优选实施方案的描述
A.背景
IL-2与IL-2受体蛋白结合介导其对T细胞的作用。T细胞上不同的表面蛋白结合IL-2。鉴定的第一个T细胞表面IL-2受体蛋白为称为IL-2Rα的单一多肽,它为在T细胞激活时出现的55kD多肽(p55),而且最初称为Tac(用于激活T细胞)抗原。IL-2Rα以Kd约10-8M结合IL-2,也称为“低亲和力”IL-2受体。IL-2与只表达IL-2Rc的细胞结合不会产生任何可检测的生物效应。
第二个IL-2受体为IL-2Rb和IL-2Rg组成的结合复合物;IL-2Rg为64 kD多肽,也称为共同γ(γc)链,因为它存在于许多细胞因子受体中。IL-Rb约70-75kD(不统一地称为p70或p75),是特征为两个半胱氨酸/WSXWS基元的I型细胞因子受体家族的成员。IL-2Rβ与γc协调表达。IL-2与IL-2Rβγc的结合亲和力高于与IL-2Rα的结合亲和力,Kd约为10-9M;也称为“中等亲和力”IL-2受体。IL-2引起表达IL-2Rβγc的细胞生长,并在产生半数最大结合的IL-2浓度(即1×10-9M)刺激半数最大生长。IL-2Rβγc是能够结合IL-15的相同信号受体复合物。
第三个已知的IL-2受体复合物是IL-2Rαβγc复合物。表达IL-2Rα和IL-2Rβγc的细胞可非常牢固地结合IL-2,Kd约10-11M,因此也称为“高亲和力”复合物。类似的低IL-2浓度刺激这样的细胞生长。抗IL-2Rα、IL-2Rβ或γc的抗体能够阻断IL-2结合和生长刺激作用,抗多个受体亚基的抗体组合的阻断作用最大。这些观测结果说明IL-2Rα与IL-2Rβγc形成复合物,增加信号受体对IL-2的亲和力,因此允许在明显降低的IL-2浓度传递生长信号。人们认为IL-2首先快速结合IL-2Rα,这促进与IL-2Rβγc的结合。静息T细胞表达IL-2βγc,但是只表达少量IL-2Rα;IL-2能够刺激增加所述表面表达的IL-2Rα。当抗原受体介导T细胞激活时,IL-2Rα迅速表达,因此降低生长刺激所需要的IL-2浓度。IL-2与IL-2Rαβγc复合物结合通过Jak/STAT信号途径产生信号转导。
我们发现相对于天然杀伤(NK)细胞(表达中等亲和力IL-2受体IL-2Rβγ的细胞),人IL-2突变蛋白优选激活T细胞(PHA-母细胞;表达高亲和力IL-2受体IL-2Rαβγ的细胞)。具有以下置换的突变蛋白意外地对PHA-母细胞具有全部IL-2活性,但是对NK细胞的活性(如果有的话)极小,所述置换突变为组氨酸(D20H)或异亮氨酸(D20I)置换Asp-20,精氨酸(N88R)、甘氨酸(N88G)或异亮氨酸(N88I)置换Asn-88,或者亮氨酸(Q126L)或谷氨酸(glutamate)(Q126E)置换Gln-126。先前的人IL-2突变蛋白研究依赖于小鼠细胞分析***,在已应用的人细胞中未应用只表达IL-2Rβγ的细胞(如NK细胞)。另外,应用人PHA-母细胞的研究表明,Asp-20置换(用Leu、Arg、Asp或Lys置换;Xu等,Eur.Cytokine Netw,6,237-244(1995))或Gln-126(用Asp置换;Buchli和Ciardelli,Arch.Biochem.Biophys,307(2):411-415,(1993))使人IL-2突变蛋白的活性严重降低。以前应用小鼠IL-2的研究鉴定了不同活性的小鼠IL-2突变蛋白(Zurawski等,EMBO J,125113-5119(1993)),在产生这些结果的突变中没有一个突变提示存在本文所述工作中鉴定的突变。在与小鼠IL-2突变蛋白的同义位置含有相同突变的人IL-2突变蛋白不具有相似的活性,因此说明在小鼠的实例不能预测在人的功能性。本发明人已知没有比较关于表达IL-2受体IL-2Rαβγ的人细胞(例如PHA-母细胞)相对于表达IL-2受体IL-2Rβγ的人细胞(例如NK细胞)的相对活性的人IL-2突变蛋白的研究。预期体内分析将证实所述突变蛋白将通过降低毒性从而提高相对于野生型人IL-2的治疗指数,所以提供治疗上有用的化合物用于治疗需要刺激免疫***的疾病。
目前临床上应用白介素2(IL-2)治疗转移性肾脏癌症。然而,其严重的毒性将其应用仅限于部分最健康的患者,而且推测剂量限制性毒性降低其整体疗效。已提出IL-2急性毒性是通过激活NK细胞介导的,而其疗效是通过直接激活T细胞介导的(Jacobson等,Proc NatlAcad Sci USA(美国),1996年9月17日,93(19)第10405-10页;Smith KA,Blood 1993,81(6)第1414-23页;Kaplan等,Biotechnology,10(2)第157-62页)。T细胞表达不同于NK细胞的IL-2受体(T细胞:IL-2Rαβγ,高亲和力IL-2受体;NK细胞:IL-2Rβγ,中等亲和力IL-2受体)。本文所述人IL-2突变蛋白选择性激活T细胞IL-2受体而不激活NK细胞IL-2受体。
已采用低剂量的IL-2疗法以避免直接激活NK细胞,取得了一定的成功(Jocobson等(1996),Proc Natl Acad Sci USA 93:10405-10)。该策略的原理是低剂量的IL-2将只激活高亲和力IL-2受体,而不激活中等亲和力的IL-2受体。中等亲和力形式的IL-2受体IL-2Rβγ表达于NK细胞上,而T细胞表达高亲和力形式的IL-2Rαβγ。
但是本发明人从不同的角度解决所述毒性问题。假设通过适当修饰在IL-2结合表面上的特定结合残基破坏IL-2与IL-2Rβ和/或IL-2Rγ的相互作用,从而防止其有效结合(因此激活)至只表达IL-2Rβγ的细胞。然而,在表达IL-2Rαβγ的细胞上,仍然出现开始结合至IL-2Rα,而因此结合至所述细胞,所以Jacobs等提出的低剂量疗法仍然表现出毒性副作用。通过结合至IL-2Rα,能够在所述细胞表面上有效募集IL-2Rβ和IL-2Rγ,尽管修饰的IL-2与IL-2Rβ和/或IL-2Rγ的相互作用受损。因此能够形成IL-2/IL-2Rαβγ信号活性复合物。相对于NK细胞上的中等亲和力IL-2受体,IL-2变异体能够优选选择性激活T细胞上的高亲和力IL-2受体,因为降低了毒性,所以我们认为它比野生型IL-2的治疗指数升高。治疗指数升高的IL-2变异体在治疗癌症(作为直接治疗法或辅助治疗法)和免疫缺陷(例如HIV和结核)方面的应用范围明显扩大。IL-2的其它潜在应用是利用其免疫刺激活性,除了直接治疗癌症外还包括治疗以下疾病:免疫缺陷如HIV或人SCID患者;感染性疾病如结核;用作“癌症疫苗”策略的佐剂;以及用于刺激免疫***的适应症例如增强标准疫苗接种方案,或用于老年人的治疗。
在Asp-20、Asn-88或Gln-126的适当置换降低对IL-2Rβ(Asp-20和Asn-88)或IL-2Rγ(Gln-126)的结合作用。这样的置换的净效应导致IL-2突变蛋白保有对人T细胞的活性,而降低对人NK细胞的活性。
因为在用T和NK细胞分析评价以前不能预测特定置换的效果,所以在位置Asp-20、Asn-88和Gln-126产生所有可能的天然氨基酸置换(Cys除外),在位置Asp-84产生有限的但是不同组的突变,测试它们是否真正与IL-2Rβ相互作用。如果观测到对表观(apparent)IL-2Rβ相互作用的影响,则应该测试位置Asp-84的其它突变。在这些位置的46个单独的置换的数据见下表1。
采用对野生型人IL-2cDNA的定点诱变引入突变。将正确的克隆亚克隆入适合在异源***(例如大肠杆菌、杆状病毒、酵母或哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)表达的表达载体。以T细胞(PHA-母细胞)增殖和NK增殖分析测试纯化的蛋白。单独的突变在这些分析之间产生的不同效应即EC50指示影响所述活性的突变。具体来说,与对NK细胞分析(对野生型IL-2)的效应相比,突变蛋白在PHA-母细胞(T细胞)分析(对野生型IL-2)中的刺激效应较强,说明置换产生细胞特异性,其特异性基础是特定突变蛋白能够结合并激活表达于所述细胞上的IL-2Rαβγ,但是不能结合并因此不能激活只表达IL-2Rβγ细胞。具有该特性的IL-2突变蛋白将因此具有IL-2体内免疫刺激特性并降低了IL-2治疗有关的血管渗漏以及低血压毒性。
B.定义
用于产生本文所述重组蛋白的CHO细胞系于1999年5月5日保藏于ATCC,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,20852,USA,保藏号为______。因为该细胞株根据布达佩斯条约条款进行保持,所以布达佩斯签约国专利局可获得该细胞株。
本文应用的“野生型IL-2”是指具有天然人IL-2氨基酸序列中正常存在的133个氨基酸的IL-2(缺乏所述信号肽,而含有额外的20个N末端氨基酸),它可以是天然或重组的IL-2,其氨基酸序列描述于Fujita等,PNAS USA,80,7437-7441(1983)中,具有或没有当所述蛋白表达为大肠杆菌细胞内组分时必需包含的额外N末端蛋氨酸。
本文所用的“IL-2突变蛋白”是指其中产生对人成熟白介素2蛋白的特定置换的多肽。下表1公开了所产生的46种单个置换的IL-2突变蛋白及其相应的相对活性数据。优选的实施方案包括具有至少100倍相对活性的突变蛋白。特别优选的实施方案包括具有以下突变、1000倍以上相对活性的突变蛋白:按照野生型IL-2编码,在位置20的(“D20”)天门冬氨酸(Asp)残基(D)置换为异亮氨酸(“D20I”)或组氨酸(“D20H”);在位置88(N88)的天门冬酰胺残基(Asn)置换为异亮氨酸(N88I)、甘氨酸(N88G)或精氨酸(N88R);以及在位置126(Q126)的谷氨酰胺残基(Gln)置换为亮氨酸(Q126L)或谷氨酸(Q126E)或天门冬氨酸(Q126D)。优选的IL-2突变蛋白在其它非置换残基位置具有与野生型IL-2相同的氨基酸序列。然而,本发明IL-2突变蛋白的特征还在于在天然IL-2多肽链的其它一个或多个残基位点的氨基酸***、缺失、置换和修饰。按照本发明的这样的任何***、缺失、置换和修饰可产生保有PHA-母细胞选择活性而激活NK细胞的能力降低的IL-2突变蛋白,它们属于本发明范围。
在单个重组IL-2分子中组合上述优选的或特别优选的置换可产生与本文所公开的单个突变体具有相似活性的组合突变体。例如可以预期的是,具有选自表1的两个或多个突变的组合的IL-2分子可产生相对活性类似于本文所公开的单个置换的相对活性的T细胞选择性IL-2激动剂。组合突变体属于本发明宗旨和范围。
我们优选在IL-2其它位置具有保守修饰和置换(即对所述突变蛋白的二级结构或四级结构影响最小的突变)。这样的保守置换包括Dayhoff(载于The Atlas of Proein Sequence and Structure 5(1978))和Argos(载于EMBO J.,8:779-785(1989))描述的置换。例如,属于以下残基组之一的氨基酸表示保守改变:
-ala、pro、gly、gln、asn、ser、thr;
-cys、ser、tyr、thr;
-val、ile、leu、met、ala、phe;
-lys、arg、his;
-phe、tyr、trp、his;和
-asp、glu。
我们还优选不会导入额外分子间交联或不正确的二硫键形成的位点的修饰或置换。例如已知在野生型成熟序列的位置58、105和125具有3个半胱氨酸(cys)残基。
“按照野生型IL-2编码”我们是指参照野生型IL-2成熟序列中氨基酸正常存在的位置鉴定选择的氨基酸。当IL-2突变蛋白发生***或缺失时,本领域技术人员应该认识到,在位置20正常存在的Asp将在突变蛋白的发生位置移位。然而,用野生型IL-2中Asp侧翼的那些氨基酸检查以及校正突变蛋白Asp侧翼氨基酸,能够容易地定位移位的Asp位置。
术语“具有IL-2Rαβγ受体的细胞类型”是指已知具有该类型受体的细胞,即T细胞、活化的T细胞、B细胞、活化的单核细胞和活化的NK细胞。术语“具有IL-2Rβγ受体的细胞类型”是指已知具有该受体类型的细胞,即B细胞、静息单核细胞和静息NK细胞。
本发明的IL-2突变蛋白可以用任何合适的本领域已知的方法生产。这样的方法包括构建编码本发明IL-2突变蛋白的DNA序列,并在合适的转化宿主中表达这些序列。此方法将产生本发明的重组突变蛋白。但是,本发明的突变蛋白也可以用化学合成或组合化学合成和重组DNA技术生产,尽管较少优选这样的方法。分批生产或灌流(perfusion)生产方法属于本领域一般技术。参见Freshey,R.I.(编辑),“Animal Cell Culture:A Practical Approach”,第二版,1992,IRLPress,Oxford,England;Mather,J.P.“实验室规模细胞培养(0.5-50L)”Methods Cell Biology 57:219-527(1998);Hu,W.S.和Aunins,J.G.,“大规模哺乳动物细胞培养”Curr Opin Biotechnol 8:148-153(1997);Konstantinov,K.B.,Tsai,Y.,Moles,D.,Matanguihan,R.,“利用葡萄糖生长抑制剂(autostat.)控制中国仓鼠卵巢细胞长期灌流式培养”Biotechnol Prog 12:100-109(1996)。
在重组生产本发明突变蛋白的方法的一个实施方案中,构建DNA序列的方法是,分离或合成编码野生型IL-2的DNA序列,然后通过位点专一性诱变使Asp20密码子变为异亮氨酸(I)密码子。该技术是众所周知的,参见例如Mark等,“位点专一性诱变人成纤维细胞干扰素基因”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,第5662-66页(1984);和美国专利第4,588,585号,通过引用结合到本文中。
构建编码本发明的IL-2突变蛋白的DNA序列的另一个方法是化学合成。其实例包括利用编码具有本发明所述特性的IL-2突变蛋白的蛋白序列的化学方法,直接合成肽。该方法可以在影响IL-2与IL-2Rβ或IL-2Rγ相互作用的位置加入天然和非天然氨基酸。另一方面,编码所需要的IL-2突变蛋白的基因可以采用寡核苷酸合成仪通过化学方法合成。这样的寡核苷酸的设计基于所需要的IL-2突变蛋白的氨基酸序列,并优选选择在产生所述重组突变蛋白的宿主细胞中有利的密码子。在该方面,已充分认识到所述遗传密码子是简并性的,即一种氨基酸可由一种以上的密码子编码。例如Phe(F)由两个密码子TTC或TTT编码,Tyr(Y)由TAC或TAT编码,his(H)由CAC或CAT编码。Trp(W)是由单一密码子TGG编码。因此,应该认识到对于编码特定IL-2突变蛋白的特定DNA序列,将有许多编码所述IL-2突变蛋白的DNA简并序列。例如应该认识到,除了SEQ ID NO:1所示的突变蛋白D20I的优选DNA序列外,将有许多编码所示IL-2突变蛋白的简并DNA序列。这些简并DNA序列属于本发明范围。所以在本发明中的“其简并变异体”是指编码以及由此能够表达特定突变蛋白的所有DNA序列。
编码本发明IL-2突变蛋白的DNA序列无论是定点诱变、化学合成或其它方法制备的,均可以另外包括或不包括编码信号序列的DNA序列。如果存在这样的信号序列,则它应该被选择用于表达所述IL-2突变蛋白的细胞识别。它可以是原核生物或真核生物信号序列或这两者的组合。它也可以是天然IL-2信号序列。信号序列的包含取决于是否需要从其产生的重组细胞分泌所述IL-2突变蛋白。如果所选定的细胞是原核生物细胞,则一般优选所述DNA序列不编码信号序列。如果所选定的细胞是真核生物细胞,则一般优选编码信号序列,而最优选使用野生型IL-2信号序列。
标准方法可用于合成编码按照本发明的IL-2突变蛋白的基因。例如所述完整的氨基酸序列可用于构建反向翻译的基因。可以合成含有编码IL-2突变蛋白的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如,可以合成然后连接编码各部分的所需多肽的数个小寡核苷酸。单独的寡核苷酸通常含有互补装配用的5’或3’突出端。
一旦装配完成(通过合成、定点诱变或其它方法),编码本发明IL-2突变蛋白的DNA序列将***表达载体并操作性连接到适合在所需要的转化宿主中表达所述IL-2突变蛋白的表达控制序列。正确的装配可由核苷酸测序、限制性作图和在合适宿主中表达生物活性多肽得到证实。如本领域众所周知,为了转染基因在宿主获得高表达水平表达,必须将所述基因操作性连接到在所选定的表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列。
表达控制序列和表达载体的选择取决于宿主的选择。可使用各种表达宿主/载体组合。适用于真核生物宿主的表达载体包括例如包含SV40、牛***瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。适用于细菌宿主的表达载体包括已知的细菌质粒,例如大肠杆菌质粒,包括col E1、pCR1、pER32z、pMB9和其衍生物;广泛宿主范围的质粒,例如RP4、噬菌体DNA,例如众多的λ噬菌体衍生物,例如NM989;以及其它DNA噬菌体,例如M13和丝状单链DNA噬菌体。适用于酵母细胞的表达载体包括2μ质粒及其衍生物。适用于昆虫细胞的表达载体包括pVL941。我们优选pFastBacTM 1(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)。Cate等,“分离牛和人的Mullerian抑制物质基因并在动物细胞中表达所述人基因”,Cell,45,第685-98(1986)。
此外,在这些载体中可使用任何为数众多的表达控制序列。这样的有用表达控制序列包括与前述表达载体的结构基因有关的表达控制序列。有用的表达控制序列的实例包括例如SV40或腺病毒的早期启动子和晚期启动子、lac***、trp***、TAC或TRC***、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区例如PL、fd包膜蛋白的控制区、3-磷酸甘油激酶或其它糖酵解酶启动子、酸性磷酸酶启动子例如PhoA、酵母α-交配***启动子、多角体杆状病毒启动子和已知控制表达原核生物或真核生物细胞或其病毒的基因的其它序列,以及它们的各种组合。
任何合适的宿主可用于产生本发明的IL-2突变蛋白,包括细菌、真菌(包括酵母)、植物、昆虫、哺乳动物或其它合适动物细胞或细胞系以及转基因动物或植物。更具体地说,这些宿主可以包括众所周知的真核和原核宿主,例如大肠杆菌、假单胞菌属、杆菌属、链霉菌属菌株,真菌,酵母,昆虫细胞例如草地夜蛾(sf9)细胞,动物细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和小鼠细胞例如NS/O,非洲绿猴细胞例如COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40和BNT 10,和人的细胞以及组织培养的植物细胞。对于动物细胞的表达,我们优选培养的CHO细胞和COS 7细胞,尤其是CHO细胞系CHO(DHFR-)系或HKB系。
当然应该理解的是,并不是所有载体和表达控制序列均能够同样地充分发挥作用,以表达本文所述DNA序列。具有相同表达***的所有宿主也不是同样充分地发挥作用。然而,本领域技术人员可对这些载体、表达控制序列和宿主进行选择,而不致有不当的实验。例如在选择载体时,必需考虑宿主,因为所述载体必须在其中复制。所述载体的拷贝数、控制拷贝数的能力以及所述载体编码的任何其它蛋白如抗生素标记的表达也应该考虑。例如在本发明中使用的优选载体包括允许编码IL-2突变蛋白的DNA增加拷贝数的载体。这样的可扩增的载体是本领域众所周知的。它们包括例如能够通过以下扩增作用扩增的载体,所述扩增作用是DHFR扩增(参见例如Kaufman,美国专利4,470,461,Karfman和sharp,“二氢叶酸还原酶cDNA基因的单元结构:有效表达使用的信号的分析”,Mol.Cell.Biol.,2,第1304-19页(1982))或谷氨酰胺合成酶(“GS”)扩增作用(参见例如,美国专利5,122,464和欧洲公开申请338,841)。
在选择表达控制序列时,也应该考虑各种因素。这些因素包括例如所述序列的相对强度、其控制能力以及与编码本发明IL-2突变蛋白的实际DNA序列的匹配性,尤其是在潜在二级结构方面的匹配性。宿主的选择应该考虑其与选定的载体的匹配性、本发明DNA序列编码的产物的毒性、其分泌特性、其正确折叠所述多肽的能力、其发酵或培养要求以及所述DNA序列编码的产物的纯化简便性。
在这些参数中,本领域技术人员可以选择各种载体/表达控制序列/宿主组合,以在发酵时或大规模动物细胞培养时表达所需要的DNA序列,例如采用CHO细胞或COS 7细胞。
按照本发明获得的IL-2突变蛋白根据用于产生所述突变蛋白的宿主生物体可以糖基化或不糖基化。如果选择细菌作为宿主,则所产生的IL-2突变蛋白将不糖基化。另一方面,真核生物细胞将糖基化IL-2突变蛋白,尽管糖基化的形式可能不同于天然IL-2。转化宿主产生的IL-2突变蛋白可按照任何合适的方法纯化。已知纯化IL-2的各种方法。参见例如Current Protocols in Protein Science,第2卷,编辑:John E.Coligan,Ben M.Dunn,Hidde L.Ploehg,David W.Speicher,Paul T.Wingfield,6.5单元(Copyright 1997,John Wiley和Sons,Inc.)。我们优选采用阳离子交换、凝胶过滤和或反向液相色谱法从大肠杆菌产生的内含体或从产生特定突变蛋白的哺乳动物或酵母培养物的条件培养基中重折叠。参见以下的实施例1(大肠杆菌)和实施例10(CHO细胞灌流)。
可用任何合适的本领域已知方法分析本发明IL-2突变蛋白的生物活性。这样的分析包括PHA-母细胞增殖和NK细胞增殖。用所述两种分析可证实突变蛋白的合适活性,即对IL-2Rαβγ的充分活性而对具有IL-2Rβγ的细胞的活性降低。突变蛋白的“相对活性”相对于野生型IL-2检测获得,如在所述实施例的进一步描述,相对活性为PHA-母细胞增殖与NK细胞增殖的活性比。
本发明的IL-2突变蛋白以大致等于或高于野生型天然或重组IL-2治疗使用量的剂量给药。优选给予有效量的IL-2突变蛋白。“有效量”是指能够阻止或减轻所治疗的病症或适应症的严重程度或发展的剂量。对于本领域技术人员显而易见的是,IL-2突变蛋白的有效量特别取决于所述疾病、所述剂量、IL-2突变蛋白的给药方案(无论是单独给予IL-2突变蛋白还是联合其它治疗药物给药)、所述组合物的血清半衰期以及患者的一般健康情况。
所述IL-2突变蛋白优选以含有药学上可接受的载体的组合物给予。“药学上可接受的载体”是指对所给予的患者不会引起任何不需要的作用的载体。这样的药学上可接受的载体是本领域众所周知的。我们优选2%HSA/PBS,pH7.0。
可用众所周知的方法将本发明IL-2突变蛋白配制为药用组合物。参见例如E.W.Martin的Remington’s Pharmaceutical Science,在此通过引用结合到本文中,该文献描述了合适的制剂。IL-2突变蛋白的药用组合物可以配制为多种形式,包括液体剂、凝胶剂、冻干剂或任何其它合适形式。优选的形式取决于所治疗的特别适应症,而且对本领域技术人员而言将是显而易见的。
IL-2突变蛋白药用组合物的给药方式可以是:口服、气雾剂、静脉内、肌内、腹膜内、皮内或皮下或任何其它可接受的方式。优选的给药方式将取决于所治疗的特别适应症,而这对本领域技术人员而言是显而易见的。IL-2突变蛋白药用组合物可以与其它治疗药物联合给予。这些药物可以合并为同一药用组合物的部分,或独立于IL-2突变蛋白或同时或按照任何其它可接受的治疗方案给予。此外,IL-2突变蛋白药用组合物可以用作其它疗法的辅助治疗药物。
所以,本发明提供以下用途的组合物和方法:治疗HIV、癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病、癌症疫苗和常规疫苗治疗的疫苗佐剂;用于在老年人或免疫功能受损个体以及人类SCID患者的免疫刺激,或在任何合适的动物、优选哺乳动物、最优选人类中需要全面刺激免疫***的其它治疗用途。如在以上的背景部分中所述,IL-2具有许多作用。其中部分作用是刺激PHA-母细胞、静息T细胞、B细胞、单核细胞和NK细胞等;本文所述的突变蛋白对只表达高亲和力IL-2受体的细胞类型具有活性,例如静息T细胞,但是对具有中等亲和力IL-2受体的细胞例如NK细胞或单核细胞没有活性。
还设计了编码本发明IL-2突变蛋白的DNA序列在基因治疗应用中的用途。设计的基因治疗应用包括治疗这样的疾病:期望因为IL-2的T细胞活性而提供有效治疗的疾病,例如HIV、癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病、癌症疫苗和常规疫苗治疗中的疫苗佐剂,用于在老年人或免疫功能受损的患者以及人类SCID患者的免疫刺激,以及治疗另外对IL-2反应或致病原对IL-2介导的免疫应答敏感的疾病。
采用基因治疗的IL-2突变蛋白的局部传递可以为目的区域提供治疗药物。设计了体外和体内的基因治疗方法学。转移有效治疗基因至限定的细胞群的数种方法是已知的。参见例如Mulligan,“基因治疗的基础科学”,Scienc,260:926-31(1993)。这些方法包括:
1)直接的基因转移法。参见例如Wolff等,“基因直接体内转移入小鼠肌肉中”,Science,247:1465-68(1990);
2)脂质体介导的DNA转移法。参见例如Caplen等,“脂质体介导CFTR基因转移入囊性纤维化患者的鼻上皮中”,Nature Med.3:39-46(1995);Crystal,“药物基因”,Nature Med.1:15-17(1995);Gao和Huang,“有效转染哺乳动物细胞的新型阳离子脂质体试剂”,Biochem.Biophys.Res.Comm.,179:280-85(1991);
3)反转录病毒介导的DNA转移法。参见例如Kay等,“血友病B的体内基因治疗:在因子IX缺陷的狗中的持续性部分校正”Science,262:117-19(1993);Anderson,“人类基因治疗”,Sceince,256:808-13(1992);
4)DNA病毒介导的DNA转移法。这样的DNA病毒包括腺病毒(优选Ad-2或Ad-5基载体)、疱疹病毒(优选单纯疱疹病毒基载体)和细小病毒(优选“缺陷型”或非自主细小病毒基载体,更优选腺伴随病毒基载体,最优选AAV-2基载体)。参见例如Ali等,“DNA病毒用作基因治疗载体”,Gene Threapy,1:367-84(1994);美国专利4,797,368,通过引用将其结合到本文中,以及美国专利5,139,941,通过引用将其结合到本文中。
用于转移目的基因的特定载体***的选择取决于各种因素。一个重要的因素是靶细胞群的性质。尽管已对反转录病毒载体进行了广泛研究并将其用于无数基因治疗用途中,但是这些载体一般不适合感染非***细胞。另外,反转录病毒具有潜在的致肿瘤性。
腺病毒的优势是它们具有广泛的宿主范围,能够感染休眠细胞或终末分化细胞,例如神经元或肝细胞,而且似乎基本上没有致肿瘤性。参见例如Ali等,同上,第367页。腺病毒似乎不整合入宿主基因组中。因为它们独立于染色体而存在,所以***诱变的风险显著降低。Ali等,同上,第373页。
腺伴随病毒作为腺病毒基载体具有相似的优势。但是,AAV具有对人染色体19的位点专一性整合作用。Ali等,同上,第377页。
在优选的实施方案中,本发明的编码IL-2突变蛋白的DNA用于以下疾病的基因治疗:免疫缺陷性疾病如HIV,感染性疾病如结核,以及癌症如肾癌。
按照该实施方案,对其需要患者在诊断的同时或诊断后立即给予采用编码本发明的IL-2突变蛋白的DNA的基因治疗。
该方法利用本发明IL-2突变蛋白的选择性活性,以防止不需要的毒性和副作用。技术人员应该知道,可按照此实施方案使用含有IL-2突变蛋白DNA的任何合适的基因治疗载体。构建这样的载体的技术是已知的。参见例如Anderson,W.F.,Human Gene Therapy,Nature,39225-30(1998);Verma,I.M.和Somia,N.,基因治疗-前景、问题以及展望,Nature,389239-242(1998)。应用已知技术可将含有IL-2突变蛋白DNA的载体导入靶位点。
为了能更好地理解本发明,因此给出以下实施例。这些实施例仅仅是为了说明本发明,而不应该解释为以任何方式限制本发明范围。本文所述所有出版物均通过引用整体结合到本文中。
C.实施例
实施例1.在大肠杆菌中产生突变蛋白
基本上按Kunkel TA,Roberts JD和Zakour RA,“不需要表型选择的快速有效的位点专一性诱变”,(1987),Methods Enzymol 154:367-382中所述,采用含有对应于所需要突变的密码子的引物经定点诱变产生突变蛋白。简要地说,将含有限制性酶位点Bam HI和Xba I的人IL-2cDNA利用所述相同位点亚克隆入M13噬菌体载体M13 mp19(NewEngland Biolabs,Beverly,MA)。野生型IL-2cDNA采用聚合酶链式反应(“PCR”)从cDNA库获得,所述cDNA库产生自用12-肉豆蔻酸13-乙酸氟波醇酯(10ng/ml)诱导24小时的人外周血淋巴细胞分离的mRNA。所用的PCR引物为IL-2可读框5’末端,
5’-CCT CAA CTC CTG AAT TCA TGT ACA GGA TGC-3’(SEQ IDNO:3);
和IL-2可读框3’末端,
5’-GGA AGC GGA TCC TTA TCA AGT CAG TGT TGA G-3’(SEQID NO:4)。
将限制性酶位点Eco RI(5’-末端)和BamHI(3’-末端)导入每个寡核苷酸中并用斜体表示。所用的PCR条件是94℃1分钟,58.7℃1分钟和72℃1分钟,25个循环。采用Sequenase测序试剂盒(Amersham Life Sciences,Arlington Heights,IL)按生产商所述经测序证实如此获得的正确IL-2cDNA序列。用含有IL-2cDNA的M13 mp19转化大肠杆菌菌株CJ236(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)获得含尿嘧啶的单链DNA(U-DNA)。定点诱变一般采用的引物含有与诱变靶密码子5’的模板U-DNA同源的15个核苷酸、引入目的变化的核苷酸和与最后一个改变的核苷酸3’的模板U-DNA同源的其它10个核苷酸。最初定点诱变用来在人IL-2成熟序列初始部位引入Nco I限制位点。该限制性位点用于引入N-末端蛋氨酸残基,该残基利用例如表达载体pET3d在大肠杆菌的胞质区中控制表达。用于该目的的引物是:
5’-GCA CTT GTC ACA AAC ACC ATG GCA CCT ACT TCA AGT-3’(SEQ ID NO:5)。
用于在位置D20、N88和Q126引入突变的特定引物是:
D20X:5’-GGA GCA TTT ACT GCT GNN NTT ACA GAT G-3’(SEQ ID NO:6)
N88X:5’-GGG ACT TAA TCA GCN NNA TCA ACG TAA TAG-3’(SEQ ID NO:7)
Q126X:5’-GGA TTA CCT TTT GTN NNA GCA TCA TCT C-3’(SEQ ID NO:8)
其中NNN置换为以下氨基酸的合适密码子:组氨酸(CAC)或异亮氨酸(ATC)(在位置D20),精氨酸(CGT)、甘氨酸(GGT)、或异亮氨酸(ATC)(在位置N88),或亮氨酸(CTG)(在位置Q126)。其它突变应用相似策略和特定突变的合适密码子。用T4多核苷酸激酶(New EnglandBiolabs,Beverly,MA)采用生产商的方案磷酸化引物。在所述引物与U-DNA模板退火并用T7DNA聚合酶(Bio-Bad Laboratories,Hercules,CA)延长后,用5μl反应混合物转化大肠杆菌菌株DH5αTM(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)细胞,并平板接种在含有0.7%琼脂的LB培养基上。在37℃温育后,挑取单个噬菌斑转移到2ml LB培养基扩展噬菌斑,并在37℃生长过夜。采用M13纯化试剂盒(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)按照生产商的方案分离单链DNA,采用Sequenase测序试剂盒(Amersham Life Science,Arlington Heights,IL)按照生产商的方案对所述单链DNA进行测序,鉴定含有所需突变的克隆。采用Nco I和Xba I分离得自对应于含有正确突变序列的噬菌斑的复制型DNA的IL-2突变蛋白cDNA,并将其亚克隆至质粒载体pET3a(Stratagene,SanDiego,CA)(Strat)中。用含有突变蛋白的pET3a载体转化大肠杆菌菌株BL21,使其生长至ABS280 0.60-1.0,此时加入0.4mM IPTG诱导IL-2突变蛋白产生。
实施例2.从大肠杆菌提取以及纯化IL-2突变蛋白
诱导3小时后,以10,000×g离心收集细胞。首先通过将细胞分散在10体积(体积/湿重)蔗糖/Tris/EDTA缓冲液(0.375M蔗糖,10mM Tris/HCl pH8.0,1mM EDTA)中使重组IL-2突变蛋白复性并纯化。采用配有1英寸标准探头的Missonix XL2020型超声仪,在冰浴上以30秒休息间隔于300W超声所述分散细胞3次。然后将所超声的物质于17,000×g、4℃离心20分钟。此时应该为白色的沉淀通过以下步骤洗涤:在蔗糖/Tris/EDTA缓冲液中重悬浮并离心一次,用Tris/EDTA缓冲液(50mM Tris/HCL pH8.0,1mM EDTA)重悬浮并离心两次,最后重悬浮在10体积0.1M Tris/HCL,pH8.0缓冲液中(此时取样用于凝胶分析)并于17,000×g离心20分钟。
加入3体积8M氯化胍的0.1M Tris/HCL(pH8.0)和0.1%(体积/体积)2-巯基乙醇溶液溶解所述沉淀。在室温下温育2小时后,将样品于17,000×g离心20分钟。将所产生的溶液对20体积10mM Tris/HCL,pH8.0,1mM EDTA于4℃透析约20小时。溶液于17,000×g离心20分钟,调节至0.1%三氟乙酸,在0.22μm过滤装置中过滤。将溶液立即转移至硅化瓶中并上样至C8柱(Vydac 208TP54)。采用45-85%乙腈的0.1%TFA用20分钟线性梯度纯化IL-2突变蛋白。用A280和氨基酸分析测定洗脱蛋白的浓度。然后将蛋白等分(100mL)在硅化管中,并贮藏在-20℃。如此纯化的突变蛋白用SDS-PAGE(银染色)观察通常为单一带,并通过氨基酸分析进行定量(通常准确率>90%)。
实施例3.T细胞增殖分析
从约100mL正常人血液(Irwin Memorial Blood Bank,SanFrancisco,CA)中分离外周血单核细胞(PBMC),所述血液在冷的Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(Ca2+和Mg2+游离;DPBS)中以1∶2稀释制得。将Ficoll-Paque(Pharmacia)置于下层,将样品离心分离PBMC,然后在冷的DPBS中充分洗涤。用以下方法产生PHA母细胞(活化的T细胞):以1×106细胞/ml密度将细胞重悬浮在含有10%胎牛血清(Hyclone)的RPMI 1640中,其中加入1%(w/v)以下各成分:L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠和抗生素-抗真菌剂(RPMI培养基)。以终浓度为10μg/mL加入植物血球凝集素(PHA-P;Sigma),将细胞于37℃、5%CO2培养3天。收获细胞并在DPBS中洗涤两次,重悬浮在RPMI培养基中并用200μl含有不同浓度IL-2或IL-2突变蛋白的RPMI培养基以1×105细胞/孔密度平板接种至96孔平底培养板中。将培养板于37℃温育48小时,以1μCi3H-胸苷(DuPont NEN,Boston,MA)/孔施加脉冲6小时,收获细胞,在将细胞收获在玻璃纤维滤膜后测定放射活性。
实施例4.NK细胞增殖分析
从约100mL正常人血液(Irwin Memorial Blood Bank,SanFrancisco,CA)中分离外周血单核细胞(PBMC),所述血液在冷的Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(Ca2+和Mg2+游离;DPBS)中以1∶2稀释制得。将Ficoll-Paque(Pharmacia)置于下层,样品经离心分离PBMC,然后在冷的DPBS中充分洗涤。将NK细胞与其它细胞分离。为此优选Miltenyi Biotec的NK细胞分离试剂盒(Bergisch Gladbach,Germany;目录号为465-01)。该试剂盒包括两种试剂、分离柱和非常强磁性的柱支持物。第一种试剂是小鼠同种型IgG1的结合半抗原的单克隆抗体CD3、CD4、CD19、CD33混合物。这将去除PBMC中的T细胞、B细胞和骨髓细胞。预期可使用识别这些细胞类型的任何合适的抗体系列。第二种试剂为结合至抗半抗原抗体的胶体超顺磁性MAC微珠。将细胞重悬浮在含有0.5%牛血清白蛋白和2mM EDTA的PBS(PBS/EDTA)中。悬浮体积取决于所用的细胞数并Miltenyi Biotec以图表形式提供了悬浮体积。通常如果PBMC细胞数为2-5×108,则将细胞重悬浮在800μL所述缓冲液中,然后使用200μl的各种试剂。在与所述试剂温育后,将所述细胞(重悬浮在2mL缓冲液中)加样至所述柱上。非NK细胞粘附到磁体上(去除),而NK细胞在径流中分离和收集的和。洗涤细胞,重悬浮在RPMI培养基(含有:RPMI 1640,其中加入1%(w/v)以下各成分:L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠、抗生素-抗真菌剂(均得自Gibco/BRL,Gaithersburg,MD)、10%胎牛血清(Hyclone))中,用200μl以1×105细胞/孔密度平板接种至96孔平底培养板中。收获细胞并在DPBS中洗涤两次,重悬浮在RPMI培养基中并用200μl含有不同浓度IL-2或IL-2突变蛋白的RPMI培养基以1×105细胞/孔密度平板接种至96孔平底培养板中。将培养板于37℃温育48小时,以1μCi3H-胸苷(DuPont NEN,Boston,MA)/孔施加脉冲6小时,收获细胞,在将细胞收获在玻璃纤维滤膜后测定放射活性。
实施例5.突变蛋白相对于NK细胞选择性激活T细胞
采用定点诱变(Kunkel等(1987),Methods Enzymol 154:367-382)在位置Asp-20、Asp-84、Asn-88和Gln-126产生突变蛋白,并在大肠杆菌中按照生产商(Stratagene)所述采用pET-3a表达***进行表达。用盐酸胍回收包含体纯化突变蛋白,重折叠,并用HPLC层析,如前所述。银染色SDS-PAGE显示所产生的蛋白纯度>95%,并通过氨基酸分析分析浓度和纯度(AAA准确率通常>90%)。采用质谱分析依次证实具有合适活性的突变蛋白。如此纯化的突变蛋白以前述T细胞和NK细胞分析进行分析。在T细胞和NK细胞分析中的IL-2突变蛋白的相对活性示于表1。
表1评价突变蛋白的T细胞选择性活性
|
相对活性 |
相对活性 |
突变蛋白 |
T细胞/NK细胞 |
T细胞 |
NK细胞 |
野生型IL-2 |
1 |
1.00000 |
1.00000 |
D20突变蛋白 |
|
|
|
D20A |
5 |
0.00024 |
0.00005 |
D20H |
3900 |
0.37081 |
0.00009 |
D20I |
7600 |
4.59635 |
0.00061 |
D20K |
330 |
0.06301 |
0.00019 |
D20L |
100 |
0.00063 |
0.00001 |
D20M |
490 |
0.05372 |
0.00011 |
D20N |
160 |
0.03000 |
0.00019 |
D20Q |
100 |
0.03180 |
0.00032 |
D20R |
33 |
0.00018 |
0.00001 |
D20S |
170 |
0.06640 |
0.00038 |
D20T |
1 |
1.00000 |
1.00000 |
D20V |
10 |
0.00093 |
0.00009 |
D20Y |
1000 |
0.06587 |
0.00007 |
N88突变蛋白 |
|
|
|
N88A |
50 |
0.50000 |
0.01 |
N88E |
10 |
0.01172 |
0.00115 |
N88F |
22 |
0.02222 |
0.001 |
N88G |
980 |
8.33333 |
0.00853 |
N88H |
3 |
0.00100 |
0.001 |
N88I |
9600 |
0.98074 |
0.00010 |
N88K |
3 |
0.00010 |
0.00032 |
N88L |
4 |
0.00400 |
0.001 |
N88M |
250 |
0.25000 |
0.001 |
N88R |
6200 |
0.89730 |
0.00015 |
N88S |
80 |
0.00200 |
0.16000 |
N88T |
395 |
0.50000 |
0.001266 |
N88V |
67 |
0.06670 |
0.001 |
N88W |
1 |
0.00100 |
0.001 |
N88Y |
8 |
0.00800 |
0.001 |
Q126突变蛋白 |
|
|
|
Q126A |
0.30 |
0.01743 |
0.05809 |
Q126D |
240 |
0.14630 |
0.00061 |
Q126E |
400 |
10.0000 |
0.02500 |
Q126F |
32 |
0.87358 |
0.02749 |
Q126G |
100 |
0.55556 |
0.00556 |
Q126H |
0.03 |
0.02216 |
0.73875 |
Q126I |
33 |
0.00100 |
0.00003 |
Q126K |
1.0 |
1.00000 |
1.00000 |
Q126L |
680 |
3.06186 |
0.00447 |
Q126M |
9.1 |
19.94092 |
2.19298 |
Q126N |
10 |
6.57895 |
0.64993 |
Q126P |
3.0 |
0.00032 |
0.00011 |
Q126R |
11 |
4.02695 |
0.36392 |
Q126S |
33 |
0.03417 |
0.00103 |
Q126T |
3.3 |
0.00010 |
0.00003 |
Q126V |
330 |
1.00556 |
0.00302 |
Q126W |
1.0 |
0.20000 |
0.20000 |
Q126Y |
10 |
0.88500 |
0.08850 |
突变蛋白活性描述为与相同分析中野生型IL-2的EC50比较,产生50%最大效应所需要的突变蛋白相对浓度(EC50);对同一突变蛋白的多个分析的情况下,列出各数值的几何平均数。野生型IL-2在T细胞分析中的EC50值范围为约10-150pM,而在NK细胞分析中为约50-200pM。突变蛋白的T细胞与NK细胞活性比表示为突变蛋白对T细胞的相对活性除以突变蛋白对NK细胞的相对活性。采用得自单一供体的细胞应用根据特定T细胞分析和NK细胞分析确定的唯一活性,确定每种突变蛋白的所述比值。
突变蛋白可以分类为6大类:1)1000倍以上T细胞选择性;2)100以上,但是<1000倍T细胞选择性;3)10以上,但是<100倍T细胞选择性;4)相对于IL-2对T细胞的活性提高的活性;5)NK细胞选择性;6)10倍以下的对T细胞或NK细胞的选择性。
1类:D20H、I和Y;N88G、I和R.
2类:D20K、L、M、N、Q和S;N88M和T;Q126D、E、G、L和V。
3类:D20R;N88A、E、F、S和V;Q126F、I、N、R和S。
4类:D20I;N88G;Q126E、L、M、N和R。
5类:Q126A、H。
6类:D20A、T和V;N88H、K、L、W和Y;Q126K、P、T、W和Y。
在1-3类中,优选突变蛋白为对T细胞的活性接近或高于野生型IL-2的突变蛋白。在1类中,应该包括D20H和I;N88G、I和R;在2类中,包括N88M和T,Q126D、E、G、L和V;在3类中,包括N88A,Q126F和G。预计4类中的突变蛋白较野生型IL-2的体内效力更高。
由表1可见,没有单一突变导致IL-2突变蛋白在两种分析中均无活性。然而可以得出,导致两个不同位置的活性严重受损的突变组合应该有效产生对T细胞或其它带有高亲和力IL-2受体的细胞类型的拮抗剂IL-2活性。之所以根据所述数据预测了这样的拮抗剂,是因为设计了仅改变与IL-2Rβ和IL-2Rγ相互作用的突变。一个这样的实例是双突变蛋白D20R/Q126T。预期在一个分子中的微弱活性突变的组合是性质的组合,即D20R对T细胞的活性为0.00018,Q126T对T细胞的活性为0.0001,则预期双突变蛋白D20R/Q126T是野生型IL-2对T细胞的活性的0.000000018。根据所提供的数据可得出其它组合。
实施例6.野生型IL-2和IL-2突变蛋白的生物活性
图1-7显示以下物质的剂量反应曲线:野生型人IL-2(IL-2)和D20H(图1)、IL-2和D20I(图2)、IL-2和N88G(图3)、IL-2和N88I(图4)、IL-2和N88R(图5)、IL-2和Q126E(图6),以及IL-2和Q126L(图7)。A:IL-2(实心圆)和突变蛋白(空心圆)在初级人T细胞增殖分析(PHA-母细胞)中的单独剂量反应。B:IL-2(实心三角形)和突变蛋白(空心三角形)在初级人NK细胞增殖分析中的单独剂量反应。
具体关于图1,对于所示的试验,野生型IL-2产生50%最大增殖的剂量(EC50)是~1.5×10-10M(T细胞(A)分析)和~1×10-10M(NK细胞(B)分析)。D20H在该T细胞分析中的EC50为~2×10-10M,但是估计在NK细胞分析中EC50>1×10-5M。因此按该分析测定,D20H的T细胞活性相对于NK细胞活性净增加>50,000倍。应用其它供体的血液获得类似的结果(资料未提供)。
具体关于图2,对于所示的试验,野生型IL-2产生50%最大增殖的剂量(EC50)是~1.5×10-10M(T细胞(A)分析)和~3×10-10M(NK细胞(B)分析)。D20I在该T细胞分析中的EC50也为~1.5×10-10M,但是估计在NK细胞分析中EC50仅为~5×10-6M。因此按该分析测定,D20I的T细胞活性相对于NK细胞活性净增加~16,000倍。应用其它供体的血液获得类似的结果(资料未提供)。
具体关于图3,对于所示的试验,野生型IL-2产生50%最大增殖的剂量(EC50)是~4×10-11M(T细胞(A)分析)和~2×10-10M(NK细胞(B)分析)。N88G在该T细胞分析中的EC50为~5×10-12M,但是估计在NK细胞分析中EC50仅为~3×10-8M。因此按该分析测定,N88G的T细胞活性相对于NK细胞活性净增加~1,200倍。应用其它供体的血液获得类似的结果(资料未提供)。
具体关于图4,对于所示的试验,野生型IL-2产生50%最大增殖的剂量(EC50)是~1.5×10-10M(T细胞(A)分析)和~1×10-10M(NK细胞(B)分析)。N88I在该T细胞分析中的EC50为~4×10-10M,但是估计在NK细胞分析中EC50仅为~5×10-6M。因此按该分析测定,N88I的T细胞活性相对于NK细胞活性净增加~18,000倍。应用其它供体的血液获得类似的结果(资料未提供)。
具体关于图5,对于所示的试验,野生型IL-2产生50%最大增殖的剂量(EC50)是~1.5×10-10M(T细胞(A)分析)和~1×10-10M(NK细胞(B)分析)。N88R在该T细胞分析中的EC50为~9×10-11M,但是估计在NK细胞分析中EC50仅为~3×10-7M。因此按该分析测定,N88R的T细胞活性相对于NK细胞活性净增加~5,000倍。应用其它供体的血液获得类似的结果(资料未提供)。
具体关于图6,对于所示的试验,野生型IL-2产生50%最大增殖的剂量(EC50)是~8×10-12M(T细胞(A)分析)和~5×10-11M(NK细胞(B)分析)。Q126E在该T细胞分析中的EC50为~8×10-13M,但是估计在NK细胞分析中EC50仅为~2×10-9M。因此按该分析测定,Q126E的T细胞活性相对于NK细胞活性净增加~400倍。应用其它供体的血液获得类似的结果(资料未提供)。
具体关于图7,对于所示的试验,野生型IL-2产生50%最大增殖(EC50)的剂量是~5×10-11M(T细胞(A)分析)和~8×10-11M(NK细胞(B)分析)。Q126L在该T细胞分析中的EC50为~2×10-11M,但是估计在NK细胞分析中EC50仅为~2×10-8M。因此按该分析测定,Q126L的T细胞活性相对于NK细胞活性净增加~625倍。应用其它供体的血液获得类似的结果(资料未提供)。
实施例7.黑猩猩毒性研究
从表1的IL-2突变蛋白选择IL-2/N88R,因为在初级人T和NK细胞分析中证实它具有T细胞选择性激动剂活性。相对于野生型IL-2,其对T细胞的活性较对NK细胞的活性高~6,000倍,而且显示与野生型IL-2对T细胞活性基本上相等的活性。在CHO细胞中产生IL-2/N88R,纯化,并在IL-2活性和毒性的黑猩猩模型中进行评价。在该体内模型中,它具有与市售重组变异体IL-2(PROLEUKINTM,Chiron Corporation,Emeryville,CA)相当的T细胞活性,然而比较起来仅诱导轻微的副作用(均根据客观参数和临床参数)。
A.试验设计
1.材料与方法
本研究的生命期(in-life)部分在New Iberia Research Center(NewIberia,LA,Sponsor Bayer Corporation,Berkeley,CA)进行并包括两个研究阶段,11只幼年至成年雄性黑猩猩,体重约45-70kg。
I期研究是剂量确定期,包括以1.2mg/m2传递皮下剂量的溶媒或PROLEUKIN,每日2次(BID),持续5天。II期研究对皮下给予溶媒、PROLEUKIN和IL-2/N88R进行比较,所述给予每12小时一次(q 12h),持续5天。根据药代动力学分析选定IL-2/N88R剂量,以提供与PROLEUKIN相当的暴露时间。取血液样品以分析血液化学、CBC、血液学/凝血以及FACS分析T细胞和NK细胞群,详见部分5和6。
表2A.I期方案
组别 |
动物数 |
受试物质 |
剂量 |
频率 |
1 |
1 |
溶媒 |
NA |
BID,5天 |
2 |
2 |
PROLEUKIN |
1.2mg/m<sup>2</sup> |
BID,5天 |
表2B.II期方案
组别 |
动物数 |
受试物质 |
剂量 |
频率 |
1 |
1 |
溶媒 |
2.4ml/m<sup>2</sup> |
q 12h,5天 |
2 |
2 |
PROLEUKIN |
1.2mg/m<sup>2</sup> |
q 12h,5天 |
3 |
3 |
IL-2/N88R |
1.2mg/m<sup>2</sup> |
q 12h,5天 |
2.给药方法
在需要取血的试验日,采用IM***以约10mg/kg剂量对动物进行全麻之后,给予所述受试物质或溶媒。在不需要取血样品的试验日,采用挤压笼(squeeze cage)物理性限制动物之后,给予受试物质或溶媒。皮下注射给予所述剂量,每12小时一次,持续5天,在研究的第一天剪去注射部位的毛发。记录每次给药的部位和时间。
3.临床观察
(a)日常观察和食物消耗 每日观察每只动物两次,任何异常观测结果均需向研究主管报告。应该使研究主管、项目兽医以及发起人代表(Sponsor Representative)关注发生疾病的动物。经肉眼观察查证并记录食物消耗,每日两次。
(b)体重 试验前、第一天给药前测量体重,每次都使动物镇静收集血液。
(c)注射部位观察 每日观察注射部位一次。记录出现的任何异常外观例如红或肿。
表3A.II期样品收集计划表
时间 |
CBC |
CHEM |
COAG |
FACS |
SPONSOR分析 |
研究前 |
X |
X |
X |
X |
X |
第1天,给药前 |
X |
X |
X |
X |
X |
第1天,15分钟 |
|
|
|
|
X |
第3天,给药前 |
X |
X |
X |
X |
X |
第3天,15分钟 |
|
|
|
|
X |
第6天 |
X |
X |
X |
X |
X |
第8天 |
X |
X |
X |
X |
X |
第10天 |
X |
X |
X |
X |
X |
第12天 |
X |
X |
X |
X |
X |
第15天 |
X |
X |
X |
X |
X |
第30天 |
X |
X |
X |
X |
X |
4.样品处理
(a)血清化学 在以上指定时间点从每只动物收集大约2ml血液样品于无抗凝剂的试管中。记录血液收集时间,并让血液在室温下凝固。然后离心样品,分离血清并将其运送至NIRC临床病理实验室。NIRC标准血清化学项目见表4:
表4:血液化学项目
钠 |
磷 |
钾 |
尿素氮 |
氯化物 |
肌酐 |
总胆红素 |
总蛋白 |
碱性磷酸酶 |
白蛋白 |
乳酸脱氢酶(LDH) |
白蛋白/球蛋白比 |
天冬氨酸氨基转移酶(AST) |
葡萄糖 |
丙氨酸氨基转移酶(ALT) |
钙 |
二氧化碳(CO<sub>2</sub>) |
γ-谷氨酰转移酶(GGT) |
(b)血液学 在上述指定时间点从每只动物收集大约2ml血液样品于EDTA试管中,并将其运送至NIRC临床病理实验室。对所有样品进行标准NIRC血液学项目,包括全部血细胞计数、分类以及血小板计数。
(c)SPONSOR分析 在以上指定时间点收集大约6ml血液样品于EDTA抗凝剂试管内。记录血液收集时间。离心样品,分离血浆并等分至3个试管中。将血浆冷冻贮藏(-60℃或以下),完成本研究就将其运送至Bayer Corporation,Berkeley,CA。
5.FACS
(a)方法 在 FACS分析特定时间点用肝素钠抗凝剂收集大约5ml血液样品。
以EDTA、ACD或肝素获得全血样本。细胞数调节为2-20×103/mm3。
适当标记12×75玻璃或塑料试管用于进行抗体系列试验。按照生产商建议的体积在各试管中加入抗体或抗体混合物。
每管中加入100μl充分混合的血液标本,将混合物在室温、避光下温育30分钟。
温育后,加入2ml裂解液(Becto Dickinson商标的FACS裂解液,BD#92-0002),轻轻涡旋该混合物,在室温下静置10分钟。然后于室温下将各管以300×g离心5分钟。倾析上清液,吸去残余液体,向每一细胞沉淀物中加入1ml PBS缓冲液(GIBCO 14190-144)。轻轻涡旋后,在室温下以300×g将各试管离心5分钟。倾析上清液,吸去残余液体,然后向细胞沉淀物中加入1ml固定液(0.5%甲醛溶液,用PBS缓冲液稀释10%甲醛(Polyscience,Inc.#0418)20倍制得),轻轻涡旋以重悬浮。然后将样品于Coulter EPICS SL流式细胞仪上进行分析。
用于研究的抗体:MIgG1/MIgG1同种型对照(Becton Dickinson,目录号349526)、CD45-PerCP(Becton Dickinson,目录号347464)、CD8-FITC(Becton Dickinson,目录号347313)、CD25-PE(BectonDickinson,目录号30795X)、CD4-FITC(Becton Dickinson,目录号340133)、CD16-PE(Pharmingen,目录号347617)、CD3-PerCP(BectonDickinson,目录号347344)。
6.凝固类型
在上述指定时间点收集大约2ml全血样品于加有柠檬酸钠抗凝剂的试管内。凝固类型包括凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血激酶时间(APTT)和纤维蛋白原。
B.结果与讨论
1.PROLEUKIN剂量确定
该期研究的主要目的是鉴定与IL-2/N88R比较的PROLEUKIN最佳剂量。寻找的PROLEUKIN最佳剂量是可产生理想的临床作用但是产生适度并可逆毒性的可耐受剂量(低于最大耐受剂量)。根据PROLEUKIN的交叉物种外推的特定临床剂量方案、其相应毒性以及短尾猴的独特PROLEUKIN剂量反应结果确定1.2mg/M2×BID的PROLEUKIN剂量为初始剂量。
用PROLEUKIN以相同方式处理两只黑黑猩。在整个给药期间这两只动物程度不断加重的活动减少、痛苦和脱水。在第3或4天两只动物均发生严重的胃肠道症状,包括食欲下降、腹泻、呕吐。给药后3天一只动物因为血液化学反映出现严重肾功能紊乱(图8A & B)和中度肝功能紊乱(图8C&D)而终止给药。所述血液化学包括血液尿素氮(BUN)、肌酐和总胆红素、ALT(SGPT)升高。在第3和4天(动物X-159)和仅在第4天(动物X-124)对均用PROLEUKIN处理的动物静脉内给予乳酸化的Ringer氏液,以恢复或防止进一步脱水。X-159号动物在第8天退出试验,因为肾功能紊乱和脉搏(股动脉)非常弱提示可能右腿发生血栓,而且整个腓肠变冷并增大。虽然在一只动物中观察到明显毒性,但是另一只动物表现出不算严重的副反应并且两只动物的副作用形式均是可逆的。基于此,1.2mg/M2PROLEUKIN和同等剂量的(根据暴露)IL-2/N88R,每12小时给药一次,将其确定为合适的剂量方案,以便比较这两种化合物。
2.比较IL-2/N88R与PROLEUKIN
临床观测结果 表5列出了在该研究期间获得的临床观测结果。数值以0-5等级报告,其中5表示严重。所有PROLEUKIN处理动物均出现严重副反应;有1例PROLEUKIN处理相关性死亡。在第6天后报告的PROLEUKIN组的数值为余下的两只动物的数据。IL-2/N88R处理最明显的副作用似乎是轻度GI紊乱(呕吐),尽管表5所示参数说明处理确实诱发轻微毒性。PROLEUKIN组的体重在第6天下降6%,第10天下降达10%,此后缓慢恢复(参见图9)。相反,IL-2/N88R和溶媒组最多仅降低1-3%。
表5.临床观测结果*
处理 |
一般状况 |
食欲降低 |
嗜睡 |
GI |
不适 |
IL-2/N88R |
良好 |
1 |
1 |
2 |
1 |
PROLEUKIN |
严重副反应 |
5 |
4/5 |
5 |
4/5 |
溶媒 |
正常 |
0 |
0 |
0 |
0 |
等级0-5,其中5最严重
(a)血液学 IL-2/N88R诱导的细胞效应与PROLEUKIN活化作用一致,尤其是增加淋巴细胞作用(图10A),还观察到白细胞(图10B)和嗜中性白细胞升高(图10C)。与PROLEUKIN(最低约50%)比较,在该研究的处理部分期间,IL-2/N88R仅诱导临界血小板减少(最低约15%)(图10D)。
(b)肾功能 在第6和8天时,所有Proleukin处理动物的BUN水平均明显升高(图11A)。其中两只动物的BUN水平高于130mg/dL;在第6和8天所述两只动物的肌酐水平也明显升高(图11B),说明肾功能全面下降。另外,在第6和8天时,PROLEUKIN处理组的血清磷和阴离子间隙也均升高。相反,在整个研究期间所有IL-2/N88R动物的所述肾功能参数保持基本正常(图11C&D)。
(c)肝功能 第6天时PROLEUKIN组动物的总胆红素升高3倍以上,到第10天仍然较高(图12A)。相反,IL-2/N88R组中只有一只动物在第3和6天暂时性轻度升高。在第6天所有PROLEUKIN动物的血清SGPT水平明显升高并达到100U/L以上(图12B)。A199号动物的SGPT水平达到651U/L,而SGOT为2789U/L(Lab Note Book:NIRC#8754-9852-Phase II,表1个体和组平均化学值,该表的第17-21页),说明肝功能严重衰竭。
d)血液凝固 PROLEUKIN和IL-2/N88R两组动物的纤维蛋白原水平升高2倍以上,在第6天达到高峰(图12C)。但是PROLEUKIN组较IL-2/N88R组动物的升高似乎更早。这反映为在第3天时其升高分别为51%与5%。纤维蛋白原变化可能是因为急性蛋白反应所致,而不是凝血缺陷,因为在此相同时间内相应存在APTT或PT的无意义变化(图12D)。但是,从第10天开始PROLEUKIN动物的APTT水平显示明显升高的趋势,尽管其绝对值仍然在正常范围内。在IL-2/N88R组也观察到相同的趋势,尽管其程度较低。然而有趣的是,在这两组中,在相同时间内的纤维蛋白原水平似乎呈下降趋势。
(e)内环境稳定性 第8天,三只PROLEUKIN动物中的两只的血清钠水平下降至135MEQ/L以下,但是其它动物的血清钠水平保持正常(图13A)。从第3天开始,PROLEUKIN组动物的氯化物水平也下降至95MEQ/L以下,直到第15天仍然低下(图13B)。在第6和8天,3只PROLEUKIN动物中的2只的钙水平降低,A199号动物低至4.9和3.1mg/dL(图13C)。在第3-12天,所有PROLEUKIN处理动物的钾水平降低至3MEQ/L以下,例外的是A199动物在终止研究前其钾水平实际升高至毒性水平7.2MEQ/L(图13D)。
(f)血管渗漏体征 PROLEUKIN(37%)和IL-2/N88R(19%)两组的血清白蛋白水平均降低(图14A)。在第3和6天,在PROLEUKIN组中观察到血细胞比容水平升高(图14B)。相反,在相同的时间内溶媒对照和IL-2/N88R组的血细胞比容水平降低并保持低水平,说明存在预期的轻度贫血,因为多次收集血液样品所致(图14B&C)。PROLEUKIN组的血细胞比容升高连同白蛋白降低与发生毛细血管渗漏综合征相符。
3.细胞活化作用
通过CD25阳性淋巴细胞百分率(运送+增殖)和CD25荧光或在特定T细胞表面表达的CD25抗原数的平均值的改变(CD25=低亲和力IL-2R)监测PROLEUKIN和IL-2/N88R的作用。监测总T细胞群(CD3+细胞)以及CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞群上的CD25表达。
通过分析CD3-CD16+和CD3-CD25+CD16+NK细胞的运送监测IL-2对天然杀伤细胞(NK)的活性。用在血液学分析期间获得数据细胞百分率×淋巴细胞数/mm3确定CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞的绝对数。
(a)在T细胞表面上的CD25表达调节 以CD25阳性细胞表示,到研究的第6天时,活化的T细胞百分率向上调节,最高见于CD3+CD4+T细胞亚群。第6天时,PROLEUKIN似乎诱导CD25在百分率升高的总CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞亚群上表达。但是到第8天时,在PROLEUKIN处理的黑猩猩和IL-2/N88R处理的黑猩猩的淋巴细胞上表达CD25抗原的细胞百分率相同(图15A、B和C)。在PROLEUKIN或IL-2/N88R处理的黑猩猩中,未观察到在天然杀伤(NK)细胞群表面上的CD25染色。怀疑在选定的NK细胞群(CD3-/CD16+)表面缺乏IL-2Rα(针对CD25染色的细胞表面的抗原)表达是产生这些结果的原因。
CD3+CD25+T细胞绝对数和CD3+CD25+T细胞百分率的图形相似,PROLEUKIN的活性似乎较IL-2/N88R强(图16A)。对CD3+CD4+T细胞群,IL-2/N88R与PROLEUKIN的T细胞活化潜力相似,因为IL-2/N88R诱导CD3+CD4+CD25+淋巴细胞向上调节的绝对数与用PROLEUKIN观察到的向上调节相同(图16B)。似乎PROLEUKIN增加CD3+CD8+CD25+T细胞的程度较IL-2/N88R高(图16C)。
用PROLEUKIN或IL-2/N88R处理,在CD3+CD4+T细胞亚群上表达的CD25分子数(平均荧光值)都遵循相同的动力学(图17)。
(b)淋巴细胞运送:PROLEUKIN和IL-2/N88R处理的作用 通过分析处理前、处理期间和处理后的循环淋巴细胞的绝对数变化,确定PROLEUKIN和IL-2/N88R对T细胞和NK细胞群的活性(图18)。似乎IL-2/N88R增加CD3+CD4+循环淋巴细胞绝对数的活性高于PROLEUKIN(图18A),与PROKEUKIN相比,IL-2/N88R增加CD3+CD8+循环淋巴细胞的活性略低(图18B)。两种化合物对增加CD3+淋巴细胞总数具有相当的作用,尽管活性作用中等(图18C)。PROLEUKIN或IL-2/N88R均不影响NK细胞的运送(图18D)。
C.结论
通过以人初级T和NK细胞分析筛选突变的IL-2蛋白获得IL-2/N88R。它对T细胞的体外选择活性相对于NK细胞约为6,000倍。基于该细胞形式的前提是当以引发明显T细胞活化的剂量给予时它仅诱发轻度副作用。在黑猩猩中进行试验,比较PROLEUKIN与IL-2/N88R,证实IL-2/N88R安全性显著好于PROLEUKIN,同时保持相似的诱导T细胞活化的能力。
实施例8:IL-2选择性激动剂N88R在小鼠CT-26肺转移肿瘤模型中的疗效
方案:在第0天经尾外侧静脉用1×105 CT-26细胞(小鼠结肠癌)的0.2ml PBS对小鼠(Balb/c,雌性,6-8周龄)进行静脉内(IV)注射。用不同剂量PROLEUKIN或IL-2/N88R(稀释剂:5%葡萄糖水溶液(D5W))或D5W进行处理,IV给药,植入肿瘤细胞后1天开始,每日一次,持续8天(QD×8)。采用结核菌素注射器、硅化小瓶,通过在室温下稀释入D5W中制备IL-2/N88R,并在制备的2小时内给予动物。向每个小瓶中加入0.7ml注射用无菌水(SWFI)制备PROLEUKIN(终浓度,1.86mg/ml)。按关于IL-2/N88R稀释入D5W中所述进行稀释(表6)。在第11天处死动物。取出肺并称重,以PBS冲洗,将组织转移至Bouin氏溶液中。24小时后,将组织转移至10%***中。在解剖显微镜下计数在肺中的转移集落数。
表6.在小鼠CT-26肿瘤模型研究中的剂量和组别
组别 |
n |
处理 |
剂量,mg/kg |
1 |
14 |
D5W |
NA |
2 |
11 |
PROLEUKIN |
3mg/kg |
3 |
11 |
PROLEUKIN |
10mg/kg |
4 |
11 |
IL-2/N88R |
1mg/kg |
5 |
12 |
IL-2/N88R |
3mg/kg |
6 |
12 |
IL-2/N88R |
10mg/kg |
7 |
12 |
IL-2/N88R |
30mg/kg |
8 |
11 |
IL-2/N88R |
60mg/kg |
表7.显示对各个小鼠计数的转移瘤数。对IL-2/N88R和PROLEUKIN都观察到相似的疗效。在高剂量的IL-2/N88R(第8组,60mg/kg),除了一只小鼠外,所有小鼠的肿瘤数为12个或更少;其中3只小鼠无肺部转移瘤。这与所测试的最高剂量PROLEUKIN相反,在该剂量所有存活小鼠均具有12个转移瘤或更多。
表7.个体转移瘤数和平均值列表
组别 |
肺转移数(列出各个小鼠的计数) |
均数 |
SEM |
P值(2-tailed) |
|
|
|
|
|
1 |
0 129 183 179 155 165 200 152 148 158200 194 165 125 |
154 |
13.42 |
|
|
|
|
|
|
2 |
118 126 107 111 118 110 137 114 135158 132 |
124 |
4.61 |
0.07278 |
3 |
12 38 18 19 30 |
23 |
4.66 |
0.00003 |
|
|
|
|
|
4 |
169 173 189 200 120 117 136 122 200163 110 |
154 |
10.41 |
0.97029 |
5 |
171 176 186 159 192 139 117 200 195116 192 |
168 |
9.31 |
0.43401 |
6 |
92 111 112 114 109 84 68 47 58 49112 |
87 |
8.16 |
0.00060 |
7 |
15 13 59 62 23 55 46 16 94 82 |
26 |
6.57 |
0.00000 |
8 |
7 0 3 2 4 9 7 0 12 55 0 |
9 |
4.75 |
0.00000 |
在以10、30和60mg/kg(分别为第6、7和8组)IL-2/N88R剂量处理的小鼠和10mg/kg PROLEUKIN(第3组)处理组观察到转移显著减少(P<0.05)。这些结果图示于图19。采用以下剂量的对数对数据作图:PROLEUKIN的剂量为3和10mg/kg;IL-2/N88R剂量为1、3、10、30和60mg/kg。采用非线性方程(4个参数拟合)进行曲线拟合,获得PROLEUKIN的IC50值为5.2mg/kg,IL-2/N88R的IC50值为10.9mg/kg。
根据该试验数据,估计转移数降低的IL-2/N88R IC50为10.9mg/kg(8.6-13.9mg/kg,95%置信度),PROLEUKIN为5.2mg/kg(3.5-7.7mg/kg,95%置信度)。
小鼠存活率见表8。在10mg/kg PROLEUKIN组,1只(1)小鼠在第7天死亡,其它5只(5)在第8天死亡。用3或10mg/kg IL-2/N88R处理组中都有1只(1)小鼠在第8天死亡,而在1、30或60mg/kgIL-2/N88R剂量未观察到死亡。此外,用3mg/kg PROLEUKIN处理的大多数小鼠和用10mg/kg PROLEUKIN处理的所有小鼠频临死亡;在IL-2/N88R处理的小鼠中未观察到发病。
表8.用IL-2/N88R或PROLEUKIN处理小鼠的存活率
组别 |
天数 |
|
0 |
7<sup>4</sup> |
8 |
11 |
D5W<sup>1</sup> |
100.0% |
100.0% |
100.0% |
100.0%
|
|
|
|
|
|
Pro:3mg/kg<sup>2</sup> |
100.0% |
100.0% |
100.0% |
100.0% |
Pro:10mg/kg<sup>2</sup> |
100.0% |
90.9% |
45.5% |
45.5% |
|
|
|
|
|
IL-2/N88R:1mg/kg<sup>2</sup> |
100.0% |
100.0% |
100.0% |
100.0% |
IL-2/N88R:3m/kg<sup>3</sup> |
100.0% |
100.0% |
91.7% |
91.7% |
IL-2/N88R:10m/kg<sup>3</sup> |
100.0% |
100.0% |
91.7% |
91.7% |
IL-2/N88R:30mg/kg<sup>3</sup> |
100.0% |
100.0% |
100.0% |
100.0% |
IL-2/N88R:60mg/kg<sup>2</sup> |
100.0% |
100.0% |
100.0% |
100.0% |
1n=14小鼠/组
2n=11小鼠/组
3n=12小鼠/组
4在第7天前未观察到死亡。
2组PROLEUKIN处理动物均频临死亡。在任何IL-2/N88R处理动物中均未观察到发病。
总之,这些研究表明IL-2/N88R降低肿瘤负荷和PROLEUKIN同样有效(按CT26模型的肺转移计数测定)。此外,证实IL-2/N88R的毒性显著低于PROLEUKIN。
实施例9.开发表达IL-2/N88R的稳定的高产率CHO细胞系
通过用图20所示的表达载体转染CHO(dhfr-)细胞研制分泌高产量IL-2/N88R突变蛋白的稳定生产细胞系(ATCC保藏号____)。IL-2/N88R表达载体的各个组成部分示于质粒图谱(图20)。它显示CMVe/p=巨细胞病毒早期启动子;PA=SV40聚腺苷酸信号序列;和DHFR=二氢叶酸还原酶表达盒。
采用标准重组DNA技术构建所述载体。一般参见Sambrook等,Molecular Cloning,第二版,1989,Cold Spring Harbor Press;Short Protocols in Molecular Bilolgy,第二版,1992,John Wiley & Son;Methods in Enzymology第185卷,编辑Goeddel等,Academic Press,Inc.,London,1991。所述表达载体含有不连续的IL-2/N88R基因表达盒和扩增及选择基因DHFR(二氢叶酸还原酶)。采用脂质转染试剂(Life Technology Inc.,Bethesda,Maryland)按照生产商的指示用10μgpBC1IL2SA转染约1×106CHO(中国仓鼠卵巢)细胞。然后在存在50nM氨甲喋呤的情况下对细胞进行选择,在加有5%透析的胎牛血清而且为胸腺嘧啶核苷和次黄嘌呤缺陷型的DME/F12培养基(LifeTechnologies,Inc.)中培养。用市售ELISA试剂盒(R&D Systems)筛选产生IL-2/N88R的细胞群。在含有氨甲喋呤浓度不断增高(100-400nM氨甲喋呤)的培养基中进一步选择高产量细胞群并筛选用于IL-2/N88R生产。然后使用有限稀释克隆产生具有高而稳定产率的克隆。采用标准组织培养技术在缺乏氨甲喋呤的情况下进行克隆。
实施例10.在灌流生物反应器中无血清生产的IL-2/N88R
通过持续灌流发酵连续生产IL-2/N88R。用实施例9的稳定CHO细胞系以2×106细胞/ml接种到19L Wheaton发酵罐中,并以5L/天的培养基交换速率进行灌流。生产培养基为DME/F12基培养基(LifeTechnologies,Inc.,Rockville,MD),加有重组人胰岛素(10ug/ml)(HUMULINTM,Eli Lilly,Inc.,Indianapolis,IN)和FeSO4.EDTA(50uM)。细胞密度保持在4×106细胞/ml。所述发酵罐的平均日产量为约200mg/天。稳定保持IL-2/N88R生产30天。
实施例11.纯化CHO细胞产生的IL-2/N88R
将以下方法用于上述灌流放罐液。收获所述灌流培养基,并上样于S-sepharose柱。该柱用含有5mmol NaCl的20mmol磷酸盐缓冲液pH7.0平衡。加入水将进样(“TCF”)电导率调节至4ms(millisiemens)传导率,并用磷酸调节至相同pH。
在TCF上柱后,将所述柱在相同平衡缓冲液中进行洗涤。经改变pH完成洗脱。用20mM乙醇胺pH10.5洗脱突变蛋白,从所述柱洗出所述突变蛋白,获得S-洗出物。
通过将S-洗出物流过用10mM碳酸氢钠缓冲液pH10.5平衡的QAE Fast FloWTM柱(Pharmacia)进行阴离子交换。流速保持在250cm/hr。洗涤至基线后,用20mM磷酸盐pH4.0洗出IL-2SA。
将稀释的QAE洗脱液(用WFI按1∶1稀释)通过装有用0.10mM磷酸盐pH7.0平衡的陶瓷羟磷灰石柱(II型,Bio-Rad,Hercules,CA),进行羟磷灰石(HAP)层析。流速保持在250cm/hr。洗涤至基线后,用100mM磷酸盐pH7.0洗脱IL2SA。
采用配有3个PES 5K滤筒的Millipore Pelicon-2装置(MilliporeCorporation,Bedford,MA)超滤羟磷灰石洗脱液至300ml体积。
将所超滤的HAP洗脱液以35cm/hr通过S100HR(Pharmacia)尺寸排阻柱进一步纯化。该柱用10mM磷酸盐和150mM NaCl pH7.0平衡。
用WFI稀释凝胶过滤合并物以达到电导率为4.0mMho/cm,将其在上述条件下再次上样于S-Sepharose柱。用含有1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲液pH7.0洗脱IL2SA。
将最终的阳离子交换合并物对磷酸缓冲盐溶液(PBS)透析过夜,并用无菌PBS稀释至浓度为6mg/ml。然后将最终稀释的合并物过滤除菌,等分并冷藏于-70℃。总回收率为65%。
本发明其它实施方案对本领域技术人员而言将是显而易见的。本发明指出了如何获得非本文具体描述的、但是引起T细胞激活(其证据是PHA-母细胞增殖)而NK细胞增殖减少的非特异性突变蛋白,所以这些突变蛋白包括在本发明的宗旨和范围内。本文所述的原理和试验方法应该适用于其它利用异源多聚体受体***的细胞因子,尤其是相关的细胞因子IL-7、IL-9和IL-15、IL-10、干扰素α以及干扰素γ。
序列
在本申请中包含以下序列:
SEQ ID NO:1:hIL-2(氨基酸)
SEQ ID NO:2:hIL-2(cDNA)
SEQ ID NO:3:5’PCR引物,IL-2
SEQ ID NO:4:3’PCR引物,IL-2
SEQ ID NO:5:IL-2表达载体的诱变引物
SEQ ID NO:6:D20X突变的诱变引物
SEQ ID NO:7:N88X突变的诱变引物
SEQ ID NO:8:Q126X突变的诱变引物
<110>Shanafelt,Armen B.
Greve,Jeffrey M.
Lembach,Kenneth J.
Wetzel,Gayle D.