KR20200086722A - 인터루킨-2의 부분 효능제 - Google Patents

인터루킨-2의 부분 효능제 Download PDF

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KR20200086722A
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케난 크리스토퍼 가르시아
소니아 에스. 마즈리
칼렙 알. 그라스만
레온 리-렌 수
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더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

인간 인터루킨-2(IL-2) 뮤테인 또는 이의 변이체가 특히 본원에 제공된다. 특히, IL-2Rγ에 대한 감소된 결합 능력을 갖는 IL-2 뮤테인이 본원에 제공된다. 상기 IL-2 뮤테인은, 예를 들어, 하나 이상의 IL-2 및/또는 IL-15 기능의 감소 또는 억제가 유용한 적용(예를 들어, 자가면역 질병 또는 질환의 치료)에서 IL-2 부분 효능제로서 유용하다. 상기 IL-2 뮤테인을 인코딩하는 핵산, 상기 IL-2 뮤테인을 제조하는 방법, 상기 IL-2 뮤테인을 포함하는 약학적 조성물 및 상기 약학적 조성물을 이용한 치료 방법이 또한 제공된다.

Description

인터루킨-2의 부분 효능제
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2017년 11월 21일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 62/589,497호에 대한 우선권의 이익을 주장한다. 상기 언급된 출원의 개시내용은 임의의 도면을 포함하여 이의 전체내용이 참조로서 본원에 명백히 포함된다.
연방 후원의 R&D에 관한 진술
본 발명은 미국국립보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 R37 AI051321 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
서열 목록에 대한 언급
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 2018년 11월 14일에 생성된 "Sequence_Listing_078430-503001WO.txt"라는 제목의 파일로 제공되며, 이는 약 32 KB 크기이다. 서열 목록의 전자 형식의 정보는 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
분야
IL-2 수용체 신호의 부분 효능작용의 특성을 나타내는 인터루킨-2 뮤테인뿐만 아니라 자가면역 질병의 치료를 위해 이를 이용하기 위한 방법이 특히 본원에 개시된다.
인터루킨 2(IL-2)는 주로 활성화된 CD4+ T 세포에 의해 생성되는 다능성 사이토카인이며, 이는 정상적인 면역 반응을 발생시키는 데 중요한 역할을 한다. IL-2는 활성화된 T 림프구의 증식 및 확장을 촉진하고, B 세포 성장을 강화시키고, 단핵구 및 자연 살해 세포를 활성화시킨다.
정상적인 면역 반응에서의 생리학적 역할에 더하여, IL-2는 병리학적 반응을 촉진할 수 있으며, 치료 목표는 원하지 않는 자가면역 또는 면역억제성 반응을 차단하면서 상기 사이토카인의 원하는 작용을 유지하는 것이다. 인간 IL-2Rα에 대한 2개의 모노클로날 항체(mAb)인 다클리주맙(Daclizumab) 및 바실릭시맙(Basiliximab)이 FDA에 의해 승인되었으며, 신장 이식 거부(Vincenti et al., N Engl J Med 338: 161 (1998)), 심장 이식(Hershberger et al., N Engl J Med 352: 2705 (2005)), 다발경화증(Gold et al., Lancet 381 : 2167 (2013)) 및 천식(Bielekova et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 : 8705 (2004); 및 Busse et al., Am J Respir Crit Care Med 178: 1002 (2008))에서 효능을 나타내지만, 이들은 NK 및 기억 CD8+ 세포에서 발현된 중간 친화성 IL-2Rγ 수용체를 통한 IL-2 신호전달을 차단하지 않는다(Tkaczuk et al., Am J Transplant 2: 31 (2002)). 항-인간 IL-2Rβ mAb Mikβ1은 IL-2Rγ 수용체를 발현하는 세포에 대한 IL-2및 IL-15의 트랜스-프리젠테이션(trans-presentation)을 차단할 수 있지만(Morris et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 401 (2006)), 고 친화성 이종삼량체 수용체 복합체를 통한 IL-2 또는 IL-15에 의한 시스-신호전달(cis-signaling)을 차단하는 데 비교적 효과적이지 않다(Morris et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 401 (2006); 및 Waldmann et al., Blood 121: 476 (2013)). 결과적으로, 상기 사이토카인의 치료적으로 이로운 효과를 촉진할 수 있지만, 또한 원치 않는 자가면역 또는 면역억제성 반응과 관련된 하나 이상의 IL-2 기능을 또한 차단하는 새로운 IL-2 뮤테인이 필요하다.
본 발명의 개시는 일반적으로 인터루킨 2(IL-2)에 의해 매개되는 신호 전달 경로를 조절하는 것을 필요로 하는 대상체에서 인터루킨 2(IL-2)에 의해 매개되는 신호 전달 경로를 조절하기 위한 조성물 및 방법을 포함하는 면역학 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 IL-2 수용체, 예를 들어, 인터루킨 2 알파 수용체(IL-2Rα), 인터루킨 2 베타 수용체(IL-2Rβ), 인터루킨-2 감마 수용체(IL-2Rγ) 중 적어도 하나에 대한 조절된 친화성을 갖는 신규한 IL-2 뮤테인을 제공한다. 본 발명의 개시의 일부 구현예는 바람직하지 않은 불리한 자가면역 사건, 예를 들어, 염증을 담당하는 면역 세포의 활성화를 촉진하지 않는 IL-2 부분 효능제를 제공한다. 본 발명의 개시의 일부 구현예는 상기 IL-2 뮤테인을 생성하는 데 유용한 조성물 및 방법뿐만 아니라 IL-2 신호전달 경로에 의해 매개되는 신호 전달의 교란과 관련된 건강 상태 및 장애의 치료를 위한 방법에 관한 것이다.
일 양태에서, (a) SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 IL-2 폴리펩티드와 비교하여 인터루킨 2 수용체 γ(IL-2Rγ)에 대한 감소된 결합 친화성, 및 (b) SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 15-95%의 Emax를 갖는 인터루킨 2(IL-2) 뮤테인이 제공된다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 (i) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 따라 넘버링된 L80F, R81D, L85V, I86V 및 I92F로부터 선택된, SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 비해 IL-2Rβ 결합 친화성을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 및/또는 (ii) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열에 따라 넘버링된 (A) L18R 및 Q22E 및 (B) 아미노산 위치 126으로부터 선택된, IL-2Rγ 수용체 결합 친화성을 감소시키고 SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 비해 15-95%의 Emax를 발생시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:2의 위치 126에서의 아미노산 치환은 Q126A, Q126C, Q126D, Q126E, Q126G, Q126H, Q126I, Q126K, Q126M, Q126R, Q126S 또는 Q126T로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 아미노산 치환 Q126H, Q126K 또는 Q126M을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 아미노산 치환 Q126H를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 반감기를 증가시키도록 구조적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 변형은 인간 Fc 항체 단편에 대한 융합, 알부민에 대한 융합 및 PEG화(PEGylation)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 Treg 세포의 확장을 유발하고, 잠재적 염증성 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포 또는 과립구의 확장을 촉진하지 않는다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 비해 잠재적 염증성 T 세포의 증식을 더 적게 유도한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 비해 Treg 세포의 증식을 적어도 3배만큼 증가시키고/시키거나, IFNγ 분비를 더 적게 유도한다. 일부 구현예에서, 잠재적 염증성 T 세포는 CD4+ IFNγ+ T 세포이거나, CD8+IFNγ+ T 세포이다. 본원에 개시된 임의의 구현예의 일부 구현예에서, 뮤테인은 CD8+ T 세포 및/또는 다른 염증성 면역 세포 서브셋으로부터 IFNγ 분비를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 뮤테인은 SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 70-95%의 Emax를 갖는다.
일 양태에서, (a) 인터루킨 2 수용체 γ(IL-2Rγ)에 대한 감소된 결합 친화성, 및 (b) SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 15-95%의 Emax를 갖는 인터루킨 2(IL-2) 뮤테인이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 뮤테인은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 따라 넘버링된 (A) L18R 및 Q22E 및 (B) 아미노산 위치 126으로부터 선택된, IL-2Rγ 수용체 결합 친화성을 감소시키고 SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 15-95%의 Emax를 발생시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 Q126A, Q126C, Q126D, Q126E, Q126G, Q126H, Q126I, Q126K, Q126M, Q126R, Q126S 또는 Q126T로 구성된 군으로부터 선택되는 SEQ ID NO:1의 위치 126에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 아미노산 치환 Q126H, Q126K 또는 Q126M을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 아미노산 치환 Q126H를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 반감기를 증가시키도록 구조적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 변형은 인간 Fc 항체 단편에 대한 융합, 알부민에 대한 융합 및 PEG화로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 IL-2 뮤테인은 조절성 T(Treg) 세포의 증식을 증가시키고/시키거나, 잠재적 염증성 T 세포의 최소 증식을 유도한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 IL-2 뮤테인은 Treg 세포의 확장을 유발하고, 잠재적 염증성 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포 또는 과립구의 확장을 촉진하지 않는다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 비해 잠재적 염증성 T 세포의 증식을 더 적게 유도한다. 일부 구현예에서, 잠재적 염증성 T 세포는 CD4+ IFNγ+ T 세포이거나, CD8+IFNγ+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 잠재적 염증성 T 세포는 CD4+ IFNγ+ T 세포이거나, CD8+IFNγ+ T 세포이다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 비해 Treg 세포의 증식을 적어도 3배만큼 증가시키고/시키거나, IFNγ 분비를 더 적게 유도한다. 일부 구현예에서, 뮤테인은 CD8+ T 세포 및/또는 다른 염증성 면역 세포 서브셋으로부터 IFNγ 분비를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 IL-2 뮤테인은 SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 70-95%의 Emax를 갖는다.
추가 양태에서, (i) 본원에 개시된 IL-2 뮤테인 중 어느 하나를 인코딩하는 핵산, (ii) 핵산을 포함하는 벡터, (iii) 벡터 또는 핵산을 포함하는 숙주 세포, 및 (iv) 본원에 개시된 IL-2 뮤테인 중 어느 하나, 및 또는 본원에 개시된 임의의 핵산 또는 벡터 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 멸균 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
추가 양태에서, 본원에 개시된 IL-2 뮤테인 중 어느 하나, 본원에 개시된 임의의 핵산 또는 벡터, 및/또는 본원에 개시된 임의의 약학적 조성물을 포함하는 주사기 및 주사기를 포함하는 카테터가 본원에 또한 제공된다.
또 다른 양태에서, (i) 본원에 개시된 IL-2 뮤테인 중 어느 하나, (ii) 본원에 개시된 핵산 또는 벡터 중 어느 하나, (iii) 본원에 개시된 주사기 또는 카테터 중 어느 하나, 및/또는 본원에 개시된 약학적 조성물 중 어느 하나뿐만 아니라 이를 사용하기 위한 서면 설명서를 포함하는 키트가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 자가면역 질병을 치료할 필요가 있는 개체에서 자가면역 질병을 치료하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 치료적 유효량의 (i) 본원에 개시된 IL-2 뮤테인 중 어느 하나, (ii) 본원에 개시된 핵산 또는 벡터 중 어느 하나, 및/또는 (iii) 본원에 개시된 약학적 조성물 중 어느 하나를 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 자가면역 질병은 류마티스 관절염, 인슐린-의존성 당뇨병, 용혈성 빈혈, 류마티스 열, 갑상샘염, 크론병, 중증근육무력증, 사구체신염, 자가면역 간염, 다발경화증, 원형탈모증, 건선, 백반증, 이영양성 수포성 표피박리증, 전신 홍반 루푸스 및 이식편 대 숙주병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 자가면역 질병은 이식편 대 숙주병이다. 본원에 개시된 방법의 일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에 개시된 임의의 IL-2 뮤테인 또는 약학적 조성물을 뮤테인을 특정 세포 유형에 표적화하는 항체와 조합하여 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 유형은 조절성 T(Treg) 세포이다. 일부 구현예에서, 항체는 IL-2 뮤테인에 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결된다.
다른 양태에서, 본원에 개시된 뮤테인 중 어느 하나를 생성시키기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 뮤테인의 생성에 적합한 조건하에서 본원에 개시된 임의의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 뮤테인을 분리시키고/시키거나 정제하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 반감기를 증가시키기 위해 뮤테인을 구조적으로 변형시키는 것을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 인간 Fc 항체 단편에 대한 융합, 알부민에 대한 융합 및 PEG화로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함한다.
또한, 일부 양태에서, 잠재적 염증성 T 세포의 증식을 방지하고/하거나 CD8+ T 세포 또는 다른 염증성 면역 세포 서브셋으로부터 IFNγ의 분비를 방지하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 인터루킨 2 수용체 γ(IL-2Rγ)를 발현하는 세포와 본원에 개시된 임의의 IL-2 뮤테인을 접촉시키는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 잠재적 염증성 T 세포는 CD4+CD44+IFNγ+ T 세포이거나, CD8+CD44+IFNγ+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 수행된다. 본원에 개시된 임의의 구현예의 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 반감기를 증가시키도록 구조적으로 변형된다. 본원에 개시된 임의의 구현예의 일부 구현예에서, 변형은 인간 Fc 항체 단편에 대한 융합, 알부민에 대한 융합 및 PEG화로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형이다.
또 다른 양태에서, 조절성 T(Treg) 세포를 (i) SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 인터루킨 2 수용체 γ(IL-2Rγ)에 대한 감소된 결합 친화성, 및 (ii) SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 0-50%의 Emax를 갖는 인터루킨 2(IL-2) 뮤테인을 접촉시키는 것을 포함하는 Treg 세포의 증식을 감소시키기 위한 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 (i) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 따라 넘버링된 L80F, R81D, L85V, I86V 및 I92F로부터 선택된, SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 비해 IL-2Rβ 결합 친화성을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 및 (ii) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열에 따라 넘버링된 (A) L18R 및 Q22E 및 (B) 아미노산 위치 126으로부터 선택된, IL-2Rγ 수용체 결합 친화성을 감소시키고 SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 비해 0-50%의 Emax를 발생시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
또 다른 양태에서, 조절성 T(Treg) 세포를 (i) SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 IL-2Rγ에 대한 감소된 결합 친화성, 및 (ii) SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 0-50%의 Emax를 갖는 IL-2 뮤테인을 접촉시키는 것을 포함하는 Treg 세포의 증식을 감소시키기 위한 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 따라 넘버링된 (A) L18R 및 Q22E 및 (B) 아미노산 위치 126으로부터 선택된, IL-2Rγ 수용체 결합 친화성을 감소시키고 SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 0-50%의 Emax를 발생시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 위치 126에서의 아미노산 치환은 Q126A, Q126C, Q126D, Q126E, Q126G, Q126H, Q126I, Q126K, Q126M, Q126R, Q126S 또는 Q126T로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 아미노산 치환 Q126H, Q126K 또는 Q126M을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 아미노산 치환 Q126H를 포함한다. 본원에 개시된 임의의 구현예의 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL2 뮤테인을 뮤테인을 Treg 세포에 표적화하는 항체와 함께 투여하는 것을 추가로 포함한다. 본원에 개시된 임의의 구현예의 일부 구현예에서, 항체는 뮤테인에 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결된다. 본원에 개시된 임의의 구현예의 일부 구현예에서, 상기 방법은 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 수행된다.
본원에 기재된 양태 및 구현예 각각은 구현예 또는 양태의 문맥에서 명백하게 또는 명확하게 배제되지 않는 한 함께 사용될 수 있다.
상기 요약은 단지 예시적인 것이며, 어떤 식으로든 제한하려는 것은 아니다. 본원에 기재된 예시적인 구현예 및 특징에 더하여, 본 발명의 개시의 추가 양태, 구현예, 목적 및 특징은 도면 및 상세한 설명 및 청구범위로부터 충분히 명백해질 것이다.
도 1은 야생형 IL-2 및 H9 백그라운드를 사용하여 작제된 뮤테인의 아미노산 서열을 도시한다.
도 2는 야생형 IL-2 및 야생형 백그라운드를 사용하여 작제된 뮤테인의 아미노산 서열을 도시한다.
도 3은 IL-2 변이체의 용량 반응을 갖는 포스포-STAT5 신호전달 검정의 결과를 도시한다. 인간 NK-유사 YT 세포는 그래프에 표시된 바와 같이 상이한 농도(1μM 내지 0 μM, 10배 희석)의 마우스 혈청 알부민(MSA)에 융합된 다양한 인간 IL-2 변이체로 15분 동안 자극되었다. Y 축은 각각의 농도에 대해 WT IL-2로부터의 p-STAT5 신호로 표준화된 각각의 IL-2 변이체로부터의 p-STAT5 신호의 비를 제시한다.
도 4a-b는 포스포-STAT5 신호전달 검정에 대한 시간 경과를 도시한다. 도 4a는 표시된 농도의 IL-2 부분 효능제로 15분 동안 자극된 YT 세포에 대한 p-STAT5 신호전달 검정의 결과를 도시한다. Y 축은 각각의 농도에 대해 WT IL-2로부터의 p-STAT5 신호로 표준화된 각각의 IL-2 변이체로부터의 p-STAT5 신호의 비를 제시한다. 도 4a는 그래프에 표시된 바와 같이 YT 세포가 1μM의 상이한 IL-2 변이체로 다양한 시점에서 자극되었음을 도시한다. Y 축은 p-STAT5 신호에 대한 중간 형광 강도(MFI)를 나타낸다.
도 5a는 마우스에서 IL2 효능제를 투여하기 위한 실험 프로토콜을 도시한다. 도 5b, 도 5c 및 도 5d는 PBS 처리된 마우스에서 각각의 빈도로 표준화된 각각의 조건에 대한 표시된 면역 세포 서브셋의 빈도를 도시한다. B 세포는 CD3-CD19+에 대해 게이팅된 세포에 의해 정의되었다. NK 세포는 CD3-NK1.1+에 대해 게이팅되었다. Ly6g (Gr1)+CD3+CD11b+에 대해 게이팅된 세포는 과립구로 정의되었다.
도 6a-b는 IL-2 변이체의 용량 반응을 갖는 포스포-STAT5 신호전달 검정의 결과를 도시한다. 도 6a는 인간 NK-유사 YT 세포를 도시하는 반면, 도 6b는 그래프에 표시된 바와 같이 상이한 농도(5 μM 내지 0 μM)의 마우스 혈청 알부민(MSA)에 융합된 다양한 인간 IL-2 변이체로 15분 동안 자극된 마우스 고갈 T 세포 블라스트(B)를 도시한다. Y 축은 각각의 농도에 대해 WT IL-2로부터의 p-STAT5 신호로 표준화된 각각의 IL-2 변이체로부터의 p-STAT5 신호의 비를 제시한다.
도 7a-e는 B6 흑색종 마우스 모델에서의 IL-2 변이체 투여의 결과를 도시한다. 도 7a는 종양 부피의 변화를 도시한다. 도 7b, 도 7c, 도 7d 및 도 7e는 WT 마우스에서 각각의 빈도로 표준화된 각각의 조건에 대한 표시된 면역 세포 서브셋의 빈도를 도시한다.
도 8a-8g는 몇몇 예시적인 IL-2R 부분 효능제가 생체 내에서 세포 유형 특이적 반응을 유도할 수 있음을 입증하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 그래프로 요약한다.
도 9a-9c는 IL-2R 부분 효능제 REH가 FoxP3+ 조절성 T 세포의 빈도를 증가시키는 것을 예시하기 위해 수행된 실험 결과를 그래프로 요약한다.
도 10은 IL-2R 부분 효능제 REH로 처리된 마우스로부터의 Treg가 CD4+ 통상적 T 세포의 증식을 억제하는 것을 입증하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과의 그래프 요약이다.
도 11은 IL-2R 부분 효능제 REH가 CD8+ T 세포 증식을 지원하나 IFNγ 생성은 지원하지 않는 것을 예시하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과의 그래프 요약이다.
도 12는 IL-2R 부분 효능제 REH의 전처리 및 공동 처리가 설치류 EAE 모델(뇌 염증의 동물 모델)에서 다양한 자가면역 증상을 보호한다는 것을 입증하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과의 그래프 요약이다. 질병 스코어는 다음과 같았다: 0- 건강함; 1- 파행 꼬리(limp tail); 2- 부분적인 뒷다리 마비; 3- 완전한 뒷다리 마비; 4- 전신 마비; 5-사망.
본 발명의 개시는 일반적으로 인터루킨 2(IL-2)에 의해 매개되는 신호 전달 경로를 조절하는 것을 필요로 하는 대상체에서 인터루킨 2(IL-2)에 의해 매개되는 신호 전달 경로를 조절하기 위한 조성물 및 방법을 포함하는 면역학 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 IL-2 수용체, 예를 들어, 인터루킨 2 알파 수용체(IL-2Rα), 인터루킨 2 베타 수용체(IL-2Rβ), 인터루킨-2 감마 수용체(IL-2Rγ) 중 적어도 하나에 대한 조절된 친화성을 가져 각각의 IL-2Rα, IL-2Rβ 및/또는 IL-2Rγ 수용체를 통해 매개되는 다운스트림 신호 전달을 완전히 또는 부분적으로 길항시키는 신규한 IL-2 뮤테인을 제공한다. 본 발명의 개시의 일부 구현예는 바람직하지 않은 불리한 자가면역 사건, 예를 들어, 염증을 담당하는 면역 세포의 활성화를 촉진하지 않는 IL-2 부분 효능제를 제공한다. 본 발명의 개시의 일부 구현예는 상기 IL-2 뮤테인을 생성하는 데 유용한 조성물 및 방법뿐만 아니라 IL-2 신호전달 경로에 의해 매개되는 신호 전달의 교란과 관련된 건강 상태 및 장애의 치료를 위한 방법에 관한 것이다.
IL-2는 면역계에 대해 광범위한 영향을 발휘하며, 이는 면역 활성화 및 항상성 둘 모두를 조절하는 데 중요한 역할을 한다. 면역계 자극제로서, IL-2는 암 및 만성 바이러스 감염의 치료에 사용되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, IL-2의 자극 효과는 혼란을 또한 유발하고, 자가면역 및 이식 거부를 매개할 수 있다. 면역 조절 및 질병에서의 이의 도구적 역할 때문에, IL-2 부분 효능제와 같은 새로운 IL-2 분자의 확인은 활발한 연구 분야로 남아 있다.
대부분의 상황에서, IL-2는 3개의 상이한 수용체 IL-2Rα, IL-2Rβ 및 IL-2Rγ를 통해 작용한다. 휴지 T 세포와 같은 대부분의 세포는 IL-2에 대해 반응성이 아닌데, 이는 이들이 IL-2에 대한 낮은 친화성을 갖는 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ만 발현하기 때문이다. 자극시, 휴지 T 세포는 상대적으로 높은 친화성의 IL-2Rα를 발현한다. IL-2Rα에 대한 IL-2의 결합은 이러한 수용체가 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ에 순차적으로 결합하여 T 세포 활성화를 발생시키도록 한다.
본원에 기재된 개시는 특히 IL-2가 이의 인지체 수용체, 특히 IL-2Rγ와 상호작용하는 방법에 대한 새로운 통찰에 기초한 신규한 IL-2 조성물을 제공한다. 본 발명자는 놀랍게도 IL-2Rγ에 대한 IL-2 결합 부위에서의 돌연변이가 조절성 T 세포(Treg)를 활성화시킬 수 있는 부분 효능제를 발생시키는 것을 발견하였다. 또한, 이들 IL-2 부분 효능제는 CD8+ T 세포 및 다른 잠재적 염증성 면역 세포 서브셋을 활성화시키지 않으며, 염증 세포가 인터페론-감마(IFNγ)를 분비하도록 유도하지 않는다. 이와 같이, 이들 분자는 자가면역 장애 및 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.
I. 일반 기술
본 발명의 개시의 실시는 달리 지시되지 않는 한 당업자에게 널리 공지된 분자생물학, 미생물학, 세포생물학, 생화학, 핵산 화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 상기 기술은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, fourth edition (Sambrook et al., 2012) 및 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001)(본원에서 "Sambrook"으로 공동으로 언급됨); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, 2014년까지의 부록을 포함함); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000, (2014년까지의 부록을 포함함), Gene Transfer and. Expression in Mammalian Cells (Makrides, ed., Elsevier Sciences B.V., Amsterdam, 2003), 및 Current Protocols in Immunology (Horgan K and S. Shaw (1994) (2014년까지의 부록을 포함함)]과 같은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 적절한 경우, 상업적으로 이용 가능한 키트 및 시약의 사용과 관련된 절차는 일반적으로 달리 명시되지 않는 한 제조업체 정의 프로토콜 및/또는 프라미터에 따라 수행된다.
II. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 과학 용어 또는 전문용어는 본 발명의 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖도록 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 준비된 참조를 위해 본원에서 정의되며, 본원에서의 상기 정의의 포함은 본 기술 분야에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적으로 차이가 있는 것으로 반드시 해석되는 것은 아니다. 본원에 기재되거나 참조된 많은 기술 및 절차는 당업자에 의해 통상적인 방법론을 이용하여 잘 이해되고 일반적으로 이용된다.
단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 이의 혼합물을 포함하는 하나 이상의 세포를 포함한다. "A 및/또는 B"는 "A", "B", "A 또는 B" 및 "A 및 B"의 모든 대안을 포함하는 것으로 본원에서 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 대략의 이의 통상적인 의미를 갖는다. 근사치의 정도가 문맥으로부터 달리 명확하지 않은 경우, "약"은 제공된 값의 플러스 또는 마이너스 10% 이내, 또는 제공된 값을 포함한 모든 경우에 가장 가까운 유효 숫자로 반올림된 것을 의미한다. 범위가 제공되는 경우, 이들은 경계 값을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "IL-2"는 고유하거나 재조합이건 간에 야생형 IL-2를 의미한다. 이와 같이, IL-2 폴리펩티드는 재조합 생성된 IL-2 폴리펩티드, 합성 생성된 IL-2 폴리펩티드, 세포 또는 조직으로부터 추출된 IL-2를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 IL-2 폴리펩티드를 나타낸다. 성숙 인간 IL-2는 문헌[Fujita, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7437-7441 (1983)]에 기재된 바와 같이 133개의 아미노산 서열(더 적은 신호 펩티드, 추가 20개의 N-말단 아미노산으로 구성됨)로 발생한다. 인간 IL-2의 아미노산 서열(SEQ ID NO:17)은 접근 로케이터 NP_000577.2로 Genbank에서 발견된다. 성숙 인간 IL-2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1에 도시되어 있다. 뮤린(무스 무스쿨루스(Mus musculus)) IL-2 아미노산 서열은 접근 로케이터(SEQ ID NO:18) 하에 Genbank에서 발견된다. 성숙 뮤린 IL-2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:19에 도시되어 있다.
본원에서 사용되는 "IL-2 뮤테인"은 인터루킨-2 단백질에 대한 특정 치환이 이루어진 IL-2 폴리펩티드를 의미한다. IL-2 뮤테인은 고유 IL-2 폴리펩티드 사슬 내의 하나 이상의 부위 또는 고유 IL-2 폴리펩티드 사슬의 다른 잔기에서 아미노산 삽입, 결실, 치환 및 변형을 특징으로 한다. 본 발명의 개시에 따르면, 임의의 상기 삽입, 결실, 치환 및 변형은 IL-2R 결합 활성을 보유하는 IL-2 뮤테인을 발생시킨다. 예를 들어, 본원에 개시된 뮤테인은 IL-2Rα 및/또는 IL-2Rβ에 대한 높거나 낮은 친화성을 가질 수 있거나, 야생형 IL-2의 것과 동일하거나 유사한 이들 수용체에 대한 친화성을 가질 수 있다. 예시적 뮤테인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 뮤테인은 또한 IL-2의 다른 위치(즉, 뮤테인의 2차 또는 3차 구조에 최소의 영향을 미치는 것)에 보존적 변형 및 치환을 포함할 수 있다. 상기 보존적 치환은 문헌[Dayhoff in The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978)] 및 문헌[Argos in EMBO J, 8:779-785 (1989)]에 의해 기재된 것을 포함한다. 예를 들어, 다음 그룹 중 하나에 속하는 아미노산은 보존적 변화를 나타낸다: 그룹 I: Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr; 그룹 II: Cys, Ser, Tyr, Thr; 그룹 III: Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; 그룹 IV: Lys, Arg, His; 그룹 V: Phe, Tyr, Trp, His; 및 그룹 VI: Asp, Glu.
어구 "~에 따라 넘버링된"은 제공된 아미노산 서열, 예를 들어, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에서 아미노산이 정상적으로 발생하는 위치를 참조하여 선택된 아미노산을 확인하는 것을 의미한다. 예를 들어, R81은 SEQ ID NO:1에서 발생하는 81번째 아미노산 아르기닌을 나타낸다.
폴리펩티드 또는 DNA 서열과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "동일성"은 2개의 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 나타낸다. 둘 모두의 분자에서 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛(즉, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드)에 의해 점유되는 경우, 분자는 상기 위치에서 동일하다. 2개의 아미노산 또는 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성은 동일한 위치의 수의 직접 함수(direct function)이다. 일반적으로, 서열은 가장 높은 차수의 일치가 획득되도록 정렬된다. 필요한 경우, 동일성은 GCS 프로그램 패키지(Devereux et al., Nucleic Acids Res. 12:387, 1984), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul et al., J. Molecular Biol. 215:403, 1990)와 같은 공개된 기술 및 널리 이용 가능한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 계산될 수 있다. 서열 동일성은 위스콘신 대학 생명공학 센터(1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705)의 유전학 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 서열 분석 소프트웨어 패키지와 같은 서열 분석 소프트웨어를 이의 디폴트 파라미터와 함께 사용하여 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 아미노산 잔기의 중합체를 나타내며, 생성물의 최소 길이에 제한되지 않는다. 따라서, 폴리펩티드, 펩티드, 폴리펩티드의 단편, 융합 폴리펩티드, 올리고펩티드 등이 상기 정의 내에 포함된다. 전장 단백질 및 이의 단편 둘 모두가 상기 정의에 포함된다. 상기 용어는 또한 폴리펩티드의 발현 후 변형, 예를 들어, 당화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 개시의 목적상, "폴리펩티드"는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한 고유 서열에 대한 변형, 예를 들어, 결실, 첨가 및 치환(일반적으로, 본질적으로 보존성)을 포함하는 단백질을 나타낸다. 이들 변형은 부위-특이적 돌연변이유발을 통하는 것과 같이 계획적일 수 있거나, 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류를 통하는 것과 같이 우연적일 수 있다. 따라서, 용어 "IL-2 폴리펩티드"는 구현예 또는 양태와 관련하여 명백하거나 명확하게 배제되지 않는 한 고유 IL-2 서열뿐만 아니라 IL-2 유사체, IL-2 뮤테인 및 단편을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "잠재적 염증성 T 세포" 또는 "염증성 면역 세포 서브셋"은 인터페론 감마를 생성하거나, 분비하거나, 인터페론 감마를 생성하거나 분비할 수 있는 하나 이상의 T 세포를 나타낸다. 일부 구현예에서, 잠재적 염증성 T 세포는 이의 세포 표면 상에서 CD44를 발현하고, 인터페론 감마를 생성하거나 분비한다. 다른 구현예에서, 잠재적 염증성 T 세포는 이의 세포 표면 상에서 CD44 및 CD4를 발현하고, 인터페론 감마를 생성하거나 분비한다. 추가 구현예에서, 잠재적 염증성 T 세포는 이의 세포 표면 상에서 CD44 및 CD8을 발현하고, 인터페론 감마를 생성하거나 분비한다. 또 다른 구현예에서, 잠재적 염증성 T 세포는 이의 세포 표면 상에서 CD4 및 CD8을 발현하고, 인터페론 감마를 생성하거나 분비한다.
본원에서 사용되는 "조절성 T 세포" 또는 "Treg 세포"는 일반적으로 다른 T 세포(들) 및/또는 다른 면역 세포의 활성을 억제함으로써 이들의 활성을 조절하는 T 세포(T 림프구)를 나타낸다. 일부 구현예에서, Treg 세포는 CD4+ 및 FoxP3+ 세포이다(그러나, Treg 세포는 이러한 표현형으로 완전히 제한되지 않음이 당업자에 의해 인지될 것이다).
본원에서 언급되는 "Emax"는 가장 높은 농도에서 측정된 IL-2 뮤테인에 의해 생성될 수 있는 최대 p-STAT5 신호이다. WT IL-2로부터의 Emax는 가장 높은 농도에서 WT IL-2로부터의 p-STAT5 신호로 표준화된 IL-2 뮤테인으로부터의 p-STAT5 신호의 비를 계산하기 위한 참조로서 사용된다.
"효능제"는 표적과 상호작용하여 표적의 활성화의 증가를 야기시키거나 촉진시키는 화합물이다.
"부분 효능제"는 효능제와 동일한 표적과 상호작용하지만, 부분 효능제의 투여량을 증가시켜도 효능제만큼 큰 생화학적 및/또는 생리학적 효과의 크기를 발생시키지 않는 화합물이다.
"초효능제(super agonist)"는 표적 수용체에 대한 내인성 효능제보다 큰 최대 반응을 생성할 수 있고, 따라서 100% 초과의 효능을 갖는 효능제 유형이다.
"길항제"는, 예를 들어, 효능제의 활성을 방지하거나, 감소시키거나, 억제하거나, 중화시킴으로써 효능제의 작용에 반대하는 화합물이다. "길항제"는 또한 확인된 효능제가 없는 경우에도 표적, 예를 들어, 표적 수용체의 항시적 활성을 방지하거나, 억제하거나, 감소시킬 수 있다.
"작동 가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오티드 서열(즉, IL-2 뮤테인을 인코딩하는 서열)이 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 방식으로(예를 들어, 시험관 내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주 세포로 도입되는 경우 숙주 세포에서) 조절 서열(들)에 연결됨을 의미하고자 하는 것이다. "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소(예를 들어, 아데닐중합체형성 신호)를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Goeddel (1990) in Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol. 185 (Academic Press, San Diego, Calif)]을 참조한다. 조절 서열은 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 항시적 발현을 유도하는 조절 서열 및 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도하는 조절 서열(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)를 포함한다. 발현 벡터의 디자인은 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 요인에 좌우될 수 있음이 당업자에 의해 인식될 것이다. 본 발명의 개시의 발현 작제물은 숙주 세포 내로 도입되어 본원에 개시된 인간 IL-2 뮤테인을 생성하거나 이의 생물학적 활성 변이체를 생성할 수 있다.
용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 상기 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 나타내는 것으로 이해된다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 특정 변형이 후속 세대에서 발생할 수 있으므로, 상기 자손은 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용되는 용어의 범위 내에 여전히 포함된다.
용어 "벡터"는 또 다른 핵산 분자를 전달 또는 수송할 수 있는 핵산 분자 또는 서열을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 전달되는 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결, 예를 들어, 삽입된다. 벡터는 세포에서 자율 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나, 숙주 세포 DNA로의 통합을 가능하게 하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 유용한 벡터는, 예를 들어, 플라스미드(예를 들어, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 및 바이러스 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는, 예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다. 일 양태에서, 벡터는 유전자 전달 벡터이다. 일 양태에서, 벡터는 유전자를 세포 내로 전달하기 위한 유전자 전달 비히클로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 리포펙션, 입자 건 또는 전기천공을 포함하는 숙주 세포 내로 외래 핵산(예를 들어, DNA)을 도입하기 위한 다양한 당 분야에 인정된 기술을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "대상체" 또는 "개체" 또는 "환자"는 동물, 예를 들어, 인간(예를 들어, 인간 대상체) 및 비-인간 동물을 포함한다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 및 비-포유동물, 예를 들어, 비-인간 영장류, 예를 들어, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 약학적 투여와 양립되는 염수, 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 보충 활성 화합물(예를 들어, 항생제)이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
본원에 기재된 본 발명의 개시의 양태 및 구현예는 양태 및 구현예를 "포함하고", 양태 및 구현예로 "구성되고", 양태 및 구현예를 "필수적으로 포함하는"을 포함하는 것이 이해된다.
당업자에 의해 이해될 바와 같이, 서면 설명을 제공하는 관점에서와 같이 임의의 및 모든 목적상, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 임의의 및 모든 가능한 하위 범위 및 이의 하위 범위의 조합을 포함한다. 임의의 나열된 범위는 동일한 범위가 적어도 동일한 반쪽, 1/3, 1/4, 1/5, 1/10 등으로 나뉘어 지도록 충분히 설명되고 이를 가능하게 하는 것으로 용이하게 인지될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에 논의된 각각의 범위는 하위 1/3, 중간 1/3 및 상위 1/3 등으로 용이하게 나뉠 수 있다. 당업자에 의해 또한 이해될 바와 같이, "최대", "적어도", "~ 초과", "~ 미만" 등과 같은 모든 용어는 언급된 수를 포함하고, 상기 논의된 바와 같이 하위 범위로 이후에 나뉠 수 있는 범위를 나타낸다. 최종적으로, 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1-3개의 품목을 갖는 그룹은 1, 2 또는 3개의 품목을 갖는 그룹을 나타낸다. 유사하게, 1-5개의 품목을 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 품목을 갖는 그룹을 나타내고, 기타 등등이다.
예를 들어, (a), (b), (i) 등의 표제는 단지 명세서 및 청구항을 쉽게 읽을 수 있도록 제시된다. 명세서 또는 청구항에서 표제의 사용은 단계 또는 요소가 알파벳 또는 숫자 순서로 또는 이들이 제시되는 순서로 수행되는 것을 요구하지 않는다.
III. 본 발명의 개시의 조성물
본 발명의 개시의 일부 양태는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 IL-2 수용체(예를 들어, IL-2Rα, IL-2Rβ 및/또는 IL-2Rγ)에 대한 조절된 친화성, 예를 들어, 증가되거나 감소된 결합 친화성을 갖는 신규한 IL-2 뮤테인에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 IL-2Rα, IL-2Rβ 및/또는 IL-2Rγ에 대한 감소된 결합 친화성을 부여하는 하나 이상의 분자 변경이 있는 IL-2 뮤테인에 관한 것이다. 다르게 말하면, 본원에 개시된 신규한 IL-2 뮤테인 중 일부는 IL-2 매개 신호전달 경로의 부분 효능제이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-2 부분 효능제는 바람직하지 않은 불리한 자가면역 사건, 예를 들어, 염증을 담당하는 면역 세포의 활성화를 촉진하지 않는다.
A. IL-2 부분 효능제
일 양태에서, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 부분 효능제인 IL-2 뮤테인을 제공한다. 일부 구현예에서, 야생형 IL-2(예를 들어, 인간 IL-2, SEQ ID NO:2)와 비교하여 IL-2Rγc 수용체에 대한 IL-2 뮤테인의 결합 친화성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 IL-2 뮤테인이 본원에 제공된다. 본원에서 사용되는 용어 "공통 감마 사슬", "γc", "IL-2Rγc", "Yc", "IL-2Rγ", "IL-2 수용체 서브유닛 감마" 및 "IL-2RG"(Genbank 접근 번호: NM_000206 및 NP_000197(인간) 및 NM_013563 및 NP_038591(마우스))는 모두 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21 수용체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 적어도 6개의 상이한 인터루킨 수용체에 대한 수용체 복합체에 대한 사이토카인 수용체 서브유닛인 타입 I 사이토카인 수용체 패밀리의 구성원을 나타낸다. IL-2Rγc는 IL-2Rβ와 상호작용하여 주로 기억 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포에서 중간 친화성 IL-2 수용체를 형성하고, IL-2Rα 및 IL-2Rβ와 상호작용하여 활성화된 T 세포 및 Treg에서 고 친화성 IL-2 수용체를 형성한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 IL-2 뮤테인은 인공 재조합 IL-2 뮤테인이며, 예를 들어, IL-2 수용체(예를 들어, IL-2Rα, IL-2Rβ 및/또는 IL-2Rγ)에 대한 조절된 결합 친화성을 갖는 임의의 재조합 IL-2 폴리펩티드, 조작된 IL-2 폴리펩티드 또는 자연 발생 IL-2 폴리펩티드일 수 있다.
예시적인 대상 IL-2 뮤테인은 상응하는 야생형 IL-2(WT IL-2)와 적어도 약 50%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 87%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일하다. 돌연변이는 아미노산 잔기의 수 또는 함량의 변화로 구성될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 IL-2는 상응하는 야생형 IL-2보다 많거나 적은 수의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 예시적인 돌연변이체 폴리펩티드는 야생형 IL-2에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 함유할 수 있다. 다양한 구현예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 단일 아미노산 잔기의 첨가, 결실 또는 치환에 의해 야생형 IL-2와 상이할 수 있다.
비제한적인 예시로서, 참조 아미노산 서열 SEQ ID NO:1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 뮤테인은 SEQ ID NO:2의 참조 아미노산 서열의 최대 5개의 변경을 포함하는 것을 제외하고는 참조 서열과 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 IL-2 뮤테인은 참조 아미노산 서열 SEQ ID NO:1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 이는 참조 아미노산 서열의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변경을 포함하는 것을 제외하고는 참조 서열과 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 예를 들어, 참조 서열에서 아미노산 잔기의 최대 5%가 결실되거나 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있거나, 참조 서열에서 전체 아미노잔 잔기의 최대 5%의 다수의 아미노산이 참조 서열에 삽입될 수 있다. 참조 서열의 이들 변경은 참조 아미노산 서열의 아미노(N-) 또는 카르복시(C-) 말단 위치, 또는 참조 서열 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 연속 그룹 내의 잔기 사이에 개별적으로 산재된 말단 위치 사이의 어느 곳에서도 발생할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%(이들 백분율 사이에 속하는 임의의 값을 포함함) 더 적은 친화성으로 IL-2Rγ에 결합한다. IL-2 뮤테인의 결합 친화성은 야생형 IL-2보다 IL-2γ에 대한 1.2, 1.4, 1.5, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 250배 이상의 더 낮은 친화성으로 표현될 수 있다. IL-2Rγ에 대한 대상 IL-2 뮤테인의 결합 친화성은 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. IL-2Rγ 결합을 측정하기 위한 적합한 방법은 방사성 리간드 결합 검정(예를 들어, 포화 결합, 스캐챠드 플롯, 비선형 곡선 적합화 프로그램 및 경쟁 결합 검정); 비-방사성 리간드 결합 검정(예를 들어, 형광 편광(FP), 형광 공명 에너지 전달(FRET) 및 표면 플라즈몬 공명 검정(예를 들어, 문헌[Drescher et al., Methods Mol Biol 493:323-343 (2009)] 참조); 액체상 리간드 결합 검정(예를 들어, 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR), 및 면역침전); 및 고체상 리간드 결합 검정(예를 들어, 다중-웰 플레이트 검정, 온-비드 리간드 결합 검정, 온-컬럼 리간드 결합 검정, 및 필터 검정)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, IL-2Rγ 수용체 결합 부위에서 돌연변이를 통해 작제된 부분 효능제가 IL-2의 야생형 또는 다른 변이체에 비해 용량 의존성이 적을 것으로 생각된다.
일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 IL-2Rβ와 IL-2Rγ의 회합을 파괴하여, 이러한 IL-2Rβ/IL-2Rγ 상호작용은 야생형 IL-2에 비해 약 2%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 50%, 약 75%, 약 90%, 약 95% 이상(이들 백분율 사이에 속하는 임의의 값을 포함함)만큼 감소된다.
일부 구현예에서, IL-2Rγ 수용체에 대한 IL-2 뮤테인의 결합 친화성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이는 아미노산 치환이다. 일부 구현예에서, 대상 IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2(SEQ ID NO:1)와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 치환으로 구성된다. 치환된 아미노산 잔기(들)는 전형적으로 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신의 그룹 내의 치환을 포함하는 보존적 치환일 수 있으나, 반드시 그러한 것은 아니다. 특정 구현예에서, 치환은 IL-2Rγ 결합 계면과 접촉하는 IL-2의 아미노산 잔기에 존재한다.
일부 구현예에서, 아미노산 치환은 야생형 hIL-2(예를 들어, SEQ ID NO:1)에 따라 넘버링된 위치 18, 22 및 126으로부터 선택된 야생형 IL-2의 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환이다. 일부 구현예에서, IL-2Rγ 수용체 결합 친화성을 감소시키는 아미노산 치환은 아미노산 치환 Leu-to-Arg(L18R), Gln-to-Glu(Q22E), 및/또는 Gln-to-His(Q126H), Gln-to-Met(Q126M) 또는 Gln-to-Lys(Q126K) 중 하나 또는 이들의 조합을 포함한다.
추가 구현예에서, IL-2Rγ 수용체 결합 친화성을 감소시키는 아미노산 치환은 L18R 및 Q22E 및 Q126A, Q126C, Q126D, Q126E, Q126G, Q126H, Q126I, Q126K, Q126M, Q126R, Q126S 또는 Q126T 중 임의의 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, IL-2 뮤테인은 야생형 hIL-2(예를 들어, SEQ ID NO:1)에 따라 넘버링된 위치 80, 81, 85, 86 및 192로부터 선택된 야생형 IL-2의 하나 이상의 아미노산 위치에서 추가의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, IL-2 뮤테인은 L80F, R81D, L85V, I86V 및/또는 I92F 중 하나 이상으로부터 선택되는 추가의 아미노산 치환을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 IL-2Rβ 수용체에 대한 증가된 결합 친화성을 추가로 가질 수 있고, IL-2Rβ 결합 친화성을 증가시키는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "IL-2Rβ" 및 "CD122"(Genbank 접근 번호 NM_000878 및 NP_000869(인간)) 둘 모두는 IL-2Rγ와 상호작용하여 주로 기억 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포 상에 중간 친화성 IL-2 수용체를 형성하고, IL-2Rα 및 IL-2Rγ와 상호작용하여 활성화된 T 세포 및 조절제 T 세포(Treg) 상에 고 친화성 IL-2 수용체를 형성하는 타입 I 사이토카인 수용체 패밀리의 구성원을 나타낸다. 일부 구현예에서, 대상 IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2(예를 들어, SEQ ID NO:1)에 비해 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 아미노산 잔기의 결실, 첨가 또는 치환)를 포함하며, 야생형 IL-2보다 높은 친화성으로 IL-2Rβ에 결합한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%(이들 백분율 사이에 속하는 임의의 값을 포함함) 더 큰 친화성으로 IL-2Rβ에 결합한다. IL-2 뮤테인의 결합 친화성은 또한 야생형 IL-2보다 IL-2Rβ에 대해 1.2, 1.4, 1.5, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 250배 이상 더 큰 친화성으로 표현될 수 있다. IL-2Rβ에 대한 대상 IL-2 뮤테인의 결합은 상기 기재된 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, IL-2Rβ 결합 친화성을 증가시키는 적어도 하나의 돌연변이는 아미노산 치환이다. 일부 구현예에서, IL-2Rβ 결합 친화성을 증가시키는 아미노산 치환은 야생형 hIL-2(SEQ ID NO:1)에 따라 넘버링된 아미노산 위치 I24, P65, Q74, L80, R81, L85, I86, I89, I92 및/또는 V93에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 치환은 I24V, P65H, Q74R, Q74H, Q74N, Q74S, L80F, L80V, R81I, R81T, R81D, L85V, I86V, I89V, I92F 및/또는 V93I 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 치환은 Q74N, Q74H, Q74S, L80F, L80V, R81D, R81T, L85V, I86V, I89V 및/또는 I93V 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 IL-2Rβ 수용체에 대한 감소된 결합 친화성을 추가로 가질 수 있고, IL-2Rβ 결합 친화성을 감소시키는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상 IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2(예를 들어, SEQ ID NO:1)에 비해 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 아미노산 잔기의 결실, 첨가 또는 치환)를 포함하며, 야생형 IL-2에 비해 감소된 친화성으로 IL-2Rβ에 결합한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%(이들 백분율 사이에 속하는 임의의 값을 포함함) 더 적은 친화성으로 IL-2Rβ에 결합한다. IL-2 뮤테인의 결합 친화성은 또한 야생형 IL-2보다 IL-2Rβ에 대해 1.2, 1.4, 1.5, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 250배 이상 더 적은 친화성으로 표현될 수 있다.
추가 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2(예를 들어, SEQ ID NO:1)와 유사하거나(예를 들어, 1 퍼센트 미만으로 변함) 동일한 친화성으로 IL-2Rβ 수용체에 결합할 수 있다.
추가 구현예에서, IL-2 뮤테인은 IL-2Rα 수용체에 대한 증가된 결합 친화성을 추가로 가질 수 있고, IL-2Rα 결합 친화성을 증가시키는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "IL-2Rα" 및 "CD25"(Genbank 접근 번호 NM_000417 및 NP_000408(인간)) 둘 모두는 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ와 상호작용하여 활성화된 T 세포 및 조절제 T 세포(Treg) 상에 고 친화성 IL-2 수용체를 형성하는 타입 I 사이토카인 수용체 패밀리의 구성원을 나타낸다. 일부 구현예에서, 대상 IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2(예를 들어, SEQ ID NO:1)에 비해 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 아미노산 잔기의 결실, 첨가 또는 치환)를 포함하며, 야생형 IL-2보다 높은 친화성으로 IL-2Rα에 결합한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%(이들 백분율 사이에 속하는 임의의 값을 포함함) 더 큰 친화성으로 IL-2Rα에 결합한다. IL-2 뮤테인의 결합 친화성은 또한 야생형 IL-2보다 IL-2Rβ에 대해 1.2, 1.4, 1.5, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 250배 이상 더 큰 친화성으로 표현될 수 있다. IL-2Rα에 대한 대상 IL-2 뮤테인의 결합은 상기 기재된 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, IL-2Rβ 결합 친화성을 증가시키는 적어도 하나의 돌연변이는 아미노산 치환이다.
또 다른 구현예에서, IL-2 뮤테인은 IL-2Rα 수용체에 대한 감소된 결합 친화성을 추가로 가질 수 있고, IL-2Rα 결합 친화성을 감소시키는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상 IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2(예를 들어, SEQ ID NO:1)에 비해 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 아미노산 잔기의 결실, 첨가 또는 치환)를 포함하며, 야생형 IL-2보다 적은 친화성으로 IL-2Rα에 결합한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%(이들 백분율 사이에 속하는 임의의 값을 포함함) 더 적은 친화성으로 IL-2Rα에 결합한다. IL-2 뮤테인의 결합 친화성은 또한 야생형 IL-2보다 IL-2Rα에 대해 1.2, 1.4, 1.5, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 250배 이상 더 적은 친화성으로 표현될 수 있다.
추가 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2(예를 들어, SEQ ID NO:1)와 유사하거나(예를 들어, 1 퍼센트 미만으로 변함) 동일한 친화성으로 IL-2Rα 수용체에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 아미노산 치환 L80F, R81D, L85V, I86V, I92F, L18R, Q22E 및 Q126H를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
APTSSSTKKTQLQLEHL R LDL E MILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFH FD PRD VV SNINV F VLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFC H SIISTLT (SEQ ID NO: 8)
다른 구현예에서, IL-2 뮤테인은 아미노산 치환 L80F, R81D, L85V, I86V, I92F, L18R, Q22E 및 Q126K를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
APTSSSTKKTQLQLEHL R LDL E MILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFH FD PRD VV SNINV F VLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFC K SIISTLT (SEQ ID NO: 10)
추가 구현예에서, IL-2 뮤테인은 아미노산 치환 L80F, R81D, L85V, I86V, I92F, L18R, Q22E 및 Q126M을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
APTSSSTKKTQLQLEHL R LDL E MILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFH FD PRD VV SNINV F VLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFC M SIISTLT (SEQ ID NO: 11).
또 다른 구현예에서, IL-2 뮤테인은 아미노산 치환 L18R, Q22E 및 Q126H를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
APTSSSTKKTQLQLEHL R LDL E MILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFC H SIISTLT (SEQ ID NO: 15)
또 다른 구현예에서, IL-2 뮤테인은 아미노산 치환 L18R, Q22E 및 Q126M을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
APTSSSTKKTQLQLEHL R LDL E MILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFC M SIISTLT (SEQ ID NO: 16).
다양한 구현예에서, 대상 IL-2 뮤테인은 하기 식에 따른 아미노산 서열을 갖는다:
A-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-(X1)n-L-D-L-(X2)n-M-I-L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-R-M-L-T-F-K-F-Y-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-E-E-L-K-P-L-E-E-V-L-N-L-A-Q-S-K-N-F-H-(X3)n-(X4)n-P-R-D-(X5)n-(X6)n-S-N-I-N-V-(X7)n-V-L-E-L-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-RW-I-T-F-C-(X13)n-S-I-I-S-T-L-T, 여기서,
각각의 n은 개별적으로 0 또는 1로부터 선택되고;
X1은 L(야생형) 또는 R이고;
X2는 Q(야생형) 또는 E이고;
X3는 L(야생형), F 또는 V이고;
X4는 R(야생형), I, T 또는 D이고;
X5는 L(야생형) 또는 V이고;
X6는 I(야생형) 또는 V이고;
X7은 I(야생형) 또는 F이고;
X13은 Q(야생형) 또는 H, M, K, C, D, E, G, I, R, S, 또는 T(SEQ ID NO:20)이다.
SEQ ID NO:20에 따른 IL-2 뮤테인의 일부 구현예에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10, X11, X12 또는 X13 중 적어도 하나의 아미노산은 야생형 아미노산이 아니다. 일부 구현예에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10, X11, X12 또는 X13 중 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개 또는 14개의 아미노산은 야생형 아미노산이 아니다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 SEQ ID NO:20의 IL-2 뮤테인과 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 부분 효능제인 대상 IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2와 비교하여 하나 이상의 감소된 기능, 예를 들어, (i) 감소된 Emax, (ii) IL-2Rβ/IL-2Rγ 이종이량체화에 의존하는 신호전달 경로를 자극하는 감소된 능력, (iii) 잠재적 염증성 면역 세포로부터 인터페론-감마(IFNγ)의 감소된 생성 및/또는 분비, (iv) 잠재적 염증성 T 세포의 감소된 증식을 갖는다.
일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 IL-2Rβ/IL-2Rγ 이종이량체화에 의존하는 하나 이상의 신호전달 경로를 자극하는 감소된 능력을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상 IL-2 뮤테인은 야생형 hIL-2(예를 들어, 실시예 1 및 도 4a-4b 참조)와 비교하여 T 세포에서 STAT5 인산화를 자극하는 감소된 능력을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2가 동일 세포에서 STAT5 인산화를 자극하는 수준의 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%(이들 백분율 사이의 값을 포함함)인 수준으로 T 세포에서 STAT5 인산화를 자극한다. 일부 구현예에서, T 세포는 자연 살해(NK) 세포이다. STAT5 신호전달은, 예를 들어, 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 STAT5의 인산화에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, STAT5 인산화는 흐름세포측정법 분석과 함께 상기 분자의 인산화된 형태에 특이적인 항체를 사용하여 측정될 수 있다.
추가 구현예에서, 본원에 개시된 IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2의 Emax와 비교하여 감소된 Emax를 갖는다. 일부 구현예에서, 뮤테인은 야생형 IL-2(예를 들어, SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드)에 비해 약 15-95% 중 임의의 것, 예를 들어, 약 20-95%, 약 30-95%, 약 40-95%, 약 50-95%, 약 60-95%, 약 70-95%, 약 80-95%, 또는 약 90-95%의 Emax를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2의 Emax와 비교하여 15-95%의 Emax를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2의 Emax와 비교하여 70-95%의 Emax를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2(예를 들어, SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드)에 비해 약 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95%의 Emax 중 임의의 것을 갖는다. 일 비제한적인 구현예에서, Emax는 야생형 IL-2에 의해 생성된 최대 p-STAT5 신호에 비한 IL-2 뮤테인에 의해 면역 세포에서 유도된 STAT5 인산화(pSTAT5)의 최대 수준의 비에 기초하여 계산된다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2(예를 들어, SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드)에 의해 유도된 IFNγ 생성 및/또는 분비의 양에 비해 잠재적 염증성 면역 세포로부터의 더 적은 인터페론-감마(IFNγ) 생성 및/또는 분비를 발생시킬 수 있다(예를 들어, 실시예 2 및 도 5a-5d 참조). IFNγ 생성 및/또는 분비의 감소는 동등한 농도 및 유사한 조건하에서 잠재적 염증성 면역 세포에서 야생형 IL-2가 자극하는 수준의 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%(이들 백분율 사이의 값을 포함함)인 수준일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-2 뮤테인은 잠재적 염증성 면역 세포로부터 IFNγ 분비를 유도하지 않는다. 비제한적인 구현예에서, 잠재적 염증성 면역 세포는 CD8+ T 세포 및/또는 다른 염증성 면역 세포 서브셋이다. 또 다른 비제한적인 구현예에서, 잠재적 염증성 면역 세포는 CD4+IFNγ+ T 세포 또는 CD8+IFNγ+ T 세포이다.
추가 구현예에서, 본원에 개시된 IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2(예를 들어, SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드)에 의해 유도된 잠재적 염증성 T 세포의 증식에 비해 잠재적 염증성 T 세포의 더 적은 증식을 발생시킬 수 있다. 잠재적 염증성 T 세포의 비제한적인 예시는 CD4+IFNγ+ T 세포 또는 CD8+IFNγ+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 잠재적 염증성 T 세포의 증식에서의 감소는 동등한 농도 및 유사한 조건하에서 야생형 IL-2가 자극하는 수준의 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%(이들 백분율 사이의 값을 포함함) 더 적은 수준일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-2 뮤테인은 잠재적 염증성 면역 세포의 임의의 증식을 유도하지 않는다. 비제한적인 구현예에서, 잠재적 염증성 면역 세포는 CD8+ T 세포 및/또는 다른 염증성 면역 세포 서브셋이다. 또 다른 비제한적인 구현예에서, 잠재적 염증성 면역 세포는 CD4+IFNγ+ T 세포 또는 CD8+IFNγ+ T 세포이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 IL-2 뮤테인은 Treg 세포의 증가된 기능, 예를 들어, 증가된 증식을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2(예를 들어, SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드)에 의해 유도된 Treg 세포의 증식의 양에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배 중 임의의 것만큼 Treg 세포의 증식을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-2 뮤테인은 야생형 IL-2(예를 들어, SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드)에 의해 유도된 Treg 세포의 증식의 양에 비해 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 중 임의의 것만큼 Treg 세포의 증식을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, Treg 세포는 CD4+ Foxp3+ 세포이다.
하기에 더 상세히 기재되는 바와 같이, 본 발명의 개시의 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-2 뮤테인 및 이러한 IL-2 뮤테인을 인코딩하는 핵산은 약학적 조성물을 포함하는 조성물에 혼입될 수 있다. 상기 조성물은 전형적으로 폴리펩티드 또는 핵산 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
B. 핵산
일 양태에서, 본원에 개시된 일부 구현예는 본 발명의 개시의 IL-2 뮤테인을 인코딩하는 핵산 분자, 예를 들어, 이종성 핵산 서열, 예를 들어, 숙주 세포 또는 생체 외 세포 비함유 발현 시스템에서 IL-2 뮤테인의 생체 내 발현을 가능하게 하는 조절제 서열에 작동 가능하게 연결된 이들 핵산 분자를 함유하는 발현 카세트 및 발현 벡터에 관한 것이다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 개시의 실시에 사용되는 폴리펩티드는 합성이거나, 재조합 핵산 분자의 발현에 의해 생성된다. 폴리펩티드가 키메라(예를 들어, 적어도 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 및 이종성 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질)인 경우, 이는 돌연변이체 IL-2의 전부 또는 일부를 인코딩하는 하나의 서열 및 이종성 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 인코딩하는 제2 서열을 함유하는 하이브리드 핵산 분자에 의해 인코딩될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 대상 IL-2 뮤테인은 박테리아 발현된 단백질의 정제를 촉진하기 위한 헥사-히스티딘 태그, 또는 진핵생물 세포에서 발현된 단백질의 정제를 촉진하는 헤마글루티닌 태그에 융합될 수 있다.
용어 "핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, cDNA, 유전체 DNA, 합성 DNA, 및 핵산 유사체를 함유하는 DNA 및 RNA 분자를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 RNA 및 DNA 분자 둘 모두를 나타낸다. 핵산 분자는 이중 가닥 또는 단일 가닥(예를 들어, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥)일 수 있다. 핵산 분자는 통상적이지 않은 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "핵산 서열"은 폴리뉴클레오티드 분자의 서열을 나타낸다. 37 CFR §1.822에 제시된 뉴클레오티드 염기에 대한 명명법이 본원에서 사용된다.
본 발명의 개시의 핵산 분자는 바람직하게는 약 0.5 Kb 내지 약 50 Kb, 또는, 예를 들어, 약 0.5 Kb 내지 약 10 Kb, 약 1 Kb 내지 약 8 Kb, 약 2 Kb 내지 약 7 Kb, 또는 약 2 Kb 내지 약 20 Kb, 예를 들어, 약 2 Kb 내지 10 Kb, 약 3 Kb 내지 약 15 Kb, 약 4 Kb 내지 약 10 Kb, 약 5 Kb 내지 약 15 Kb, 또는 약 3 Kb 내지 약 9 Kb인 핵산 분자를 포함하는 임의의 길이의 핵산 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 분자는 5 Kb 내지 50 Kb, 예를 들어, 약 5 Kb 내지 약 40 Kb, 약 5 Kb 내지 약 30 Kb, 약 5 Kb 내지 약 20 Kb, 또는 약 10 Kb 내지 약 50 Kb, 예를 들어, 약 15 Kb 내지 30 Kb, 약 20 Kb 내지 약 50 Kb, 약 20 Kb 내지 약 40 Kb, 약 5 Kb 내지 약 25 Kb, 또는 약 30 Kb 내지 약 50 Kb일 수 있다.
IL-2 뮤테인을 인코딩하는 DNA 서열을 작제하고, 이들 서열을 적합하게 형질전환된 숙주에서 발현시키기 위한 방법은 PCR-보조 돌연변이유발 기술을 이용하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. IL-2 폴리펩티드에 대한 아미노산 잔기의 결실 또는 첨가로 구성된 돌연변이는 또한 표준 재조합 기술로 이루어질 수 있다. 결실 또는 첨가의 경우, IL-2를 인코딩하는 핵산 분자는 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 선택적으로 소화된다. 생성된 단편은 직접 발현되거나, 예를 들어, 이를 제2 단편에 라이게이션시킴으로써 추가로 조작될 수 있다. 라이게이션은 핵산 분자의 2개의 말단이 서로 중첩되는 상보적 뉴클레오티드를 함유하는 경우에 촉진될 수 있지만, 블런트 말단 단편이 또한 라이게이션될 수 있다. PCR 생성 핵산은 또한 다양한 돌연변이체 서열을 생성하는 데 사용될 수 있다.
완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역된 유전자를 작제할 수 있다. IL-2 뮤테인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머가 합성될 수 있다. 예를 들어, 원하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 몇몇 작은 올리고뉴클레오티드가 합성된 후 라이게이션될 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보적 조립을 위해 5' 또는 3' 오버행을 함유한다.
재조합 분자생물학 기술에 의해 변경된 핵산 분자의 발현을 통해 돌연변이체 폴리펩티드를 생성하는 것에 더하여, 대상 IL-2 뮤테인은 화학적으로 합성될 수 있다. 화학적으로 합성된 폴리펩티드는 당업자에 의해 일상적으로 생성된다.
조립되면(합성, 부위 특이적 돌연변이유발 또는 또 다른 방법에 의함), IL-2 뮤테인을 인코딩하는 DNA 서열은 발현 벡터에 삽입되고, 원하는 형질전환된 숙주에서 IL-2 뮤테인의 발현에 적절한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 것이다. 적절한 조립은 뉴클레오티드 시퀀싱, 제한 맵핑 및 적합한 숙주에서의 생물학적 활성 폴리펩티드의 발현에 의해 확인될 수 있다. 당 분야에 널리 공지된 바와 같이, 숙주에서 형질감염된 유전자의 높은 발현 수준을 획득하기 위해, 유전자는 선택된 발현 숙주에서 기능하는 전사 및 번역 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어야 한다.
부위 특이적 돌연변이유발, 화학적 합성 또는 다른 방법에 의해 제조되든지 어떤지 간에 IL-2 뮤테인을 인코딩하는 DNA 서열은 또한 신호 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 상기 신호 서열은, 존재시, IL-2 뮤테인의 발현을 위해 선택된 세포에 의해 인지되는 것이어야 한다. 이는 원핵생물, 진핵생물 또는 이 둘의 조합일 수 있다. 이는 또한 고유 IL-2의 신호 서열일 수 있다. 신호 서열의 포함은 제조되는 재조합 세포로부터 IL-2 뮤테인을 분비하는 것이 바람직한지의 여부에 의존한다. 선택된 세포가 원핵생물인 경우, 이는 일반적으로 DNA 서열이 신호 서열을 인코딩하지 않는 것이 바람직하다. 선택된 세포가 진핵생물인 경우, 이는 일반적으로 신호 서열이 인코딩되고, 가장 바람직하게는 야생형 IL-2 신호 서열이 사용되는 것이 바람직하다.
일부 구현예에서, 상기 기재된 것과 같은 단독이거나 키메라 폴리펩티드의 일부인 대상 IL-2 뮤테인은 핵산 분자의 발현에 의해 획득될 수 있다. IL-2 뮤테인이 야생형 IL-2 폴리펩티드와의 동일성에 의해 기재될 수 있는 바와 같이, 이를 인코딩하는 핵산 분자는 반드시 야생형 IL-2를 인코딩하는 것과 특정한 동일성을 가질 것이다. 예를 들어, 대상 IL-2 뮤테인을 인코딩하는 핵산 분자는 야생형 IL-2를 인코딩하는 핵산과 적어도 50%, 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 가장 바람직하게는 적어도 95%(예를 들어, 99%) 동일할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 대상 IL-2 뮤테인을 인코딩하는 핵산 분자는 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산을 갖는 야생형 IL-2를 인코딩하는 핵산과 적어도 50%, 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 가장 바람직하게는 적어도 95%(예를 들어, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 대상 IL-2 뮤테인을 인코딩하는 핵산 분자는 SEQ ID NO:2에 기재된 아미노산을 갖는 야생형 IL-2를 인코딩하는 핵산과 적어도 50%, 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 가장 바람직하게는 적어도 95%(예를 들어, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일하다.
제공된 핵산 분자는 자연 발생 서열, 또는 자연 발생하는 것과 상이하나, 유전 부호의 축퇴성으로 인해 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 함유할 수 있다. 이들 핵산 분자는 RNA 또는 DNA(예를 들어, 포스포라미다이트-기반 합성에 의해 생성되는 것과 같은 유전체 DNA, cDNA 또는 합성 DNA), 또는 이들 유형의 핵산 내에서의 뉴클레오티드의 조합 또는 변형으로 구성될 수 있다. 또한, 핵산 분자는 이중 가닥 또는 단일 가닥(즉, 센스 또는 안티센스 가닥)일 수 있다.
핵산 분자는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열로 제한되지 않으며; 코딩 서열(예를 들어, IL-2의 코딩 서열)로부터 업스트림 또는 다운스트림에 놓여 있는 비-코딩 서열의 일부 또는 전부가 또한 포함될 수 있다. 분자 생물학의 당업자는 핵산 분자를 분리시키기 위한 일상적인 절차에 친숙하다. 이들은, 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제를 이용한 유전체 DNA의 처리, 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 수행에 의해 생성될 수 있다. 핵산 분자가 리보핵산(RNA)인 경우, 분자는, 예를 들어, 시험관 내 전사에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 개시의 예시적인 분리된 핵산 분자는 자연 상태에서 발견되지 않는 단편을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 개시는 핵산 서열(예를 들어, 돌연변이체 IL-2를 인코딩하는 서열)이 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터) 또는 이종성 세포의 유전체(또는 자연 염색체 위치 이외의 위치에서의 상동성 세포의 유전체)에 혼입된 것과 같은 재조합 분자를 포함한다.
상기 기재된 바와 같이, 대상 IL-2 뮤테인은 키메라 폴리펩티드의 일부로서 존재할 수 있다. 상기 기재된 이종성 폴리펩티드에 더하여 또는 이를 대신하여, 대상 핵산 분자는 "마커" 또는 "리포터"를 인코딩하는 서열을 함유할 수 있다. 마커 또는 리포터 유전자의 예는 β-락타마제, 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제(CAT), 아데노신 데아미나제(ADA), 아미노글리코시드 포스포트랜스페라제(neoR, G418), 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 하이그로마이신-B-포스포트랜스페라제(HPH), 티미딘 키나제(TK), lacz(β-갈락토시다제를 인코딩함), 및 크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스페라제(XGPRT)를 포함한다. 당업자는 추가의 유용한 시약, 예를 들어, 마커 또는 리포터의 기능을 제공할 수 있는 추가 서열을 인지할 것이다.
대상 핵산 분자는 포유동물의 세포와 같은 임의의 생물학적 세포로부터 획득된 IL-2 인코딩 DNA에 돌연변이를 도입시킴으로써 획득될 수 있다. 따라서, 대상 핵산(및 이들이 인코딩하는 폴리펩티드)은 마우스, 래트, 기니아 피그, 소, 양, 말, 돼지, 토끼, 원숭이, 비비, 개 또는 고양이의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 인간의 것일 것이다.
C. 벡터 및 숙주 세포
본원에 개시된 임의의 IL-2 뮤테인 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 함유하는 벡터, 플라스미드 또는 바이러스가 또한 본원에 제공된다. 상기 기재된 핵산 분자는, 예를 들어, 벡터로 형질도입된 세포에서 이들의 발현을 지시할 수 있는 벡터 내에 함유될 수 있다. 따라서, 대상 IL-2 뮤테인에 더하여, 대상 IL-2 뮤테인을 인코딩하는 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터 및 이들 벡터로 형질감염된 세포가 바람직한 구현예 중 하나이다. 진핵생물 및 원핵생물 세포에서 사용하기에 적합한 벡터는 당 분야에 공지되어 있으며, 당업자에 의해 상업적으로 이용 가능하거나 용이하게 제조된다. 추가 벡터는, 예를 들어, 문헌[Ausubel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, (Current Protocol, 1994) 및 Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2nd ED. (1989)]에서 발견될 수 있다.
물론, 모든 벡터 및 발현 조절 서열이 본원이 기재된 DNA 서열을 발현시키는 데 동일하게 잘 기능하는 것은 아님이 이해되어야 한다. 모든 숙주가 동일 발현 시스템으로 동일하게 잘 기능하지는 않는다. 그러나, 당업자는 과도한 실험 없이 이들 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 선택할 수 있다. 예를 들어, 벡터 선택에 있어서, 숙주 내에서 벡터를 복제시켜야 하므로 숙주가 고려되어야 한다. 벡터의 카피수, 상기 카피수를 제어하는 능력, 및 벡터에 의해 인코딩되는 임의의 다른 단백질, 예를 들어, 항생제 마커의 발현이 또한 고려되어야 한다. 예를 들어, 사용될 수 있는 벡터는 IL-2 뮤테인을 인코딩하는 DNA가 카피수로 증폭되는 것을 가능하게 하는 것을 포함한다. 상기 증폭 가능한 벡터는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 이들은, 예를 들어, DHFR 증폭(예를 들어, 문헌[Kaufman, 미국 특허 번호 4,470,461호, Kaufman and Sharp, "Construction of a Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis of Signals Utilized for Efficient Expression”, Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)] 참조) 또는 글루타민 신세타제("GS") 증폭(예를 들어, 미국 특허 번호 5,122,464호 및 유럽 공개 출원 번호 338,841호 참조)에 의해 증폭될 수 있는 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 인간 IL-2 뮤테인은 벡터, 바람직하게는 발현 벡터로부터 발현될 것이다. 벡터는 숙주 세포에서 자율 복제에 유용하거나, 숙주 세포로 도입시 숙주 세포의 유전체로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 유전체(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)와 함께 복제된다. 발현 벡터는 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태(벡터)이다. 그러나, 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 발현 벡터의 다른 형태가 또한 포함된다.
예시적 재조합 발현 벡터는 발현에 사용될 숙주 세포에 기초하여 선택되고, 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함할 수 있다.
발현 작제물 또는 벡터는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 IL-2 뮤테인 또는 이의 변이체의 발현을 위해 설계될 수 있다.
벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 원핵생물 또는 진핵생물 세포에 도입될 수 있다. 숙주 세포를 형질전환시키거나 형질감염시키는 적합한 방법은 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)] 및 다른 표준 분자생물학 실험실 메뉴얼에서 발견될 수 있다.
원핵생물에서의 단백질의 발현은 항시성 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터로 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)에서 가장 자주 수행된다. E. 콜리에서 재조합 단백질 발현을 최대화하기 위한 전략은, 예를 들어, 문헌[Gottesman (1990) in Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol. 185 (Academic Press, San Diego, Calif.), pp. 119-128 및 Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118]에서 발견될 수 있다. 세포로부터 IL-2 뮤테인 또는 이의 변이체를 성장시키거나, 수확하거나, 파괴하거나, 추출하기 위한 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,604,377호; 4,738,927호; 4,656,132호; 4,569,790호; 4,748,234호; 4,530,787호; 4,572,798호; 4,748,234호; 및 4,931,543호에 실질적으로 기재되어 있으며, 이들의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다.
일부 구현예에서, 재조합 IL-2 뮤테인 또는 이의 생물학적 활성 변이체는 진핵생물, 예를 들어, 효모 또는 인간 세포에서 제조될 수 있다. 적합한 진핵생물 숙주 세포는 곤충 세포(배양된 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포)에서 단백질의 발현에 이용 가능한 배큘로바이러스 벡터의 예는 pAc 시리즈(Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) 및 pVL 시리즈(Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39)를 포함함); 효모 세포(효모 S. 세레비지에에서의 발현을 위한 벡터의 예는 pYepSec1(Baldari et al. (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa(Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88(Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123), pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) 및 pPicZ(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)를 포함함); 또는 포유동물 세포(포유동물 발현 벡터는 pCDM8(Seed (1987) Nature 329:840) 및 pMT2PC(Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187:195)를 포함함)를 포함한다. 적합한 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 COS 세포를 포함한다. 포유동물 세포에서, 발현 벡터의 제어 기능은 종종 바이러스 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 및 원숭이 바이러스 40으로부터 유래된다. 원핵생물 및 진핵생물 세포 둘 모두에 대한 다른 적합한 발현 시스템에 대해, 예를 들어, 문헌[Chapters 16 and 17 of Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)]을 참조한다. 예를 들어, 문헌[Goeddel (1990, 상기)]을 참조한다.
본 발명의 개시의 인간 IL-2 뮤테인을 인코딩하는 서열은 관심 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 서열의 G-C 함량은 숙주 세포에서 발현된 공지된 유전자를 참조하여 계산된 바와 같이 제공된 세포 숙주에 대한 평균 수준으로 조정될 수 있다. 코돈 최적화를 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. IL-2 뮤테인 코딩 서열 내의 코돈은 코딩 서열 내의 코돈의 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 25%, 약 50%, 약 75% 또는 최대 100%가 특정 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화되도록 숙주 세포에서의 발현을 향상시키기 위해 최적화될 수 있다.
사용에 적합한 벡터는 박테리아에서 사용하기 위한 T7-기반 벡터(예를 들어, 문헌[Rosenberg et al., Gene 56:125, 1987] 참조), 포유동물 세포에서 사용하기 위한 pMSXND 발현 벡터(Lee and Nathans, J. Biol. Chem. 263:3521, 1988), 및 곤충 세포에서 사용하기 위한 배큘로바이러스-유래 벡터(예를 들어, Clontech, Palo Alto, Calif.로부터의 발현 벡터 pBacPAK9)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 벡터에서 대상 IL-2 뮤테인을 인코딩하는 핵산 삽입물은, 예를 들어, 발현이 추구되는 세포 유형에 기초하여 선택되는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
발현 조절 서열 선택에서, 다양한 요인이 또한 고려되어야 한다. 이들은, 예를 들어, 서열의 상대 강도, 이의 제어성, 및 특히 잠재적 이차 구조와 관련하여 대상 IL-2 뮤테인을 인코딩하는 실제 DNA 서열과의 이의 상용성을 포함한다. 숙주는 선택된 벡터와의 이의 상용성, 본 발명의 개시의 DNA 서열에 의해 코딩된 생성물의 독성, 이의 분비 특징, 이의 폴리펩티드를 정확하게 폴딩시키는 능력, 이의 발효 또는 배양 필요조건, 및 DNA 서열에 의해 코딩된 생성물의 정제 용이성을 고려하여 선택되어야 한다.
이들 파라미터 내에서, 당업자는 발효시 또는 대규모 동물 배양에서, 예를 들어, CHO 세포 또는 COS 7 세포를 사용하여 원하는 DNA 서열을 발현할 다양한 벡터/발현 제어 서열/숙주 조합을 선택할 수 있다.
일부 구현예에서, 발현 제어 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 의존할 것이다. 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵생물 숙주에 유용한 발현 벡터는, 예를 들어, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 사이토메갈로바이러스로부터의 발현 제어 서열을 갖는 벡터를 포함한다. 박테리아 숙주에 유용한 발현 벡터는 공지된 박테리아 플라스미드, 예를 들어, E. 콜리로부터의 플라스미드, 예를 들어, col El, pCRI, pER32z, pMB9 및 이들의 유도체, 더 넓은 숙주 범위 플라스미드, 예를 들어, RP4, 파지 DNA, 예를 들어, 파지 람다의 다수의 유도체, 예를 들어, NM989, 및 다른 DNA 파지, 예를 들어, M13 및 실모양 단일 가닥 DNA 파지를 포함한다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2μ 플라스미드 및 이의 유도체를 포함한다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941 및 pFastBac™ 1(Gibco BRL, Gaithersburg, Md.)(Cate et al., Cell, 45, pp. 685-98 (1986))을 포함한다.
또한, 매우 다양한 발현 제어 서열 중 임의의 것이 이들 벡터에 사용될 수 있다. 상기 유용한 발현 제어 서열은 상기 발현 벡터의 구조 유전자와 관련된 발현 제어 서열을 포함한다. 유용한 발현 제어 서열의 예는, 예를 들어, S40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, 파지 람다의 주요 작동자 및 프로모터 영역, 예를 들어, PL, fd 코트 단백질의 제어 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당 효소에 대한 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터, 예를 들어, PhoA, 효모 a-메이팅 시스템의 프로모터, 배큘로바이러스의 다면체 프로모터, 및 원핵생물 또는 진핵생물 세포 또는 이의 바이러스의 유전자의 발현을 제어하는 것으로 공지된 다른 서열, 및 이들의 다양한 조합을 포함한다.
T7 프로모터는 박테리아에 사용될 수 있고, 다면체 프로모터는 곤충 세포에 사용될 수 있고, 사이토메갈로바이러스 또는 메탈로티오네인 프로모터는 포유동물 세포에 사용될 수 있다. 또한, 더 고등한 진핵생물의 경우, 조직 특이적 및 세포 유형 특이적 프로모터가 널리 이용 가능하다. 이들 프로모터는 신체 내의 제공된 조직 또는 세포 유형에서 핵산 분자의 발현을 지시하는 능력에 대해 명명된다. 당업자는 핵산의 발현을 지시하는 데 사용될 수 있는 다수의 프로모터 및 다른 조절 요소를 잘 알고 있다.
삽입된 핵산 분자의 전사를 촉진하는 서열에 더하여, 벡터는 복제 기점, 및 선택 가능한 마커를 인코딩하는 다른 유전자를 함유할 수 있다. 예를 들어, 네오마이신-내성(neoR) 유전자는 그것이 발현되는 세포에 G418 내성을 부여하고, 이에 따라 형질감염된 세포의 표현형 선택을 허용한다. 당업자는 제공된 조절 요소 또는 선택 가능한 마커가 특정 실험 상황에서 사용하기에 적합한 지의 여부를 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 개시에서 사용될 수 있는 바이러스 벡터는, 예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 벡터, 헤르페스 바이러스, 원숭이 바이러스 40(SV40), 및 소 유두종 바이러스 벡터(예를 들어, 문헌[Gluzman (Ed.), Eukaryotic Viral Vectors, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조)를 포함한다.
본원에 개시된 대상 IL-2 뮤테인을 인코딩하는 핵산 분자를 함유하고 발현하는 원핵생물 또는 진핵생물 세포가 또한 본 발명의 개시의 특징이다. 본 발명의 개시의 세포는 형질감염된 세포, 즉, 핵산 분자, 예를 들어, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자가 재조합 DNA 기술에 의해 도입된 세포이다. 상기 세포의 자손이 또한 본 발명의 개시의 범위 내로 고려된다.
발현 시스템의 정확한 구성요소는 중요하지 않다. 예를 들어, IL-2 뮤테인은 박테리아 E. 콜리와 같은 원핵생물 숙주, 또는 곤충 세포(예를 들어, Sf21 세포) 또는 포유동물 세포(예를 들어, COS 세포, NIH 3T3 세포 또는 HeLa 세포)와 같은 진핵생물 숙주에서 생성될 수 있다. 이들 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(Manassas, Va.)을 포함하는 많은 공급처에서 이용 가능하다. 발현 시스템 선택에서, 구성요소가 서로 상용되는 것만 중요하다. 숙련자 또는 통상의 기술자는 상기 결정을 할 수 있다. 또한, 발현 시스템을 선택하는 데 지침이 필요한 경우, 당업자는 문헌[Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1993) 및 Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985 Suppl. 1987)]을 참조할 수 있다.
발현된 폴리펩티드는 일상적인 생화학 절차를 이용하여 발현 시스템으로부터 정제될 수 있고, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 치료제로서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 획득된 IL-2 뮤테인은 뮤테인을 생성시키는 데 사용되는 숙주 유기체에 따라 당화되거나 당화되지 않을 것이다. 박테리아가 숙주로 선택되는 경우, 생성된 IL-2 뮤테인은 당화되지 않을 것이다. 반면에, 진핵생물 세포는 IL-2 뮤테인을 당화시킬 것이나, 아마 고유 IL-2가 당화되는 것과 동일한 방식은 아닐 것이다. 형질전환된 숙주에 의해 생성된 IL-2 뮤테인은 임의의 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다. IL-2를 정제하기 위한 다양한 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Protein Science, Vol 2. Eds: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploehg, David W. Speicher, Paul T. Wingfield, Unit 6.5 (Copyright 1997, John Wiley and Sons, Inc.)]을 참조한다. IL-2 뮤테인은 E. 콜리에서 생성된 봉입체, 또는 양이온 교환, 젤 여과 및/또는 역상 액체 크로마토그래피를 사용하여 제공된 뮤테인을 생성하는 포유동물 또는 효모 배양물로부터의 조건화 배지로부터 분리될 수 있다.
IL-2 뮤테인을 인코딩하는 DNA 서열을 작제하는 또 다른 예시적 방법은 화학적 합성에 의한 것이다. 이는 기재된 특성을 나타내는 IL-2 뮤테인을 인코딩하는 단백질 서열의 화학적 수단에 의한 펩티드의 직접 합성을 포함한다. 이러한 방법은 IL-2와 IL-2Rα, IL-2Rβ 및/또는 IL-2Rγ의 상호작용에 영향을 미치는 위치에 자연 및 비자연 아미노산 둘 모두를 포함할 수 있다. 대안적으로, 원하는 IL-2 뮤테인을 인코딩하는 유전자는 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하는 화학적 수단에 의해 합성될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 원하는 IL-2 뮤테인의 아미노산 서열, 바람직하게는 재조합 뮤테인 생성될 숙주 세포에서 선호되는 코돈 선택에 기초하여 설계된다. 이와 관련하여, 유전 부호는 축퇴성이고, 아미노산은 하나 초과의 코돈에 의해 코딩될 수 있음이 잘 알려져 있다. 예를 들어, Phe(F)는 2개의 코돈 TIC 또는 TTT에 의해 코딩되고, Tyr(Y)은 TAC 또는 TAT에 의해 코딩되고, his(H)는 CAC 또는 CAT에 의해 코딩된다. Trp(W)는 단일 코돈 TGG에 의해 코딩된다. 따라서, 특정 IL-2 뮤테인을 인코딩하는 제공된 DNA 서열에 대해, 상기 IL-2 뮤테인을 코딩할 많은 DNA 축퇴성 서열이 있을 것이 인지될 것이다. 예를 들어, 도 2에 제시된 뮤테인 5-2에 대한 바람직한 DNA 서열에 더하여, 제시된 IL-2 뮤테인을 코딩하는 많은 축퇴성 DNA 서열이 존재할 것이 인지될 것이다. 이들 축퇴성 DNA 서열은 본 발명의 개시 범위 내로 고려된다. 따라서, 본 발명의 개시의 맥락에서 "이의 축퇴성 변이체"는 특정 뮤테인을 코딩하고 이에 의해 특정 뮤테인의 발현을 가능하게 하는 모든 DNA 서열을 의미한다.
IL-2 뮤테인의 생물학적 활성은 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 검정될 수 있다. 상기 검정은 PHA-블라스트 증식 및 NK 세포 증식을 포함한다.
D. 융합 단백질
본원에 개시된 임의의 IL-2 뮤테인은 대상 IL-2 뮤테인 및 이종성 폴리펩티드(즉, IL-2 또는 이의 돌연변이체가 아닌 폴리펩티드)를 포함하는 융합 또는 키메라 폴리펩티드로 제조될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 6,451,308호 참조). 예시적인 이종성 폴리펩티드는 생체 내에서 키메라 폴리펩티드의 순환 반감기를 증가시킬 수 있고, 따라서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 특성을 추가로 향상시킬 수 있다. 다양한 구현예에서, 순환 반감기를 증가시키는 폴리펩티드는 혈청 알부민, 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 또는 IgG 중쇄 가변 영역이 결여된 항체의 IgG 서브클래스의 Fc 영역일 수 있다. 예시적인 Fc 영역은 보체 고정 및 Fc 수용체 결합을 억제하는 돌연변이를 포함할 수 있거나, 이는 용해성, 즉, 보체에 결합할 수 있거나, 또 다른 메커니즘, 예를 들어, 항체-의존성 보체 용해(ADCC; 1994년 12월 12일에 출원된 미국 일련 번호 08/355,502호)를 통해 세포를 용해시킬 수 있다.
"Fc 영역"은 파파인에 의한 IgG의 소화에 의해 생성된 IgG C-말단 도메인과 상동성인 자연 발생 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. IgG Fc는 약 50 kDa의 분자량을 갖는다. 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 전체 Fc 영역, 또는 일부가 키메라 폴리펩티드의 순환 반감기를 연장시키는 능력을 보유하는 더 작은 부분을 포함할 수 있다. 또한, 전장 또는 단편화된 Fc 영역은 야생형 분자의 변이체일 수 있다. 즉, 이들은 폴리펩티드의 기능에 영향을 줄 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 돌연변이를 함유할 수 있으며; 하기에 추가로 기재되는 바와 같이, 모든 경우에 고유 활성이 필요하거나 요구되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인 융합 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 부분 효능제 또는 길항제)은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역을 포함한다.
Fc 영역은 "용해성" 또는 "비-용해성"일 수 있지만, 전형적으로 비-용해성이다. 비-용해성 Fc 영역은 전형적으로 고 친화성 Fc 수용체 결합 부위 및 C'1q 결합 부위가 결여되어 있다. 뮤린 IgG Fc의 고 친화성 Fc 수용체 결합 부위는 IgG Fc의 위치 235에서 Leu 잔기를 포함한다. 따라서, Fc 수용체 결합 부위는 Leu 235를 돌연변이시키거나 결실시킴으로써 파괴될 수 있다. 예를 들어, Leu 235에 대한 Glu의 치환은 Fc 영역이 고 친화성 Fc 수용체에 결합하는 능력을 억제한다. 뮤린 C'1q 결합 부위는 IgG의 Glu 318, Lys 320 및 Lys 322 잔기를 돌연변이시키거나 결실시킴으로써 기능적으로 파괴될 수 있다. 예를 들어, Glu 318, Lys 320 및 Lys 322에 대한 Ala 잔기의 치환은 IgG1 Fc가 항체-의존적 보체 용해를 지시할 수 없게 한다. 대조적으로, 용해성 IgG Fc 영역은 고 친화성 Fe 수용체 결합 부위 및 C'1q 결합 부위를 갖는다. 고 친화성 Fc 수용체 결합 부위는 IgG Fc의 위치 235에 Leu 잔기를 포함하고, C'1q 결합 부위는 IgG1의 Glu 318, Lys 320 및 Lys 322 잔기를 포함한다. 용해성 IgG Fc는 이들 부위에서 야생형 잔기 또는 보존성 아미노산 치환을 갖는다. 용해성 IgG Fc는 항체 의존성 세포 세포독성 또는 보체 지정 세포용해(CDC)를 위해 세포를 표적으로 할 수 있다. 인간 IgG에 대한 적절한 돌연변이가 또한 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Morrison et al., The Immunologist 2:119-124, 1994; 및 Brekke et al., The Immunologist 2: 125, 1994] 참조).
다른 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 대상 IL-2 뮤테인 및 FLAG 서열과 같은 항원성 태그로서 기능하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. FLAG 서열은 본원에 기재된 바와 같이 비오티닐화된 매우 특이적인 항-FLAG 항체에 의해 인지된다(또한, 문헌[Blanar et al., Science 256:1014, 1992; LeClair et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8145, 1992] 참조). 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 C-말단 c-myc 에피토프 태그를 추가로 포함한다.
다른 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드, 및 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 발현을 향상시키거나 이의 세포 국소화를 지시하는 기능을 하는 이종성 폴리펩티드, 예를 들어, Aga2p 아글루티닌 서브유닛을 포함한다(예를 들어, 문헌[Boder and Wittrup, Nature Biotechnol. 15:553-7, 1997] 참조).
다른 구현예에서, 돌연변이체 IL-2 및 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 키메라 폴리펩티드가 생성될 수 있다. 키메라 단백질의 항체 또는 항원 결합 성분은 표적화 모이어티로 작용할 수 있다. 예를 들어, 이는 키메라 단백질을 세포의 특정 서브셋 또는 표적 분자로 국소화시키는 데 사용될 수 있다. 사이토카인-항체 키메라 폴리펩티드를 생성시키는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,617,135호에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IL-2는 이의 반감기를 증가시키기 위해 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자로 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "PEG"는 폴리에틸렌 글리콜 분자를 의미한다. 이의 전형적인 형태에서, PEG는 말단 하이드록실기를 갖는 선형 중합체이며, 화학식 HO-CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH를 갖고, 여기서 n은 약 8 내지 약 4000이다.
전형적으로, n은 이산 값이 아니지만, 평균 값 주위의 대략적인 가우시안 분포를 갖는 범위를 구성한다. 말단 수소는 알킬 또는 알칸올 기와 같은 캡핑 기로 치환될 수 있다. PEG는 적어도 하나의 하이드록시기를 가질 수 있으며, 더욱 바람직하게는 이는 말단 하이드록시기이다. 이러한 하이드록시기는 펩티드와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 링커 모이어티에 부착될 수 있다. PEG의 다수의 유도체가 당 분야에 존재한다. (예를 들어, 미국 특허 번호 5,445,090호; 5,900,461호; 5,932,462호; 6,436,386호; 6,448,369호; 6,437,025호; 6,448,369호; 6,495,659호; 6,515,100호 및 6,514,491호 및 문헌[Zalipsky, S. Bioconjugate Chem. 6: 150-165, 1995] 참조). 본 발명의 개시의 IL-2 뮤테인에 공유적으로 부착된 PEG 분자는 대략 10,000, 20,000, 30,000 또는 40,000 달톤의 평균 분자량일 수 있다. PEG화 시약은 선형 또는 분지형 분자일 수 있고, 단독으로 또는 나란히 존재할 수 있다. 본 발명의 개시의 PEG화된 IL-2 뮤테인 펩티드는 펩티드의 C-말단 및/또는 N-말단에 부착된 탠덤 PEG 분자를 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "PEG화"는 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 PEG 분자의 본 발명의 개시의 IL-2 뮤테인과 같은 분자로의 공유 부착을 의미한다.
E. 약학적 조성물
주사용 사용에 적합한 약학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 인산염 완충 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고, 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유체여야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정적이어야 하고, 미생물, 예를 들어, 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예를 들어, 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제, 예를 들어, 소듐 도데실 설페이트의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에서, 조성물 내에 등장성 작용제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 발생될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 상기 열거된 성분 중 하나 또는 성분의 조합과 함께 적절한 용매 중에 필요량의 활성 화합물을 혼입시키고, 필요에 따라 이후 멸균 여과에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에서, 바람직한 제조 방법은 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 냉동-건조이다.
경구 조성물은 사용되는 경우 일반적으로 비활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 경구 치료 투여의 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있고, 정제, 트로키(troche), 또는 캡슐, 예를 들어, 젤라틴 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강세정제로서 사용하기 위한 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 약학적으로 양립되는 결합제, 및/또는 애쥬번트 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환약, 캡슐, 트로키 등은 결합제, 예를 들어, 미정질 셀룰로스, 검 트래거캔쓰 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들어, 전분 또는 락토스, 붕해제, 예를 들어, 알긴산, Primogel™, 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트 또는 Sterotes™; 활택제, 예를 들어, 콜로이드성 실리콘 디옥사이드; 감미제, 예를 들어, 수크로스 또는 사카린; 또는 착향제, 예를 들어, 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 착향제의 성분 중 임의의 성분 또는 유사한 특성의 화합물을 함유할 수 있다.
흡입에 의한 투여의 경우, 대상 IL-2 뮤테인 또는 이를 인코딩하는 핵산은 적합한 추진제, 예를 들어, 가스, 예를 들어, 이산화탄소를 함유하는 가압 용기 또는 디스펜서, 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다. 상기 방법은 미국 특허 번호 6,468,798호에 기재된 것을 포함한다.
대상 IL-2 뮤테인 또는 핵산의 전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 침투되어야 하는 장벽에 적절한 침투제가 제형에서 이용된다. 상기 침투제는 일반적으로 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 경점막 투여를 위해 세제, 담즙산 염, 및 퓨시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비내 분무 또는 좌약의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 일반적으로 당 분야에 공지된 바와 같은 연고, 고약, 젤, 또는 크림으로 제형화된다.
일부 구현예에서, 화합물(돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 또는 핵산)은 또한 직장 전달을 위한 좌약(예를 들어, 코코아 버터 및 다른 글리세라이드와 같은 통상적인 좌약 베이스를 가짐) 또는 정체 관장제의 형태로 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 화합물(대상 IL-2 뮤테인 또는 핵산)은 또한 문헌[McCaffrey et al. (Nature 418:6893, 2002), Xia et al. (Nature Biotechnol. 20: 1006-1010, 2002), 또는 Putnam(Am. J. Health Syst. Pharm. 53: 151-160, 1996, erratum at Am. J. Health Syst. Pharm. 53:325, 1996)]에 기재된 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 형질감염 또는 감염에 의해 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상 IL-2 뮤테인 또는 핵산은 임플란트 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같은 신체로부터의 신속한 제거에 대해 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드를 보호할 담체와 함께 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생물분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 상기 제형은 표준 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 물질은 또한 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.로부터 상업적으로 획득될 수 있다. 리포솜 현탁액(바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체로 감염된 세포를 표적으로 하는 리포솜을 포함함)이 또한 약학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,522,811호에 기재된 바와 같은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
IV. 본 발명의 개시의 방법
본 발명의 개시의 일부 양태는 IL-2 뮤테인, 예를 들어, 본원에 기재된 IL-2 부분 효능제를 생성하는 데 유용한 방법 및 관련 물질뿐만 아니라 IL-2 신호전달 경로에 의해 매개되는 신호 전달의 교란과 관련된 건강 상태 및 장애의 치료를 위한 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 인터루킨 2(IL-2)에 의해 매개되는 신호 전달 경로의 조절을 필요로 하는 대상체에서 IL-2에 의해 매개되는 신호 전달 경로를 조절하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 개시의 일부 구현예에서, IL-2 매개 신호전달은 수용체, 예를 들어, 인터루킨 2 알파 수용체(IL-2Rα), 인터루킨 2 베타 수용체(IL-2Rβ), 인터루킨-2 감마 수용체(IL-2Rγ) 중 1개, 2개 또는 3개에 대한 IL-2 결합의 선택적 감소를 통해 조절된다.
일 양태에서, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 본원에 개시된 IL-2 뮤테인을 생성하는 데 유용한 조성물 및 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 IL-2 뮤테인의 생성에 적합한 조건하에서 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 생성된 뮤테인의 분리를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 생성된 뮤테인의 정제를 추가로 포함한다. 원핵생물 및 진핵생물 숙주 세포에서 생성된 단백질 재조합체의 분리 및 정제에 적합한 기술, 시스템 및 관련 물질은 당 분야에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 생성된 IL-2 뮤테인은 생체 내 및/또는 생체 외에서 반감기를 연장시키도록 추가로 변형될 수 있다. 본 발명의 개시의 IL-2 뮤테인을 변형시키기에 적합한 공지된 전략 및 방법론의 비제한적인 예는 (1) 폴리펩티드가 프로테아제와 접촉하는 것을 방지하는 폴리에틸렌 글리콜("PEG")과 같은 고도로 가용성인 거대분자를 이용한 본원에 기재된 IL-2 뮤테인 폴리펩티드의 화학적 변형; (2) 본원에 기재된 IL-2 뮤테인과 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 인간 Fc 항체 단편의 공유적 연결 또는 컨쥬게이션; 및 (3) 본원에 기재된 IL-2 뮤테인과 안정한 단백질, 예를 들어, 알부민의 공유적 연결 또는 컨쥬게이션을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 IL-2 뮤테인은 알부민과 같은 안정한 단백질에 융합될 수 있다. 예를 들어, 인간 알부민은 이에 융합된 폴리펩티드의 안정성을 향상시키는 가장 효과적인 단백질 중 하나로 공지되어 있으며, 이러한 융합 단백질이 많이 보고되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 생성된 IL-2 뮤테인은 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 모이어티로 화학적으로 변형되고, 예를 들어, PEG화되거나, 유사한 변형, 예를 들어, PAS화(PASylation)가 수행된다. 일부 구현예에서, PEG 분자 또는 PAS 분자는 IL-2 뮤테인의 하나 이상의 아미노산에 컨쥬게이션된다. 일부 구현예에서, PEG화 또는 PAS화된 IL-2 뮤테인은 단지 하나의 아미노산 상에 PEG 또는 PAS 모이어티를 함유한다. 다른 구현예에서, PEG화 또는 PAS화된 IL-2 뮤테인은, 예를 들어, 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상 또는 20개 이상의 상이한 아미노산 잔기에 부착된 2개 이상의 아미노산 상의 PEG 또는 PAS 모이어티를 함유한다. 일부 구현예에서, PEG 또는 PAS 사슬은 2000, 2000 초과, 5000, 5,000 초과, 10,000, 10,000 초과, 10,000 초과, 20,000, 20,000 초과 및 30,000 Da이다. 생성된 IL-2 뮤테인은 아미노기, 설프하이드릴기, 하이드록실기 또는 카르복실기를 통해 PEG 또는 PAS(예를 들어, 연결 기가 없음)에 직접 커플링될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 IL-2 신호전달 경로에 의해 매개되는 신호 전달의 교란과 관련된 건강 상태 및 장애의 치료에 유용한 조성물 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 인터루킨 2(IL-2)에 의해 매개되는 신호 전달 경로의 조절을 필요로 하는 대상체에서 IL-2에 의해 매개되는 신호 전달 경로를 조절하는 것에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 IL-2 뮤테인 및/또는 이를 발현하는 핵산은 원하지 않는 자가면역 또는 면역억제 반응과 관련된 장애를 치료하기 위해 대상체에 투여될 수 있다. 상기 질병의 치료에서, 본원에 개시된 IL-2 뮤테인은 잠재적으로 염증성 면역 세포를 최소로 활성화시키거나 활성화시키지 않으면서 동시에 조절성 T 세포를 자극하는 것과 같은 유리한 특성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 IL-2 뮤테인은 자가면역 질환을 갖거나, 가질 것으로 의심되거나, 발생할 위험이 높을 수 있는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 상기 방법은 치료적 유효량의 (i) 본원에 개시된 IL-2 뮤테인 중 어느 하나, (ii) 본원에 개시된 핵산 또는 벡터 중 어느 하나, 및/또는 (iii) 본원에 개시된 약학적 조성물 중 어느 하나를 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 자가면역 질병은 류마티스 관절염, 인슐린-의존성 당뇨병, 용혈성 빈혈, 류마티스 열, 갑상샘염, 크론병, 중증근육무력증, 사구체신염, 자가면역 간염, 다발경화증, 원형탈모증, 건선, 백반증, 이영양성 수포성 표피박리증, 전신 홍반 루푸스 및 이식편 대 숙주병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 자가면역 질병은 이식편 대 숙주병이다.
일부 구현예에서, IL-2 뮤테인, 핵산 또는 벡터 및/또는 약학적 조성물은 단일 치료제로서 또는 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 뮤테인을 특정 세포 유형으로 표적화하는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 유형은 조절성 T(Treg) 세포이다. 일부 구현예에서, 항체는 IL-2 뮤테인에 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결된다.
일 양태에서, 잠재적 염증성 T 세포의 증식을 방지하고/하거나 CD8+ T 세포 또는 다른 염증성 면역 세포 서브셋으로부터 IFNγ의 분비를 방지하는 방법이 또한 본원에 제공되며, 상기 방법은 인터루킨 2 수용체 γ(IL-2Rγ)를 발현하는 세포와 본원에 개시된 임의의 IL-2 뮤테인을 접촉시키는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 잠재적 염증성 T 세포는 CD4+CD44+IFNγ+ T 세포이거나, CD8+CD44+IFNγ+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 수행된다.
상기 논의된 바와 같이, 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 반감기를 증가시키도록 구조적으로 변형된다. 본원에 개시된 임의의 구현예의 일부 구현예에서, 변형은 인간 Fc 항체 단편에 대한 융합, 알부민에 대한 융합 및 PEG화로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형이다.
또 다른 양태에서, 조절성 T(Treg) 세포를 (i) SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 인터루킨 2 수용체 γ(IL-2Rγ)에 대한 감소된 결합 친화성, 및 (ii) SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 0-50%의 Emax를 갖는 인터루킨 2(IL-2) 뮤테인을 접촉시키는 것을 포함하는 Treg 세포의 증식을 감소시키기 위한 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 (i) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 따라 넘버링된 L80F, R81D, L85V, I86V 및 I92F로부터 선택된, SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 비해 IL-2Rβ 결합 친화성을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 및 (ii) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열에 따라 넘버링된 (A) L18R 및 Q22E 및 (B) 아미노산 위치 126으로부터 선택된, IL-2Rγ 수용체 결합 친화성을 감소시키고 SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 비해 0-50%의 Emax를 발생시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
또 다른 양태에서, 조절성 T(Treg) 세포를 (i) SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 IL-2Rγ에 대한 감소된 결합 친화성, 및 (ii) SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 0-50%의 Emax를 갖는 IL-2 뮤테인을 접촉시키는 것을 포함하는 Treg 세포의 증식을 감소시키기 위한 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 따라 넘버링된 (A) L18R 및 Q22E 및 (B) 아미노산 위치 126으로부터 선택된, IL-2Rγ 수용체 결합 친화성을 감소시키고 SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 0-50%의 Emax를 발생시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 위치 126에서의 아미노산 치환은 Q126A, Q126C, Q126D, Q126E, Q126G, Q126H, Q126I, Q126K, Q126M, Q126R, Q126S 또는 Q126T로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 아미노산 치환 Q126H, Q126K 또는 Q126M을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 아미노산 치환 Q126H를 포함한다. 본원에 개시된 임의의 구현예의 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL2 뮤테인을 뮤테인을 Treg 세포에 표적화하는 항체와 함께 투여하는 것을 추가로 포함한다. 본원에 개시된 임의의 구현예의 일부 구현예에서, 항체는 뮤테인에 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결된다. 본원에 개시된 임의의 구현예의 일부 구현예에서, 상기 방법은 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 수행된다.
약학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 양립되도록 제형화된다. 본원에서 사용되는 용어 "투여" 및 "투여하는"은 경구, 정맥내, 동맥내, 근내, 복막내, 피하, 근내 및 국소 투여, 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 투여 경로에 의한 생물활성 조성물 또는 제형의 전달을 나타낸다. 상기 용어는 의료 전문가에 의한 투여 및 자가 투여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 경구 또는 흡입에 의해 제공될 수 있으나, 비경구 경로를 통해 투여될 가능성이 더 높다. 비경구 투여 경로의 예는, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경피(국소), 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 비경구 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들어, 주사용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예를 들어, 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이트제, 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성의 조정을 위한 제제, 예를 들어, 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예를 들어, 일염기 및/또는 이염기 소듐 포스페이트, 염산 또는 소듐 하이드록시드로 조정(예를 들어, 약 7.2-7.8, 예를 들어, 7.5의 pH로 조정)될 수 있다. 비경구 제조물은 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰풀, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 넣을 수 있다.
상기 대상 IL-2 뮤테인 또는 핵산 화합물의 투여량, 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50 비로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하여 부작용을 감소시키기 위해 상기 화합물을 감염된 조직 부위에 표적화하는 전달 시스템을 설계하도록 주의를 기울여야 한다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 획득된 데이터가 인간에서 사용하기 위한 광범위한 투여량을 제형화시키는데 이용될 수 있다. 상기 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 독성이 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 변할 수 있다. 본 발명의 개시 방법에 사용된 임의의 화합물에 대해, 치료적 유효 용량은 초기에 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 세포 배양에서 결정된 바와 같이 IC50(즉, 증상의 최대 절반 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 용량이 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 상기 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다. 혈장의 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
본원에 정의된 바와 같이, 대상 IL-2 뮤테인의 "치료적 유효량"(즉, 유효 투여량)은 선택된 폴리펩티드에 의존한다. 예를 들어, 대략 0.001 내지 0.1 mg/환자 체중 kg 범위의 단일 용량이 투여될 수 있으며; 일부 구현예에서, 약 0.005, 0.01, 0.05 mg/kg이 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 600,000 IU/kg이 투여된다(IU는 림프구 증식 생물검정에 의해 결정될 수 있고, 인터루킨-2(인간)에 대한 세계보건기구 1st 국제 표준에 의해 확립된 바와 같이 국제 단위(IU)로 표현된다). 투여량은 PROLEUKIN®에 대해 처방된 것과 유사할 수 있지만, 이보다 적을 것으로 예상된다. 조성물은 하루에 1회 이상 내지 격일에 1회를 포함하는 주 당 1회 이상으로 투여되는 것일 수 있다. 당업자는 질병 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 대상체의 전반적 건강 및/또는 연령, 및 다른 존재하는 질병을 포함하나 이에 제한되지는 않는 특정 요인이 대상체를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 치료 유효량의 대상 IL-2 뮤테인을 이용한 대상체의 치료는 단일 치료를 포함할 수 있거나, 일련의 치료를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 5일 동안 8시간마다 투여된 후, 2 내지 14일, 예를 들어, 9일의 휴지 기간, 이어서 8시간마다의 추가 5일의 투여가 후속된다.
잠재적 염증성 T 세포의 증식을 방지하거나, 감소시키거나, 촉진하지 않고/않거나, CD8+ T 세포 또는 다른 염증성 면역 세포 서브셋으로부터의 IFNγ의 분비를 방지하기 위한 방법이 또한 본원에 제공된다. 상기 방법은 인터루킨 2 수용체 γ(IL-2Rγ)를 발현하는 세포를 본원에 개시된 임의의 IL-2 뮤테인과 접촉시킴으로써 수행된다. 잠재적 염증성 T 세포의 증식 및/또는 CD8+ T 세포 또는 다른 염증성 면역 세포 서브셋으로부터의 IFNγ의 분비 방지는 야생형 IL-2가 동등한 농도 및 유사한 조건하에서 자극하는 증식 및/또는 IFNγ의 분비에 비해 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%(이들 백분율 사이의 값을 포함함) 중 임의의 것만큼 감소될 수 있다. 일부 구현예에서, 잠재적 염증성 T 세포는 CD4+CD44+IFNγ+ T 세포이거나, CD8+CD44+IFNγ+ T 세포이다. 상기 방법은 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 추가로 수행될 수 있다.
V. 시스템 및 키트
본 발명의 개시의 시스템 및/또는 키트는 본원에 개시된 임의의 IL-2 뮤테인, 핵산, 벡터 또는 약학적 조성물 중 하나 이상뿐만 아니라 임의의 IL-2 뮤테인, 핵산, 벡터 또는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 데 사용되는 주사기(미리 충전된 주사기를 포함함) 및/또는 카테터(미리 충전된 주사기를 포함함)를 포함한다. 키트는 또한 본원에 개시된 임의의 IL-2 뮤테인, 핵산, 벡터 또는 약학적 조성물뿐만 아니라 이의 투여에 사용하기 위한 주사기 및/또는 카테터를 사용하기 위한 서면 설명서를 포함한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 제공된 모든 최대 수치 제한은 더 낮은 수치 제한이 본원에 명백히 기록된 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서 전체에 걸체 제공된 모든 최소 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 본원에 명백히 기록된 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함할 것이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 제공된 모든 수치 범위는 보다 좁은 수치 범위가 모두 본원에 명백히 기록된 것처럼 더 넓은 수치 범위 내에 속하는 모든 더 좁은 수치 범위를 포함할 것이다.
본 발명의 개시에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별적 간행물 또는 특허 출원이 특별히 및 개별적으로 참조로서 포함되는 것으로 지정되는 것과 동일한 정도로 참조로서 본원에 포함된다.
본원에 임용된 임의의 참고문헌이 선행 기술을 구성한다는 것을 인정하지는 않는다. 참고문헌에 대한 논의는 저자가 주장하는 내용을 나타내며, 발명자는 인용된 문헌의 정확성 및 적절성에 이의를 제거할 권리를 보유한다. 과학 저널 논문, 특허 문서 및 교과서를 포함하여 다수의 정보원이 본원에 언급되어 있으나, 이러한 참고문헌은 이들 문서 중 어느 것도 당 분야에서 일반적인 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것은 아님이 명백히 이해될 것이다.
본원에 제공된 일반적 방법의 논의는 단지 예시 목적을 위한 것이다. 다른 대안적 방법 및 대안은 본 발명의 개시의 검토시 당업자에게 명백할 것이며, 본 출원의 사상 및 범위 내에 포함되어야 한다.
실시예
실시예 1
본 실시예는 다양한 인간 IL-2 변이체가 STAT5의 인산화를 자극하는 능력을 제시한다. 인간 NK-유사 YT 세포를 도 3에 도시된 그래프에 표시된 바와 같이 상이한 농도(1μM 내지 0 μM, 10배 희석)의 마우스 혈청 알부민(MSA)에 융합된 다양한 인간 IL-2 변이체로 15분 동안 자극하였다. 곤충 세포로부터 정제된 IL-2 REK(SEQ ID NO:10)를 제외한 모든 IL-2 변이체를 형질도입된 HEK 293 세포로부터 정제하였다. 도 3에 도시된 그래프 상의 Y 축은 각각의 농도에 대해 WT IL-2로부터의 p-STAT5 신호로 표준화된 각각의 IL-2 변이체로부터의 p-STAT5 신호의 비를 제시한다. 제시된 바와 같이, IL-2 H9(SEQ ID NO:2) 백그라운드에서 특정 아미노산에 의한 잔기 Q126의 치환은 광범위한 IL-2 효능을 발생시킨다.
다음으로, 타임 코스 포스포-STAT5 신호전달 검정을 도 4a에 도시된 그래프에 표시된 IL-2 부분 효능제의 농도로 15분 동안 YT 세포를 자극함으로써 수행하였다. 도 4a의 그래프 상의 Y 축은 각각의 농도에 대해 WT IL-2로부터의 p-STAT5 신호로 표준화된 각각의 IL-2 변이체로부터의 p-STAT5 신호의 비를 제시한다. 도 4b에 제시된 바와 같이, 그래프에 표시된 바와 같이 YT 세포를 1μM의 상이한 IL-2 변이체로 다양한 시점에서 자극하였다. 이러한 도면에서, Y 축은 p-STAT5 신호에 대한 중간 형광 강도(MFI)를 나타낸다.
도 4b의 이러한 데이터는 WT(SEQ ID NO:1), H9(SEQ ID NO:2) 및 새로운 부분 효능제 REE(SEQ ID NO:6), REH(SEQ ID NO:8) 및 REK(SEQ ID NO:10)(모두 H9 백그라운드 상)에 대한 p-STAT5 신호의 크기는 각각 25%, 50% 및 75%에서의 REE, REK 및 REH 신호전달로 시간 경과에 따라 일정한 것을 입증한다.
실시예 2
본 실시예는 마우스에서의 IL-2 변이체의 생체 내 투여를 제시한다. 0일에, 암컷 WT C57BL/6c 마우스는 복막내(IP) 주사에 의해 30 μg의 각각의 MSA 융합 IL-2 변이체를 투여받았다. 6일에, 비장을 회수하고, 세포 표면 마커 발현 및 세포 내 사이토카인(n=3/그룹)에 대한 흐름세포측정법에 의해 분석하였다(도 5a 참조). 도 5b, 도 5c 및 도 5d에 도시된 그래프는 PBS 처리된 마우스에서 각각의 빈도로 표준화된 각각의 조건에 대한 표시된 세포 서브셋의 빈도를 나타낸다. B 세포는 CD3-CD19+ 상에 게이팅된 세포에 의해 정의되었다. NK 세포는 CD3-NK1.1+ 상에 게이팅되었다. Ly6g (Gr1)+CD3+CD11b+ 상에 게이팅된 세포는 과립구로 정의되었다.
도 5b-5d에 제시된 바와 같이, IL-2 변이체 투여는 다른 면역 세포 유형에서 약간의 변화를 발생시켰고, IL-2 H9_REH(REH; SEQ ID NO:8)는 CD4 효과기 기억 T(TEM) 세포의 우선적 확장을 개시하였다. 특히, WT(SEQ ID NO:1) 및 H9 IL-2(SEQ ID NO:2) 처리는 IFNγ 분비 CD8 T 세포 빈도에서 유의한 증가를 발생시켰으나, 이러한 증가는 마우스가 REE(SEQ ID NO:6), REH(SEQ ID NO:8) 및 REK(SEQ ID NO:10)로 처리된 경우에 관찰되지 않았다.
실시예 3
본 실시예는 야생형 백그라운드에서의 IL-2 뮤테인의 생성 및 특성규명을 개시한다. STAT5의 인산화를 자극하는 이들 변이체의 능력을 포스포-STAT5 신호전달 검정을 이용하여 측정하였다. 인간 NK-유사 YT 세포(도 6a) 또는 마우스 고갈 T 세포 블라스트(도 6b)를 그래프에 표시된 바와 같이 상이한 농도(5 μM 내지 0 μM)의 마우스 혈청 알부민(MSA)에 융합된 다양한 인간 IL-2 변이체로 15분 동안 자극하였다. 모든 IL-2 변이체를 곤충 세포로부터 정제하였다. 도 6a 및 도 6b에 도시된 그래프의 Y 축은 각각의 농도에 대해 WT IL-2로부터의 p-STAT5 신호로 표준화된 각각의 IL-2 변이체로부터의 p-STAT5 신호의 비를 제시한다. 제시된 바와 같이, WT_REH(SEQ ID NO:15) 신규 부분 효능제는 H9_REH(SEQ ID NO:8)에 비해 낮은 EC50 및 높은 Emax를 나타내는 것으로 보인다. 신규 부분 효능제 WT_REH(SEQ ID NO:1) 및 H9_REH(SEQ ID NO:8) 둘 모두는 WT 또는 H9 IL-2보다 낮은 효능(Emax)을 나타낸다.
야생형 백그라운드 IL-2 뮤테인을 이후 B16 흑색종 마우스 모델에 투여하였다. D0에서, 106 B16F10 세포를 C57BL/6 암컷 마우스에 피하 주사하였다. D5, D9 및 D14에서, 마우스를 IP 주사에 의해 30 μg의 각각의 MSA-IL2 변이체로 처리하였다. 종양 크기를 캘리퍼를 사용하여 D5로부터 격일로 측정하였다. mm3의 종양 부피를 다음과 같이 계산하였다: (길이* (폭)2)/2. D19에서, 비장을 수거하고, 세포 표면 및 세포내 마커 발현에 대해 흐름세포측정법에 의해 분석하였다. (n=5/그룹).
도 7a에 도시된 바와 같이, 종양 크기는 PBS 처리된 마우스와 비교하여 WT(SEQ ID NO:1) 또는 H9(SEQ ID NO:2)로 처리된 마우스에서 실질적으로 더 작았다. H9_REH(SEQ ID NO:8) 및 H9_REM(REM)(SEQ ID NO:11) 투여는 PBS 처리된 마우스만큼 동등하게 종양 크기의 증가를 발생시켰다. WT_REH(SEQ ID NO:15)로 처리된 마우스는 WT(SEQ ID NO:1) 또는 H9(SEQ ID NO:2) 처리된 마우스와 비교하여 더 큰 종양 크기를 나타낸다. Foxp3+ 조절성 T(Treg) 세포에서 증가된 빈도가 REM(SEQ ID NO:11) 처리된 마우스에서 관찰되었고, PBS 마우스와 비교하여 마우스가 WT_REH(SEQ ID NO:15)로 처리된 경우 Foxp3+ Treg 세포 수에서의 3배 증가가 관찰되었다(도 7b). WT 및 H9 처리된 마우스는 IFNγ를 분비하는 CD44+CD8 기억 세포의 확장을 나타내었으나, 신규 부분 효능제 WT_REH(SEQ ID NO:15), H9_REH(SEQ ID NO:8) 또는 REM(SEQ ID NO:11) 처리는 그렇지 않았다. 도 7c는 NK 세포 및 과립구에 대한 효과를 도시한다. IFNγ 분비 CD4 CD44+ 기억 T 세포에서도 동일한 경향이 관찰되었다(도 7d). 최종적으로, WT IL-2(SEQ ID NO:1)는 CD4+ 효과기 T 세포(Teff Ki67+ 세포) 및 Treg 세포의 증식을 촉발시켰으나, WT_REH(SEQ ID NO:1)는 Treg 세포의 특이적 확장을 유도하였으나, Teff 세포는 그렇지 않았다(도 7e).
실시예 4
본 실시예는 야생형 백그라운드에서 IL-2R 부분 효능제가 생체 내에서 세포 유형 특이적 반응을 유도할 수 있음을 입증하기 위해 수행된 실험을 기재한다.
이들 실험에서, 암컷 C57/BL6 마우스에 3 × 30 μg 복막내 용량(0, 3 및 6일)의 야생형(WT) IL-2(SEQ ID NO:1), 부분 효능제 WT_REH(SEQ ID NO:15), 부분 효능제 WT_RETR(SEQ ID NO:21), 부분 효능제 WT_REK(SEQ ID NO:22) 또는 PBS 대조군을 투여하였다. 모든 사이토카인을 마우스 혈청 알부민(MSA)에 대한 N-말단 융합체로 포맷화하였다. 7일에, 비장 및 말초 림프절을 수거하고, 흐름세포측정법에 의해 분석하고, 곤충 세포에서 분비된 단백질로서 발현시켰다.
이들 실험에 사용된 IL-2 뮤테인 WT_RETR 및 WT_REK는 다음 아미노산 서열을 포함하였다:
APTSSSTKKTQLQLEHL R LDL E MILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFC T SII R TLT (WT_RETR; SEQ ID NO: 21).
APTSSSTKKTQLQLEHL R LDL E MILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFC K SIISTLT (WT_REK; SEQ ID NO: 22).
IL-2R의 부분 효능제가 림프 기관의 확대를 유도하는 것은 이의 효능제 활성에 따른다는 것이 관찰되었다(비장 및 샅고랑 림프절이 촬영되었다). 도 8a-8b에 제시된 바와 같이, 부분 효능제의 투여는 림프 기관의 확대를 유도하는 것으로 밝혀졌다. IL-2 및 부분 효능제는 NK 세포(CD3-NK1.1+)의 빈도에 거의 영향을 미치지 않은 것을 나타낸 반면, IL-2는 B 세포(CD3-CD19+)의 빈도의 감소를 나타낸 반면 부분 효능제는 그렇지 않았다. IL-2 및 부분 효능제는 T 세포(CD3+)의 빈도를 변경하지 않았지만, IL-2는 CD4 대 CD8 T 세포의 비의 감소를 발생시킨 반면, 하나의 부분 효능제인 REH는 CD4 대 CD8 T 세포 비의 증가를 야기시킨 것이 또한 관찰되었다.
실시예 5
본 실시예는 예시적인 IL-2R 부분 효능제 REH를 이용한 처리가 통상적인 CD4+ T 세포의 감소된 활성화로 FoxP3+ 조절성 T 세포의 빈도를 증가시켰음을 입증하기 위해 수행된 실험을 기재한다.
이들 실험에서, 암컷 C57/BL6 마우스에 3 × 30 μg 복막내 용량(0, 3 및 6일)의 야생형 WT IL-2(SEQ ID NO:1), 부분 효능제 WT_REH(SEQ ID NO:15), 부분 효능제 WT_RETR(SEQ ID NO:21), 부분 효능제 WT_REK(SEQ ID NO:22) 또는 PBS 대조군을 투여하였다. 모든 사이토카인은 마우스 혈청 알부민(MSA)에 대한 N-말단 융합체로서 포맷화되었고, 곤충 세포에서 분비된 단백질로서 발현되었다. 7일에, 비장 및 말초 림프절을 수거하고, 흐름세포측정법에 의해 분석하여 Treg(CD25+FoxP3+)의 빈도 및 통상적인 CD4+ T 세포(CD25+FoxP3-)의 활성화를 평가하였다.
IL-2R 부분 효능제 REH가 CD25+ 통상 세포를 유도하지 않고 CD25+FoxP3+ 조절성 T 세포의 빈도를 증가시킨 것이 관찰되었다.
실시예 6
본 실시예는 IL-2R 부분 효능제 REH로 처리된 마우스로부터의 Treg가 CD4+ 통상적 T 세포의 증식을 억제하는 것을 입증하기 위해 수행된 실험을 기재한다.
이들 실험에서, 암컷 B6.FoxP3 GFP 마우스에 3 × 30 μg 복막내 용량(0, 3 및 6일)의 야생형 WT(SEQ ID NO:1), 부분 효능제 WT_REH(SEQ ID NO:15) 또는 PBS 대조군을 투여하였다. 7일에, 비장 및 림프절을 수거하고, CD4 T 세포를 자기 분류(MACS)에 의해 분리하였다. 정제된 CD4+ T 세포를 GFP 발현에 기초하여 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 분류하여 Treg(GFP+) 및 Tcon(GFP-)을 분리하였다. 사이토카인 처리된 마우스로부터의 FoxP3 GFP+ 세포를 PBS 처리된 마우스로부터의 CellTrace Violet 표지된 Tcon 및 aCD3aCD28 코팅된 비드(1:1의 비드 대 Tcon 비)와 함께 공동 배양하였다. CTV 로딩된 Tcon의 증식을 72시간 후에 평가하였다.
REH 처리된 마우스로부터의 FoxP3+ 세포는 FoxP3- 효과기 세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 관찰되었다.
실시예 7
본 실시예는 IL-2R 부분 효능제 REH가 CD8+ T 세포 증식을 지원하지만 IFNγ 생성은 지원하지 않음을 예시하기 위해 수행된 실험을 기재한다.
이들 실험에서, CD8+ T 세포를 자기 분리(MACS)에 의해 C57/BL6 마우스의 비장 및 림프절로부터 분리시키고, CellTrace Violet으로 로딩하고, 3일 동안 20 nM WT(SEQ ID NO:1) 또는 WT_REH(SEQ ID NO:15)의 존재 또는 부재하에서 aCD3aCD28 코팅된 비드와 공동 배양하였다. 수거 4시간 전에, 추가 사이토카인 분비를 방지하기 위해 GolgiStop을 세포에 첨가하였다. 72시간에, 세포를 고정시키고, 투과화시키고, 인터페론 감마(IFNγ)에 대한 항체로 염색하였다.
IL-2R 부분 효능제 REH 및 IL-2 둘 모두는 증식을 지원할 수 있지만, IL-2만 세포를 증식시킴으로써 강력한 IFNγ 생성을 유도할 수 있는 것으로 관찰되었다.
실시예 8
본 실시예는 IL-2R 부분 효능제 REH의 처리 및 공동 처리가 설치류 EAE 모델(뇌 염증의 동물 모델)에서 다양한 자가면역 증상을 보호한다는 것을 입증하기 위해 수행된 실험을 기재한다.
이들 실험에서, B6 마우스는 10 μg의 MSA 융합 WT_REH(SEQ ID NO:15)로 전처리(-7, -4, -1일) 또는 공동 처리(0, 3 및 7일)되었다. 0일에, 마우스를 완전 프로인트 애쥬번트(CFA) 중 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG 35-55) 및 백일해 독소(PTX)로 면역화시킨 후, 2일째에 PTX 부스트를 실시하였다. 질병 스코어 진행은 체중 감소 및 질병 스코어에 의해 추적되었다. 질병 스코어는 다음과 같았다: 0- 건강함; 1- 파행 꼬리; 2- 부분적인 뒷다리 마비; 3- 완전한 뒷다리 마비; 4- 전신 마비; 5-사망.
IL-2R 부분 효능제 REH 전처리는 보호성이면서 REH 공동 처리는 REH 처리된 마우스에서 Treg의 동역학을 검사하는 이전 실험과 일치하는 방식으로 질병 발병을 지연시키는 것으로 관찰되었다.
본 발명의 개시의 특정 대안이 개시되었지만, 다양한 변형 및 조합이 가능하며 첨부된 청구항의 진정한 사상 및 범위 내에서 고려되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본원에 제시된 정확한 요약 및 개시에 대한 제한의 의도는 없다.
SEQUENCE LISTING <110> THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY Garcia, Christopher K Majri, Sonia S Glassman, Caleb R Su, Leon Lih-Ren <120> PARTIAL AGONISTS OF INTERLEUKIN-2 <130> 078430-503001WO <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> WT IL-2 <400> 1 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> H9 IL-2 <400> 2 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe 65 70 75 80 Asp Pro Arg Asp Val Val Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 3 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 mutein H9_REA <400> 3 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Arg Leu Asp Leu Glu Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe 65 70 75 80 Asp Pro Arg Asp Val Val Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Ala Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 4 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 mutein H9_REC <400> 4 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Arg Leu Asp Leu Glu Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe 65 70 75 80 Asp Pro Arg Asp Val Val Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Cys Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 5 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 mutein H9_RED <400> 5 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Arg Leu Asp Leu Glu Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe 65 70 75 80 Asp Pro Arg Asp Val Val Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Asp Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 6 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 mutein H9_REE <400> 6 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Arg Leu Asp Leu Glu Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn 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Phe Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gly Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 8 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 mutein H9_REH <400> 8 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Arg Leu Asp Leu Glu Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe 65 70 75 80 Asp Pro Arg Asp Val Val Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys His Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 9 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 mutein H9_REI 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Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe 65 70 75 80 Asp Pro Arg Asp Val Val Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Lys Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 11 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 mutein H9_REM <400> 11 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Arg Leu Asp Leu Glu Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe 65 70 75 80 Asp Pro Arg Asp Val Val Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Met Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 12 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 mutein H9_RER <400> 12 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Arg Leu Asp Leu Glu Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe 65 70 75 80 Asp Pro Arg Asp Val Val Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Met Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 13 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 mutein H9_RER <400> 13 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Arg Leu Asp Leu Glu Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe 65 70 75 80 Asp Pro Arg Asp Val Val Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Arg Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 14 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 mutein H9_RES <400> 14 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Arg Leu Asp Leu Glu Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe 65 70 75 80 Asp Pro Arg Asp Val Val Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Ser Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 15 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 mutein WT_REH <400> 15 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Arg Leu Asp Leu Glu Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys His Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 16 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 mutein WT_REM <400> 16 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Arg Leu Asp Leu Glu Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Met Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 17 <211> 149 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human IL-2, GenBank NP_000577.2 <400> 17 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Phe Tyr 50 55 60 Met Pro Lys Ala Thr Glu Leu His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu 65 70 75 80 Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His 85 90 95 Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Val Ile Val Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 115 120 125 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 130 135 140 Ile Ser Thr Leu Thr 145 <210> 18 <211> 167 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> murine IL-2 <400> 18 Met Tyr Ser Met Gln Leu Ala Ser Cys Val Thr Leu Thr Leu Val Leu 1 5 10 15 Leu Val Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala 20 25 30 Glu Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu 35 40 45 Glu Gln Leu Leu Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn 50 55 60 Tyr Arg Asn Leu Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Pro Gln Ala Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu Leu 85 90 95 Gly Pro Leu Arg His Val Leu Asp Leu Thr Gln Ser Lys Ser Phe Gln 100 105 110 Leu Glu Asp Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val Val 115 120 125 Leu Lys Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp Glu Ser 130 135 140 Ala Thr Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys Gln Ser 145 150 155 160 Ile Ile Ser Thr Ser Pro Gln 165 <210> 19 <211> 149 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> mature murine IL-2 <400> 19 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala Glu Ala Gln Gln 1 5 10 15 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu Glu Gln Leu Leu 20 25 30 Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn Tyr Arg Asn Leu 35 40 45 Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Leu Pro Lys Gln Ala 50 55 60 Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu Leu Gly Pro Leu 65 70 75 80 Arg His Val Leu Asp Leu Thr Gln Ser Lys Ser Phe Gln Leu Glu Asp 85 90 95 Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val Val Lys Leu Lys 100 105 110 Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp Glu Ser Ala Thr 115 120 125 Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys Gln Ser Ile Ile 130 135 140 Ser Thr Ser Pro Gln 145 <210> 20 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutein IL-2 <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> Xaa = Leu or Arg <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> residue 18 can be either present or absent <220> <221> VARIANT <222> (22)..(22) <223> Xaa = Gln or Glu <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> residue 22 can be either present or absent <220> <221> VARIANT <222> (80)..(80) <223> Xaa = Leu or Phe or Val <220> <221> misc_feature <222> (80)..(80) <223> residue 80 can be either present or absent <220> <221> VARIANT <222> (81)..(81) <223> Xaa = Arg or Ile or Thr or Asp <220> <221> misc_feature <222> (81)..(81) <223> residue 81 can be either present or absent <220> <221> VARIANT <222> (85)..(85) <223> Xaa = Leu or Val <220> <221> misc_feature <222> (85)..(85) <223> residue 85 can be either present or absent <220> <221> VARIANT <222> (86)..(86) <223> Xaa = Ile or Val <220> <221> misc_feature <222> (86)..(86) <223> residue 86 can be either present or absent <220> <221> VARIANT <222> (92)..(92) <223> Xaa = Ile or Phe <220> <221> misc_feature <222> (92)..(92) <223> residue 92 can be either present or absent <220> <221> VARIANT <222> (126)..(126) <223> Xaa = Gln or His or Met or Lys or Cys or Asp or Glu or Gly or Ile or Arg or Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (126)..(126) <223> residue 126 can be either present or absent <400> 20 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Xaa Leu Asp Leu Xaa Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Xaa 65 70 75 80 Xaa Pro Arg Asp Xaa Xaa Ser Asn Ile Asn Val Xaa Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Xaa Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 21 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 mutein WT_ RETR <400> 21 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Arg Leu Asp Leu Glu Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Thr Ser Ile 115 120 125 Ile Arg Thr Leu Thr 130 <210> 22 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 mutein WT_REK <400> 22 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Arg Leu Asp Leu Glu Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Lys Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130

Claims (49)

  1. (a) SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 IL-2 폴리펩티드와 비교하여 인터루킨 2 수용체 γ(IL-2Rγ)에 대한 감소된 결합 친화성; 및
    (b) SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 IL-2 폴리펩티드와 비교하여 15-95%의 Emax를 갖는,
    인터루킨 2(IL-2) 뮤테인.
  2. 제1항에 있어서, 뮤테인이,
    (i) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 따라 넘버링된 L80F, R81D, L85V, I86V 및 I92F로부터 선택된, SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 비해 IL-2Rβ 결합 친화성을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환; 및/또는
    (ii) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열에 따라 넘버링된 (A) L18R 및 Q22E 및 (B) 아미노산 위치 126으로부터 선택된, IL-2Rγ 수용체 결합 친화성을 감소시키고 SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 15-95%의 Emax를 발생시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는,
    IL-2 뮤테인.
  3. 제2항에 있어서, SEQ ID NO:2의 위치 126에서의 아미노산 치환이 Q126A, Q126C, Q126D, Q126E, Q126G, Q126H, Q126I, Q126K, Q126M, Q126R, Q126S 또는 Q126T로 구성된 군으로부터 선택되는 IL-2 뮤테인.
  4. 제3항에 있어서, 뮤테인이 아미노산 치환 Q126H, Q126K 또는 Q126M을 포함하는 IL-2 뮤테인.
  5. 제3항에 있어서, 뮤테인이 아미노산 치환 Q126H를 포함하는 IL-2 뮤테인.
  6. (a) 인터루킨 2 수용체 γ(IL-2Rγ)에 대한 감소된 결합 친화성, 및 (b) SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 15-95%의 Emax를 갖는 인터루킨 2(IL-2) 뮤테인.
  7. 제6항에 있어서, 뮤테인이 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 따라 넘버링된 (A) L18R 및 Q22E 및 (B) 아미노산 위치 126으로부터 선택된, IL-2Rγ 수용체 결합 친화성을 감소시키고 SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 15-95%의 Emax를 발생시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 IL-2 뮤테인.
  8. 제7항에 있어서, 뮤테인이 Q126A, Q126C, Q126D, Q126E, Q126G, Q126H, Q126I, Q126K, Q126M, Q126R, Q126S 또는 Q126T로 구성된 군으로부터 선택되는 SEQ ID NO:1의 위치 126에서의 아미노산 치환을 포함하는 IL-2 뮤테인.
  9. 제8항에 있어서, 뮤테인이 아미노산 치환 Q126H, Q126K 또는 Q126M을 포함하는 IL-2 뮤테인.
  10. 제9항에 있어서, 뮤테인이 아미노산 치환 Q126H를 포함하는 IL-2 뮤테인.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 뮤테인이 반감기를 증가시키도록 구조적으로 변형된 IL-2 뮤테인.
  12. 제11항에 있어서, 상기 변형이 인간 Fc 항체 단편에 대한 융합, 알부민에 대한 융합 및 PEG화(PEGylation)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 포함하는 IL-2 뮤테인.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뮤테인이 조절성 T(Treg) 세포의 증식을 증가시키고/시키거나 잠재적 염증성 T 세포의 최소 증식을 유도하는 IL-2 뮤테인.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뮤테인이 Treg 세포의 확장을 유발하고, 잠재적 염증성 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포 또는 과립구의 확장을 촉진하지 않는 IL-2 뮤테인.
  15. 제14항에 있어서, 뮤테인이 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 비해 잠재적 염증성 T 세포의 증식을 더 적게 유도하는 IL-2 뮤테인.
  16. 제15항에 있어서, 상기 잠재적 염증성 T 세포가 CD4+ IFNγ+ T 세포이거나, CD8+IFNγ+ T 세포인 IL-2 뮤테인.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 뮤테인이 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 비해 Treg 세포의 증식을 적어도 3배만큼 증가시키고/시키거나, IFNγ 분비를 더 적게 유도하는 IL-2 뮤테인.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뮤테인이 CD8+ T 세포 및/또는 다른 염증성 면역 세포 서브셋으로부터 IFNγ 분비를 유도하지 않는 IL-2 뮤테인.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 뮤테인이 SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 70-95%의 Emax를 갖는 IL-2 뮤테인.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 IL-2 뮤테인을 인코딩하는 핵산.
  21. 제20항의 핵산을 포함하는 벡터.
  22. 제20항의 핵산 또는 제21항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  23. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 IL-2 뮤테인 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 멸균 약학적 조성물.
  24. (a) 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 IL-2 뮤테인; (b) 제20항의 핵산; (c) 제21항의 벡터; (d) 제22항의 숙주 세포; 및/또는 (e) 제23항의 약학적 조성물을 포함하는 주사기.
  25. (a) 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 IL-2 뮤테인; (b) 제20항의 핵산; (c) 제21항의 벡터; (d) 제22항의 숙주 세포; 및/또는 (e) 제23항의 약학적 조성물을 포함하는 카테터.
  26. (a) (i) 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 IL-2 뮤테인; (ii) 제20항의 핵산; (iii) 제21항의 벡터; (iv) 제22항의 숙주 세포; (v) 제23항의 멸균 약학적 조성물; (vi) 제24항의 주사기; 및/또는 (vii) 제25항의 카테터 중 하나 이상; 및
    (b) (i) 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 IL-2 뮤테인; (ii) 제20항의 핵산; (iii) 제21항의 벡터; (iv) 제22항의 숙주 세포; (v) 제23항의 멸균 약학적 조성물; (vi) 제24항의 주사기; 및/또는 (vii) 제25항의 카테터를 사용하기 위한 서면 설명서를 포함하는,
    키트.
  27. (a) 치료적 유효량의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 IL-2 뮤테인; (b) 제20항의 핵산; (c) 제21항의 벡터; (d) 제22항의 숙주 세포; 및/또는 (e) 제23항의 약학적 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질병의 치료를 필요로 하는 개체에서 자가면역 질병을 치료하기 위한 방법.
  28. 제27항에 있어서, 자가면역 질병이 류마티스 관절염, 인슐린-의존성 당뇨병, 용혈성 빈혈, 류마티스 열, 갑상샘염, 크론병, 중증근육무력증, 사구체신염, 자가면역 간염, 다발경화증, 원형탈모증, 건선, 백반증, 이영양성 수포성 표피박리증, 전신 홍반 루푸스 및 이식편 대 숙주병으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 자가면역 질병이 이식편 대 숙주병인 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 뮤테인을 특정 세포 유형에 표적화하는 항체와 조합된 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 IL-2 뮤테인 또는 제23항의 약학적 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 세포 유형이 조절성 T(Treg) 세포인 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 항체가 IL-2 뮤테인에 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결되는 방법.
  33. 뮤테인의 생성에 적합한 조건하에서 제22항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 IL-2 뮤테인을 생성시키기 위한 방법.
  34. 제33항에 있어서, 생성된 IL-2 뮤테인을 분리시키고/시키거나 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 반감기를 증가시키도록 IL-2 뮤테인을 구조적으로 변형시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 변형이 인간 Fc 항체 단편에 대한 융합, 알부민에 대한 융합 및 PEG화로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변경을 포함하는 방법.
  37. 인터루킨 2 수용체 γ(IL-2Rγ)를 발현하는 세포와 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 IL-2 뮤테인을 접촉시키는 것을 포함하는, 잠재적 염증성 T 세포의 증식을 방지하고/하거나 CD8+ T 세포 또는 다른 염증성 면역 세포 서브셋으로부터 IFNγ의 분비를 방지하기 위한 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 잠재적 염증성 T 세포가 CD4+CD44+IFNγ+ T 세포이거나, CD8+CD44+IFNγ+ T 세포인 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 방법이 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 수행되는 방법.
  40. 조절성 T(Treg) 세포를 (i) SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 인터루킨 2 수용체 γ(IL-2Rγ)에 대한 감소된 결합 친화성, 및 (ii) SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 0-50%의 Emax를 갖는 인터루킨 2(IL-2) 뮤테인과 접촉시키는 것을 포함하는 Treg 세포의 증식을 감소시키기 위한 방법.
  41. 제40항에 있어서, IL-2 뮤테인이,
    (i) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 따라 넘버링된 L80F, R81D, L85V, I86V 및 I92F로부터 선택된, SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 비해 IL-2Rβ 결합 친화성을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환; 및
    (ii) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열에 따라 넘버링된 (A) L18R 및 Q22E 및 (B) 아미노산 위치 126으로부터 선택된, IL-2Rγ 수용체 결합 친화성을 감소시키고 SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 0-50%의 Emax를 발생시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는,
    방법.
  42. 조절성 T(Treg) 세포를 (i) SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 IL-2Rγ에 대한 감소된 결합 친화성, 및 (ii) SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 0-50%의 Emax를 갖는 IL-2 뮤테인과 접촉시키는 것을 포함하는 Treg 세포의 증식을 감소시키기 위한 방법.
  43. 제42항에 있어서, 뮤테인이 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 따라 넘버링된 (A) L18R 및 Q22E 및 (B) 아미노산 위치 126으로부터 선택된, IL-2Rγ 수용체 결합 친화성을 감소시키고 SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 비교하여 0-50%의 Emax를 발생시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 방법.
  44. 제41항 또는 제43항에 있어서, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 위치 126에서의 아미노산 치환이 Q126A, Q126C, Q126D, Q126E, Q126G, Q126H, Q126I, Q126K, Q126M, Q126R, Q126S 또는 Q126T로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 뮤테인이 아미노산 치환 Q126H, Q126K 또는 Q126M을 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 뮤테인이 아미노산 치환 Q126H를 포함하는 방법.
  47. 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 뮤테인을 Treg 세포에 표적화하는 하나 이상의 항체와 함께 뮤테인을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 항체가 뮤테인에 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결되는 방법.
  49. 제39항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 수행되는 방법.
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