CN101244261B - 一种含未复性重组蛋白的生物制剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种含未复性重组蛋白的生物制剂及其制备方法与应用，制备方法为：先制备包涵体，然后将包涵体蛋白在变性条件下分离纯化，得到高纯度的、未复性的、不溶于水的重组蛋白，再与其它医学上可接受的辅液混匀，即制成可直接静脉注射或腹腔注射的生物制剂。本发明具有以下优点：1、只对重组蛋白进行纯化，不进行体外复性，省略了繁琐的复性过程，成本低、产品收率高；2、将纯化处理后的未复性的重组蛋白直接制成生物制剂供静脉注射用，重组蛋白在体内会逐渐复性、逐步发挥药理作用，不会被酶解，降低了给药后的峰值作用，延长药效作用的半衰期。本发明的制备方法具有简单、成本低、收率高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种含未复性重组蛋白的生物制剂及其制备方法与应用。
背景技术
目前，重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，但人们在分离纯化基因工程表达产物时却遇到了意想不到的困难：很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白介素-6、人γ-干扰素、G-CSF、IL-2、GM-CSF、渐-18等，不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1～3.0μm的固体颗粒包涵体，这些基因表达产物的一级结构(即氨基酸序列)虽然正确，而其立体结构是错误的，所以没有生物活性；因此，为获得天然状态的目标产物，必须在分离回收包涵体后，溶解包涵体并设法使其中的目标蛋白质恢复应有的天然构象和活性，这就向生物化学家关于蛋白质折叠机制及复性研究提出了新课题。
包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒；是因在重组蛋白表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因造成的。包涵体一般含有50％以上的重组蛋白，其余为核糖体、RNA聚合酶、内毒素、环状或缺口的质粒DNA、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5～1μm，具有很高的密度(约1.3mg/ml)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
现有技术中一般是先将重组蛋白纯化复性后应用于人体静脉或腹腔注射，但重组蛋白的复性过程步骤繁琐、耗时长、成本高，而且产品收率低；另外，在体外进行复性后的重组蛋白进入人体后存在以下不足：1.很容易被酶解；2.半衰期短；3.会形成药理作用的峰效应，影响了应有的疗效。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种含未复性重组蛋白的生物制剂，省略了烦琐的复性过程，且进入人体后不容易被酶解，不会形成药理作用的峰效应，不影响重组蛋白应有的疗效。本发明还提供了此生物制剂的制备方法与应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种含未复性重组蛋白的生物制剂，是由未复性重组蛋白和医学上可接受的辅液组成的，其中，未复性重组蛋白与医学上可接受的辅液的质量比为1∶1～25。
所述医学上可接受的辅液是人血清白蛋白，未复性重组蛋白与人血清白蛋白的质量比为1∶1～10。
所述医学上可接受的辅液是人血清白蛋白和磷脂酰胆碱，其中，人血清白蛋白和磷脂酰胆碱的质量比为2～20∶1～5。
所述医学上可接受的辅液是人血清白蛋白、海藻糖，其中，人血清白蛋白和海藻糖的质量比为1～15∶1～10。
所述医学上可接受的辅液是人血清白蛋白、海藻糖、甘露醇，其中，人血清白蛋白、海藻糖、甘露醇三者的质量比为1～15∶1～5∶1～5。
一种含未复性重组蛋白的生物制剂的制备方法，步骤如下：
(1).制备包涵体；
(2).将包涵体蛋白在变性条件下分离纯化，得到高纯度的、未复性的、不溶于水的重组蛋白；
(3).与其它医学上可接受的辅液混匀，制成可直接静脉注射或腹腔注射的生物制剂。
所述步骤(2)中的变性条件是：先用6～8mol/L的尿素溶解包涵体，然后采用金属离子亲和层析进行纯化。
所述步骤(2)中的变性条件是：先用5～7mol/的盐酸胍溶解包涵体，然后采用Q-Sepharose H.P.离子交换层析进行纯化。
所述步骤(2)中的变性条件是：先用0.1％～0.3％Triton X-100及1～3％SDS溶解包涵体，然后采用Q-Sepharose F.F.离子交换层析进行纯化。
一种含未复性重组蛋白的生物制剂作为静脉注射剂或腹腔注射剂的使用。
本发明与常规技术相比，具有以下优点：1、只对重组蛋白进行纯化，不进行体外复性，省略了繁琐的复性过程，成本低、产品收率高；2、将纯化处理后的未复性的重组蛋白直接制成生物制剂供静脉注射用，重组蛋白在体内会逐渐复性、逐步发挥药理作用，不会被酶解，降低了给药后的峰值作用，延长药效作用的半衰期。本发明的制备方法具有简单、成本低、收率高等优点。
附图说明
图1为实施例1的制备工艺流程图；
图2为实施例2的制备工艺流程图；
图3为实施例3的制备工艺流程图；
图4为实施例4的制备工艺流程图。
具体实施方式
实施例1：制备含未复性rhIL-2(白介素-2)的生物制剂，步骤如下：
(1).常规技术制备rhIL-2蛋白包涵体：先使白介素-2(IL-2)在大肠杆菌中表达，然后常规制备包涵体；
(2).用7mol/L的尿素溶解包涵体蛋白，然后采用IMAC金属离子亲和层析对其进行纯
化，透析，得到高纯度的、未复性的、不溶于水的、无内毒素的重组蛋白；
(3).将上述未复性的、不溶于水的重组蛋白与人血清白蛋白混匀，超声处理制成微乳剂，供静脉或腹腔注射，其中，未复性重组蛋白与人血清白蛋白的质量比为1∶5。
给猕猴静脉注射本制剂，以注射市售IL-2冻干制剂为对照组，比较其血清rhIL-2活性水平，结果如表1所示：
表1.猕猴静脉注射本制剂后血清rhIL-2活性水平比较△
△活性测定采用CTLL-2细胞株/MTT比色法，IU/ml血浆.
由上表可知，含未复性rhIL-2(白介素-2)的生物制剂与市售IL-2冻干制剂相比较，半衰期明显增长，给药后的峰值作用明显降低。
实施例2：制备含未复性G-CSF(粒细胞集落刺激因子)的生物制剂，步骤如下：
(1).常规技术制备G-CSF蛋白包涵体：先使粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在大肠杆菌中表达，然后常规制备G-CSF蛋白包涵体；
(2).用6mol/的盐酸胍溶解包涵体蛋白，然后采用Q-Sepharose H.P.离子交换层析对其进行纯化，透析，得到高纯度的、未复性的、无内毒素的重组蛋白；
(3).将上述未复性的重组蛋白与人血清白蛋白及0.5％(w/w)磷脂酰胆碱混匀，制成纳米乳制剂，供静脉或腹腔注射。其中，未复性重组蛋白与人血清白蛋白、磷脂酰胆碱的质量比为1∶10∶3。
给犬白细胞减少症模型静脉注射本制剂，以注射市售G-CSF注射液为对照组，比较其血清G-CSF活性水平，结果如表2所示：
表2.犬白细胞减少症模型静脉注射本制剂后血清G-CSF活性水平比较△
△活性测定采用NFS-60细胞株/MTT比色法，IU/ml血浆.
由上表可知，含未复性G-CSF(粒细胞集落刺激因子)的生物制剂与市售G-CSF注射液相比较，半衰期明显增长，给药后的峰值作用明显降低。
实施例3：制备含未复性干扰素(IFN，包括α、β、ω、γ-IFN)的生物制剂，步骤如下：
(1).常规技术制备干扰素蛋白包涵体：先使干扰素在大肠杆菌中表达，然后常规制备包涵体；
(2).用6mol/的盐酸胍溶解包涵体蛋白，然后采用Q-Sepharose H.P.离子交换层析对其进行纯化，透析，得到高纯度的、未复性的、无内毒素的重组蛋白；
(3).将上述未复性的重组蛋白与人白蛋白、海藻糖、甘露醇混匀，进行乳化，制成生物制剂，供静脉或腹腔注射，其中，未复性重组蛋白与人血清白蛋白、海藻糖的质量比为1∶8∶6。
给猕猴静脉注射本制剂，以注射市售rhIFN制剂为对照组，比较其血清rhIFN活性水平，结果如表3所示：
表3.猕猴静脉注射本制剂后血清rhIFN活性水平比较△
△活性测定采用微量病毒抑制(WISH/VSN)法，IU/ml血浆.
由上表可知，含未复性干扰素(IFN，包括α、β、ω、γ-IFN)的生物制剂与市售rhIFN制剂相比较，半衰期明显增长，给药后的峰值作用明显降低。
实施例4：制备含未复性GH(生长激素)的生物制剂，步骤如下：
(1).常规技术制备生长激素包涵体：先使生长激素在DH5α大肠杆菌中表达，然后常规制备包涵体；
(2).用0.1％～0.3％Triton X-100及1～3％SDS溶解包涵体蛋白，然后采用Q-Sepharose F.F.离子交换层析对其进行纯化，得到高纯度的、未复性的、无内毒素的重组蛋白；
(3).将上述未复性的重组蛋白与人血清白蛋白及海藻糖混匀，进行乳化，制成生物制剂，供静脉或腹腔注射，其中，未复性重组蛋白与人血清白蛋白、海藻糖、甘露醇的质量比为1∶12∶2∶4。
以本制剂相当于市售制剂的剂量给予去垂体大白鼠，体重仍增加，增加程度与对照接近，这表明含未复性GH(生长激素)的生物制剂与对照药均可使去垂体的大白鼠体重增加，而且增加程度相近，故含未复性GH(生长激素)的生物制剂与对照药疗效相当。
本说明书未详述之处均为本领域技术人员所掌握和熟知。
Claims (7)
1.一种含未复性重组蛋白的生物制剂，其特征在于：是由未复性重组蛋白和医学上可接受的辅液组成的，其中，未复性重组蛋白与医学上可接受的辅液的质量比为1∶(1～25)；所述未复性重组蛋白为未复性粒细胞集落刺激因子、未复性干扰素或未复性生长因子中的任一种；
未复性重组蛋白为未复性粒细胞集落刺激因子时，辅液为人血清白蛋白和磷脂酰胆碱，人血清白蛋白和磷脂酰胆碱的质量比为(2～20)∶(1～5)；
未复性重组蛋白为未复性干扰素或未复性生长因子时，辅液为人血清白蛋白、海藻糖、甘露醇，其中，人血清白蛋白、海藻糖、甘露醇三者的质量比为(1～15)∶(1～5)∶(1～5)。
2.一种含未复性重组蛋白白介素-2的生物制剂，其特征在于：是由白介素-2和辅液人血清白蛋白组成的，其中，白介素-2与人血清白蛋白的质量比为1∶(1～10)。
3.根据权利要求1或2所述的一种含未复性重组蛋白的生物制剂的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)制备包涵体；
(2)将包涵体蛋白在变性条件下分离纯化，得到高纯度的、未复性的、不溶于水的重组蛋白；
(3)与其它医学上可接受的辅液混匀，制成可直接静脉注射或腹腔注射的生物制剂。
4.根据权利要求3所述的一种含未复性重组蛋白的生物制剂的制备方法，其特征在于：所述未复性重组蛋白为白介素-2时，步骤(2)中的变性条件是：先用6～8mol/L的尿素溶解包涵体，然后采用金属离子亲和层析进行纯化。
5.根据权利要求3所述的一种含未复性重组蛋白的生物制剂的制备方法，其特征在于：所述未复性重组蛋白为未复性粒细胞集落刺激因子或未复性干扰素时，步骤(2)中的变性条件是：先用5～7mol/L的盐酸胍溶解包涵体，然后采用Q-Sepharose H.P.离子交换层析进行纯化。
6.根据权利要求3所述的一种含未复性重组蛋白的生物制剂的制备方法，其特征在于：所述未复性重组蛋白为未复性生长因子时，步骤(2)中的变性条件是：先用0.1％～0.3％TritonX-100及1～3％SDS溶解包涵体，然后采用Q-Sepharose F.F.离子交换层析进行纯化。
7.根据权利要求1或2所述的一种含未复性重组蛋白的生物制剂，其特征在于：作为静脉注射剂或腹腔注射剂的使用。
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