ES2415604T3

ES2415604T3 - Proteínas de fusión de inmunoglobulina

Info

Publication number: ES2415604T3
Application number: ES08766022T
Authority: ES
Inventors: Young Chul Sung; Sehwan Yang
Original assignee: Genexine Co Ltd; Academy Industry Foundation of POSTECH; Genexine Inc
Current assignee: Genexine Co Ltd; Academy Industry Foundation of POSTECH; Genexine Inc
Priority date: 2007-05-30
Filing date: 2008-05-30
Publication date: 2013-07-26
Anticipated expiration: 2028-05-30
Also published as: JP2010531134A; JP5577243B2; KR20080094781A; HK1218127A1; US7867491B2; CN101687933B; US8586531B2; CN103626875B; EP2162472A4; AU2008257923A1; KR20090045953A; ES2623925T3; CN105198998A; EP3176264B1; HK1191959A1; HK1219284A1; EP3173484A1; KR20140037961A; CN103641919B; US20120276043A1

Abstract

Un polipéptido representado por la siguiente fórmula N'-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C' en la que: N' es el extremo N y C' es el extremo C del polipéptido. Z1 es una secuencia de aminoácidos que consta de 5 a 9 restos de aminoácidos consecutivos procedentes del ladodel extremo C de los restos de aminoácidos en las posiciones 90 a 98 de la SEQ ID NO: 14; Y es una secuencia de aminoácidos que consta de 5 o más restos de aminoácidos consecutivos procedentes dellado del extremo C de los restos de aminoácidos en las posiciones 99 a 162 de la SEQ ID NO: 14; Z2 es una secuencia de aminoácidos que consta de los restos de aminoácidos en las posiciones 163 a 170 de laSEQ ID NO: 14; 20 Z3 es una secuencia de aminoácidos que consta de los restos de aminoácidos en las posiciones 121 a 220 de laSEQ ID NO: 13; Z4 es una secuencia de aminoácidos que consta de los restos de aminoácidos en las posiciones 221 a 327 de laSEQ ID NO: 13; y p es un número entero de 0 o 1.

Description

Proteínas de fusión de inmunoglobulina

5 Campo técnico

[0001] La presente invención se refiere a una proteína Fc híbrida humana y a una proteína de fusión de inmunoglobulina en la que la proteína Fc híbrida humana se une a una molécula biológicamente activa. En particular, se refiere a una proteína Fc híbrida humana, que se deriva de combinaciones de subtipos de la

10 inmunoglobulina G humana (IgG) o combinaciones de la IgD y la IgG humanas, y una proteína de fusión en la que dicha proteína Fc está acoplada a una molécula biológicamente activa mediante un enlace covalente.

Antecedentes de la técnica

15 [0002] Las moléculas biológicamente activas pueden ser de gran interés terapéutico. Sin embargo, tienen muchas desventajas como agente terapéutico porque su estabilidad in vivo es baja. Su vida media en circulación o vida media en suero es corta debido a que se digieren por diversos enzimas en el cuerpo vivo. Por tanto se ha deseado mejorar la vida media en circulación de las moléculas biológicamente activas.

20 [0003] Se sabe que aumentando el tamaño de una proteína puede aumentar su vida media, ya que se evita que el riñón elimine la proteína (Knauf y col., J. Biol. Chem. 1988. 263: 15064-15070). Por ejemplo, se ha notificado un aumento de la estabilidad de la proteína mediante el acoplamiento de una proteína activa con la albúmina humana (Kinstler y col., Pharm. Res. 1995. 12: 1883-1888). Sin embargo, como el acoplamiento de una proteína activa con la albúmina humana aumenta solo ligeramente su tiempo de residencia, no ha sido un procedimiento

25 eficaz para desarrollar una formulación farmacéutica eficaz que contenga la proteína activa que se acopla a la albúmina humana.

[0004] El otro procedimiento notificado es modular la glicosilación de una proteína. La glicosilación adicional en la proteína y la introducción de ácidos siálicos en las proteínas conduce a la prevención de la degradación de las

30 proteínas en el hígado. Sin embargo, el aumento en la glicosilación de las proteínas conduce también a una disminución de la bioactividad de las proteínas.

[0005] Para estabilizar las proteínas y evitar la depuración renal, las proteínas se han conjugado con polietilenglicol. Se ha utilizado ampliamente la conjugación covalente con el PEG para administrar un fármaco de

35 una vida media prolongada (Delgado y col., 1991. 9. 249-304. Sin embargo, se ha notificado que la conjugación de PEG con citocinas u hormonas da como resultado una afinidad de unión reducida del receptor debido al impedimento estérico producido por la conjugación.

[0006] Recientemente, se han investigado y desarrollado proteínas de fusión preparadas utilizando una

40 inmunoglobulina (Ig). La Ig es un componente principal de la sangre. La Ig humana (hIg) incluye diversos tipos tales como IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE (Roitt y col., “Immunology” 1989, Gower Medical Publishing, Londres, Reino Unido; Nueva York, N. Y.). las IgG humanas se pueden clasificar adicionalmente en diversos subtipos conocidos como IgG1 humana (hIgG1), IgG2 humana (hIgG2), IgG3 humana (hIgG3), e IgG4 humana (hIgG4).

45 [0007] Las inmunoglobulinas están constituidas por cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, que están asociadas mediante enlaces disulfuro para formar tetrámeros. Cada cadena está compuesta por una región variable y una región constante. La región constante de la cadena pesada se divide además en tres o cuatro regiones (CH1, CH2, CH3, y CH4), dependiendo de los isotipos. La porción Fc de la región constante de la cadena pesada, dependiendo del isotipo de Ig, incluye la región bisagra, los dominios CH2, CH3, y/o

50 CH4.

[0008] Con respecto a la vida media en suero, la IgG1, IgG2, e IgG4 tienen vidas medias largas de 21 días, mientras que otras inmunoglobulinas tienen vidas medias relativamente cortas, de menos de una semana. Las proteínas quiméricas fusionadas con una porción de Fc de la IgG muestran un aumento de la estabilidad y un

55 aumento de la vida media en suero (Capon y col., Nature 1989. 337: 525-531). Las proteínas biológicamente activas se han fusionado en el extremo N de la región CH1, el extremo N de la región Fc, o en extremo C de la región CH3 de las IgG.

[0009] En el periodo inicial, se han creado las proteínas de fusión de la IgG con los dominios extracelulares de receptores superficiales celulares tales como CD4 (Capon y col., Nature 1989. 337: 525-531), TNFR (Mohler y col.,

J. Immunology 1993. 151: 1548-1561), CTLA4 (Linsley y col., J. Exp. Med. 1991. 173: 721-730), CD86 (Morton y col., J. Immunology 1996. 156: 1047-1054). También, existen algunas citocinas y hormonas de crecimiento que se han fusionado con los dominios de la IgG. Sin embargo, a diferencia de la fusión con los dominios extracelulares de

5 los receptores superficiales celulares, la fusión con proteínas solubles con las IgG conduce a actividades biológicas reducidas, en comparación con las citocinas no fusionadas o los factores de crecimiento. Las proteínas quiméricas existen como dímeros, lo que conduce al impedimento estérico procedente de la interacción con sus receptores del tipo moléculas diana, debido a la presencia de dos proteínas activas en estrecha proximidad entre sí. Por tanto, debe superarse este problema para preparar una proteína de fusión eficaz.

10 [0010] La otra limitación de la tecnología de fusión de Fc es la presencia de respuestas inmunes indeseables. El dominio Fc de la inmunoglobulina tiene también funciones efectoras tales como la citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Estas funciones efectoras se consiguen generalmente mediante la interacción entre la región Fc de la Ig y las FcR en las células

15 efectoras o mediante la unión del complemento. Por tanto, debe llevarse a cabo el bloqueo de las funciones efectoras de la Fc para reducir las reacciones indeseables tales como la muerte celular, la liberación de citocinas, o la inflamación.

Divulgación de la invención

20 Problema técnico

[0011] En resumen, se necesitan proteínas de fusión de Fc mejoradas con una mínima pérdida de actividad biológica y con un riesgo disminuido de respuestas inmunes indeseadas.

25 Solución técnica

[0012] La presente invención proporciona una proteína Fc híbrida, que se deriva de combinaciones de subtipos de la IgG humana o combinaciones de la IgD e IgG humanas. La región Fc híbrida es eficaz, cuando se une a una

30 molécula biológicamente activa, para aumentar la vida media en suero de la molécula biológicamente activa así como para aumentar el nivel de expresión del polipéptido cuando se expresa un polipéptido que codifica una proteína de fusión del polipéptido Fc.

[0013] La presente invención proporciona también un polipéptido de fusión Fc híbrido en el que el Fc híbrido se

35 une a una molécula biológicamente activa. La proteína de fusión se denomina algunas veces proteína de fusión de Fc-molécula activa o simplemente “proteína de fusión”. La proteína de fusión puede tener un enlazador entre la FC y la molécula biológicamente activa. La Fc puede estar acoplada en su extremo N con un extremo C de la molécula biológicamente activa.

40 [0014] La proteína de fusión puede producirse fabricando una construcción de nucleótidos que codifica y es capaz de expresar la proteína de fusión; expresándola en una célula hospedadora; y cosechar la proteína de fusión. De forma alternativa puede producirse expresando un nucleótido que codifica la Fc y acoplando esta a una molécula biológicamente activa de una manera convencional.

45 [0015] De acuerdo con esto, en un aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido representado por la siguiente fórmula:

N’-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C’

50 [0016] en la que:

[0017] N’ es el extremo N y C’ es el extremo C del polipéptido.

[0018] Z1 es una secuencia de aminoácidos que consta de 5 a 9 restos de aminoácidos consecutivos procedentes

55 del lado del extremo C de los restos de aminoácidos en las posiciones 90 a 98 de la SEQ ID NO: 14; Y es una secuencia de aminoácidos que consta de 5 o más restos de aminoácidos consecutivos procedentes del lado del extremo C de los restos de aminoácidos en las posiciones 99 a 162 de la SEQ ID NO: 14;

[0019] Z2 es una secuencia de aminoácidos que consta de los restos de aminoácidos en las posiciones 163 a 170 de la SEQ ID NO: 14;

Z3 es una secuencia de aminoácidos que consta de los restos de aminoácidos en las posiciones 121 a 220 de la SEQ ID NO: 13;

5 Z4 es una secuencia de aminoácidos que consta de los restos de aminoácidos en las posiciones 221 a 327 de la SEQ ID NO: 13; y p es un número entero de 0 o 1.

[0020] Z1 puede ser una secuencia de aminoácidos que incluye 5-9 restos de aminoácidos consecutivos

10 procedentes del lado del extremo C de los restos de aminoácidos en las posiciones 90-98 de la SEQ ID NO: 14. En algunas realizaciones, Z1 puede ser 5, 6, 7, 8 o 9 restos de aminoácidos del extremo C de un dominio CH1 de la IgG1 (SEQ ID NO: 11) o de un dominio CH1 de la IgD (SEQ ID NO: 14).

[0021] Y puede ser una secuencia de aminoácidos que incluye 5 o más, o 10 o más restos de aminoácidos

15 consecutivos procedentes del lado del extremo C de los restos de aminoácidos en las posiciones 99 a 162 de la SEQ ID NO: 14. En determinadas realizaciones, Y puede ser una secuencia de aminoácidos que incluye restos de aminoácidos en las posiciones 158 a 162 de la SEQ ID NO: 14, restos de aminoácidos en las posiciones 153 a 162 de la SEQ ID NO: 14, restos de aminoácidos en las posiciones 143 a 162 de la SEQ ID NO: 14, restos de aminoácidos en las posiciones 133 a 162 de la SEQ ID NO: 14, o restos de aminoácidos en las posiciones 99 a 162

20 de la SEQ ID NO: 14.

[0022] Z2 pueden ser 6 restos de aminoácidos del extremo N de un dominio CH2 de la IgG2 humana u 8 restos de aminoácidos del extremo N de un dominio CH2 de la IgD humana.

25 [0023] El número total de restos de aminoácidos de Z2 y Z3 puede estar entre 80 y 140. En una realización, el número total de restos de aminoácidos de Z2 y Z3 está entre 90 y 120, ambos inclusive. En otra realización, el número total de restos de aminoácidos de Z2 y Z3 está entre 105 y 115, ambos inclusive. En una realización, el número total de restos de aminoácidos de Z2 y Z3 es 108. En una realización adicional, el número total de restos de aminoácidos de Z2 y Z3 es 109.

30 [0024] Z4 puede ser una secuencia de aminoácidos de los restos de aminoácidos en las posiciones 221 a 327 de la SEQ ID NO: 13.

[0025] En una realización, el polipéptido puede estar codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada

35 entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 26, y SEQ ID NO: 27. El polipéptido es una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, and SEQ ID NO: 29.

40 [0026] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido quimérico que es una fusión que comprende un polipéptido tal como se define en el presente documento y un polipéptido, proteína o péptido fusionado en el extremo N o el extremo C del polipéptido, denominado “molécula biológicamente activa”. La molécula biológicamente activa puede ser una proteína soluble tal como, pero sin limitarse a, una hormona, citocina, factor de crecimiento, una molécula coestimuladora, receptor de hormonas, receptor de citocinas, receptor de

45 factores de crecimiento, o péptido corto. La molécula biológicamente activa puede ser EPO o sus variantes/fragmentos, p40 o sus variantes/fragmentos (por ejemplo, variante p40 que contiene una sustitución Asn303Gln, G-CSF o sus variantes/fragmentos, los receptores de TNF, GMCSF, los receptores de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-10, TGF-beta, el receptor de TGF-beta, IL-17, el receptor de IL-17, el Factor VII, CXCL-11, FSH, la hormona del crecimiento humano, la proteína-1 morfogenética del hueso (BMP-1), CTLA4, PD-1,

50 GLP-1, la betacelulina, OPG, RNAK, el interferón alfa, el interferón beta o sus variantes/fragmentos. La molécula biológicamente activa puede ser una proteína secretada, que puede estar en una forma madura.

[0027] En una realización, se proporciona un procedimiento para producir el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende las etapas de. (i) introducir una molécula de ADN que

55 codifica el polipéptido en una célula hospedadora de mamífero (ii) hacer crecer la célula en condiciones en las que se pueda expresar el polipéptido en su medio de crecimiento; y (iii) cosechar el polipéptido expresado. La célula hospedadora de mamífero puede ser una de entre células CHO, COS o BHK.

[0028] En otra realización, se proporciona un procedimiento para (i) reducir los síntomas de, evitar o tratar una enfermedad autoinmune, (ii) inhibir el rechazo de un injerto, o (iii) tratar o evitar el shock inducido por endotoxinas, que incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido descrito anteriormente, en el que el polipéptido se fusiona a una molécula biológicamente activa.

5 [0029] En una realización, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de acuerdo con las realizaciones de la presente invención. El polipéptido puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, y SEQ ID NO: 29. La molécula de ácido nucleico puede tener una secuencia de nucleótidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4,

10 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 26, o SEQ ID NO: 27. La molécula de ácido nucleico puede incluir además una secuencia señal o secuencia líder.

[0030] De acuerdo con una realización de la invención, se proporcionan un vector de expresión que incluye la molécula de ácido nucleico y la célula hospedadora que contiene el vector. Los ejemplos de vectores de expresión

15 pueden incluir, pero no se limitan a, pAD1 EPO-hFc-1, pAD11 G-CSF-hFc-1, pAD11 p40N303Q-hFc-1, pAD11 EPOhFc-6, pAD11 IG-CSF-hFc-6, pAD11 p40N303Q-hFc-6, pAD11 EPO-hFc-5, pAD11 G-CSF-hFc-5, pAD11 p40N303Q-hFc-5 and pAD11 TNFR-hFc-5.

[0031] En una realización, se proporciona un procedimiento para administrar moléculas biológicamente activas a 20 un mamífero que incluye la etapa de administrar la molécula de ácido nucleico al mamífero que lo necesita.

[0032] En otra realización, un polipéptido incluye un dominio Fc que consta de una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 en una dirección del extremo N al extremo C, en el que dicha región bisagra incluye al menos una porción de restos de aminoácidos de un dominio CH2 de la IgG4 humana, en el que 4-37 restos de aminoácidos

25 consecutivos en el extremo N del dominio CH2 de la IgG4 humana están sustituidos con al menos una porción de restos de aminoácidos de la región del extremo N del dominio CH2 de la IgG2 humana o la región del extremo N del dominio CH2 de la IgD humana, y dicho dominio CH3 incluye al menos una porción de restos de aminoácidos de un dominio CH3 de la IgG4 humana.

30 [0033] La región bisagra puede incluir al menos una porción de restos de aminoácidos de la región bisagra de la IgG1 humana, dicho dominio CH2 incluye al menos una porción de restos de aminoácidos del dominio CH2 de la IgG4, en el que 4-37 restos de aminoácidos en el extremo N del dominio CH2 de la IgG4 humana están sustituidos con al menos una porción de los restos de aminoácidos de la región del extremo N del dominio CH2 de la IgG2 humana.

35 [0034] La región bisagra puede incluir al menos una porción de restos de aminoácidos de la región bisagra de la IgD humana, dicho dominio CH2 incluye al menos una porción de restos de aminoácidos del dominio CH2 de la IgG4 humana, en el que 4-37 restos de aminoácidos en el extremo N del dominio CH2 de la IgG4 humana están sustituidos con al menos una porción de los restos de aminoácidos de la región del extremo N del dominio CH2 de la

40 IgD humana.

[0035] El polipéptido puede incluir además un dominio CH1, en el que dicho dominio CH1 incluye al menos una porción de restos de aminoácidos del dominio CH1 de la IgG1 humana, y en el que dicho dominio CH1 está acoplado al extremo N de dicha región bisagra. El polipéptido puede incluir además un dominio CH1, en el que dicho 45 dominio CH1 incluye al menos una porción de restos de aminoácidos del dominio CH1 de la IgD humana, y en el que dicho dominio CH1 está acoplado al extremo N de dicha región bisagra. El polipéptido puede incluir además un segundo polipéptido acoplado al extremo N de dicha región bisagra, en el que el segundo polipéptido es un polipéptido no de inmunoglobulina biológicamente activo. El polipéptido puede incluir además una molécula biológicamente activa acoplada al extremo N de dicho dominio CH1 o al extremo C de dicho dominio CH4 mediante 50 un enlazador, en el que dicha molécula biológicamente activa no es un polipéptido de la inmunoglobulina. El polipéptido y la molécula biológicamente activa pueden estar acoplados entre sí mediante un enlazador. La molécula enlazadora es una albúmina enlazadora o un enlazador sintético. La albúmina enlazadora comprende la secuencia de aminoácidos 321 a 323, 318 a 325, 316 a 328, 313 a 330, 311 a 333, o 306 a 338 de la SEQ ID NO: 25. El enlazador sintético puede ser un péptido de 10 a 20 restos de aminoácidos compuestos por restos de Gly y Ser. En

55 una realización, dicho enlazador de Gly-Ser es GGGGSGGGGSGGGSG (SEQ ID NO: 32).

[0036] La presente invención abarca también una molécula de anticuerpo que comprende una región Fc recombinante, la región Fc recombinante se describe como anteriormente.

Breve descripción de los dibujos

[0037] La Fig. 1 muestra el diagrama esquemático de las Fc hibridas (hFc) que se pueden usar como proteínas portadoras de moléculas activas designadas como “X”.

5 [0038] La Fig. 2 muestra las representaciones esquemáticas de las hFc siguiendo la descripción de las posiciones de aminoácidos derivadas de la IgG1 (SEQ ID NO: 11), IgG2 (SEQ ID: 12), IgG4 (SEQ ID: 13) e IgD (SEQ ID: 14). Se aplica la misma regla a la designación de las posiciones de aminoácidos en el polipéptido a lo largo de la solicitud, a no ser que se indique otra cosa.

10 [0039] La Fig. 3 muestra la representación esquemática de las hFc en la que cada una está conjugada a moléculas biológicamente activas designadas como “X” en el extremo C mediante un péptido enlazador de albúmina designado como “AL”.

15 [0040] La Fig. 4 muestra representaciones esquemáticas de las hFc conjugadas con enlazadores siguiendo la descripción detallada acerca de las posiciones de los aminoácidos de los enlazadores de la albúmina derivados de la albúmina humana (SEQ ID NO: 25).

[0041] La Fig. 5 muestra los resultados de la gráfica de hidrofobicidad de la hFc-6.

20 [0042] La Fig. 6(a) muestra los resultados de las actividades de unión de FcγRI de MabThera® (Rituximab), hIgG1, Enbrel® (etanercept), EPO-hFc-5, G-CSF-hFc-5, p40N303Q-hFc-5 utilizando el ensayo ELISA específico; la Fig. 6(b) muestra los resultados de las actividades de unión de Clq de MabThera® (Rituximab), hIgG1, Enbrel® (etanercept), EFO-hFc-5, G-CSF-hFc-5, p40N303Q-hFc-5 utilizando el ensayo ELISA específico.

25 [0043] La Fig. 7(a) muestra los resultados de las bioactividades de EPO-IgG1 Fc, EFO-hFc-1, EFO-hFc-5, EPOhFc-6 y Aranesp® (darbepoetina alfa), en comparación con la de EPO en la línea de células F36E; la Fig. 7(b) muestra los resultados de las bioactividades in vitro de Neulasta® (pegfilgrastim) y G-CSF-hFc-5 en una línea de células hematopoyéticas de ratón (NFS-60), la Fig. 7(c) muestra los resultados de Enbrel® (etanercept) y TNFR-hFc

30 5 en células L929 de murino, y la Fig. 7(e) muestra los resultados de las bioactividades in vitro de thFc-1-AL(0)-IFNbeta and thFc-1-AL(3)-IFN-beta en células WISH humanas.

[0044] La Fig. 8(a) muestra los resultados de la vida media in vivo de Aranesp® (darbepoetina alfa), EPO-hFc-1, o EPO-hFc-5 mediante la ruta SC (panel izquierdo) y la ruta IV (panel derecho), la Fig. 8(b) muestra los resultados de

35 la farmacocinética de LEUCOSTIM® (filgrastim) y G-CSF-hFc-1 administrados a ratas Sprague Dawley mediante la ruta SC (panel izquierdo) y la ruta IV (panel derecho), la Fig. 8(c) muestra los resultados de la farmacocinética de p40N303Q-hFc-5 and Enbrel® (etanercept) administrados a monos cynomolgus Sprague Dawley mediante la ruta SC. La Fig. 8(d) muestra los resultados de la farmacocinética de TNFR-hFc-5 y Enbrel® (etanercept) administrados a ratas Sprague Dawley mediante la ruta SC.

40 [0045] La Fig. 9(a) muestra los resultados de las bioactividades in vivo de Aranesp® (darbepoetina alfa) y EPOhFc-5 administrados a monos cynomolgus mediante la ruta SC (panel superior izquierdo) y la ruta IV (panel superior derecho) y la Fig. 9(b) muestra los resultados de las bioactividades in vivo de LEUCOSTIM® (filgrastim) y G-CSFhFc-1 administrados a ratas Sprague Dawley mediante la ruta SC (panel superior) y la ruta IV (panel inferior).

Mejor modo de llevar a cabo la invención.

[0046] La presente invención proporciona un fragmento de Fc híbrido de la inmunoglobulina humana que incluye una región bisagra, y un dominio CH2 y un dominio CH3 en una dirección del extremo N al extremo C, en el que la 50 región bisagra es una secuencia de aminoácidos al menos parcial de una región bisagra de la IgD humana o una región bisagra de la IgG1 humana; y el dominio CH2 es un dominio CH2 de la IgG4 humana, una porción de la cual, en su región del extremo N, está sustituida por 4-37 restos de aminoácidos de una región del extremo N de un dominio CH2 de la IgG2 humana o un dominio CH2 de la IgD humana. Dicho fragmento de Fc híbrido, cuando se une a una molécula biológicamente activa, tal como un polipéptido biológicamente activo de la molécula

55 biológicamente, para producir una proteína de fusión de Fc, minimiza las inmunoreacciones no específicas de la proteína de fusión de Fc, prolonga la vida media en suero del polipéptido biológicamente de la molécula biológicamente activa, y optimiza la actividad del polipéptido biológicamente activo de la molécula biológicamente activa.

[0047] En la proteína de fusión de Fc de acuerdo con una realización de la presente invención, la combinación del dominio CH2 de la IgD del extremo N con la porción restante del dominio CH2 de la IgG4 se ha diseñado para que la región de la proteína de fusión resultante en la que dos diferentes subunidades de Ig se recombinan sea hidrófoba. La región hidrófoba de la proteína fusionada resultante se localizará en el interior de una proteína plegada,

5 minimizando la reacción inmune no específica no deseada.

[0048] El término “fragmento de Fc” o “Fc”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína que contiene la región 1 constante de la cadena pesada. (CH1), la región 2 constante de la cadena pesada (CH2) y la región 3 constante de la cadena pesada (CH3) de una inmunoglobulina, y no las regiones variables de las

10 cadenas pesada y ligera, y la región 1 constante de la cadena ligera (CL1) de la inmunoglobulina. Puede incluir adicionalmente la región bisagra y la región constante de la cadena pesada. Fc híbrido o fragmento de Fc híbrido se denomina algunas veces en el presente documento como “hFc”.

[0049] Además, el fragmento de Fc de la presente invención puede estar en la forma de tener cadenas naturales

15 de azúcar, un mayor número de cadenas de azúcar en comparación con una forma natural o un menor número de cadenas de azúcar en comparación con la forma natural, o puede estar en forma deglicosilada. El aumento, disminución o eliminación de las cadenas de azúcar del Fc de la inmunoglobulina se pueden conseguir mediante procedimientos habituales en la técnica, tales como procedimientos químicos, procedimientos enzimáticos y procedimientos de genomanipulación utilizando un microorganismo. La eliminación de las cadenas de azúcar de un

20 fragmento de Fc da como resultado una fuerte disminución en la afinidad de unión a la parte Clq del primer componente C1 del complemento y una disminución o pérdida en la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), no induciendo de esta forma respuestas inmunes innecesarias in vivo. A este respecto, un fragmento de Fc de la inmunoglobulina en una forma deglicosilada o aglicosilada puede ser, en algunos casos, más adecuado para el objeto de la presente invención

25 como fármaco portador.

[0050] Tal como se usa en el presente documento, el término “deglicosilación” se refiere a que estos restos de azúcar se eliminan enzimáticamente de un fragmento de Fc, y el término “aglicosilación” significa que se produce un fragmento de Fc en una forma no glicosilada por un procariota, preferiblemente E. coli.

30 [0051] El término “híbrido”, tal como se usa en el presente documento, significa que las secuencias que codifican dos o más fragmentos de Fc de inmunoglobulinas de diferente origen están presentes en un fragmento de Fc de la inmunoglobulina monocatenaria.

35 [0052] En una realización, el Fc humano híbrido incluye una región bisagra, un dominio CH2, y un dominio CH3 en una dirección del extremo N al extremo C, en el que la región bisagra es una secuencia de aminoácidos al menos parcial de una región bisagra de la IgD humana o una región bisagra de la IgGI humana, y el dominio CH2 es un dominio CH2 de la IgG4 humana, una porción del cual, en su región del extremo N, está sustituida por 4-37 restos de aminoácidos de una región del extremo N de un dominio CH2 de la IgG2 humana o un dominio CH2 de la IgD

40 humana. El Fc híbrido humano se puede unir por su extremo N al extremo C de una molécula biológicamente activa mediante un enlace covalente.

[0053] Los polipéptidos de la fórmula N’-X-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C’ y N’-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-(enlazador)q-X-C’ aumentan la vida media en circulación de la molécula X biológicamente activa en comparación con la vida media en circulación

45 de X solo, cuando se administran a un sujeto.

[0054] El enlazador puede derivarse de la albúmina humana (CAA00606 SEQ ID NO: 25). El enlazador puede comprender la secuencia de aminoácidos 321 a 323, 318 a 325, 316 a 328, 313 a 330, 311 a 333, o 306 a 338 de la SEQ ID NO: 25. De forma alternativa, el enlazador puede ser un enlazador sintético. El enlazador sintético puede ser

50 un péptido compuesto por un total de 10-20 restos de Gly y Ser. En una realización, el enlazador de Gly-Ser es GGGGSGGGGSGGGSG (SEQ ID NO: 32).

[0055] Z1 puede comprender al menos una porción del dominio CH1 de la IgD (SEQ ID NO: 14). Z1 puede comprender 5 a 9 o 7 a 9 restos de aminoácidos consecutivos de la región del extremo C del dominio CH1 de la IgD

55 (posiciones 90-98 de la SEQ ID NO: 14). En algunas realizaciones, Z1 puede tener 5, 6, 7, 8 o 9 restos de aminoácidos en el extremo C del dominio CH1 de la IgD.

[0056] Y puede comprender al menos una porción de la región bisagra de la IgD humana. Y puede comprender 5

o más, o 10 o más restos de aminoácidos consecutivos de la región bisagra de la IgD (aminoácidos en las posiciones 99 a 162 de la SEQ ID NO: 14). En determinadas realizaciones, Y puede ser una secuencia de aminoácidos que incluye restos de aminoácidos en las posiciones 158 a 162 de la SEQ ID NO: 14, restos de aminoácidos en las posiciones 153 a 162 de la SEQ ID NO: 14, restos de aminoácidos en las posiciones 143 a 162 de la SEQ ID NO: 14, restos de aminoácidos en las posiciones 133 a 162 de la SEQ ID NO: 14, o restos de

5 aminoácidos en las posiciones 99 a 162 de la SEQ ID NO: 14.

[0057] 8 restos de aminoácidos del extremo N de un dominio CH2 de la IgD humana (los restos de aminoácidos 163-170 de la SEQ ID NO: 14).

10 [0058] Z4 puede ser restos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del dominio CH3 de la IgG4 (restos de aminoácidos en las posiciones 221 a 327 de la SEQ ID NO: 13), que corresponden a los restos de aminoácidos 341447 de la IgG4 humana, tal como se numeran de acuerdo con el Índice EU, de acuerdo con Kabat (que corresponde a los restos de aminoácidos en las posiciones 221-327 de la SEQ ID NO: 13).

15 [0059] En otra realización, Y puede ser una secuencia de aminoácidos que incluye al menos una porción de la región del extremo C de la región bisagra de la IgD humana (restos de aminoácidos en las posiciones 99 a 162 de la SEQ ID NO: 14), p puede ser 1 o 0 (cero), Z2 puede ser una secuencia de aminoácidos que incluye al menos una porción de la región del extremo N del dominio CH2 de la IgD humana (restos de aminoácidos en las posiciones 163 a 199 de la SEQ ID NO: 14), y Z3 puede ser una secuencia de aminoácidos que incluye al menos una porción de la

20 región del extremo C del dominio CH2 de la IgG4 humana ( restos de aminoácidos en las posiciones 121 a 220 de la SEQ ID NO: 13). Por ejemplo, Y puede ser restos de aminoácidos en las posiciones 158 a 162, 133 a 162, o 99 a 162 de la SEQ ID NO: 14, Z2 puede ser los restos de aminoácidos en las posiciones 163 a 170 de la SEQ ID NO: 14, y Z3 puede ser los restos de aminoácidos en las posiciones 121-220 de la SEQ ID NO: 13.

25 [0060] En esta realización, cuando p es 1, Z1 puede ser una secuencia de aminoácidos que incluye la región del extremo C del dominio CH1 de la IgD humana (restos de aminoácidos en las posiciones 90 a 98 de la SEQ ID NO: 14). Por ejemplo, Z1 puede ser los restos de aminoácidos 90 a 98 de la SEQ ID NO: 14

[0061] En esta realización, Y puede ser 20 restos de aminoácidos consecutivos o más, 30 restos de aminoácidos

30 consecutivos o más, 40 restos de aminoácidos consecutivos o más, 50 restos de aminoácidos consecutivos o más, o 60 restos de aminoácidos consecutivos o más del lado del extremo C de la región bisagra de la IgD humana ( restos de aminoácidos en las posiciones 99-162 de la SEQ ID NO: 14). Z3 puede comprender 71 a 100 restos de aminoácidos consecutivos del lado del extremo C de los restos de aminoácidos en las posiciones 121-220 de la SEQ ID NO: 13. El número total de los restos de aminoácidos de Z2 y Z3 puede ser 108.

35 [0062] La Tabla 1 muestra las secuencias de aminoácidos de los fragmentos de la IgG1, IgG2, IgG3 e IgD útiles en la construcción de los hFc de acuerdo con las realizaciones de la presente invención.

[0063] Tabla 1 40

[Tabla 1]

dominio hFc Intervalo aceptable

Secuencia del fragmento más largo

SEQ Localización

Localización de los fragmentos de

en el intervalo aceptable, en la

ID en la SEQ

en el índice Ig

dirección del extremo N al extremo

NO:

ID

EU * C CH1(Z1)

5-9 restos de SNTKVDKRV** 11 90-98

207-215 aminoácidos del extremo C del CH1 de la IgG1 5-9 restos de

ASKSKKEIF 14 90-98

No aminoácidos del

disponible extremo C del CH1 de la IgD

Bisagra 5-15 restos de EPKSCDKTHTCPPCP 11 99-113

216-230 aminoácidos del extremo C de la región bisagra de la IgG1 5-64 aminoácidos

14 99-162

No del extremo C de la

disponible región bisagra de la IgD

CH2, lado 4-37 restos de

12

111-147

231-267 del extremo

aminoácidos del N (Z2)

extremo N

CH2 de la IgG2 4-37 restos de

14 163-199

No aminoácidos del

disponible extremo N del dominio CH2 de la IgD CH2, lado 71-106 restos de

13

115-220

235-340 + del extremo

aminoácidos del

+ 221-327

341-447 C (Z3) +

extremo C del CH2 CH3 (Z4)

de la IgG4 + 80-107 restos de aminoácidos del dominio CH3 de la IgG4

71-106 restos de 24 165-270 +

235-340 + aminoácidos del

271-377

341-447 extremo C del CH2 de la IgG3 + 80-107 restos de aminoácidos del extremo N del dominio CH3 de la Ig3

71-106 restos de los aminoácidos del extremo C del CH2 de la IG2 +: 12 114-219 + 220-326 234-340 +341-447

80-197 restos de aminoácidos del extremo N del dominio CH3 de la IgG2

71-106 restos de aminoácidos del extremo C del CH2 de la IgG1 + 80-107 restos de aminoácidos del extremo N: 11 118223 + 224330 235-340 341-447

[0064] * el índice EU se describe en "Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, United States Department of Health and Human Services." 5 [0065] ** la región subrayada en cada una de las secuencias de aminoácidos indica los fragmentos más cortos de 12

la gama de restos de aminoácidos aceptables.

[0066] En una realización, la presente invención proporciona una Fc híbrida que es una de hFc-1, hFc-2, hFc-3, hFc-4, hFc-5, o hFc-6, tal como se muestra en las Fig. 1 y 2, o la thFc-1 o thFc-2 que se muestra en las Fig. 3 y 4. 5 Aunque las Figs. 1 y 3 representan Fc bicatenarias, la presente invención también abarca moléculas de Fc híbridas monocatenarias. Las secuencias de aminoácidos de hFc-1 a hFc-6 se muestran en las SEQ ID NOs: 18-23, respectivamente y las secuencias de aminoácidos de thFc-1 y thFc-2 se muestran en la SEQ ID NO: 28 y la SEQ ID NO: 29, respectivamente. La presente invención abarca también moléculas de polinucleótidos que codifican la Fc híbrida. Incluyen, pero no se limitan a, una secuencia de polinucleótidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: 1

10 (hFc-1), SEQ ID NO: 2 (hFc-2), SEQ ID NO: 3 (hFc-3), SEQ ID NO: 4 (hFc-4), SEQ ID NO: 5 (hFc-5), SEQ ID NO: 6 (hFc-6), SEQ ID NO: 26 (thFc-1) and SEQ ID NO: 27 (thFc-2).

[0067] Se conocen en la técnica las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas humanas y están depositadas en un depositario públicamente disponible. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de la región

15 constante de la Igg1 humana, la región constante de la IgG2 humana, la región constante de la Igg3 humana, la región constante de la Igg4 humana, y la región constante de la IgD humana están disponibles en CAA75032, CAC20455, CAC20456, AAH25985 y P01880, respectivamente. Estas secuencias se reprodujeron como la SEQ ID NO: 11, 12, 24, 13 and 14, respectivamente.

20 [0068] Una molécula X biológicamente activa puede ser una proteína soluble. Puede incluir, pero no se limita a, una hormona, citocina, factor de crecimiento, molécula coestimuladora, receptor de hormonas, receptor de citocinas, receptor de factores de crecimiento, o péptidos cortos. Por ejemplo, X puede ser un receptor de EPO, p40, G-CSF, TNF o sus variantes/fragmentos. X puede ser un receptor de GMCSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL10, IL-10 IL-17, TGF-beta, receptor de TGF-beta IL-17 receptor de IL-17, Factor VII, CXCL-11, FSH, hormona del

25 crecimiento humano, proteína 1 morfogenética del hueso, CTLA4, PD-1, GLP-1, betacelulina, OPG, RNAK, interferón alfa, interferón beta o sus variantes/fragmentos, puede incluir también, pero sin limitarse a, una región Fab de un anticuerpo. La molécula biológicamente activa puede ser también una proteína secretada. En una realización, la molécula biológicamente activa no pertenece a la familia de las inmunoglobulinas.

30 [0069] El término “variante” se refiere a un polinucleótido o ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico o polipéptido de referencia, pero que retiene las propiedades esenciales del mismo. Generalmente, las variantes son globalmente muy similares y, en muchas regiones, idénticas al ácido nucleico o polipéptido de referencia. También, el término “variante” se refiere a una porción biológicamente activa de una molécula biológicamente activa de fármaco, y que retiene al menos una de sus propiedades funcionales y/o terapéuticas tal como se describe en

35 cualquier parte del presente documento o se conoce de otra forma en la técnica. Generalmente, las variantes son globalmente muy similares, y, en muchas regiones, idénticas a la secuencia de aminoácidos de la proteína de interés biológicamente activa.

[0070] La presente invención proporciona también proteínas que comprenden, o constan de forma alternativa de,

40 una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, idéntica a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos, tal como se muestra en las SEQ ID NOs: 18-23 y 28

29. Se proporcionan también fragmentos de estos polipéptidos. Los polipéptidos adicionales abarcados por la invención son polipéptidos codificados por los nucleótidos que se hibridan con el complemento de una molécula de ácido nucleico que codifica los polipéptidos de la invención en condiciones de hibridación restrictiva (por ejemplo, 45 hibridación a un filtro unido al ADN en 6 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45º C seguido por uno o más lavados en 0,2 x SSC, SDS al 0,1% a aproximadamente 50-65º C) en condiciones muy restrictivas (por ejemplo, hibridación a un filtro unido a ADN en 6 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45º C, seguido por uno más lavados en 0,1 x SSC, SDS al 0,2% a aproximadamente 68º C), o en otras condiciones de hibridación restrictivas que conocen los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, F. M. y col., eds.,

50 1989 Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons Inc., Nueva York, en las páginas 6.3.1 6.3.6 y 2.10.3). los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos están también abarcados por la invención.

[0071] En un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, un 95% “idéntica” a una

55 secuencia de aminoácidos solicitada, se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sujeto sea idéntica a la secuencia solicitada excepto en que la secuencia polipeptídica sujeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos solicitada. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos solicitada, hasta un 5% de los restos de aminoácidos de la secuencia se puede invertir, eliminar o sustituir con otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones de los extremos amino o carboxi de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier sitio entre aquellas posiciones terminales, intercaladas tanto individualmente entre restos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia.

5 [0072] Desde el punto de vista práctico, se puede determinar de forma convencional utilizando programas informáticos conocidos que cualquier polipéptido particular es al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión de la albúmina de la invención o uno de sus fragmentos. Un procedimiento preferido para determinar la mejor correspondencia global entre una

10 secuencia solicitada (una secuencia de la presente invención) y una secuencia sujeto, denominado alineación de la secuencia global, se puede determinar utilizando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag y col. (Comp. App. Biosd. 6: 237 245 (1990)). En una alineación de secuencias, las secuencias solicitada y sujeto son ambas secuencias de nucleótidos o son ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de la alineación de la secuencia global se expresa como porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos utilizados en la alineación de

15 aminoácidos por FASTDB son: Matriz = PAM 0, valor k-tupla = 2, Penalización por error de emparejamiento = 1, Penalización por unión = 20, Longitud del grupo de aleatorización = 0, Puntuación por corte = 1, Tamaño de ventana = longitud de la secuencia, Penalización por hueco = 5, Penalización por tamaño de hueco = 0,05, Tamaño de ventana = 500 o la longitud de la secuencia de aminoácidos sujeto, lo que sea más corto.

20 [0073] La variante tendrá usualmente al menos un 75% (preferiblemente al menos aproximadamente 80%, 90%, 95% o 99%) de identidad de la secuencia con una longitud de HA normal o de la proteína terapéutica que tenga la misma longitud que la variante. La homología o identidad en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos se determina mediante análisis BLAST (Herramienta Básica de Investigación de la Alineación Local), utilizando el algoritmo empleado por los programas blastn, blastx, tblastn y tblastx (Karlin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:

25 2264 2268 (1990) y Altschul, J. Mol. Evol. 36: 290 300 (1993) que se hacen a medida para la investigación de la similitud de la secuencia.

[0074] Las variantes de polinucleótidos de la invención pueden contener alteraciones en las regiones de codificación, regiones no codificantes, o ambas. Especialmente preferidas son las variantes de polinucleótidos que 30 contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones, o eliminaciones silenciosas, pero que no alteran las propiedades o las actividades del polipéptido codificado. Se prefieren las variantes de nucleótidos producidas por sustituciones silenciosas debidas a la degeneración del código genético. Además, se prefieren también las variantes de polipéptidos en las que menos de 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20, menos de 10, o 5-50, 5-25, 5-10, 1-5, o 1-2 aminoácidos se sustituyen, eliminan, añaden en cualquier combinación. Se pueden producir variantes de

35 polinucleótidos por una variedad de razones, por ejemplo, para optimizar la expresión del codón de un hospedador concreto (cambio de codones en el ARNm humano por los preferidos por un hospedador bacteriano, tales como, levadura o E. coli).

[0075] A fin de construir diversas proteínas de fusión de Fc tales como la construcción de fusión EPO-Fc, la

40 construcción de fusión G-CSF-Fc, o la construcción de fusión p40-Fc humana, las secuencias de aminoácidos de la EPO humana, G-CSF humano, p40 humana, y el receptor de TNF humano están disponibles de NP_000790 (SEQ ID NO: 15), CAA27291 (SEQ ID NO: 16), AAG32620 (SEQ ID NO: 17), y NP_001057 (SEQ ID NO: 31), respectivamente. En una realización, está vinculada al polipéptido una p40 humana en la que el resto del aminoácido Asn en la posición 303 está sustituido por Gln.

45 [0076] De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo completo que contiene la región Fc genomanipulada. El término “anticuerpo” tal como se usa en el presente documento incluye anticuerpos completos y fragmentos de anticuerpos que incluyen al menos dos de CH1, la región bisagra, CH2 o CH3. Se prefieren anticuerpos monoclonales completos. La región variable de la cadena pesada del anticuerpo se selecciona

50 por su especificidad de unión y puede ser de cualquier tipo, tal como, por ejemplo, no humana, humanizada o completamente humana. Cuando la región variable de la cadena pesada de la región variable del anticuerpo es no humana (tal como, por ejemplo, de murino) y se combina de forma recombinante con una región Fc genomanipulada de acuerdo con esta divulgación, el anticuerpo recombinante resultante se denomina anticuerpo quimérico. Si la región variable de la cadena pesada del anticuerpo está humanizada y se combina de forma recombinante con una

55 región Fc genomanipulada de acuerdo con esta divulgación, el anticuerpo recombinante resultante se denomina anticuerpo humanizado. Si la región variable de la cadena pesada del anticuerpo es humana y se combina de forma recombinante con una región Fc genomanipulada de acuerdo con esta divulgación, el anticuerpo recombinante resultante se denomina anticuerpo completamente humano. Por ejemplo, la región variable de la cadena pesada está humanizada e incluye regiones marco de origen humano y regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de origen no humano (en este caso, de murino). Debe entenderse que las regiones marco se pueden derivar de una fuente o más de una fuente y que las CDR se pueden derivar de una fuente o más de una fuente. Los expertos en la técnica conocen los procedimientos de humanización de anticuerpos y se conocen en la técnica.

5 [0077] La cadena ligera del anticuerpo puede ser humana, no humana o humanizada. En la realización que se muestra en la Figura 1B, la cadena ligera está humanizada e incluye regiones marco humanas, CDR no humanas (en este caso de murino) y una región constante humana. Debe entenderse que las regiones marco se pueden derivar de una fuente o más de una fuente y que las CDR se pueden derivar de una fuente o más de una fuente.

10 [0078] El anticuerpo que contiene la región Fc genomanipulada se selecciona basándose en su capacidad de unirse a una molécula superficial celular o a una molécula soluble que se une a una molécula superficial celular. De esta manera, por ejemplo, el anticuerpo se puede seleccionar basándose en su capacidad de unirse a las moléculas superficiales celulares tales como los receptores de citocina (por ejemplo, IL-2R, TNF-aR, IL-15R, etc.), moléculas de adhesión (por ejemplo, E-selectina, P-selectina, L-selectina, VCAM, ICAM, etc.), antígenos de diferenciación o

15 activación celular (por ejemplo, CD3, CD4, CD8, CD20, CD25, CD40, etc.), y otros. De forma alternativa, se puede seleccionar el anticuerpo basándose en su capacidad para unirse a una molécula soluble que se une a moléculas superficiales celulares. Dichas moléculas solubles incluyen, pero no se limitan a, citocinas y quimiocinas (por ejemplo, interleucina-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, etc.) factores de crecimiento (por ejemplo, EGF, PGDF, GCSF, HGF, IGF, BMP-1, etc.) moléculas que induce la diferenciación celular (por ejemplo, EPO, TPO, SCF; PTN, etc.), y

20 otros.

[0079] En general, la construcción de los anticuerpos dados a conocer en el presente documento se consigue mediante el uso de manipulaciones reconocidas utilizadas en tecnología de genomanipulación. Por ejemplo, se conocen generalmente en el campo las técnicas para aislar el ADN, preparar y seleccionar vectores para expresar el

25 ADN, purificar y analizar ácidos nucleicos, procedimientos específicos para preparar el ADN de un vector recombinante, escindir ADN con enzimas de restricción, unir ADN, introducir ADN incluyendo el ADN del vector en células hospedadoras por medios estables o transitorios, cultivar las células hospedadoras en medios selectivos o no selectivos para seleccionar y mantener células que expresan el ADN

30 [0080] Los anticuerpos monoclonales dados a conocer en el presente documento se pueden derivar utilizando el procedimiento del hibridoma, que se conoce en la técnica, u otros procedimientos de ADN recombinante bien conocidos en la materia. En el procedimiento del hibridoma, un ratón u otro animal hospedador adecuado se inmuniza con ADN, péptidos o proteínas que estimulan la producción de anticuerpos por los linfocitos.

35 [0081] De forma alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Los linfocitos producidos en respuesta al antígeno se fusionan a continuación con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Las células de hibridoma se siembran a continuación y se hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parenteral no fusionadas. Las células de mieloma

40 preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, apoyan la producción estable de anticuerpos mediante las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y no son sensibles a un medio tal como el medio HAT (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo., Nº de catálogo H-0262).

[0082] Se pueden usar también los anticuerpos que contienen la región Fc genomanipulada como composiciones

45 administradas por separado proporcionadas junto con agentes terapéuticos. A fines diagnósticos, los anticuerpos pueden tanto marcarse como no marcarse.

[0083] Se pueden usar anticuerpos no marcados en combinación con otros anticuerpos marcados (anticuerpos segundos) que reaccionan con el anticuerpo genomanipulado, tal como anticuerpos específicos de las regiones

50 constantes de la inmunoglobulina humana. De forma alternativa, los anticuerpos se pueden marcar directamente. Se puede emplear una amplia variedad de marcas, tales como radionucleidos, flúores, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores de enzimas, inhibidores de enzimas, ligandos (particularmente haptenos), etc. Están disponibles numerosos tipos de inmunoensayos y son bien conocidos por los expertos en la técnica.

55 [0084] De acuerdo con una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para producir la proteína de fusión, cuyo procedimiento comprende: (i) introducir una molécula de ADN que codifica la proteína de fusión en una célula hospedadora de mamífero, (ii) hacer crecer la célula en condiciones para que la proteína de fusión se exprese en su medio de crecimiento; y (iii) cosechar la proteína de fusión producida.

[0085] En otra realización a modo de ejemplo, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína de fusión o una molécula de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo descrito anteriormente. Se proporciona también un procedimiento para tratar o evitar determinados síntomas administrando la composición farmacéutica. Por ejemplo, se proporciona un procedimiento, que (i) reduce los síntomas de/evita/trata una

5 enfermedad autoinmune (0) inhibe el rechazo de un injerto, (0) trata/evita el shock inducido por una endotoxina, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión de la Fc híbrida y una proteína p40 o sus variantes/fragmentos.

[0086] La composición puede comprender un vehículo farmacéutico, un vehículo farmacéutico puede ser cualquier

10 sustancia no tóxica compatible para la administración de los anticuerpos al paciente. Pueden estar incluidos en el vehículo agua estéril, alcohol, grasas, ceras, y sólidos inertes. Los adyuvantes farmacéuticamente aceptados (agentes tamponantes, agente dispersante) pueden incorporarse también a la composición farmacéutica.

[0087] Se pueden administrar las composiciones de anticuerpos a un sujeto de una variedad de formas. Por

15 ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por vía parenteral, por ejemplo, por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa. Estas composiciones se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales, bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste del pH y tamponantes, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de

20 sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio, etc. La concentración de la proteína de fusión, el anticuerpo, o el fragmento de anticuerpo en estas formulaciones puede variar ampliamente, por ejemplo, desde menos de aproximadamente 0,5%, usualmente a o al menos aproximadamente 1% hasta como mucho 15 o 20% en peso y se seleccionará principalmente basándose en los volúmenes de fluidos, las viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado.

25 [0088] La presente invención proporciona también una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la proteína de fusión, y un vector de expresión que transporta la molécula de ácido nucleico. Dicho ácido nucleico puede administrarse directamente a un sujeto que necesita un polipéptido codificado por el ácido nucleico. De forma alternativa, el polinucleótido se produce expresando el ácido nucleico en un medio y a continuación administrándose

30 a un sujeto.

[0089] El término “péptido”, “polipéptido” o “proteína” se refiere a moléculas de 2 a 40 aminoácidos, prefiriéndose moléculas de 3 a 20 aminoácidos y prefiriéndose más las de 6 a 15 aminoácidos. Pueden generarse de forma aleatoria péptidos a modo de ejemplo mediante cualquier de los procedimientos citados anteriormente, llevados a

35 cabo en una biblioteca de péptidos (por ejemplo, una biblioteca de expresión en fagos) o derivados mediante digestión de proteínas.

[0090] El término “fármaco”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que muestra actividad terapéutica cuando se administra a seres humanos o animales, y los ejemplos del fármaco incluyen, pero

40 no se limitan a, polipéptidos, compuestos, extractos y ácidos nucleicos., Se prefiere un fármaco de polipéptido.

[0091] Los términos “polipéptido fisiológicamente activo”, “molécula biológicamente activa”, “proteína fisiológicamente activa”, “polipéptido activo”, “fármaco de polipéptido”, y “fármaco de proteína”, tal como se usan en el presente documento, tienen un significado indistinto, y se caracterizan en que están en una forma fisiológicamente

45 activa presentando diversas funciones fisiológicas in vivo.

[0092] El fármaco de polipéptido tiene la desventaja de ser incapaz de mantener la acción fisiológica durante un largo periodo de tiempo debido a su propiedad de desnaturalizarse o degradarse fácilmente por las enzimas proteolíticas presentes en el cuerpo. Sin embargo, cuando el fármaco de polipéptido se une (o se acopla) a los 50 fragmentos Fc de la inmunoglobulina de acuerdo con las realizaciones de la presente invención para formar una proteína de fusión, el fármaco tiene una mayor estabilidad estructural y vida media en suero. También, el polipéptido unido al fragmento de Fc tiene una disminución mucho más pequeña en la actividad fisiológica que otras formulaciones de fármacos de polipéptido conocidas. Por tanto, en comparación con la biodisponibilidad in vivo de los fármacos de los polipéptidos convencionales, el polipéptido fusionado que comprende el fármaco de polipéptido y 55 el fragmento de Fc, o un conjugado del fármaco de polipéptido y del fragmento de Fc de acuerdo con la presente invención se caracteriza por tener una biodisponibilidad in vivo marcadamente mejorada. Esto se describe también claramente a lo largo de las realizaciones de la presente invención. Esto es, cuando se unen al fragmento de Fc de la presente invención, el receptor de IFN-a, G-CSF, EPO, p40, TNF, y otros fármacos de proteínas presentaron un aumento en la biodisponibilidad in vivo en comparación con sus formas naturales u otras formas fusionadas

convencionales.

[0093] Debe entenderse que la presente invención aprovecha metodologías de ADN recombinante para generar las proteínas de fusión de Fc, los anticuerpos que contienen la región Fc genomanipulada de acuerdo con la

5 presente invención y los fragmentos de anticuerpos útiles en la práctica de la invención. Las construcciones de fusión de Fc, se generan preferiblemente para el ADN, y los ADN resultantes se integran en vectores de expresión, y se expresan para producir las proteínas de fusión, el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de la invención.

[0094] Tal como se usa en el presente documento, se entiende que el término “vector” significa cualquier ácido

10 nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos competente para incorporarse en una célula hospedadora y que se va a recombinar con y a integrarse en el genoma de la célula hospedadora, o a replicarse de forma autónoma como un episoma. Dichos vectores incluyen ácidos nucleicos lineales, plásmidos, fagémidos, cósmidos, vectores de ARN, vectores víricos y similares. Los ejemplos no limitantes de un vector vírico incluyen un retrovirus, un adenovirus, y un virus adenoasociado. Tal como se usa en el presente documento, se entiende que los términos

15 “expresión génica” o “expresión” de una proteína diana, significan la transcripción de una secuencia de ADN, traducción del transcrito de ARNm, y secreción de un producto de proteína de fusión de Fc o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

[0095] Un vector de expresión útil es RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) o sus variantes. El vector de expresión útil

20 debe trasportar el promotor de citomegalovirus humano (CMV) para promover la transcripción constitutiva del gen de interés en células de mamífero y transportar la secuencia señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino para aumentar el nivel del ARN en estado estacionario después de la transcripción. En una realización de la presente invención, el vector de expresión es pAD11, que es un vector modificado de RcCMV. Los ejemplos del vector de expresión que transporta una secuencia de nucleótidos que codifica un fármaco de una molécula

25 biológicamente activa puede incluir, y no se limita a, pAD 11 EPO-hFc-1, pAD 11 G-CSF-hFc-1, pAD 11 p40N303QhFc-1, pAD11 EPOhFc-6, pAD11 G-CSF-hFc-6, pAD11 p40N303Q-hFc-6, pAD11 EPO-hFc-5, pAD11 G-CSF-hFc-5, pAD11 p40N303QhFc-5 o pAD 11 TNFR-hFc-5, tal como se describe con más detalle en los Ejemplos.

[0096] Una célula hospedadora adecuada puede ser un transformador transfectado con la secuencia de ADN de la

30 invención, y utilizarse para la expresión y/o la secreción de la proteína diana. Las células hospedadoras actualmente preferidas para uso en la invención incluyen células de hibridoma inmortalizadas, células de mieloma NS/0, células 293, células de ovario de hámster chino, células HeLa, y células COS.

[0097] Un sistema de expresión que se ha usado para producir una expresión de alto nivel de las proteínas de

35 fusión o el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo en las células de mamífero es una construcción de ADN que codifica, en la dirección 5’ a 3’, un casete de secreción, que incluye una secuencia señal y una región Fc de la inmunoglobulina, y una proteína diana tal como el receptor de p40, EPO, G-CSF, TNF. Se han expresado de forma satisfactoria algunas proteínas diana en dicho sistema e incluyen, por ejemplo, IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, ss; IG-H3, el receptor de IgE, PSMA, y gp120. Se dan a conocer estas construcciones de expresión en las Patentes de

40 Estados Unidos Nos 5.541.087 y 5.726.044 de Lo y col.

[0098] Las proteínas de fusión o la molécula de anticuerpo o los fragmentos de anticuerpos de la invención pueden incluir o no una secuencia señal cuando se expresan. Tal como se usa en el presente invención, se entiende que el término “secuencia señal” significa un segmento que dirige la secreción del fármaco de la molécula 45 biológicamente activa; la proteína de fusión, y posteriormente se escinde tras la traducción en la célula hospedadora. La secuencia señal de la invención es un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácido que inicia el transporte de una proteína a través de la membrana del retículo endoplásmico, por ejemplo, el anticuerpo 14.18 (Gillies y col., J. Immunol. Meth. 1989. 125: 191-202), las secuencias señal de la cadena pesada del anticuerpo, por ejemplo, las secuencias señal de la cadena pesada del anticuerpo, por ejemplo MOPC141 (Sakano y col., Nature

50 1980. 286: 676-683), y cualesquiera otras secuencias señal que se conozcan en la técnica (véase, por ejemplo, Watson y col., Nucleic Adds Research 1984. 12: 5145-5164).

[0099] Se han caracterizado bien en la técnica las secuencias señal y se sabe que contienen normalmente de 16 a 30 restos de aminoácidos, y pueden contener unos pocos más o menos restos de aminoácidos. Un péptido señal 55 típico consta de tres regiones, una región del extremo N básica, una región hidrófoba central, y una región del extremo C más polar. La región hidrófoba central contiene 4 a 12 restos hidrófobos que se anclan al péptido señal a través de la bicapa de lípidos de la membrana durante el transporte del polipéptido nascente. Tras el inicio, el péptido señal se escinde normalmente en el interior de la luz del retículo endoplásmico por enzimas celulares conocidos como peptidasas señal. Los potenciales sitios de escisión del péptido señal siguen generalmente la regla

“(-3, -1). De esta manera, un péptido señal típico tiene pequeños restos de aminoácidos neutros en las posiciones -1 y -3 y carece de restos de prolina en esta región.

[0100] La peptidasa señal escindirá dicho péptido señal entre los aminoácidos -1 y +1. De esta manera, la

5 secuencia señal se puede escindir a partir del término amino formado de la proteína de fusión durante la secreción. Esto da como resultado la secreción de una proteína de fusión de Fc consistente en la región de Fc de la inmunoglobulina y la proteína diana. Se proporciona una descripción detallas de las secuencias del péptido señal en von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14: 4683.

10 [0101] Como será evidente para un experto en la técnica, la adecuabilidad de una secuencia señal concreta para uso en el casete de secreción puede requerir alguna experimentación rutinaria.

[0102] Dicha experimentación incluirá determinar la capacidad de la secuencia señal para dirigir la secreción de una proteína de fusión de Fc y también una determinación de la configuración óptima, genómica o el ADNc, de la

15 secuencia que se va a usar con el fin de conseguir una secreción eficaz de las proteínas de fusión de Fc. De forma adicional, una persona experta en la técnica es capaz de crear un péptido señal sintético siguiendo las reglas presentadas por von Heijne (1986), y ensayar la eficacia de dicha secuencia señal sintética mediante la experimentación rutinaria. Se puede denominar una secuencia señal como “péptido señal”, “secuencia líder”, o ”péptido líder”

20 [0103] La fusión de la secuencia señal y la región Fc de la inmunoglobulina se denomina algunas veces casete de secreción. Un casete de secreción a modo de ejemplo útil en la práctica de la invención es un polinucleótido que codifica en una dirección 5’ a 3’, una secuencia señal de un gen de la cadena ligera de la inmunoglobulina y una región Fcy1 del gen y1 de la inmunoglobulina humana. La región Fcy1 del gen Fcy1 de la inmunoglobulina incluye

25 preferiblemente al menos una porción del dominio bisagra de la inmunoglobulina y al menos el dominio CH3, o de forma más preferible al menos una porción del dominio bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3. Tal como se usa en el presente documento, se entiende que la “porción” de la región bisagra de la inmunoglobulina significa una porción de la bisagra de la inmunoglobulina que contiene al menos uno, preferiblemente dos restos de cisteína capaces de formar enlaces disulfuro entre cadenas. El ADN que codifica el casete de secreción puede estar en su

30 configuración genómica o en su configuración de ADNc. En determinadas circunstancias, puede ser ventajoso producir la región Fc a partir de secuencias de la cadena pesada de la Fcy2 de la inmunoglobulina humana. Aunque las fusiones de Fc basadas en la inmunoglobulina humana comportan similitud en ratones, las fusiones de Fc basadas en las secuencias y2 pueden presentar una farmacocinética superior en seres humanos.

35 [0104] En otra realización, la secuencia de ADN que codifica un sitio de escisión proteolítica interpuesto entre el casete de secreción y la proteína diana. Un sitio de escisión proporciona la escisión proteolítica de la proteína de fusión codificada separando de esta manera el dominio Fc de la proteína diana. Tal como se usa en el presente documento, se entiende que “sitio de escisión proteolítica” significa las secuencias de aminoácidos que se escinden preferentemente por una enzima proteolítica u otros agentes de escisión proteolítica. Los sitios de escisión

40 proteolítica útiles incluyen secuencias de aminoácidos que se reconocen por las enzimas proteolíticas tales como tripsina, plasmina o enteroquinasa K. Se conocen muchas parejas de sitio de escisión/agente de escisión (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.726.044)

[0105] Además, sería también útil la sustitución o eliminación de las construcciones de estas regiones constantes,

45 en las que uno o más restos de aminoácidos de los dominios de la región constante se sustituyen o eliminan. Un ejemplo sería introducir sustituciones de aminoácidos en la región CH2 superior para crear una variante de Fc con afinidad reducida por los receptores de Fc (Cole y col. (1997) J. Immunol. 159: 3613). Una persona normalmente experta en la técnica puede preparar dichas construcciones utilizando técnicas de biología molecular bien conocidas.

50 [0106] Los ejemplos no limitantes de fármacos de proteína capaces de conjugarse con el fragmento de Fc de la inmunoglobulina de la presente invención incluyen la hormona del crecimiento humano, la proteína-1 morfogenética del hueso (BMP-1), hormona liberadora de la hormona de crecimiento, péptido liberador de la hormona del crecimiento, interferones y receptores de interferones (por ejemplo, interferón a, � y γ, receptor del interferón de tipo I soluble en agua, etc.), factor estimulador de las colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulador de las colonias

55 de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), péptidos de tipo glucagón (por ejemplo, GLP-1, etc.), receptor acoplado a la proteína G, interleucinas (por ejemplo, interleucina 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, etc.) y los receptores de las interleucinas (por ejemplo, receptor de IL-1, receptor de IL-4, etc.), enzimas (por ejemplo, glucocerebrosidasa, iduronato-2-sulfatasa, alfa-galactosidasas-A, agalsidasa alfa y beta, alfa-L-iduronidasa, butirilcolinesterasa, quitinasa, glutamato decarboxilasa, imiglucerasa,

lipasa, uricasa, acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas, endopeptidasa neutra, mieloperoxidasa, etc.), proteínas de unión a interleucina y citocina (por ejemplo, IL-18pb, proteína de unión a TNF, etc.), factor activador de macrófagos, péptido macrófago, factor de linfocitos B, factor de linfocitos T, proteína A, inhibidor de alergia, glicoproteínas de necrosis celular, inmunotoxina, linfotoxina, factor de necrosis tumoral, supresores tumorales, factor 5 de crecimiento metastásico, antitripsina alfa-1, albúmina, alfa-lactoalbúmina, apolipoproteína-E, eritropoyetina, eritropoyetina muy glicosilada, angiopoyetinas; hemoglobina, trombina, péptido activador del receptor de la trombina, trombomodulina, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor IX, factor XIII, factor activador del plasminógeno, péptido de unión a fibrina, uroquinasa, estreptoquinasa, hirudina, proteína C, proteína C reactiva, inhibidor de la renina, inhibidor de la colagenasa, superóxido dismutasa, leptina, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de 10 crecimiento epitelial, factor de crecimiento epidérmico, angiostatina, angiotensina, factor de crecimiento del hueso, proteína estimuladora ósea, calcitonina, insulina, atriopeptina, factor inductor de cartílago, elcatonina, factor activador del tejido conectivo, inhibidor de la ruta del factor tisular, hormona estimuladora del folículo, hormona luteneizante, hormona liberadora de la hormona luteneizante, factores de crecimiento nervioso (por ejemplo, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico ciliar, factor 1 de la axogénesis, péptido natriurético del cerebro, factor 15 neurotrófico derivado glial, netrina, factor inhibidor neurófilo, factor neurotrófico, neuturina, etc.), hormona paratiroidea, relaxina, secretina, somatomedina, factor de crecimiento de tipo insulina, hormona adrenoaórtica, glucagón, colecistoquinina, polipéptido pancreático, péptido liberador de la gastrina, factor de liberación de la corticotropina, hormona estimuladora del tiroides, autotaxina, lactoferrina, miostatina, receptores (por ejemplo, TNFRP75), TNFRP55), receptor de IL-1, receptor de VEGF, receptor del factor activador de linfocitos B, etc.), 20 antagonistas de receptores (por ejemplo, IL1-Ra, etc.), antígenos superficiales celulares (por ejemplo, CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69, etc.), antígenos de vacunas de virus, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, scFv, Fab, Fab’, F(ab’)2 y Fd), y antígenos de vacuna derivados de virus. Un fragmento de anticuerpo puede ser Fab, Fab’, F (ab’) 2, Fd o scFv, que es capaz de unirse a un antígeno específico, y preferiblemente Fab’. Los fragmentos Fab contienen el dominio variable (VL) y el 25 dominio constante (CL) de la cadena ligera y el dominio variable (VH) y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab’ difieren de los fragmentos Fab en términos de añadir algunos restos de aminoácidos que incluyen uno o más restos de cisteína procedentes de la región bisagra al extremo carboxilo del dominio CH1. Los fragmentos Fd comprenden solo el dominio VH y CH1, y los fragmentos F (ab’) 2 se producen como una pareja de fragmentos Fab’ tanto mediante enlace disulfuro como mediante reacción química. Los

30 fragmentos scFv (Fv monocatenarios) comprenden los dominios VL y VH que se unen entre sí mediante un péptido enlazador y de esta manera están presentes en una cadena de un único péptido.

[0107] En particular, se prefieren como moléculas biológicamente activas aquellas que requieren una frecuente dosificación tras la administración en el cuerpo para la terapia o la prevención de enfermedades, que incluyen, la 35 hormona del crecimiento humano, interferones (interferón a, , γ, etc.) factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF, eritropoyetina (EPO), receptor de TNF, p40, y fragmentos de anticuerpos. Además, se incluyen determinados derivados en el alcance de las moléculas biológicamente activas de la presente invención siempre que tengan función, estructura, actividad o estabilidad sustancialmente idéntica a o mejorada en comparación con otras formas naturales de las moléculas biológicamente activas. En la presente invención, el fármaco de polipéptido más

40 preferible es el interferón alfa.

[0108] En otro aspecto de la invención, las proteínas de fusión IgG-Fc e IgG-CH, por ejemplo, se sintetizan como monómeros que pueden ensamblarse para formar dímeros. Normalmente, los dímeros se unen mediante enlaces disulfuro en la región bisagra de la IgG. Los medios acondicionados procedentes de células que secretan las

45 proteínas de fusión de IgG pueden contener mezclas de monómeros y dímeros de la proteína de fusión de IgG. Para su uso como agentes terapéuticos humanos, será deseable utilizar poblaciones homogéneas tanto de monómeros como de dímeros de la proteína de fusión de IgG, pero no de las mezclas de las dos formas.

[0109] Se proporcionan también procedimientos para obtener preparaciones esencialmente puras de proteínas de

50 fusión de IgG-polipéptido dimérico activo. Los procedimientos se llevan a cabo generalmente obteniendo una célula hospedadora capaz de expresar la proteína de fusión de IgG, recogiendo los medios acondicionados, y purificando la proteína de fusión dimérica a partir de la proteína de fusión monomérica, los agregados y las proteínas contaminantes mediante procedimientos de cromatografía en columna. Las células hospedadoras adecuadas para expresar las proteínas de fusión de IgG incluyen células de levaduras, insectos, mamíferos u otras células

55 eucariotas. En una realización, la célula hospedadora puede ser una célula de mamífero, particularmente células COS; CHO o BHK.

[0110] Se proporcionan también proteínas de fusión novedosas de un fármaco de polipéptido y un fragmento de Fc. En una realización, un fármaco de polipéptido tal como el receptor de EPO, p40, G-CSF o TNF se une directamente al fragmento de Fc hibrido sin intervención de un enlazador peptídico. En otra realización, el fármaco de polipéptido se une a cada uno de los otros mediante un péptido enlazador de 1 a 50 aminoácidos, y, de forma más preferible mediante un enlazador peptídico de 1 a 7 aminoácidos. Los enlazadores particularmente útiles para este fin incluyen un péptido inmunológicamente inactivo compuesto por restos de Gly y Ser (por ejemplo, Gly Gly Ser

5 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser SEQ ID NO: 32) o compuesto por aminoácidos en las posiciones 282-314 de la SEQ ID NO: 25, derivada de albúmina humana.

[0111] En el caso en que se utiliza un enlazador, el enlazador y el fármaco de polipéptido pueden prepararse en una determinada dirección. Esto es, el enlazador puede unirse en el extremo N, el extremo C o un grupo libre del 10 fragmento de Fc híbrido, y puede también unirse en el extremo N, el extremo C o un grupo libre del fármaco de polipéptido. Cuando el enlazador es un enlazador peptídico, el enlace puede tener lugar en un sitio de unión determinado. Cuando un fármaco de polipéptido y un Fc híbrido se expresan de forma separada y a continuación se unen entre sí, el acoplamiento se puede llevar a cabo usando cualquiera de los numerosos agentes de acoplamiento conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de los agentes de acoplamiento incluyen 1,1-bis (diazoacetil)-2

15 feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida tales como ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres que incluyen ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3’-ditiobis (propionato de succinimidilo), y maleimidas funcionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano.

[0112] La presente invención proporciona también procedimientos para la producción de un fragmento de Fc20 hibrido-fármaco de polipéptido.

[0113] La presente invención proporciona también procedimientos para tratar dolencias aliviadas mediante la administración de un fármaco de polipéptido. Estos procedimientos incluyen administrar a un mamífero que tiene la dolencia, que puede estar o no directamente relacionada con la enfermedad de interés, una cantidad eficaz de un

25 polipéptido de la invención. Por ejemplo, se puede administrar a un sujeto, preferentemente un mamífero, un ácido nucleico, tal como un ADN o ARN, que codifica una proteína de fusión de un fragmento de Fc híbrido-fármaco de polipéptido deseado, como agente terapéutico. Dicho polipéptido quimérico se puede administrar por vía intravenosa, subcutánea, oral, bucal, sublingual, nasal, parenteral, rectal, vaginal o mediante una ruta pulmonar.

30 [0114] Una proteína de fusión de EPO (incluyendo sus variantes/fragmentos)-fc de la presente invención puede ser útil para aumentar y mantener el hematocrito en un mamífero.

[0115] p40 es una subunidad de IL-12. IL-12 es una citocina heterodimérica de 75 kDa que tiene algunas funciones in vivo. Por ejemplo, IL-12 estimula la proliferación de linfocitos T y células NK activados y promueve las 35 respuestas del linfocito auxiliar de tipo Th I. IL-12 ejerce sus efectos biológicos mediante la unión del receptor de IL12 a la membrana plasmática de los linfocitos T y las células NK activados, y la capacidad de Il-12 de unirse al receptor ID-12 se ha atribuido a la subunidad p40 de IL-12. Por tanto, una proteína de fusión de p40 (incluyendo sus variantes/fragmentos)-fc de la presente invención puede ser útil para reducir los síntomas de/evitar/tratar una enfermedad autoinmune, (0) inhibir el rechazo de un injerto, o (0) tratar/evitar el shock inducido por una endotoxina.

40 También una proteína de fusión de p40 (incluyendo sus variantes/fragmentos)-fc de la presente invención puede ser útil en el tratamiento/prevención/mejora de los síntomas de la artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple o psoriasis. Se conocen en la técnica variantes y fragmentos, incluyendo, pero sin limitarse a, el documento WO 97/20062. Una realización de la variante p40 incluye, pero no se limita a, p40 que contiene la sustitución Asn303Gln.

45 [0116] El factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) es una proteína que es esencial para la proliferación y diferenciación de los granulocitos, particularmente los neutrófilos. Los granulocitos engullen y devoran invasores microbianos y desechos celulares y de esta manera son cruciales para la respuesta a la infección. La quimioterapia destruye los granulocitos y/o disminuye la producción de granulocitos. Por tanto, una proteína de

50 fusión G-CSF (incluyendo sus variantes/fragmentos)-fc de la presente invención puede ser útil en el tratamiento/prevención/mejora de los síntomas de la mielosupresión de la neutropenia inducida por quimioterapia tras el trasplante de médula ósea, leucemia aguda, anemia aplásica, síndrome mielodisplásico, neutropenias crónicas graves, o movilización de las células progenitoras de la sangre periférica para el trasplante.

55 [0117] Las proteínas de fusión de la invención no solo son útiles como agentes terapéuticos, sino como un experto en la técnica reconoce, las proteínas de fusión son útiles en la producción de anticuerpos para uso diagnóstico. Igualmente, la administración adecuada del ADN o ARN, por ejemplo, en un vector u otro sistema de administración para dichos usos, está incluida en los procedimientos de uso de la invención.

[0118] Las composiciones de la presente invención se pueden administrar mediante cualquier ruta que sea compatible con las moléculas concretas. Se contempla que las composiciones de la presente invención se proporcionan a un animal mediante cualquier medio adecuado, en forma directa (por ejemplo, por vía local, como mediante inyección, implante o administración tópica a un locus en un tejido) o por vía sistémica (por ejemplo, por 5 vía parenteral u oral). Cuando la composición es para proporcionar por vía parenteral, tal como por vía intravenosa, subcutánea, oftálmica, intraperitoneal, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intracraneal, intraespinal, intraventricular, intratecal, intracisternal, intracapsular, intranasal o mediante administración en aerosol, la composición incluye preferiblemente parte de una suspensión o disolución fluida acuosa o fisiológicamente compatible. De esta manera, el portador o vehículo es fisiológicamente aceptable de tal manera que, además de

10 administrar la composición deseada al paciente, no afecta de forma adversa de otra forma al electrolito y/o al equilibrio volumétrico del paciente. El medio fluido para el agente puede incluir de esta manera solución salina fisiológica normal.

[0119] Las construcciones de ADN (o construcciones génicas) de la invención se pueden usar también como parte

15 de un protocolo de terapia génica para administrar los ácidos nucleicos que codifican un fármaco de polipéptido o una construcción de una proteína de fusión del mismo.

[0120] La invención se caracteriza por vectores de expresión para la transfección y la expresión in vivo de un fármaco de polipéptido de interés o una construcción de una proteína de fusión del mismo en tipos de células

20 concretos con el fin de reconstruir o suplementar la función del fármaco de polipéptido deseado. Se pueden administrar construcciones de expresión del fármaco de polipéptido deseado, o construcciones de la proteína de fusión del mismo, en cualquier vehículo biológicamente eficaz, por ejemplo, cualquier formulación o composición capaz de administrar eficazmente el gen que codifica el fármaco de polipéptido deseado o la construcción de la proteína de fusión del mismo a las células in vivo.

25 [0121] Las soluciones incluyen la inserción del gen sujeto en vectores víricos que incluyen retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, y el virus 1 del herpes simple recombinantes, o en bacterias recombinantes o plásmidos eucariotas. Las dosificaciones preferidas para la administración de los ácidos nucleicos que codifican las proteínas están comprendidas en el intervalo de 0,1 mg – 100 mg para seres humanos, de forma más preferible 1 mg – 10 mg,

30 y lo más preferible 2 mg 10 mg. Se contempla que la dosificación óptima y el modo de administración se pueden determinar mediante experimentación rutinaria bien comprendida en los conocimientos del experto en la técnica.

[0122] Las dosificaciones preferidas de la proteína de fusión para la administración están comprendidas en el intervalo de 0,1 mg – 1.000 mg para seres humanos, de forma más preferible, 1 mg -100 mg, y lo más preferible 5

35 mg – 20 mg. Se contempla que la dosificación óptima, sin embargo, dependa también de la enfermedad que se está tratando y de la existencia de efectos secundarios. Sin embargo, se pueden determinar las dosificaciones óptimas utilizando experimentación rutinaria. La administración de la proteína puede ser mediante inyecciones en bolo periódicas, o mediante administración intravenosa, subcutánea, o intraperitoneal continua desde un depósito externo (por ejemplo, desde una bolsa intravenosa) o interna (por ejemplo, a partir de un implante bioerosionable).

40 [0123] Además, se contempla que las proteínas de fusión de la invención se pueden administrar también a receptor previsto junto con una pluralidad de diferentes moléculas biológicamente activas. Se contempla, sin embargo, que la combinación óptima de la proteína de fusión y otras moléculas, modos de administración, y dosificaciones se puede determinar mediante experimentación rutinaria bien comprendida dentro del nivel de

45 conocimientos del experto en la técnica.

Modo para realizar la invención

[0124] La invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos no limitantes 50

[0125] <Ejemplo 1> Preparación de vectores de expresión para las proteínas de fusión hFc-1, hFc-2, hFc-3, hFc-4, hFc-5, y hFc-6

[0126] La hFc-1 incluye 9 aminoácidos (90-98) de la región CH1 de la IgG del extremo C, la región bisagra (99

55 113) de IgG1, 6 aminoácidos (111-116) de la región CH2 de la IgG2 del extremo N, 103 aminoácidos (118-220) de la región CH2 de la IgG4, y 107 aminoácidos (221-327) de la región CH3 de la IgG4 (Fig. 1 y 2). Se muestra en la SEQ ID NO: 18 una secuencia de aminoácidos de la hFc-1, Para obtener nucleótidos optimizados por el codón que codifican, cada uno de ellos, la hFc-1 (SEQ ID NO:1), la EPO humana (SEQ ID NO: 7), el G-CSF humano (SEQ ID NO: 8) y la p40N303Q humana (un mutante derivado de la sustitución de Asn con Gln en el 303er aminoácido de la

subunidad p40 humana) (se muestra una secuencia de nucleótidos de p40N303Q como la SEQ ID NO:9, y se muestra una secuencia de aminoácidos de la p40 humana como la SEQ ID NO: 17), respectivamente, estas moléculas de nucleótidos se sintetizaron mediante un servicio personalizados de TOP Gene Technologies (Quebec, Canadá) (www.topgenetech.com). Para aumentar el nivel de expresión de la proteína, resulta de mucha utilidad 5 optimizar la utilización del codón del gen. El modelo de utilización del codón difiere entre organismos. Algunos codones se utilizan con más frecuencia en un organismo, pero se usan raramente en otro organismo. El sesgo en la utilización del codón se ha atribuido a la eficacia de la traducción, la capacidad del organismo para sintetizar la proteína codificada. Para insertar cada gen de fusión en un vector de expresión, pAD11 (SEQ ID NO: 10), se generó un sitio EcoRI en el extremo 5’ de la secuencia ATG de la EPO, G-CSF, y p40N303Q y se generó un sitio Xba en el 10 extremo 3’ del codón de terminación de hFc-1. El vector de expresión pAD 11 se obtuvo de la estructura de RcCMV (disponible de Invitrogen, Carslbad). pAD11 incluye un promotor derivado de citomegalovirus (CMV), secuencias poli

(A) derivadas de la hormona de crecimiento bovino, secuencia de intervención de la globina (gIVS) derivada de la beta globina de conejo (Mol Cell Biol, 1988 8: 4395) y etc. Para preparar el vector pAD11, existen algunas modificaciones a partir del vector RcCMV (Invitrogen). Se eliminó una región resistente a la neomicina mediante 15 tratamiento con la enzima Xho I y se añadió gIVS a 3’ de la región del promotor de CMV. Además, se añadió un gen de la dihidrofolato reductasa de ratón (DHFR, Pubmed, NM 010049) a 5’ del promotor de CMV. El vector pAD11 se desarrolló después de muchas pruebas de expresión en combinación con algunos elementos descritos anteriormente. El resultado no publicado de los autores, el vector pAD11 mostró un aumento de aproximadamente 12 veces en el nivel de expresión, en comparación con el vector RcCMV (Invitrogen). Para preparar un sitio de unión

20 entre el extremo 3’ de EPO, G-CSF y p40N303Q en el extremo 5’ de hFc-1 en el marco, se generó un sitio Nhe I en el extremo 3’ de la secuencia de codificación de EPO, G-CSF y p40N303Q y en el extreme 5’ de la secuencia de codificación de hFc-1. Tras subclonar mediante cada uno de los sitios de las enzimas de restricción, se generaron los vectores de expresión finales de la hFc-1 fusionada con EFO, G-CSF o p40N303Q, que se designaron posteriormente como pAD11 EPO-hFc-1, pAD11 G-CSF-hFc-1 y pAD11 p40N303Q-hFc-1, respectivamente.

25 [0127] Se muestran las secuencias de los aminoácidos de hFc-2, hFc-3, hFc-4, hFc-5 y hFc-6 en las SEQ ID NOs: 19-23, respectivamente. La hFc-6 incluye 9 aminoácidos (90-98) del dominio CH1 de la IgD del extremo C, 64 aminoácidos de la región bisagra (99-162) de IgD, 8 aminoácidos (shtqplgv 163-170) del dominio CH2 de la IgD del extremo N, 100 aminoácidos (121-220) del dominio CH2 de la IgG4, y 107 aminoácidos (221-327) del dominio CH3

30 de la IgG4 (Fig. 1 y 2). Para obtener moléculas de nucleótidos optimizadas por el codón que codifiquen la hfc-6 (SEQ ID NO:6, se sintetizó el gen mediante el servicio personalizado de TOP Gene Technologies (www.topgenetech.com). Para hacer una fusión entre el extremo 3’ de EPO, G-CSF, o p40N303Q y el extremo 5’ de hFc-6 en marco, se usó un sitio Nhe I (gctagc: Ala-Ser) incluido en la región del extremo N (90 y 91 aminoácidos) de hFc-6. También, para insertar cada gen de la fusión hFc-6 en un vector pAD 11, se generó el sitio Xba en el extremo

35 3’ del gen hFc-6. Tras subclonar utilizando cada sitio de las enzimas de restricción, se generaron los vectores de expresión final de la EPO fusionada con hPc-6, G-CSF y p40N303Q, que se designaron a continuación como pAD11 EFO-hFc-6, pAD11 G-CSF-hFc-6 y pAD11 p40N303QhFc-6, respectivamente. Las hFc-2, hFc-3, hFc-4, y hFc-5 tienen regiones CH2 y CH3 idénticas, pero tienen diferentes tamaños de la bisagra de IgD (Figs. 1 y 2). La hFc-2 (SEQ ID NO: 19), hFc-3 (SEQ ID NO: 20), hFc-4 (SEQ ID NO: 21), y hFc-5 (SEQ ID NO: 22) incluye 5 aminoácidos

40 (158-162), 10 aminoácidos (153-162), 20 aminoácidos (143-162), 30 aminoácidos (133-162) de la bisagra de la IgD del extremo C, respectivamente (Fig.1 y 2). Para llevar a cabo la fusión de los genes entre EPO, G-CSF, p40N303Q

o TNFR (receptor II del factor de necrosis tumoral) (SEQ ID NO: 30) y las moléculas de ácido nucleico de las moléculas que codifican estas hFc (SEQ ID NOs: 2-5), se sintetizaron los fragmentos génicos mínimos en el tamaño total de los genes fusionados mediante el servicio personalizado de TOP Gene Technologies 45 (www.topgenetech.com). Los fragmentos sintetizados de cada EPO, G-CSF, p40N303Q o TNFR fusionados con una molécula de nucleótido que codifica la bisagra y la región CH2 del extremo N de cada hFc-2, hFc-3, hFc-4, o hFc-5 incluyen las secuencias incluidas entre las secuencias completas de EPO, G-CSF, p40N303Q o TNFR del sitio idéntico de la enzima, el sitio BstE II (GGTGACC) que está localizado en los restos de aminoácidos 138-140º de la región CH2 en IgG4 (SEQ ID NO: 13). Los vectores de subclonación incluyendo algunos fragmentos génicos se 50 extrajeron con EcoR I y BstE II localizados en el extremo 5’ y el extremo 3’, respectivamente, y a continuación se unieron a la región CH2-CH3 de la hFc-6. Finalmente, cada gen de fusión se subclonó en el pAD11 utilizando los sitios EcoR I y Xba, y a continuación se designaron como pAD11 EPO-hFc-2, pAD11 EPO-hFc-3, pAD11 EPO-hFc4, pAD11 EPO-hfc-5, pAD11 G-CSF-hFc-2, pAD11 G-CSF-hFc-3, pAD11 G-CSF-hFc-4, pAD11 G-CSF-hFc-5, pAD11 p40N303Q-hfc-2, pAD11 p40N303Q-hFc-3, pAD11 p40N303Q-hfc-4, pAD11 p40N303Q-hFc-5 and pAD11

55 TNFR-hFc-5, respectivamente.

[0128] <Ejemplo 2> preparación de los vectores de expresión de thFc-1 y thFc-2 acoplados a IFN-b

[0129] La thFc-1 incluye 23 aminoácidos (MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPS) de la secuencia señal del activador

del plasminógeno del tejido humano (tPA), 15 aminoácidos (99-113) de la región bisagra de IgG1, 6 aminoácidos (111-116) de la región CH2 de la IgG2 del extremo N, 103 aminoácidos (118-220) de la región CH2 de oflgG4, y 107 aminoácidos (221-327) de la región CH3 de IgG4 (Fig. 3). Se muestra una secuencia de aminoácidos de thFc-1 en la SEQ ID NO: 28. La thFc-2 incluye 23 aminoácidos (MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPS) de la secuencia señal de 5 tPA, 15 aminoácidos (148-162) de la región bisagra de la IgD, 8 aminoácidos (163-170) de la región CH2 de la IgD del extremo N, 100 aminoácidos (121-220) de la región CH2 de la IgG4, y 107 aminoácidos (221-327) de la región CH3 de IgG4 (Fig. 3). Se muestra una secuencia de aminoácidos de thFc-2 en la SEQ ID NO: 29. Para obtener los nucleótidos optimizados por el codón que codifican thFc-1 (SEQ ID NO: 26) o thFc-2 (SEQ ID NO: 27) acoplados al extremo N del IFN-beta humano con la secuencia señal eliminada, se sintetizaron estas moléculas de nucleótidos

10 mediante el servicio personalizado de TOP Gene Technologies (Quebec, Canadá) (www.topenetech.com). Para insertar cada gen de fusión en un vector de expresión, pAD11 (SEQ ID NO: 10), se generó un sitio EcoR I en el extremo 5’ de thFc-1 o thFc-2 y se generó un sitio Not I en el extremo 3’ del codón de terminación de IFN-beta. Tras subclonar utilizando cada sitio de las enzimas de restricción, se designaron los vectores de expresión final como pAD11 thFc-1-AL(0)-IFN-beta y pAD11 thFc-2-AL(0)-IFN-beta, respectivamente.

15 [0130] Para acoplar thFc a IFN–beta mediante enlazadores de albúmina de diferentes tamaños o el enlazador Gly-Ser, los fragmentos génicos desde el sitio Pst I de la región CH3 de thFc-1 acoplado a IFN-beta cuya secuencia señal se había eliminado mediante enlazadores de albúmina de diferentes tamaños (3aa, 8aa, 13aa, 18aa, 23aa y 33aa) o el enlazador Gly-Ser, fueron sintetizados por el servicio de atención al cliente de TOP Gene Technologies

20 (www.topgenetech.com) (Fig. 4). Para insertar 7 diferentes fragmentos génicos en los vectores de expresión, pAD11 thFc-1-AL(0)- IFN-beta y pAD11 thFc-2-AL(0)-IFN-beta, se generó un sitio Pst I en el extremo 5 de los mismos y se generó un sitio Not I en el extremo 3 del codón de terminación de IFN-beta. Tras subclonar utilizando cada sitio de las enzimas de restricción, se designaron los vectores de expresión final como pAD11 thFc-1-AL(1)-IFN-beta, pAD11 thFc-1-AL(2)-IFN-beta, pAD11 thFc-1-AL(3)-IFN-beta, pAD11 thFc-1-AL(4)-IFN-beta, pAD11 thFc-1-AL(5)-IFN-beta,

25 pAD11 thFc-1-AL(6)-IFN-beta pAD11, thFc-1-GS-IFN-beta, y pAD11 thFc-2-AL(1)-IFN-beta, pAD11 thFc-2-AL(2)IFN-beta, pAD11 thFc-2-AL(3)-IFN-beta, pAD11 thFc-2-AL(4)-IFN-beta, pAD11 thFc-2-AL(5)-IFN-beta, pAD11 thFc2-AL(6)-IFN-beta pAD11, y thFc-2-GS-IFN-beta, respectivamente.

[0131] <Ejemplo 3> Expresión de las proteínas EPO-HFc humanas, G-CSF-hFc humanas, p40N303Q-hFc 30 humanas, TNFR-hFc-5 y thFc-IFN-beta humanas

[0132] Se usaron células COS-7 para el ensayo de la expresión con medio DMEM (Invitrogen, Carlsbad) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Hyclone, South Logan) y antibióticos (Invitrogen, Carlsbad). Se transfectaron los vectores que codificaban EPO-hFc, G-CSF-hFc, p40N303Q-hFc, TNFR-hFc-5, thFc-IFN-beta en 5

35 X 106 células COS-7 utilizando procedimientos de electroporación convencionales. A las 48 h de la transfección, se cosecharon los sobrenadantes y las células. Para comprobar la expresión de la proteína de fusión de cada vector, se utilizaron todas las muestras para el ensayo ELISA con varios Kits (R&D system, Minneapolis, nº DEP00 para EPO; Biosource, Camarillo, nº KHC2032, para G-CSF; R&D system, Minneapolis, nº DY1240 para p40N303Q de R&D System, Minneapolis, nº DRT200 para TNFR, PBL Biomedical Laboratories, nº 41410-1A para IFN-beta) y el análisis

40 de la transferencia western con anticuerpos dirigidos contra la IgG humana (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz). Como resultado, todos los vectores mostraron un modelo correcto de expresión en los sobrenadantes y los lisados celulares (no se muestran los datos)

[0133] <Ejemplo 4> Purificación de proteínas fusionadas a hFc

45 [0134] Se cultivaron células CHO/DHFR-/- (células de ovario de hámster chino, DG44, ATCC) con a-MEM (Invitrogen, Carlsbad), suero bovino fetal dializado al 10% (JRH Biosciences, Kansas), suplemento de HT (Invitrogen, Carlsbad) y antibióticos (Invitrogen, Carlsbad). Los vectores de expresión se transfectaron en células CHO de acuerdo con los procedimientos de precipitación simultánea de CaPO4 convencionales. A las 48 h de la

50 transfección, las células CHO se desprendieron de las placas y se diluyeron varias veces (1/2, 1/5, 1/20, 1/50, 1/100, 1/200, 1/500). Las células diluidas se plaquearon en placas de 100 mm y se cultivaron con los medios sin el suplemento de HT. Durante el procedimiento de cribado, se suministraron medios recientes sin el suplemento de HT a las células sin pases. Se generaron colonias durante 2-3 semanas después del plaqueo y se movieron las colonias individuales a placas de 48 pocillos. Se cribaron las colonias positivas tras el ensayo ELISA para las detecciones de

55 la EPO, G-CSF, p40N303Q, y TNFR. Cada colonia que mostró la expresión más elevada se cultivó a gran escala (5 l) usando medio exento de suero (JRH Biosciences, Kansas). Los sobrenadantes exentos de suero cosechados se usaron para la purificación de cada proteína de fusión. Para la purificación, columnas FF de proteína A recombinante de HiTrap (Amersham Biosciences, Piscataway) se equilibraron con fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0). Se añadieron los sobrenadantes filtrados a las columnas y se eluyeron con citrato de sodio 0,1 M (pH 3,0). Se obtuvieron finalmente las proteínas eluidas tras diálisis con membrana (MWCO 12 14K, Spectrapor, Rancho Dominguez) más de tres veces. Se determinaron todas las concentraciones de las muestras de proteínas mediante el kit BCA (Pierce Biotechnology, Rockford) para la medida de la proteína total y mediante kits ELISA para la medida de las EFO-hFc, G-CSF-hFc, p40N303Q-hFcs, TNFR-hFc-5 y thFc-IFN-beta.

[0135] <Ejemplo 5> Ensayo de unión a FcgRI y C1q

[0136] Para investigar si las proteínas fusionadas a hFc-5 se unen a FcgRI y C1q, Mabthera (Rituximab, Roche), hIgG1 (Calbiochem, nº de Cat. 400120), Enbrel® (etanercept, Amgen), EPO-hFc-5, G-CSF-hFc-5 y p40N303Q-hFc10 5 se diluyeron en serie (de 2 µg/ml a 16 ng/ml en 2 veces) y se revistieron en una tira de 8 pocillos (COSTAR, Nueva York) durante la noche en 4. Para preparar una curva estándar, se diluyeron en serie también FcgRI (R&D, nº de Cat BAF1257) o Clq (AbD serotech, nº de Cat 2221-5504) (de 2 µg/ml a 32 ng/ml en 2 veces) y se revistieron en una tira de 8 pocillos (COSTAR, Nueva York) durante la noche en 4. Tras lavar cada tira de muestras con tampón de lavado (PBS que contenía Tween al 0,05%) y bloquear con FBS al 10% en PBS durante una hora a TA, se añadieron FcgRI 15 o C1q en cada pocillo a 2 µg/ml tras una incubación de 2 horas a temperatura ambiente (TA). Se lavaron todas las tiras con tampón de lavado. Para el ensayo de unión a C1q, se añadió un anticuerpo dirigido contra C1q conjugado con HRP (AbD serotech, nº de cat. 2221-5004P) en cada pocillo a 2,5 µg/ml después de 30 min de incubación a TA en condiciones de oscuridad. Para el ensayo de unión a FcgRI, se añadió un anticuerpo biotinilado dirigido contra FcgRI (R&D, nº de cat. 1257-FC) en cada pocillo a 2 µg/ml tras 1 hora de incubación a TA. Tras lavado con tampón 20 de lavado, se añadió Estreptavidina-HRP (BD, nº de cat. 554066) diluida 3.000 veces a cada tira tras una incubación de 30 minutos a TA en condiciones de oscuridad. Tras el lavado de las tiras, se añadió solución de TMB (mezcla 1:1 de sustrato de peroxidasa TMB y solución B de sustrato de peroxidasa, KPL, nº de Cat. 50-76-01, nº de Cat, 50-6500) para el revelado y se añadió H2SO4 2 N para detener el revelado. Tal como se muestra en la Fig. 6(a) y en la Fig. 6(b), MabThera® Enbrel® e hIgG1 mostraron una buena unión a FcgRI y Clq, pero EPO-hFc-5, G-CSF-hFc-5 y

25 p40N303Q-hFc-5 no.

[0137] <Ejemplo 6> Bioactividad in vitro de proteínas fusionadas a hFc purificadas

[0138] Para investigar las bioactividades in vitro de las proteínas EPO-hFc, se cultivó la línea de células F35E

30 humana en medio RPMI1640 (Cambrex, Charles City) suplementada con FBS al 10%, antibióticos y 5 UI/ml de EPO humana recombinante (DongA, República de Corea). Se configuraron los bioensayos sembrando 2 X 104 células en los pocillos de ensayo de una placa de cultivo de 96 pocillos (Corning, Países Bajos). Se añadieron las muestras con diluciones en serie (0, 0,064 mUI/ml a 25 UI/ml en 5 veces) de EPO, EPO-hFc-1, EPO-hFc-5, EPO-hFc-6, EPO-IgG1 Fc o Aranesp (darbepoetina alfa, Amgen), a estos pocillos y se incubaron las placas a 37º C durante 72 horas en

35 una incubadora humidificada con CO2 al 5%. De acuerdo con el protocolo del fabricante, se llevó a cabo el ensayo MTT utilizando un kit de ensayo colorimétrico de crecimiento celular (Sigma-Aldrich, Corea). La línea de células F35E humana mostró una fuerte respuesta proliferativa a rEPO, tal como se evidenció de una manera dependiente de la dosis en numerosas células y valores de absorbancia. Tal como se muestra en la Fig. 7(a) Aranesp® y las proteínas EPO acopladas a IgG1 Fc o las hFc mostraron pérdida de actividad biológica en comparación con la

40 proteína EPO. Sin embargo, EPO-hFc-1, EPO-hFc-5 y EPO-hFc-6 mostraron una bioactividad significativamente mayor que EPO-IgG1 Fc. Además, EPO-hFc-5 y EPO-hFc-6 mostraron una bioactividad ligeramente mayor que Aranesp® indicando que estas proteínas fusionadas a hFc parecen ser mejores que Aranesp® en términos de mantener la bioactividad de la proteína EPO.

45 [0139] Para investigar las bioactividades in vitro de la proteína G-CSF-hFc, se cultivó una línea de células hematopoyéticas de ratón, NF-60 en medio RPMI1640 (Cambrex, Charles City) suplementado con FBS al 10%, antibióticos, y 100 unidades/ml de IL-3 recombinante de ratón (R&D system, Minneapolis). Se configuraron los bioensayos sembrando 2 X 104 células en los pocillos de una placa de cultivo de 96 pocillos (Corning, Países Bajos).: Las muestras con diluciones en serie (que variaban desde 0 a 10.000 pg/ml en 3 veces) de G-CSF-hFc-5 y

50 Neulasta (pegfilgrastim, Amgen) se añadieron a estas células y se incubaron las placas a 37º C durante 72 horas en una incubadora humidificada con CO2 al 5%. Se evaluaron las muestras de proteína en pocillos por triplicado y este experimento se llevó a cabo repetidamente durante cinco veces. A las 72 horas de la incubación, se llevó a cabo el ensayo MTT utilizando un kit de ensayo colorimétrico de crecimiento celular (Sigma-Aldrich, Corea), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Tal como se ilustra en la Fig. 7(b), GCSF-hFc-5 mostró una bioactividad ligeramente

55 superior en la in vitro que Neulasta®.

[0140] Para investigar la bioactividad in vitro de la proteína p40N303Q-hFc, se incubaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con artritis reumatoide con 2 µg/ml de anticuerpo dirigido contra CD3 humana (R&D system, nº MAB 100) con o sin 10 ng/ml de p40 humana (R&D system) o p40N303Q-hFc-5 en medio RPMI1640 (Cambrex, Charles City) suplementado con FBS al 10%, y antibióticos. Después del día 6, se midieron las células positivas para CD4 e IL-17 mediante el análisis FACS. Tal como se muestra en la Fig. 7(c), p40N303Q-hFc-5 mostró un efecto supresor más fuerte sobre la generación de células CD4+ /IL-17+ que la proteína p40, indicando la función inhibidora de p40N303Q-hFc-5 sobre la polarización de Th17.

5 [0141] Para investigar la bioactividad in vitro de la proteína TNFR-hFc, se cultivaron células L929 de murino en medio RPMI1640 (Cambrex, Charles City) suplementado con FBS al 10% y antibióticos. Se configuró el ensayo de inhibición citopática sembrando 3 X 104 células en los pocillos de una placa de cultivo de 96 pocillo (Corning, Países Bajos), a continuación se trataron con 1 ng/ml de TNF-a. Las muestras con las diluciones en serie (que variaban

10 desde 15,6 a 1.000 ng/ml en 2 veces) de TNFR-hFc-5 y Enbrel® (etanercept, Amgen) se añadieron a estos pocillos y se incubaron las placas a 37º C durante 48 horas en una incubadora humidificada con CO2 al 5%. Tras la incubación, se llevó a cabo el ensayo MTT utilizando un kit de ensayo colorimétrico de crecimiento celular (Sigma-Aldrich., Corea), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Tal como se ilustra en la Fig. 7(d), TNFR-hFc-5 mostró una bioactividad in vitro ligeramente mayor que Enbrel®.

15 [0142] Para investigar las bioactividades in vitro de las proteínas thFc-I-AL(0)-IFN-beta y thFc-1-AL(3)-IFN-beta, se cultivaron células WISH (ATCC, CCL-25) en DMEM F12 (Cambrex, Charles City) suplementado con FBS al 10% y antibióticos. Se configuró el ensayo de inhibición citopática sembrando 3 X 104 células en los pocillos de una placa de cultivo de 96 pocillos (Corning, Países Bajos), a continuación se trataron con 1.500 UFP/pocillo de VSV (ATCC,

20 VR-158). Las muestras con diluciones en serie de las proteínas (de 40 UI/ml en 2 veces) de IFN-beta recombinante (Norma WHO, NIBSC 00/572), thFc-1-AL(0)-IFN-beta y thFc-1-AL(3)-IFN-beta se añadieron a estos pocillos y se incubaron las placas a 37º C durante 48 horas en una incubadora humidificada con CO2 al 5%. Tras la incubación, se llevó a cabo el ensayo MTT utilizando un kit de ensayo colorimétrico de crecimiento celular (Sigma-Aldrich, Corea), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Tal como se ilustra en la Fig. 7(e), thFc-1-AL(3)-IFN-beta mostró

25 una bioactividad in vitro aproximadamente 20 veces mayor que thFc-1-AL(0)-IFN-beta, indicando el importante papel del enlazador de la albúmina en el mantenimiento de la bioactividad del IFN-beta fusionado a Fc.

[0143] <Ejemplo 7> Vida media in vivo de las proteínas fusionadas a hFc purificadas

30 [0144] Para comparar la vida medida de EPO-hFc-1, EPO-hFc-5 y Aranesp, se trataron cinco macacos con estas proteínas en una dosis de 2.400 UI/kg mediante una única inyección subcutánea (SC) o una única inyección intravenosa (IV). Se obtuvieron muestras de sangre de cada mono antes de la inyección y a 1, 3, 6, 12, 24, 30, 48, 54, 72, 78, 96, 120, 168, 336, 504, y 672 h después de la inyección. Las muestras de sangre se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min hasta coagularse. Después de una centrifugación a 3000 rpm durante 10 min,

35 se obtuvieron sueros de cada muestra y se almacenaron en un congelador. Todas las muestras obtenidas en cada punto se ensayaron para la cuantificación de EPO mediante el kit EPO ELISA (R&D, nº de cat. DEP00). Tal como se muestra en la Fig. 8(a), todos los monos individuales inyectados con EPO-hFc-1 o EFO-hFc-5 mediante las rutas SC

o IV mostraron una vida media más larga que los monos individuales inyectados con Aranesp® mediante las rutas SC o IV.

40 [0145] Para investigar la farmacocinética de G-CSF-hFc-1, se administraron 100 µg/kg de LEUCOSTIM® filgrastim, DongA, República de Corea) y G-CSF-hFc-1 mediante las rutas SC o IV a dos ratas Sprague Dawley macho (Charles River Laboratories, Wilmington) por grupo. Se extrajo sangre antes de la inyección y a 1, 2, 3, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120 y 192 h después de la inyección. Se obtuvieron los sueros por centrifugación a 3.000 rpm

45 durante 10 min tras incubación a temperatura ambiente durante 30 min y se almacenaron en un congelador. Se cuantificaron las muestras con varias veces de dilución tales como 1/2, 1/5, 1/50, 1/250, 1/500 utilizando el kit G-CSF (Biosource, Camarillo, nº KHC2032). Tal como se muestra en la Fig 8(b) G-CSF-hFc-1 inyectada mediante las rutas SC o IV mostró una vida media más larga que LEUCOSTIM® G-CSF-hFc-1 y G-CSF tuvieron 8,76 h y 2,36 h de t1/2 in vivo tras la administración de SC y 10,42 h y 1,78 h tras la administración IV, respectivamente. Por tanto, G-CSF

50 hFc-1 y G-mostró un aumento de 3,7 veces tras las inyecciones SC y de 5,9 veces tras la inyección IV, en comparación con LEUCOSTIM®.

[0146] Para investigar la farmacocinética de p40N303Q-hFc-5 y Enbrel®, se trataron tres macacos por grupo con una única inyección SC en una dosis de 100 µg/kg. Se obtuvieron las muestras de sangre de cada mono antes de la

55 inyección y a 8, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 336, 504, y 672 h después de la inyección. Se incubaron las muestras de sangre a temperatura ambiente durante 30 min hasta que se coagularon. Después de una centrifugación a 3000 rpm durante 10 min, se obtuvieron sueros de cada muestra y se almacenaron en un congelador. Todas las muestras obtenidas en cada punto se ensayaron para la cuantificación de la p40 humana y TNFR II humano mediante los kits ELISA (R&D system, Minneapolis, nº DY1240 y nº DRT200, respectivamente). Tal como se muestra en la Fig. 8(c), p40N303Q-hFc-5 mostraron una vida media más larga que vida media promedio de Enbrel® de 199 h frente a 127 h), aunque p40N303Q-hFc-5 un valor Cmáx menor que Enbrel® (promedio de 3 ng/ml frente a 7 ng/ml).

[0147] Para investigar la farmacocinética de TNFR-hFc-5 y Enbrel, se trataron tres ratas Sprague Dawley macho

5 (Charles River Laboratories, Wilmington) por grupo con una inyección SC en una dosis de 500 µg/kg. Se obtuvieron muestras de sangre de cada rata antes de la inyección y a 2, 4, 8, 12, 24, 30, 48, 72 y 120 h después de la inyección. Se incubaron las muestras de sangre a temperatura ambiente durante 30 min hasta que se coagularon. Después de la centrifugación a 3.000 rpm durante 10 min, se obtuvieron sueros de cada muestra y se almacenaron en un congelador. Se ensayaron todas las muestras obtenidas en cada punto para la cuantificación de TNFR II

10 humano mediante kits ELISA (R&D system, Minneapolis, nº DRT200). Tal como se muestra en la Fig. 8(d), TNFRhFc-5 mostró un nivel del ABC ligeramente mayor que Enbrel® (promedio de 198,1 frente a 172,9 µg*h/ml), aunque TNFR-hFc-5 mostró una vida media similar a Enbrel® (promedio 28,6 h frente a 29,4 h).

[0148] <Ejemplo 8> Bioactividad in vivo de las proteínas fusionadas a hFc purificadas

15 [0149] Para comparar la bioactividad in vivo de EPO-hFc-5 y Aranesp®, se trataron tres macacos por grupo con una inyección SC o una única inyección IV en una dosis de 2.400 UI/kg. Se obtuvieron muestras de sangre de cada mono antes de la inyección y a 1, 3, 6, 12, 24, 30, 48, 54, 72, 78, 96, 120, 168, 336, 504, y 672 h después de la inyección. Se midió el número de las diversas células de la sangre, incluyendo los reticulocitos para evaluar la

20 bioactividad in vivo de EPO-hFc-5 y Aranesp®. Tal como se muestra en la Fig 9(a), EPO-hFc-5 mostró una potencia in vitro ligeramente mayor que Aranesp® en las rutas SC e IV en términos de aumento de los reticulocitos en monos.

[0150] Para investigar la bioactividad in vivo de G-CSF-hFc-1, se administraron LEUCOSTIM®filgrastim, (DongA, República de Corea) como control y G-CSF-hFc-1 en una dosis de 100 µg/kg mediante las rutas SC o IV a dos ratas 25 Sprague Dawley macho (Charles River Laboratories, Wilmington) por grupo. Se obtuvo sangre utilizando un tubo de EDTA antes de la inyección y a 1, 2, 3, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120 y 192 h después de la inyección. Se trató cada muestra de sangre con tampón de lisis RBC (BD Bioscience, Corea) durante 4 minutos y se llevó a cabo un recuento de los leucocitos totales (glóbulos blancos de la sangre) diluidos en tampón FACS por triplicado utilizando un hematocitómetro. Se midió el número de granulocitos FACSCalibur mediante la determinación del tamaño celular por

30 FSC (dispersión hacia delante) y de los gránulos mediante SSC (dispersión lateral). Tal como se ilustra en la Fig. 9(b), LEUCOSTIM® tratado mediante las rutas SC e IV indujo el número máximo de leucocitos y granulocitos a las 24 horas de la inyección, mientras que G-CFS-hFc-1 indujo el número máximo de leucocitos y granulocitos a las 72 horas de la inyección SC y a las 48 horas de la inyección IV. Desde las 24 h a las 120 h después de la inyección, GCSF-hFc-1 tuvo una bioactividad in vivo más sostenida, en comparación con LEUCOSTIM®.

Aplicabilidad industrial

[0151] Se dan a conocer proteínas de fusión que comprenden una molécula biológicamente activa y un dominio Fc de la inmunoglobulina (Ig) que están unidos a la molécula biológicamente activa. El dominio Fc es un dominio Fc

40 humano híbrido de (i) IgG1, IgG2 o IgG4 o (ii) IgG4 e IgD. El Fc híbrido es útil como un vehículo de moléculas biológicamente activas.

<110> Genexine Co., Ltd.

POSTECH Academy-Industry Foundation 45

<120> PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE INMUNOGLOBLULINA

<150> US60/940,753

<151> 50

<160> 32

<170> KopatentIn 1.71

55 <210> 1

<211> 720

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> fragmento 1 de Fc híbrido (hFc-1)

<400> 1

<210> 2

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: fragmento 2 de Fc híbrido (hFC-2) 15

<400> 2

<210> 3

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: fragmento 3 de Fc híbrido (hFC-3) 10

<400> 3

<210> 4

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: fragmento 4 de Fc híbrido (hFC-4) 10

<400> 4

<210> 5

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: fragmento 5 de Fc híbrido (hFC-5) 10

<400> 5

<210> 6

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: fragmento 6 de Fc híbrido (hFc-6) 10

<400> 6

<210> 7

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: gen de EPO humana sintetizado de acuerdo con la optimización por codón 10

<400> 7

<210> 8

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: gen de G-CSF humano sintetizado de acuerdo con la optimización por codón 10

<400> 8

15 <210> 9

<211> 984

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

20 <220>

<223> gen p40 humano sintetizado de acuerdo con la optimización por codón

<400> 9

<210> 10

<211> 5698

<212> ADN 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> pAD11

15 <400> 10

<210> 11

<213> Homo sapiens <220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(330)

<223> región constante de la IgG1 humana parcial (Nº de acceso al GenBank CAA75032)

<400> 11

<210> 12

<211> 326 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: PÉPTIDO 10 <222> (1)..(326)

<223> región constante de la IgG2 humana (nº de acceso al GenBank CAC20455)

<400> 12

<210> 13

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: PÉPTIDO 10 <222> (1)..(327)

<223> región constante de la IgG4 humana parcial (Nº de acceso al GenBank AAH25985)

<400> 13

<210> 14

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: PÉPTIDO 10 <222> (1)..(383)

<223> región constante de la IgD humana (Nº de acceso al GenBank P01880)

<400> 14

<210> 15

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: PÉPTIDO 10 <222> (1)..(193)

<223> precursor de la EPO humana (nº de acceso al GenBank NP_000790)

<400> 15

<210> 16

<211> 207

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: PÉPTIDO 5 <222> (1)..(207)

<223> G-CSF humano (Nº de acceso al GenBank CAA27291)

<400> 16

<210> 17

<211> 328

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(328)

<223> subunidad p40 de la IL12 (nº de acceso al GenBank AAG32620)

<400> 17

<210> 18

<211> 240 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia de aminoácidos de hFc-1 10

<400> 18 <210> 19

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia de aminoácidos de hFc-2

<400> 19 <210> 20

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia de aminoácidos de hFc-3

<400> 20 <210> 21

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia de aminoácidos de hFc-4

<400> 21 5 <210> 22

<211> 245

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

10 <220>

<223> secuencia de aminoácidos de hFc-5

<400> 22

<210> 23

<211> 288

<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial <220>

<223> secuencia de aminoácidos de hFc-6

<400> 23

<210> 24

<213> Homo sapiens

<220>

<221> PÉPTIDO 10 <222> (1)..(377)

<223> región constante de la IgG3 humana (Nº de acceso al GenBank CAC20456)

<400> 24

<210> 25

<211> 609 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> PÉPTIDO 10 <222> (1)..(609)

<223> albúmina humana (Nº de acceso al GenBank CAA00606)

<400> 25

<210> 26

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> fragmento 1 de Fc híbrido 1 (thFc-1) 10

<400> 26

15 <210> 27

<211> 759

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

20 <220>

<223> fragmento 2 de Fc híbrido (thFc-2)

<400> 27

<210> 28

<211> 254

<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia de aminoácidos de thFc-1

15 <400> 28 5 <210> 29

<211> 253

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

10 <220>

<223> secuencia de aminoácidos de thFc-2

<400> 29

<210> 30 10 <211> 771

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 5 <223> gen del receptor 2 del TNF soluble humano sintetizado de acuerdo con la optimización por codón

<400> 30

<210> 31

<211> 257

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial 15

<220>

<223> receptor 2 del TNF soluble humano codificado por el gen sintetizado de acuerdo con la optimización por codón

20 <400> 31 <210> 32

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> enlazador de Gly-Ser 5 <400> 32

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido representado por la siguiente fórmula

N’-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C’

en la que:

N’ es el extremo N y C’ es el extremo C del polipéptido.

Z1 es una secuencia de aminoácidos que consta de 5 a 9 restos de aminoácidos consecutivos procedentes del lado del extremo C de los restos de aminoácidos en las posiciones 90 a 98 de la SEQ ID NO: 14;

Y es una secuencia de aminoácidos que consta de 5 o más restos de aminoácidos consecutivos procedentes del lado del extremo C de los restos de aminoácidos en las posiciones 99 a 162 de la SEQ ID NO: 14;

Z2 es una secuencia de aminoácidos que consta de los restos de aminoácidos en las posiciones 163 a 170 de la SEQ ID NO: 14;

Z3 es una secuencia de aminoácidos que consta de los restos de aminoácidos en las posiciones 121 a 220 de la SEQ ID NO: 13;

Z4 es una secuencia de aminoácidos que consta de los restos de aminoácidos en las posiciones 221 a 327 de la SEQ ID NO: 13; y

p es un número entero de 0 o 1.
2.

El polipéptido de la reivindicación 1, en el que p es 0.
3.

El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 28 o 29.
4.

Un polipéptido quimérico que es una fusión que comprende un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un polipéptido, proteína o péptido fusionado en el extremo N o el extremo C del polipéptido.
5.

El polipéptido quimérico de la reivindicación 4, en el que la fusión del polipéptido, proteína o péptido tiene una vida media en circulación aumentada en comparación con la vida media en circulación de la forma natural.
6.

El polipéptido quimérico de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que el polipéptido, proteína o péptido es una hormona, citocina, factor de crecimiento, molécula coestimuladora, receptor de hormona, receptor de citocina, receptor de factor de crecimiento, o péptido corto.
7.

El polipéptido quimérico de una cualquiera de la reivindicación 4 a 6, en el que el polipéptido, proteína

o péptido es EPO, G-CSF, GM-CSF, insulina, hormona del crecimiento humano, GLP-1, p40, receptor de TNF , IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, proteína 1 morfogenética ósea, betacelulina, interferón alfa, IL-10, FSH, Factor VII, CTLA4, IFN-beta, PD-1, IL-10R, CXCL-11, receptor de TGF-beta , TGF-beta, IL-17, IL- 17R, BTC, OPG o RANK,

o una de sus variantes.
8.

El polipéptido quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que el polipéptido, proteína o péptido es una variante de p40 que contiene la sustitución Asn303Gln.
9.

El polipéptido quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que el polipéptido, proteína o péptido es una proteína secretada, una forma madura de una proteína secretada, o una región Fab de un anticuerpo.
10.

El polipéptido quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que el polipéptido, proteína o péptido se acoplan entre sí mediante un enlazador.
11.

El polipéptido quimérico de la reivindicación 10, en el que el enlazador es un enlazador de albúmina o

un enlazador sintético.
12.

El polipéptido quimérico de la reivindicación 11, en el que:

5 (a) dicho enlazador de albúmina comprende las secuencias 321 a 323, 318 a 325, 316 a 328, 313 a 330, 311 a 333, o 306 a 338 de la SEQ ID NO: 25; o

(b) dicho enlazador sintético es un péptido de 10 a 20 restos de aminoácidos, en el que el péptido está compuesto

por restos de Gly y Ser. 10
13. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
14. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 15 13.
15. Un procedimiento para producir el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el procedimiento comprende las etapas de. (i) introducir una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13 en una célula hospedadora de mamífero, (ii) hacer crecer la célula en condiciones en las que se

20 pueda expresar el polipéptido en su medio de crecimiento, y (iii) cosechar el polipéptido expresado.
16. Un polipéptido quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 para uso en un procedimiento de tratamiento médico.