增强的结合可增加Fc多肽的半衰期和暴露。或者，在减少暴露有利的情况中，诸如当这样的药物具有副作用时，对FcRn减弱的结合可减少Fc多肽的半衰期和暴露。
本领域公知，在不同免疫细胞类型上以及在不同组织中Fc受体组差异表达。Fc受体的特异性组织分布可最终影响本发明Fc变体的药效学(PD)和药动学(PK)特性。因为所述的Fc变体对Fc受体组具有不同的亲和力，对于确定每种候选多肽所赋予的PD、PK的最佳平衡以及治疗功效，对多肽进一步筛选PD和/或PK特性可能是极其有用的。
药效学研究可包括但不限于靶向特定肿瘤细胞或阻断信号机制、测量靶抗原表达细胞或信号的损耗等。本发明的Fc变体可靶向特定的效应细胞群并因此指导Fc多肽募集某些活性以改善效力或增加进入特别有利的生理区室的侵入。例如，可通过优先靶向FcγRIIIb的Fc变体而靶向嗜中性粒细胞活性和定位。可在动物模型或人中证实这样的药效学效应。
Fc变体的治疗应用
本发明的Fc变体可用于多种治疗目的。本领域技术人员将领会，本发明的Fc变体可用于可使用抗体、Fc融合物等的任何治疗目的。在一个优选的实施方案中，对患者施用Fc变体以治疗包括但不限于自身免疫性和炎性疾病、传染病和癌症的紊乱。
对于本发明的目的而言，“患者”包括人和其它动物，优选哺乳动物，最优选人。因此本发明的Fc变体可用于人治疗和兽医两种应用。本发明中术语“治疗”意图包括对疾病或紊乱的治疗性处理，以及预防性或抑制性措施。因此，举例来说，在疾病发作前成功施用Fc变体导致对疾病的治疗。作为另一个实例，在疾病临床表现后成功施用优化的Fc变体以对抗疾病症状构成对疾病的治疗。“治疗”还涵盖在疾病出现后施用优化的Fc变体以根除疾病。在发作后以及在临床症状已经形成后成功施用试剂，有可能消除临床症状并有可能改善疾病，构成对疾病的治疗。那些“需要治疗的”包括已患有疾病或紊乱的哺乳动物，以及易患上疾病或紊乱的那些哺乳动物，包括其中疾病或紊乱有待预防的那些哺乳动物。
在一个实施方案中，对患有牵涉蛋白质或其它分子不当表达的疾病的患者施用本发明的Fc变体。在本发明的范围内，这意图包括特征为例如由于蛋白质存在的量、蛋白质定位、翻译后修饰、构象状态的改变、突变或病原体蛋白质的存在等引起的异常蛋白质的疾病和紊乱。类似的，疾病或紊乱可具有分子改变的特点，包括但不限于多糖和神经节苷脂。过量可能归因于任何原因，包括但不限于分子水平上的过表达、在作用部位的出现延长或累积、或相对于正常值增加的蛋白质活性。该定义包括特征为蛋白质减少的疾病和紊乱。该减少可能归因于任何原因，包括但不限于分子水平上的表达减少、在作用部位的出现缩短或减少、蛋白质的突变形式、或相对于正常值减少的蛋白质活性。可相对于正常的表达、出现或蛋白质活性测量这样的蛋白质过量或减少，且所述测量可能在本发明Fc变体的开发和/或临床测试中起重要作用。
本文中“癌症”和“癌性的”指的是或描述哺乳动物中通常特征为不受调节的细胞生长的生理条件。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤(包括脂肉瘤)、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、施旺细胞瘤(schwanoma)、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、以及白血病或淋巴恶性肿瘤。
这样的癌症的更具体实例包括血液学恶性肿瘤，诸如何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤；非何杰金氏淋巴瘤(伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞性白血病、蕈样肉芽肿病、外套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性巨大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、毛细胞性白血病和淋巴浆细胞性白血病)、淋巴细胞前体细胞的肿瘤，包括B细胞急性成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤、和T细胞急性成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK细胞的肿瘤，包括外周T细胞白血病、成熟T细胞白血病/T细胞淋巴瘤和大颗粒淋巴细胞性白血病、朗格汉斯(Langerhans)细胞组织细胞增多症、骨髓瘤形成诸如急性骨髓性白血病，包括伴有成熟的AML、没有分化的AML、急性前髓细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、和急性单核细胞性白血病、脊髓发育不良综合征、和慢性骨髓增生障碍，包括慢性髓细胞性白血病；中枢神经***的肿瘤，诸如神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、星细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤和视网膜母细胞瘤；头和颈(如鼻咽癌、唾液腺癌和食管癌)、肺(如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状细胞癌)、消化***(如胃(gastric)或胃(stomach)癌包括胃肠癌、胆管或胆道的癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌和***癌)、生殖***(如睾丸、***或***癌、子宫、***、外阴、宫颈、卵巢和子宫内膜癌)、皮肤(如黑素瘤、基细胞癌、鳞状细胞癌、光线性角化病)、肝(如肝癌(liver cancer)、肝癌(hepatic carcinoma)、肝细胞癌和肝细胞瘤)、骨(如破骨细胞瘤和溶骨性骨癌)、其它组织或器官(如胰腺癌、膀胱癌、肾(kidney)或肾脏(renal)癌、甲状腺癌、乳腺癌、腹膜的癌和卡波西(Kaposi)氏肉瘤)的实体瘤、以及血管***的肿瘤(如血管肉瘤和血管外皮细胞瘤(hemagiopericytoma))。
本文中“自身免疫病”包括同种异体胰岛移植排斥、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森(Addison)氏病、抗中性白细胞胞质自身抗体(ANCA)、肾上腺的自身免疫病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性心肌炎、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、自身免疫性***和***、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性荨麻疹、贝切特(Behcet)氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯尔曼(Castleman)氏综合征、口炎性腹泻-皮炎、慢性疲劳免疫机能异常综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、丘-施(Churg-Strauss)二氏综合征、疤痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩(Crohn)氏病、皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合型冷球蛋白血症、因子VIII缺乏症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格雷夫斯(Grave)氏病、格-巴(Guillain-Barre)二氏、古德帕斯丘(Goodpasture)氏综合征、移植物抗宿主病(GVHD)、桥本(Hashimoto)氏甲状腺炎、血友病A、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病、IgM多神经病、免疫介导的血小板减少症、幼年型关节炎、川崎(Kawasaki)氏病、扁平苔藓(lichen plantus)、红斑狼疮(lupus erthematosis)、梅尼尔(Meniere)氏病、混合性***病、多发性硬化症、I型糖尿病、重症肌无力、寻常天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎(polychrondritis)、多腺性综合征、风湿性多肌病、多肌炎和皮肌炎、原发性无γ球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、银屑病、银屑病关节炎、Reynauld氏现象、莱特尔(Reiter)氏综合征、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦(Sjorgen)氏综合征、实体器官移植排斥、僵人综合征、***性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓性血小板减少性紫癜、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎病诸如疱疹样皮炎血管炎、白癜风和韦格纳(Wegner)氏肉芽肿病。
本文中“炎性紊乱”包括急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性脓毒性关节炎、变应性脑脊髓炎、变应性鼻炎、变应性脉管炎、***反应、哮喘、动脉粥样硬化、由于慢性细菌或病毒感染引起的慢性炎症、慢性阻塞性肺病(COPD)、冠心病、脑炎、炎性肠病、炎性骨质溶解、与急性和迟发性超敏反应有关的炎症、与肿瘤有关的炎症、周围神经损伤或脱髓鞘性疾病、与组织创伤诸如烧伤和局部缺血有关的炎症、由脑膜炎引起的炎症、多器官损伤综合征、肺纤维化、脓毒症和败血性休克、斯-约(Stevens-Johnson)二氏综合征、未分化的关节化脓、以及未分化的脊椎关节病。
本文中“传染病”包括由诸如病毒、细菌、真菌、原生动物和寄生虫的病原体引起的疾病。传染病可由病毒引起，包括腺病毒、巨细胞病毒、登革热病毒、EB病毒、汉坦病毒、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人***瘤病毒(HPV)、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、乳多泡病毒、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒、牛瘟病毒、鼻病毒、轮状病毒、风疹病毒、SARS病毒、天花病毒、病毒性脑膜炎病毒等等。传染病也可由细菌引起，包括炭疽杆菌(Bacillus antracis)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉(Diptheria)、大肠杆菌(E.Coli)、军团菌(Legionella)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、分枝杆菌(Mycobacterium)立克次氏体(rickettsia)、支原体(Mycoplasma)奈瑟氏菌(nesisseria)、百日咳(Pertussis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎链球菌(S.Pneumonia)、链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、霍乱弧菌(Vibria cholerae)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)等等。传染病还可由真菌引起，诸如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、皮炎芽生酵母(Blastomyces dermatitidis)、白色假丝酵母(Candida albicans)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、夹膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、马尼弗氏青霉(Penicillium marneffei)等等。传染病还可由原生动物和寄生虫引起，诸如衣原体、kokzidioa、利什曼原虫、疟原虫、立克次体、锥虫等等。
此外，本发明的Fc变体可用于预防或治疗另外的状况，包括但不限于心脏状况诸如充血性心力衰竭(CHF)、心肌炎和其它心肌状况；皮肤状况诸如蔷薇疹(rosecea)、痤疮和湿疹；骨和牙状况诸如骨丢失、骨质疏松、佩吉特(Paget)氏病、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、牙周病、不用性骨量减少、骨软化症、单骨纤维性骨发育不良、多发性骨纤维性发育不良、骨转移、骨痛处理、体液恶性高钙血症、牙周再建、脊髓损伤和骨折；代谢状况诸如高歇(Gaucher)氏病；内分泌状况诸如库兴(Cushing)氏综合征；以及神经学状况。
配制、施用和剂量给药
设想了其中本发明的Fc变体与一种或多种治疗活性剂配制的药用组合物。制备本发明Fc变体的配制剂，即将具有所需纯化程度的所述Fc变体与任选的制药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980)，以冻干剂型或水溶液的形式贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；甜味剂和其它芳香剂；填充剂，诸如微晶纤维素、乳糖、玉米和其它淀粉；粘合剂；添加剂；着色剂；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。在一个优选的实施方案中，包含本发明Fc变体的药用组合物可以水溶性形式存在，诸如以制药学可接受盐存在，其意图包括酸和碱加成盐二者。“制药学可接受的酸加成盐”指那些保留游离碱的生物学效力且在生物学或其它方面没有不良特性，用无机酸和有机酸形成的盐，所述无机酸诸如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等，而所述有机酸诸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等等。“制药学可接受的碱加成盐”包括那些由无机碱衍生的盐，诸如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等等。特别优选铵、钾、钠、钙和镁盐。由制药学可接受的有机无毒碱衍生的盐包括伯、仲和叔胺、取代胺包括天然存在取代胺、环胺和碱性离子交换树脂诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。用于体内施用的剂型优选是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤或其它方法来实现。
本文公开的Fc变体还可配制成免疫脂质体。脂质体是一种小囊泡，包含可用于将治疗剂投递至哺乳动物的不同类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂。可通过本领域公知方法来制备含有Fc变体的脂质体，诸如Epstein et al.，1985，Proc Natl Acad Sci USA，82：3688；Hwang et al.，1980，Proc Natl Acad SciUSA，77：4030；US 4,485,045；US 4,544,545；和PCT WO 97/38731中所描述的。US 5,013,556中公开了具有延长的循环时间的脂质体。脂质体的成分通常排列成双分子层结构，类似于生物膜的脂质排列。可通过反相蒸发法使用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生特别有用的脂质体。将脂质体从具有规定孔径的滤器挤出以产生具有期望直径的脂质体。任选在脂质体中含有化疗剂或其它治疗活性剂(Gabizon et al.，1989，J National Cancer Inst 81：1484)。
还可将Fc变体和其它治疗活性剂包裹于通过包括但不限于凝聚技术、界面聚合(例如使用羟甲基纤维素或明胶微胶囊或聚(甲基丙烯酸酯)微胶囊)的方法制备的微胶囊、胶体药物投递***(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)以及粗滴乳状液中。这样的技术披露于《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980中。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括固相疏水性聚合物的半透性基质，该基质以成型产品的形式存在，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(US 3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON
(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)、聚-D-(-)-3-羟基丁酸以及
(可从Alkermes购得)，其是由掺入聚-DL-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质的期望生物活性分子组成的基于微球体的投递***。
包含本发明Fc变体的药用组合物的施用，优选以无菌水溶液的形式，可以多种方式进行，包括但不限于口服、皮下、静脉内、鼻内、耳内、经皮、局部(如凝胶剂、油膏剂、洗剂、霜剂等)、腹膜内、肌内、肺内、经***、肠胃外、经直肠或眼内。在某些情况中，例如用于处理伤口、炎症等，Fc变体可作为溶液或喷雾剂直接应用。本领域公知，药用组合物可根据导入方式而相应进行配制。
在某些情况中优选皮下施用，因为患者可自己施用药用组合物。对于皮下施用而言，许多蛋白质治疗剂并不足以有效的供以最大限度可接受体积配制治疗有效剂量之用。通过使用包含精氨酸-HCl、组氨酸和聚山梨醇酯的蛋白质剂型可部分解决该问题(参见WO 04091658)。由于例如增加的效力、改善的血清半衰期或增加的溶解度，本发明的Fc多肽可能更适于皮下施用。
本领域公知，蛋白质治疗剂常常通过静脉内输注或推注投递。本发明的Fc变体也可使用这样的方法投递。例如，用0.9％氯化钠作为输注媒介通过静脉内输注进行静脉施用。
可使用吸入器或喷雾器以及包含雾化剂的剂型实现肺部投递。例如，可使用可从Aradigm购买的
可吸入技术或可从Nektar Therapeutics购买的InhanceTM肺部投递***。本发明的Fc变体可能更适于肺内投递。FcRn存在于肺中，且可能促进从肺到血流的转运(如Syntonix WO 04004798，Bitonti et al.(2004)Proc.Nat.Acad.Sci.101：9763-8)。因此，在肺中更有效的结合FcRn或在血流中更有效释放的抗体或Fc融合物可能在肺内施用后具有改善的生物利用度。由于例如改善的溶解度或改变的等电点，本发明的Fc变体还可能更适于肺内施用。
此外，由于例如在胃pH下改善的溶解度以及对蛋白水解增加的抗性，本发明的Fc多肽可能更适于口服投递。此外，FcRn似乎在成人的肠上皮细胞中表达(Dickinson et al.，1999，J Clin Invest 104：903-11)，故具有改善的FcRn相互作用谱的本发明Fc多肽例如抗体或Fc融合物可能在口服后显示提高的生物利用度。还可在其它粘膜处发生FcRn介导的Fc变体转运，诸如在胃肠、呼吸和生殖道粘膜处(Yoshida et al.，2004，Immunity 20：769-83)。
此外，本领域公知许多投递***且可用于施用本发明的Fc变体。实例包括但不限于包囊在脂质体、微粒、微球体(如PLA/PGA微球体)等等中。或者，可以使用多孔的、非多孔的或凝胶状物质，包括膜或纤维的植入物。持续释放***可包含聚合材料或基质，诸如聚酯、水凝胶、聚(乙烯醇)、聚交酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、乙烯-醋酸乙烯、乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON
以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。还有可能施用编码本发明Fc变体的核酸，例如通过逆转录病毒感染、直接注射或包被脂质、细胞表面受体或其它转染剂。在所有情况中，可使用受控释放***在期望作用部位或其附近释放Fc变体。
在一个优选的实施方案中，选择的给药数量和频率在治疗或预防上是有效的。本领域公知，可能必须对于蛋白质降解、***性较之局部化投递、和新蛋白酶合成速率，以及年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和状况的严重程度进行调整，并可由本领域技术人员通过常规实验方法来确定。
配制剂中治疗活性Fc变体的浓度可从约0.1到100重量％变化。在一个优选的实施方案中，Fc变体的浓度在0.003-1.0摩尔的范围内。为了治疗患者，可施用治疗有效剂量的本发明Fc变体。本文中“治疗有效剂量”指所施用的产生效力的剂量。精确剂量将取决于治疗目的，并可由本领域技术人员使用公知技术来确定。剂量范围可为0.0001-100mg/kg体重或更大，例如0.1、1、10或50mg/kg体重，优选1-10mg/kg。
在有些实施方案中，仅使用单次剂量的Fc变体。在其它实施方案中，施用多剂量的Fc变体。施用间的实耗时间可小于1小时、约1小时、约1-2小时、约2-3小时、约3-4小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约2-4天、约4-6天、约1周、约2周或大于2周。
在其它实施方案中，本发明的Fc变体以有节奏(metronomic)的剂量方案施用，或通过连续输注或频繁施用而无延长的休息期。这样的有节奏施用可能牵涉以不变的间隔给药而无休息期。典型的是，这样的方案涵盖长期低剂量或连续输注较长一段时间，例如1-2天、1-2周、1-2月、或直到6个月或更久。使用较低剂量可使副作用及对休息期的需要减到最小。
在某些实施方案中，将本发明的Fc变体和一种或多种其它预防或治疗剂循环施用于患者。循环疗法牵涉在一个时间施用第一药剂，在第二时间施用第二药剂，任选在另外的时间施用另外的药剂，任选有休息期，以及然后重复该施用顺序一次或多次。循环次数通常为2-10次。循环疗法可减少对一种或多种药剂抗性的发展，可使副作用减到最小，或可改善疗效。
联合疗法和共同疗法
本发明的Fc变体与一种或多种其它治疗方案或药剂相伴施用。另外的治疗方案或药剂可用于改善Fc变体的功效或安全性。同样，另外的治疗方案或药剂可用于治疗相同的疾病或同病(comorbidity)而非改变Fc变体的作用。例如，可将本发明的Fc变体与化疗、放疗或两者一起施用于患者。本发明的Fc变体可与一种或多种其它预防或治疗剂联合施用，包括但不限于胞毒剂、化疗剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管生成剂、保心药、免疫刺激剂、免疫抑制剂、促进血液学细胞增殖的药剂、血管生成抑制剂、蛋白质酪氨酸激酶(PTK)抑制剂、另外的Fc变体、FcγRIIb或其它Fc受体抑制剂、或其它治疗剂。
术语“联合”及“共同施用”不限于在恰好相同的时间施用所述预防或治疗剂。相反，它指以某种顺序和在一定时间间隔内施用本发明的Fc变体和其它药剂使得它们可共同作用以提供较之仅用本发明的Fc变体或其它药剂增加的益处。优选Fc变体和其它药剂起累加作用，尤其优选起协同作用。这样的分子适合以对于预期目的有效的量联合存在。熟练的医务人员可凭经验或考虑到药剂的药动学和作用模式而确定每种治疗剂的合适剂量以及合适的施用时间和方法。
在一个实施方案中，本发明的Fc变体与包含抗体或Fc的一种或多种另外的分子一起施用。本发明的Fc变体可与在治疗相同疾病或另外的同病中有功效的一种或多种其它抗体共同施用；例如可施用识别在给定癌症类型中过表达的两种抗原或介导自身免疫病或传染病发病机理的两种抗原的两种抗体。
可共同施用的抗癌抗体的实例包括但不限于抗17-IA细胞表面抗原抗体诸如PanorexTM(edrecolomab)；抗4-1BB抗体；抗4Dc抗体；抗A33抗体诸如A33和CDP-833；抗α4β1整联蛋白抗体诸如natalizumab；抗α4β7整联蛋白抗体诸如LDP-02；抗αVβ1整联蛋白抗体诸如F-200、M-200和SJ-749；抗αVβ3整联蛋白抗体诸如abciximab、CNTO-95、Mab-17E6和VitaxinTM；抗补体因子5(C5)抗体诸如5G1.1；抗CA125抗体诸如(oregovomab)；抗CD3抗体诸如
(visilizumab)和Rexomab；抗CD4抗体诸如IDEC-151、MDX-CD4、OKT4A；抗CD6抗体诸如溶瘤素(oncolysin)B和溶瘤素CD6；抗CD7抗体诸如HB2；抗CD19抗体诸如B43、MT-103和溶瘤素B；抗CD20抗体诸如2H7、2H7.v16、2H7.v114、2H7.v115、
(tositumomab)、
(rituximab)、
(Ibritumomab tiuxetan)和PRO70769；抗CD22抗体诸如LymphocideTM(epratuzumab)；抗CD23抗体诸如IDEC-152；抗CD25抗体诸如basiliximab和
(daclizumab)；抗CD30抗体诸如AC10、MDX-060和SGN-30；抗CD33抗体诸如
(gemtuzumab ozogamicin)、溶瘤素M和Smart M195；抗CD38抗体；抗CD40抗体诸如SGN-40和toralizumab；抗CD40L抗体诸如5c8、AntovaTM和IDEC-131；抗CD44抗体诸如bivatuzumab；抗CD46抗体；抗CD52抗体诸如
(alemtuzumab)；抗CD55抗体诸如SC-1；抗CD56抗体诸如huN901-DM1；抗CD64抗体诸如MDX-33；抗CD66e抗体诸如XR-303；抗CD74抗体诸如IMMU-110；抗CD80抗体诸如galiximab和IDEC-114；抗CD89抗体诸如MDX-214；抗CD123抗体；抗CD138抗体诸如B-B4-DM1；抗CD146抗体诸如AA-98；抗CD148抗体；抗CEA抗体诸如cT84.66、labetuzumab和PentaceaTM；抗CTLA-4抗体诸如MDX-101；抗CXCR4抗体；抗体诸如ABX-EGF、
(cetuximab)、IMC-C225和Merck Mab 425；抗EpCAM抗体诸如Crucell的抗EpCAM、ING-1和IS-IL-2；抗肝配蛋白B2/EphB4抗体；抗Her2抗体诸如
MDX-210；抗FAP(成纤维细胞活化蛋白)抗体诸如sibrotuzumab；抗铁蛋白抗体诸如NXT-211；抗FGF-1抗体；抗FGF-3抗体；抗FGF-8抗体；抗FGFR抗体；抗血纤蛋白抗体；抗G250抗体诸如WX-G250和
抗GD2神经节苷脂抗体诸如EMD-273063和TriGem；抗GD3神经节苷脂抗体诸如BEC2、KW-2871和mitumomab；抗gpIIb/IIIa抗体诸如ReoPro；抗肝素酶抗体；抗Her2/ErbB2抗体诸如
(trastuzumab)、MDX-210和pertuzumab；抗HLA抗体诸如
Smart 1D10；抗HM1.24抗体；抗ICAM抗体诸如ICM3；抗IgA受体抗体；抗IGF-1抗体诸如CP-751871和EM-164；抗IGF-1R抗体诸如IMC-A12；抗IL-6抗体诸如CNTO-328和elsilimomab；抗IL-15抗体诸如HuMaxTM-IL15；抗KDR抗体；抗层粘连蛋白5抗体；抗Lewis Y抗原抗体诸如Hu3S193和IGN-311；抗MCAM抗体；抗Muc1抗体诸如BravaRex和TriAb；抗NCAM抗体诸如ERIC-1和ICRT；抗PEM抗原抗体诸如Theragyn和Therex；抗PSA抗体；抗PSCA抗体诸如IG8；抗Ptk抗体；抗PTN抗体；抗RANKL抗体诸如AMG-162；抗RLIP76抗体；抗SK-1抗原抗体诸如Monopharm C；抗STEAP抗体；抗TAG72抗体诸如CC49-SCA和MDX-220；抗TGF-β抗体诸如CAT-152；抗TNF-α抗体诸如CDP571、CDP870、D2E7、
(adalimumab)和
(infliximab)；抗TRAIL-R1和TRAIL-R2抗体；抗VE-钙粘着蛋白-2抗体；以及抗VLA-4抗体诸如AntegrenTM。此外，可以使用抗独特型抗体，包括但不限于GD3表位抗体BEC2和gp72表位抗体105AD7。此外，还可使用双特异性抗体，包括但不限于抗CD3/CD20抗体Bi20。
可共同施用以治疗自身免疫性或炎性疾病、移植排斥、GVHD等的抗体的实例包括但不限于抗α4β7整联蛋白抗体诸如LDP-02，抗β2整联蛋白抗体诸如LDP-01，抗补体(C5)抗体诸如5G1.1，抗CD2抗体诸如BTI-322、MEDI-507，抗CD3抗体诸如OKT3、SMART抗CD3，抗CD4抗体诸如IDEC-151、MDX-CD4、OKT4A，抗CD11a抗体，抗CD14抗体诸如IC14，抗CD18抗体，抗CD23抗体诸如IDEC 152，抗CD25抗体诸如Zenapax，抗CD40L抗体诸如5c8、Antova、IDEC-131，抗CD64抗体诸如MDX-33，抗CD80抗体诸如IDEC-114，抗CD147抗体诸如ABX-CBL，抗E-选择蛋白抗体诸如CDP850，抗gpIIb/IIIa抗体诸如ReoPro/Abcixima，抗ICAM-3抗体诸如ICM3，抗ICE抗体诸如VX-740，抗FcR1抗体诸如MDX-33，抗IgE抗体诸如rhuMab-E25，抗IL-4抗体诸如SB-240683，抗IL-5抗体诸如SB-240563、SCH55700，抗IL-8抗体诸如ABX-IL8，抗干扰素γ抗体，以及抗TNFa抗体诸如CDP571、CDP870、D2E7、Infliximab、MAK-195F，抗VLA-4抗体诸如Antegren。可共同施用以治疗自身免疫性或炎性疾病、移植排斥、GVHD等的其它含Fc分子的实例包括但不限于p75TNF受体/Fc融合物
(依那西普(etanercept))和Regeneron的IL-1 trap。
可共同施用以治疗传染病的抗体的实例包括但不限于抗炭疽抗体诸如ABthrax，抗CMV抗体诸如CytoGam和sevirumab，抗隐孢子虫抗体诸如CryptoGAM、Sporidin-G，抗螺杆菌抗体诸如Pyloran，抗乙肝抗体诸如HepeX-B、Nabi-HB，抗HIV抗体诸如HRG-214，抗RSV抗体诸如felvizumab、HNK-20、palivizumab、RespiGam，以及抗葡萄球菌抗体诸如Aurexis、Aurograb、BSYX-A110和SE-Mab。
或者，本发明的Fc变体可与竞争结合一种或多种Fc受体的一种或多种其它分子共同施用。例如，共同施用抑制性受体FcγRIIb的抑制剂可导致效应器功能增强。类似的，共同施用活化受体例如FcγRIIIa的抑制剂可将不需要的效应器功能减到最小。Fc受体抑制剂包括但不限于经过改造而作为竞争性FcγR抑制剂起作用的Fc变体，以及其它免疫球蛋白和特异性静脉内免疫球蛋白(IVIg)。在一个实施方案中，施用抑制剂并容许在施用Fc变体前起作用。实现顺序剂量给药效果的一种备选方式将是提供Fc受体抑制剂的直接释放剂量形式以及随后的本发明Fc变体的持续释放剂型。立即释放和受控释放剂型可分开施用或联合为一种单位剂量形式。FcγRIIb抑制剂的施用还可用于限制不需要的免疫应答，例如在对血友病患者施用因子VIII后的抗因子VIII抗体应答。
在一个实施方案中，本发明的Fc变体与化疗剂一起施用。本文所用“化 疗剂”指在癌症治疗中有用的化学化合物。化疗剂的实例包括但不限于烷化剂类，诸如噻替哌(thiotepa)和环膦酰胺(cyclosphosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；抗生素类，诸如阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加利车霉素、carabicin、caminomycin、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗***类，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制4(5)-咪唑的芳香酶、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene，Fareston)；抗代谢物，诸如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、氨甲蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；氮丙啶类，诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；氮芥类，诸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；硝基脲类，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；蛋白质，诸如精氨酸脱亚氨酶和天冬酰胺酶；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；紫杉烷类，如紫杉醇paclitaxel(
Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和doxetaxel(
Rhne-Poulenc Rorer，Antony，France)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；胸苷酸合酶抑制剂(诸如拓优得(Tomudex))；另外的化疗剂包括醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；磷胺氮芥(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；依洛尼塞(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(″Ara-C″)；环磷酰胺；塞替哌(thiotepa)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊拜膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；视黄酸；esperamicins；卡培他滨(capecitabine)。还可使用上述任何物质的制药学可接受的盐、酸或衍生物。
化疗剂或其它胞毒剂可作为前药施用。本文所用“前药”指与母药(parentdrug)相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性亲本形式的前体或衍生物形式药用活性物质。参见例如Wilman，1986，Biochemical Society Transactions，615th Meeting Belfast，14：375-382；和Stella et al.，“Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”，Directed Drug Delivery，Borchardt et al.，(ed.)：247-267，Humana Press，1985。可供本发明使用的前药包括但不限于含磷酸盐(酯)前药、含硫代磷酸盐(酯)前药、含硫酸盐(酯)前药、含肽前药、D-氨基酸修饰前药、糖基化前药、含β-内酰胺前药、含任选取代苯氧基乙酰胺的前药或含任选取代苯乙酰胺的前药、可转化为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟胞嘧啶前药。可衍生为与本发明Fc变体一起使用的前药形式的胞毒性药物的例子包括但不限于任何上述化疗剂。
多种其它治疗剂可用于与本发明的Fc变体一起施用。在一个实施方案中，Fc变体与抗血管生成剂一起施用。本文所用“抗血管生成剂”指在一定程度上阻断或干扰血管发育的化合物。抗血管生成因子可以是例如结合牵涉促进血管生成的生长因子或生长因子受体的小分子或蛋白质例如抗体、Fc融合物或细胞因子。本文优选的抗血管生成因子是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体。也可使用抑制经VEGF发信号的其它药剂，例如可降低VEGF或VEGF-R表达水平的基于RNA的治疗剂，VEGF-毒素融合物，Regeneron的VEGF-trap，以及结合VEGF-R的抗体。在一个备选的实施方案中，Fc变体与诱导或增强适应性免疫应答的治疗剂，例如靶向CTLA-4的抗体一起施用。另外的抗血管生成剂包括但不限于血管抑素(纤溶酶原片段)、抗凝血酶III、angiozyme、ABT-627、Bay 12-9566、氟草胺(benefin)、bevacizumab、双膦酸盐(bisphosphonate)、BMS-275291、软骨衍生抑制剂(CDI)、CAI、CD59补体片段、CEP-7055、Col 3、考布他汀(combretastatin)A-4、内皮抑素(胶原XVIII片段)、法呢基转移酶抑制剂、纤连蛋白片段、gro-beta、卤夫酮(halofuginone)、肝素酶、肝素己糖片段、HMV833、人绒毛膜***(hCG)、IM-862、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素诱导蛋白10(IP-10)、白介素-12、三环5(纤溶酶原片段)、马立马司他(marimastat)、金属蛋白酶抑制剂(例如TIMP)、2-methodyestradiol、MMI 270(CGS 27023A)、纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI)、血小板因子-4(PF4)、普啉司他(prinomastat)、促乳素16kD片段、多育曲菌素相关蛋白(PRP)、PTK787/ZK 222594、类维A、索立司他(solimastat)、角鲨胺、SS3304、SU5416、SU6668、SU11248、四氢皮质醇-S、四硫代钼酸盐、沙利度胺(thalidomide)、血小板反应蛋白-1(TSP-1)、TNP-470、转化生长因子-β(TGF-β)、脉管抑素(vasculostatin)、血管形成抑制素(vasostatin，钙网蛋白片段)、ZS6126、以及ZD6474。
在一个优选的实施方案中，Fc变体与酪氨酸激酶抑制剂一起施用。本文所用“酪氨酸激酶抑制剂”指在一定程度上抑制酪氨酸激酶活性的分子。这样的抑制剂的实例包括但不限于喹唑啉，诸如PD 153035、4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶；嘧啶并嘧啶；吡咯并嘧啶，诸如CGP 59326，CGP60261及CGP 62706；吡唑并嘧啶，4-(苯胺基)-7H-吡咯(2，3-d)嘧啶；姜黄素(二阿魏酰甲烷，4，5-双(4-氟苯胺基)-酞亚胺)；含硝基噻吩的tyrphostine；PD-0183805(Warner-Lambert)；反义分子(如结合编码ErbB的核酸的分子)；喹喔啉(US 5,804,396)；tryphostin(US 5,804,396)；ZD6474(Astra Zeneca)；PTK-787(Novartis/Schering A G)；泛ErbB抑制剂，诸如C1-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS 3521；Isis/Lilly)；甲磺酸伊马替尼(STI571，
Novartis)；PKI 166(Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；C 1-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxinib(Sugen)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imclone)；或任-下述专利出版物中记载的化合物：US 5,804,396；PCT WO 99/09016(American Cyanimid)；PCT WO98/43960(American Cyanamid)；PCT WO 97/38983(Warner-Lambert)；PCTWO 99/06378(Warner-Lambert)；PCT WO 99/06396(Warner-Lambert)；PCTWO 96/30347(Pfizer，Inc)；PCT WO 96/33978(AstraZeneca)；PCT WO96/3397(AstraZeneca)；PCT WO 96/33980(AstraZeneca)，gefitinib(IRESSATM，ZD1839，AstraZeneca)，及OSI-774(TarcevaTM，OSI Pharmaceuticals/Genentech)。
在另一个实施方案中，Fc变体与一种或多种免疫调节剂一起施用。这样的试剂可增加或减少一种或多种细胞因子的生成，上调或下调自身抗原呈递，掩蔽MHC抗原，或促进一种或多种类型免疫细胞的增殖、分化、迁移或激活。免疫调节剂包括但不限于：非类固醇抗炎药物(NSAID)，诸如asprin(阿司匹林)、ibuprofed(布洛芬)、塞来考昔(celecoxib)、双氯芬酸(diclofenac)、依托度酸(etodolac)、菲诺洛芬(fenoprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、ketoralac(酮咯酸)、奥沙普秦(oxaprozin)、nabumentone(萘丁美酮)、舒林酸(sulindac)、tolmentin(托美丁)、罗非考昔(rofecoxib)、萘普生(naproxen)、酮洛芬(ketoprofen)及萘丁美酮(nabumetone)；类固醇(如糖皮质激素、***(dexamethasone)、可的松(cortisone)、羟化可的松(hydroxycortisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、***(prednisone)、***龙(prednisolone)、trimcinolone、柳氮磺吡啶类廿碳烷(azulfidineicosanoid)，诸如***素、血栓烷、及白三烯；以及局部类固醇，诸如蒽林(anthralin)、卡钙三烯(calcipotriene)、氯倍他索(clobetasol)及他扎罗汀(tazarotene))；细胞因子，诸如TGFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-2、IL-4、IL-10；细胞因子、趋化因子、或受体拮抗剂，包括针对BAFF、B7、CCR2、CCR5、CD2、CD3、CD4、CD6、CD7、CD8、CD11、CD14、CD15、CD17、CD18、CD20、CD23、CD28、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD52、CD64、CD80、CD86、CD147、CD152、补体因子(C5、D)CTLA4、嗜酸性粒细胞趋化因子、Fas、ICAM、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNAR、IgE、IL-1、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5R、IL-6、IL-8、IL-9、IL-12、IL-13、IL-13R1、IL-15、IL-18R、IL-23、整合蛋白、LFA-1、LFA-3、MHC、选择蛋白、TGFβ、TNFα、TNFβ、TNF-R1、T-细胞受体的抗体、可溶性受体和受体-Fc融合物，包括
(etanercept)、
(adalimumab)、
(infliximab)；异源抗淋巴细胞清蛋白；其它免疫调节分子，诸如2-氨基-6-芳基-5取代嘧啶、MHC结合肽和MHC片段的抗独特型抗体、硫唑嘌呤(azathioprine)、布喹那(brequinar)、溴隐亭(bromocryptine)、环磷酰胺、环胞菌素A、D-青霉胺、脱氧精胍菌素、FK506、戊二醛、金、羟氯喹、来氟米特(leflunomide)、malononitriloamides(如来氟米特)、氨甲喋呤、米诺环素(minocycline)、咪唑立宾(mizoribine)、麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil)、雷帕霉素(rapamycin)、及sulfasasazine。
在一个备选实施方案中，本发明的Fc变体与细胞因子一起施用。本文所用“细胞因子”指由一种细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。这样的细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒(Mullerian)氏抑制性物质；小鼠***相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；***-I和-II；***(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)、和粒细胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养的蛋白质以及天然序列细胞因子的生物学活性等同物。
在一个优选的实施方案中，细胞因子或刺激免疫***细胞的其它药剂，与本发明的Fc变体共同施用。这样的治疗模式可增强希望的效应器功能。例如，可共同施用刺激NK细胞的药剂，包括但不限于IL-2。在另一个实施方案中，可共同施用刺激巨噬细胞的药剂，包括但不限于C5a、甲酰基肽诸如N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(Beigier-Bompadre et al.(2003)Scand.J.Immunol.57：221-8)。也可施用刺激嗜中性粒细胞的药剂，包括但不限于G-CSF、GM-CSF等等。此外，可使用促进此类免疫刺激性细胞因子迁移的药剂。包括但不限于干扰素γ、IL-3和IL-7的其它药剂也可促进一种或多种效应器功能。在一个备选的实施方案中，细胞因子或抑制效应细胞功能的其它药剂，与本发明的Fc变体共同施用。这样的治疗模式可限制不期望的效应器功能。
在另一个实施方案中，Fc变体与一种或多种抗生素一起施用，包括但不限于：氨基糖苷类抗生素(例如安普霉素(apramycin)、阿贝卡星(arbekacin)、斑贝霉素(bambermycins)、布替罗星(butirosin)、地贝卡星(dibekacin)、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星(netilmicin)、巴龙霉素(paromomycin)、核糖霉素(ribostamycin)、西索霉素(sisomycin)、spectrinomycin(壮观霉素))、氨基环醇类抗生素(例如sprctinomycin)、amphenicol类抗生素(例如叠氮氯霉素(azidamfenicol)、氯霉素、florfrnicol和thiamphemicol)、安沙霉素(ansamycin)抗生素(例如利福米特(rifamide)和利福平(rifampin))、碳青霉烯类(例如亚胺培南(imipenem)、美罗培南(meropenem)、帕尼培南(panipenem))；头孢菌素类(例如头孢克洛(cefaclor)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢孟多(cefamandole)、头孢曲秦(cefatrizine)、头孢西酮(cefazedone)、头孢唑兰(cefozopran)、头孢咪唑(cefpimizole)、头孢匹胺(cefpiramide)、头孢匹罗(cefpirome)、头孢丙烯(cefprozil)、cefuroxine(头孢呋辛)、头孢克肟(cefixime)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢雷定(cephradine))、头霉素类(头孢拉宗(cefbuperazone)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢米诺(cefminox)、头孢美唑(cefmetazole)和头孢替坦(cefotetan))；林可酰胺类(例如克林霉素(clindamycin)、林可霉素(lincomycin))；大环内酯类(例如阿奇霉素(azithromycin)、布雷菲德菌素(brefeldin)A、克拉霉素(clarithromycin)、红霉素(erythromycin)、罗红霉素(roxithromycin)、妥布霉素(tobramycin))、单环β-内酰胺类(例如氨曲南(aztreonam)、卡芦莫南(carumonam)和tigernonam)；莫匹罗星(mupirocin)；氧头孢烯类(例如氟氧头孢(flomoxef)、拉氧头孢(latamoxef)和moxalactam)；青霉素类(例如氮卓西林(amdinocillin)、氮卓西林匹酯(amdinocillin pivoxil)、阿莫西林(amoxicillin)、巴卡西林(bacampicillin)、bexzylpenicillinic acid(苄基青霉酸)、苄青霉素钠、依匹西林(epicillin)、芬贝西林(fenbenicillin)、氟氯西林(floxacillin)、培那西林(penamecillin)、氢碘酸喷沙西林(penethamatehydriodide)、对-苯乙苄胺青霉素(penicillin o-benethamine)、青霉素O、青霉素V、苯甲酸青霉素V、海巴明青霉素V(penicillin V hydrabamine)、青哌环素(penimepicycline)和phencihicillin potassium(青霉素钾))；多肽类(例如杆菌肽、粘菌素、多粘菌素B、替考拉宁(teicoplanin)、万古霉素(vancomycin))；喹诺酮类(氨氟沙星(amifloxacin)、西诺沙星(cinoxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、恩氟沙星(enrofloxacin)、feroxacin、氟甲喹(flumequine)、加替沙星(gatifloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、格帕沙星(grepafloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、萘啶酸(nalidixic acid)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、奥索利酸(oxolinic acid)、培氟沙星(pefloxacin)、吡哌酸()pipemidic acid、罗索沙星(rosoxacin)、芦氟沙星(rufloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、替马沙星(temafloxacin)、托氟沙星(tosufloxacin)、曲伐沙星(trovafloxacin))；利福平(rifampin)；链霉杀阳菌素类(streptogramin)(例如奎奴普丁(quinupristin)、达福普汀(dalfopristin))；磺胺类(磺胺、磺胺甲噁唑)；四环烯类(tetracyclene)(金霉素(chlortetracycline)、盐酸地美环素(demeclocycline hydrochloride)、去甲金霉素、多西环素(doxycycline)、耐久霉素(duramycin)、米诺环素(minocycline)、新霉素、土霉素(oxytetracycline)、链霉素、四环素、万古霉素)。
还可使用抗真菌剂，例如两性霉素B、环吡酮(ciclopirox)、克霉唑(clotrimazole)、益康唑(econazole)、氟康唑(fluconazole)、氟胞嘧啶(flucytosine)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、niconazole(烯效唑)、制霉菌素(nystatin)、特比萘芬(terbinafine)、特康唑(terconazole)、和噻康唑(tioconazole)。
还可使用抗病毒剂，包括蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、以及包括I型干扰素、病毒融合抑制剂和神经氨酸酶抑制剂在内的其它试剂。可以使用的抗病毒剂的实例包括但不限于阿昔洛韦(acyclovir)、阿德福韦(adefovir)、金刚烷胺(amantadine)、安泼那韦(amprenavir)、clevadine(克来夫定)、enfuvirtide、恩替卡韦(entecavir)、福斯卡尼(foscarnet)、gangcyclovir、碘苷(idoxuridine)、茚地那韦(indinavir)、洛匹那韦(lopinavir)、普来可那立(pleconaril)、利巴韦林(ribavirin)、金刚乙胺(rimantadine)、利托那韦(ritonavir)、沙奎那韦(saquinavir)、曲氟尿苷(trifluridine)、阿糖腺苷(vidarabine)、以及齐多夫定(zidovudine)。
本发明的Fc变体可与其它治疗方案联合。例如，在一个实施方案中，将用本发明的抗体或Fc融合物治疗的患者还可接受放疗。放疗可根据本领域常常采用的和本领域技术人员知道的方案施行。这样的疗法包括但不限于铯、铱、碘或钴照射。放疗可以是全身照射，或者可以是局部针对身体特定部位或组织，诸如肺、膀胱或***。典型的，放疗脉冲施用约1-2周时间。然而，放疗可施行更长时间。例如，放疗可对头颈部癌症患者施行约6-约7周。任选的，放疗可以作为单剂量或多次连续剂量施用。熟练医务人员可以凭经验确定对本文有用的放疗的合适剂量。根据本发明的另一个实施方案，采用本发明的Fc变体和一种或多种其它抗癌疗法回体(exvivo)处理癌细胞。设想了这样的回体处理在骨髓移植和特别是在自体骨髓移植中可能是有用的。例如，用Fc变体和一种或多种其它抗癌疗法诸如上文所述处理含癌细胞的细胞或组织，可用于在接受者患者移植之前耗减或基本上耗减癌细胞。
放疗也可包括用同位素标记的分子诸如抗体进行治疗。放射免疫疗法的实例包括但不限于ZevalinTM(Y-90标记的抗CD20)、LymphoCideTM(Y-90标记的抗CD22)和BexxarTM(I-131标记的抗CD20)。
当然设想了可联合还有一些其它治疗技术采用本发明的Fc变体，诸如外科手术或光照疗法。
临床试验设计和批准后治疗策略
临床实验和治疗的药物基因组方法是本发明的实施方案。可能与本发明的Fc变体相互作用的许多受体在人群中具有多态性。对于给定的患者或患者群来说，本发明Fc变体的功效可能受蛋白质特定多态性存在与否的影响。例如，FcγRIII在位置158有多态性，通常是V(高亲和力)或F(低亲和力)。具有V/V纯合基因型的患者观察到对抗CD20抗体
(rituximab)治疗有较好的临床应答(Carton et al.，2002，Blood 99：754-758；Weng et al.，2003，J Clin Oncol 21：3940-3947；Dall’Ozzo et al.，2004，CancerRes 64：4664-9)。另外的多态性包括但不限于FcγRIIa R131或H131，而这样的多态性，根据多态性的不同，已知增加或降低Fc结合及随后的生物学活性。本发明的Fc变体可能优先结合受体的特定多态形式，例如F158FcγRIIIa，或者以等同的亲和力结合受体特定位置的所有多态性，例如FcγRIIIa的V158和F158多态性。在一个优选的实施方案中，对多态性提供等同结合的本发明Fc变体可用于抗体中，以消除在不同多态性患者之间看到的差异功效。这种特性可能在治疗响应中有更好的一致性，并减少不响应的患者群。等同结合受体多态性的此类Fc变体可通过调节与相关Fc受体的结合而具有增加的生物学活性，诸如ADCC、CDC或循环半衰期，或者降低活性。在一个优选的实施方案中，本发明的Fc变体可以以更高或更低亲和力结合受体多态性之一，或是加强结合中存在的差异或是使差异逆转。这种特性可能允许产生对拥有该多态性患者群的功效特定改造的治疗剂。例如，拥有以高亲和力结合Fc的FcγRIIb多态性患者群，可接受含有对这种受体多态性形式有降低结合的Fc变体的药物，从而产生更加有效的药物。
在一个优选的实施方案中，对患者筛选一种或多种多态性，以预测本发明Fc变体的功效。该信息可用于例如选择临床试验包括在内或排除在外的患者，或者在批准后用于给医师和患者提供关于合适剂量和治疗选择的指导。例如，抗CD20抗体rituximab在对F158FcγRIIIa纯合或杂合的患者中效果最低(Carton et al.，2002，Blood 99：754-758；Weng et al.，2003，J ClinOncol 21：3940-3947；Dall’Ozzo et al.，2004，Cancer Res 64：4664-9)。这样的患者可能对包含本发明Fc变体的抗体显示出改进的临床应答。在一个实施方案中，如果患者的基因型指示他们可能对本发明的抗体较之一种或多种当前使用的抗体治疗剂具有显著更好的应答，则选择他们包括在临床试验内。在另一个实施方案中，用该基因型信息决定合适的剂量和治疗方案。在另一个实施方案中，根据患者的多态性基因型，选择患者包括在临床试验内或在批准后接受治疗，其中这样的治疗包含改造成对该人群有特定效果的Fc变体，或者其中这样的治疗包含对多态性的不同形式不显示差异活性的Fc变体。
本发明还包括鉴定有可能对本发明的Fc变体显示出良好的临床应答，或者在用本发明的Fc变体治疗时较之一种或多种当前使用抗体治疗剂可能显示出显著更好的应答的患者的诊断测试。可以使用本领域已知的用于测定人FcγR多态性的多种方法之一。
在一个优选的实施方案中，对患者筛选以预测本发明Fc多肽的功效。该信息可用于例如选择临床试验包括在内或排除在外的患者，或者在批准后用于给医师和患者提供关于合适剂量和治疗方案的指导。筛选可牵涉测定靶抗原的表达水平或分布。例如，Her2/neu表达水平目前用于选择将对trastuzumab疗法有最好应答的患者。筛选还可牵涉测定遗传多态性，例如关于FcγR或FcαR的多态性。例如，对FcγRIIIa的F158多态性形式的纯合或杂合患者，可能对本发明的Fc多肽有更良好的临床应答。从患者筛选获得的信息可用于选择包括在临床试验内的患者，确定合适的剂量和治疗方案，或者用于其它临床应用。本发明包括鉴定可能对本发明Fc多肽显示出良好临床应答，或者在用本发明的Fc多肽治疗时较之一种或多种当前使用的生物治疗剂可能显示出显著更好的应答的患者的诊断测试。可以使用本领域已知的用于测定人体中抗原表达水平、抗原分布和/或遗传多态性的多种方法中的任意一种。
此外，本发明包括对临床样品诸如血液和组织样品进行的预后测试。这样的测试可分析效应器功能活性，包括但不限于调理作用、ADCC、CDC、ADCP、或者不考虑机理对癌细胞或其它致病细胞的杀伤作用。在一个优选的实施方案中，使用ADCC测定法，诸如本文所描述的，来预测对于特定患者而言给定的本发明Fc多肽的功效。该信息可用于鉴定临床实验包括在内或排除在外的患者，或者用于告知关于合适剂量和治疗方案的决定。该信息还可用于选择含有特定Fc变体的药物，所述Fc变体在这样的分析法中显示出优异活性。
实施例
下文提供了实施例以举例说明本发明。这些实施例并非意图将本发明限制于任何特定的操作应用或理论。
对本发明讨论的所有位置来说，编号依照EU索引或EU编号方案(Kabatet al.，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.，UnitedStates Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda)，它涉及EU抗体的编号(Edelman et al.，1969，Proc Natl Acad Sci USA 63：78-85)。抗体领域技术人员将领会，这些惯例包括免疫球蛋白序列特定区域的非连续编号，从而能够对免疫球蛋白家族中的保守位置有标准化参考。因此，根据EU索引定义的任何给定免疫球蛋白的位置将不必对应于其连续序列。图3显示了抗体alemtuzumab的连续和EU索引编号方案，以更清晰的举例说明该原则。还应该注意，在许多Fc位置处观察到多态性，包括但不限于Kabat 270、272、312、315、356及358，因此在所呈现的序列和科学文献中的序列之间可能存在微小差异。
使用USSN 10/672,280和USSN 10/822,231中描述的基于计算和测序的方法，设计Fc变体和Fc变体文库。以连续多轮计算和实验筛选，设计实验文库。后续Fc文库的设计可以从前文库的反馈受益，因此典型的包括在前轮筛选中显示出有利特性的Fc变体的组合。图4显示了本发明Fc变体中进行氨基酸修饰的残基，定位到人Fc/FcγRIIIb结构上。构建并经实验测试的整组Fc变体如图41所示。
实施例1：分子生物学和蛋白表达/纯化
大多数Fc变体实验在抗癌抗体alemtuzumab(
IlexPharmaceuticals LP的注册商标)的背景中进行。Alemtuzumab结合其靶抗原CD52内的线性短表位(Hale et al.，1990，Tissue Antigens 35：118-127；Hale，1995，Immunotechnology 1：175-187)。选择Alemtuzumab作为初始改造模板，是因为其功效部分归于其募集效应细胞的能力(Dyer et al.，1989，Blood73：1431-1439；Friend et al.，1991，Transplant Proc 23：2253-2254；Hale et al.，1998，Blood 92：4581-4590；Glennie et al.，2000，Immunol Today 21：403-410)，以及因为在结合实验中，其抗原的生产和使用都相对简单。为了在其它抗体的背景中评价本发明的优化Fc变体，在抗Her2抗体trastuzumab(
Genentech的注册商标)、抗CD20抗体rituximab(
IDEC Pharmaceuticals Corporation的注册商标)、抗EGFR抗体cetuximab(
Imclone的注册商标)、以及抗CD20抗体PRO70769(PCT/US2003/040426，题为“Immunoglobulin Variants and Uses Thereof”(免疫球蛋白变体及其应用))中评价所选的Fc变体。用于筛选目的的alemtuzumab、trastuzumab、rituximab、cetuximab及PRO70769的使用，并不意味着将本发明限制于任何特定的抗体。
使用递归PCR构建alemtuzumab(campath-1H James et al.，1999，J MolBiol 289：293-301)、trastuzumab(hu4D5-8；Carter et al.，1992，Proc Natl AcadSci USA 89：4285-4289；Gerstner et al.，2002，J.Mol.Biol.，321：851-862)、rituximab(C2B8，US 6,399,061)、以及cetuximab(C225，PCT US96/09847)的IgG1全长轻链(VL-CL)和重链(VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3)抗体基因，含有方便的末端限制性位点以利于亚克隆。将基因连接到哺乳动物表达载体pcDNA3.1Zeo(Invitrogen)中，该载体包含全长κ轻链(Cκ)和重链IgG1恒定区。将pcDNA3.1zeo中的VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3克隆作为模板用于Fc区的诱变。利用基于PCR的诱变或快速改变诱变(Stratagene)技术，将突变引入该克隆中。对Fc变体测序，以确认序列的保真度。将含重链基因(VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3)(野生型或变体)的质粒与含轻链基因(VL-CL)的质粒共转染到293T细胞中。转染后5天收获培养基。通过使用缀合有过氧化物酶的山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，产品目录号109-035-088)的western筛选转染瘤的培养物上清液来监测免疫球蛋白表达。图5显示了野生型alemtuzumab及变体1至10在293T细胞中的表达。用蛋白A亲和层析(Pierce，产品目录号20334)从上清液纯化抗体。图6显示了WT alemtuzumab的蛋白质纯化结果。抗体Fc变体显示出与WT相似的表达和纯化结果。将有些Fc变体脱糖基化，以测定缺少碳水化合物时其溶解和功能特性。为获得脱糖基化抗体，将纯化的alemtuzumab抗体与肽-N-糖苷酶(PNGase F)于37℃温育24小时。图7呈现了SDS PAGE凝胶，证实了几种Fc变体和WTalemtuzumab的脱糖基化。
为了证实这些条件下生产的alemtuzumab的功能保真度，在IPTG诱导下在大肠杆菌BL21(DE3)中表达与GST融合的抗原性CD52肽。将未诱导的和诱导的样品在SDS PAGE凝胶上电泳，转移至PVDF膜。为进行western分析，将来自Sotec(终浓度2.5ng/ul)的alemtuzumab或转染293T细胞的培养基(alemtuzumab终浓度约0.1-0.2ng/ul)用作一抗，将缀合有过氧化物酶的山羊抗人IgG用作二抗。图8呈现了这些结果。结合靶抗原的能力证实了所表达alemtuzumab的结构和功能保真度。与WT alemtuzumab有相同可变区的Fc变体，预期保持相当的抗原结合亲和力。
通过PCR从获自Mammalian Gene Collection(MGC：22630)的克隆获得编码人V158 FcγRIIIa胞外区的基因。通过V158 FcγRIIIa基因的诱变，构建了F158 FcγRIIIa。通过递归PCR构建编码人FcγRI、人FcγRIIa、人FcγRIIb、人FcγRIIc、小鼠FcγRIII、以及人FcRnα链及β-微球蛋白链的胞外区的基因。FcγR和FcRnα链在C末端融合有6x His标签和GST标签。将所有基因亚克隆到pcDNA3.1zeo载体中。为进行表达，将含人FcγR的载体转染到293T细胞中，将FcRnα链及β-微球蛋白链共转染到293T细胞中，将小鼠FcγRIII转染到NIH3T3细胞中。3天后收获含所分泌受体的培养基，通过镍亲和层析纯化。为进行western分析，用抗GST抗体探查膜。图9呈现了SDS PAGE凝胶，显示了人γ158 FcγRIIIa的表达和纯化结果。纯化的人C1q蛋白质复合物可通过商业途径购买(Quidel Corp.，San Diego)。
实施例2.Fc配体结合分析
对指定的Fc变体测量与人Fc配体FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、C1q及FcRn的结合。使用AlphaScreenTM测定法(放大的发光邻近均质测定法即Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay(ALPHA)，PerkinElmer，Wellesley，MA)，一种基于珠的发光邻近测定法测量结合亲和力。供体珠的激光激发激发了氧，如果足够接近受体珠则产生级联化学发光事件，最终导致520-620nm处的荧光发射。通过标准方法将WTalemtuzumab抗体生物素化以附着于链霉亲合素供体珠，将GST标记的FcγR和FcRn结合到谷胱甘肽螯合物受体珠上。为进行C1q结合分析，用N-氢化琥珀酰亚胺(NHS)化学法，将未标记的C1q蛋白与Digoxygenin(DIG，Roche)缀合并结合到DIG受体珠上。为进行蛋白A结合分析，直接从PerkinElmer购买蛋白A受体珠。作为用于筛选Fc变体的竞争分析应用AlphaScreen分析。在缺少竞争性Fc变体时，WT抗体与FcγR相互作用，在520-620nm处产生信号。加入的未标记Fc变体与WT Fc/FcγR相互作用竞争，减少了荧光量，从而能够测定相对结合亲和力。在alemtuzumab或trastuzumab的背景中筛选Fc变体，还在rituximab和cetuximab的背景中筛选选定的Fc变体。
图10显示了选择的Fc变体结合人V158FcγRIIIa的AlphaScreen数据。对于每条特定曲线，将结合数据标准化为最大和最小发光信号，其分别由低和高抗体浓度时的基线所提供。采用非线性回归将数据拟合为单一位点竞争模型，这些拟合以图中的曲线呈现。这些拟合提供了每种抗体的50％抑制浓度(IC50)(即50％抑制所需要的浓度)，在图10中用虚线图示，由此能够定量测定Fc变体的相对结合亲和力。将每种变体的IC50除以WTalemtuzumab的IC50，得到相对于WT Herceptin的相对增强或减弱倍数(WT倍数)。本文中，WT alemtuzumab的IC50为(4.63x10-9)x(2)＝9.2nM，而S239D的IC50为(3.98x10-10)x(2)＝0.8nM。因此，与WT alemtuzumab对人V158FcγRIIIa的结合相比，S239D alemtuzumab的结合更紧密9.2nM/0.8nM＝11.64倍。图11a和11b提供了显示其它Fc变体的AlphaScreen数据，所述Fc变体在位置239、264、272、274和332有替代，结合FcγRIIIa更紧密，因此可作为提高Fc多肽效应器功能的候选变体。
还对其它Fc配体平行筛选了Fc变体。如上所述，抑制性受体FcγRIIb在效应器功能中扮演重要角色。图12中提供了由AlphaScreen测得的本发明所选Fc变体与人FcγRIIb结合的示例性数据。FcγRIIa是与FcγRIIb高度同源的活化受体。图13中提供了所选Fc变体与人FcγRIIa的R131多态形式结合的示例性数据。另一种重要的Fc配体是新生儿Fc受体FcRn。如上所述，该受体结合Cγ2和Cγ3结构域之间的Fc区；因为结合介导内体循环，所以Fc对FcRn的亲和力是抗体和Fc融合物药动学的关键决定因素。图14中提供了由AlphaScreen测得的所选Fc变体与FcRn结合的示例性数据。Fc上的FcRn结合位点，在Cγ2和Cγ3结构域之间，与细菌蛋白A和G结合位点交叠。因为蛋白A经常用于抗体纯化，所以对所选变体测试与该Fc配体的结合。图15提供了这些AlphaScreen数据。虽然蛋白A未包括在所有变体的平行筛选中，但Fc变体使用蛋白A层析纯化的能力(参见实施例1)表明，对大多数Fc变体而言，结合蛋白A的能力以及Cγ2-Cγ3铰链区的完整性不受Fc替代的影响。
如上文关于图11所述分析Fc变体结合FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、C1q及FcRn的数据。图41中提供了由AlphaScreen测得的每种变体与每种Fc配体的结合相对于WT的倍数增强或减弱。该表对每种变体呈现了变体编号(变体)、变体的替代、抗体背景(背景)、结合每种Fc配体的相对于WT的倍数亲和力(倍数)及倍数亲和力的置信度
(置信度)，以及IIIa∶IIb特异性比率(IIIa∶IIb)(参见下文)。许多变体获得了多组数据，将给定变体的所有数据一起编组。抗体背景表示对哪种抗体构建了特定Fc变体；a＝alemtuzumab，t＝trastuzumab，r＝rituximab，c＝cetuximab，以及p＝PRO70769。所提供的数据是在所列第一种抗体的背景中获得的，典型的是alemtuzumab，虽然在有些情况中是trastuzumab。星号(*)表示对给定Fc配体的数据是在trastuzumab的背景中获得的。倍数(倍数)在1以上表示相对于亲本抗体对给定Fc配体的结合亲和力增强，倍数在1以下表示结合亲和力减弱。置信度值(置信度)对应于log置信度水平，从数据对S形剂量响应曲线的拟合提供。正如本领域已知的，较低置信度值表示倍数值的误差较低、置信度较高。缺少的给定变体与Fc配体的数据表示该数据的拟合不提供有意义的值，或者没有对该变体测试该Fc配体。
图41显示，许多Fc变体对各种Fc配体获得了增强的亲和力及改变的特异性。有些本发明的Fc变体提供了对不同Fc配体结合亲和力的选择性增强，而其它提供了对不同Fc配体结合亲和力的选择性减弱。本文所用“选 择性增强”指Fc变体对一种或多种Fc配体，相对于一种或多种其它Fc配体，结合亲和力有提高或更大提高。例如，对给定的变体，与比如说FcγRIIa的结合的WT倍数可以比与比如说FcγRIIb的结合的WT倍数更大。本文所用“选择性减弱”指Fc变体对一种或多种Fc配体，相对于一种或多种其它Fc配体，结合亲和力有降低或更大降低。例如，对给定的变体，与比如说FcγRI的结合的WT倍数可以比与比如说FcγRIIb的结合的WT倍数更低。这种选择性的实例是，相对于FcγRI和FcγRIIIa，G236S提供了对FcγRII(IIa、IIb和IIc)的选择性增强，并且相对于FcγRIIb和FcγRIIc，该G236S提供了对FcγRIIa的一定程度更大增强。然而，G236A对FcγRIIa的高度选择性增强，不仅相对于FcγRI和FcγRIIIa，而且相对于FcγRIIb和FcγRIIc。在许多Fc变体中都观察到选择性增强和减弱，包括但不限于在残基L234、L235、G236、S267、H268、R292、E293、Q295、Y300、S324、A327、L328、A330和T335处包含替代的变体。总之，图41提供的数据显示，确实有可能调整Fc区的Fc配体特异性，通常利用极微小的突变差异，尽管有事实表明许多高度同源的受体结合相同的FcγR结合位点。本发明提供了可用于选择性增强和选择性减弱Fc多肽对某些Fc配体相对其它配体的亲和力的许多Fc变体。诸如这些的Fc变体集合，不仅能够生成具有对期望结果进行了改造的效应器功能的抗体和Fc融合物，而且还提供了用于实验分析和鉴定效应器功能生物学的独特试剂组。
如上所述，可能由对激活性FcγR的亲和力高于对抑制性FcγRIIb的亲和力的Fc变体获得最佳效应器功能。确实，获得了多种Fc变体，相对于FcγRIIb，显示出对FcγRIIIa的差异增强结合。图16a和图16b中显示了直接比较具有该特异性谱的两种Fc变体，A330L和A330Y的FcγRIIIa和FcγRIIb结合的AlphaScreen数据。该概念可定量定义为激活性FcγRIIIa的倍数增强或减弱(图41，第12列)除以抑制性FcγRIIb的倍数增强或减弱(图41，第8列)，在本文中称为“FcγRIIIa倍数∶FcγRIIb倍数比率”或“IIIa∶IIb 比率”。该值提供在图41第18列中(IIIa∶IIb)。A330L和A330Y与其它变体的组合，例如A330L/I332E、A330Y/I332、S239D/A330L/I332E，都提供了极好的IIIa∶IIb比率。图41显示，许多Fc变体提供正面的、有利的FcγRIIIa对FcγRIIb特异性谱，IIIa∶IIb比率高达86∶1。
本发明增强效应器功能最有前景的Fc变体中的某些具有对FcγRIIIa的亲和力和有利FcγRIIIa倍数∶FcγRIIb倍数比率的实质性增加。这些变体包括例如S239D/I332E(FcγRIIIa倍数＝56-192，FcγRIIIa倍数∶FcγRIIb倍数＝3)、S239D/A330Y/I332E(FcγRIIIa倍数＝130)、S239D/A330L/I332E(FcγRIIIa倍数＝139，FcγRIIIa倍数∶FcγRIIb倍数＝18)、以及S239D/S298A/I332E(FcγRIIIa倍数＝295，FcγRIIIa倍数∶FcγRIIb倍数＝48)。图17a-17c显示了监测trastuzumab背景中这些及其它Fc变体对人V158 FcγRIIIa和人FcγRIIb结合的AlphaScreen数据。
除了alemtuzumab和trastuzumab以外，在其它抗体的背景中筛选所选Fc变体以研究它们的适用性的宽度。图18和图19中分别显示了在rituximab和cetuximab的背景中测量所选Fc变体对人V158 FcγRIIIa结合的AlphaScreen数据。该结果与先前为alemtuzumab和trastuzumab显示的数据一起表明与抗体背景无关的一致性结合增强，由此表明本发明的Fc变体可广泛应用于抗体和Fc融合物。
如上所述，Fc介导的效应器功能的一项重要参数是Fc对FcγRIIIa的V158和F158两种多态形式的亲和力。图20a(V158 FcγRIIIa)和图20b(F158FcγRIIIa)中显示了比较所选变体与两种受体同种异型结合的AlphaScreen数据。如图所示，所有变体都提高了对两种FcγRIIIa同种异型的结合。这些数据显示具有增强的效应器功能的本发明Fc变体可广泛用于整个患者群，以及临床功效的增强可能对最需要它的低应答患者群最大。
使用表面激元共振(SPR)(Biacore，Uppsala，Sweden)进一步研究了这些Fc变体的FcγR结合亲和力。SPR是能够测量蛋白质-蛋白质相互作用结合亲和力的灵敏且极端定量的方法，该方法已用于有效测量Fc/FcγR结合(Radaev et al.，2001，J Biol Chem 276：16478-16483)。因此，相对于AlphaScreen分析，SPR提供了优越的互补结合分析。将His标记的V158FcγRIIIa固定于SPR芯片上，将WT和Fc变体alemtuzumab抗体以一定浓度范围流过芯片。使用标准曲线拟合方法，通过数据拟合获得结合常数。表3呈现了用SPR获得的所选Fc变体与V158 FcγRIIIa和F158 FcγRIIIa结合的解离常数(Kd)，将这些数据与通过AlphaScreen分析获得的IC50进行了比较。将每种变体的Kd和IC50除以WT alemtuzumab的Kd和IC50，得到相对于WT的提高倍数(WT倍数)。
表3
SPR数据确证了通过AlphaScreen分析观察到的对FcγRIIIa亲和力的提高。表3进一步表明了V264I/I332E和I332E较之S298A和S298A/E333A/K334A的优越性；然而S298A/E333A/K334A分别将Fc对V158和F158FcγRIIIa的结合提高了1.7倍和4.7倍，I332E显示了分别为2.2倍和10.1倍的结合增强，V264I/I332E显示了分别为4.0倍和14倍的结合增强。还值得注意的是，V264I/I332E对F158 FcγRIIIa的亲和力(52nM)好于WT对V158同种异型的亲和力(68nM)，说明该Fc变体以及那些具有甚至更大结合提高的变体可能能够使对低应答患者群的抗体临床功效达到对高应答者当前可能的效果。图21a-21d中显示了SPR与AlphaScreen结合测量之间的相关性。图21a和21b分别显示了结合V158 FcγRIIIa和F158FcγRIIIa的Kd-IC50相关性，图21c和21d分别显示了结合V158 FcγRIIIa和F158 FcγRIIIa的倍数提高相关性。这些数据对直线的较好拟合(r2＝0.9，r2＝0.84，r2＝0.98，以及r2＝0.90)支持AlphaScreen测量的精确性，并确认它可用于测定Fc变体的相对FcγR结合亲和力。
还获得了所选trastuzumab Fc变体对人V158 FcγRIIIa、F158 FcγRIIIa及FcγRIIb的结合SPR数据。这些数据显示在表4中。所测试Fc变体显示出了对活化受体FcγRIIIa的实质性结合增强，S239D/I332E/S298A与F158FcγRIIIa的相互作用观察到有100倍以上的更紧密结合。此外，对最好的FcγRIIIa结合者，观察到F158 FcγRIIIa/FcγRIIb比率为3-4。
表4
如上所述，虽然需要更大的效应器功能，但对有些抗体治疗剂来说，可能期望降低或消除效应器功能。图41中的几种Fc变体实质性降低或消除FcγR结合，因此可用于不期望效应器功能的抗体和Fc融合物。图22a和22b中显示了测量有些示例性Fc变体与人V158 FcγRIIIa结合的AlphaScreen数据。这些Fc变体以及它们的组合应用可用于在期望时消除效应器功能，例如在其作用机理牵涉阻断或拮抗而不是杀伤携带靶抗原的细胞的抗体和Fc融合物中。根据图41提供的数据，用于降低Fc配体结合和/或效应器功能的优选位点，即可进行修饰以降低与一种或多种Fc配体的结合和/或降低效应器功能的位置包括但不限于位置232、234、235、236、237、239、264、265、267、269、270、299、325、328、329和330。
实施例3.Fc变体的ADCC
为测定对效应器功能的效果，对所选Fc变体进行基于细胞的ADCC分析。以纯化的人外周血单核细胞(PBMC)作为效应细胞，使用基于
EuTDA的细胞毒性分析(Perkin Elmer，MA)测量ADCC。用BATDA以1x106细胞/ml加载靶细胞，洗涤4次，以10,000细胞/孔接种至96孔板中。然后用Fc变体或WT抗体以指定终浓度调理靶细胞。以超过靶细胞的指定倍数加入自血沉棕黄层分离的人PBMC，将板于37℃温育4小时。将共培养细胞以500xg离心，将上清液转移至分开的板，与Eu溶液一起温育，用PackardFusionTM α-FP HT读数器(Packard Biosciences，IL)测量相对荧光单位。样品运行三份以提供误差评估(n＝3，+/-S.D.)。用PCR将PBMC分型为V158或F158 FcγRIIIa同种异型。
用DoHH-2淋巴靶细胞，对Fc变体和WT alemtuzumab进行ADCC分析。图23a的条形图显示了这些蛋白质在10ng/ml抗体时的ADCC。结果显示，alemtuzumab Fc变体I332E、V264I和I332E/V264I，与WT alemtuzumab相比，具有实质性增强的ADCC，该相对ADCC增强与AlphaScreen分析和SPR表示的对FcγRIIIa的结合提高成正比。图23b中显示了ADCC对抗体浓度的剂量依赖。对于每条特定曲线，将结合数据标准化至最小和最大荧光信号，其分别由低和高抗体浓度时的基线所提供。采用非线性回归，将所述数据拟合S形剂量-响应模型，由图中的曲线呈现。该拟合能够确定50％有效浓度(EC50)(即50％效果所需要的浓度)，它提供了每种Fc变体的ADCC相对增强。这些结合数据的EC50与从AlphaScreen竞争数据获得的IC50类似，因此这些值的偏差与实施例2和图11中所记载的类似。在图23b中，对于WT、V264I/I332E和S239D/I332E alemtuzumab，自数据拟合获得的log(EC50)分别是0.99、0.60和0.49，因而它们各自的EC50分别是9.9、4.0和3.0。因此，用表达杂合V158/F158 FcγRIIIa的PBMC，V264I/I332E和S239E/I332E提供比WT alemtuzumab分别提高了2.5倍和3.3倍的ADCC。这些数据概括在下表5中。
表5
| log(EC50) | EC50(ng/ml) | WT倍数 | |
| WT | 0.99 | 9.9 | |
| V264I/I332E | 0.60 | 4.0 | 2.5 |
| S239D/I332E | 0.49 | 3.0 | 3.3 |
为确定这些ADCC增强是否广泛适用于抗体，在trastuzumab和rituximab的背景中评估所选Fc变体。用两种乳癌靶细胞系BT474和Sk-Br-3对Fc变体和WT trastuzumab进行ADCC分析。图24a显示的条形图显示了1ng/ml抗体时的ADCC。结果显示，V264I和V264I/I332E trastuzumab与WT trastuzumab相比，提供了实质性增强的ADCC，该相对ADCC增强与AlphaScreen分析和SPR显示的它们对FcγRIIIa的结合增强成正比。图24b和24c为所选Fc变体显示了ADCC对抗体浓度的剂量依赖。下表6中提供了自这些数据的拟合获得的EC50和ADCC相对增强倍数。I332Etrastuzumab与A330L和A330Y组合时，观察到显著的ADCC增强。此外，相对于WT trastuzumab和S298A/E333A/K334A，S239D/A330L/I332E提供了实质性增强的ADCC，对表达纯合F158/F158 FcγRIIIa的PBMC大300倍，与通过AlphaScreen分析和SPR观察到的FcγR结合数据一致。
表6
| log(EC50) | EC50(ng/ml) | WT倍数 | |
| 图24b | |||
| WT | 1.1 | 11.5 | |
| I332E | 0.34 | 2.2 | 5.2 |
| A330Y/I332E | -0.04 | 0.9 | 12.8 |
| A330L/I332E | 0.04 | 1.1 | 10.5 |
| 图24c | |||
| WT | -0.15 | 0.71 |
| log(EC50) | EC50(ng/ml) | WT倍数 | |
| S298A/E333A/K334A | -0.72 | 0.20 | 3.6 |
| S239D/A330L/I332E | -2.65 | 0.0022 | 323 |
使用WIL2-S淋巴瘤靶细胞，对V264I/I332E、WT和S298A/D333A/K334A rituximab进行ADCC分析。图25a呈现的条形图显示了1ng/ml抗体时这些蛋白质的ADCC。结果显示，V264I/I332E rituximab提供相对于WT rituximab实质性增强的ADCC，以及优于S298A/D333A/K334A的ADCC，与AlphaScreen分析和SPR观察到的FcγRIIIa结合增强一致。图25b和25c为所选Fc变体显示了ADCC对抗体浓度的剂量依赖。下表7中提供了自这些数据的拟合获得的EC50和ADCC的相对增强倍数。正如所看到的，对于表达纯合F158/F158 FcγRIIIa的PBMC，S239D/I332E/A330L rituximab较之WT，EC50提供900倍以上的增强。对alemtuzumab、trastuzumab和rituximab观察到的ADCC增强差异，可能是因为使用了不同的PBMC、不同的抗体和不同的靶细胞系。
表7
| log(EC50) | EC50(ng/ml) | WT倍数 | |
| 图25b | |||
| WT | 0.23 | 1.7 | |
| S298A/E333A/K334A | -0.44 | 0.37 | 4.6 |
| V264I/I332E | -0.83 | 0.15 | 11.3 |
| 图25c | |||
| WT | 0.77 | 5.9 | |
| S239D/I332E/A330L | -2.20 | 0.0063 | 937 |
至此，将ADCC数据标准化，即将每种Fc多肽的底部和顶部基线设置为该特定Fc多肽的最小和最大荧光信号，典型的分别为最低和最高抗体浓度时的荧光信号。虽然以这种方式呈现数据可以直观比较不同抗体的相对EC50(因此成为以这种方式呈现它们的原因)，但丢失了关于每种Fc多肽所取得的效应器功能的绝对水平的重要信息。图26a和27b分别呈现了trastuzumab和rituximab基于细胞的ADCC数据，它们已经根据由PBMC单独存在(没有抗体)时靶细胞的荧光信号所提供的该分析法的绝对最低裂解和由Triton X1000存在时靶细胞的荧光信号所提供的该分析法的绝对最高裂解进行了标准化。该图表明，抗体不仅在反映其相对效力的EC50中有差异，而且在反映其相对功效的抗体在饱和浓度时可达到的ADCC最大水平中有差异。迄今，这两个术语，效力和功效，宽松的用于指期望的临床特性。然而在当前实验背景中它们以特定数量表示，因此在本文中明确定义。当前实验背景中所用的“效力”指Fc多肽的EC50。当前实验背景中所用的“功效”指Fc多肽在饱和水平时的最大可能效应器功能。除了至今所记载的效力的实质性增强以外，图26a和26b显示，本发明的Fc变体较之WT trastuzumab和rituximab，功效提供100％以上的增强。
实施例4.Fc变体的交叉确认
在两种抗体alemtuzumab和trastuzumab的背景中对所选Fc变体确认它们的FcγR结合和ADCC增强。使用上文描述的AlphaScreen和SPR二者，测量对人V158 FcγRIIIa的结合。图27中提供了测量FcγRIIIa结合的示例性AlphaScreen数据。使用Sk-Br-3靶细胞和上文描述的LDH检测，在trastuzumab的背景中进行ADCC。图28中提供了示例性的ADCC数据。表8提供了在alemtuzumab(alem)和trastuzumab(trast)的背景中一系列Fc变体通过AlphaScreen和SPR测定的相对于WT的FcγRIIIa结合亲和力倍数及相对WT的ADCC倍数的总结。
表8
变体 变体 背景 V158FcγRIIIa WT倍数
替代 数量 AlphaScreen SPR ADCC
G236S 719 trast 2.78 1.34 0.37
G236S 719 alem 6.22 6.69
S239E 43 trast 29.99 4.17 7.6
S239E 43 alem 2.64 3.28
S239D 86 trast 16.9 3.5 6.1
S239D 86 alem 36.56 16.61
K246H 812 trast 17.91 2.67 2
K246H 812 alem 13.58 22.36
K246Y 813 trast 17.44 2.39 1.36
K246Y 813 alem 4.32 7.07
R255Y 818 trast 21.14 2.75 1.6
R255Y 818 alem 0.92 1.41
E258H 820 trast 1.18 0.77 0.76
E258H 820 alem 2.35 5.5
E258Y 821 trast 2.82 1.69 0.92
E258Y 821 alem 0.64 1.77
T260H 824 trast 35.32 2.82
T260H 824 alem 1 1.86
S267E 338 alem 9.33 2.62
H268D 350 trast 45.27 4.76 4.59
H268D 350 alem 10.55 5.66
E272I 237 trast 5.86 1.63 1.38
E272I 237 trast 3.24 1.99
E272R 634 alem 1.38
E272H 636 trast 1.02 0.65 1.28
E272H 636 alem 187.1 383.88
E272P 642 trast 0.005 0.522 0.39
E272P 642 alem 1.46 1.41
E283H 839 trast 0.99 0.71 1.4
E283H 839 alem 2.31
E283L 840 trast 19.88 3.68 5.2
E283L 840 alem 1.36 2.56
V284E 844 trast 2.82 1.26 0.84
V284E 844 alem 1.51
E293R 555 trast 1.15 0.94 0.47
变体 变体 背景 V158 FcγRIIIa WT倍数
替代 数量 AIphaScreen SPR ADCC
S298D 364 trast 3.48 1.49 0.58
S304T 879 trast 6.33 1.65 1.02
S304T 879 alem 12.85
S324I 267 trast 5.26 1.46 2.21
S324G 608 trast 3.04 1.76 3.23
S324G 608 alem 13.62 14.17
K326E 103 trast 6.12 2.12 2.87
K326E 103 alem 1.86 3.13
A327D 274 trast 2.44 1.31 1.04
I332E 22 trast
I332D 62 trast 19 2.57 5
I332D 62 alem 21.65 11.16
E333Y 284 trast 8.24 1.94 2.23
K334I 285 trast 15.24 7.1 1.2
K334T 286 trast 15.73 6.79 3.14
K334F 287 trast 10.46 5.82 1.92
实施例5.不同靶抗原表达水平时的ADCC
控制抗癌抗体临床功效的一项关键参数是肿瘤细胞表面上的靶抗原表达水平。因此，增强ADCC的Fc变体，其主要临床优点可能在于它能靶向抗原较低水平表达的肿瘤。为验证该假设，使用DELFIAEuTDA法，对WT和Fc变体trastuzumab抗体测试其介导针对表达不同Her2/neu靶抗原水平的细胞系的ADCC能力。使用了表达扩大至低水平Her2/neu受体的四个细胞系，包括Sk-Br-3(1×106个拷贝)、SkOV3(～1×105)、OVCAR3(～1×104)及MCF-7(～3×103个拷贝)(图29a)。用BATDA分批加载靶细胞25分钟，用培养基洗涤多次，以10,000细胞/孔接种至96孔板中。用各种抗体和浓度调理靶细胞15分钟(在1/2log阶段，终浓度范围100ng/ml-0.0316ng/ml，包括未处理对照)。接着，将自血沉棕黄层分离的且同种异型分型为纯合F158/F158 FcγRIIIa的人PBMC，以25倍过量加到调理细胞，于37℃共培养4小时。然后，将板离心，除去上清液，用Eu3+溶液处理，用Packard FusionTM α-FP HT计数仪(PerkinElmer，Boston，MA)测量相对荧光单位(与细胞裂解水平相关)。实验进行了三份。图29b显示了比较WT和Fc变体trastuzumab针对四种不同Her2/neu+细胞系的ADCC数据。S239D/I332E和S239D/I332E/A330L变体与WT trastuzumab相比，在高、中、低靶抗原表达水平中提供实质性的ADCC增强。该结果表明，本发明的Fc变体可增宽抗癌抗体的治疗窗口。
实施例6.NK细胞作为效应细胞的ADCC
天然杀伤(NK)细胞是PBMC中存在的，认为在ADCC中扮演重要角色的细胞亚群。在基于细胞的ADCC分析中测试所选Fc变体，其中使用天然杀伤(NK)细胞而非PBMC作为效应细胞。在该分析中，使用内源乳糖脱氢酶(LDH)而非EuTDA的释放来监测细胞裂解。图30表明，在使用NK细胞作为效应细胞时，Fc变体显示实质性的ADCC增强。此外，该结果与以前的分析一起表明，不论效应细胞的类型或所用检测方法，本发明的Fc变体显示实质性的ADCC增强。
实施例7.Fc变体的ADCP
另一重要的FcγR介导的效应器功能是ADCP。靶癌细胞的吞噬不仅可导致靶细胞的立即破坏，而且因为吞噬是抗原呈递细胞摄取和加工抗原的潜在机理，所以ADCP增强还可提高Fc多肽引发适应性免疫应答的能力。因此，研究本发明Fc变体介导ADCP的能力。使用Percoll梯度从杂合V158/F158 FcγRIIIa PBMC分离单核细胞。在存在0.1ng/ml时培养一周后，用EDTA/PBS使分化的巨噬细胞脱离，用亲脂性荧光团PKH26(Sigma，St Louis，Mo)按制造商方案进行标记。用PKH67(Sigma，St Louis，Mo)标记Sk-Br-3靶细胞，以20,000细胞/孔接种至96孔板中，用指定终浓度的WT或Fc变体trastuzumab处理。接着，将PKH26标记的巨噬细胞以20,000细胞/孔加到经调理、经标记的Sk-Br-3细胞中，在为了双重标记物流式细胞术分析而处理细胞之前，将这些细胞共培养18小时。在计数10,000以后，将PKH76和PKH26共标记的细胞数(巨噬细胞+Sk-Br-3)除以细胞群中Sk-Br-3细胞总数(吞噬的+未吞噬的)，从而确定吞噬百分率。图31显示了在不同抗体浓度时比较WT和Fc变体trastuzumab的数据。结果显示，S239D/I332E/A330L变体较之WTtrastuzumab提供ADCP的显著增强。
实施例8.Fc变体的补体结合和激活
Fc上补体蛋白C1q的结合位点与FcγR结合位点接近，因此谨慎的确定Fc变体是否保持其募集和激活补体的能力。使用AlphaScreen分析来测量所选Fc变体与补体蛋白C1q的结合。使用实施例2记载的附着于链霉亲合素供体珠上的生物素化WT alemtuzumab抗体，和使用与受体珠直接偶联的C1q进行分析。图32a所示的V264I、I332E、S239E及V264I/I332Erituximab的结合数据表明，C1q结合未受损害。还对所选Fc变体进行基于细胞的CDC分析，以研究Fc变体是否保持激活补体的能力。使用AlamarBlue法来监测人血清补体(Quidel，San Diego，CA)对经Fc变体和WTrituxima调理的WIL2-S淋巴瘤细胞的裂解。图32b的数据显示，Fc变体S239E、V264I和V264I/I332E rituximab的CDC未受损害。相反，图32c显示，Fc变体S239D/I332E/A330L的CDC受到完全消除，而S239D/I332E变体介导与WT rituximab相当的CDC。这些结果表明，蛋白质工程可用于区分不同效应器功能。这种控制不仅能产生具有为期望临床效果改造的特性的Fc多肽，包括抗体和Fc融合物，而且还提供可用于实验研究效果器功能生物学的一组独特试剂。
实施例9.猕猴中增强的B细胞耗减
为评估Fc变体在体内增强效应器功能的能力，进行临床前研究，其中使用B细胞耗减来测量抗体在猕猴(Macaca fascicularis)中的细胞毒性。每种样品对三只猴静脉内注射WT或S239D/I332E rituximab抗体，在第1-4天每天进行一次注射，剂量范围大约40μg/kg(WT对照)或1、4、10、40μg/kg(S239D/I332E和/或WT)。通过实验测定实际浓度。在第5-28天监测B细胞和天然杀伤细胞水平，用B细胞标志物CD20+和CD40+及天然杀伤细胞标志物CD3-/CD16+和CD3-/CD8+，通过流式细胞术对细胞群计数。
图33a显示了剂量服用包括WT或S239D/I332E rituximab的抗体的猴中所剩的CD20+B细胞百分比。S239D/I332E变体和WT对照在较低剂量时(1.8和2.1ug/kg)在第5天显示B细胞计数的较大差异。监测NK细胞群，以评估效应器功能增强对该细胞类型的影响；图33b显示S239D/I332E变体增强的CD20+B细胞杀伤不影响天然杀伤细胞群。B细胞水平的减少也是剂量依赖性的，如图33c关于第5天所示。
实施例10.在小鼠中测试Fc变体的能力
Fc对非人FcγR的优化对于在动物模型中实验测试Fc变体可能是有用的。例如，当在小鼠中测试时(例如裸鼠、SCID小鼠、异种移植小鼠、和/或转基因小鼠)，包含对一种或多种小鼠FcγR优化的Fc变体的抗体和Fc融合物可提供关于临床功效、作用机理等等的有价值信息。为评估本发明的Fc变体是否可用于这种实验，用AlphaScreen分析测量所选Fc变体对小鼠FcγRIII的亲和力。使用实施例2记载的附着于链霉亲合素供体珠的生物素化WT alemtuzumab，和如实施例2所述表达和纯化的结合于谷胱甘肽螯合受体珠的GST标记小鼠FcγRIII进行AlphaScreen分析。图34a中显示了在alemtuzumab的背景中Fc变体的这些结合数据，图34b和34c是在trastuzumab的背景中。结果显示，增强对人FcγRIIIa的结合的有些Fc变体也增强对小鼠FcγRIII的结合。使用小鼠而非人PBMC，通过进行前述基于细胞的ADCC分析而研究了Fc变体对小鼠效应器功能的增强。图35显示S239D/I332E/A330Ltrastuzumab变体在存在小鼠免疫细胞时提供较之WT的实质性ADCC增强。该结果显示，本发明的Fc变体或对非人FcγR优化的其它Fc变体可用于使用动物模型的实验。
实施例11.在CHO细胞中表达的Fc变体的确认
尽管出于筛选目的在293T细胞中表达本发明的Fc变体，然而大规模的抗体生产典型的通过在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中表达来进行。为评估CHO表达的Fc变体的特性，在CHO细胞中表达所选Fc变体和WT alemtuzumab，并如实施例1所述纯化。图36显示了比较CHO和293T表达的Fc变体和WT alemtuzumab与人V158 FcγRIIIa结合的AlphaScreen数据。结果显示，本发明的Fc变体无论在293T还是在CHO中表达，都显示出相当的FcγR结合增强。
实施例12.岩藻糖阴性株中Fc变体的增强
为产生具有优化特性的新Fc多肽的目标，设想将本发明的Fc变体与其它Fc修饰结合。将本发明的Fc变体与其它Fc修饰组合可能是有益的，包括改变效应器功能或与一种或多种Fc配体的相互作用的修饰。这种组合可为Fc多肽提供叠加的、协同的或新颖的特性。例如，存在改造Fc不同糖型以改变效应器功能的多种方法。经改造糖型可通过本领域已知的多种方法产生，许多这些技术都是基于控制共价附着于Fc区的岩藻糖化和/或二分寡糖水平来实现的。改造Fc糖型的一种方法是在产生改变的糖型的细胞系中表达Fc多肽，例如Lec-13CHO细胞。为研究与经改造糖型组合的Fc变体的特性，在Lec-13CHO细胞中表达WT和V209(S239D/I332E/A330L)trastuzumab，并用如上所述纯化。图37a显示了比较在293T、CHO和Lec-13细胞中表达的WT和V209trastuzumab与人V158 FcγRIIIa结合的AlphaScreen结合数据。结果显示，在由该细胞系产生的经改造糖型与本发明的Fc变体之间有实质性协同作用。图37b所示的基于细胞的ADCC分析支持该结果。这些数据一起表明，其它Fc修饰，特别是经改造糖型，可以与本发明的Fc变体组合，以产生具有优化的效应器功能的Fc多肽，例如抗体和Fc融合物。
实施例13.无糖基化Fc变体
如上所述，本实验的一个目标是获得优化的无糖基化Fc变体。几种Fc变体提供了迈向该目标的重要进展。由于它是糖基化位点，所以N297处的替代导致无糖基化Fc。尽管在N297处包含替代的所有其它Fc变体完全消除了FcγR结合，然而N297D/I332E却有对FcγRIIIa的显著结合亲和力，如图41和图38所示。由于缺少该变体的高分辨率结构，该结果的确切原因不明，尽管计算筛选预测提示可能是由于新的有利的Fc/FcγR相互作用和有利的静电特性之间的组合。确实，预想了其它静电替代以进一步优化无糖基化Fc。图41显示，其它无糖基化Fc变体，诸如N297D/A330Y/I332E和S239D/N297D/I332E提供结合增强，使得对FcγRIIIa的亲和力分别达到足有糖基化WT alemtuzumab的0.4和0.8倍。为获得以大致相同或甚至好于糖基化亲本Fc的亲和力结合一种或多种FcγR的无糖基化Fc变体的目标，设想将这些变体与增强FcγR结合的其它Fc变体组合。优选用于在无糖基化Fc多肽中增强Fc配体结合和/或效应器功能的Fc变体包括但不限于：N297D、N297D/I332E、N297D/I332D、S239D/N297D、S239D/N297D/I332E、N297D/A330Y/I332E和S239D/N297D/A330Y/I332E。因此，本发明当然设想了这些无糖基化变体与本文所记载的也增强Fc配体结合和/或效应器功能的其它Fc变体的组合。
另外一组有希望的Fc变体在缺少碳水化合物时提供稳定性和溶解度增强。在不介导FcγR结合但决定碳水化合物和Fc间介面的位置241、243、262和264处包含替代的Fc变体消除了FcγR结合，可能是因为它们干扰了碳水化合物的构象。然而，在脱糖基化形式中，Fc变体F241E/F243R/V262E/V264R、F241E/F243Q/V262T/V264E、F241R/F243Q/V262T/V264R及F241E/F243Y/V262T/V264R显示出比糖基化形式更强的FcγRIIIa结合，如图39中的AlphaScreen数据所示。该结果显示，这些是优化无糖基化Fc的结构、稳定性、溶解度及功能的关键位置。这些结果一起表明，蛋白质工程可用于在缺少碳水化合物时恢复抗体和Fc融合物的有利功能和溶解特性，为在这些和其它Fc位置包含替代的具有有利溶解特性和全部功能性的无糖基化抗体和Fc融合无铺平了道路。
实施例14.优选的变体
总而言之，本发明提供的数据表明，提供优化的FcγR结合特性的Fc变体也提供增强的效应器功能。许多位置，包括但不限于236、239、246、246、249、255、258、260、264、267、268、272、274、281、283、304、324、326、327、330、332、333、334和334的替代，为提高Fc多肽，包括抗体和Fc融合物的效应器功能和因此临床特性，提供了有希望的候选物。因为本发明Fc变体的组合典型的导致叠加的或协同的结合提高，及由此效应器功能的叠加或协同增强，所以预期图41所示尚未探索的Fc变体组合也将提供有利结果。表9中提供了优选用于增强Fc配体结合和/或效应器功能的本发明Fc变体。
表9
G236S S239D/I332E S239D/K246H/I332E S239D/K246H/T260H/I332E
G236A S239D/G236A S239D/V264I/I332E S239D/K246H/H268D/I332E
S239D S239D/G236S S239D/S267E/I332E S239D/K246H/H268E/I332E
S239E S239D/V264I S239D/H268D/I332E S239D/H268D/S324G/I332E
S239N S239D/H268D S239D/H268E/I332E S239D/H268E/S324G/I332E
S239Q S239D/H268E S239D/S298A/I332E S239D/H268D/K326T/I332E
S239T S239D/S298A S239D/S324G/I332E S239D/H268E/K326T/I332E
K246H S239D/K326E S239D/S324I/I332E S239D/H268D/A330L/I332E
K246Y S239D/A330L S239D/K326T/I332E S239D/H268E/A330L/I332E
D249Y S239D/A330Y S239D/K326E/I332E S239D/H268D/A330Y/I332E
R255Y S239D/A330I S239D/K326D/I332E S239D/H268E/A330Y/I332E
E258Y I332E/V264I S239D/A327D/I332E S239D/S298A/S267E/I332E
T260H I332E/H268D S239D/A330L/I332E S239D/S298A/H268D/I332E
V264I I332E/H268E S239D/A330Y/I332E S239D/S298A/H268E/I332E
S267E I332E/S298A S239D/A330I/I332E S239D/S298A/S324G/I332E
H268D I332E/K326E S239D/K334T/I332E S239D/S298A/S324I/I332E
H268E I332E/A330L S239D/S298A/K326T/I332E
E272Y I332E/A330Y S239D/S298A/K326E/I332E
E272I I332E/A330I S239D/S298A/A327D/I332E
E272H I332E/G236A S239D/S298A/A330L/I332E
K274E I332E/G236S S239D/S298A/A330Y/I332E
G281D I332D/V264I S239D/K326T/A330Y/I332E
E283L I332D/H268D S239D/K326E/A330Y/I332E
E283H I332D/H268E S239D/K326T/A330L/I332E
S304T I332D/S298A S239D/K326E/A330L/I332E
S324G I332D/K326E
S324I I332D/A330L
K326T I332D/A330Y
A327D I332D/A330I
A330Y I332D/G236A
A330L I332D/G236S
A330I
I332D
I332E
I332N
I332Q
E333Y
K334T
K334F
该优选Fc变体列表并不意味着限制本发明。实际上，图41提供的任何Fc变体的组合也是本发明的实施方案。此外，本发明的任何Fc变体与其它已发现或未发现Fc变体的组合也可能提供有利特性，这些组合也设想作为本发明的实施方案。最后，从这些结果预期，本发明中突变位点的其它替代也可能提供有利的结合增强和特异性，因此设想了图41中所有位置的替代。
实施例15.Fc变体的治疗应用
本发明记载的多种Fc变体有提高抗癌抗体治疗功效的显著潜力。为了举例说明，已经将本发明的多种Fc变体掺入抗体rituximab的序列。图40a和40b中提供了US 5,736,137中记载的WT rituximab轻链和重链。图40c中提供了改进的抗CD20抗体序列。改进的抗CD20抗体序列至少包含选自X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9的非WT氨基酸。这些改进的抗CD20抗体序列还可包含替代Z1和/或Z2。本文中rituximab的使用仅仅是一个例子，并不意味着将Fc变体的应用限制于该抗体或任何其它特定Fc多肽。
表10记载了人Fc位置、野生型残基和本发明特定实施方案中包括的变体。表10是基于IgG1的，尽管本领域技术人员将领会，可以对任何Ig，特别是IgG2、IgG3和IgG4进行相同的事。
表10
| 位置 | 野生型(人) | 包括野生型的变体 |
| 118-220 | FX | 参见图3a |
| Vb(221) | D | D，K，Y |
| Vb(222) | K | K，E，Y |
| 位置 | 野生型(人) | 包括野生型的变体 |
| Vb(223) | T | T，E，K |
| Vb(224) | H | H，E，Y |
| Vb(225) | T | T，E，K，W |
| Fx(226) | WT | C |
| Vb(227) | P | P，E，G，K，Y |
| Vb(228) | P | P，E，G，K，Y |
| Fx(229) | (开放)(WT) | C |
| Vb(230) | P | P，A，E，G，Y |
| Vb(231) | A | A，E，G，K，P，Y |
| Vb(232) | P | P，E，G，K，Y |
| Vb(233) | E | A，D，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(234) | L | L，A，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(235) | L | L，A，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y |
| 位置 | 野生型(人) | 包括野生型的变体 |
| Vb(236) | G | G，A，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(237) | G | G，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(238) | P | P，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(239) | S | S，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y |
| Vb(240) | V | V，A，I，M，T |
| Vb(241) | F | F，D，E，L，R，S，W，Y |
| Fx(242) | WT | L |
| Vb(243) | F | F，E，H，L，Q，R，W，Y |
| Vb(244) | P | P，H |
| Vb(245) | P | P，A |
| Vb(246) | K | K，D，E，H，Y |
| Vb(247) | P | P，G，V |
| Vb(248) | WT | K |
| 位置 | 野生型(人) | 包括野生型的变体 |
| Vb(249) | D | D，H，Q，Y |
| Fx(250-254) | WT | -(T-L-M-I-S)- |
| Vb(255) | R | R，E，Y |
| Fx(256-257) | WT | -(T-P)- |
| Vb(258) | E | E，H，S，Y |
| Fx(259) | WT | V |
| Vb(260) | T | T，D，E，H，Y |
| Fx(261) | WT | C |
| Vb(262) | V | V，A，E，F，I，T |
| Vb(263) | V | V，A，I，M，T |
| Vb(264) | V | V，A，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y |
| Vb(265) | D | D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(266) | V | V，A，I，M，T |
| 位置 | 野生型(人) | 包括野生型的变体 |
| Vb(267) | S | S，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y |
| Vb(268) | H | H，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y |
| Vb(269) | E | E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(270) | D | D，F，G，H，I，L，M，P，Q，R，S，T，W，Y |
| Vb(271) | A | A，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(272) | E | E，D，F，G，H，I，K，L，M，P，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(273) | V | V，I |
| Vb(274) | K | K，D，E，F，G，H，L，M，N，P，R，T，V，W，Y |
| Vb(275) | F | F，L，W |
| 位置 | 野生型(人) | 包括野生型的变体 |
| Vb(276) | N | N，D，E，F，G，H，I，L，M，P，R，S，T，V，W，Y |
| Fx(277) | WT | W |
| Vb(278) | Y | Y，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W |
| Fx(279) | WT | V |
| Vb(280) | D | D，G，K，L，P，W |
| Vb(281) | G | G，D，E，K，N，P，Q，Y |
| Vb(282) | V | V，E，G，K，P，Y |
| Vb(283) | E | E，G，H，K，L，P，R，Y |
| Vb(284) | V | V，D，E，L，N，Q，T，Y |
| Vb(285) | H | H，D，E，K，Q，W，Y |
| Vb(286) | N | N，E，G，P，Y |
| Fx(287) | WT | A |
| Vb(288) | K | K，D，E，Y |
| 位置 | 野生型(人) | 包括野生型的变体 |
| Fx(289) | WT | T |
| Vb(290) | K | K，D，H，L，N，W |
| Vb(291) | P | P，D，E，G，H，I，Q，T |
| Vb(292) | R | R，D，E，T，Y |
| Vb(293) | E | E，F，G，H，I，L，M，N，P，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(294) | E | E，F，G，H，I，K，L，M，P，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(295) | Q | Q，D，E，F，G，H，I，M，N，P，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(296) | Y | Y，A，D，E，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V |
| Vb(297) | N | N，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(298) | S | S，D，E，F，H，I，K，M，N，Q，R，T，W，Y |
| Vb(299) | T | T，A，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y |
| Vb(300) | Y | Y，A，D，E，G，H，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W |
| Vb(301) | R | R，D，E，H，Y |
| 位置 | 野生型(人) | 包括野生型的变体 |
| Vb(302) | V | V，I |
| Vb(303) | V | V，D，E，Y |
| Vb(304) | S | S，D，H，L，N，T |
| Vb(305) | V | V，E，T，Y |
| Fx(306-312) | WT | -(L-T-V-L-H-Q-D)-* |
| Vb(313) | W | W，F |
| Fx(314-316) | WT | -(L-N-G)- |
| Vb(317) | K | K，E，Q |
| Vb(318) | E | E，H，L，Q，R，Y |
| Fx(319) | WT | Y |
| Vb(320) | K | K，D，F，G，H，I，L，N，P，S，T，V，W，Y |
| Fx(321) | WT | C |
| Vb(322) | K | K，D，F，G，H，I，P，S，T，V，W，Y |
| 位置 | 野生型(人) | 包括野生型的变体 |
| Vb(323) | V | V，I |
| Vb(324) | S | S，D，F，G，H，I，L，M，P，R，T，V，W，Y |
| Vb(325) | N | N，A，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(326) | K | K，I，L，P，T |
| Vb(327) | A | A，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(328) | L | L，A，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(329) | P | P，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(330) | A | A，E，F，G，H，I，L，M，N，P，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(331) | P | P，D，F，H，I，L，M，Q，R，T，V，W，Y |
| 位置 | 野生型(人) | 包括野生型的变体 |
| Vb(332) | I | I，A，D，E，F，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y |
| Vb(333) | E | E，F，H，I，L，M，N，P，T，Y |
| Vb(334) | K | K，F，I，L，P，T |
| Vb(335) | T | T，D，F，G，H，I，L，M，N，P，R，S，V，W，Y |
| Vb(336) | I | I，E，K，Y |
| Vb(337) | S | S，E，H，N |
将所有参考文献在此明确引入作为参考。
尽管上文出于举例说明的目的已经描述了本发明的具体实施方案，然而本领域技术人员将领会，可以对细节进行许多改变而不背离如所附权利要求所描述的本发明。
Claims (1)
1.多肽的亲本Fc区Fc变体，其中所述Fc变体与所述亲本Fc多肽相比展示对受体改变的结合，其中所述Fc变体的相应位置以下述中的一个替代：
S239D/E272Y/I332E，S239D/E272S/I332E，S239D/E272K/I332E，S239D/E272I/I332E，S239D/E272Y/A330L/I332E，S239D/E272I/A330L/I332E，S239D/K274E/I332E，S239D/Y278T/I332E，S239D/K326T/I332E，S239D/K326E/I332E，S239D/K274E/A330L/I332E，其中编号依照EU索引。
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