CN104427995A - 嵌合凝血因子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含可激活凝血因子和增强子部分的嵌合凝血因子。所述可激活凝血因子使所述嵌合凝血因子在凝固部位被激活。所述增强子部分可另外提高所述嵌合凝血因子的促凝活性。通过与提高所述嵌合凝血因子的药代动力学性质的半衰期延长剂融合，可进一步改善所述嵌合凝血因子。本发明还包括制备和使用这些嵌合凝血因子的方法。

Description

嵌合凝血因子
发明背景
通过因损伤而暴露于血管壁的组织因子与因子VIIa之间形成复合物介导外源凝血途径的引发。然后这种复合物将因子IX和X转化为其活性形式(因子IXa和Xa)。因子Xa在携带组织因子的细胞上将有限量的凝血酶原转化为凝血酶。然后这种所得凝血酶能够扩散远离携带组织因子的细胞并活化血小板及因子V和VIII，产生因子Va和VIIIa。凝固散播期间，通过活化血小板表面的因子IXa(与因子VIIIa复合)生成因子Xa。与辅因子Va复合的因子Xa将凝血酶原活化为凝血酶，引起凝血酶大量形成。级联在凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白时达到顶点，这导致纤维蛋白凝块形成。因子VII和组织因子是引发凝血的关键作用因子。
因子VII是在血液中作为非催化活性型单链酶原循环的血浆糖蛋白。虽然单链因子VII可由多种体外因子转化为双链因子VIIa，但是因子Xa是因子VII的重要生理活化剂。酶原因子VII向活化双链分子的转化通过裂解连接氨基酸位置152处的精氨酸残基和氨基酸位置153处的Ile残基的肽键发生。在组织因子、磷脂和钙离子的存在下，双链因子VIIa激活因子X或因子IX。因子VIIa被认为是通过在携带TF的细胞表面作用并且产生初始量的凝血酶的凝血级联生理引发剂，然后初始量的凝血酶扩散到血小板以将其激活并为凝血酶生成的散播期做准备。在治疗上，重组FVIIa通过激活活化血小板表面的因子X起作用，凝固散播期间引起凝血酶大量生成不需要FIXa或FVIIIa。因为FVIIa对血小板的亲和力相对较低，所以在超生理水平服用重组FVIIa。认为这个过程不依赖于组织因子。
因子X也呈包含由Arg-Lys-Arg三肽连接的轻链和重链的单链多肽合成。然后通过裂解两个(或更多个)内部肽键将单链分子转化为轻链和重链。在血浆中，这些双链由二硫键连接在一起，形成因子X。活化因子X，因子Xa，参与最后共同途径，由此凝血酶原转化为凝血酶，凝血酶依次将纤维蛋白原转化为纤维蛋白。
已经向患者施用凝血因子一段时间以提高止血。重组DNA技术的出现已经显著提高了对有凝血障碍的患者的治疗，允许研发安全相容的蛋白质治疗剂。例如，重组活化因子VII已经广泛用于治疗大出血，例如在有血友病A或B、凝固因子XI或VII缺乏、血小板功能缺陷、血小板减少症或血管性血友病(vonWillebrand's disease)的患者中出现的大出血。
虽然这种重组分子有效，但是需要将治疗剂定位到凝固部位，药代动力学性质提高、清除率降低、工艺性提高、促凝性降低或活性增强或具有一种以上这些特征的改进形式。
发明概述
本发明提供了一种嵌合蛋白，包含(i)可激活凝血因子(Ac)，(ii)增强子部分(Em)，和(iii)所述可激活凝血因子和增强子部分之间的任选接头部分(L或L1)。所述可激活凝血因子和所述增强子部分相互连接或缔合，但是未化学交联。所述嵌合蛋白可用式Ac-L-Em或Em-L-Ac表示，其中Ac包含所述可激活凝血因子；L包含所述任选接头部分；并且Em包含所述增强子部分。
在一个实施方案中，所述可激活凝血因子包含含重链(HC)和轻链(LC)及***所述HC和LC之间的蛋白酶裂解位点的凝血因子酶原。所述凝血因子酶原可为FVII蛋白(例如，FVII、其功能片段、衍生物或变体)或FX蛋白(FX、其功能片段、衍生物或变体)。本发明的实施方案包括进一步包含***所述蛋白酶裂解位点和所述HC之间的自切除部分(例如，PABC)的嵌合蛋白。***HC和LC之间的所述蛋白酶裂解位点可由选自凝血酶(因子IIa)、因子XIa、因子XIIa、激肽释放酶、因子VIIa、因子IXa、因子Xa或其任何组合的蛋白酶裂解，其中所述蛋白酶裂解位点并非自然存在于所述凝血因子酶原中。
在另一实施方案中，增强子部分包含凝血辅因子、促凝血肽或抗原结合部分。凝血辅因子的实例包括但不限于组织因子、其片段(例如，可溶性组织因子)、变体或衍生物或FVa、其片段、变体或衍生物。抗原结合部分的非限制性实例包括能够与所述FVII蛋白或FX蛋白结合并分别增强FVII或FX的活性的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，嵌合蛋白进一步包含与可激活凝血因子、接头部分或增强子部分连接的异源部分(Het)(例如，半衰期延长剂)。半衰期延长剂的非限制性实例包括免疫球蛋白恒定区或其一部分(例如，Fc部分或FcRn结合伴侣)、白蛋白、转铁蛋白、白蛋白结合部分、PAS序列、XTEN序列、HES序列、人绒毛膜***C端肽(CTP)的β亚基、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合小分子或其任何组合。免疫球蛋白恒定区或其一部分可包含Fc部分或FcRn结合伴侣。
在其它实施方案中，嵌合蛋白包含第一异源部分(Het1)和第二异源部分(Het2)。Het1和Het2的任一个或二者可包含半衰期延长剂，例如免疫球蛋白恒定区或其一部分(例如，Fc部分或FcRn结合伴侣)、白蛋白、转铁蛋白、白蛋白结合部分、PAS序列、XTEN序列、HES序列、人绒毛膜***C端肽(CTP)的β亚基、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合小分子或其任何组合。任选地，在某些实施方案中，第一异源部分经由第一任选接头(L1)与可激活凝血因子连接，并且第二异源部分经由第二接头(L2)与增强子部分连接。嵌合蛋白可只包含一个接头(L1或L2)或两个接头。
还有其它实施方案中，嵌合蛋白包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含所述可激活凝血因子(Ac)并且所述第二多肽链包含所述增强子部分(Em)，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链相互缔合。例如，第一多肽链包含所述可激活凝血因子(Ac)、所述第一异源部分(Het1)和所述第一任选接头部分(L1)，并且所述第二多肽包含所述增强子部分(Em)、所述第二异源部分(Het2)和所述第二任选接头部分(L2)，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链相互缔合。
还有其它实施方案中，嵌合蛋白具有选自以下的结构：
(a)Ac经由所述接头部分与Het1连接，并且Em与Het2连接；
(b)Ac经由所述第一接头部分与Het1连接，并且Em经由所述第二接头部分与Het2连接；
(c)Ac与Het1连接，并且Em经由所述接头部分与Het2连接；
(d)Ac与Het1连接，并且Em与Het2连接；
(e)Em经由所述接头部分与Het1连接；并且Ac与Het2连接；
(f)Em经由所述第一接头部分与Het1连接，并且Ac经由所述第二接头部分与Het2连接；
(g)Em与Het1连接，并且Ac经由所述接头部分与Het2连接；或，
(h)Em与Het1连接，并且Ac与Het2连接。
还有其它实施方案中，包含两条多肽链的嵌合蛋白可包含：
(a)所述第一多肽包含式Ac-L1-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Em-Het2表示的结构；
(b)所述第一多肽包含式Ac-L1-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Em-L2-Het2表示的结构；
(c)所述第一多肽包含式Ac-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Em-Het2表示的结构；
(d)所述第一多肽包含式Ac-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Em-L1-Het2表示的结构；
(e)所述第一多肽包含式Em-L2-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Ac-L1-Het2表示的结构；
(f)所述第一多肽包含式Em-L1-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Ac-Het2表示的结构；
(g)所述第一多肽包含式Em-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Ac-Het2表示的结构；和，
(h)所述第一多肽包含式Em-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Ac-L1-Het2表示的结构；
其中所述两条多肽链的Het1和Het2形成二硫键。
在一些实施方案中，嵌合蛋白为单条多肽链。例如，嵌合蛋白可进一步包含连接增强子部分和与可激活凝血因子连接的第一异源部分或可激活凝血因子和与增强子部分连接的第二异源部分的scFc接头(X)。单链嵌合蛋白的实例可包含选自以下的式：
(1)  Ac-Het1-X-Em-Het2；
（2)  Ac-Het1-X-Em-L2-Het2；
(3)  Ac-L1-Het1-X-Em-Het2；
(4)  Ac-L1-Het1-X-Em-L2-Het2；
(5)  Het2-Em-X-Het1-Ac；
(6)  Het2-L2-Em-X-Het1-Ac；
(7)  Het2-Em-X-Het1-L1-Ac；或
(8)  Het2-L2-Em-X-Het1-L1-Ac，
其中(a)Ac为所述可激活凝血因子，(b)L1为所述第一任选接头部分；(c)Het1为所述第一异源部分；(d)X为所述scFc接头；(e)Em为所述增强子部分；(f)L2为所述任选第二接头部分；(g)Het2为所述第二异源部分；并且(h)(-)为肽键或一个或多个氨基酸。在一个实施方案中，scFc接头为可加工接头(cscFc)，其包含至少一个胞内加工位点。可加工接头可由选自酵母Kex2、PCSK1、PCSK2、PCSK3、PCSK4、PCSK5、PCSK6或PCSK7或其任何组合的一种或多种胞内加工酶加工成两条或更多条肽链。在一个实施方案中，胞内加工位点由PCSK5加工。
在一些实施方案中，嵌合蛋白经多聚唾液酸化、聚乙二醇化、糖基化、羟乙基化、γ-羧基化或其任何组合。
还包括编码所述嵌合蛋白或其补体的核酸分子，包含第一核苷酸序列(NA1)和第二核苷酸序列(NA2)的一组核酸分子，其中NA1编码所述双链嵌合蛋白或其补体的第一多肽，并且NA2编码所述双链嵌合蛋白或其补体的第二多肽，载体包含所述核酸分子或核酸分子组，或宿主细胞包含所述载体或载体组。
本发明还涉及包含所述嵌合蛋白、所述核酸分子、所述载体和所述宿主细胞的药物组合物并且涉及在有需要的受试者中治疗、改善或预防出血性疾病或病症的方法，包括向所述受试者施用有效量的嵌合蛋白、核酸分子或核酸分子组、载体或载体组、宿主细胞或药物组合物。可用所述组合物治疗或预防的出血性疾病或病症选自关节积血、肌肉流血、口腔流血、出血、肌肉出血、口腔出血、创伤、创伤性头癣、胃肠道出血、颅内出血、腹腔内出血、胸内出血、骨折、中枢神经***出血、咽后隙出血、腹膜后间隙出血和髂腰肌鞘出血。本发明的组合物也可用于在哺乳动物受试者中治疗、改善或预防凝固因子缺乏，包括向所述受试者施用有效量的嵌合蛋白、核酸分子或核酸分子组、载体或载体组、宿主细胞或药物组合物，其中所述凝固因子选自FVII、FVIIa、FVIII、FIX或FXI。
在一个特定实施方案中，所述嵌合蛋白或组合物用于在旁路疗法中治疗、改善或预防出血性疾病或病症。在所述旁路疗法中，所述受试者已经发展或可能易于发展对因子VIII的抑制剂。
本发明还包括生成嵌合蛋白的方法，包括表达编码包含scFc接头的所述单链嵌合蛋白的核苷酸序列，其中所述scFc接头由胞内加工酶在胞内裂解。由于胞内加工位点的加工，由核苷酸序列生成的嵌合蛋白将包含两条多肽链。
附图简述
图1说明了包含凝血酶可激活或FXIa-可激活凝血因子和增强子部分(有时称为“活性增强部分”)的示例性嵌合蛋白(例如，嵌合凝血因子)的示意图。图1A示出了具有FX的任选激活肽的FVII或FX轻链，与凝固级联蛋白酶裂解位点(例如，凝血酶裂解位点或FXIa裂解位点)连接，所述裂解位点进一步与FVII或FX重链连接。然后FVII或FX重链经由接头与增强子部分连接。当图1A中的构建体作为酶原(非活性形式)服用时，施用后(激活之前)所述构建体抗蛋白酶抑制剂。如图1B所示，当在损伤部位激活凝血因子时，凝血因子可展现出由增强子部分刺激的高活性。
图2说明了包含凝血酶可激活分子和增强子部分的嵌合FVII蛋白的示意图。图2A示出了与凝血酶裂解位点连接的FVII轻链，凝血酶裂解位点进一步与FVII重链连接。然后FVII重链经由接头与增强子部分连接，产生非活性和酶原形式。给动物服用时，这种酶原抗循环中的蛋白酶抑制剂并且可在损伤部位转化为活性形式(图2B)。凝血因子的活性可受增强子部分刺激。增强子部分的实例包括可溶性组织因子(sTF)、促凝血肽和抗体片段。
图3说明了包含凝血酶可激活FVII分子、作为增强子部分的sTF分子和显示为用于半衰期延长的Fc部分的异源部分(Het)的分子的示意图。图3A中的构建体包含第一多肽链和第二多肽链，其中第一多肽链按N端到C端顺序包含FVII轻链、凝血酶裂解位点、FVII重链、第一接头和第一Fc部分(Het1)并且第二多肽链在N端到C端方向上包含sTF、第二接头和第二Fc部分(Het2)。第一接头和第二接头可以相同或不同。第一Fc部分和第二Fc部分可以相同或不同。服用图3A中的构建体(即，酶原(非活性形式))时，施用后(激活之前)所述构建体抗蛋白酶抑制剂。如图3B所示，当在损伤部位由凝血酶激活凝血因子时，凝血因子可展现出由增强子部分刺激的高活性。
图4示出了生成图4B(类似于图3A)中的构建体的示意图。图4A(左侧构建体)按N端到C端顺序示出了编码FVII轻链、凝血酶裂解位点(ALRPR(SEQID NO:1))、FVII重链、第一接头、第一Fc部分(Het1)、第一胞内加工位点(例如，RRRR(SEQ ID NO:2))、第二接头、第二胞内加工位点(例如，RKRRKR(SEQID NO:3))、sTF、第三接头和第二Fc部分(Het2)的单一多肽序列。可在宿主细胞中表达编码所述单一多肽序列的核苷酸序列(FVIII-133)，并且所述单一多肽序列经受胞内加工，以致第一胞内加工位点和第二胞内加工位点由前肽肽链内切酶，例如PCSK5裂解。因此***第一胞内加工位点和第二胞内加工位点之间的第二接头可由PCSK5去除。图4B示出了最终构建体，通过加工去除接头后，其可能含有在裂解后保留的胞内加工位点的一部分。这个剩余接头部分可包含一系列约1个至约10个，1个至约4个氨基酸。图4C示出了在所示非还原条件或还原条件下，凝血酶可激活FVII-Fc/sTF-Fc嵌合蛋白的SDS-PAGE。
图5示出了在还原条件下凝血酶可激活FVII-Fc/sTF-Fc二聚体(FVII-133)的SDS-PAGE分析。第二条带(即，洗脱物)显示出纯化凝血酶可激活FVII-Fc/sTF-Fc二聚体。
图6示出了为测试FVII-133和FVIIaFc的活性，通过凝血酶生成测定产生的数据。无或有组织因子(TF)的FVII-133的活性分别用圆形(●)和正方形(■)示出。无或有TF的FVIIaFc的活性分别用三角形(▲)或菱形(◆)示出。y轴显示凝血酶的毫微摩尔(nM)，而x轴显示时间。构建体FVIIaFc由两条多肽链组成，第一条链由与第一Fc区连接的活化FVII(FVIIa)组成，而第二条链由Fc区组成。
图7示出了为测试FVII-133和FVIIaFc的活性，用小鼠血友病B血液通过ROTEM测定产生的数据。图7A和7B示出了FVII-133凝血时间和α角。图7C和7D分别示出了FVIIaFc和媒介物的凝血时间和α角。
图8A-C示出了在人类血友病A血液中通过ROTEM测定测量的FVII活性。将FVII-133、FVII-184和FVIIa掺入来自血友病A供体的柠檬酸化人血中。图4中示出了FVII-133的结构。FVII-184是FVII-133的突变形式并且由于凝血酶裂解所必需的Arg残基突变为Ala，对凝血酶激活不敏感。其它方面FVIII-184与FVII-133相同。测量FVII-133(三角形)、FVII-184(正方形)和FVIIa(圆形)的凝血时间(CT)、凝血形成时间(CFT)和α角。血友病A供体的基线凝血时间以菱形(◇)示出。图8A、8B和8C分别示出了凝血时间、凝血形成时间和α角的结果图。FVIIa用作FVIIa活性的对照。
图9示出了通过活体外ROTEM测定，在血友病B小鼠中的FVII-133活体外功效。对从经尾静脉注射分别服用了媒介物、FVIIa和FVII-133的小鼠采集的血液测量凝血时间(CT)。
图10A-B示出了根据施用所述蛋白质后的时间，FVII和FVII/ATIII复合物的血浆水平。血友病B小鼠静脉施用了FVII-133、rFVIIaFc或rFVIIa。在不同时间点采集血浆样品，并且通过ELISA测量FVII抗原水平(图10A)和FVII-133/ATIII或rFVIIFc-ATIII复合物(图10B)。通过2房室分析，使用Phoenix6程序生成FVII-133(虚线，圆形)和FVIIaFc(实线，三角形)的PK性质，包括平均滞留时间(MRT)。
图11示出了在血友病A人血中通过ROTEM测定测量的体外凝血时间。测量具有与FVII-133相同结构的FVII-212的凝血活性。将蛋白质掺入柠檬酸化血友病A人血中。用钙引发凝血并且用ROTEM机器在NATEM程序下记录凝血时间。X轴以nM显示rFVIIa或FVII-212的浓度，而y轴显示凝血时间。
图12示出了在通过腔静脉放血采集的小鼠血友病A血液中，通过ROTEM测定测量的体外凝血时间。将蛋白质掺入柠檬酸化小鼠血友病A血液中。用钙引发凝血并且用ROTEM机器在NATEM程序下记录凝血时间。X轴以nM显示掺入rFVIIa和FVII-212的浓度，而y轴显示凝血时间。
图13示出了在血友病A小鼠中的活体外功效。在血友病A小鼠中按10nmol/kg施用FVII-212(三角形)。在给药后的不同时间，用柠檬酸盐和玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)作为抗凝剂经由腔静脉采血，并且用ROTEM分析仪在NATEM程序下测量凝血活性。rFVIIa(圆形)用作对照。X轴显示蛋白质施用后的时间(h)，而y轴显示凝血时间。
图14示出了在血友病A小鼠中rFVIIa(圆形)、FVII-212(正方形)和rFVII/ATIII(三角形)的药代动力学性质。按时间(x轴)绘制蛋白质的浓度(y轴)。
图15示出了使用色酶t-PA底物激活凝血酶之前和之后测量的FVII-212的酰胺分解活性。将具有凝血酶的FVII-212表示为倒三角形(从上到下的第一条线)。将rFVIIa表示为圆形(从上到下的第二条线)。将FVII-212和凝血酶表示为第三和第四条线(底部线)。
图16A示出了本发明蛋白酶可激活的促凝血化合物的一般构造。Het2、Pep2、Het1和L独立地为任选组分。Pep1和Pep2为多肽，其中至少一个为凝血因子或促凝血肽。Het1和Het为异源部分。L为接头。附加接头可连接不同部分；例如，接头可位于Pep2和Het1之间(如图所示)。可在其它部分例如多肽或异源部分的N端***附加蛋白酶可裂解底物和自切除间隔基团。图中显示这种基团任选***Pep2的N端。图16B为本发明包含蛋白酶可裂解底物(Aa1Aa2Aa3Aa4)、自切除间隔和目标蛋白(POI；例如凝血因子或促凝血肽)的示例性促凝血化合物的示意图；说明在可裂解底物经蛋白水解裂解和1,6自发片段化后，所述化合物片段化并且释放目标肽或蛋白质。
图17为本发明包含外在位点结合肽(M)的替代示例性蛋白酶可激活的促凝血化合物的示意图。图中说明在可裂解底物(Aa1Aa2Aa3Aa4)经蛋白水解裂解和1,6自发片段化后，释放目标肽或蛋白质(POI；例如凝血因子或促凝血肽)及外在位点结合肽。
图18示出了用14nM凝血酶处理后，对应FXa凝血因子重链N端6个氨基酸残基的肽IVGGQE从不同促凝血化合物(化合物1、2和3)的释放动力学。
图19示出了用1.4nM凝血酶处理后，对应FXa凝血因子重链N端6个氨基酸残基的肽IVGGQE从不同促凝血化合物(化合物1、4、5和6)的释放动力学。
图20示出了为产生活化因子(FVIIa)，对因子VII的自然加工。
图21为本发明包含FVIIa凝血因子的示例性促凝血化合物的示意图。
图22A-B示出了可裂解多肽FVII-186(图22A)可经前蛋白转化酶(例如PACE)加工成经加工的可裂解多肽(图22B)的流程图。图22A示出了包含FVIILC(FVII轻链)-前蛋白转化酶的前蛋白转化酶加工位点(例如，PACE加工位点，例如2X(RKR)(SEQ ID NO:3))-接头1-SUMO-截短FVIIHC(N端没有IVGGKV(SEQ ID NO:60)的FVII重链)-接头2-Fc区2-接头3-Fc区2的可裂解多肽。图22B示出了已经受PACE加工的可裂解多肽。经加工的可裂解多肽包含两条多肽链，第一条链包含与前蛋白转化酶加工位点连接的FVIILC并且第二条链包含接头1-SUMO-截短FVIIHC(N端没有IVGGKV(SEQ ID NO:60)的FVII重链)-接头2-Fc区1-接头3-Fc区2。图22C展示了非还原(条带1)或还原(条带2)SDS-PAGE，显示了以上构建体和链。(-)表示肽键。
图23A-C示出了(i)FVII-186被SUMO蛋白酶裂解(图23B)和(ii)其与硫酯肽融合(图23C)的流程图。图23A与图22B中的构建体相同。图23B显示，FVII-186被SUMO蛋白酶裂解后，所得裂解多肽构建体包含两条链，第一条链包含FVIILC和前蛋白转化酶位点而第二条链包含截短FVIIHC(N端没有IVGGKV(SEQ ID NO:60)的FVII重链)-接头2-Fc区1-接头3-Fc区2。第一条链和第二条链通过二硫键结合。图23C显示，图23B中的裂解多肽构建体与硫酯肽(D-Phe-Pip-Arg-PABC-IVGGKV-COSBn)连接后，所得构建体包含两条多肽链，第一条链包含FVIILC和前蛋白转化酶加工位点而第二条链包含凝血酶裂解位点-FVIIHC(FVII重链)-接头2-Fc区1-接头3-Fc区2(TA-FVII-186)。图23D示出了指示所述构建体和链的还原SDS-PAGE：条带1示出了标记物；条带2示出了FVII-186；条带3示出了FVII-186与SUMO蛋白酶反应；条带3示出了FVII-186与SUMO蛋白酶反应并且与阳性对照肽偶联；并且条带5示出了FVII-186与SUMO蛋白酶反应并且与PABC肽偶联。(-)表示肽键。
图24示出了凝血酶激活TA-FVII-186后的FVIIa显色测定。X轴表示时间(min)，而Y轴表示对FVIIa活性的吸光度(A405)测量。(x)显示凝血酶和水蛭素的混合物的FVIIa活性。(□)表示FVII-186、凝血酶和水蛭素的混合物的FVIIa活性。(○)表示TA-FVII-186、凝血酶和水蛭素的混合物的FVIIa活性。
发明详述
本发明涉及包含可激活凝血因子和增强子部分的嵌合蛋白。本发明至少部分基于对增强凝血因子功效、药代动力学性质和/或工艺性的新方式的研发。可激活凝血因子呈可在凝固部位激活的形式。对于在旁路疗中使用，外源凝血因子只有在呈活化形式给予时才有效。然而，这种活化凝血因子通过内源途径(例如，抗凝血酶III、TFPI)迅速灭活，导致其快速清除并且在循环中的有效半衰期短。给予较高剂量未解决这个问题，因为可导致血栓形成效应。因此，在一个实施方案中，本发明关于包含与增强子部分融合或缔合的可激活凝血因子的活性增强型嵌合蛋白构建体。“可激活”凝血因子包含凝血因子酶原的重链和轻链及***重链和轻链之间的异源蛋白酶裂解位点(即，在凝血因子酶原中非自然存在)。这些分子作为增强型酶原融合蛋白循环并且由于没有灭活，半衰期比其活化配对物长，但是由于重链和轻链受在凝血部位激活或定位的蛋白酶裂解，可在凝血部位容易地激活。并入增强子部分也可提高其促凝血活性。
附图和序列表中说明了本发明的示例性构建体。在一个实施方案中，本发明关于具有图中提出的结构的多肽。在另一实施方案中，本发明关于具有所附序列表中提出的序列的多肽或编码这种多肽的核酸分子。在一个实施方案中，本发明关于具有所附序列表中提出的序列的多肽的成熟形式。应理解，这些构建体及其编码核酸分子可在受试者中用于提高止血。
为了提供对说明书和权利要求的清晰理解，下面提供了以下定义。
I.定义
如本文所使用，术语“蛋白质”或“多肽”指两种或更多种天然氨基酸或非天然氨基酸的聚合物。
术语“氨基酸”包括丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。非传统氨基酸也在本发明范围内并且包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，例如Ellman等Meth.Enzym.202:301-336(1991)中描述的氨基酸残基类似物。为生成这种非自然存在的氨基酸残基，可使用Noren等Science 244:182(1989)和Ellman等(同上)的程序。简言之，这些程序牵涉化学活化带非自然存在的氨基酸残基的抑制基因tRNA，接着体外转录和翻译RNA。非传统氨基酸的引入也可使用本领域已知的肽化学法完成。如本文所使用，术语“极性氨基酸”包括具有零净电荷，但是在其侧链的不同部分(例如M、F、W、S、Y、N、Q、C)具有非零局部电荷的氨基酸。这些氨基酸可参与疏水相互作用和静电相互作用。如本文所使用，术语“带电氨基酸”包括在其侧链(例如R、K、H、E、D)上可具有非零净电荷的氨基酸。这些氨基酸可参与疏水相互作用和静电相互作用。
“氨基酸取代”指预定氨基酸序列(起始多肽的氨基酸序列)中至少一个现有氨基酸残基经第二不同“置换”氨基酸残基置换。“氨基酸***”指在预定氨基酸序列中并入至少一个附加氨基酸。虽然***通常将由一个或两个氨基酸残基的***组成，但是可产生当前较大的“肽***”，例如约3个至约5个或甚至多达约10、15或20个氨基酸残基的***。如以上所公开那样，***的残基可能是自然存在或非自然存在的。“氨基酸缺失”指从预定氨基酸序列去除至少一个氨基酸残基。
多肽可为单体或多聚体。例如，在一个实施方案中，本发明的蛋白质为二聚体。本发明的二聚多肽可能包含两条多肽链或可能由一条多肽链组成(例如，在scFc分子的情况下)。在一个实施方案中，本发明的二聚体为同型二聚体，包含两个相同单体亚基或多肽(例如，两个相同的Fc部分或两个相同的生物活性部分)。在另一实施方案中，本发明的二聚体为杂二聚体，包含两个不同单体亚基或多肽(例如，包含两个不同凝血因子或其一部分或仅一个凝血因子)。见，例如，以引用的方式并入的美国专利7404956。
如本文所使用，术语“肽接头”、“接头”或“接头部分”指连接多肽链线性氨基酸序列中两个结构域的肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)。在一个实施方案中，由编码直接或间接连接构成所述构建体的两个Fc部分的肽接头的核酸分子编码本发明的多肽。本文将这些接头称为“scFc接头”并且scFc接头***包含scFc接头的多肽的两个Fc部分之间。如果scFc接头连续地连接线性多肽序列中的两个Fc部分，则为“直接”连接。相反，scFc接头可将第一Fc部分连接到结合部分，结合部分依次与第二Fc部分连接，从而形成间接连接。这些scFc接头允许形成单链基因构建体。在一个实施方案中，多肽还包含胞内加工位点，其导致scFc接头(cscFc接头)被加工，并且在一个实施方案中，大体上被切除(例如，细胞加工期间)。因此，所得经加工的多肽是包含至少两条氨基酸链并且大体上缺乏外来接头氨基酸序列的二聚体分子。在一些实施方案中，切除全部或绝大部分接头，而在一些实施方案中，可保留裂解位点的一部分，例如RRRR裂解位点的4个精氨酸。在另一实施方案中，接头或肽接头通常不可能裂解；然而在某些实施方案中，这种裂解可能是可取的。附图中示出了接头的示例性位置。接头可位于可激活凝血因子、增强部分和/或异源部分之间，例如在这些部分的N或C端。在一个实施方案中，在加工期间去除了这些接头。
可激活凝血因子中可能存在的第三类接头本文称为“可裂解接头”，其包含在凝血因子中非自然存在的异源蛋白酶裂解位点(例如，因子XIa或凝血酶裂解位点)并且可能在裂解位点的N端或C端或两侧包括附加接头。附图中示出了这种位点的示例性位置并且包括(例如)凝血因子酶原重链和凝血因子酶原轻链之间的位置。在另一实施方案中，这种接头可进一步包含自切除部分。例如，在一个实施方案中，与可裂解接头连接的自切除部分可能与凝血因子重链的N端融合。在这种情况下，可裂解接头可在裂解位点N端包括附加接头，但是需要在裂解位点的C端与凝血因子重链的氨基末端直接融合。
如本文所使用，术语“gly-ser肽接头”指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性gly/ser肽接头包含氨基酸序列(Gly4Ser)n.(SEQ ID NO:4)。另一示例性gly/ser肽接头包含氨基酸序列S(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:5)，其中n为相同或大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、46、50、55、60、70、80、90或100的整数。
在一个实施方案中，n＝1。在一个实施方案中，n＝2。在另一实施方案中，n＝3。在另一实施方案中，n＝4。在另一实施方案中，n＝5。再一实施方案中，n＝6。在另一实施方案中，n＝7。再一实施方案中，n＝8。在另一实施方案中，n＝9。再一实施方案中，n＝10。另一示例性gly/ser肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:5)。在一个实施方案中，n＝1。在一个实施方案中，n＝2。在一个优选实施方案中，n＝3。在另一实施方案中，n＝4。在另一实施方案中，n＝5。再一实施方案中，n＝6。
本发明多肽或蛋白质的“衍生物”是已经改变以致表现出在天然多肽或蛋白质上不存在的附加特征的多肽或蛋白质。“衍生物”还包括含20种标准氨基酸的一种或多种自然存在的氨基酸衍生物的肽。“源自”指定多肽或蛋白质的多肽或氨基酸序列指多肽的起源。在一个实施方案中，源自特定序列的多肽或氨基酸序列具有与所述序列或其一部分基本上相同的氨基酸序列，其中所述部分由至少约10至约20个氨基酸，至少约20至约30个氨基酸，或至少约30至约50个氨基酸组成，或其可为本领域的普通技术人员另外鉴定为起源于所述序列。
为另一肽的“变体”的多肽可能相对于起始多肽具有一个或多个突变，例如一个或多个氨基酸残基已经由另一氨基酸残基取代或具有一个或多个氨基酸残基***或缺失。在一个实施方案中，多肽包含非自然存在的氨基酸序列。这种变体与起始多肽的序列同一性或相似性必定小于100％。在另一实施方案中，变体将具有与起始多肽的氨基酸序列约75％到小于100％的氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列，例如，在变体分子的整个长度上，从约80％到小于100％，从约85％到小于100％，从约90％到小于100％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)和从约95％到小于100％。在一个实施方案中，在起始多肽序列及其衍生的序列之间存在一个氨基酸差异。本文将关于该序列的同一性或相似性定义为比对序列并且必要时引入空位以达到最高序列同一性百分比后，候选序列中与原始氨基酸残基相同的氨基酸残基(即，相同残基)的百分比。
术语“片段”在提到本发明的多肽和蛋白质时包括保持参考多肽或蛋白质的至少一些性质的任何多肽或蛋白质。多肽片段包括蛋白水解片段以及缺失片段。
在一个实施方案中，本发明的多肽包含源自人蛋白质序列的氨基酸序列(例如，至少一个凝血因子或Fc部分或结构域)。然而，多肽可能包含来自另一哺乳动物物种的一种或多种氨基酸。例如，凝血因子、Fc结构域或增强部分可源自非人类物种并且包括在主题多肽中。可选地，在源自非人类物种的多肽中可能存在一种或多种氨基酸。在一个特定实施方案中，本发明的多肽没有免疫原性。
本领域的普通技术人员还将理解，可改变本发明的多肽，以致它们在来自于其来源的自然存在的或天然多肽的氨基酸序列上改变，同时保持天然多肽的所需活性。例如，可产生在“非必需”氨基酸残基处导致保守性取代或变化的核苷酸或氨基酸取代。可通过向免疫球蛋白的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失，产生编码源自免疫球蛋白的多肽(例如，Fc结构域、部分或抗原结合位点)的非天然变体的分离核酸分子，以便向编码的蛋白质中引入一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。也可通过标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变引入突变。
本发明的多肽可在一个或多个氨基酸残基处，例如在必需或非必需氨基酸残基处包含保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是氨基酸残基经具有相似侧链的氨基酸残基置换的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支化侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，多肽中的非必需氨基酸残基可经来自同一侧链家族的另一氨基酸残基置换。在另一实施方案中，一串氨基酸可经结构相似，在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同的一串置换。可选地，在另一实施方案中，可沿着整个或部分编码序列，例如通过饱和诱变随机引入突变，并且可将所得突变体引入本发明的多肽中并且筛选其与所需靶标结合的能力。
在多肽的情况下，“线性序列”或“序列”是多肽中氨基到羧基端方向上的氨基酸顺序，其中序列上相互邻近的残基在多肽的一级结构中连续。
如本文所使用，术语“经连接”、“经融合”或“融合”指经由肽键(例如，基因融合)、化学偶联或其它方式连接。例如，可连接分子或部分的一种方式采用经由肽键连接所述分子或部分的肽接头。术语“基因上融合”、“基因上连接”或“基因融合”可交换使用并且指两个或多个蛋白质、多肽或其片段经由其单独肽骨架，通过编码那些蛋白质、多肽或片段的单个多核苷酸分子的基因表达共线、共价连接或结合。这种基因融合导致单个连续基因序列表达。优选基因融合在框内，即两个或更多个开放阅读框(ORF)以保持原ORF的正确阅读框的方式融合形成更长的连续ORF。因此，所得重组融合蛋白是含有与原ORF编码的多肽相对应的两个或更多个蛋白质片段的单一多肽(所述片段在自然界中通常不这样连接)。在这种情况下，单一多肽在加工期间经裂解产生包含两条多肽链的二聚体分子。
如本文所使用，术语“缔合”指第一条氨基酸链和第二条氨基酸链之间形成的共价或非共价键。在一个实施方案中，术语“与…缔合”意指共价非肽键或非共价键。在另一实施方案中，术语“与…缔合”指未经化学交联的共价非肽键或非共价键。在一些实施方案中，这种缔合用冒号，即(:)表示。在另一实施方案中，其意指除肽键外的共价键。例如，氨基酸半胱氨酸包含硫醇基，可与第二半胱氨酸残基上的硫醇基形成二硫键或桥。在大部分自然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过一个二硫键缔合并且两条重链在对应于使用Kabat编号***的239和242的位置(位置226或229，EU编号***)，通过两个二硫键缔合。共价键的实例包括但不限于肽键、金属键、氢键、二硫键、σ键、π键、δ键、糖苷键、不可知键、弯键、偶极键、π反向键、双键、三键、四重键、五重键、六重键、共轭、超共轭、芳香性、哈普托数或反键作用。非共价键的非限制性实例包括离子键(例如阳离子π键或盐键)、金属键、氢键(例如，双氢键、双氢配合物、低垒氢键或对称氢键)、范德华力(van der Walls force)、伦敦分散力(London dispersion force)、机械键、卤键、亲金作用、***、堆集、熵力或化学极性。
如本文所使用，术语“化学交联”指通过氨基酸酸性侧链之间的共价键，直接地或经由接头例如肽接头连接。化学交联不包括二聚Fc区的Fc部分之间的分子内或分子间的二硫键，或可激活凝血因子的氨基酸与增强子部分的氨基酸之间的非工程化二硫键。通常添加交联剂，例如异型双功能交联剂，就会发生化学交联。化学交联的实例包括化学连接光-Ile、光-Met和光-Leu的一个或多个光反应键。见Suchanek等，(2005)Nature methods,2:261-267。
如本文所使用，术语“Fc区”定义为与天然免疫球蛋白的Fc区相对应的多肽部分，即通过其两条重链各自的Fc结构域的二聚缔合形成。天然Fc区为同型二聚体并且包含两条多肽链。相反，如本文所使用，术语“基因融合Fc区”或“单链Fc区”(scFc区)指由单条多肽链内基因上连接(即，单条连续基因序列中编码)的Fc结构域构成的合成二聚Fc区。
如本文所使用，术语“Fc结构域”指单条免疫球蛋白重链就在木瓜蛋白酶裂解位点上游的铰链区(即，IgG中的残基216，将重链恒定区的第一个残基视为114)开始并且在抗体C端结束的部分。相应地，完整Fc结构域包含至少一个铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。
如本文所使用，术语“Fc结构域部分”或“Fc部分”包括Fc结构域的或源自Fc结构域的氨基酸序列。在某些实施方案中，Fc部分包含以下至少一个：铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或其变体、一部分或片段。在其它实施方案中，Fc部分包含完整Fc结构域(即，铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域)。在一个实施方案中，Fc部分包含与CH3结构域(或其一部分)融合的铰链结构域(或其一部分)。在另一实施方案中，Fc部分包含与CH3结构域(或其一部分)融合的CH2结构域(或其一部分)。在另一实施方案中，Fc部分由CH3结构域或其一部分组成。在另一实施方案中，Fc部分由铰链结构域(或其一部分)和CH3结构域(或其一部分)组成。在另一实施方案中，Fc部分由CH2结构域(或其一部分)和CH3结构域组成。在另一实施方案中，Fc部分由铰链结构域(或其一部分)和CH2结构域(或其一部分)组成。在一个实施方案中，Fc部分至少缺乏CH2结构域的一部分(例如，整个或部分CH2结构域)。
如本文所使用，术语“半衰期”指特定多肽在体内的生物半衰期。半衰期可用向受试者施用的一半量从循环和/或动物体内其它组织中清除所需要的时间表示。当根据时间作给定多肽的清除曲线时，曲线通常为双相，快速α-相和较长β-相。α-相通常表示施用的嵌合多肽在血管内和血管外间隙之间的平衡并且部分由多肽的尺寸决定。β-相通常表示多肽在血管内间隙的分解代谢。因此，在一个特定实施方案中，如本文所使用的术语半衰期指β-相多肽的半衰期。人源性抗体的典型β-相半衰期为21天。
如本文所使用，术语“半衰期延长剂”指增加蛋白质的体内半衰期的异源部分。可通过本领域技术人员已知的任何方法，例如FVII活性水平测定法测定本发明嵌合凝血因子的体内半衰期。在某些实施方案中，半衰期延长剂可包含非多肽部分例如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、多聚唾液酸或这些要素的任何衍生物、变体或组合的附着位点。
如本文所使用，术语“部分”指嵌合多肽的组成部分或构成部分。
如本文所使用，术语“增强子部分”指能够增强凝血因子的促凝血活性的分子、其片段、衍生物或变体或多肽组分。在一个实施方案中，本发明的嵌合凝血因子包含(例如)通过起辅因子的作用，增强多肽活性的“增强子部分”。这种部分可为(例如)凝血辅因子，例如可溶性组织因子(sTF)或因子Va蛋白，但是不包括靶向部分，例如血小板靶向部分。在另一实施方案中，增强子部分与可激活凝血因子相互作用，从而增加凝血因子的促凝血活性。增强子部分可与构建体基因融合，与构建体化学偶联或经由接头与构建体连接。例如，增强子部分可通过在增强子部分与构建体的可激活凝血因子之间形成键附着于本发明的构建体，其中增强子部分包含第一官能团并且可激活凝血因子包含第二官能团，并且其中第一和第二官能团能够相互反应形成化学键。下面更加详细地描述了示例性增强子部分。
如本文所使用，术语“自切除部分”指可以包括在可裂解接头内以增强其功能的分子。在一个实施方案中，自切除部分***凝血因子酶原的重链与蛋白酶裂解位点之间。这种自切除部分的优点在于，蛋白酶裂解位点的可裂解性不受第一部分末端氨基酸残基的负面影响。例如，在美国专利7,375,078和美国专利7,754,681中公开了示例性自切除部分，其以引用的方式整体并入本文。
如本文所使用，术语“异源部分”指并非与嵌合蛋白的组分，例如可激活凝血因子、接头部分或增强子部分一起自然存在和/或与嵌合蛋白的组分连接或缔合的部分。在一个实施方案中，异源部分能够延长可激活凝血因子的半衰期。在另一实施方案中，异源部分增大了可激活或活化凝血因子的流体动力学半径。在其它实施方案中，异源部分提高了凝血因子的一种或多种药代动力学性质，未明显影响其生物活性或功能(例如，其促凝血活性)。还有其它实施方案中，异源部分为非多肽部分，例如肽或多肽与非多肽部分的化学修饰或组合。还有其它实施方案中，异源部分为多肽。在一些实施方案中，嵌合凝血因子通过接头与异源部分连接或接合。异源多肽部分的非限制性实例包括免疫球蛋白恒定区或其一部分、白蛋白或或其片段、白蛋白结合部分、PAS序列、HAP序列、转铁蛋白或其片段、人绒毛膜***C端肽(CTP)的β亚基、白蛋白结合小分子、XTEN序列或其两种或更多种组合。异源非多肽部分的非限制性实例包括聚乙二醇(PEG)、多聚唾液酸、羟乙基淀粉(HES)、其衍生物或其任何组合。示例性异源部分包括(例如)FcRn结合部分(例如，与FcRn结合的完整Fc区或其部分)、单链Fc区(ScFc区，例如US 2008/0260738、WO 2008/012543或WO2008/1439545中所述)、可加工scFc区(包含如本文所述的cscFc区)。
在一个实施方案中，用于本发明构建体中的增强子部分包含抗体变体。术语“抗体变体”或“经修饰抗体”包括在自然界中不存在并且如本文所述，具有与自然衍生抗体有至少一个氨基酸或氨基酸修饰不同的氨基酸序列或氨基酸侧链化学结构的抗体。如本文所使用，术语“抗体变体”包括经改变，以致其并非自然存在的抗体合成形式，例如包含至少两个重链部分，但并非两条完整重链的抗体(例如，结构域缺失抗体或微型抗体)；经改变以与两种或更多种抗原或与单个抗原上的不同表位结合的抗体多特异性形式(例如，双特异性、三特异性等)；与scFv分子接合的重链分子；单链抗体；双链抗体；三链抗体；和效应子功能改变的抗体等。
如本文所使用，术语“Gla结构域”指维生素K依赖性蛋白，例如凝血酶原、凝固因子VII、IX和X、蛋白质C、S和Z中存在的保守膜结合基序。这些蛋白质对于翻译后合成g-羧基谷氨酸，这些蛋白质N端Gla结构域中集簇的氨基酸，需要微生物K。所述结构域中存在的所有谷氨酸残基为潜在羧化位点并且其中许多因此通过羧化而修饰。在钙离子的存在下，Gla结构域与包括磷脂酰丝氨酸的磷脂膜相互作用。Gla结构域还在与FVIIa辅因子(组织因子(TF))的结合中起作用。与TF复合，FVIIa的Gla结构域载有7个Ca2+离子，在细胞膜方向上突出3条疏水性侧链以与细胞表面的磷脂相互作用，并且与TF的C端结构域显著接触。
如本文所使用，术语“scFv分子”包括由一个轻链可变结构域(VL)或其部分和一个重链可变结构域(VH)或其部分组成的结合分子，其中每个可变结构域(或其部分)源自相同或不同抗体。scFv分子优选包含***VH结构域和VL结构域之间的scFv接头。scFv分子在本领域中已知并且例如在美国专利5,892,019、Ho等1989.Gene 77:51；Bird等1988Science 242:423；Pantoliano等1991.Biochemistry 30:10117；Milenic等1991.Cancer Research 51:6363；Takkinen等1991.Protein Engineering 4:837中有描述。
如本文所使用，术语“scFv接头”指在scFv的VL和VH结构域之间***的部分。scFv接头优选维持scFv分子呈抗原结合构象。在一个实施方案中，scFv接头包含或由scFv接头肽组成。在某些实施方案中，scFv接头肽包含或由gly-ser肽接头组成。在其它实施方案中，scFv接头包含二硫键。
术语“糖基化”指一种或多种碳水化合物与多肽的共价连接。通常，糖基化是可以在细胞的胞内环境或来自其中的提取物中发生的翻译后事件。术语糖基化包括(例如)N-连接的糖基化(其中一个或多个糖与天冬酰胺残基连接)和/或O-连接的糖基化(其中一个或多个糖与具有羟基的氨基酸残基(例如丝氨酸或苏氨酸)连接)。在一个实施方案中，本发明的分子经糖基化。在另一实施方案中，本发明的分子未糖基化。再一实施方案中，本发明的分子与野生型Fc区中的糖基化相比，糖基化减少。
如本文所使用，术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含硫醇基，可与第二硫醇基形成二硫键或桥。在大部分自然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过天然二硫键连接并且两条重链在对应于使用Kabat编号***的239和242的位置(位置226或229，EU编号***)，通过两个天然二硫键连接。
术语“载体”或“表达载体”在本文中用于指根据本发明用作在细胞中引入和表达所需多核苷酸的媒介物的载体。正如本领域技术人员所知，可容易地从质粒、噬菌体、病毒或逆转录病毒选择这种载体。一般而言，与本发明相容的载体将包含选择标记、促进所需基因的克隆和进入和/或在真核或原核细胞中复制的能力的适当限制位点。
可采用许多表达载体***生成本发明的嵌合凝血因子。例如，一类载体利用源自动物病毒例如牛***瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。另外，可通过引入允许选择经转染宿主细胞的一个或多个标记选择已经将所述DNA整合到其染色体中的细胞。所述标记可为营养缺陷型宿主提供原营养、生物杀灭剂抗性(例如，抗生素)或对重金属例如铜的抗性。可选标记基因可与要表达的DNA序列直接连接，或通过共转化引入同一细胞中。在一个实施方案中，可采用诱导型表达***。对于mRNA的最优合成，可能还需要附加元件。这些元件可包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。在一个实施方案中，分泌信号，例如几种表征清楚的细菌前导肽的任一种(例如，pelB、phoA或ompA)可在框内与本发明多肽的N端融合以获得多肽的最优分泌。(Lei等(1988),Nature,331:543；Better等(1988)Science,240:1041；Mullinax等(1990).PNAS,87:8095)。
术语“宿主细胞”指已经用使用重组DNA技术构建的并且编码至少一个异源基因的载体转化的细胞。在从重组宿主中分离蛋白质的工艺的描述中，除非另外明确说明，术语“细胞”和“细胞培养物”可交换用于指蛋白质来源。换言之，从“细胞”回收蛋白质可意指从离心全细胞或从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物。用于蛋白质表达的宿主细胞系最优选为哺乳动物来源；认为本领域的技术人员有能力优先确定最适合要在其中表达的所需基因产物的特定宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢系，DHFR-)、HELA(人***)、CVI(猴肾系)、COS(带SV40T抗原的CVI的衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、PerC6细胞)、HAK(仓鼠肾系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾)。宿主细胞系通常可由商业服务，美国模式培养物保藏所或由出版文献获得。也可在非哺乳动物细胞例如细菌或酵母或植物细胞中表达本发明的多肽。在这点上，应认识到各种单细胞非哺乳动物微生物例如细菌也可转化；即，能够在培养或发酵中生长的微生物。对转化敏感的细菌包括肠杆菌科成员，例如大肠杆菌(Escherichiacoli)或沙门氏菌(Salmonella)菌株；芽胞杆菌科，例如枯草杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)。应进一步认识到，在细菌中表达时，多肽通常成为包涵体的一部分。所述多肽必须分离、纯化，然后组装成功能性分子。
除原核生物外，也可使用真核微生物。虽然许多其它菌株普遍可用，包括毕赤酵母(Pichia pastoris)，但是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见面包酵母是真核微生物中最常用的。为了在酵母中表达，常用质粒YRp7，例如(Stinchcomb等(1979),Nature,282:39；Kingsman等(1979),Gene,7:141；Tschemper等(1980),Gene,10:157)。这种质粒已经含有为没有能力在色氨酸中生长的酵母突变菌株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标记的TRP1基因(Jones,(1977),Genetics,85:12)。作为酵母宿主细胞基因组特征的trpl损伤的存在则提供了通过在色氨酸缺乏时的生长检测转化的有效环境。
如本文所使用，术语“内源”指分子(例如核酸和/或蛋白质分子)自然地存在于细胞中。相反，术语“外源”或“异源”指这种分子不常出现在特定环境中，例如细胞或多肽中。例如，可将外源或异源分子引入细胞并且只有在操纵细胞，例如通过转染或其它形式的基因工程后存在，或异源氨基酸可存在于它并非自然存在于其中的蛋白质中。
如本文所使用，术语“裂解位点”或“蛋白酶裂解位点”指蛋白酶所识别的位点。在一个实施方案中，多肽具有在凝血级联期间激活的蛋白酶所裂解的蛋白酶裂解位点，以致这种位点的裂解在凝块形成部位发生。这种示例性位点包括(例如)凝血酶、因子XIa或因子Xa识别的位点。示例性FXIa裂解位点包括(例如)TQSFNDFTR(SEQ ID NO:6)和SVSQTSKLTR(SEQ ID NO:7)。示例性凝血酶裂解位点包括(例如)DFLAEGGGVR(SEQ ID NO:8)、TTKIKPR(SEQ IDNO:9)、LVPRG(SEQ ID NO:10)和ALRPR(SEQ ID NO:1)。下面详细地描述了其它蛋白酶裂解位点。
如本文所使用，术语“加工位点”或“胞内加工位点”指多肽中是在多肽翻译后起作用的酶的靶标的一类酶促裂解位点。在一个实施方案中，这种酶在从高尔基内腔转运到反式高尔基隔室期间起作用。细胞内加工酶在蛋白质从细胞分泌之前裂解多肽。这种加工位点的实例包括(例如)肽链内切酶的PACE/弗林蛋白酶(furin)(其中PACE是配对碱性氨基酸裂解酶的首字母缩写)家族。这些酶定位于高尔基膜并裂解序列基序Arg-[任何残基]-(Lys或Arg)-Arg的羧基末端一侧的蛋白质。如本文所使用，酶的“弗林蛋白酶”家族中包括(例如)弗林蛋白酶、酵母Kex2、PCSK1(也称为PC1/Pc3)、PCSK2(也称为PC2)、PCSK3(也称为弗林蛋白酶或PACE)、PCSK4(也称为PC4)、PCSK5(也称为PC5或PC6)、PCSK6(也称为PACE4)或PCSK7(也称为PC7/LPC、PC8或SPC7)。在本领域中已知其它加工位点。
在包括一个以上加工或裂解位点的构建体中，应理解这种位点可能相同或不同。
体外生成允许扩大规模以生成大量本发明的所需改变多肽。本领域中已知在组织培养条件下进行哺乳动物细胞培养的技术并且包括(例如)在气升式反应器或连续搅拌釜式反应器中的均匀悬浮培养或(例如)在空心纤维、微胶囊中，在琼脂糖微珠或陶瓷管壳中的固定化或包埋细胞培养。如果必要和/或需要，可通过传统色谱法，例如凝胶过滤、离子交换色谱法、疏水性相互作用色谱法(HIC)、在DEAE-纤维素上的色谱法或亲和色谱法纯化多肽溶液。
如本文所使用，短语“将受益于施用多肽的受试者”或“有需要的受试者”包括将受益于施用本发明的多肽，例如提高止血的受试者，例如哺乳动物受试者。在一个实施方案中，受试者包括但不限于已经发展FVIII抑制剂并因此需要旁路疗法的个体。在另一实施方案中，受试者还包括尚未发展FVIII抑制剂，但是有发展FVIII抑制剂的倾向的个体。受试者可为成人或未成年人(例如，12岁以下)。
如本文所使用，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”指由源自第一来源的第一氨基酸序列与源自第二来源的第二氨基酸序列共价或非共价键合构成的任何蛋白质，其中第一和第二来源不相同。不相同的第一来源和第二来源可包括两个不同生物实体或来自同一生物实体的两种不同蛋白质或生物实体和非生物实体。嵌合蛋白可包括(例如)源自至少2个不同生物来源的蛋白质。生物来源可包括任何非合成生成的核酸或氨基酸序列(例如，如本文进一步描述的基因组或cDNA序列、质粒或病毒载体、天然病毒粒子或以上任一种的突变体或类似物)。合成来源可包括经化学生成而不是通过生物***生成(例如氨基酸序列的固相合成)的蛋白质或核酸序列。嵌合蛋白还可包括源自至少2个不同合成来源的蛋白质或源自至少一个生物来源和至少一个合成来源的蛋白质。嵌合蛋白也可包含源自第一来源的第一氨基酸序列，其与源自任何来源的核酸或源自任何来源的有机或无机小分子共价或非共价连接。嵌合蛋白可包含介于第一和第二氨基酸序列之间或介于第一氨基酸序列和核酸之间，或介于第一氨基酸序列和有机或无机小分子之间的接头分子。
如本文所使用，术语“凝血因子”指自然存在或重组生成的防止或减少受试者出血事件持续时间的分子或其类似物。换言之，指具有促凝活性，即负责将纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白网，引起血液凝固或凝结的分子。“可激活凝血因子”是呈非活性形式(即，呈其酶原形式)，能够转化为活性形式的凝血因子。
如本文所使用，凝血活性指参与在形成纤维蛋白凝块时达到顶点的一连串生化反应和/或降低出血或出血事件的严重程度、持续时间或频率的能力。
如本文所使用，止血指阻止或减缓流血或出血；或阻止或减缓血流通过血管或身体部位。
如本文所使用，止血障碍指由于形成纤维蛋白凝块的能力受损或不能形成纤维蛋白凝块，特征在于自发或因创伤而倾向于出血的基因遗传或获得性病状。
这种病症的实例包括血友病。3种主要形式为血友病A(因子VIII缺乏)、血友病B(因子IX缺乏或“克雷司马斯病(Christmas disease)”)和血友病C(因子XI缺乏，轻微出血倾向)、血管性血友病(Von Willebrand disease)、因子Xi缺乏(PTA缺乏)、因子XII缺乏、纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII的缺乏或结构异常，巨血小板综合征(Bernard-Souliersyndrome)是GPIb缺陷或缺乏。vWF的受体GPIb可能有缺陷并且导致缺乏初级凝块形成(初级止血)和出血倾向增加，和格兰茨曼-尼耶格利二氏血小板机能不全(血小板无力症(Glanzmann thrombasthenia))。在肝功能衰竭(急性和慢性形式)中，肝脏的凝固因子生成不足；这可能增加出血危险。
本发明的嵌合分子预防性使用。如本文所使用，术语“预防性治疗”指出血事件之前施用分子。在一个实施方案中，需要一般止血剂的受试者正在接受或即将接受手术。本发明的嵌合蛋白可在手术之前或之后作为预防剂施用。本发明的嵌合蛋白可在手术期间或之后施用以控制急性出血事件。手术可包括但不限于肝脏移植、肝切除术或干细胞移植。
按需治疗包括对出血事件、关节积血、肌肉流血、口腔流血、出血、肌肉出血、口腔出血、创伤、创伤性头癣(头部创伤)、胃肠道出血、颅内出血、腹腔内出血、胸内出血、骨折、中枢神经***出血、咽后隙出血、腹膜后间隙出血或髂腰肌鞘出血的治疗。受试者可能需要手术预防、围术期管理或手术治疗。这种手术包括(例如)小手术、大手术、拔牙、扁桃体切除术、***切开术、滑膜切除术、全膝关节置换术、开颅术、骨缝术、创伤手术、颅内手术、腹腔内手术、胸内手术或关节置换手术。
如本文所使用，术语“急性出血”指不管根本原因如何的出血事件。例如，受试者可能有创伤、***、遗传性出血性疾病(例如，因子VII缺乏)、血小板异常或由于发展抗体对凝血因子的抗性。
如本文所使用，治疗(treat)、治疗(treatment)、治疗(treating)指(例如)降低疾病或病状的严重程度；减少病程持续时间；改善与疾病或病状相关的一种或多种症状；对有疾病或病状的受试者提供有益效果，不一定治愈所述疾病或病状，预防与疾病或病状相关的一种或多种症状。
如本文所使用，术语“固相肽合成”指固定在固体表面的多肽分子的体外合成。SPPS的一般原理是偶联-洗涤-去保护-洗涤重复循环之一。固相附着肽的N端游离胺与单个N-保护的氨基酸单元偶联。然后使该单元去保护，露出另一氨基酸可附于其上的新N端胺。最初在Merrifield等，"Solid Phase PeptideSynthesis.I.The Synthesis of a Tetrapeptide".J.Am.Chem.Soc.85(14):2149–2154(1963)中描述了固相肽合成。例如，如"Fmoc Solid Phase PeptideSynthesis-A Practical Approach"，W.C.Chan,P.D.White编辑，OxfordUniversity Press,New York 2000及其参考文献中所述，使用固相肽合成，合成本公开的化合物。固相肽合成包括合成包含天然氨基酸、非天然氨基酸(包括D-氨基酸)的多肽、肽/蛋白质骨架修饰和肽与非肽部分偶联。
II.嵌合蛋白
本发明涉及包含可激活凝血因子和增强子部分的嵌合蛋白。嵌合蛋白中的可激活凝血因子呈非活性形式(即酶原)施用并且在体内施用后，例如在损伤部位，经蛋白酶激活。可激活凝血因子一经激活，与激活的凝血因子缔合或连接的增强子部分就可通过在凝血途径中起伴侣的作用，增强凝血因子的活性。因此，也可将本发明的嵌合蛋白描述为增强型或改良酶原或增强型或改良酶原融合蛋白(例如，FVII增强型酶原融合蛋白或FX增强型酶原融合蛋白)。用于嵌合蛋白的可激活凝血因子的实例包括但不限于如下面部分(A)中描述的因子VII或因子X。
通过使增强子部分(例如，凝血辅因子(例如，组织因子))接近可激活凝血因子进一步改良可激活凝血因子。因此，当凝血因子裂解为杂二聚体时，增强子部分可与凝血因子杂二聚体相互作用并且可诱导构象变化以增强促凝血活性。用于本发明的增强子部分的实例包括但不限于凝血辅因子、促凝血肽或如下面部分(B)中描述的抗原结合部分。在一些实施方案中，增强子部分与凝血因子相互作用，未将凝血因子裂解成杂二聚体。
虽然轻链从凝血因子的重链裂解产生凝血因子的双链活化形式，但是当重链的N端未完全裂解时，凝血因子可能仍然呈酶原样蛋白质存在。本发明的一个实施方案包括包含含轻链和重链的杂二聚体酶原样蛋白质的嵌合蛋白，其中重链的N端与蛋白酶裂解位点连接。在损伤部位蛋白酶裂解位点的裂解可激活体内凝血因子。
在一个实施方案中，嵌合蛋白中的可激活凝血因子通过共价键，例如肽键、二硫键、金属键、氢键、二硫键、σ键、π键、δ键、糖苷键、不可知键、弯键、偶极键、π反向键、双键、三键、四重键、五重键、六重键、共轭、超共轭、芳香性、哈普托数或反键作用与增强子部分连接。在另一实施方案中，可激活凝血因子和增强子部分之间的连接为非共价相互作用，例如离子相互作用、疏水性相互作用、亲水性相互作用、范德华相互作用或氢键。在一些实施方案中，可激活凝血因子和增强子部分之间的连接为共价键或非共价键，但不是化学交联，例如光反应性键。在一个特定实施方案中，可激活凝血因子和增强子部分之间的连接为二硫键。
一方面，包含可激活凝血因子和增强子部分的嵌合蛋白进一步包含一个或多个接头部分。例如，嵌合蛋白可包含式Ac-L-Em或Em-L-Ac，其中Ac为可激活凝血因子，L为接头部分，并且Em为增强子部分。在一个实施方案中，接头部分可为肽接头。下面在部分(D)中描述了肽接头的非限制性实例。在另一实施方案中，接头部分为低复杂度多肽，例如XTEN序列。用于嵌合蛋白的接头部分包含至少约5个、至少约10个、至少约20个、至少约30个、至少约40个、至少约50个、至少约60个、至少约70个、至少约80个、至少约90个、至少约100个、至少约110个、至少约120个氨基酸、至少约150个氨基酸、至少约200个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约1000个氨基酸或至少约2000个氨基酸。
另一方面，本发明的嵌合蛋白包含可激活凝血因子、增强子部分和一个或多个异源部分(本文有时表示为Het、Het1或Het2)。异源部分可包含异源多肽部分、非多肽部分或二者。异源多肽部分可选自免疫球蛋白恒定区或其部分、白蛋白或其片段、衍生物或变体、白蛋白结合部分、白蛋白结合小分子、PAS序列、XTEN序列、HAP序列、转铁蛋白或其片段、衍生物或变体或其任何组合。在其它实施方案中，异源部分为免疫球蛋白恒定区或其部分，例如Fc部分。还有其它实施方案中，非多肽部分选自聚乙二醇(PEG)、多聚唾液酸、羟乙基淀粉(HES)、其衍生物或其任何组合。异源部分可连接到活化凝血因子(轻链、重链或二者)的N端或C端或***活化凝血因子(轻链、重链或二者)内两个氨基酸之间或连接到增强部分的N端或C端或***增强部分内两个氨基酸之间。下面在部分(C)中描述了异源部分的实例。
在一些实施方案中，嵌合蛋白包含两个或更多个异源部分。包含两个或更多个异源部分的嵌合蛋白可具有单条多肽链、两条多肽链、三条多肽链或更多。例如，嵌合蛋白可包含式Ac-Het1-Em-Het2、Het2-Em-Het1-Ac、Ac-Em-Het1-Het2、Het2-Het1-Em-Ac、Het1-Het2-Ac-Em、Em-Ac-Het2-Het1、Het1-Em-Het2-Ac、Ac-Het1-Em-Het2、Em-Het2-Ac-Het1、Het1-Ac-Het2-Em、Het2-Ac-Het1-Em和Em-Het1-Ac-Het2表示的单链，其中Ac为可激活凝血因子，Het1为第一异源部分，Em为增强子部分，Het2为第二异源部分，并且(-)为肽键或一个或多个氨基酸。
包含两条多肽链的嵌合蛋白可用式Ac-Het1:Em-Het2、Het1-Ac:Het2-Em、Ac-Het1:Het2-Em或Het1-Ac:Em-Het2表示，其中中Ac为可激活凝血因子，Em为增强子部分，Het1为第一异源部分(例如，第一Fc部分)，Het2为第二异源部分(例如，第二Fc部分)，(-)为肽键或一个或多个氨基酸，并且(:)为两条多肽链(例如，Ac-Het1和Em-Het2)之间的缔合。如本文提出的缔合(:)表示共价键或非共价键，例如至少一个非肽键。在一个实施方案中，缔合即(:)为共价键。在另一实施方案中，缔合即(:)为非共价键，例如离子相互作用、疏水性相互作用、亲水性相互作用、范德华相互作用、氢键。在其它实施方案中，(:)为非肽共价键。还有其它实施方案中，(:)为肽键。还有其它实施方案中，本文提出的式中的(:)表示两个序列之间的物理或化学缔合，但非化学交联，其中第一序列的一部分接近第二序列，以致在激活第一序列和第二序列的任一个或二者后，第一序列和第二序列相互作用。
本文提出的式仅为本发明构建体的非限制性实例。从N端(左)到C端(右)示出了多肽式的定向。例如，式Ac-Het1指式NH2-Ac-Het1-COOH。另外，除非另外指出，(:)可为两条多肽链之间通过第一条链任一部分与第二条链任一部分之间的共价键或非共价键的缔合或相互作用。例如，式Ac-Het1:Em-Het2具有两条多肽链，第一条链为Ac-Het1而第二条链为Em-Het2，其中第一条链中的Ac与第二条链中的Em相互作用或缔合和/或第一条链中的Het1与第二条链中的Het2相互作用或缔合。在一些实施方案中，(:)指共价、非肽键或非共价键。
再一方面，本发明的嵌合蛋白包含可激活凝血因子、增强子部分、一个或多个接头部分和一个或多个异源部分。在一个实施方案中，嵌合蛋白包含可激活凝血因子(Ac)、增强子部分(Em)、一个接头部分(L)和一个异源部分(Het)，其中所述组分相互连接或缔合。可用式Ac-L-Het:Em、Het-L-Ac:Em、Em-L-Het:Ac、Het-L-Em:Ac、Ac-L-Het-Em或Em-Het-L-Ac表示所述嵌合蛋白。在另一实施方案中，嵌合蛋白包含可激活凝血因子(Ac)、增强子部分(Em)、两个接头部分(L1和L2)和一个异源部分(Het)。可用式Ac-L1-Het-L2-Em和Em-L2-Het-L1-Ac表示所述嵌合蛋白。在其它实施方案中，嵌合蛋白包含可激活凝血因子(Ac)、增强子部分(Em)、两个接头部分(L1和L2)和两个异源部分(Het1和Het2)，其中所述组分相互连接或缔合。可用式Ac-L1-Het1:Em-L2-Het2、Het1-L2-Ac:Em-L2-Het2或Het1-L2-Ac:Het2-L2-Em表示所述嵌合蛋白，其中Ac包含、基本上由或由可激活凝血因子组成，L1包含、基本上由或由第一任选接头部分例如第一接头组成，Het1包含、基本上由或由第一异源部分(例如，第一Fc部分)组成，Em包含、基本上由或由增强子部分组成，L2包含、基本上由或由第二任选接头部分例如第二接头组成，Het2包含、基本上由或由第一异源部分(例如，第二Fc部分)组成，(-)包含、基本上由或由肽键或一个或多个氨基酸组成；并且(:)为Ac-L1-Het1与Em-L2-Het2之间的缔合。如本文提出的缔合(:)表示共价键或非共价键，例如至少一个非肽键。在一个实施方案中，缔合即(:)为共价键。在一个特定实施方案中，缔合(:)为Het1和Het2之间的二硫键。在另一实施方案中，缔合即(:)为非共价相互作用，例如离子相互作用、疏水性相互作用、亲水性相互作用、范德华相互作用、氢键。在其它实施方案中，(:)为非肽共价键。还有其它实施方案中，(:)为肽键。还有其它实施方案中，本文提出的式中的(:)表示两个序列之间的物理或化学缔合，但非化学交联，其中第一序列的一部分接近第二序列，以致在激活第一序列和第二序列的任一个或二者后，第一序列和第二序列相互作用。
在某些方面，本发明的嵌合蛋白包含第一条多肽链和第二条多肽链，其中第一条多肽链包含可激活凝血因子而第二条多肽链包含增强子部分，其中第一条多肽链和第二条多肽链相互连接或缔合。嵌合蛋白可进一步包含含第一异源部分Het1(例如，第一Fc部分(例如F1))和第二异源部分Het2(例如，第二Fc部分(例如F2))的二聚体异源部分区域，其中第一异源部分在第一条多肽链中而第二异源部分在第二条多肽链中。例如，嵌合蛋白可包含选自以下的结构：
(a)Ac经由所述接头部分与Het1连接，并且Em与Het2连接；
(b)Ac经由所述第一接头部分与Het1连接，并且Em经由所述第二接头部分与Het2连接；
(c)Ac与Het1连接，并且Em经由所述接头部分与Het2连接；
(d)Ac与Het1连接，并且Em与Het2连接；
(e)Em经由所述接头部分与Het1连接；并且Ac与Het2连接；
(f)Em经由所述第一接头部分与Het1连接，并且Ac经由所述第二接头部分与Het2连接；
(g)Em与Het1连接，并且Ac经由所述接头部分与Het2连接；或，
(h)Em与Het1连接，并且Ac与Het2连接，其中Het1和Het2形成二硫键。
包含两个多肽的嵌合蛋白也可表示如下：
(a)所述第一多肽包含式Ac-L1-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Em-Het2表示的结构；
(b)所述第一多肽包含式Ac-L1-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Em-L2-Het2表示的结构；
(c)所述第一多肽包含式Ac-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Em-L2-Het2表示的结构；
(d)所述第一多肽包含式Ac-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Em-L1-Het2表示的结构；
(e)所述第一多肽包含式Em-L2-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Ac-L1-Het2表示的结构；
(f)所述第一多肽包含式Em-L1-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Ac-Het2表示的结构；
(g)所述第一多肽包含式Em-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Ac-L1-Het2表示的结构；和，
(h)所述第一多肽包含式Em-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Ac-Het2表示的结构；
其中所述两条多肽链的Het1和Het2形成二硫键。
还有其它方面，嵌合蛋白包含可激活凝血因子(Ac)、增强子部分(Em)、三个接头部分(L1、L2和X)和两个异源部分(Het1和Het2)，其中所述组分相互连接。嵌合蛋白可包含选自Ac-Het1-X-Em-Het2或Het2-Em-X-Het1-Ac的式，其中Ac为可激活凝血因子，Het1为第一异源部分，X为scFc接头，Em为增强子部分，并且Het2为第二异源部分。嵌合蛋白也可包含一个或多个接头部分。例如，嵌合蛋白可包含选自Ac-L1-Het1-X-Em-Het2、Ac-Het1-X-Em-L2-Het2、Ac-L1-Het1-X-Em-L2-Het2、Het2-Em-X-Het1-L1-Ac、Het2-L2-Em-X-Het1-Ac或Het2-L2-Em-X-Het1-L1-Ac的式，其中Ac为可激活凝血因子，L1为第一任选接头部分，Het1为第一异源部分，X为scFc接头，Em为增强子部分，L2为第二任选接头部分，并且Het2为第二异源部分。
在一个实施方案中，任一个或两个异源部分(Het1和Het2)为相同或不同的异源多肽部分。在另一实施方案中，Het1和Het2中任一个或两个为非多肽部分。在其它实施方案中，任一个或两个异源部分(Het1和Het2)可为半衰期延长剂。半衰期延长剂的实例包括但不限于免疫球蛋白恒定区或其一部分、白蛋白、转铁蛋白、白蛋白结合部分、PAS序列、HES序列、人绒毛膜***C端肽(CTP)的β亚基、聚乙二醇(PEG)、XTEN序列、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合小分子、血管性血友病因子或其片段、衍生物或变体，或其任何组合。下面在部分(C)中示出了异源部分的实例。
在另一实施方案中，第一和第二异源部分(Het1和Het2)通过肽键或接头(例如，scFc接头(有时也表示为“X”))相互连接或通过共价或非共价键，例如二硫键缔合。例如，scFc接头可连接第一Fc部分和第二Fc部分，从而形成二聚Fc区。scFc接头可进一步包含使得能够在宿主细胞中表达时加工嵌合蛋白的胞内加工位点。下面在部分(C.3)中示出了scFc接头的实例。
下面描述了嵌合蛋白的每种组分。
A.可激活凝血因子
1.凝血因子
具体而言，本发明关于因子VII和X的改良形式。这些因子全部在结构上的相关之处在于，各自轻链的氨基末端不易受并入附加部分影响。类似地，这3种凝血因子重链的氨基酸末端不易受并入附加部分影响，可裂解部分，即经由裂解位点连接的部分或由裂解位点组成的部分除外。基于这些共有性质设计了本发明的嵌合凝血因子构建体并应理解，虽然常常示出因子VII以说明本发明的示例性实施方案，但是可使用因子VII或X产生主题构建体。例如，本领域的技术人员将理解，可用FX部分取代本发明构建体的FVII部分以产生这些凝血因子其中之一的增强形式。
指定用于旁路疗法的凝血因子在呈活化形式给予时有效，因为外源凝血因子常常未经足够动力学活化为有效。然而，它们也可通过内源途径(例如，通过抗凝血酶III或TFPI)快速灭活，导致活性形式清除和短的有效半衰期。为了防止由内源性酶快速灭活和清除，将本发明的嵌合凝血因子构建为“可激活”形式。这种可激活构建体作为半衰期更长的增强型酶原循环，但在必要时，可在凝血部位容易地裂解。
附图中提出了本发明的示例性嵌合凝血因子构建体。用于本发明的嵌合凝血因子呈非活性形式表达，随后呈非活性形式施用，然后在体内施用后激活。因子VII和X的非活性形式为单链酶原。因子VII和X的活性形式由二聚体分子构成，其中重链和轻链通过共价键，例如二硫键连接。
可激活凝血因子包含与蛋白酶裂解位点连接的凝血因子酶原轻链，所述轻链进一步与凝血因子酶原的重链连接。凝血因子酶原的轻链或重链可包括分别保持了凝血因子酶原轻链或重链的功能的片段、变体、衍生物或类似物。
在一个实施方案中，本发明的凝血因子为因子VII的成熟形式或其变体。因子VII(FVII、F7；也称为因子7、凝固因子VII、血清因子VII、血清凝血酶原转化加速因子、SPCA、转化加速因子前体和依他凝血素α)是为凝血级联的一部分的丝氨酸蛋白酶。FVII包括Gla结构域、两个EGF结构域(EGF-1和EGF-2)和丝氨酸蛋白酶结构域(或肽酶S1结构域)，所述丝氨酸蛋白酶结构域在丝氨酸蛋白酶的肽酶S1家族所有成员中高度保守，例如胰凝乳蛋白酶。FVII呈单链酶原(即，可激活FVII)和完全活化双链形式存在。
如本文所使用，术语“FVII蛋白”包括野生型FVII、成熟FVII、全长FVII、FVII的功能片段、其变体或衍生物。示例性FVII变体包括比活性增加的变体，例如通过增加其酶活性(Kcat或Km)增加FVII活性的突变。本领域已经描述了这种变体并且包括(例如)在Persson等2001.PNAS 98:13583；Petrovan and Ruf.2001.J.Biol.Chem.276:6616；Persson等2001J.Biol.Chem.276:29195；Soejima等2001.J.Biol.Chem.276:17229；Soejima等2002.J.Biol.Chem.247:49027中描述的分子的突变形式。在一个实施方案中，FVII的变体形式包括突变。示例性突变包括V158D-E296V-M298Q。在另一实施方案中，FVII的变体形式包括来自胰蛋白酶170-环的氨基酸EASYPGK置换来自FVII成熟序列的氨基酸608-619(LQQSRKVGDSPN，对应170-环)。FIX的高比活性变体在本领域中也已知。例如，Simioni等(2009N.E.Journal of Medicine 361:1671)描述了R338L突变。Chang等(1988JBC 273:12089)和Pierri等(2009HumanGene Therapy 20:479)描述了R338A突变。在本领域中已知其它突变并且包括例如Zogg和Brandstetter.2009Structure 17:1669；Sichler等2003.J.Biol.Chem.278:4121；和Sturzebecher等1997.FEBS Lett 412:295中描述的突变。这些参考文献的内容以引用的方式并入本文。序列表中公开了示例性FVII氨基酸和核苷酸序列，分别作为SEQ ID NO:44和45的一部分。
当裂解FVII酶原或FX酶原的重链的紧靠上游时发生因子VII或因子X激活。例如，当裂解FVII重链第一残基紧靠上游即Ile-153时，激活FVII。
在一个实施方案中，本发明的凝血因子为因子X的成熟形式。因子X是分子量为58.5kDa的维生素K依赖性糖蛋白，其作为酶原从肝细胞分泌到血浆中。最初因子X作为具有总计由488个氨基酸组成的信号肽的前肽原生成。信号肽在输出到内质网期间由信号肽酶裂解掉，在成熟N端链的N端的前11个谷氨酸残基处发生γ羧化后，裂解掉前肽序列。进一步加工步骤通过在Arg182和Ser183之间的裂解发生。该加工步骤还附随导致三肽Arg180-Lys181-Arg182缺失。所得分泌因子X酶原由139个氨基酸(M，16,200)的N端轻链和306个氨基酸(M，42,000)的C端重链组成，其经由Cys172和Cys342之间的二硫桥共价连接。更多翻译后加工步骤包括Asp103的.β.-羟基化以及N-和O-型羰基化。
表1.
应理解，除这些凝血因子的野生(WT)形式或其生物活性部分外，本发明还可采用其具有活性的前体截短形式、等位基因变体和物种变体、剪接变体编码的变体和包括与凝血因子成熟形式具有至少40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的多肽并且保持促进凝块形成的能力的其它变体。例如，可采用保持FVII的至少一种活性，例如FVII的TF结合、因子X结合、磷脂结合和/或促凝血活性的经修饰FVII多肽及其变体。通过保持活性，与野生型凝血因子相比，可改变活性，例如降低或增加，只要保持的活性水平足以产生可检测效应。在所附序列表中找到可用于本发明构建体的凝血因子的示例性序列。
示例性修饰多肽包括但不限于组织特异性同种型及其等位基因变体，通过翻译核酸制备的合成分子，通过化学合成例如包括通过重组方法连接较短多肽的合成法生成的蛋白质，从人类和非人类组织和细胞分离的蛋白质，嵌合多肽及其修饰形式。本凝血因子也可由具有足够长度或包括适当区域以保持全长成熟多肽的至少一种活性(在激活后若需要)的WT分子片段或部分组成。在本领域中已知示例性凝血因子变体。
在一个实施方案中，可激活凝血因子经修饰为缺乏Gla结构域。在因子VII的情况下，Gla结构域存在于轻链的氨基末端并且由氨基酸1-35组成。GLA结构域负责钙离子的高亲和力结合。其从成熟形式的蛋白质N端尽头开始并且以保守芳香族残基结束。在似乎对于羧化酶的底物识别很重要的结构域中部发现保守Gla-x(3)-Gla-x-Cys基序。
使用停流荧光动力学测量结合表面等离子体共振分析，已经发现Gla结构域在FVIIa蛋白酶结构域由此开始与sTF接触的一系列事件中很重要(Biochemical and Biophysical Research Communications.2005.337:1276)。另外，可通过例如肝细胞和清除受体(例如，EPCR)上的Gla相互作用显著介导凝血因子的清除。
因此，Gla结构域负责经由多种途径，例如与肝细胞、清除受体(例如EPCR)等结合，介导凝血因子的清除。因此，消除Gla结构域对凝血因子的半衰期具有有益影响。因子VII的Gla结构域包含不常见的氨基酸_-羧基谷氨酸(Gla)，其在凝血因子与带负电的磷脂表面的结合中起重要作用。
示例性凝血因子为哺乳动物，例如人类来源的凝血因子。在所附序列表中，例如单独地或在嵌合凝血因子构建体的上下文中，呈现了示例性凝血因子的序列。
2.蛋白酶裂解位点
连接凝血因子酶原轻链和凝血因子酶原重链的蛋白酶裂解位点可选自本领域中已知的任何蛋白酶裂解位点。在一个实施方案中，蛋白酶裂解位点由选自因子XIa、因子XIIa、激肽释放酶、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子IIa(凝血酶)或其任何组合的蛋白酶裂解。蛋白酶裂解位点允许在损伤部位裂解凝血因子的轻链和重链并相互解离。示例性FXIa裂解位点包括(例如)KLTR(SEQ ID NO:13)、DFTR(SEQ ID NO:14)、TQSFNDFTR(SEQ ID NO:6)和SVSQTSKLTR(SEQ ID NO:7)。示例性凝血酶裂解位点包括(例如)DFLAEGGGVR(SEQ ID NO:8)、TTKIKPR(SEQ ID NO:9)、LVPRG(SEQID NO:10)和ALRPR(SEQ ID NO:1)。
在一些实施方案中，蛋白酶裂解位点可与胞内加工位点结合进行有效裂解和激活。例如，嵌合蛋白中的可激活凝血因子可包含杂二聚体，杂二聚体包含通过共价键与凝血因子重链缔合的凝血因子轻链，其中凝血因子重链的N端与蛋白酶裂解位点连接。可在凝固部位裂解掉蛋白酶裂解位点，从而激活凝血因子。可通过在凝血因子酶原轻链与连接到凝血因子酶原重链的蛋白酶裂解位点之间***胞内加工位点设计这种构建体。在宿主细胞内表达后，可由胞内加工酶加工(裂解)***其中的胞内加工位点，从而允许形成酶原样杂二聚体。胞内加工酶的实例包括弗林蛋白酶、酵母Kex2、PCSK1(也称为PC1/Pc3)、PCSK2(也称为PC2)、PCSK3(也称为弗林蛋白酶或PACE)、PCSK4(也称为PC4)、PCSK5(也称为PC5或PC6)、PCSK6(也称为PACE4)或PCSK7(也称为PC7/LPC、PC8或SPC7)。在本领域中已知其它加工位点。
3.自切除部分
在某些实施方案中，蛋白酶裂解位点经由自切除部分与凝血因子酶原重链连接。如本文所使用的术语“自切除部分”指能够将两个间隔部分(例如凝血因子重链和蛋白质裂解位点)共价连接在一起成通常稳定的三体分子的双官能化学部分。自切除部分如果与第一部分(例如，蛋白质裂解位点)结合，将自发地和第二部分(例如，凝血因子的重链)分离。
在一些方面，自切除部分包含氨基苄基氨基甲酸酯基团、氨基苄基醚基团或氨基苄基碳酸酯基团。一方面，自切除部分为对氨基苄基氨基甲酸酯(PABC)。
对氨基苄基氨基甲酸酯(PABC)是用于自切除定点前药激活最有效且最普遍的连接体连接(见，例如，Carl等J.Med.Chem.24:479-480(1981)；WO1981/001145；Rautio等，Nature Reviews Drug Discovery 7:255-270(2008)；Simplicio等，Molecules 13:519-547(2008)；)。PABC允许在受蛋白酶裂解和1,6自发片段化后释放任何胺类药物、肽和蛋白质。
氨基苄基的芳香环可任选地在芳香环上经一个或多个(例如，R1和/或R2)取代基取代，所述取代基置换另外附于形成所述环的4个非取代碳之一的氢。如本文所使用，符号“Rx”(例如，R1、R2、R3、R4)是表示如本文所述的取代基的缩写。
取代基可提高对氨基苄基的自切除能力(Hay等，J.Chem Soc.,Perkin Trans.1:2759-2770(1999)；还见Sykes等J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1:1601-1608(2000))。
下式示出了对氨基苄基自切除接头的一般拓扑学及示例性蛋白酶裂解位点(Aa1Aa2Aa3Aa4)和凝血因子(POI)重链的相对位置。所述式指出了R取代基(R1、R2、R3)的可能位置。
选择可为单原子(例如，卤素)或多原子基团(例如，甲基)的取代基以便影响氨基苄基或其分解产物的稳定性。从所述环吸电子可用于促进氨基苄基在氨基苄基的氨基与相邻肽键之间的键裂解后，从药物上自发分解。示例性芳族基团R1、R2或R3取代基包括(例如)F、Cl、I、Br、OH、甲基、甲氧基、NO2、NH2、NO3+、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3、烷基、卤代烷基、C1-C8卤代烷、羧酸酯、硫酸酯、,氨基磺酸酯、磺酸酯等(见，例如，美国专利No.7,091,186和7,659,241)。对氨基苄基接头可包含与目标肽或蛋白质的氨基末端连接的杂原子Z。如本文所使用，术语杂原子包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)、硼(B)和磷(P)。在一个实施方案中，Z中的杂原子为O、S或N。
在一些实施方案中，对氨基苄基环中4个非取代碳中仅一个经取代。在其它一些实施方案中，对氨基苄基环中4个非取代碳中有两个经取代。在其它实施方案中，对氨基苄基环中4个非取代碳中有三个经取代。在一些实施方案中，对氨基苄基环中4个非取代碳经取代。
自切除式消除可经由1,4消除、1,6消除(例如，PABC)、1,8消除(例如，对氨基-肉桂醇)、环化消除(例如，4-氨基丁醇酯和乙二胺)等进行。在一些方面，自切除部分可包含(例如)肉桂基、萘基或联苯基(见，例如，Blencowe等Polym.Chem.2:773-790(2011))。在一些方面，自切除部分包含杂环(见，例如，美国专利No.7,375,078；7,754,681)。在本领域中已知在含水和生理条件下自切除的许多同芳香性(见，例如，Carl等J.Med.Chem.24:479(1981)；Senter等J.Org.Chem.55:2975(1990)；Taylor等J.Org.Chem.43:1197(1978)；Andrianomenjanahary等Bioorg.Med.Chem.Lett.2:1903(1992))和基于香豆素(见，例如，Weinstein等Chem.Commun.46:553(2010))、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、异噁唑、吡咯、吡唑(见，例如，Hay等J.Med.Chem.46:5533(2003))、吡啶(见，例如，Perry-Feigenbaum等Org.Biomol.Chem.7:4825(2009))、咪唑酮(见，例如，Nailor等Bioorg.Med.Chem.Lett.Z:1267(1999)；Hay和Denny，Tetrahedron Lett.38:8425(1997))和***(见，例如，Bertrand和Gesson，J.Org.Chem.72:3596(2007))的杂芳香基团。还见，美国专利No.7,691,962、7,091,186；美国专利公布No.US2006/0269480、US2010/0092496、US2010/0145036、US2003/0130189、US2005/0256030。
用从左到右书写的其传统化学式表示自切除接头中的取代基时，它们同样涵盖从右到左书写结构产生的化学性质相同的取代基。例如，“-CH2O-”也旨在叙述“-OCH2-”。自切除接头中的取代基，例如以上所讨论的对氨基苄基自切除接头中的R1和/或R2取代基，可包括(例如)烷基、亚烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳基烷基、芳氧基、杂芳基等。当本公开的化合物包括一个以上取代基时，则独立地选择每个取代基。
B.增强子部分(Em)
本发明提供了改进或增强型可激活凝血因子，以致通过使可激活凝血因子与“增强子部分”融合，与未与增强子部分融合的可激活凝血因子相比，本发明的可激活凝血因子的性质改善。改善的性质包括凝血因子的促凝血活性。促凝血活性的增强是相对于游离或未融合可激活凝血因子。增强子部分可为具有增强凝血因子促凝血活性的能力的任何分子。用于本发明的增强子部分可与可激活凝血因子有物理相互作用，并且物理相互作用可诱导促凝血活性增强。
本发明的嵌合蛋白可包含一个或一个以上增强子部分。另外，两个或更多个增强子部分可相互(例如，经由接头)串联连接，并且串联阵列与本发明的构建体可操作地连接。当本发明的嵌合凝血因子中存在两个或更多个增强子部分时，所述部分可能相同或不同。
在一个实施方案中，增强子部分位于因子VII或因子X重链的C端。在另一实施方案中，增强子部分位于因子VII或因子X轻链的N端。在其它实施方案中，增强子部分位于因子VII或因子X轻链的C端。在采用Fc结构域或其部分的实施方案中，增强子部分可能位于第二Fc部分的N或C端，或任一个或两个Fc部分的C端。
在一个实施方案中，增强子部分未直接与构建体基因融合，而是经由接头或化学键与构建体连接。例如，可通过在增强子部分和构建体的Fc部分之间形成键，使增强子部分附于本发明的构建体上，其中增强子部分包含第一官能团并且Fc部分包含第二官能团，并且其中第一和第二官能团能够相互反应形成化学键(见，例如，美国专利7381408)。
在某些实施方案中，本发明的增强子部分可为凝血通路蛋白(例如，辅因子)、促凝血肽或抗原结合分子。在本实施例和图中存在增强子部分的实例。用作增强子部分的其它分子可由本领域的技术人员基于本文的教导容易地选择。
1.凝血辅因子
对嵌合蛋白有用的增强子部分可为凝血辅因子。如本文所使用，“凝血辅因子”指与另一凝血因子，例如因子VII或因子X形成复合物，并且变成具有促凝血活性的活化复合物的凝血因子。例如，FVII的凝血辅因子为组织因子，其形成TF-FVIIa复合物。FX的凝血辅因子为FVa，其形成凝血酶原酶复合物并从而将凝血酶原活化为凝血酶。
在一个实施方案中，凝血因子酶原为FVII蛋白，并且凝血辅因子为组织因子(TF)多肽。组织因子通过与循环因子VII或VIIa形成复合物引发凝血。[TF:VIIa]复合物通过特异性受限蛋白水解激活因子IX或X。TF通过引发细胞表面组装和凝固蛋白酶级联的散播在正常止血中起作用。TF也称为凝固因子III、促凝血酶原激酶、CD142和F3。全长组织因子多肽在UniProtKB条目中具有入藏号P13726-1并且由信号肽(氨基酸1-32)、胞外结构域(氨基酸33-251)、跨膜结构域(氨基酸252-274)和胞质结构域(氨基酸275-295)组成，总共295个氨基酸。本文将组织因子的核苷酸和氨基酸序列分别表示为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:15。入藏号P13726-1(No.P13726-2)的同种型含有氨基酸199-238取代：TAKTNTNEFL...TVNRKSTDSP→YSTSLELWYL...WGRAGRRTPH和氨基酸239-295缺失。人类组织因子的变体包括但不限于具有下列突变的多肽：T36A、I145V、R163W或G281E。还包括来自不同物种，例如小鼠、大鼠、猴子、狗、果蝇或猪的PCSK1。如本文所使用，组织因子多肽指包含组织因子的可溶性胞外域(sTF)(大致为氨基酸33-251)或其功能变体、片段、类似物或衍生物的多肽。sTF缺乏跨膜结构域和胞质结构域。Spicer等Proc.Natl.Acad.Sci,USA,84,5148-5152(1987)中公开了成熟人类组织因子的全长序列。
表2.组织因子序列
用于本发明的组织因子多肽包含与SEQ ID NO:15的氨基酸33-251(sTF)至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列能够与FVII或FVIIa形成复合物。如本文所使用，术语“TF蛋白”包括全长TF、其功能片段(例如，胞外结构域)、变体、类似物或衍生物。如本文所使用，术语“可溶性TF”包括保持了TF整个胞外结构域的一种或多种活性的任何功能片段、变体、类似物或衍生物。在一个实施方案中，可溶性TF(及其功能片段、变体、类似物或衍生物)能够与FVII结合。在另一实施方案中，可溶性TF可用作FVII的凝血辅因子。
在另一实施方案中，凝血因子酶原为FX蛋白，并且凝血辅因子为FVa蛋白。FVa蛋白用作导致凝血酶原活化为凝血酶的因子Xa的凝血酶原酶活性的关键辅因子。因子Va，因子V的活化形式，由非共价结合的重链和轻链构成。两条链间的相互作用依赖钙。因子V也称为凝固因子V、活化蛋白C辅因子、促凝血球蛋白原和易变因子并且可裂解为两条链，重链和轻链。全长因子V多肽在UniProtKB条目中具有入藏号P12259并且由信号肽(氨基酸1-28)、重链(氨基酸29-737)、活化肽(也称为连接区，氨基酸734-1573)和轻链(氨基酸1574-2224)组成。本文将FV的核苷酸和氨基酸序列分别表示为SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:17。人类因子V的变体包括但不限于具有下列突变的多肽：G15S、D107H、R334G、R334T、I387T、M413T、R513K、R534Q、C613R、S775A、S781R、P809S、N817T、K858R、H865R、T915S、K925E、N969S、R980L、H1146Q、L1285I、H1327R、L1397F、P1404S、E1530A、T1685S、Y1730C、L1749V、M1764V、M1820I、R2102C、R2102H、M2148T、K2185R或D2222G。还包括来自不同物种，例如小鼠、大鼠、猴子、狗、果蝇或猪的因子V蛋白。
表3.因子V序列
用于本发明的因子FVa蛋白包含含重链和轻链的杂二聚体，其中重链包含与SEQ ID NO:17的氨基酸29-737至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的第一氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:18的氨基酸1574-2224至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的第二氨基酸序列，其中第一氨基酸序列和第二氨基酸序列在形成杂二聚体时能够与FX或FXa形成复合物。如本文所使用的FVa蛋白包括全长FVa、成熟FVa、其功能片段、变体、类似物或衍生物。
2.促凝血肽
在其它实施方案中，增强子部分为促凝血肽。“促凝血肽”是具有促凝血活性，可用于治疗出血素质(例如，凝血障碍/凝血病，例如血友病)或用于治疗缺乏FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI和vWF中至少一种的低分子量化合物(例如，肽或肽衍生物)。在一些实施方案中，当促凝血肽用作增强子部分时，其能够增加与之融合的凝血因子的催化活性。
在一个实施方案中，促凝血肽包含化合物，化合物包括：
(a)包括式II的氨基酸序列：
C1LASYC2   (式II)
或(b)(a)的氨基酸序列的逆向、反向或逆-反向变体。本公开进一步提供了以上化合物的药学上可接受的盐。
式II中，C1和C2为具有侧链的氨基酸，其中C1和C2的侧链连接形成环。在一个实例中，C1和C2的侧链共价连接(例如，经由二硫键或酰胺键)。
式II中，可在C1和C2之间的任何地方***一个、两个或三个附加氨基酸。在根据以上任一实施方案的一个实例中，向式(I)中C1和C2之间的任何地方任选***一个或两个附加氨基酸。在另一实例中，向式II中C1和C2之间的任何地方任选***一个氨基酸。在另一实例中，在C1和C2之间未***氨基酸。
式II中，L为L-亮氨酸，A为L-丙氨酸，S为L-丝氨酸，并且Y为L-酪氨酸。式II中，L、A、S和Y中的一个、两个或三个任选地经独立选择的置换氨基酸置换。在一个实例中，L、A、S和Y中的一个或两个任选地经独立选择的置换氨基酸置换。在另一实例中，L、A、S和Y中唯一一个任选地经独立选择的置换氨基酸置换。
在另一实施方案中，嵌合蛋白中的增强子部分包含含有式III的肽的化合物：
或其逆向、反向或逆-反向变体。
式III中，R1、R2、R3和R4为独立地选自氨基酸侧链的成员。式III中，L1和L2为独立地选自直链或支链亚烷基和直链或支链杂亚烷基的接头基团。
式III中，Z为连接部分。在一个实例中，Z选自氨基酸、酰胺基团、二硫化物基团、联硒化物基团、-S-Se-基团、亚烷基(例如(C2-C4)亚烷基)、烯基(例如，(C2-C4)烯基)、炔基(例如，(C2-C4)炔基)、环烷基(例如，含有1-4个双键的(C3-C8)环烷基)、杂环烷基(例如，包含1-6个选自O、S和N的杂原子的3-8元杂环)、芳基(例如，(C3-C7)芳基)和杂芳基(例如，包含1-6个选自O、S和N的杂原子的3-8元杂芳基)。
示例性合成促凝血肽包括，例如：
KLTCLASYCWLF                          (SEQ ID NO：19)；
RRAPGKLTCLASYCWLFWTGIA               (SEQ ID NO：20)；
RRAPGKLQCLASYCWLFWTGIA                (SEQ ID NO：21)；
PRIRTVGPGSRSASGKLTCLASYCWLFWTGIA      (SEQ ID NO：22)；
SKQGRPISPDRRAAGKLTCLASYCWLFWTGIA      (SEQ ID NO：23)；
PRIRTVGPGSRSASGKSTCLASYCWLFWTGIA     (SEQ ID NO：24)；
SRIRTVSPGSRSASGKSTCLASYCWLFWTGIA      (SEQ ID NO：25)；或
PRSRTVGPGSRSASGKSTCLASYCWLFWIGIA      (SEQ ID NO：26)；。
另外在U.S.61/495,818、U.S.61/600,237、U.S.61/605,540、U.S.61/496,540、U.S.61/496,543、U.S.61/496,544、U.S.61/496,541和U.S.61/496,542中公开了示例性促凝血肽，其各自以引用的方式整体并入本文。
3.抗体或抗原结合位点
在其它实施方案中，增强子部分包含至少一个抗原结合部分(例如，抗体的抗原结合位点、抗体变体或抗体片段)、配体的受体结合部分或受体的配体结合部分。在Andersen LM等，J Biol Chem.287:8994-9001(Jan.2012)中公开了可用作增强子部分的示例性抗原结合分子，其以引用的方式整体并入本文，其公开了用于增加FVIIa的促凝血活性和治疗凝血障碍例如血友病A和出血素质的FVII活化抗体和抗体衍生物。
术语“抗原结合部分”指结合抗原或与完整抗体(即，其所来源的完整抗体)竞争抗原结合(即，特异性结合)的免疫球蛋白多肽片段、抗体或抗体变体。抗原结合部分可通过本领域众所周知的重组或生物化学方法产生。示例性抗原结合部分包括Fv、Fab、Fab’和(Fab’)2以及scFv分子。
在其它实施方案中，本发明的嵌合凝血因子可包含含来自于单链结合分子(例如，单链可变区或scFv)的结合位点的增强子部分。描述用于生成单链抗体的技术(美国专利No.4,694,778；Bird，Science 242:423-442(1988)；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Ward等，Nature 334:544-554(1989))可适于生成单链结合分子。通过经由氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段产生单链抗体，形成单链抗体。也可使用在大肠杆菌中组装功能Fv片段的技术(Skerra等，Science 242:1038-1041(1988))。
在某些实施方案中，本发明的嵌合凝血因子可包含含一个或多个结合位点或区域的增强子部分，所述结合位点或区域包含或由单链可变区序列组成(scFv)。单链可变区序列包含具有一个或多个抗原结合位点，例如通过柔性接头与VH结构域连接的VL结构域的单一多肽。可按VH-接头-VL方向或VL-接头-VH方向构建ScFv分子。连接构成抗原结合位点的VL和VH结构域的柔性接头优选包含约10至约50个氨基酸残基。在一个实施方案中，肽接头为gly-ser肽接头。示例性gly/ser肽接头具有式(Gly4Ser)n，其中n为正整数(例如，1、2、3、4、5或6)。在本领域中已知其它肽接头。具有单链可变区序列的抗体(例如单链Fv抗体)和制备所述单链抗体的方法在本领域中众所周知(见例如，Ho等1989.Gene 77:51；Bird等1988Science 242:423；Pantoliano等1991.Biochemistry 30:10117；Milenic等1991.Cancer Research 51:6363；Takkinen等1991.Protein Engineering 4:837)。
在某些实施方案中，在本发明的嵌合凝血因子中采用的scFv分子为稳定scFv分子。在一个实施方案中，稳定cFv分子可包含***VH结构域和VL结构域之间的scFv接头，其中VH和VL结构域通过VH结构域中的氨基酸与VL结构域中的氨基酸之间的二硫键连接。在其它实施方案中，稳定scFv分子可包含具有最佳长度或组成的scFv接头。还有其它实施方案中，稳定scFv分子可包含具有至少一个稳定化氨基酸取代的VH或VL结构域。还有其它实施方案中，稳定scFv分子可具有以上所列至少两种稳定化特征。
稳定scFv分子具有更高的蛋白质稳定性或赋予与之可操作性连接的多肽更高的蛋白质稳定性。与常规多肽相比，本发明的优选scFv接头使本发明嵌合凝血因子的热稳定性提高至少约2℃或3℃。例如，可在本发明的scFv分子之间做比较。在某些实施方案中，稳定scFv分子包含连接VH氨基酸44和VL氨基酸100的(Gly4Ser)4scFv接头和二硫键。在2006年12月8日提交的美国临时专利申请No.60/873,996或2007年3月19日提交的美国专利申请No.11/725,970中公开了可在本发明的嵌合凝血因子中采用的其它示例性稳定scFv分子，其各自以引用的方式整体并入本文。
本发明的嵌合凝血因子可包含使用本领域公认的方法从抗体得到的可变区或其部分(例如，VL和/或VH结构域)。例如，可用抗原或其片段使哺乳动物免疫，从在非人类哺乳动物，例如鼠、豚鼠、灵长类动物、兔子或大鼠中生成的抗体得到可变结构域。见Harlow和Lane，同上，以引用的方式并入用于所有目的。可通过多次皮下或腹膜内注射相关抗原(例如，纯化肿瘤相关抗原或包含此类抗原的细胞或细胞提取物)和佐剂生成免疫球蛋白。这种免疫球蛋白通常引起免疫反应，包括由活化脾细胞或淋巴细胞生成抗原反应性抗体。
虽然可由从免疫动物的血清收获的多克隆抗体得到可变区，但是常常可取的是从脾脏、***或外周血液分离单独淋巴细胞以提供从中得到所需可变区的单克隆抗体(MAb)的同源制剂。兔子或豚鼠通常用于制备多克隆抗体。小鼠通常用于制备单克隆抗体。可通过向小鼠注射抗体片段，制备“杂交瘤”并筛选杂交瘤与抗原特异性结合的抗体，制备单克隆抗体。在这种众所周知的工艺中(Kohler等，(1975),Nature,256:495)，来自已经注射了抗原的小鼠的相对寿命较短或必死的淋巴细胞与永生肿瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)融合，从而产生杂交细胞或“杂交瘤”，二者均永生并且能够生成由B细胞基因编码的抗体。通过选择、稀释和再生长将所得杂种分成单一遗传品系，每个单独品系包含用于形成单一抗体的特定基因。它们生成对所需抗原同源，并且根据其纯遗传血统，称为“单克隆”的抗体。
接种这样制备的杂交瘤细胞并使其在优选含有抑制未融合、亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质的适合培养基中生长。本领域的技术人员将认识到，用于杂交瘤的形成、选择和生长的试剂、细胞系和培养基可从许多来源购买获得并且确立了标准化规程。通常，测定杂交瘤生长的培养基，抗所需抗原的单克隆抗体的生成。优选地，通过免疫沉淀反应或体外测定法，例如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。鉴定杂交瘤细胞生成所需特异性、亲和力和/或活性的抗体后，可通过限制稀释程序亚克隆所述克隆并且通过标准方法培育(Goding，Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，第59-103页(Academic Press,1986))。将进一步认识到，可通过传统纯化程序，例如亲和色谱法(例如，蛋白质-A、蛋白质-G或蛋白质-L亲和色谱法)、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳或透析，从培养基、腹水或血清中分离亚克隆分泌的单克隆抗体。
可使用以上描述的用于分离恒定区结构域序列的任何传统程序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡聚核苷酸探针)，容易地分离编码所需单克隆抗体或其结合位点的DNA并且测序。经分离并亚克隆的杂交瘤细胞用作这种DNA的优选来源。更特别地，分离的DNA(如本文所述可以是合成的)可用于克隆所需可变区序列，以并入本发明的嵌合凝血因子中。
在其它实施方案中，结合位点源自全人源性抗体。在不能够生成内源性免疫球蛋白的转基因动物(例如，小鼠)体内，可生成人源或大体上人源性抗体(见例如，美国专利No.6,075,181、5,939,598、5,591,669和5,589,369，其各自以引用的方式并入本文)。例如，已经描述嵌合和种系突变小鼠中的抗体重链接合区的纯合缺失导致完全抑制内源性抗体生成。将人免疫球蛋白基因阵列转移到这种种系突变小鼠将导致在抗原激发后生成人源性抗体。在以引用的方式并入本文的美国专利No.5,811,524中公开了使用SCID小鼠生成人源性抗体的另一种优选方式。将认识到，也可如本文所述分离和操纵与这些人源性抗体相关的遗传物质。
在其它方面，本发明的多肽可包含源自抗体修饰形式的抗原结合位点或其部分。这种示例性形式包括(例如)微型抗体、双链抗体、三链抗体、纳米抗体、骆驼科抗体、Dab、四价抗体、胞内双功能抗体(例如，Jendreyko等2003.J.Biol.Chem.278:47813)、融合蛋白(例如，抗体细胞因子融合蛋白，与Fc受体的至少一部分融合的蛋白质)和双特异性抗体。例如，在美国专利No.4,745,055；EP 256,654；Faulkner等，Nature 298:286(1982)；EP 120,694；EP 125,023；Morrison，J.Immun.123:793(1979)；Kohler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:2197(1980)；Raso等，Cancer Res.41:2073(1981)；Morrison等，Ann.Rev.Immunol.2:239(1984)；Morrison,Science 229:1202(1985)；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851(1984)；EP 255,694；EP 266,663；和WO 88/03559中描述了其它修饰抗体。还已知重配免疫球蛋白链。见，例如，美国专利No.4,444,878、WO 88/03565和EP 68,763及其中引用的参考文献。
在另一实施方案中，本发明的嵌合凝血因子包含抗原结合位点或为双链抗体或从中得到的抗原结合位点的区域。双链抗体为二聚、四价分子，各自具有与scFv分子相似的多肽，但是通常具有连接两个可变结构域的较短(例如，小于10个并且优选为1-5个)氨基酸残基接头，以致同一条多肽链上的VL和VH结构域不能相互作用。相反，一条多肽链的VL和VH结构域与第二条多肽链上的VL和VH结构域(分别)相互作用(见，例如，WO 02/02781)。在一个实施方案中，本发明的嵌合凝血因子包含与至少一个基因融合Fc区(即，scFc区)的N端和/或C端可操作性连接的双链抗体。
在某些实施方案中，本发明的嵌合凝血因子包含作为增强子部分的单域结合分子(例如，单域抗体)。示例性单域分子包括分离的抗体重链可变结构域(VH)，即重链可变结构域，无轻链可变结构域，和分离的抗体轻链可变结构域(VL)，即轻链可变结构域，无重链可变结构域。在本发明的结合分子中采用的示例性单域抗体包括(例如)如Hamers-Casterman等，Nature 363:446-448(1993)和Dumoulin等，Protein Science 11:500-515(2002)中描述的骆驼科重链可变结构域(约118-136个氨基酸残基)。其它示例性单域抗体包括单个VH或VL结构域，也称为(Domantis Ltd.,Cambridge,UK)。还有其它单域抗体包括鲨鱼抗体(例如，鲨鱼Ig-NAR)。鲨鱼Ig-NAR包含一个可变结构域(V-NAR)和5个C样恒定结构域(C-NAR)的同型二聚体，其中多样性集中在长度从5个至23个残基变化的延长CDR3区。在骆驼科物种(例如，羊驼)中，称为VHH的重链可变区形成整个抗原结合结构域。骆驼科VHH可变区与源自常规抗体的可变区(VH)之间的主要差异包括(a)与VHH中的相应区域相比，VH轻链接触表面上有更多疏水性氨基酸，(b)VHH中的CDR3更长，和(c)VHH中CDR1和CDR3之间频繁出现二硫键。在美国专利No 6.005,079和6,765,087中描述了获得单域结合分子的方法，两个专利以引用的方式并入本文。包含VHH结构域的示例性单域抗体包括(Ablynx NV,Ghent,Belgium)。
C.异源部分(例如，Het1、Het2、…、Hetn)
本发明的一些实施方案包含一个或多个异源部分(本文表示为“Het1”或“Het2”)。在其它实施方案中，本发明的嵌合蛋白可包含两个异源部分(“Het1”和“Het2”)。还有其它实施方案中，本发明的嵌合蛋白可包含两个以上异源部分，例如3、4、5个或5个以上异源部分。在一些实施方案中，所有异源部分均相同。在一些实施方案中，至少一个异源部分与其它异源部分不同。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白可包含2、3个或3个以上串联的异源部分。在其它实施方案中，本发明的嵌合蛋白可包含2、3个或3个以上异源部分，其中在两个异源部分之间***至少一个附加部分(例如，可激活凝血因子、接头部分、蛋白酶裂解位点、自切除部分、增强子部分或其组合)。
异源部分可包含异源多肽部分或异源非多肽部分或二者。在一个特定实施方案中，Het1为第一异源部分，例如本领域中已知的半衰期延长分子。在一些实施方案中，Het2为第二异源部分，其也可以是本领域中已知的半衰期延长分子。在一些方面，所述异源部分包含异源多肽和异源非多肽部分的组合。
在某些实施方案中，第一异源部分(例如，第一Fc部分)和第二异源部分(例如，第二Fc部分)相互缔合形成二聚体。在一个实施方案中，第二异源部分为第二Fc部分，其中第二Fc部分与第一异源部分(例如，第一Fc部分)连接或缔合。例如，第二异源部分(例如，第二Fc部分)可通过接头与第一异源部分(例如，第一Fc部分)连接或通过共价或非共价键与第一异源部分缔合。
在一些实施方案中，Het1和Het2异源部分是在并入本发明的嵌合蛋白中时具有与体内半衰期延长相关的非结构化或结构化特征的肽和多肽。非限制性实例包括白蛋白、白蛋白片段、免疫球蛋白Fc片段、人绒毛膜***C端肽(CTP)的β亚基、HAP序列、XTEN序列、转铁蛋白或其片段、PAS多肽、多聚甘氨酸接头、多聚丝氨酸接头、白蛋白结合部分或这些多肽的任何片段、衍生物、变体或组合。在其它相关方面，异源部分可包括非多肽部分例如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、多聚唾液酸或这些成分的任何衍生物、变体或组合的附着位点(例如，半胱氨酸氨基酸)。在一些方面，由半胱氨酸氨基酸组成的异源部分起非多肽部分例如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、多聚唾液酸或这些成分的任何衍生物、变体或组合的附着位点的作用。
在一些实施方案中，异源部分为包含、基本上由或由至少约10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000或4000个氨基酸组成的多肽。在其它实施方案中，异源部分为包含、基本上由或由约100至约200个氨基酸、约200至约300个氨基酸、约300至约400个氨基酸、约400至约500个氨基酸、约500至约600个氨基酸、约600至约700个氨基酸、约700至约800个氨基酸、约800至约900个氨基酸或约900至约1000个氨基酸组成的多肽。
在某些实施方案中，异源部分改善了嵌合蛋白的一种或多种药代动力学性质，未显著影响可激活凝血因子和/或增强子部分的生物活性或功能(例如，凝血因子或其片段的促凝血活性或增强子部分的活性增强性质)。
在某些实施方案中，异源部分增加了本发明凝血因子的体内和/或体外半衰期。在其它实施方案中，异源部分促进本发明凝血因子或其片段(例如，可激活凝血因子蛋白水解后，包含异源部分的片段)的可视化或定位。本发明嵌合蛋白或其片段的可视化和/或定位可在体内、体外、活体外或其组合。
在其它实施方案中，异源部分增加了本发明嵌合蛋白或其片段(例如，可激活凝血因子蛋白水解后，包含异源部分的片段)的稳定性。如本文所使用，术语“稳定性”指本领域公认对响应于环境条件(例如，温度升高或降低)，可激活凝血因子的一种或多种物理性质的维持的度量。在某些方面，物理性质可以是嵌合蛋白共价结构的维持(例如，没有蛋白水解裂解、不必要的氧化或脱酰胺作用)。在其它方面，物理性质也可以是呈恰当折叠状态的嵌合蛋白(例如，没有可溶性或不溶性聚集物或沉淀物)的存在。一方面，通过测定嵌合蛋白的生物物理性质，例如热稳定性、pH解折叠谱、糖基化的稳定去除、溶解性、生物化学功能(例如，与蛋白质、受体或配体结合的能力)等和/或其组合，测量嵌合蛋白的稳定性。另一方面，通过相互作用的结合亲和力证明生物化学功能。一方面，蛋白质稳定性的度量为热稳定性，即对热激发的抗性。可使用本领域已知的方法测量稳定性，例如HPLC(高效液相色谱法)、SEC(尺寸排阻色谱法)、DLS(动态光散射)等。测量热稳定性的方法包括但不限于差示扫描量热法(DSC)、差示扫描荧光测定法(DSF)、圆二色光谱法(CD)和热激发测定法。
在某些方面，本发明的嵌合蛋白包含至少一个半衰期延长剂，即相对于没有这种异源部分的相应嵌合蛋白的体内半衰期，增加了所述嵌合蛋白的体内半衰期的异源部分。可通过本领域技术人员已知的任何方法，例如活性测定法(显色测定法或一段式凝血aPTT测定法)、ELISA等测定嵌合蛋白的体内半衰期。
在一些实施方案中，一个或多个半衰期延长剂的存在导致与没有一个或多个这种半衰期延长剂的相应蛋白质相比，所述嵌合蛋白的半衰期增加。包含半衰期延长剂的嵌合蛋白的半衰期比没有这种半衰期延长剂的相应嵌合蛋白的体内半衰期长至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍或至少约12倍。
在一个实施方案中，包含半衰期延长剂的嵌合蛋白的半衰期比没有这种半衰期延长剂的相应蛋白质的体内半衰期长约1.5倍至约20倍，约1.5倍至约15倍或约1.5倍至约10倍。在另一实施方案中，与没有这种半衰期延长剂的相应蛋白质的体内半衰期相比，包含半衰期延长剂的嵌合蛋白的半衰期延长约2倍至约10倍，约2倍至约9倍，约2倍至约8倍，约2倍至约7倍，约2倍至约6倍，约2倍至约5倍，约2倍至约4倍，约2倍至约3倍，约2.5倍至约10倍，约2.5倍至约9倍，约2.5倍至约8倍，约2.5倍至约7倍，约2.5倍至约6倍，约2.5倍至约5倍，约2.5倍至约4倍，约2.5倍至约3倍，约3倍至约10倍，约3倍至约9倍，约3倍至约8倍，约3倍至约7倍，约3倍至约6倍，约3倍至约5倍，约3倍至约4倍，约4倍至约6倍，约5倍至约7倍或约6倍至约8倍。
在其它实施方案中，包含半衰期延长剂的嵌合蛋白的半衰期为至少约17小时、至少约18小时、至少约19小时、至少约20小时、至少约21小时、至少约22小时、至少约23小时、至少约24小时、至少约25小时、至少约26小时、至少约27小时、至少约28小时、至少约29小时、至少约30小时、至少约31小时、至少约32小时、至少约33小时、至少约34小时、至少约35小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约60小时、至少约72小时、至少约84小时、至少约96小时或至少约108小时。
还有其它实施方案中，包含半衰期延长剂的嵌合蛋白的半衰期为约15小时至约2周、约16小时至约1周、约17小时至约1周、约18小时至约1周、约19小时至约1周、约20小时至约1周、约21小时至约1周、约22小时至约1周、约23小时至约1周、约24小时至约1周、约36小时至约1周、约48小时至约1周、约60小时至约1周、约24小时至约6天、约24小时至约5天、约24小时至约4天、约24小时至约3天或约24小时至约2天。
在一些实施方案中，每位受试者包含半衰期延长剂的嵌合蛋白的平均半衰期为约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约25小时(1天)、约26小时、约27小时、约28小时、约29小时、约30小时、约31小时、约32小时、约33小时、约34小时、约35小时、约36小时、约40小时、约44小时、约48小时(2天)、约54小时、约60小时、约72小时(3天)、约84小时、约96小时(4天)、约108小时、约120小时(5天)、约6天、约7天(1周)、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天。
1.免疫球蛋白恒定区或其部分
另一方面，异源部分包含一个或多个免疫球蛋白恒定区或其一部分(例如，Fc部分)。在一个实施方案中，嵌合蛋白包含可激活凝血因子、增强子部分和至少两个异源部分，第一异源部分包含与可激活凝血因子连接的第一免疫球蛋白恒定区或其一部分(例如，第一Fc部分)并且第二异源部分包含与增强子部分连接的第二免疫球蛋白恒定区或其一部分(例如，第二Fc部分)。第一免疫球蛋白恒定区或其一部分和第二免疫球蛋白恒定区或其一部分可形成共价键(例如，二硫键)，从而使可激活凝血因子和增强子部分靠近以允许活化凝血因子和增强子部分之间在损伤部位的相互作用。
免疫球蛋白恒定区由结构域，指定CH(恒定重链)结构域(CH1、CH2等)构成。根据同型(即IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)，恒定区可由3或4个CH结构域构成。一些同型(例如IgG)恒定区还含有铰链区。见Janeway等2001,Immunobiology,Garland Publishing,N.Y.,N.Y.。
用于生成本发明嵌合蛋白的免疫球蛋白恒定区或其一部分可从许多不同来源得到。在一个实施方案中，免疫球蛋白恒定区或其一部分源自人免疫球蛋白。然而，应理解免疫球蛋白恒定区或其一部分可源自另一哺乳动物物种，包括例如啮齿动物(例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠)或非人灵长类动物(例如黑猩猩、猕猴)物种的免疫球蛋白。而且，免疫球蛋白恒定区或其一部分可源自任何免疫球蛋白类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和任何免疫球蛋白同型，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在一个实施方案中，使用人类同型IgG1。
多种免疫球蛋白恒定区基因序列(例如人恒定区基因序列)呈可公开获取的存储形式可用。可选择具有特定效应子功能(或没有特定效应子功能)或具有降低免疫原性的特定修饰的恒定区结构域序列。已经公开了抗体和抗体编码基因的许多序列并且可使用本领域公认的技术由这些序列得到适合的Ig恒定区序列(例如铰链、CH2和/或CH3序列或其部分)。然后可改变或合成使用前述任何方法获得的遗传物质以获得本发明的多肽。将进一步认识到，本发明的范围涵盖恒定区DNA序列的等位基因、变体和突变。
例如，可使用聚合酶链式反应和选择用于扩增目标结构域的引物克隆免疫球蛋白恒定区或其一部分的序列。为克隆来自抗体的免疫球蛋白恒定区或其一部分的序列，可从杂交瘤、脾脏或淋巴细胞分离mRNA，反转录成DNA，并且通过PCR扩增抗体基因。在美国专利No.4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；和例如在“PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications”Innis等编辑，Academic Press,San Diego,CA(1990)；Ho等1989.Gene 77:51；Horton等1993.Methods Enzymol.217:270)中详细描述了PCR扩增方法。可基于公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列，用共有恒定区引物或用更具特异性的引物引发PCR。如以上所讨论，PCR也可用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，可用共有引物或较长同源探针，例如小鼠恒定区探针筛选库。在本领域中已知适合扩增抗体基因的许多引物组(例如，基于纯化抗体N端序列(Benhar和Pastan.1994.Protein Engineering 7:1509)；cDNA末端迅速扩增(Ruberti,F.等1994.J.Immunol.Methods 173:33)；抗体前导序列(Larrick等1989Biochem.Biophys.Res.Commun.160:1250)的5’引物)。在1995年1月25日提交的Newman等，美国专利No.5,658,570中进一步描述了抗体序列的克隆，其以引用的方式并入本文。
本文使用的免疫球蛋白恒定区可包括全部结构域和铰链区或其部分。在一个实施方案中，免疫球蛋白恒定区或其一部分包含CH2结构域、CH3结构域和铰链区，即Fc结构域或FcRn结合伴侣。
免疫球蛋白恒定区或其一部分可为FcRn结合伴侣。FcRn在成人上皮组织中有活性并且在肠内腔、肺部气道、鼻面、***表面、结肠和直肠表面中表达(美国专利No.6,485,726)。FcRn结合伴侣是免疫球蛋白与FcRn结合的部分。
已经从几个哺乳动物物种，包括人类中分离出FcRn受体。人FcRn、猴FcRn、大鼠FcRn和小鼠FcRn的序列已知(Story等1994,J.Exp.Med.180:2377)。FcRn受体在相对较低的pH下结合IgG(但非其它免疫球蛋白类别例如IgA、IgM、IgD和IgE)，主动在内腔到浆膜的方向上跨细胞转运IgG，然后在间质液中存在的相对较高pH下释放IgG。FcRn受体在成人上皮组织(美国专利No.6,485,726、6,030,613、6,086,875；WO 03/077834；US2003-0235536A1)中表达，包括肺和肠上皮细胞(Israel等1997,Immunology 92:69)、肾近端小管上皮细胞(Kobayashi等2002,Am.J.Physiol.Renal Physiol.282:F358)以及鼻上皮细胞、***表面和胆道表面。
用于本发明的FcRn结合伴侣涵盖FcRn受体可特异性结合的分子，包括全IgG、IgG的Fc片段和包括FcRn受体的整个结合区域的其它片段。已经基于X射线晶体学描述了IgG的Fc部分与FcRn受体结合的区域(Burmeister等1994,Nature 372:379)。Fc与FcRn的主要接触区靠近CH2和CH3结构域的接点。Fc-FcRn接触全部在单条Ig重链内。FcRn结合伴侣包括全IgG、IgG的Fc片段和包括FcRn受体的整个结合区域的IgG的其它片段。主要接触位点包括CH2结构域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314和CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436。对免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或区域的氨基酸编号的参考全部基于Kabat等1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Public Health,Bethesda,Md.。
FcRn可使与FcRn结合的Fc区或FcRn结合伴侣有效地穿过上皮屏障，从而提供了全身施用所需治疗分子的非侵入性方式。另外，表达FcRn的细胞内吞包含Fc区或FcRn结合伴侣的融合蛋白。但不是标记为降解，而是回收这些融合蛋白再次进入循环中，从而增加了这些蛋白质的体内半衰期。在某些实施方案中，免疫球蛋白恒定区的部分是通常经由二硫键和其它非特异性相互作用缔合的Fc区或FcRn结合伴侣，另一Fc区或另一FcRn结合伴侣形成二聚体和高阶多聚体。
两个FcRn受体可结合单个Fc分子。晶体学数据表明每个FcRn分子结合Fc同型二聚体的单条多肽。在一个实施方案中，将FcRn结合伴侣，例如IgG的Fc片段连接到生物活性分子，提供了经口服、口腔、舌下、直肠、***、作为经鼻施用的气溶胶或经由肺部途径或经由眼部途径递送生物活性分子的方式。在另一实施方案中，可侵入性，例如皮下、静脉施用嵌合蛋白。
FcRn结合伴侣区是FcRn受体可特异性结合，继而受Fc区的FcRn受体主动转运的分子或其部分。特异性结合指两个分子形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合的特征在于，区别于通常具有低亲和力和中等到高等容量的非特异性结合的高亲和力和低到中等容量。通常，当亲和力常数KA高于106M-1或高于108M-1时，将结合视为特异性。如有必要，可通过改变结合条件减少非特异性结合，大体上不会影响特异性结合。技术人员可使用常规技术优化恰当结合条件，例如分子浓度、溶液离子强度、温度、允许结合的时间、阻滞剂(例如血清白蛋白、乳酪蛋白)的浓度等。
在某些实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个截短Fc区，尽管如此仍足以赋予Fc区以Fc受体(FcR)结合性质。例如，Fc区与FcRn结合的部分(即，FcRn结合部分)大致包含IgG1的氨基酸282-438，EU编号(主要接触位点为CH2结构域的氨基酸248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436)。因此，本发明的Fc区可包含或由FcRn结合部分组成。FcRn结合部分可源自任何同型的重链，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在一个实施方案中，使用来自人同型IgG1抗体的FcRn结合部分。在另一实施方案中，使用使用来自人同型IgG4抗体的FcRn结合部分。
本文指定为F、F1或F2的Fc部分可从许多不同来源获得。在一个实施方案中，多肽的Fc部分源自人免疫球蛋白。然而，应理解Fc部分可源自另一哺乳动物物种，包括例如啮齿动物(例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠)或非人灵长类动物(例如黑猩猩、猕猴)物种的免疫球蛋白。而且，Fc结构域或其部分的多肽可源自任何免疫球蛋白类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和任何免疫球蛋白同型，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在另一实施方案中，使用人类同型IgG1。
在某些实施方案中，Fc变体赋予包含所述野生型Fc结构域的Fc部分给予的至少一种效应子功能变化(例如，Fc区与Fc受体(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)或补体蛋白(例如C1q)结合或触发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、噬菌作用或补体依赖性细胞毒性(CDCC)的能力提高或降低)。在其它实施方案中，Fc变体提供了工程化半胱氨酸残基。
本发明的Fc部分可采用本领域公认的已知给予效应子功能和/或FcR或FcRn结合变化(例如，增强或降低)的Fc变体。具体地，本发明的结合分子可包括(例如)国际PCT公布WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO04/044859、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2和WO06/085967A2；美国专利公布No.US2007/0231329、US2007/0231329、US2007/0237765、US2007/0237766、US2007/0237767、US2007/0243188、US20070248603、US20070286859、US20080057056；或美国专利5,648,260、5,739,277、5,834,250、5,869,046、6,096,871、6,121,022、6,194,551、6,242,195、6,277,375、6,528,624、6,538,124、6,737,056、6,821,505、6,998,253、7,083,784、7,404,956和7,317,091中公开的一个或多个氨基酸位置处的变化(例如，取代)，其各自以引用的方式并入本文。在一个实施方案中，可在公开的一个或多个氨基位置产生特异性变化(例如，本领域中公开的一种或多种氨基酸的特异性取代)。在另一实施方案中，可在公开的一个或多个氨基位置产生不同变化(例如，本领域中公开的一个或多个氨基酸位置的不同取代)。
可根据公认的程序，例如定点诱变等修饰IgG的Fc部分或FcRn结合伴侣以产生将由FcRn结合的经修饰IgG或其Fc片段或部分。这种修饰包括远离FcRn接触位点的修饰以及在接触位点内维护或甚至增强与FcRn的结合的修饰。例如，人IgG1 Fc(Fc γ1)中的以下单氨基酸残基可经取代，Fc对FcRn的结合亲和力无明显损失：P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A和K447A，其中例如P238A表示在位置编号238处，野生型脯氨酸经丙氨酸取代。例如，特定实施方案并入N297A突变，去除了高度保守的N-糖基化位点。除丙氨酸外，其它氨基酸可取代以上指定位置的野生物氨基酸。可单独向Fc引入突变，产生一百个以上不同于天然Fc的Fc区。另外，可一起引入这些单独突变中2、3个或更多个的组合，产生数以百计的Fc部分。而且，本发明构建体的其中一个Fc部分可突变而构建体的另一个Fc部分根本不突变，或它们两个可能突变，但是突变不同。
以上某些突变可赋予Fc部分或FcRn结合伴侣新的功能性。例如，一个实施方案并入N297A，去除了高度保守的N-糖基化位点。这种突变的作用是降低免疫原性，从而增加Fc区的循环半衰期，并且致使Fc区不能与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA结合，而未损害对FcRn的亲和力(Routledge等1995,Transplantation 60:847；Friend等1999,Transplantation 68:1632；Shields等1995,J.Biol.Chem.276:6591)。作为由上述突变产生的新功能性的另一例子，在一些情况下可增加对FcRn的亲和力，超过野生型的亲和力。这样增加的亲和力可能反映“结合”速率增加、“解离”速率降低或“结合”速率增加且“解离”速率降低。认为给予对FcRn更高亲和力的突变的实例包括但不限于T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等2001,J.Biol.Chem.276:6591)
另外，似乎至少3种人Fc受体识别IgG上的下部铰链区内的结合位点，通常为氨基酸234-237。因此，新功能性和潜在免疫原性降低的另一实例可能由该区域的突变产生，例如通过将人IgG1“ELLG”的氨基酸233-236置换为来自IgG2“PVA”的相应序列(有一个氨基酸缺失)。已经证实，在已经引入这种突变时，介导各种效应子功能的FcγRI、FcγRII和FcγRIII不会与IgG1结合。Ward和Ghetie 1995,Therapeutic Immunology 2:77和Armour等1999,Eur.J.Immunol.29:2613。
在一个实施方案中，免疫球蛋白恒定区或其一部分，例如Fc部分，是包括序列PKNSSMISNTP(SEQ ID NO:27)并且任选包括选自HQSLGTQ(SEQ ID NO:28)、HQNLSDGK(SEQ ID NO:29)、HQNISDGK(SEQ ID NO:30)或VISSHLGQ(SEQ ID NO:31)(美国专利No.5,739,277)的序列的多肽。
在另一实施方案中，免疫球蛋白恒定区或其一部分包含铰链区或其一部分中与另一免疫球蛋白恒定区或其一部分形成一个或多个二硫键的氨基酸序列。免疫球蛋白恒定区或其一部分旁边的二硫键将包含可激活凝血因子的第一多肽和包含增强子部分的第二多肽放置在一起，以致在激活凝血因子后，增强子部分可用于增强凝血因子的活性。铰链区或其一部分可进一步与CH1、CH2、CH3中的一个或多个结构域、其片段或其任何组合连接。
在某些实施方案中，免疫球蛋白恒定区或其一部分半糖基化。例如，包含两个Fc部分或FcRn结合伴侣的嵌合蛋白可含有第一糖基化Fc部分(例如，糖基化CH2区)或FcRn结合伴侣和第二未糖基化Fc部分(例如，未糖基化CH2区)或FcRn结合伴侣。在一个实施方案中，接头可***糖基化和未糖基化Fc部分之间。在另一实施方案中，Fc部分或FcRn结合伴侣完全糖基化，即全部Fc部分均糖基化。在其它实施方案中，Fc部分可未糖基化，即没有Fc部分糖基化。
在某些实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含对免疫球蛋白恒定区或其一部分的氨基酸取代(例如，Fc变体)，其改变了Ig恒定区的抗原非依赖性效应子功能，尤其是蛋白质的循环半衰期。
当与没有这些取代的蛋白质相比时，这种蛋白质表现出与FcRn的结合增加或减少，并且因此在血清中的半衰期分别增加或减少。预测对FcRn的亲和力提高的Fc变体具有较长血清半衰期，并且这种分子在治疗希望施用的多肽半衰期长的哺乳动物，例如治疗慢性疾病或病症的方法中，具有有益应用(见，例如美国专利7,348,004、7,404,956和7,862,820)。相反，预计FcRn结合亲和力降低的Fc变体具有较短半衰期，并且这种分子也有用，例如用于施用给缩短循环时间可能有利的哺乳动物，例如用于体内诊断成像或用于长期存在于循环中时，起始多肽有毒副作用的情形。FcRn结合亲和力降低的Fc变体也不太可能穿过胎盘，因此在孕妇疾病或病症的治疗中也有用。另外，可能希望降低FcRn结合亲和力的其它应用包括希望定位于脑部、肾脏和/或肝脏的那些应用。在一个示例性实施方案中，本发明的嵌合蛋白表现出从脉管***通过肾小球上皮细胞的转运减少。在另一实施方案中，本发明的嵌合蛋白表现出从脑部通过血脑屏障(BBB)进入血管间隙的转运减少。在一个实施方案中，FcRn结合改变的蛋白质包含在Ig恒定区的“FcRn结合环”内具有一个或多个氨基酸取代的至少一个Fc部分或FcRn结合伴侣(例如，一个或两个Fc区或FcRn结合伴侣)。FcRn结合环由野生型、全长Fc区的氨基酸残基280-299(根据EU编号)构成。在其它实施方案中，本发明的FcRn结合亲和力改变的嵌合蛋白中Ig恒定区或其一部分包含在FcRn“接触区”内具有一个或多个氨基酸取代的至少一个Fc区或FcRn结合伴侣。如本文所使用，FcRn“接触区”包括在野生型、全长Fc部分的下列位置的残基：243-261、275-280、282-293、302-319、336-348、367、369、372-389、391、393、408、424、425-440(EU编号)。在其它实施方案中，本发明的FcRn结合亲和力改变的Ig恒定区或其一部分包含在对应下列任一EU位置的氨基酸位置具有一个或多个氨基酸取代的至少一个Fc部分或FcRn结合伴侣：256、277-281、283-288、303-309、313、338、342、376、381、384、385、387、434(例如，N434A或N434K)和438。在国际PCT公布No.WO05/047327中公开了改变FcRn结合亲和力的示例性氨基酸取代，其以引用的方式并入本文。
用于本发明的Fc部分或FcRn结合伴侣也可包含本领域公认的改变嵌合蛋白的糖基化的氨基酸取代。例如，嵌合蛋白与可激活凝血因子或增强子部分连接的Fc部分或FcRn结合伴侣可包含具有导致糖基化(例如，N-或O-连接糖基化)减少的突变的Fc部分，或可包含野生型Fc部分的改变糖型(例如，低岩藻糖或无岩藻糖多糖)。
在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白可包含其组成Ig恒定区或其部分中的两个或更多个独立地选自本文所述Ig恒定区或其部分的基因融合Fc区(即，scFc区)。在一个实施方案中，二聚Fc区的Fc结构域相同。在另一实施方案中，Fc结构域的至少两个不同。例如，本发明蛋白质的Fc部分或FcRn结合伴侣包含相同数量的氨基酸残基或它们可能在长度上相差一个或多个氨基酸残基(例如，约5个氨基酸残基(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基)、约10个残基、约15个残基、约20个残基、约30个残基、约40个残基或约50个残基)。还有其它实施方案中，本发明蛋白质的Fc部分或FcRn结合伴侣可能在一个或多个氨基酸位置的序列上不同。例如，至少两个Fc部分或FcRn结合伴侣可在约5个氨基酸位置(例如，1、2、3、4或5个氨基酸位置)、约10个位置、约15个位置、约20个位置、约30个位置、约40个位置或约50个位置不同。
2.scFc区
在一个实施方案中，本发明提供了未加工的嵌合多肽，其在单条多肽链(即，包含单链Fc(scFc)区的多肽)中，包含可激活凝血因子、增强子部分和至少一个基因融合的Fc区或其部分。未加工的多肽包含在同一条线性多肽链中，能够折叠(例如，分子内或分子间折叠)形成一个通过Fc肽接头连接的功能scFc区的至少两个免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc部分或结构域(例如，2、3、4、5、6个或更多个Fc部分或结构域))。例如，在一个实施方案中，本发明的多肽能够经由其scFc区与至少一个Fc受体(例如，FcRn、FcγR受体(例如，FcγRIII)或补体蛋白(例如，C1q))结合，以便提高半衰期或触发免疫效应子功能(抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、噬菌作用或补体依赖性细胞毒性(CDCC)和/或提高工艺)。
各种替代性设计的多肽在本发明范围之内。例如，在一个实施方案中，多肽包含从氨基到羧基端呈线性序列的部分：
A-F1-P1-L-P2-B-F2  (__)
其中A若存在，为可激活凝血因子或其部分，F1为第一免疫球蛋白恒定区或其部分，P1为第一胞内加工位点，L为scFc接头，P2为第二胞内加工位点；B为增强子部分，F2为第二免疫球蛋白恒定区或其部分；并且“-”表示肽键。式(__)至少包含P1或P2和任选包含二者。P1和P2，若二者均存在，可相同或不同。式(__)至少包含F1、F2或二者。F1和F2，若二者均存在，可相同或不同。
3.CTP
在某些方面，本发明的嵌合蛋白包含至少一个异源部分，其包含人绒毛膜***C端肽(CTP)的β亚基、其片段、变体或衍生物。已知***重组蛋白质中的一个或多个CTP肽增加了该蛋白质的体内半衰期。见，例如，美国专利No.5,712,122，以引用的方式整体并入本文。
示例性CTP肽包括DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ IDNO:32)或SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ.(SEQ IDNO:33)。见，例如，以引用的方式并入的美国专利申请公布US 2009/0087411 A1。
4.XTEN序列
在一些实施方案中，嵌合蛋白中的异源部分包含一个或多个XTEN序列、其片段、变体或衍生物。如此处所使用，“XTEN序列”指具有主要由小亲水性氨基酸构成的非自然存在、大体上非重复性的序列的长度延长多肽，所述序列在生理条件下具有低程度的或没有二级或三级结构。作为异源部分，XTEN可用作半衰期延长部分。另外，XTEN可提供所需性质，包括但不限于增强的药代动力学参数和溶解性特征。
向本发明的嵌合蛋白中并入包含XTEN序列的异源部分可赋予嵌合蛋白下列一种或多种有利性质：构象柔性、水溶解性增强、高度的蛋白酶抗性、低免疫原性、与哺乳动物受体的低结合或流体动力学(或斯托克斯)半径增加。
在某些方面，XTEN序列可提高药代动力学性质，例如延长体内半衰期或增加总暴露量(曲线下面积(AUC))，以致与有效但是没有XTEN异源部分的嵌合蛋白相比，本发明的嵌合蛋白展示出长时间控制出血的功效。
例如，在美国专利No.7,855,279和7,846,445、美国专利公布No.2009/0092582 A1、2010/0239554 A1、2010/0323956 A1、2011/0046060 A1、2011/0046061 A1、2011/0077199 A1、2013/0017997 A1或2012/0263701 A1或2011/0172146 A1或国际专利公布No.WO 2010091122 A1、WO 2010144502A2、WO 2010144508 A1、WO 2011028228 A1、WO 2011028229 A1或WO2011028344 A2或2011年8月19日提交的国际申请No.PCT/US2011/48517中公开了可在本发明的嵌合蛋白中用作异源部分的XTEN序列的实例，其各自以引用的方式整体并入本文。
5.白蛋白或其片段、衍生物或变体
在某些实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含含白蛋白或其功能片段的异源部分。人血清白蛋白(HAS或HA)，一种609个氨基酸的呈其全长形式的蛋白质，负责血清很大比例的渗透压并且还起内源和外源配体的载体的作用。如本文所使用，术语“白蛋白”包括全长白蛋白或其功能片段、变体、衍生物或类似物。在美国专利公布No.2008/0194481A1、2008/0004206 A1、2008/0161243 A1、2008/0261877 A1或2008/0153751 A1或PCT申请公布No.2008/033413 A2、2009/058322 A1或2007/021494 A2中公开了白蛋白或其片段或变体的实例，其以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含进一步与选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)、PAS序列、HES、PEG或其任何组合的异源部分连接的白蛋白、其片段或变体。
6.白蛋白结合部分
在某些实施方案中，异源部分为白蛋白结合部分，其包含白蛋白结合肽、细菌白蛋白结合结构域、白蛋白结合抗体片段或其任何组合。
例如，白蛋白结合蛋白可为细菌白蛋白结合蛋白、抗体或抗体片段，包括结构域抗体(见美国专利No.6,696,245)。例如，白蛋白结合蛋白可为细菌白蛋白结合结构域，例如链球菌蛋白G(Konig,T.和Skerra,A.(1998)J.Immunol.Methods 218,73-83)。例如，可用作偶联伴侣的白蛋白结合肽的其它实例为具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys共有序列的白蛋白结合肽，其中如美国专利申请2003/0069395或Dennis等(Dennis等(2002)J.Biol.Chem.277,35035-35043)中所述，Xaa1为Asp、Asn、Ser、Thr或Trp；Xaa2为Asn、Gln，H为Ile、Leu或Lys；Xaa3为Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr；并且Xaa4为Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr(SEQ ID NO:34)。
如Kraulis等，FEBS Lett.378:190-194(1996)和Linhult等，Protein Sci.11:206-213(2002)所公开，来自链球菌蛋白G的结构域3是细菌白蛋白结合结构域的实例。白蛋白结合肽的实例包括一系列具有核心序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO:35)的肽。见，例如，Dennis等，J.Biol.Chem.2002,277:35035-35043(2002)。在Muller和Kontermann，Curr.Opin.Mol.Ther.9:319-326(2007)；Rooverset等，Cancer Immunol.Immunother.56:303-317(2007)和Holt等，Prot.Eng.Design Sci.,21:283-288(2008)中公开了白蛋白结合抗体片段的实例，其以引用的方式整体并入本文。这种白蛋白结合部分的实例为Trussel等，Bioconjugate Chem.20:2286-2292(2009)公开的2-(3-马来酰亚胺基丙酰胺基)-6-(4-(4-碘苯基)丁酰胺基)己酸酯(“Albu”标签)。
脂肪酸，尤其是长链脂肪酸(LCFA)和长链脂肪酸样白蛋白结合化合物可用于延长本发明嵌合蛋白的体内半衰期。LCFA样白蛋白结合化合物的实例为16-(l-(3-(9-(((2,5-二氧吡咯烷-l-基氧基)羰氧基)-甲基)-7-磺基-9H-芴-2-基氨基)-3-氧代丙基)-2,5-二氧吡咯烷-3-基硫代)棕榈酸(见，例如，WO 2010/140148)。
7.PAS序列
在其它实施方案中，至少一个异源部分为PAS序列。如本文所使用，PAS序列指主要包含丙氨酸和丝氨酸残基或主要包含丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸的氨基酸序列，所述氨基酸序列在生理条件下形成无规卷曲构象。相应地，PAS序列是包含、基本上由或由丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸组成，可用作嵌合蛋白中异源部分的一部分的构造块、氨基酸聚合物或序列盒。然而，技术人员意识到当添加除丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸外的残基作为PAS序列中的次要成分时，氨基酸聚合物也可形成无规卷曲构象。如本文所使用，术语“次要成分”指可在PAS序列中添加除丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸外的氨基酸，达到某种程度，例如高达约12％，即PAS序列100个氨基酸中约12个；高达约10％，即PAS序列100个氨基酸中约10个；高达约9％，即100个氨基酸中约9个；高达约8％，即100个氨基酸中约8个；约6％，即100个氨基酸中约6个；约5％，即100个氨基酸中约5个；约4％，即100个氨基酸中约4个；约3％，即100个氨基酸中约3个；约2％，即100个氨基酸中约2个；约1％，即100个氨基酸中约1个。不同于丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸的氨基酸可选自Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr或Val。
在生理条件下，PAS序列段形成无规卷曲构象并且从而可对嵌合蛋白介导更高的体内和/或体外稳定性。因为无规卷曲结构域本身不采用稳定结构或功能，所以基本上保持了嵌合蛋白中可激活凝血因子介导的生物活性。在其它实施方案中，特别是就血浆中的蛋白水解、免疫原性、等电点/静电行为、与细胞表面受体的结合或内化而言，形成无规卷曲结构域的PAS序列具生物惰性，但是仍生物可降解，这提供了优于聚合物例如PEG的明显优势。
形成无规卷曲构象的PAS序列的非限制性实例包括选自ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO:36)、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO:37)、APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO:38)、APSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQID NO:39)、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO:40)、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO:41)、ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO:42)或其任何组合的氨基酸序列。例如，从美国专利公布No.2010/0292130A1和PCT申请公布No.WO 2008/155134A1已知另外的PAS序列实例。
8.HAP序列
在某些实施方案中，至少一个异源部分为富含甘氨酸的高氨基酸聚合物(HAP)。HAP序列可包含甘氨酸重复序列，其长度为至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、120个氨基酸、140个氨基酸、160个氨基酸、180个氨基酸、200个氨基酸、250个氨基酸、300个氨基酸、350个氨基酸、400个氨基酸、450个氨基酸或500个氨基酸。在一个实施方案中，HAP序列能够延长与HAP序列融合或连接的部分的半衰期。HAP序列的非限制性实例包括但不限于(Gly)n、(Gly4Ser)n或S(Gly4Ser)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一个实施方案中，n为20、21、22、23、24、25、26、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在另一实施方案中，n为50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200。
9.转铁蛋白或其片段
在某些实施方案中，至少一个异源部分为转铁蛋白或其片段。任何转铁蛋白均可用于制备本发明的嵌合蛋白。例如，野生型人TF(TF)为约75KDa(未考虑糖基化)的679氨基酸蛋白质，具有两个似乎来源于基因复制的结构域，N(约330个氨基酸)和C(约340个氨基酸)。见基因库入藏号NM001063、XM002793、M12530、XM039845、XM 039847和S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov/)，其全部以引用的方式整体并入本文。转铁蛋白包含两个结构域，N结构域和C结构域。N结构域包含两个子域，N1结构域和N2结构域，并且C结构域包含两个子域，C1结构域和C2结构域。
在一个实施方案中，转铁蛋白异源部分包括转铁蛋白剪接变体。在一个例子中，转铁蛋白剪接变体可为人转铁蛋白，例如基因库入藏号AAA61140的剪接变体。在另一实施方案中，嵌合蛋白的转铁蛋白部分包括转铁蛋白序列的一个或多个结构域，例如N结构域、C结构域、N1结构域、N2结构域、C1结构域、C2结构域或其任何组合。
10.聚合物，例如聚乙二醇(PEG)
在其它实施方案中，至少一个异源部分为本领域中已知的可溶性聚合物，包括但不限于聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖或聚乙烯醇。在一些实施方案中，包含PEG异源部分的嵌合蛋白进一步包含选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)、PAS序列、HES、白蛋白、其片段或变体或其任何组合的异源部分。还有其它实施方案中，嵌合蛋白包含可激活凝血因子或其片段和PEG异源部分，其中嵌合蛋白进一步包含选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc部分)、PAS序列、HES、白蛋白、其片段或变体或其任何组合的异源部分。还有其它实施方案中，嵌合蛋白包含凝血因子或其片段、第二凝血因子或其片段和PEG异源部分，其中嵌合蛋白进一步包含选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc部分)、PAS序列、HES、白蛋白、其片段或变体或其任何组合的异源部分。在其它实施方案中，嵌合蛋白包含凝血因子或其片段、合成促凝血多肽和PEG异源部分，其中嵌合蛋白进一步包含选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)、PAS序列、HES、白蛋白、其片段或变体或其任何组合的异源部分。在其它实施方案中，嵌合蛋白包含两个合成促凝血肽和PEG异源部分，其中嵌合蛋白进一步包含选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)、PAS序列、HES、白蛋白、其片段或变体或其任何组合的异源部分。再一实施方案中，嵌合蛋白包含凝血因子或其片段、凝血因子辅因子(例如，如果凝血因子为因子X，则为因子Va；或者如果凝血因子为因子VII，则为组织因子)和PEG异源部分，其中嵌合蛋白进一步包含选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)、PAS序列、HES、白蛋白、其片段或变体或其任何组合的异源部分。
本发明还提供了包含可提供附加优点，例如多肽溶解性、稳定性和循环时间增加或免疫原性降低的异源部分的本发明嵌合蛋白(见美国专利No.4,179,337)。这种用于修饰的异源部分可选自水溶性聚合物，包括但不限于聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇或其任何组合。
聚合物可具有任何分子量，并且可支化或未支化。对于聚乙二醇而言，在一个实施方案中，为了易于处理和生产，分子量介于约1kDa和约100kDa之间。根据所需性质(例如，所需缓释持续时间、对生物活性的影响(如果有)、处理简易性、抗原性程度或缺乏抗原性和聚乙二醇对蛋白质或类似物的其它已知影响)，可使用其它尺寸。例如，聚乙二醇的平均分子量可为约200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000kDa。
在一些实施方案中，聚乙二醇可能具有支化结构。例如，在美国专利No.5,643,575；Morpurgo等，Appl.Biochem.Biotechnol.56:59-72(1996)；Vorobjev等，Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750(1999)；和Caliceti等，Bioconjug.Chem.10:638-646(1999)中描述了支化聚乙二醇，其各自以引用的方式整体并入本文。
附着于本发明每个嵌合蛋白的聚乙二醇部分的数量(即，取代度)也可能不同。例如，聚乙二醇化嵌合蛋白可平均与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20个或更多个聚乙二醇分子连接。类似地，平均取代度在例如每个蛋白质分子1-3、2-4、3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、8-10、9-11、10-12、11-13、12-14、13-15、14-16、15-17、16-18、17-19或18-20个聚乙二醇部分的范围内。例如，在Delgado等，Crit.Rev.Thera.Drug Carrier Sys.9:249-304(1992)中讨论了测定取代度的方法。
在一些实施方案中，嵌合蛋白可经聚乙二醇化。聚乙二醇化嵌合蛋白包含至少一个聚乙二醇(PEG)分子。在其它实施方案中，聚合物可为水溶性。聚合物的非限制性实例为聚(环氧烷)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉或聚(丙烯酰吗啉)。在美国专利No.7,199,223中公开了与凝血因子偶联的其它类型的聚合物。同样见，Singh等Curr.Med.Chem.15:1802-1826(2008)。
11.羟乙基淀粉(HES)
在某些实施方案中，至少一个异源部分为聚合物，例如羟乙基淀粉(HES)或其衍生物。羟乙基淀粉(HES)是自然存在的支链淀粉的衍生物并且在体内由α-淀粉酶降解。HES是碳水化合物聚合物支链淀粉的经取代衍生物，以高达95重量％的浓度存在于玉米淀粉中。HES表现出有利的生物活性并且用作血容量替代剂并且用于临床上的血液稀释疗法(Sommermeyer等，Krankenhauspharmazie,8(8),271-278(1987)；和Weidler等，Arzneim.-Forschung/Drug Res.,41,494-498(1991))。
支链淀粉含有葡萄糖部分，其中在主链上存在α-1,4-糖苷键并且在支化位点发现α-1,6-糖苷键。这种分子的物理-化学性质主要由糖苷键的类型决定。由于带缺口的α-1,4-糖苷键，产生每个翻转具有约6个葡萄糖单体的螺旋结构。可经由取代改变聚合物的物理-化学以及生物化学性质。可经由碱性羟乙基化实现羟乙基的引入。通过调整反应条件，就羟乙基化而论可能开发在未经取代的葡萄糖单体中各个羟基的不同反应性。由于这一事实，技术人员能够在有限范围内影响取代模式。
主要用于分子量分布和取代度表征HES。取代度，表示为DS，涉及摩尔取代度，为技术人员已知。见以上引用的Sommermeyer等，Krankenhauspharmazie,8(8),271-278(1987)，尤其是第273页。
在一个实施方案中，羟乙基淀粉的平均分子量(重均)从1到300kD，从2到200kD，从3到100kD，或从4到70kD。羟乙基淀粉可进一步表现出从0.1到3，优选从0.1到2，更优选0.1到0.9，优选0.1到0.8的摩尔取代度，和就羟乙基而言，在2-20范围内的C2:C6取代比例。平均分子量为约130kD的HES的非限制性实例是取代度为0.2到0.8，例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，优选为0.4到0.7，例如0.4、0.5、0.6或0.7的HES。在一个特定实施方案中，平均分子量为约130kD的HES为来自Fresenius的 是人造胶体，例如用于治疗和预防血容量减少的治疗适应证中使用的容量替代。的特征是平均分子量为130,000+/-20,000D，摩尔取代度为0.4并且C2:C6比例为约9:1。在其它实施方案中，羟乙基淀粉的平均分子量的范围为，例如4-70kD或10-70kD或12-70kD或18-70kD或50-70kD或4-50kD或10-50kD或12-50kD或18-50kD或4-18kD或10-18kD或12-18kD或4-12kD或10-12kD或4-10kD。还有其它实施方案中，采用的羟乙基淀粉的平均分子量在大于4kD而小于70kD的范围内，例如约10kD，或在9-10kD或10-11kD或9-11kD范围内，或为约12kD，或在11-12kD)或12-13kD或1l-13kD范围内，或为约18kD，或在17-18kD或18-19kD或17-19kD范围内，或为约30kD，或在29-30或30-31kD范围内，或为约50kD，或在49-50kD或50-51kD或49-51kD范围内。
在某些实施方案中，异源部分可为具有不同平均分子量和/或不同取代度和/或不同C2:C6取代比例的羟乙基淀粉混合物。因此，可采用具有不同平均分子量和不同取代度及不同C2:C6取代比例，或具有不同平均分子量和不同取代度及相同或几乎相同的C2:C6取代比例，或具有不同平均分子量和相同或几乎相同的取代度及不同C2:C6取代比例，或具有相同或几乎相同的平均分子量和不同取代度及不同C2:C6取代比例，或具有不同平均分子量和相同或几乎相同的取代度及相同或几乎相同的C2:C6取代比例，或具有相同或几乎相同的平均分子量和不同取代度及相同或几乎相同的C2:C6取代比例，或具有相同或几乎相同的平均分子量和相同或几乎相同的取代度及不同C2:C6取代比例，或具有几乎相同的平均分子量和几乎相同的取代度及几乎相同的C2:C6取代比例的羟乙基淀粉混合物。
12.多聚唾液酸(PSA)
在某些实施方案中，至少一个异源部分为聚合物，例如多聚唾液酸(PSA)或其衍生物。多聚唾液酸(PSA)是由某些菌株和在哺乳动物中在某些细胞中生成的自然存在的唾液酸未支化聚合物。Roth J.等(1993)在Polysialic Acid:FromMicrobes to Man中，编者Roth J.、Rutishauser U.、Troy F.A.(Verlag,Basel,Switzerland)，第335-348页。它们可通过有限酸水解或通过神经氨酸酶消化，或通过分馏聚合物的天然、细菌来源形式，以不同聚合程度生成，从n＝约80或更多个唾液酸残基下至n＝2。不同多聚唾液酸的组成也不同，以致存在均聚物形式，即包含大肠杆菌菌株K1和B群脑膜炎球菌的荚膜多糖的α-2,8-连接的多聚唾液酸，其也存在于神经细胞黏附分子(N-CAM)的胚胎形式上。也存在杂聚物形式-例如大肠杆菌K92的交替α-2,8、α-2,9多聚唾液酸和C群脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis.)多糖。唾液酸也可能存在于具有除唾液酸外的单体，例如W135群或Y群脑膜炎奈瑟菌的交替共聚物中。多聚唾液酸具有重要生物功能，包括病原菌逃避免疫和补充习题和胎儿发育期间对未成熟神经元胶质粘附性的调节(其中聚合物具有抗粘附功能)Cho和Troy，P.N.A.S.,USA,91(1994)11427-11431，即使在哺乳动物中没有多聚唾液酸的已知受体。大肠杆菌菌株K1的α-2,8-连接的多聚唾液酸也称为‘多聚乙酰神经氨糖酸’并且用于(不同长度)例证本发明。已经描述了使多聚唾液酸附着或偶联到多肽的各种方法(例如，见美国专利No.5,846,951；WO-A-0187922和US2007/0191597A1，其以引用的方式整体并入本文)。
13.清除受体
在某些方面，当嵌合蛋白包含至少一个包含清除受体、其片段、变体或衍生物的异源分子时，本发明嵌合蛋白中可激活凝血因子的体内半衰期可延长。在其中治疗性肽为因子X的特定方面，可溶性形式的清除受体，例如低密度脂蛋白相关蛋白受体LRP1或其片段，可阻滞因子X与清除受体的结合并从而延长其体内半衰期。
LRP1为600kDa膜内在蛋白，其牵涉于受体介导的各种蛋白质例如因子X的清除。见，例如，Narita等，Blood 91:555-560(1998)。
D.接头部分(L、L1或L2)
用于本发明的接头部分可为肽接头或非肽接头。在一个实施方案中，肽接头可以是合成的。
如本文所使用，术语“肽接头”指连接多肽链线性氨基酸序列中两个结构域的肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)。由编码直接或间接连接构成所述构建体的两个免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc部分)的肽接头的核酸分子编码本发明的多肽。本文将这些接头称为“scFc接头”。如果scFc接头连续地连接线性多肽序列中的两个Fc部分，则为“直接”连接。相反，scFc接头可能将第一Fc部分连接到结合部分，结合部分依次与第二Fc部分连接，从而形成间接连接。这些scFc接头(X)导致形成单链基因构建体。然而，在一个实施方案中，scFc多肽还包含胞内加工位点，其导致scFc接头可裂解(cscFc接头)，并且在一个实施方案中，大体上被切除(例如，在受细胞加工期间)。因此，经加工的分子是包含至少两条氨基酸链并且大体上缺乏外来接头氨基酸序列的二聚体分子。在一些实施方案中，切除全部或绝大部分接头，而在一些实施方案中，可保留胞内加工位点的一部分，例如RRRR裂解位点的4个精氨酸。
在另一实施方案中，本文称为“接头部分”的另一类肽接头可用于连接不同部分，例如将可激活凝血因子连接到增强子部分，将可激活凝血因子连接到异源部分，和/或将增强子部分连接到异源部分。这种类型的肽接头可为多肽分子提供柔性。通常不裂解接头，然而这种裂解可能是可取的。在附图中示出了接头的示例性位置。接头可位于可激活凝血因子和增强子部分之间，可激活凝血因子和与之连接的异源部分之间，或增强子部分和与之连接的异源部分之间，例如在这种部分的N或C端。在一个实施方案中，加工期间未去除这些接头。
在本发明的嵌合蛋白中可能存在的第三类接头为蛋白酶可裂解接头，其包含裂解位点(即，蛋白酶裂解位点底物(例如因子XIa、Xa)或凝血酶裂解位点)并且其可在裂解位点的N端或C端或两侧包括附加接头。这种可裂解接头在并入凝血因子酶原时产生具有异源裂解位点的嵌合分子。附图中示出了这种位点的示例性位置并且包括，例如在凝血因子酶原轻链和重链之间，在凝血因子酶原重链和第一异源部分之间，在增强子部分和第二异源部分之间。
在一个实施方案中，本发明未加工的多肽包含两个或更多个Fc结构域或部分，经由cscFc接头连接形成包括在单条多肽链中的Fc区。cscFc接头两侧有至少一个胞内加工位点，即胞内酶裂解的位点。在至少一个胞内加工位点裂解多肽产生包含至少两条多肽链的多肽。在一个实施方案中，cscFc接头任选经由胞内加工位点将F1或F2连接到(例如)可激活凝血因子，或经由胞内加工位点连接到增强子部分。
正如上面提出的，其它肽接头可任选用于本发明的构建体中，例如用于将可激活凝血因子或增强子部分连接到Fc部分。可连同本发明使用的接头的一些示例性位置包括(例如)包含GlySer氨基酸，例如附图中提出并且下面更加详细地描述的氨基酸的多肽。在一个实施方案中，接头可与各自独立地选自可激活凝血因子、异源部分(例如，Fc)、裂解位点和增强子部分的一个或多个部分相邻。
在一个实施方案中，肽接头是合成的，即非自然存在。在一个实施方案中，肽接头包括肽(或多肽)(其可以是或可不是自然存在的)，其包含使第一氨基酸线性序列和与之在自然界中并非自然连接或基因融合的第二氨基酸线性序列连接或基因融合的氨基酸序列。例如，在一个实施方案中，肽接头可包含非自然存在的多肽，其为自然存在的多肽的修饰形式(例如，包含突变(例如添加、取代或缺失))。在另一实施方案中，肽接头可包含非自然存在的氨基酸。在另一实施方案中，肽接头可包含在自然界中不存在的线性序列中存在的自然存在氨基酸。再一实施方案中，肽接头可包含自然存在的多肽序列。
例如，在某些实施方案中，肽接头可用于融合相同Fc部分，从而形成同型二聚体scFc区。在其它实施方案中，肽接头可用于融合不同Fc部分(例如，野生型Fc部分和Fc部分变体)，从而形成杂二聚体scFc区。
在另一实施方案中，肽接头包含或由gly-ser接头组成。在一个实施方案中，scFc或cscFc接头包含免疫球蛋白铰链的一部分和gly-ser接头。如本文所使用，术语“gly-ser接头”指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性gly/ser接头包含式(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列，其中n为正整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。gly/ser接头的实例为(Gly4Ser)2(SEQ ID NO:4)、(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:4)或(Gly4Ser)6，(SEQ ID NO:4)。另一示例性gly-ser接头为GGGSSGGGSG(SEQ ID NO:43)。在某些实施方案中，可在肽接头的另外两个序列(例如，本文所述任何肽接头序列)之间***所述gly-ser接头。在其它实施方案中，gly-ser接头附于肽接头另一序列(例如，本文所述任何肽接头序列)的一端或两端。还有其它实施方案中，在肽接头中串联并入两个或更多个gly-ser接头。在一个实施方案中，本发明的肽接头包含上部铰链区(例如，源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子)的至少一部分、中部铰链区(例如，源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子)的至少一部分和一系列gly/ser氨基酸残基(例如，gly/ser接头(例如(Gly4Ser)n)(SEQ ID NO:4)))。
本发明的肽接头长度为至少一个氨基酸并且具有不同长度。在一个实施方案中，本发明的肽接头长度为约1至约50个氨基酸。如在这种情况下所使用，术语“约”指+/-2个氨基酸残基。因为接头长度必须为正整数，所以约1至约50个氨基酸的长度指1-3到48-52个氨基酸的长度。在另一实施方案中，本发明的肽接头长度为约10至约20个氨基酸。在另一实施方案中，本发明的肽接头长度为约15至约50个氨基酸。在另一实施方案中，本发明的肽接头长度为约20至约45个氨基酸。在另一实施方案中，本发明的肽接头长度为约15至约35个或约20至约30个氨基酸。在另一实施方案中，本发明的肽接头长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000或2000个氨基酸。在一个实施方案中，本发明的肽接头长度为约20或30个氨基酸。
在一些实施方案中，肽接头可包含至少两个氨基，至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸。在其它实施方案中，肽接头可包含至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1000个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头可包含至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000个氨基酸。肽接头可包含1-5个氨基酸、1-10个氨基酸、1-20个氨基酸、10-50个氨基酸、50-100个氨基酸、100-200个氨基酸、200-300个氨基酸、300-400个氨基酸、400-500个氨基酸、500-600个氨基酸、600-700个氨基酸、700-800个氨基酸、800-900个氨基酸或900-1000个氨基酸。
可使用本领域已知的技术将肽接头引入多肽序列中。可通过DNA序列分析确认修饰。质粒DNA可用于转化宿主细胞，以稳定生成所生成的多肽。
III.多肽的制备
多种方法可用于重组生成本发明的嵌合蛋白。在一个实施方案中，本发明涉及包含编码本发明嵌合蛋白的核酸的核酸构建体。应理解，由于密码简并性，多种核酸序列将编码多肽的氨基酸序列。可通过从头固相DNA合成或通过PCR诱变早期制备的多核苷酸生成所需多核苷酸。
寡聚核苷酸介导的诱变是准备取代、框内***或改变(例如，异常密码子)以引入编码氨基酸取代的密码子(例如，进入Fc变体部分中)的一种方法。例如，通过使编码所需突变的寡聚核苷酸与单链DNA模板杂交，改变起始多肽DNA。杂交后，用DNA聚合酶合成并入了寡聚核苷酸引物的模板的整条第二互补链。在一个实施方案中，基因工程，例如基于引物的PCR诱变，足以并入本文所定义的改变，以生成编码本发明多肽的多核苷酸。
对于重组生成，将编码嵌合蛋白的多核苷酸序列***适当表达媒介物中，即含有转录和翻译***的编码序列的必需元件的载体，或在RNA病毒载体的情况下，含有复制和翻译的必需元件。
将编码嵌合蛋白的核酸***适当阅读框中的载体。然后将表达载体转染到适合靶细胞中，靶细胞将表达多肽。本领域已知的转染技术包括但不限于磷酸钙沉淀(Wigler等1978,Cell 14:725)和电穿孔(Neumann等1982,EMBO,J.1:841)。可利用多种宿主表达载体***在真核细胞中表达本文所述的嵌合蛋白。在一个实施方案中，真核细胞为动物细胞，包括哺乳动物细胞(例如，293细胞、PerC6、CHO、BHK、Cos、HeLa细胞)。当在真核细胞中表达嵌合蛋白时，编码嵌合蛋白的DNA也可编码将允许分泌嵌合蛋白的信号序列。本领域的技术人员将理解，虽然翻译了蛋白质，但是信号序列可经细胞裂解以形成成熟嵌合蛋白。本领域中已知各种信号序列，例如天然因子Vll信号序列、天然因子IX信号序列和小鼠IgK轻链信号序列。可选地，不包括信号序列时，可通过溶解细胞回收嵌合蛋白。
可在转基因动物，例如啮齿动物、山羊、绵羊、猪或牛中合成本发明的嵌合蛋白。术语“转基因动物”指已经将外来基因并入其基因组中的非人类动物。因为这种基因存在于种系组织中，所以从亲本传给子代。将外源基因引入单细胞胚胎(Brinster等1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:4438)。本领域中已知生产转基因动物的方法，包括生产免疫球蛋白分子的转基因法(Wagner等1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:6376；McKnight等1983,Cell 34:335；Brinster等1983,Nature 306:332；Ritchie等1984,Nature 312:517；Baldassarre等2003,Theriogenology 59:831；Robl等2003,Theriogenology 59:107；Malassagne等2003,Xenotransplantation 10(3):267)。
表达载体可编码允许容易地纯化或鉴定重组生成的蛋白质的标签。实例包括但不限于载体pUR278(Ruther等1983,EMBO J.2:1791)，在其中本文所述嵌合蛋白编码序列可在具有lac z编码区的框内与载体连接，以致生成杂交蛋白；pGEX载体可用于表达具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的蛋白质。这些蛋白质通常可溶并且可通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠粒上，接着在游离谷胱甘肽的存在下洗脱，容易地从细胞中纯化。载体包括裂解位点(例如，PreCission蛋白酶(Pharmacia,Peapack,N.J.))，以在纯化后容易地去除标签。
为了本发明的目的，可采用许多表达载体***。这些表达载体通常在宿主生物中可作为附加体或宿主染色体DNA不可分割的部分复制。表达载体可包括表达控制序列，包括但不限于启动子(例如，自然缔合的或异源启动子)、增强子、信号序列、剪接信号、增强子元件和转录终止序列。优选地，表达控制序列是载体中能够转化或转染真核宿主细胞的真核启动子***。表达载体也可利用源自动物病毒，例如牛***瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)、巨细胞病毒(CMV)或SV40病毒的DNA元件。其它牵涉使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子***。
一般地，表达载体含有选择标记(例如，氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性或新霉素抗性)以允许检测经所需DNA序列转化的那些细胞(见，例如，Itakura等，美国专利4,704,362)。可通过引入允许选择经转染宿主细胞的一个或多个标记，选择已经将DNA整合到其染色体中的细胞。所述标记可为营养缺陷型宿主提供原营养、生物杀灭剂抗性(例如，抗生素)或对重金属例如铜的抗性。可选标记基因可与要表达的DNA序列直接连接，或通过共转化引入同一细胞中。
优选的表达载体为NEOSPLA(美国专利No.6,159,730)。这种载体含有巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β球蛋白主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素聚腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。已经发现这种载体导致在并入可变和恒定区基因，在细胞中转染，接着在含有G418的培养基中选择和甲氨蝶呤扩增后抗体极高水平表达。在美国专利No.5,736,137和5,658,570中也教导了载体***，其各自以引用的方式整体并入本文。这种***提供了高表达水平，例如>30pg/细胞/天。例如，在美国专利No.6,413,777中公开了其它示例性载体***。
在其它实施方案中，可适于多顺反子构建体表达本发明的多肽。在这些表达***中，可由单个多顺反子构建体生成多种目标基因产物，例如多聚体结合蛋白的多种多肽。这些***有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)以在真核宿主细胞中提供相对高水平的本发明多肽。也并入本文的美国专利No.6,193,980中公开了相容IRES序列。本领域的技术人员将认识到，这种表达***可用于有效地生成本申请中公开的全系列多肽。
更一般地说，编码多肽的载体或DNA序列一经制备，就可将表达载体引入恰当宿主细胞中。即，可转化宿主细胞。可通过本领域技术人员众所周知的各种技术实现向宿主细胞中引入质粒。这些技术包括但不限于转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、细胞与包膜DNA融合、显微注射和用完整病毒感染。见，Ridgway,A.A.G."Mammalian Expression Vectors"第24.2章，第470-472页，Vectors，Rodriguez和Denhardt编辑(Butterworths,Boston,Mass.1988)。最优选地，经由电穿孔向宿主引入质粒。在适于轻链和重链生成的条件下培育转化细胞并测定重链和/或轻链蛋白质合成。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或荧光激活细胞分选仪分析(FACS)、免疫组织化学法等。
如本文所使用，术语“转化”应在广义上用于指向受体宿主细胞引入改变基因型并因此导致受体细胞变化的DNA。
依此类推，“宿主细胞”指已经用使用重组DNA技术构建的并且编码至少一个异源基因的载体转化的细胞。在从重组宿主中分离多肽的工艺的描述中，除非另外明确说明，术语“细胞”和“细胞培养物”可交换用于指多肽的来源。换言之，从“细胞”中回收多肽可意指从离心全细胞或从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物。
用于蛋白质表达的宿主细胞系最优选为哺乳动物来源；认为本领域的技术人员有能力优先确定最适合要在其中表达的所需基因产物的特定宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢系，DHFR-)、HELA(人***)、CVI(猴肾系)、COS(带SV40T抗原的CVI衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)、PerC6和293(人肾)。宿主细胞系通常可由商业服务，美国组织培养物保藏所或由出版文献获得。
在一个实施方案中，宿主细胞内源性表达在加工形成成熟多肽期间，裂解scFc接头(例如，如果这种接头存在并且含有胞内加工位点)所必需的酶(或酶类)。这种加工期间，大体上可去除scFc接头以减少外来氨基酸的存在。在本发明的另一实施方案中，转化宿主细胞以表达所述细胞外源的一种或多种酶，以便进行或改善scFc接头的加工。
在一个实施方案中，可由细胞内源性或外源性表达的酶是弗林蛋白酶家族的成员。在1990.Van den Ouweland A M等(1990)Nucleic Acids Res.18:664；Erratum在：Nucleic Acids Res.18:1332(1990)中公开了人弗林蛋白酶(即，PACE)的完整cDNA和氨基酸序列。
授予Barr等的美国专利No.5,460,950描述了重组PACE和PACE与异源蛋白的底物前体多肽的共表达以提高活性、成熟异源蛋白的表达。
授予van de Ven等的美国专利No.5,935,815同样描述了重组人弗林蛋白酶(即，PACE)和弗林蛋白酶与异源蛋白的底物前体多肽的共表达以提高活性、成熟异源蛋白的表达。该专利中公开的可能底物前提包括因子IX的前体。据报道除PACE外，哺乳动物弗林蛋白酶/枯草杆菌蛋白酶/Kex2p样前蛋白转化酶(PC)家族的其它家族成员包括PCSK1(也称为PC1/Pc3)、PCSK2(也称为PC2)、PCSK3(也称为弗林蛋白酶或PACE)、PCSK4(也称为PC4)、PCSK5(也称为PC5或PC6)、PCSK6(也称为PACE4)或PCSK7(也称为PC7/LPC、PC8或SPC7)。虽然这些不同成员共有某些保守的总体结构特征，但是它们在其组织分布、亚细胞定位、裂解特异性和优选底物上不同，为了审查，见Nakayama K(1997)Biochem J.327:625-35。与PACE类似，从氨基末端开始，这些前蛋白转化酶通常包括信号肽、前肽(其可能经自身催化裂解)、用Asp、His、Ser和Asn/Asp残基表征的枯草杆菌蛋白酶样催化结构域和也是催化活性所必需的并且用Arg-Gly-Asp(RGD)序列表征的Homo B结构域。PACE、PACE4和PC5还包括富含Cys的结构域，其功能未知。另外，PC5具有有和无跨膜结构域的同种型；这些不同的同种型分别称为PC5B和PC5A。PACE催化结构域的氨基酸序列和该前蛋白转化酶家族其它成员的催化结构域的氨基酸序列之间的比较显示出下列同一性程度：PC4为70％；PACE4和PC5为65％；PC1/PC3为61％；PC2为54％；并且LPC/PC7/PC8/SPC7为51％。Nakayama K(1997)Biochem J.327:625-35。
已经报道PACE和PACE4具有部分重叠但是不同的底物。具体而言，已经报道PACE4与PACE形成鲜明对比，不能够加工FIX的前体多肽。Wasley LC等(1993)J Biol Chem.268:8458-65；Rehemtulla A等(1993)Biochemistry.32:11586-90。
授予Seidah等的美国专利No.5,840,529公开了人PC7的核苷酸和氨基酸序列和与其它PC家族成员相比，PC7将HIV gp160裂解为gp120和gp41的显著能力。
Lusson J等(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90:6691-5首先将啮齿动物PC5的核苷酸和氨基酸序列描述为PC5并且由Nakagawa T等(1993)J Biochem(Tokyo)113:132-5描述为PC6。授予Day等的美国专利No.6,380,171公开了人没有跨膜结构域的同种型PC5A的核苷酸和氨基酸序列。这些酶的序列及其克隆方法在本领域中已知。
也可在非哺乳动物细胞例如细菌或酵母或植物细胞中表达编码本发明多肽的基因。在这点上，应认识到各种单细胞非哺乳动物微生物例如细菌也可转化；即，能够在培养或发酵中生长的微生物。对转化敏感的细菌包括肠杆菌科成员，例如大肠杆菌或沙门氏菌菌株；芽胞杆菌科，例如枯草杆菌；肺炎球菌；链球菌和流感嗜血杆菌。应进一步认识到，在细菌中表达时，多肽通常成为包涵体的一部分。所述多肽必须分离、纯化，然后组装成功能性分子。
除原核生物外，也可使用真核微生物。虽然许多其它菌株普遍可用，但是酿酒酵母或常见面包酵母是真核微生物中最常用的。
为了在酵母中表达，常用质粒YRp7，例如(Stinchcomb等，Nature,282:39(1979)；Kingsman等，Gene,7:141(1979)；Tschemper等，Gene,10:157(1980))。这种质粒已经含有为没有能力在色氨酸中生长的酵母突变菌株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标记的TRP1基因(Jones,Genetics,85:12(1977))。作为酵母宿主细胞基因组特征的trpl损伤的存在则提供了通过在色氨酸缺乏时的生长检测转化的有效环境。
也可采用其它酵母宿主例如毕赤酵母。需要具有表达控制序列(例如，启动子)、复制起点、终止序列等的酵母表达载体。典型启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其它糖酵解酶。其中，诱导型酵母启动子包括来自乙醇脱氢酶、异细胞色素C和负责甲醇、麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
可选地，可在转基因中并入编码多肽的核苷酸序列，以引入转基因动物的基因组中并且随后在转基因动物乳中表达(见，例如，Deboer等，US 5,741,957；Rosen，US 5,304,489和Meade等，US 5,849,992)。适合的转基因包括与来自乳腺特异性基因，例如酪蛋白和β乳球蛋白的启动子和增强子可操作连接的多肽编码序列。
体外生产运行扩大规模以产生大量所需多肽。本领域中已知在组织培养条件下进行哺乳动物细胞培养的技术并且包括(例如)在气升式反应器或连续搅拌釜式反应器中的均匀悬浮培养或(例如)在空心纤维、微胶囊中，在琼脂糖微珠或陶瓷管壳中的固定化或包埋细胞培养。如果必要和/或需要，例如在合成铰链区优先生物合成后或在本文所述HIC色谱法步骤之前或之后，可通过传统色谱法，例如凝胶过滤、离子交换色谱法、在DEAE-纤维素上的色谱法或(免疫)亲和色谱法纯化多肽溶液。可任选将亲和标签序列(例如，His(6)标签)连接或包括在多肽序列内以促进下游纯化。
在一个实施方案中，本发明的宿主细胞包含编码包含scFc接头的多肽的基因构建体和一种或多种可加工cscFc接头的酶。可适于单个载体或两个载体表达所述构建体和酶。因此由于胞内加工，由编码scFc接头的基因构建体生成的嵌合蛋白可具有附加多肽链。在一些实施方案中，嵌合蛋白可含有经裂解的蛋白酶劣迹位点(例如，RRRR)。
在一个实施方案中，本发明关于编码本发明多肽的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子编码包含增强子部分和选自可激活FVII或可激活FX的可激活凝血因子的嵌合蛋白，其中所述增强子部分增强了FVII和FX的活性。在另一实施方案中，核酸分子编码包含增强子部分、可激活凝血因子和任选介于可激活凝血因子和增强子部分之间的接头部分的嵌合蛋白。
在另一实施方案中，本发明关于编码包含FVII的多肽的核酸分子，所述FVII包含可由凝血级联组分激活的异源酶裂解位点。
一旦表达，就可根据本领域的标准程序，包括硫酸铵沉淀、亲和柱色谱法、HPLC纯化、凝胶电泳等纯化嵌合凝血因子(通常见Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,(1982))并且具体见本实施例中使用的方法。优选至少约90-95％均匀性的大体上纯净的蛋白质，并且最优选98-99％均匀性的大体上纯净的蛋白质，供制药使用。
在其它实施方案中，可通过将重组DNA技术与化学合成法结合，生成嵌合凝血因子。例如，本发明包括用编码包含凝血因子轻链、蛋白酶可裂解位点(例如，SUMO)、凝血因子截短重链、任选接头和增强子部分的嵌合凝血因子的多核苷酸转染宿主细胞的方法。小泛素样修饰物(或SUMO)是泛素(Ub)和泛素样(Ubl)家族的成员。翻译后SUMO附着于靶蛋白通过类似于泛素偶联级联的酶促级联(E1-E2-E3酶)发生，最终导致在Ub/Ubl C端残基和底物赖氨酸残基之间形成异肽键。
SUMO蛋白酶，也称为Ulp的高活性半胱氨酰蛋白酶，是来自酿酒酵母的Ulp1(Ubl特异性蛋白酶1)的重组片段。SUMO蛋白酶以高度特异性方式裂解，识别泛素样(UBL)蛋白SUMO的三级结构，而非氨基酸序列。所述蛋白酶可用于从重组融合蛋白裂解SUMO。SUMO蛋白的序列包含：
SLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKR
QGKEMDSLSFLUDGIFIQADQQPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG(SEQ ID NO：65)
在一些实施方案中，本发明包括用编码包含凝血因子轻链、任选胞内加工位点、蛋白酶可裂解位点(例如，SUMO)、凝血因子截短重链、任选接头和增强子部分的嵌合凝血因子的多核苷酸转染宿主细胞的方法，其中表达了嵌合凝血因子。在某些实施方案中，截短重链不包含来自对应于野生型重链的N端的一个或多个氨基酸。重链缺少一个或多个氨基酸以在FVII或FX上暴露出自然存在的半胱氨酸残基，以与硫酯肽化学连接。在一个实施方案中，在截短重链中缺少的氨基酸为6个氨基酸，例如对于FVII而言为IVGGKV(SEQ IDNO:60)或对于FX而言为IVGGQE(SEQ ID NO:61)。在另一实施方案中，在截短重链中缺少的氨基酸为11个氨基酸，例如对于FVII而言为IVGGKVCPKGE(SEQ ID NO:62)或对于FX而言为IVGGQECKDGE(SEQ ID NO:63)。在其它实施方案中，宿主细胞进一步包含编码胞内加工酶的多核苷酸序列，从而加工来自嵌合凝血因子的凝血因子的轻链。凝血因子的轻链可与凝血因子的重链形成二硫键。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括向重组表达的嵌合凝血因子结合(或添加)SUMO蛋白酶，其中SUMO蛋白酶从嵌合凝血因子裂解SUMO。SUMO的裂解可暴露出凝血因子的截短重链的N端(例如，Cys)，供进一步反应。
在其它实施方案中，所述方法进一步包括将要连接的硫酯肽添加到凝血因子的截短重链的N端(例如，Cys)。在一个实施方案中，硫酯肽可包含凝血酶裂解位点(例如，D-Phe-Pip-Arg)。在另一实施方案中，硫酯肽包含凝血酶裂解位点(例如，D-Phe-Pip-Arg)和自切除接头(例如，PABC)。在其它实施方案中，硫酯肽包含凝血酶裂解位点(例如，D-Phe-Pip-Arg)、自切除接头(例如，PABC)和与在凝血因子截短重链N端缺少的氨基酸相同的所述一个或多个氨基酸。在一个实施方案中，硫酯肽中的所述一个或多个氨基酸包含在截短重链中缺少的6个氨基酸(例如，对于FVII而言为IVGGKV(SEQ ID NO:60)或对于FX而言为IVGGQE(SEQ ID NO:61))。在另一实施方案中，硫酯肽中的所述一个或多个氨基酸包含在截短重链中缺少的11个氨基酸(例如，对于FVII而言为IVGGKVCPKGE(SEQ ID NO:62)或对于FX而言为IVGGQECKDGE(SEQID NO:63))。因此，当硫酯肽与凝血因子的截短重链融合时，嵌合凝血因子可包含可激活凝血因子、任选接头和增强部分，其中可激活凝血因子包含凝血酶裂解位点(例如，D-Phe-Pip-Arg)、自切除接头(例如，PABC)和凝血因子的全长重链。
IV.施用本发明多肽的方法
本发明还涉及为受试者治疗、改善或预防止血障碍的方法，包括施用治疗有效量的本发明的嵌合蛋白。用嵌合蛋白治疗、改善或预防可为旁路疗法。旁路疗法中的受试者可能已经发展出凝血因子，例如因子VIII的抑制物，或易于发展凝血因子抑制物。
用于向受试者施用的组合物包括包含编码本发明的嵌合凝血因子的核苷酸序列的核酸分子(用于基因疗法应用)以及多肽分子。
在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白组合物与至少一种促进止血的其它试剂联合施用。所述促进止血的其它试剂是证明了凝血活性的治疗剂。例如但不限于，止血剂可包括因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、凝血酶原或纤维蛋白原或前述任一种的活化形式。止血剂的凝血因子也可包括抗纤维蛋白溶解药物，例如ε-氨基-己酸、氨甲环酸。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物(例如，多肽或编码所述多肽的核酸分子)是在施用给受试者时，其中凝血因子呈可激活形式存在的组合物。可在施用给受试者后，在凝血部位体内激活这种可激活分子。
可经静脉、皮下、肌肉内或经由任何粘膜表面，例如口服、舌下、口腔、舌下、鼻、直肠、***或经由肺部途径施用本发明的嵌合蛋白。嵌合蛋白可植入或连接到允许向所需部位缓慢释放嵌合蛋白的生物聚合物载体。
对于口服施用，药物组合物可呈通过常规方式制备的片剂或胶囊形式。也可将所述组合物制备成液体，例如糖浆或混悬液。所述液体可包括助悬剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)、乳化剂(卵磷脂或***树胶)、非水媒介物(例如，扁桃仁油、油酯、乙醇或分馏植物油)和防腐剂(例如，甲基或丙基-对羟基苯甲酸酯或山梨酸)。所述制剂也可包括调味剂、着色剂和甜味剂。可选地，所述组合物可呈用水或另一种适合媒介物复水的干燥产品呈现。
对于口腔和舌下施用，根据常规方法，所述组合物可呈片剂、锭剂或速溶薄膜形式。
对于通过吸入施用，根据本发明使用的嵌合蛋白便于呈气溶胶喷雾的形式从加压包或喷雾器(例如，于PBS)中与推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其它适合气体一起递送。在为加压气溶胶的情况下，可通过提供阀门以递送计量的量，确定剂量单位。例如用于吸入器或吹入器的明胶胶囊和药筒可配制成含有所述化合物的粉末混合物和适合的粉末基质，例如乳糖或淀粉。
在一个实施方案中，本发明多肽的施用途径为肠胃外。如本文所使用，术语肠胃外包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或***施用。优选静脉形式的肠胃外施用。虽然明确地将这些形式的施用考虑为在本发明范围之内，但是对于注射，尤其是静脉或动脉注射或滴注而言，施用的形式应为溶液。通常，用于注射的适合药物组合物可包含缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)，任选稳定剂(例如，人白蛋白)等。然而，在与本文教导一致的其它方法中，可将多肽直接递送到有害细胞群的部位，从而增加患病组织向治疗剂的暴露。
供肠胃外施用的制剂包括无菌水或非水溶液、混悬液和乳液。非水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。含水载体包括水、醇溶液/水溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。在本发明中，药学上可接受的载体包括但不限于0.01-0.1M和优选0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其它常见肠胃外媒介物包括磷酸钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉媒介物包括液体和营养补充物、电解质补充物，例如基于林格氏葡萄糖的电解质补充物等。也可能存在防腐剂和其它添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
更具体地，适合注射用的药物组合物包括无菌水溶液(为水溶性时)或分散体和用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。在这种情况下，所述组合物必须无菌并且流动性应达到易于注射的程度。在生产和储存条件下应稳定并且优选保护其免受微生物，例如细菌和真菌的污染作用。所述载体可为含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适合混合物的溶剂或分散介质。例如，可通过使用包衣例如卵磷脂，在为分散体的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂，维持适当流动性。
可通过各种抗菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，实现对微生物作用的预防。在许多情况下，将优选在所述组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可通过在所述组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，引起可注射组合物的长时间吸收。
在任何情况下，可通过将活性化合物(例如，多肽本身或与其它活性试剂组合)，按所需量并入具有一种本文所列成分或其组合的适当溶剂中，根据需要，接着过滤灭菌制备无菌注射液。通常，可通过将活性化合物并入含有碱性分散介质和来自以上所列成分的所需其它成分的无菌媒介物中，制备分散体。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，由其先前经无菌过滤的溶液产生活性成分粉末加上任何附加所需成分。加工用于注射的制剂，过滤到容器，例如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶中，并且根据本领域已知的方法在无菌条件下密封。进一步地，可将所述制剂成试剂盒形式并出售。这种制品将优选具有表明相关组合物用于治疗患有或易患凝血障碍的受试者的标签或包装说明书。
也可配制药物组合物用于直肠施用，呈例如含有常规栓剂基质(例如可可油或其它甘油酯)的栓剂或保留灌肠。
本发明组合物用于病状治疗的有效剂量根据许多不同因素改变，包括施用方式、目标部位、患者的生理状态、患者是人类还是动物、施用的其它药剂和治疗为预防性还是治疗性。通常，患者为人，但是也可治疗包括转基因动物在内的非人类哺乳动物。可使用本领域技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
在一个实施方案中，生物活性部分(例如，包含FVII)的剂量范围可从约90至270ug/kg或0.090至0.270mg/kg。在另一实施方案中，生物活性部分(例如，包含FX)的剂量范围可从约1μg/kg至400mg/kg。
剂量范围可从1000ug/kg至0.1ng/kg体重。在一个实施方案中，剂量范围为1ug/kg至100ug/kg。可连续或按特定时间间隔施用蛋白质。可采用体外测定确定施用的最佳剂量范围和/或时间表。测量凝血因子活性的体外测定在本领域中已知，例如STA-CLOT Vlla-rTF凝血测定法。另外，可从由动物模型，例如血友病狗获得的剂量-反应曲线推断出有效剂量(Mount等2002,Blood 99(8):2670)。
也旨在使以上范围中间的剂量在本发明范围之内。可每天、隔天、每周或根据经验性分析确定的任何其它时间表为受试者施用这样的剂量。示例性治疗需要分多个剂量长期施用，例如至少6个月。在一些方法中，可同时施用两种或更多种多肽，在这种情况下，施用的每种多肽的剂量均在所示范围内。
可多次施用本发明的多肽。单次剂量之间的间隔可为每日、每周、每月或每年一次。通过测量患者体内经修饰多肽或抗原的血浓度表明，间隔也可不规则。可选地，多肽可作为缓释制剂施用，在这种情况下，不需要那么频繁的施用。剂量和频率根据患者体内多肽的半衰期而改变。
施用的剂量和频率可根据治疗为预防性还是治疗性而改变。在预防性应用中，向还未处于疾病状态的患者施用含有本发明多肽或其混合物的组合物以增强患者的抗性或将疾病的影响减到最低。将这种量定义为“预防有效剂量”。以相对较少的间隔，长期施用相对较低的剂量。一些患者在其余生继续接受治疗。
本发明的多肽可任选与治疗需要治疗(例如，预防性或治疗性)的病症或病状有效的其它试剂一起联合施用。
如本文所使用，连同或联合辅助疗法施用本发明的多肽指依次、同步、共同、同时、相伴或同时期施用或应用所述疗法和公开的多肽。本领域的技术人员将认识到，联合治疗方案各组分的施用或应用可定时以增强治疗的总体效果。技术人员将能够基于所选辅助疗法和本说明书的教导，容易地鉴别有效联合治疗方案，无需过度实验。
将进一步认识到本发明的多肽可连同或联合试剂一起使用(例如，以提供联合治疗方案)。可与本发明的多肽联合的示例性试剂包括代表对正在治疗的特定病症的当前护理标准的试剂。这种试剂在自然界中可能为化学性或生物性。术语“生物”或“生物试剂”指由活生物和/或其产物制成的旨在用作治疗剂的任何药物活性剂。
与本发明多肽联合使用的试剂的量可因受试者而改变或者可根据本领域所知施用。见例如，Bruce A Chabner等，Antineoplastic Agents，GOODMAN&GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287((Joel G.Hardman等编辑，1996年第9版)。在另一实施方案中，施用符合护理标准的量的这种试剂。
如先前所讨论，可按药学有效量施用本发明的多肽，进行凝血障碍的体内治疗。在这点上，将认识到可将本发明的多肽配制为利于施用并促进活性剂的稳定性。优选地，根据本发明的药物组合物包含药学上可接受的、无毒、无菌载体，例如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。当然，本发明的药物组合物可分单次或多次剂量施用以提供药学有效量的多肽。
在一个实施方案中，本发明的嵌合凝血因子可作为核酸分子施用。可使用本领域已知的技术，包括经由载体、质粒、脂质体、DNA注射、电穿孔、基因枪、静脉注射或肝动脉灌注，施用核酸分子。用于基因疗法实施方案的载体在本领域中已知。
与本公开的范围一致，可根据前述治疗方法，按足以产生治疗或预防效果的量，向人或其它动物施用本发明的嵌合凝血因子。
正如本领域的技术人员将认识到那样，本发明的嵌合蛋白具有许多用途，包括但不限于治疗有疾病或病状的受试者的方法。所述疾病或病状可包括但不限于止血障碍。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗有止血障碍的受试者的方法，包括施用治疗有效量的本发明的至少一种嵌合蛋白。
本发明的嵌合蛋白通过促进纤维蛋白凝块形成，治疗或预防止血障碍。本发明的嵌合蛋白可激活凝血级联的任何成员。凝血因子可为外源性途径、内源性途径或二者的参与者。
本发明的嵌合蛋白可用于治疗止血障碍，例如已知可用嵌合蛋白中存在的特定凝血因子治疗的止血障碍。可通过施用本发明的嵌合蛋白治疗的止血障碍包括但不限于血友病A、血友病B、血管性血友病、因子XI缺乏(PTA缺乏)、因子XII缺乏以及纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII缺乏或结构异常。
在一个实施方案中，止血障碍为遗传性病症。在一个实施方案中，受试者患有血友病A，并且嵌合蛋白包含与增强子部分连接或缔合的蛋白酶-可激活因子VII。在另一实施方案中，受试者患有血友病A并且嵌合凝血因子包含与增强子部分连接或缔合的蛋白酶-可激活因子VII。在另一实施方案中，受试者患有血友病B并且嵌合蛋白包含与增强子部分连接或缔合的蛋白酶-可激活因子VII或因子X。在另一实施方案中，受试者具有因子VIII或因子VIIIa的抑制性抗体并且嵌合凝血因子包含与增强子部分连接或缔合的蛋白酶-可激活因子VII。再一实施方案中，受试者具有因子IX或因子IXa的抑制性抗体并且嵌合蛋白包含与增强子部分连接或缔合的蛋白酶-可激活因子VII。在其它实施方案中，受试者具有因子VIII或因子VIIIa的抑制性抗体并且嵌合凝血因子包含与增强子部分连接或缔合的蛋白酶-可激活因子X。再一实施方案中，受试者具有因子IX或因子IXa的抑制性抗体并且嵌合蛋白包含与增强子部分连接或缔合的蛋白酶-可激活因子X。
本发明的嵌合凝血因子可用于预防性治疗有止血障碍的受试者。本发明的嵌合凝血因子可用于有止血障碍的受试者中治疗急性出血事件。
在一个实施方案中，止血障碍是凝血因子例如因此VII、因此IX或因子VIII缺乏的结果。在另一实施方案中，止血障碍可为有缺陷的凝血因子的结果。
在另一实施方案中，止血障碍可为获得性病症。获得性病症可由潜在继发性疾病或病状引起。例如，无关病状可为，但不限于，癌症、自身免疫性疾病或怀孕。获得性病症可由高龄或由治疗潜在继发性病症的药疗法(例如癌症化学疗法)引起。
本发明还涉及治疗没有止血障碍或导致获得止血障碍的继发性疾病或病状的受试者的方法。因此本发明涉及治疗需要一般止血剂的受试者的方法，包括施用治疗有效量的本发明的至少一种嵌合蛋白。例如，在一个实施方案中，需要一般止血剂的受试者正在进行或将要进行手术。本发明的嵌合蛋白可在手术之前作为预防药施用。本发明的嵌合蛋白可在手术期间或之后施用以控制急性出血事件。手术包括但不限于肝移植、肝切除或干细胞移植。
在另一实施方案中，本发明的嵌合蛋白可用于治疗有急性出血事件，没有止血障碍的受试者。急性出血事件可能由严重的创伤，例如手术、车祸、外伤、撕裂、中枪或导致不受控制的出血的任何其它创伤事件引起。
通过下列实施例进一步说明本发明，不得将下列实施例视为限制。遍及本申请引用的所有参考文献、专利和公开专利申请的内容以引用的方式并入本文。
实施例
实施例中，除非另有说明，则使用下列材料和方法。
实施例1.FVII-133的克隆
合成包含从FVII-133的HindIII位点到第一个EcoRI位点的核苷酸的DNA序列并亚克隆到pBUD-CE4.1(Invitrogen)的HindIII/EcoRI位点，生成中间构建体。接下来，合成包含从FVII-133的第一个EcoRI位点到第二个EcoRI位点的核苷酸的DNA区域并亚克隆到中间构建体的EcoRI位点以生成FVII-133(图4A)。
实施例2.FVII-133的瞬时表达
为了表达FVII-133，在37℃/10％CO2下，在用维生素K3(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)补充到2μg/升(生长培养基)的自由式培养基中(Invitrogen)，作为悬浮细胞培育HEK-293-F细胞。每3-4天，通过按5×105个细胞/ml的细胞密度接种，次代培养细胞。
转染前24小时，按7×105个细胞/ml的密度在生长培养基中接种细胞。转染当天，制备转染液，体积等于待转染细胞培养物总体积的5％。于转染液中，将DNA转染溶液(最终浓度20mg/L)添加到生长培养基中新制备的PEI溶液(60mg/L)。溶液涡旋30秒并且在室温下温育5分钟，之后直接添加到细胞培养物中。4小时后，向细胞中添加与细胞培养物体积相等体积的补充了维生素K3和200mM L-谷氨酰胺的OptiCHO(Invitrogen)。如上所示，使细胞培养物生长并且取每日培养基样品以评估蛋白质表达。收获当天，离心细胞并过滤培养基，为通过蛋白质A下拉(pulldown)进行蛋白质纯化或蛋白质分析作准备。为了表达FVII-133，使编码FVII-133的质粒与编码前肽肽链内切酶PC5的质粒共转染以确保连接Fc与sTF的接头中的肽链内切酶位点裂解(图4A)。
实施例3.对瞬时转染生成的蛋白质的分析
为了分析来自瞬时转染的蛋白质，使来自FVII-133与PC5共转染的条件培养基受蛋白质A免疫沉淀。简言之，使细胞培养物上清液与约50μl的蛋白质A-琼脂糖50％浆料混合并且在4℃下摇床培养1小时，然后离心以团块化蛋白质A珠粒。通过重新悬浮于1ml的PBS中，离心并抽吸洗涤珠粒两次。在还原或非还原条件下用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液使珠粒重新悬浮，在100℃下加热5分钟，离心并加载到SDS-PAGE凝胶上并且根据标准方法电泳。在非还原条件下，观察到具有预计分子量的凝血酶可激活FVII-Fc/sTF-Fc二聚体的1条带(图4C)。在还原条件下，观察到表示凝血酶可激活FVII-Fc亚基和sTF-Fc亚基的2条带。
实施例4.FVII-133的小规模纯化
将FcRn负载调节缓冲液(0.5ml)添加到5ml来自于经FVII-133瞬时转染的细胞的过滤条件培养基中。使用30,000MWCO、15ml离心过滤装置(目录号#UFC 903008)浓缩pH经调节的培养基(～5.5ml)。在4000rpm下离心培养基10’至～200ul体积，转移到管中并用平衡缓冲液将体积调至400ul。添加10ul的FcRn树脂并且在4℃下转动混合物过夜。将具有树脂的条件培养基加载到微柱体中并且在2000rpm下离心30”。用平衡缓冲液大面积洗涤所述柱。用30ul洗脱缓冲液洗脱蛋白质。洗脱缓冲液含有50mM Tris、250mM NaCl和0.02％吐温80(Tween-80)，pH为7.5。FcRn负载调节缓冲液含有0.5M MES和0.2％吐温80，pH为6.0。FcRn树脂含有与琼脂糖4快流(Sepharose 4 Fast Flow)偶联的可溶性FcRn。平衡缓冲液含有10mM MES、250mM NaCl、0.02％吐温80，pH为6.2。
在还原条件下，通过SDS PAGE分析洗脱物质。观察到具有预计分子量的凝血酶可激活FVII-Fc和sTF-Fc亚基的两条带(图5)。
实施例5.凝血酶原时间测定法测定的FVII-133活性
使用测量全部FVII，包括FVIIa在内的活性的Dade Innovin试剂(Siemens目录号539196)，通过凝血酶原时间测定FVIIaFc和纯化FVII-133的活性。遵照生产商建议。我们观察到FVIIaFc的活性为约10,000IU/mg，但是FVII-133的活性低于定量水平。因此，在缺乏凝血酶时，FVII-133仍呈酶原和无活性形式。
实施例6.凝血酶生成测定中FVII-133和FVIIaFc的活性
用Fluoroskan Ascent荧光计(Thermo Scientific)和来自于Thrombinoscope的试剂和分析软件，根据生产商的建议进行凝血酶生成测定。简言之，在5.4mM柠檬酸三钠、146mM NaCl(pH 6.8)中洗涤人血小板并重新悬浮在缺乏FVIII的人血浆(Siemens)中，以生成血小板浓度为2×108个血小板/ml的富血小板血浆(PRP)。注明时，每次反应含有缺乏FVIII的PRP、校准器(Thrombinoscope)或Tyrode缓冲液(15mM Hepes pH 7.4、138mM NaCl、2.7mM KCl、1mMMgCl2、5.5mM葡萄糖、1mg/ml BSA)、FVII-133或FVIIaFc(最终浓度50nM)和脂化组织因子(1/8稀释的PRP试剂，Thrombinoscope)。预计作为与内源性FVIIa的复合物的组织因子通过诱导生成少量凝血酶激活反应。如图6所示，FVII-133在组织因子(TF)存在或不存在时，展现出比FVIIaFc强得多的活性。有趣的是，在TF存在或不存在时，FVII-133显示出相似活性，但是凝血酶原时间测定显示FVII-133在凝血酶不存在时没有活性。这表明PRP中微量的凝血酶或TF(可依次与内源性FVIIa一起生成凝血酶)足以激活FVII-133。此外，这些数据显示，一经激活，FVII-133就具有高活性潜力。
实施例7.旋转式血栓弹性描记测定中FVII-133和FVIIaFc的活性
来自FIX缺陷型小鼠的柠檬酸化血用于这些实验。在ROTEM分析仪(Pentapharm)中根据生产商的建议进行血栓弹性描记法。简言之，将280ul血液转移到预加温ROTEM塑料杯中并加入FVIIaFc或FVII-133至最终浓度为50nM。添加EXTEM试剂(TF和钙)以引发反应。测量凝血时间和(CT)和α角。如图7所示，FVII-133和FVIIaFc分别展现出比媒介物显著低或高的凝血时间和α角。低凝血时间和大α角表明止血活性增加。这些数据显示FVII-133在受凝血酶激活时可展现出高活性。
实施例8.包含可激活FVII和增强子部分的替代嵌合凝血因子的生成
如图2所说明，将生成构建体用于表达凝血酶可激活的FVII，接着是接头和增强子部分(也称为“增强子部分”)。在一个实施方案中，增强子部分将为可溶性组织因子(来自成熟序列的残基1-219)。在另一实施方案中，增强子部分将为促凝血肽SYN3731或SYN3524(见，2012年6月9日提交并且作为WO2012/170969公布的国际申请No.PCT/US2012/041777，其以引用的方式整体并入本文)。在另一实施方案中，增强子部分将为源自增加FVIIa活性的抗体的抗体片段。例如，在Andersen LM等J Biol Chem.287:8994-9001(2012年1月24日)中描述了增强FVIIa活性的抗体。如先前所述，这些构建体将在哺乳动物细胞中瞬时表达，纯化并测试其活性(凝血酶原时间、凝血酶生成和ROTEM测定)。
实施例9.通过旋转式血栓弹性描记测定的人血友病A血液中FVII-133的体外活性
为测定凝血活性，将FVII-133蛋白加热来自血友病A供体的柠檬酸化人全血中。添加CaCl2引发凝块；在ROTEM分析仪(Pentapharm)上，按照生产商的建议测量凝血时间、凝血形成时间和α角。平行测试FVIIa和FVII-184；而FVIIa用作活性的比较物，采用FVII-184作为对照测定可由融合蛋白本身激活的内源性FVIIa的贡献，因为FVII-184通过使凝血酶裂解位点必需的Arg突变为Ala被设计为对凝血酶激活不敏感，但是其它与FVII-133相同。如图8所示，记录该血友病A供体中的凝血时间为2500秒。在全血中加入FVII-133以剂量依赖方式导致凝血时间短得多。对10和2nM的FVII-133记录的凝血时间分别比50、10nM的rFVIIa短。基于其凝血时间性质，估计FVII-133的活性比FVIIa高至少10倍。FVII-133凝血时间越快与其凝血形成时间越短和α角越大相关，这与FVII-133的止血活性越高一致。灭活FVII133的凝血酶裂解位点大大地降低了活性；因为FVII-184的活性，只有在50nM下变得可检测，比FVIIa的活性低得多，表明FVII-133的活性实际上由其自身凝血酶激活的FVIIa贡献，而不是内源性FVII/FVIIa。
实施例10.通过ROTEM分析，血友病B小鼠中FVII-133的活体外功效
为评估活体外功效，经由尾静脉注射为血友病B(hemB)小鼠服用20nmol/kg的FVII-133或对照蛋白质rFVIIa。服用2.5小时后，经由腔静脉放血按9:1比例从小鼠收集血液于CTI中。使血液复钙，并立即在ROTEM分析仪上测量。如图9所示，尽管在血友病B血液中测量的平均凝血时间为约1800秒，但是来自注射了FVII-133的小鼠的全血凝血时间短得多，接近500秒，表明FVII-133在体内有活性。
实施例11.FVII-133优于rFVIIaFc的改善PK性质
设计FVII-133作为FVII酶原循环，因此预计对抗凝血酶III(ATIII)介导的清除不太敏感。为评价FVII-133的药代动力学性质，按10nmol/kg向血友病B小鼠(n＝4)静脉注射纯化FVII-133、rFVIIaFc和rFVIIa，并且在不同时间经由腔静脉放血收集血浆样品并通过ELISA测定，分析FVII抗原和FVII-ATIII复合物。通过使用Phoenix程序(Pharsight)进行PK建模评估药代动力学参数。因为rFVIIa清除比FVII-133或rFVIIaFc迅速得多(图10A)，我们使用rFVIIaFc作为FVII-133药代动力学分析的比较物(图10B)。发现蛋白质的血浆浓度与时间曲线在双腔室模型中最佳拟合；如表4所示，所有PK参数均表明FVII-133比rFVIIaFc明显改善，终末半衰期更长(β半衰期分别为16.56小时与7.78小时)并且平均滞留时间更长(MRT 19.29小时与7.45小时)。
表4.PK参数：FVII-133与FVIIaFc
另外，尽管检测到大量rFVIIaFc/ATIII复合物，但是血浆中的FVII-133/ATIII复合物几乎不可检测。总之，这些结果表明FVII-133成功地避免了ATIII介导的清除，导致在PK性质方面比rFVIIaFc明显改善。
实施例12.在血友病A小鼠中FVII-212比rFVIIa的活体外功效更长
FVII-212与FVII-133相同，但是由改进的表达载体编码。与FVII-133相似，每次ROTEM测定FVII-212在人血友病A血液中展现出比rFVIIa更高的体外凝血活性(图11)。然而，在小鼠血友病A血液中，发现FVII-212的活性与rFVIIa相似(图12)，表明FVII-212在小鼠中比在人类中活性低。
为评估FVII-212的活体外功效并且通过实施例10确证所述发现(FVII-133在血友病B小鼠中的活体外功效)，在血友病A小鼠中按10nmol/kg施用FVII-212；在不同时间取血样，并且用ROTEM分析仪在NATEM程序下测量凝血活性。平行包括rFVIIa作为比较物。如图13所示，虽然在服药5分钟后收集的血液的凝血时间在rFVII-212和rFVIIa处理组之间相似，但是从FVII-212组稍后时间点收集的血液比rFVIIa组相应时间点的血液凝结得更快。结果表明与rFVIIa相比，FVII-212的活体内功效更长。
如实施例11所示，在血友病B小鼠中FVII-133展现出高于rFVIIaFc的PK性质，认为这有助于这种蛋白质的功效延长。与血友病B小鼠中的FVII-133相似，血友病A小鼠中FVII-212的清除大大慢于rFVIIa的清除(图14)，由约18小时的较长终末半衰期(通过rFVIIa的活性测量时，与rFVIIa在血友病A血浆中约1小时的半衰期相比)以及经处理血友病A小鼠中不存在rFVII-212-ATIII复合物表示。
总之，该实施例扩展了先前的发现并且证明1)FVII-212在血友病A小鼠中展现出比rFVIIa更长的活体外功效；2)FVII-212功效延长是由PK性质改善引起；并且3)对ATIII抑制的抗性至少部分有助于FVII-212的PK改善。
实施例13.FVII-212的酰胺分解活性
使用色酶t-PA底物激活凝血酶之前和之后测量FVII-212的酰胺分解活性。为了激活凝血酶，在37℃下用凝血酶(50nM)处理FVII-212(100nM)20分钟。随后用水蛭素(250nM)抑制凝血酶。
如图15所示，凝血酶激活之前，FVII-212未展现出活性。凝血酶激活之后，与FVII-212相关的酰胺分解活性高于对等摩尔水平的rFVIIa观察到的酰胺分解活性。这些数据证明，FVII-212的活性依赖于凝血酶激活。
实施例14.具有PABC自切除接头的凝血酶可激活促凝血化合物
将指定为化合物1-6的6种不同肽用于本文公开的实验中(表5)。在该特定实例FX中，化合物1-6中的序列重复凝血酶可裂解底物和自切除间隔与凝血酶因子或其片段N端的偶联。这些化合物包含FXa凝血因子重链N端6个氨基酸残基，Ile-Val-Gly-Gly-Gln-Glu，并且用作显示本文公开的促凝血化合物设计对凝血因子的适用性的模型。
表5
Pip为哌啶酸。(D-Phe)为D-苯丙氨酸。凝血酶底物的序列加有下划线。PABC自切除接头的位置用框标出。
图8描绘了14nM凝血酶对化合物1、2和3的清除。在该特定实例中，将50μL于水中的肽(1mM)添加到900μL PBS中，接着添加50μL凝血酶(278nM，10μg/mL)，达到下列近似初始浓度：凝血酶＝14nM，肽＝50μM。在室温下温育混合物。在不同时间点用5μL水蛭素(2μM)猝灭等分试样(95μL)并注入HPLC(C-18柱，CH3CN/H2O，12分钟内0-70％，60℃0.5mL/min，nm)。使用肽峰面积的减少量计算产率。
与化合物2和3相比，并入了凝血酶可裂解合成底物D-Phe-Pip-Arg和自切除间隔PABC的构建体(化合物1)是更好的凝血酶底物。向化合物1中并入PABC导致与化合物2相比，裂解速率增加至少10倍。
图19描绘了1.4nM凝血酶对化合物1、4、5和6的裂解。化合物1、4和5并入了PABC和不同的凝血酶可裂解底物。将50μL于水中的肽(1mM)添加到900μL PBS中。在37℃下温育混合物30min，接着添加50μL凝血酶(27.8nM，1μg/mL)，达到下列近似初始浓度：凝血酶＝1.4nM，肽＝50μM。在37℃下温育混合物。在不同时间点用5μL水蛭素(2μM)猝灭等分试样(95μL)并注入HPLC(C-18柱，CH3CN/H2O，12分钟内0-70％，60℃0.5mL/min，)。使用肽峰面积的减少量计算产率。
化合物1是比化合物4和5更好的凝血酶底物。在1.4nM凝血酶生理相关浓度下，30％的化合物1迅速裂解并释放。相反，未观察到凝血酶介导的肽IVGGQE从没有PABC接头的化合物6中释放。
实施例15.具有SUMO裂解位点的凝血酶可激活FVII-186
为了克隆FVII-186，合成包含FVII-186(表#)从HindIII位点到EcoRI位点的核苷酸的DNA序列。将所述DNA亚克隆到pcDNA的HindIII/EcoRI位点。
为瞬时表达FVII-186，在37℃/10％CO2下，在用维生素K3(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)补充到2μg/升(生长培养基)的培养基中(Invitrogen)，作为悬浮细胞悬浮培养HEK-293-F细胞。每3-4天，通过按5×105个细胞/ml的细胞密度接种，次代培养细胞。转染前24小时，按7×105个细胞/ml的密度在生长培养基中接种细胞。转染当天，制备转染液，体积等于待转染细胞培养物总体积的5％。于转染液中，将DNA(最终浓度20mg/L)添加到生长培养基中新制备的PEI溶液(60mg/L)。溶液涡旋30秒并且在室温下温育5分钟，之后直接添加到细胞培养物中。4小时后，向细胞中添加与细胞培养物体积相等体积的补充了维生素K3和200mM L-谷氨酰胺的OPTICHOTM(Invitrogen)。如上所示，使细胞培养物生长并且取每日培养基样品以评估蛋白质表达。收获当天，离心细胞并过滤培养基，为通过蛋白质A下拉(pulldown)进行蛋白质纯化或蛋白质分析作准备。为了表达FVII-186，使编码FVII-186的质粒与编码前蛋白转化酶PACE的质粒共转染以确保加工和裂解连接FVII轻链与SUMO的接头中的前蛋白转化酶裂解位点(2X(RKR)SEQ ID NO:3)(图22)。
为纯化FVII-186，在用2.0M Tris(pH 8.0)将pH调节到7.4后，将条件培养基加载到Q快流25-mL柱上(GE HealthCare Life Sciences)。用10mM MES、50mM NaCl(pH 6.5)洗涤柱。用10mM MES、100mM NaCl、20mM CaCl2(pH 6.5)洗脱蛋白质。汇合含FVII-186的成分并且在用0.5M MES(pH 5.5)将pH调节到6.2后，加载到rhFcRn-琼脂糖的25-mL柱上。用50mM MES、100mM NaCl(pH 6.2)洗涤后，用10mM Tris、250mMNaCl(pH 8.0)洗脱结合的物质并用SDS-PAGE分析。
FVII-186被SUMO蛋白酶裂解，如下。在室温下用10μL含有0.4mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、20mM谷胱甘肽(GSH)、0.2U/μL SUMO蛋白酶(Invitrogen目录号12588-018)的100mM HEPES、20mM CaCl2、0.004％吐温80培育FVII-186(0.83mg/mL，10μL)48小时。还原SDS-PAGE(图23，条带3)显示FVII-186几乎完全转化为所需FVIIHC。
对于FVII-186的SUMO蛋白酶裂解和与硫酯肽的天然化学连接，在室温下用10μL含有0.4mM作为阳性对照肽的SYN470、0.4mM GSSG、20mMGSH、0.2U/μL SUMO蛋白酶(Invitrogen目录号12588-018)的100mM HEPES、20mM CaCl2、0.004％吐温80培育FVII-186(0.83mg/mL，10μL)48小时。还原SDS-PAGE(图#，条带4)显示FVIIHC带完全消失和作为阳性肽对照与FVIIHC偶联物的一条新带。
为了合成凝血酶可激活的FVII-186(TA-FVII-186)，在室温下用200μL含有0.4mM FVII-PABC肽(即，D-Phe-Pip-Arg-PABC-IVGGKV-COSBn)(SEQID NO:66)、0.4mM GSSG、20mM GSH、0.2U/μL SUMO蛋白酶(Invitrogen目录号12588-018)的100mM HEPES、20mM CaCl2、0.004％吐温80培育FVII-186(0.83mg/mL，200μL)48小时并通过还原SDS-PAGE分析(图23，条带5)。将反应混合物置于具有10k MWCO的0.5mL透析盒中并且在4℃下用1L含有0.4mMGSSG、2mM GSH的10mM Tris、250mM NaCl(pH 8.0)透析24小时。如所述，用rhFcRn-琼脂糖柱进一步纯化偶联物。
凝血酶裂解和TA-FVII-186激活后进行FVIIa显色测定(图24)。该测定通过测量可由活化FX(FXa)裂解的发色底物的水平，测量FVIIa激活FX的活性，测量了FX激活活性。在37℃下用凝血酶(140nM)激活TA-FVII-186(200nM)20分钟。添加水蛭素以猝灭凝血酶。添加sTF-PL混合物(AFVII-rTF试剂盒)、FX和FXa底物并通过测量405nm下的吸光度监测反应。在凝血酶的存在下，缺少N端6个氨基酸的FVII-186无活性。只有具有和完整重链FVII连接的凝血酶裂解位点的TA-FVII-186在凝血酶裂解后显示出活性。所产生的活性证明，FVII PABC肽成功地与FVII截短重链的N端半胱氨酸偶联，受凝血酶裂解后生成至关重要的N端异亮氨酸残基，并且形成的蛋白质具有活性的基本结构。
上面已经借助于说明指定功能的实施及其关系的功能构造块描述了本发明。为了便于描述，本文已经任意限定了这些功能构造块的边界。只要恰当地执行指定功能及其关系，就可以定义替代边界。
前面对特定实施方案的描述将如此全面地揭示本发明的一般特性，以致其他人通过应用本领域技术范围内的知识，在不背离本发明一般概念的前提下，可容易地修改这种特定实施方案和/或适应各种应用，无需过度实验。因此，根据本文提出的教导和指导，旨在使这种适应和修改属于公开实施方案的等效方案的意义和范围内。应理解，本文的措词或术语是为了描述而非限制，以致本说明书的术语或措词将由技术人员根据所述教导和指导进行解释。
本发明的广度和范围不应受上述任何示例性实施方案限制，但是应仅仅根据下列权利要求及其等效权利要求限定。从本文公开的说明书和本发明实践考虑，本发明的其它实施方案将对本领域的技术人员显而易见。
本文引用的所有专利和出版物以引用的方式整体并入本文。
序列
FVII-133的SEQ ID NO:44DNA序列
SEQ ID NO: 45：FVII-133氨基酸序列。用带点下划线示出了信号序列，前肽加有波浪下划线，在轻链和重链之间***的凝血酶裂解位点加有双下划线，连接FVII与Fc区的接头加有下划线，用粗体示出了具有前蛋白转化酶加工位点，连接Fc和sTF的接头，并且连接sTF与Fc的接头区为虚下划线。轻链从残基39扩展到189，重链从残基195到448，而sTF从残基742到960。
FVII-184的SEQ ID NO: 46 DNA序列。
SEQ ID NO:47：FVII-184氨基酸序列。用带点下划线示出了信号序列，前肽加有波浪下划线，在轻链和重链之间***的突变凝血酶裂解位点加有双下划线，Arg向Ala突变(残基194)为粗体，连接FVII与Fc区的接头区加有下划线，用粗体示出了具有前蛋白转化酶加工位点，连接Fc和sTF的接头，并且连接sTF与Fc的接头区为虚下划线。轻链从残基39扩展到189，重链从残基195到448，而sTF从残基742到960。
SEQ ID NO：32
>CTP肽1
DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL
SEQ ID NO：33
>CTP肽2
SSSSKAPPPSLPSPSRLPGRSDTPILPQ
SEQ ID NO：36
>PAS肽1
ASPAAPAPASPAAPAPSAPA
SEQ ID NO：37
>PAS肽2
AAPASPAPAAPSAPAPAAPS
SEQ ID NO：38
>PAS肽3
APSSPSPSAPSSPSPASPSS
SEQ ID NO：39
>PAS肽4
APSSPSPSAPSSPSPASPS
SEQ ID NO：40
>PAS肽5
SSPSAPSPSSPASPSPSSPA
SEQ ID NO：41
>PAS肽6
AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA
SEQ ID NO：42
>PAS肽7
ASAAAPAAASAAASAPSAAA
SEQ ID NO：35
>白蛋白结合肽核心序列
DICLPRWGCLW
SEQ ID NO：48
>GFP蛋白质序列(基因库ID AAG34521.1)
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFGYGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKSRTSGSPGLQEFDIKLIDTVDLESCN
SEQ ID NO：49
>实例：单链人IgG1 Fc。(具有加下划线的Gly/Ser接头的Fc序列。)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：50
>成熟人白蛋白蛋白质序列(源自NCBI参考序列NP_000468)：
RGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLBKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADFHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELPEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAXRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO：51
>白蛋白结合肽1
RLIEDICLPRWGCLWEDD
SEQ ID NO：52
>白蛋白结合肽2
QRLMEDICLPRWGCLWEDDF
SEQ ID NO：53
>白蛋白结合肽3
QGLIGDICLPRWGCLWGDSVK
SEQ ID NO：54
>白蛋白结合肽4
GEWWEDICLPRWGCLWEEED
SEQ ID NO：55
>含半胱氨酸的肽
GGGSGCGGGS
SEQ ID NO：56
>人LRP1序列(加下划线的信号肽和跨膜片段；NCBI参考序列：CAA32112)
KCNSGRCIPEHWTCDGDNDCGDYSDETHANCTNQATRPPGGCHTDEFQCRLDGLCIPLRWRCDGDTDCMDSSDEKSCEGVTHVCDPSVKFGCKDSARCISKAWVCDGDNDCEDNSDEENCESLACRPPSHPCANNTSVCLPPDKLCDGNDDCGDGSDEGELCDQCSLNNGGCSHNCSVAPGEGIVCSCPLGMELGPDNHTCQIQSYCAKHLKCSQKCDQNKFSVKCSCYEGWVLEPDGESCRSLDPFKPFIIFSNRHEIRRIDLHKGDYSVLVPGLRNTIALDFHLSQSALYWTDVVEDKIYRGKLLDNGALTSFEVVIQYGLATPEGLAVDWIAGNIYWVESNLDQIEVAKLDGTLRTTLLAGDIEHPRAIALDPRDGILFWTDWDASLPRIEAASMSGAGRRTVHRETGSGGWPNGLTVDYLEKRILWIDARSDAIYSARYDGSGHMEVLRGHEFLSHPFAVTLYGGEVYWTDWRTNTLAKANKWTGHNVTVVQRTNTQPFDLQVYHPSRQPMAPNPCEANGGQGPCSHLCLINYNRTVSCACPHLMKLHKDNTTCYEFKKFLLYARQMEIRGVDLDAPYYNYIISFTVPDIDNVTVLDYDAREQRVYWSDVRTQAIKRAFINGTGVETVVSADLPNAHGLAVDWVSRNLFWTSYDTNKKQINVARLDGSFKNAVVQGLEQPHGLVVHPLRGKLYWTDGDNISMANMDGSNRTLLFSGQKGPVGLAIDFPESKLYWISSGNHTINRCNLDGSGLEVIDAMRSQLGKATALAIMGDKLWWADQVSEKMGTCSKADGSGSVVLRNSTTLVMHMKVYDESIQLDHKGTNPCSVNNGDCSQLCLPTSETTRSCMCTAGYSLRSGQQACEGVGSFLLYSVHEGIRGIPLDPNDKSDALVPVSGTSLAVGIDFHAENDTIYWVDMGLSTISRAKRDQTWREDVVTNGIGRVEGIAVDWTAGNIYWTDQGFDVIEVARLNGSFRYVVISQGLDKPRAITVHPEKGYLFWTEWGQYPRIERSRLDGTERVVLVNVSISWPNGISVDYQDGKLYWCDARTDKIERIDLETGENREVVLSSNNMDMFSVSVFEDFIYWSDRTHANGSIKRGSKDNATDSVPLRTGIGVQLKDIKVFNRDRQKGTNVCAVANFFCQQLCLYRGRGQRACACAHGMLAEDGASCREYAGYLLYSERTILKSIHLSDERNLNAPVQPFEDPEHMKNVIALAFDYRAGTSPGTPNRIFFSDIHFGNIQQINDDGSRRITIVENVGSVEGLAYHRGWDTLYWTSYTTSTITRHTVDQTRPGAFERETVITMSGDDHPRAFVLDECQNLMFWTNWNEQHPSIMRAALSGANVLTLIEKDIRTPNGLAIDHRAEKLYFSDATLDKIERCEYDGSHRYVILKSEPVHPFGLAVYGEHIFWTDWVRRAVQRANKHVGSNMKLLRVDIPQQPMGIIAVANDTNSCELSPCRINNGGCQDLCLLTHQGHVNCSCRGGRILQDDLTCRAVNSSCRAQDEFECANGECINFSLTCDGVPHCKDKSDEKPSYCNSRRCKKTFRQCSNGRCVSNMLWCNGADDCGDGSDEIPCNKTACGVGEFRCRDGTCIGNSSRCNQFVDCEDASDEMNCSATDCSSYFRLGVKGVLFQPCERTSLCYAPSWVCDGANDCGDYSDERDCPGVKRPRCPLNYFACPSGRCIPMSWTCDKEDDCEHGEDETHCNKFCSEAQFECQNHRCISKQWLCDGSDDCGDGSDEAAHCEGKTCGPSSFSCPGTHVCVPERWLCDGDKDCADGADESIAAGCLYNSTCDDREFMCQNRQCIPKHFVCDHDRDCADGSDESPECEYPTCGPSEFRCANGRCLSSRQWECDGENDCHDQSDEAPKNPHCTSPEHKCNASSQFLCSSGRCVAEALLCNGQDDCGDSSDERGCHINECLSRKLSGCSQDCEDLKIGFKCRCRPGFRLKDDGRTCADVDECSTTFPCSQRCINTHGSYKCLCVEGYAPRGGDPHSCKAVTDEEPFLIFANRYYLRKLNLDGSNYTLLKQGLNNAVALDFDYREQMIYWTDVTTQGSMIRPMHLNGSNVQVLHRTGLSNPDGLAVDWVGGNLYWCDKGRDTIEVSKLNGAYRTVLVSSGLREPRALVVDVQNGYLYWTDWGDHSLIGRIGMDGSSRSVIVDTKITWPNGLTLDYVTERIYWADAREDYIEFASLDGSNRHVVLSQDIPHIFALTLFFDYVYWTDWETKSINRAHKTTGTNKTLLISTLHRPMDLHVFHALRQPDVPNHPCKVNNGGCSNLCLLSPGGGHKCACPTNFYLGSDGRTCVSNCTASQFVCKNDKCIPFWWKCDTEDDCGDHSDEPPDCPEFKCRPGQFQCSTGICTNPAFICDGDNDCQDNSDEANCDIHVCLPSQFKCTNTNRCIPGIFRCNGQDNCGDGEDERDCPEVTCAPNQFQCSITKRCIPRVWVCDRDNDCVDGSDEPANCTQMTCGVDEFRCKDSGRCIPARWKCDGEDDCGDGSDEPKEECDERTCEPYQFRCKNNRCVPGRWQCDYDNDCGDNSDEESCTPRPCSESEFSCANGRCIAGRWKCDGDMDCADGSDEKDCTPRCDMDQFQCKSGHCIPLRWRCDADADCMDGSDEEACGTGVRTCPLDEFQCNNTLCKPLAWKCDGEDDCGDNSDENPEECARFVCPPNRPFRCKNDRVCLWIGRQCDGTDNCGDGTDEEDCEPPTARTTHCKDKKEFLCRNQRCLSSSLRCNMFDDCGDGSDEEDCSIDPKLTSCATNASICGDEARCVRTEKAAYCACRSGFHTVPGQPGCQDINECLRFGTCSQLCNNTKGGHLCSCARNFMKTHNTCKAEGSEYQVLYIADDNEIRSLFPGHPHSAYEQAFQGDESVRIDAMDVHVKAGRVYWTNWHTGTISYRSLPPAAPPTTSNRHRRQIDRGVTHLNISGLKMPRGIAIDWVAGNVYWTDSGRDVIEVAQMKGENRKTLISGMIDEPHAIVVDPLRGTMYWSDWGNHPKIETAAMDGTLRETLVQDNIQWPTGLAVDYHNERLYWADAKLSVIGSIRLNGTDPIVAADSKRGLSHPFSIDVFEDYIYGVTYINNRVFKIHKFGHSPLVNLTGGLSHASDVVLYHQHKQPEVTNPCDRKKCEWLCLLSPSGPVCTCPNGKRLDNGTCVPVPSPTPPPDAPRPGTCNLQCFNGGSCFLNARRQPKCRCQPRYTGDKCELDQCWEHCRNGGTCAASPSGMPTCRCPTGFTGPKCTQQVCAGYCANNSTCTVNQGNQPQCRCLPGFLGDRCQYRQCSGYCENFGTCQMAADGSRQCRCTAYFEGSRCEVNKCSRCLEGACVVNKQSGDVTCNCTDGRVAPSCLTCVGHCSNGGSCTMNSKMMPECQCPPHMTGPRCEEHVFSQQQPGHIASILIPLLLLLLLVLVAGV VFWYKRRVQGAKGFQHQRMTNGAMNVEIGNPTYKMYEGGEPDDVGGLLDADFALDPDKPTNFTNPVYATLYMGGHGSRHSLASTDEKRELLGRGPEDEIGDPLA
SEQ ID NO：57
>生物素受体肽(BAP)
LNDTFEAQKIEWH
SEQ ID NO：58
>脂酸受体肽2(LAP2)
GFEIDKVWYDLDA
SEQ ID NO：4
>HAP化基序，n＝1-400
(Gly4Ser)n
SEQ ID NO：59
>CTP
DSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ
SEQ ID NO：65
>SUMO
SLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKR
QGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG
SEQ ID NO：66
>FVII-PABC肽
D-Phe-Pip-Arg-PABC-IVGGKV-COSBn

Claims (106)

1.一种嵌合蛋白，包含(i)可激活凝血因子(Ac)，(ii)增强子部分(Em)，和(iii)所述可激活凝血因子和增强子部分之间的任选接头部分(L或L1)。
2.根据权利要求1所述的嵌合蛋白，其中所述可激活凝血因子和所述增强子部分相互连接或缔合，但是未化学交联。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合蛋白，包含式Ac-L-Em或Em-L-Ac表示的结构，其中Ac包含所述可激活凝血因子；其中L包含所述任选接头部分；并且其中Em包含所述增强子部分。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述可激活凝血因子包含含重链(HC)和轻链(LC)及***所述HC和所述LC之间的蛋白酶裂解位点的凝血因子酶原。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述增强子部分包含凝血辅因子、促凝血肽或抗原结合部分。
6.根据权利要求4或5所述的嵌合蛋白，其中所述凝血因子酶原为FVII蛋白或FX蛋白。
7.根据权利要求5或6所述的嵌合蛋白，其中所述促凝血肽是合成的。
8.根据权利要求5或6所述的嵌合蛋白，其中所述促凝血肽包含(a)含式C1LASYC2的氨基酸序列
其中
L为L-亮氨酸；
A为L-丙氨酸；
S为L-丝氨酸；
Y为L-酪氨酸；
L、A、S和Y中的一个或两个经独立地选自D-和L-氨基酸的置换氨基酸任选置换；
一个附加氨基酸任选***式(I)介于C1和C2之间的任何地方；并且
C1和C2独立地选自具有侧链的氨基酸，其中C1和C2的侧链连接形成环；或
(b)(a)的氨基酸序列的逆向、反向或逆-反向变体。
9.根据权利要求4-6中任一项所述的嵌合蛋白，其中：
(a)所述凝血因子酶原包含FVII蛋白，并且所述凝血辅因子包含组织因子蛋白；或
(b)所述凝血因子酶原包含FX蛋白，并且所述凝血辅因子包含FVa蛋白。
10.根据权利要求9所述的嵌合蛋白，其中所述组织因子蛋白为可溶性组织因子(sTF)。
11.根据权利要求5-10中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述抗原结合部分包含能够与所述FVII蛋白或FX蛋白结合并分别增强所述FVII蛋白或FX蛋白的活性的抗体或其抗原结合片段。
12.根据权利要求11所述的嵌合蛋白，进一步包含***所述蛋白酶裂解位点和所述HC之间的自切除部分。
13.根据权利要求4-12中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述蛋白酶裂解位点被选自凝血酶(因子IIa)、因子XIa、因子XIIa、激肽释放酶、因子VIIa、因子IXa和因子Xa的蛋白酶裂解，其中所述蛋白酶裂解位点并非自然存在于所述凝血因子酶原中。
14.根据权利要求12或13所述的嵌合蛋白，其中所述自切除部分包含对氨基苄基氨基甲酸酯(PABC)、对氨基苄基醚(PABE)、对氨基苄基碳酸酯。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的嵌合蛋白，进一步包含异源部分(Het)。
16.根据权利要求15所述的嵌合蛋白，其中所述异源部分(Het)为半衰期延长剂。
17.根据权利要求16所述的嵌合蛋白，其中所述半衰期延长剂包含免疫球蛋白恒定区或其一部分、白蛋白、转铁蛋白、白蛋白结合部分、PAS序列、HES序列、人绒毛膜***C端肽(CTP)的β亚基、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合小分子或其任何组合。
18.根据权利要求16所述的嵌合蛋白，其中所述免疫球蛋白恒定区或其一部分包含Fc部分或FcRn结合伴侣。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的嵌合蛋白，进一步包含第二异源部分(Het2)，并且任选包含与所述第一接头部分(L或L1)相同或不同的第二接头部分(L2)。
20.根据权利要求19所述的嵌合蛋白，其中所述第二异源部分(Het2)包含半衰期延长剂。
21.根据权利要求20所述的嵌合蛋白，其中所述半衰期延长剂包含免疫球蛋白恒定区或其一部分、白蛋白、转铁蛋白、白蛋白结合部分、PAS序列、HES序列、人绒毛膜***C端肽(CTP)的β亚基、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合小分子或其任何组合。
22.根据权利要求21所述的嵌合蛋白，其中所述免疫球蛋白恒定区或其一部分包含Fc部分或FcRn结合伴侣。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含所述可激活凝血因子(Ac)并且所述第二多肽链包含所述增强子部分(Em)，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链相互缔合。
24.根据权利要求19-22中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含所述可激活凝血因子(Ac)、所述第一异源部分(Het1)和所述第一任选接头部分(L1)，并且所述第二多肽包含所述增强子部分(Em)、所述第二异源部分(Het2)和所述第二任选接头部分(L2)，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链相互缔合。
25.根据权利要求24所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白具有选自以下的结构：
(a)Ac经由所述接头部分与Het1连接，并且Em与Het2连接；
(b)Ac经由所述第一接头部分与Het1连接，并且Em经由所述第二接头部分与Het2连接；
(c)Ac与Het1连接，并且Em经由所述接头部分与Het2连接；
(d)Ac与Het1连接，并且Em与Het2连接；
(e)Em经由所述接头部分与Het1连接；并且Ac与Het2连接；
(f)Em经由所述第一接头部分与Het1连接，并且Ac经由所述第二接头部分与Het2连接；
(g)Em与Het1连接，并且Ac经由所述接头部分与Het2连接；和，
(h)Em与Het1连接，并且Ac与Het2连接。
26.根据权利要求25所述的嵌合蛋白，其包含两条多肽，其中：
(a)所述第一多肽包含式Ac-L1-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Em-Het2表示的结构；
(b)所述第一多肽包含式Ac-L1-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Em-L2-Het2表示的结构；
(c)所述第一多肽包含式Ac-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Em-Het2表示的结构；
(d)所述第一多肽包含式Ac-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Em-L1-Het2表示的结构；
(e)所述第一多肽包含式Em-L1-Het2表示的结构，并且所述第二多肽包含式Ac-Het1表示的结构；
(f)所述第一多肽包含式Em-L2-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Ac-L1-Het2表示的结构；
(g)所述第一多肽包含式Em-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Ac-L1-Het2表示的结构；和，
(h)所述第一多肽包含式Em-Het1表示的结构，并且所述第二多肽包含式Ac-Het2表示的结构；
其中所述两条多肽链的Het1和Het2形成二硫键。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的嵌合蛋白，包含至少一个接头部分。
28.根据权利要求18-27中任一项所述的嵌合蛋白，包含两个接头部分。
29.根据权利要求28所述的嵌合蛋白，其中所述两个接头部分相同。
30.根据权利要求28所述的嵌合蛋白，其中所述两个接头部分不同。
31.根据权利要求27-30中任一项所述的嵌合蛋白，其中至少一个接头部分具有包含约10个至约50个氨基酸的氨基酸序列。
32.根据权利要求31所述的嵌合蛋白，其中所述至少一个接头部分具有包含约20个至约30个氨基酸的氨基酸序列。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述接头部分包含gly/ser肽。
34.根据权利要求33所述的嵌合蛋白，其中所述gly/ser肽包含式(Gly4Ser)n或Ser(Gly4Ser)n的氨基酸序列，其中n为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的正整数。
35.根据权利要求34所述的嵌合蛋白，其中所述(Gly4Ser)n肽包含选自(Gly4Ser)6、Ser(Gly4Ser)6、(Gly4Ser)4和Ser(Gly4Ser)4.的氨基酸序列。
36.根据权利要求35所述的嵌合蛋白，其中所述(Gly4Ser)n肽为(Gly4Ser)6肽。
37.根据权利要求1-22中任一项所述的嵌合蛋白，其为单条多肽链。
38.根据权利要求37所述的嵌合蛋白，进一步包含连接所述增强子部分和所述第一异源部分或所述可激活凝血因子和所述第二异源部分的scFc接头(X)。
39.根据权利要求38所述的嵌合蛋白，包含选自以下的式：
(1)  Ac-Het1-X-Em-Het2；
(2)  Ac-Het1-X-Em-L2-Het2；
(3)  Ac-L1-Het1-X-Em-Het2；
(4)  Ac-L1-Het1-X-Em-L2-Het2；
(5)  Het2-Em-X-Het1-Ac；
(6)  Het2-L2-Em-X-Het1-Ac；
(7)  Het2-Em-X-Het1-L1-Ac；和
(8)  Het2-L2-Em-X-Het1-L1-Ac，
其中
(a)Ac为所述可激活凝血因子，
(b)L1为所述第一任选接头部分；
(c)Het1为所述第一异源部分；
(d)X为所述scFc接头；
(e)Em为所述增强子部分；
(f)L2为所述任选第二接头部分；
(g)Het2为所述第二异源部分；并且
(h)(-)为肽键或一个或多个氨基酸。
40.根据权利要求39所述的嵌合蛋白，其中Het1或Het2中的每个均为半衰期延长剂。
41.根据权利要求40所述的嵌合蛋白，其中Het1和Het2为Fc部分或FcRn结合部分，其中Het1和E2相同或不同。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述scFc接头为可加工接头(cscFc)。
43.根据权利要求42所述的嵌合蛋白，其中所述cscFc接头包含至少一个胞内加工位点。
44.根据权利要求42或43所述的嵌合蛋白，其中所述cscFc接头包含可被相同或不同胞内加工酶识别的两个胞内加工位点。
45.根据权利要求44所述的嵌合蛋白，其中所述胞内加工位点被选自酵母Kex2、PCSK1、PCSK2、PCSK3、PCSK4、PCSK5、PCSK6或PCSK7的胞内加工酶识别。
46.根据权利要求44或45所述的嵌合蛋白，其中所述至少一个胞内加工位点由PCSK5加工。
47.根据权利要求44或45所述的嵌合蛋白，其中所述两个胞内加工位点的每一个均由PCSK5加工。
48.根据权利要求47所述的嵌合蛋白，其中所述两个胞内加工位点相同。
49.根据权利要求47所述的嵌合蛋白，其中所述两个胞内加工位点不同。
50.根据权利要求43-49中任一项所述的嵌合蛋白，其中由所述胞内加工酶加工的所述胞内加工位点包含氨基酸序列R-X-[R/K]-R，其中X可为任何氨基酸，并且[R/K]指示所述氨基酸可为R或K。
51.根据权利要求50所述的嵌合蛋白，其中所述PCSK5酶裂解位点的每一个独立地包含序列RRRR(SEQ ID NO:2)或(RKR)n(SEQ ID NO:3)，其中n为2。
52.根据权利要求51所述的嵌合蛋白，其中在所述cscFc接头C末端的所述PCSK5酶裂解位点包含序列RRRR(SEQ ID NO:2)并且在所述cscFc接头N末端的所述PCSK5酶裂解位点包含序列(RKR)2(SEQ ID NO:3)。
53.根据权利要求38-52中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述scFc接头的长度为约10个至约50个氨基酸。
54.根据权利要求38-52中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述scFc接头的长度为约20个至约30个氨基酸。
55.根据权利要求38-52中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述scFc接头包含gly/ser肽。
56.根据权利要求55所述的嵌合蛋白，其中所述gly/ser肽包含式(Gly4Ser)n或Ser(Gly4Ser)n的氨基酸序列，其中n为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的正整数。
57.根据权利要求55所述的嵌合蛋白，其中所述(Gly4Ser)n肽包含选自(Gly4Ser)6、Ser(Gly4Ser)6、(Gly4Ser)4和Ser(Gly4Ser)4.的氨基酸序列。
58.根据权利要求57所述的嵌合蛋白，其中所述(Gly4Ser)n肽为(Gly4Ser)6肽。
59.根据权利要求4-58中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述凝血因子酶原为FVII蛋白。
60.根据权利要求59所述的嵌合蛋白，其中所述FVII蛋白为因子VII的高比活性变体。
61.根据权利要求4-58中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述凝血因子酶原为FX蛋白。
62.根据权利要求61所述的嵌合蛋白，其中所述FX蛋白为因子X的高比活性变体。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述可激活凝血因子在体内激活。
64.根据权利要求4-63中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述蛋白酶裂解位点为凝血酶裂解位点。
65.根据权利要求64所述的嵌合蛋白，其中所述凝血酶裂解位点包含选自TQSFNDFTR(SEQ ID NO:6)、SVSQTSKLTR(SEQ ID NO:7)、TTKIKPR(SEQ IDNO:9)、LVPRG(SEQ ID NO:10)和ALRPR(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。
66.根据权利要求4-65中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述蛋白酶裂解位点为FXIa裂解位点。
67.根据权利要求66所述的嵌合蛋白，其中所述FXIa裂解位点包含KLTR(SEQ ID NO:13)或DFTR(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列。
68.根据权利要求4-67中任一项所述的嵌合蛋白，其中在所述凝血因子酶原的轻链与所述蛋白酶裂解位点之间***胞内加工位点。
69.根据权利要求68所述的嵌合蛋白，其中所述胞内加工位点由选自酵母Kex2、PCSK1、PCSK2、PCSK3、PCSK4、PCSK5、PCSK6和PCSK7的胞内加工酶裂解。
70.根据权利要求69所述的嵌合蛋白，其中所述胞内加工酶为PCSK5。
71.根据权利要求12-70中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述自切除部分包含芳香环。
72.根据权利要求71所述的嵌合蛋白，其中所述芳香环选自苄基、肉桂基、萘基和联苯基。
73.根据权利要求71或72所述的嵌合蛋白，其中所述芳香环为杂环。
74.根据权利要求71-73中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述芳香环包含至少一个取代基。
75.根据权利要求74所述的嵌合蛋白，其中所述至少一个取代基选自F、Cl、I、Br、OH、NO2、NH2、NO3+、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3,、烷基、卤代烷基、C1-C8烷基卤、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯或磺酸酯。
76.根据权利要求75所述的嵌合蛋白，其中所述芳族基团中至少一个C经N、O或C-R1取代，其中R1独立地选自F、Cl、I、Br、OH、NO2、NH2、NO3+、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3,、烷基、卤代烷基、C1-C8烷基卤、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯或磺酸酯。
77.根据权利要求10-76中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述可溶性TF包含与成熟TF肽的氨基酸1-219(即，SEQ ID NO:15的氨基酸33-251)至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
78.根据权利要求18-87中任一项所述的嵌合蛋白，进一步包含至少一个附加异源部分。
79.根据权利要求1-78中任一项所述的嵌合蛋白，其经多聚唾液酸化、聚乙二醇化、糖基化、羟乙基化、γ-羧基化或其任何组合。
80.一种核酸分子，其编码根据权利要求1-79中任一项所述的嵌合蛋白或其补体。
81.一组核酸分子，包含第一核苷酸序列(NA1)和第二核苷酸序列(NA2)，其中NA1编码根据权利要求23-37和59-79中任一项所述的嵌合蛋白或其补体的第一多肽，并且NA2编码根据权利要求23-37和59-79中任一项所述的嵌合蛋白或其补体的第二多肽。
82.一种载体，其包含根据权利要求80或81所述的核酸分子或其补体。
83.一组载体，其包含第一载体(V1)和第二载体(V2)，其中V1包含根据权利要求81所述的NA1或其补体并且V2包含根据权利要求81所述的NA2或其补体。
84.根据权利要求82或83所述的载体或载体组，进一步包含编码加工所述嵌合蛋白中至少一个胞内加工位点的胞内加工酶的核苷酸序列或其补体。
85.一种宿主细胞，其包含根据权利要求82-84中任一项所述的载体。
86.根据权利要求85所述的宿主细胞，其为HEK293细胞、BHK细胞或CHO细胞。
87.一种生成嵌合蛋白的方法，包括培养根据权利要求85或86所述的宿主细胞并且从培养基中回收所述嵌合蛋白。
88.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-79中任一项所述的嵌合蛋白、根据权利要求80或81所述的核酸分子或核酸分子组、根据权利要求82-84中任一项所述的载体或载体组和药学上可接受的载体。
89.一种在有需要的受试者中治疗、改善或预防出血性疾病或病症的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-79中任一项所述的嵌合蛋白、根据权利要求80或81所述的核酸分子或核酸分子组、根据权利要求82-84中任一项所述的载体或载体组、根据权利要求85或86中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求85所述的药物组合物。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述出血性疾病或病症由凝血障碍引起。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述凝血障碍为血友病A或血友病B。
92.根据权利要求89-91中任一项所述的方法，其中所述出血性疾病或病症选自关节积血、肌肉流血、口腔流血、出血、肌肉出血、口腔出血、创伤、创伤性头癣、胃肠道出血、颅内出血、腹腔内出血、胸内出血、骨折、中枢神经***出血、咽后隙出血、腹膜后间隙出血和髂腰肌鞘出血。
93.一种在有需要的受试者中治疗、改善或预防凝固因子缺乏的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-79中任一项所述的嵌合蛋白、根据权利要求80或81所述的核酸分子或核酸分子组、根据权利要求82-84中任一项所述的载体或载体组、根据权利要求85或86中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求88所述的药物组合物，其中所述凝固因子选自FVII、FVIIa、FVIII、FIX和FXI。
94.根据权利要求89-93中任一项所述的方法，其中所述治疗、改善或预防为旁路疗法。
95.根据权利要求89-94中任一项所述的方法，其中所述受试者已经发展或易于发展对因子VIII的抑制剂。
96.根据权利要求89-95中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类受试者。
97.根据权利要求1-79中任一项所述的嵌合蛋白、根据权利要求80或81所述的核酸分子或核酸分子组、根据权利要求82-84中任一项所述的载体或载体组、根据权利要求85或86所述的宿主细胞或根据权利要求88所述的药物组合物，用于治疗、改善或预防有凝血障碍的受试者。
98.根据权利要求1-79中任一项所述的嵌合蛋白、根据权利要求80或81所述的核酸分子或核酸分子组、根据权利要求82-84中任一项所述的载体或载体组、根据权利要求85或86所述的宿主细胞或根据权利要求88所述的药物组合物用于生产治疗、预防或改善凝血障碍的药剂的用途。
99.一种制备根据权利要求1-79中任一项所述的嵌合蛋白的方法，所述方法包括使用固相肽合成。
100.根据权利要求99所述的方法，包括使用正交固相肽合成。
101.一种嵌合蛋白，包含式Ac-L1-Em表示的从氨基末端到羧基末端的线性结构，其中Ac为蛋白酶可激活的FVII凝血因子，Em为可溶性组织因子，并且L1为包含连接Ac的羧基末端和Em的氨基末端的gly/ser肽的接头部分；其中所述蛋白酶可激活的FVII凝血因子Ac包含轻链(LC)和重链(HC)及***所述LC的羧基末端和所述HC的氨基末端之间的凝血酶裂解位点。
102.一种包含两条多肽的嵌合蛋白，所述第一多肽具有式Ac-L1-Het1表示的从氨基末端到羧基末端的线性结构，而所述第二多肽具有式Em-L2-Het2表示的从氨基末端到羧基末端的线性结构，其中：
(a)Ac为蛋白酶可激活的FVII凝血因子；
(b)Het1为二聚Fc区的Fc部分；并且
(c)L1为包含连接Ac的羧基末端和Het1的氨基末端的gly/ser肽的接头部分；
(d)Em为可溶性组织因子；
(e)Het2为二聚Fc区的Fc部分；并且，
(f)L2为包含连接Het2的氨基末端和Em的羧基末端的gly/ser肽的接头部分；
其中所述Het1和Het2部分形成二聚Fc区；并且，
其中所述蛋白酶可激活的FVII凝血因子Ac包含轻链(LC)和重链(HC)及***所述LC的羧基末端和所述HC的氨基末端之间的凝血酶裂解位点。
103.一种嵌合蛋白，包含式Ac-L1-Het1-X-Em-L2-Het2表示的从氨基末端到羧基末端的线性结构，其中：
(a)Ac为蛋白酶可激活的FVII凝血因子；
(b)Het1为二聚Fc区的Fc部分；
(c)L1为包含连接Ac的羧基末端和Het1的氨基末端的gly/ser肽的接头部分；
(d)X为连接Het1的羧基末端和Em的氨基末端的可裂解scFc接头；
(e)Em为可溶性组织因子；
(f)L2为包含连接Em的羧基末端和Het2的氨基末端的gly/ser肽的接头部分；和
(g)Het2为二聚Fc区的Fc部分；
其中所述Het1和Het2部分形成二聚Fc区；
其中所述蛋白酶可激活的FVII凝血因子Ac包含轻链(LC)和重链(HC)及***所述LC的羧基末端和所述HC的氨基末端之间的凝血酶裂解位点；并且
其中所述cscFc可裂解接头包含两侧为两个PCSK5酶裂解位点的gly/ser肽，所述酶裂解位点为包含序列RRRR(SEQ ID NO:2)的氨基末端位点和包含序列(RKR)2(SEQ ID NO:3)的羧基末端位点。
104.一种生成嵌合蛋白的方法，包括表达编码根据权利要求38-79中任一项所述的嵌合蛋白的核苷酸序列，其中所述scFc接头由胞内加工酶在胞内裂解。
105.根据权利要求104所述的方法，进一步纯化所述嵌合蛋白。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述嵌合蛋白具有两条相互共价缔合的多肽链。
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