TW202034945A - 一種人白細胞介素２變體或其衍生物 - Google Patents

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Abstract

本公開涉及一種人白細胞介素2變體或其衍生物。具體而言，本公開涉及具有一個或多個胺基酸突變的人白細胞介素-2(IL-2)變體或其衍生物，該IL-2變體或其衍生物與野生型IL-2相比，具有增加的穩定性，並具有用作免疫治療劑的改善特性。另外，本公開還涉及包含該人IL-2變體或其衍生物的免疫綴合物、醫藥組成物、編碼其的多核苷酸分子、載體、宿主細胞和製備方法，以及該IL-2變體或其衍生物、包含其的免疫綴合物或醫藥組成物的製藥用途。

Description

一種人白細胞介素2變體或其衍生物
本公開涉及具有一個或多個胺基酸突變的人白細胞介素-2(IL-2)變體或其衍生物，具體地，該人IL-2變體或其衍生物穩定性增加，並作為免疫治療劑具有改善的特性。本公開還涉及包含該人IL-2變體或其衍生物的免疫綴合物、編碼其的多核苷酸分子、載體、宿主細胞和製備方法，以及包含該IL-2變體或其衍生物、免疫綴合物的醫藥組成物及其治療方法、製藥用途。
人白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)，也稱為T細胞生長因子(TCGF)，基因位於4號染色體(4q27)，包括共7kb的序列，由133個胺基酸組成，分子量約15kD。1976年和1977年，Doris Morgan，Francis Ruscetti，Robert Gallo和Steven Gillis，Kendal Smith等分別發現活化後的T細胞培養液可以促進T細胞增殖。之後培養液中的刺激因子被純化並被鑒定為單一的蛋白質即IL-2。
最初的體外細胞實驗表明T細胞在藉由TCR和CD28活化之後，可以分泌IL-2並在細胞表面表達IL-2受體(IL-2R)。IL-2和其受體的 結合可以引起T細胞的增殖和使T細胞產生效應。這一模型使得IL-2成為T細胞免疫反應中起到中心作用的一個分子。不過隨後的體內實驗發現在敲除IL-2或其受體後，動物產生了自身免疫。隨後的實驗表明IL-2不僅可以激活如T細胞和NK細胞的效應細胞，還可以激活調節性T細胞(Treg)，從而抑制過量的針對自身的免疫。
IL-2藉由IL-2R發生作用。IL-2R包括三個亞基，IL-2Rα(即CD25)、IL-2Rβ(即CD122)和IL-2Rγ(即CD132)。三個亞基可以形成三種受體形式：高結合力受體包含所有三個亞基IL-2Rα/β/γ，中結合力受體包含IL-2Rβ/γ，低結合力受體為IL-2Rα。其中，IL-2Rβ和IL-2Rγ是IL-2激活下游信號通路所必需的，當IL-2同時結合IL-2Rβ和IL-2Rγ時，兩個受體亞基形成異源二聚體，磷酸化細胞內的STAT5，進入細胞核導致相應的基因轉錄和表達；IL-2Rα並非信號傳導所必需，但可以促進IL-2與IL-2Rβ和IL-2Rγ的結合。IL-2Rγ在所有免疫細胞中均有表達；IL-2Rβ在CD8+ T細胞、NK細胞、Treg中均有表達，而且在T細胞被激活後還會提升表達水平；IL-2Rα在Treg持續高表達，在被激活的CD8+ T細胞中會有短暫表達，隨即下調表達水平。
IL-2主要由活化的T細胞，尤其是CD4+輔助T細胞合成。它刺激T細胞的增殖和分化，誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的生成以及外周血淋巴細胞分化成細胞毒性細胞和淋巴因子激活的殺傷(LAK)細胞，促進T細胞表達細胞因子和細胞溶解分子，促進B細胞的增殖和分化以及藉由B細胞的免疫球蛋白合成，並刺激天然殺傷(NK)細胞的生成、增殖和活化。
IL-2在體內擴充淋巴細胞群體和提高這些細胞的效應器功能的能力使得其具有抗腫瘤效果，IL-2免疫療法成為某些轉移性癌症患者的治療選擇，目前，高劑量IL-2已被批准用於治療轉移性腎細胞癌和惡性黑素瘤。
已有的IL-2變體研究顯示，在38、42、45、62、68位中的至少四個位點具有突變的IL-2變體，對Treg的刺激作用降低(WO2012062228)；同時包含72、42、45位突變的IL-2變體，對高結合力IL-2受體的結合力降低或消除，但仍保留對中等結合力IL-2受體的結合力(CN201280017730.1)；在91、126位突變的變體，所述突變使得IL-2能與CD25(IL2Rα)結合，但不激活Treg上的IL-2R(US8906356)；至少包含一個E15、H16、Q22、D84、N88或E95突變的IL-2R，用於治療受試者中移植物抗宿主病(US9732134)；至少包含R38W的IL-2變體能降低血管通透性，治療實體瘤(US7371371；US7514073；US8124066；US7803361)；IL-2變體與Fc的融合蛋白治療疾病，所述IL-2存在N88R突變(WO2016014428)；hIL-2-N88R可以選擇性地活化T細胞而非天然殺傷細胞並且能夠降低肺中的轉移形成(WO 99/60128)；20、88或126位突變的IL-2可以製備用於治療和/或預防自身免疫性疾病的藥物(WO2009135615)；嵌合多肽，包含連接在免疫細胞表面蛋白靶向配體上的細胞因子，其中細胞因子可以為IL-2的變體(WO2017136818)等。
然而，本領域中仍然缺少具有更高穩定性的IL-2變體。提供這樣的IL-2變體及其衍生物，以增強IL-2的治療有效性，是本領域中亟需解決的問題。
本公開提供具有一個或多個胺基酸突變的IL-2變體或其衍生物，及IL-2變體或其衍生物的綴合物、編碼多肽和核酸分子、載體、宿主細胞、醫藥組成物、製藥用途和治療方法。
第一方面，本公開提供IL-2變體或其衍生物，其是在野生型人IL-2的第11、26、27、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、70、71、72、78、82、88、132位具有一個或多個胺基酸突變。本公開對於突變的表示方式為abc，其中a為突變前的胺基酸類型，b為突變位點，c為突變後的胺基酸類型。例如，N26S，即第26位由天冬醯胺(N)突變為絲胺酸(S)；N26為第26位的天冬醯胺(N)發生突變；26S為第26位突變為絲胺酸(S)。
具體地，本公開提供的IL-2變體或其衍生物含有以下位點上的一個或多個胺基酸突變或其任意組合：26、29、30、71、11、132、70、82、27、78位。在一些實施方案中，突變前的胺基酸(例如野生型人IL-2中的)為：26位為天冬醯胺(N)、29位為天冬醯胺(N)、30位為天冬醯胺(N)、71位為天冬醯胺(N)、11位為穀胺醯胺(Q)、132位為亮胺酸(L)、70位為亮胺酸(L)、82位為脯胺酸(P)、27位為甘胺酸(G)、78位為***酸(F)。在一些實施方案中，IL-2變體或其衍生物的胺基酸突變方式為包含以下的任一或任意組合：26位突變為Gln(Q)、29位突變為絲胺酸(S)、30位突變為Ser(S)、71位突變為Gln(Q)，11、132、70、82、27、78位突變為Cys(C)。
在一些具體實施方案中，IL-2變體或其衍生物包含第一類突變，該第一類突變為如下(1)-(7)任一所示或其任意組合：
(1)N26Q，
(2)N29S，
(3)N30S，
(4)N71Q，
(5)Q11C和L132C，
(6)L70C和P82C，和
(7)G27C和F78C。
在一些具體實施方案中，上述IL-2變體或其衍生物具有增加的穩定性，例如，增加的脫胺穩定性和/或熱穩定性；具體地，本公開提供的第一類突變是包含該突變的IL-2變體或其衍生物與野生型IL-2相比具有增加的穩定性，包括但不限於，具有增加的脫胺穩定性和/或熱穩定性。
在另一方面，本公開提供的IL-2變體或其衍生物還含有如下位點上的一個或多個胺基酸突變或其任意組合：29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、72。在一些實施方案中，突變前的胺基酸(例如野生型人IL-2中的)為：29位為天冬醯胺(N)、30位為天冬醯胺(N)、31位為酪胺酸(Y)、32位為賴胺酸(K)、33位為天冬醯胺(N)、34位為脯胺酸(P)、35位為賴胺酸(K)、36位為亮胺酸(L)、37位為蘇胺酸(T)、38位為精胺酸(R)、39位為甲硫胺酸(M)、40位為亮胺酸(L)、41位為蘇胺酸(T)、42位為***酸(F)、43位 為賴胺酸(K)、44位為***酸(F)、45位為酪胺酸(Y)、72位為亮胺酸(L)。
在一些具體實施方案中，IL-2變體或其衍生物還包含第二類突變，該第二類突變選自(8)-(11)中任一項所示的突變或(8)-(10)的任意組合：
(8)F42A，
(9)Y45A，
(10)L72G，和
(11)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突變為QSMHIDATL。
一些實施方案中，該第二類突變能夠消除或降低IL-2對高親和力受體(IL-2Rα/β/γ)的親和力，並保留IL-2對中等親和力受體(IL-2Rβ/γ)的親和力；第二類突變能夠保留IL-2對效應細胞(如NK和T細胞)的誘導增殖和激活功能，但降低IL-2對Treg細胞的誘導增殖和激活功能。
在第三方面，本公開提供的IL-2變體或其衍生物含有如下位點上的一個或多個胺基酸突變或其任意組合：20、88、126。一些實施方案中，突變前的胺基酸(例如野生型人IL-2中的)為：20位為天冬胺酸(D)、88位為天冬醯胺(N)、126位為穀胺醯胺(Q)。在一些實施方案中，IL-2變體或其衍生物的胺基酸突變方式為包含以下的任一項或其任意組合：20位突變為丙胺酸(A)或組胺酸(H)或異亮胺酸(I)或甲硫胺酸(M)或谷胺酸(E)或絲胺酸(S)或纈胺酸(V)或色胺酸(W)、88位突變為丙胺酸(A)或精胺酸(R)或谷胺酸(E)或亮胺酸(L)或***酸(F)或甘胺酸(G)或異亮胺酸(1)或甲硫胺酸(M)或絲胺酸(S)或Y或纈 胺酸(V)、126位突變為天冬醯胺(N)或亮胺酸(L)或P或***酸(F)或甘胺酸(G)或異亮胺酸(I)或甲硫胺酸(M)或精胺酸(R)或絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)或酪胺酸(Y)或纈胺酸(V)。
在一些具體實施方案中，IL-2變體或其衍生物還包含第三類突變，其選自(12)-(14)任一項所示的突變或其任意組合：
(12)N88突變為A、R、E、L、F、G、I、M、S、Y、V或D，
(13)D20突變為A、H、I、M、E、S、V、W或Y，(2)
(14)Q126突變為N、L、P、F、G、I、M、R、S、T、Y、V。
一些實施方案中，該第三類突變能夠降低IL-2對高親和力受體(IL-2Rα/β/γ)和中等親和力受體(IL-2Rβ/γ)的親和力，但對高親和力受體的親和力比對中等親和力受體的親和力降低得更多；第三類突變能夠保留IL-2對Treg的誘導增殖和激活功能，但消除或降低IL-2對效應細胞(如NK和T細胞)的誘導增殖和激活功能。
一些實施方案中，IL-2變體或其衍生物含有如上所述的第一類突變和第二類突變，或含有第一類突變和第三類突變。
一些實施方案中，IL-2變體或其衍生物中的第一類突變選自(15)-(17)，或(15)-(17)中的任一項與前述(5)-(7)中的任一項的組合：
(15)N26Q和N29S，
(16)N26Q、N29S和N71Q，和
(17)N26Q和N30S；
第二類突變選自(18)-(20)和(11)中的任一項：
(18)F42A和Y45A，
(19)F42A和L72G，和
(20)Y45A和L72G；
第三類突變為N88R或N88G或N88I或N88D。
一些實施方案中，IL-2變體或其衍生物包含選自(21)-(29)中任一項所示的突變：
(21)N26Q、N29S、F42A、N71Q和L72G，
(22)N26Q、N29S和N88R，
(23)N26Q、N29S、F42A和L72G，
(24)N26Q、N30S、F42A和L72G，
(25)Q11C、N26Q、N30S、F42A、L72G和L132C，
(26)N26Q、N30S、F42A、L70C、L72G和P82C，
(27)N26Q、G27C、N30S、F42A、L72G和F78C，
(28)N29S、F42A和L72G，和
(29)Q11C、29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突變為QSMHIDATL和L132C。
除上述(1)-(29)外，本公開還提供如下IL-2變體，其具有(1)-(20)中突變位點、突變類型的任意組合方式，包括但不限於如下的(30)-(208)：
(30)N26Q/Q11C/L132C；
(31)N26Q/L70C/P82C；
(32)N26Q/G27C/F78C；
(33)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突變為QSMHIDATL；
(34)N26Q/F42A/Y45A；
(35)N26Q/F42A/L72G；
(36)N26Q/Y45A/L72G；
(37)N26Q/F42A/Y45A/L72G；
(38)Q11C/N30S/L132C；
(39)N30S/L70C/P82C；
(40)G27C/N30S/F78C；
(41)N30S/F42A/Y45A；
(42)N30S/F42A/L72G；
(43)N30S/Y45A/L72G；
(44)N30S/F42A/Y45A/L72G；
(45)N29S/N30S/F42A/L72G；
(46)Q11C/F42A/Y45A；
(47)Q11C/F42A/L72G/L132C；
(48)Q11C/Y45A/L72G/L132C；
(49)Q11C/F42A/Y45A/L72G/L132C；
(50)Q11C/N29S/F42A/L72G/L132C；
(51)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突變為QSMHIDATL/L70C/P82C；
(52)F42A/Y45A/L70C/P82C；
(53)F42A/L70C/L72G/P82C；
(54)Y45A/L70C/L72G/P82C；
(55)F42A/Y45A/L70C/L72G/P82C；
(56)N29S/F42A/L70C/L72G/P82C；
(57)G27C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突變為QSMHIDATL/F78C；
(58)G27C/F42A/Y45A/F78C；
(59)G27C/F42A/L72G/F78C；
(60)G27C/Y45A/L72G/F78C；
(61)G27C/F42A/Y45A/L72G/F78C；
(62)G27C/N29S/F42A/L72G/F78C；
(63)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突變為QSMHIDATL/Y45A；
(64)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突變為QSMHIDATL/L72G；
(65)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突變為QSMHIDATL/Y45A/L72G；
(66)N26Q/N30S/Q11C/L132C；
(67)N26Q/N30S/L70C/P82C；
(68)N26Q/G27C/N30S/F78C；
(69)N26Q/N30S/F42A/Y45A；
(70)N26Q/N30S/F42A/L72G；
(71)N26Q/N30S/Y45A/L72G；
(72)N26Q/N30S/F42A/Y45A/L72G；
(73)N26Q/N29S/N30S/F42A/L72G；
(74)N26Q/N29S/N30S；
(75)N26Q/N29S/Q11C/L132C；
(76)N26Q/N29S/L70C/P82C；
(77)N26Q/N29S/G27C/F78C；
(78)N26Q/N29S/F42A/Y45A；
(79)N26Q/N29S/Y45A/L72G；
(80)N26Q/N29S/F42A/Y45A/L72G；
(81)Q11C/N29S/N30S/L132C；
(82)N29S/N30S/L70C/P82C；
(83)G27C/N29S/N30S/F78C；
(84)N29S/N30S/F42A/Y45A；
(85)N29S/N30S/F42A/L72G；
(86)N29S/N30S/Y45A/L72G；
(87)N29S/N30S/F42A/Y45A/L72G；
(88)Q11C/N29S/F42A/Y45A/L132C；
(89)Q11C/N29S/F42A/L72G/L132C；
(90)Q11C/N29S/Y45A/L72G/L132C；
(91)Q11C/N29S/F42A/Y45A/L72G/L132C；
(92)N29S/F42A/Y45A/L70C/P82C；
(93)N29S/F42A/L70C/L72G/P82C；
(94)N29S/Y45A/L70C/L72G/P82C；
(95)N29S/F42A/Y45A/L70C/L72G/P82C；
(96)G27C/N29S/F78C/F42A/Y45A；
(97)G27C/N29S/F78C/F42A/L72G；
(98)G27C/N29S/F78C/Y45A/L72G；
(99)G27C/N29S/F78C/F42A/Y45A/L72G；
(100)N29S/F42A/Y45A；
(101)N29S/F42A/L72G；
(102)N29S/Y45A/L72G；
(103)N29S/F42A/Y45A/L72G；
(104)Q11C/N29S/L132C；
(105)N29S/L70C/P82C；
(106)G27C/N29S/F78C；
(107)N29S/N30S；
(108)N26Q/N29S；
(109)N26Q/N71Q；
(110)N30S/N71Q；
(111)Q11C/N71Q/L132C；
(112)L70C/N71Q/P82C；
(113)G27C/N71Q/F78C；
(114)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突變為QSMHIDATL/N71Q；
(115)F42A/Y45A/N71Q；
(116)F42A/N71Q/L72G；
(117)Y45A/N71Q/L72G；
(118)N26Q/N30S/F42A/N71Q/L72G；
(119)Q11C/N26Q/N30S/F42A/N71Q/L72G/L132C；
(120)N26Q/N30S/F42A/L70C/N71Q/L72G/P82C；
(121)N26Q/G27C/N30S/F42A/N71Q/L72G/F78C；
(122)N29S/F42A/N71Q/L72G；
(123)N26Q/N30S/N71Q；
(124)N26Q/Q11C/N71Q/L132C；
(125)N26Q/L70C/N71Q/P82C；
(126)N26Q/G27C/N71Q/F78C；
(127)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突變為QSMHIDATL/N71Q；
(128)N26Q/F42A/Y45A/N71Q；
(129)N26Q/F42A/N71Q/L72G；
(130)N26Q/Y45A/N71Q/L72G；
(131)N26Q/F42A/Y45A/N71Q/L72G；
(132)Q11C/N30S/N71Q/L132C；
(133)N30S/L70C/N71Q/P82C；
(134)G27C/N30S/N71Q/F78C；
(135)N30S/F42A/Y45A/N71Q；
(136)N30S/F42A/N71Q/L72G；
(137)N30S/Y45A/N71Q/L72G；
(138)N30S/F42A/Y45A/N71Q/L72G；
(139)N29S/N30S/F42A/N71Q/L72G；
(140)Q11C/F42A/Y45A/N71Q；
(141)Q11C/F42A/N71Q/L72G/L132C；
(142)Q11C/Y45A/N71Q/L72G/L132C；
(143)Q11C/F42A/Y45A/N71Q/L72G/L132C；
(144)Q11C/N29S/F42A/N71Q/L72G/L132C；
(145)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突變為QSMHIDATL/L70C/N71Q/P82C；
(146)F42A/Y45A/L70C/N71Q/P82C；
(147)F42A/L70C/N71Q/L72G/P82C；
(148)Y45A/L70C/N71Q/L72G/P82C；
(149)F42A/Y45A/L70C/N71Q/L72G/P82C；
(150)N29S/F42A/L70C/N71Q/L72G/P82C；
(151)G27C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突變為QSMHIDATL/N71Q/F78C；
(152)G27C/F42A/Y45A/N71Q/F78C；
(153)G27C/F42A/N71Q/L72G/F78C；
(154)G27C/Y45A/N71Q/L72G/F78C；
(155)G27C/F42A/Y45A/N71Q/L72G/F78C；
(156)G27C/N29S/F42A/N71Q/L72G/F78C；
(157)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突變為QSMHIDATL/Y45A/N71Q；
(158)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突變為QSMHIDATL/N71Q/L72G；
(159)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突變為QSMHIDATL/Y45A/N71Q/L72G；
(160)N26Q/N30S/Q11C/N71Q/L132C；
(161)N26Q/N30S/L70C/N71Q/P82C；
(162)N26Q/G27C/N30S/N71Q/F78C；
(163)N26Q/N30S/F42A/Y45A/N71Q；
(164)N26Q/N30S/F42A/N71Q/L72G；
(165)N26Q/N30S/Y45A/N71Q/L72G；
(166)N26Q/N30S/F42A/Y45A/N71Q/L72G；
(167)N26Q/N29S/N30S/F42A/N71Q/L72G；
(168)N26Q/N29S/N30S/N71Q；
(169)N26Q/N29S/Q11C/N71Q/L132C；
(170)N26Q/N29S/L70C/N71Q/P82C；
(171)N26Q/N29S/G27C/N71Q/F78C；
(172)N26Q/N29S/F42A/Y45A/N71Q；
(173)N26Q/N29S/Y45A/N71Q/L72G；
(174)N26Q/N29S/F42A/Y45A/N71Q/L72G；
(175)Q11C/N29S/N30S/N71Q/L132C；
(176)N29S/N30S/L70C/N71Q/P82C；
(177)G27C/N29S/N30S/N71Q/F78C；
(178)N29S/N30S/F42A/Y45A/N71Q；
(179)N29S/N30S/F42A/N71Q/L72G；
(180)N29S/N30S/Y45A/N71Q/L72G；
(181)N29S/N30S/F42A/Y45A/N71Q/L72G；
(182)Q11C/N29S/F42A/Y45A/N71Q/L132C；
(183)Q11C/N29S/F42A/N71Q/L72G/L132C；
(184)Q11C/N29S/Y45A/N71Q/L72G/L132C；
(185)Q11C/N29S/F42A/Y45A/N71Q/L72G/L132C；
(186)N29S/F42A/Y45A/L70C/N71Q/P82C；
(187)N29S/F42A/L70C/N71Q/L72G/P82C；
(188)N29S/Y45A/L70C/N71Q/L72G/P82C；
(189)N29S/F42A/Y45A/L70C/N71Q/L72G/P82C；
(190)G27C/N29S/F78C/F42A/Y45A/N71Q；
(191)G27C/N29S/F78C/F42A/N71Q/L72G；
(192)G27C/N29S/F78C/Y45A/N71Q/L72G；
(193)G27C/N29S/F78C/F42A/Y45A/N71Q/L72G；
(194)N29S/F42A/Y45A/N71Q；
(195)N29S/F42A/N71Q/L72G；
(196)N29S/Y45A/N71Q/L72G；
(197)N29S/F42A/Y45A/N71Q/L72G；
(198)Q11C/N29S/N71Q/L132C；
(199)N29S/L70C/N71Q/P82C；
(200)G27C/N29S/N71Q/F78C；
(201)N29S/N30S/N71Q；
(202)N26Q/N29S/N71Q；
(203)N26Q/N88R；
(204)N29S/N88R；
(205)N30S/N88R；
(206)N26Q/N88R/Q11C/L132C；
(207)N29S/N88R/L70C/P82C；和
(208)N30S/N88R/G27C/F78C；其中，“/”表示在同一個IL-2變體中，該突變是同時存在的。一些實施方案中，上述突變是相對於野生型IL-2發生的突變，所述野生型IL-2的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示。突變 的位點編號根據SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列從第2位的胺基酸A開始計數。
在一些實施方式中，該IL-2變體或其衍生物包含選自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.41任一項所示的胺基酸。該多肽的胺基酸和對應的核苷酸序列號如表1所示(下劃線為突變胺基酸)：
表1. IL-2變體胺基酸序列和核酸序列
Figure 108146978-A0101-12-0018-1
Figure 108146978-A0101-12-0019-2
Figure 108146978-A0101-12-0020-3
Figure 108146978-A0101-12-0021-4
Figure 108146978-A0101-12-0022-5
在一些實施方案中，IL-2變體的衍生物包括涉及本公開IL-2變體的全長、部分蛋白或在本公開IL-2變體的基礎上進一步突變獲得的突變蛋白、功能性衍生物、功能性片段、生物活性肽、融合蛋白、同種型或其鹽。例如，包含IL-2變體的融合蛋白、該IL-2變體的單體或二聚物或三聚物或多聚物、該IL-2變體的各種修飾形式(如PEG化、聚乙二醇化、糖基化、白蛋白綴合或融合、Fc融合或綴和、羥乙基化、去除O-糖基化等)，以及該IL-2變體在各物種中的同源物。該IL-2的修飾不會導致對治療相關的免疫原性的不利影響。
在一些實施方案中，IL-2變體或衍生物是PEG化的(可以表示為PEG-IL-2)，例如是單或雙PEG化的IL-2變體或衍生物。PEG-IL-2變體或衍生物包括SC-PEG連接基。在另一些實施方案中，PEG-IL-2變體或衍生物包括甲氧基-PEG-醛(mPEG-ALD)連接基。在某些實施方案中，PEG部分的平均分子量在約5KD至約50KD，具體地5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50KD；或約5KD至約40KD，或約10KD至約30KD，或約10KD至約30KD之間，或約15KD至約20KD之間。某些具體實施方案中，mPEG-ALD連接基包括具有選自下列平均分子量的PEG分子：約5KDa、約12KDa或約20KDa。在某些實施方案中，mPEG-ALD的醛基可以是乙醛、丙醛或丁醛等。在一個實施方案中，IL-2變體或其衍生物相比於野生型IL-2或其衍生物具有延長的血清半衰期。
當IL-2變體或其衍生物包含第二類突變時，一些實施方案中，IL-2變體或其衍生物能引發一種或多種選自下組的細胞應答：激活的T淋巴細胞中的增殖、激活的T淋巴細胞中的分化、細胞毒性T細胞(CTL)活性、激活的B細胞中的增殖、激活的B細胞中的分化、天然殺傷(NK)細胞中的增殖、NK細胞中的分化、藉由激活的T細胞或NK細胞的細胞因子分泌、和NK/淋巴細胞激活的殺傷細胞(LAK)抗腫瘤細胞毒性。一些實施方案中，IL-2變體或其衍生物與野生型IL-2多肽相比具有降低的誘導調節性T細胞中IL-2信號傳導的能力。在一個實施方案中，IL-2變體或其衍生物相比於野生型IL-2或其衍生物誘導T細胞中更少的激活誘導的細胞死亡 (AICD)。一些具體實施方案中，IL-2變體或其衍生物相比於野生型IL-2或其衍生物具有減小的體內毒性。
當IL-2變體或其衍生物包含第三類突變時，一些實施方案中，IL-2變體或其衍生物能夠降低IL-2對高親和力受體(IL-2Rα/β/γ)和中等親和力受體(IL-2Rβ/γ)的親和力，但對高親和力受體的親和力比對中等親和力受體的親和力降低得更多。一些實施方案中，IL-2變體或其衍生物能夠保留IL-2對Treg的誘導增殖和激活功能，但消除或降低IL-2對效應細胞(如NK和T細胞)的誘導增殖和激活功能。
在另一方面，本公開提供IL-2變體或其衍生物直接或藉由接頭間接地與非IL-2模塊連接的連接體或綴和物。一些實施方案中，其為免疫綴合物，其中，非IL-2模塊為抗原結合模塊。一些實施方案中，該抗原結合模塊靶向腫瘤細胞上呈現的或腫瘤細胞環境中的抗原。
一些實施方案中，IL-2變體連接於至少一個非IL-2模塊。一些實施方案中，IL-2變體和非IL-2模塊形成融合蛋白，即IL-2變體與非IL-2模塊共享肽鍵。一些實施方案中，IL-2變體連接於至少一個非IL-2模塊，例如第一和第二非IL-2模塊。一些實施方案中，非IL-2模塊為抗原結合模塊。一些實施方案中，IL-2變體與第一抗原結合模塊共享胺基或羧基端肽鍵，且第二抗原結合模塊與以下共享胺基或羧基端肽鍵：i)IL-2變體或ii)第一抗原結合模塊。一些具體的實施方案中，IL-2變體與所述第一非IL-2模塊共享羧基端肽鍵，而與該第二非IL-2模塊共享胺基末端肽鍵。一些實施方案中，該非IL-2模塊是抗原結合模塊。該抗原結合模塊可以是抗體或抗原結合片段，包括但不限於免疫球蛋白分子(例如IgG(例如IgG1)類免 疫球蛋白分子)、抗體或其抗原結合片段。一些具體實施方案中，抗體或其抗原結合片段選自包含抗體重鏈可變區和抗體輕鏈可變區的多肽複合物、Fab、Fv、sFv、F(ab’)2、線性抗體、單鏈抗體、scFv、sdAb、sdFv、奈米抗體、肽抗體(peptibody)、結構域抗體和多特異性抗體(雙特異性抗體、雙體抗體(diabody)、三體抗體(triabody)和四體抗體(tetrabody)、串聯二-scFv、串聯三-scFv)。在IL-2變體連接於超過一個抗原結合模塊例如第一和第二抗原結合模塊的情況下，每個抗原結合模塊可以獨立地選自各種形式的抗體和抗原結合片段，例如，第一抗原結合模塊可以是Fab分子，而第二抗原結合模塊可以是scFv分子，或第一和第二抗原結合模塊中的每一個都是scFv分子，或第一和第二抗原結合模塊中的每一個是Fab分子。一些實施方案中，在IL-2變體連接於超過一個抗原結合模塊例如第一和第二抗原結合模塊的情況下，能獨立地選擇每個抗原結合模塊所針對的抗原，例如，該第一和所述第二抗原結合模塊針對不同的抗原或針對同一抗原。
一些實施方案中，該抗原結合模塊結合的抗原可以選自下組：生腱蛋白C的A1域(TNC A1)、生腱蛋白C的A2域(TNC A2)、纖連蛋白的外域(Extra Domain B)(EDB)、癌胚抗原(CEA)和黑色素瘤有關的硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)。一些實施方案中，腫瘤抗原包括但不限於MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脫胺酶結合蛋白(ADAbp)、親環素(cyclophilin)b、結腸直腸有關的抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、***特異性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、***特異性膜抗原(PSMA)、T細胞受體/CD3-zeta鏈、腫瘤抗原的MAGE 家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、腫瘤抗原的GAGE家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7，GAGE-8，GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪胺酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-鈣黏蛋白、α-連環蛋白(catenin)、β-連環蛋白和γ-連環蛋白、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤樣結腸息肉蛋白(adenomatous polyposis coli protein，APC)、胞襯蛋白(fodrin)、連接蛋白(Connexin)37、Ig獨特型、p15、gp75、GM2和GD2神經節苷脂、病毒產物如人乳頭狀瘤病毒蛋白、腫瘤抗原的Smad家族、lmp-1、P1A、EBV編碼的核抗原(EBNA)-1、腦糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、以及c-erbB-2。一些實施方案中，病毒抗原的非限制性例子包括流感病毒血凝素、Epstein-Barr病毒LMP-1、丙肝病毒E2糖蛋白、HIV gp160和HIV gp120。一些實施方案中，ECM抗原的非限制性例子包括多配體聚糖(syndecan)、類肝素酶(heparanase)、整聯蛋白、骨橋蛋白(osteopontin)、link、鈣黏蛋白、層黏連蛋白、EGF型層黏連蛋白、凝集素、纖連蛋白、notch、生腱蛋白和基質素(matrixin)。
一些實施方案中，包含上述抗原結合模塊的IL-2變體或其衍生物包含第二類突變，不包含第三類突變。
一些實施方案中，提供增加IL-2或其衍生物、綴合物穩定性的方法，該方法包括在IL-2或其衍生物、綴合物中引入1)-7)任一項所示的突變或其任意組合：
1)N26Q，
2)N29S，
3)N30S，
4)N71Q，
5)Q11C和L132C，
6)L70C和P82C，和
7)G27C和F78C。
在另一方面，本公開提供醫藥組成物，其含有上述IL-2變體或其衍生物或免疫綴合物，視需要地可包含藥學上可接受的稀釋劑、載體或助劑。該醫藥組成物可以為凍乾製劑或可注射溶液。
在一些具體實施方案中，醫藥組成物單位計量中可含有0.01至99重量%的IL-2變體或其衍生物或免疫綴合物，或醫藥組成物單位劑量中含有的IL-2變體或其衍生物或免疫綴合物的量為0.1-2000mg(例如1-1000mg)。
在另一方面，本公開提供編碼上述IL-2變體或其衍生物的核酸。該核酸包含選自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、和SEQ ID NO.40中任一項所示的多核苷酸。
一些實施方案中，提供含有編碼上述IL-2變體或其衍生物的核酸的表達載體。
在另一方面，提供表達上述載體的宿主細胞。該宿主細胞可以是原核或真核細胞。一些具體實施方案中，宿主細胞為細菌、酵母菌或哺乳動物細胞，具體可以為巴斯德畢赤酵母或釀酒酵母。
一些實施方案中，宿主細胞包含(例如已被轉化或轉染)載體，該載體包含編碼上述IL-2變體或其衍生物、免疫綴合物的胺基酸序列的多核苷酸。宿主細胞包括原核微生物(如大腸桿菌)或各種真核生物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、人胚胎腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)、昆蟲細胞等)。一些實施方案中，可以使用表達糖基化多肽的宿主細胞，由多細胞生物體(包括例如無脊椎動物和脊椎動物)衍生，例如植物和昆蟲細胞。脊椎動物細胞也可以用作宿主細胞，例如，懸浮生長的哺乳動物細胞系、猴腎CV1系(COS-7)、人胚胎腎系(293或293T細胞)、幼侖鼠腎細胞(BHK)、小鼠塞托利(sertoli)細胞(TM4細胞)、猴腎細胞(CV1)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、人宮頸癌細胞(HELA)、犬腎細胞(MDCK)、buffalo大鼠肝細胞(BRL3A)、人肺細胞(W138)、人肝細胞(Hep G2)、小鼠***腫瘤細胞(MMT060562)、TRI細胞(如例如記載於Mather等，Annals N.Y.Acad Sci383，44-68(1982))、MRC5細胞和FS4細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、骨髓瘤 細胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0，以及在轉基因動物、轉基因植物或培養的植物或動物組織中包含的細胞。
在另一方面，本公開提供上述IL-2變體或其衍生物、免疫綴合物或包含其的醫藥組成物的製藥用途。
當IL-2變體或其衍生物包含第二類突變時，其用於治療增生性疾病、免疫性疾病、調節T細胞介導的免疫應答、刺激個體免疫系統的方法和相關製藥用途。該增生性疾病可以是腫瘤或癌(例如轉移性腫瘤或癌)，可以是實體瘤(例如轉移性腎細胞癌和惡性黑色素瘤)。一些實施方案中，本公開的IL-2變體或其衍生物、免疫綴合物可用於治療刺激宿主的免疫系統以獲益的疾病情形，特別是期望增強細胞免疫應答的狀況，可以包括宿主免疫應答不足或缺陷性的疾病情形。一些實施方案中，施用IL-2變體或其衍生物、免疫綴合物的疾病情形包括細胞免疫應答是特異性免疫的關鍵機制的腫瘤或感染，例如癌症(例如腎細胞癌或黑色素瘤)、免疫缺陷(例如HIV陽性患者中、免疫受抑制的患者)、慢性感染等。一些實施方案中，增強細胞免疫應答可以包括以下任一種或多種：免疫功能的一般升高、T細胞功能升高、B細胞功能升高、淋巴細胞功能的恢復、IL-2受體表達提高、T細胞應答性提高、天然殺傷細胞活性或淋巴因子激活的殺傷(LAK)細胞活性升高等。一些實施方案中，本公開的IL-2變體或其衍生物、免疫綴合物用於治療的疾病是增殖性病症，例如癌症。癌症的非限制性例子包括膀胱癌、腦癌、頭和頸癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、***癌、血液癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌和腎癌。其它可使用本公開的IL- 2變體或其衍生物治療的細胞增殖病症包括但不限於位於以下處的新生物：腹部、骨、***、消化系統、肝、胰、腹膜、內分泌腺(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睾丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭和頸、神經系統(中樞和外周)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾、胸部、和泌尿生殖系統。還包括癌症前期狀況或損傷以及癌症轉移。在某些實施方案中，癌症選自下組：腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳腺癌、腦癌、頭和頸癌。類似地，其它細胞增殖病症也可用本公開的IL-2變體或其衍生物治療，包括但不限於：高丙種球蛋白血症(hypergammaglobulinemia)、淋巴增生性病症、病變蛋白血症(paraproteinemias)、紫癜(purpura)、結節病、塞紮裡綜合症(Sezary Syndrome)、Waldenstron's巨球蛋白血症、高歇氏病(Gaucher's Disease)、組織細胞增多病(histiocytosis)以及任何其它位於上文所列的器官系統中的瘤形成(neoplasia)外的細胞增殖疾病。在另一些實施方案中，所述疾病涉及自身免疫性、移植排斥、外傷後免疫應答和傳染性疾病(例如HIV)。
當IL-2變體或其衍生物包含第三類突變時，其用於治療自身免疫性疾病或緩解/治療/預防器官移植之後的自身免疫反應。自身免疫性疾病可以是選自由以下各種組成的組：I型糖尿病(type I diabetes mellitus)、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)、多發性硬化症(multiple sclerosis)、慢性胃炎(chronic gastritis)、克羅恩病(Crohn’s disease)、巴塞多病(Basedow disease)、別赫捷列夫病(Bechterew disease)、銀屑病(psoriasis)、重症肌無力(myasthenia gravis)、自身免疫肝炎(autoimmune hepatitis)、APECED、變應性肉芽腫血管炎(Chrug-Strauss syndrome)、潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)、腎小球腎炎(glomerulonephritis)、吉蘭-巴 雷綜合症(Guillain-Barrésyndrome)、橋本甲狀腺炎(Hashimoto thyroiditis)、硬化萎縮性苔蘚(lichen sclerosus)、系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematodes)、PANDAS、風濕熱(rheumatic fever)、結節病(sarcoidosis)、舍格倫綜合症(syndrome)、僵人綜合症(Stiff-Man syndrome)、硬皮病(scleroderma)、韋格納肉芽腫病(Wegener’s granulomatosis)、白斑(vitiligo)、自身免疫性腸病(autoimmune enteropathy)、肺出血腎炎綜合症(Goodpasturesyndrome)、皮肌炎(dermatomyositis)、多發性肌炎(polymyositis)、自身免疫性過敏症(autoimmune allergy)、哮喘(asthma)。在一些實施方案中，IL-2變體或其衍生物可以與免疫抑制劑聯用。一些實施方案中，免疫抑制劑選自由以下各項組成的組：糖皮質激素(glucocorticoid)，包括去氧皮質酮(decortin)、prednisol；硫唑嘌呤(azathioprine)；環孢素A(cyclosporin A)；嗎替麥考酚酯(mycophenolatemofetil)；他克莫司(tacrolimus)；抗T淋巴細胞球蛋白，抗CD3抗體，包括莫羅單抗(muromonab)；抗CD25抗體，包括巴利昔單抗(basiliximab)和達克珠單抗(daclizumab)；抗TNF-α抗體，包括英利昔單抗(infliximab)和阿達木單抗(adalimumab)；硫唑嘌呤；甲胺蝶呤(methotrexate)；環孢素(cyclosporin)；西羅莫司(sirolimus)；依維莫司(everolimus)；芬戈莫德(fingolimod)；驍悉(CellCept)；麥考酚酸鈉腸溶劑(myfortic)；以及環磷醯胺(cyclophosphamide)。
一些實施方案中，本公開的IL-2變體或其衍生物、免疫綴合物不能提供治癒而僅能提供部分益處。在一些實施方案中，具有一些益處的生理學變化也被視為治療有益的。如此，在一些實施方案中，提供生理 學變化的IL-2變體或其衍生物、免疫綴合物的量被視為“有效量”或“治療有效量”。需要治療的受試者、患者或個體通常為哺乳動物，更特定地為人。
一些實施方案中，提供其中每日至少2次、每日至少1次、每48小時至少1次、每72小時至少一次、每週至少一次、每2週至少一次、每個月至少一次、每2個月至少一次或每3個月至少一次向受試者施用本公開的IL-2變體或其衍生物、免疫綴合物的方法。可藉由任何有效途徑施用IL-2，例如，藉由腸胃外注射包括皮下注射施用IL-2變體或其衍生物、免疫綴合物。
在進一步的方面，本公開提供製備IL-2變體或衍生物、免疫綴合物的方法，包括向野生型人IL-2中引入前述IL-2變體的突變，或使用前述核酸序列，或使用前述表達載體，或使用前述宿主細胞。此處全文引入WO2012/107417中的IL-2變體的製備方法。
發明詳述
為了更容易理解本公開，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本公開中的它處另有明確定義，否則本公開使用的所有其它技術和科學術語都具有本公開所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本文中所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
術語
“白介素-2”或“IL-2”指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物如靈長類(例如人)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)的任何天然的IL-2。該術語涵蓋未加工的IL-2以及源自細胞中的加工的任何形式的IL-2。該術語還涵蓋天然存在的IL-2變體，例如剪接變體或等位變體。例示性野生型人IL-2的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示。未加工的人IL-2額外包含N端20個胺基酸的信號肽(如WO2012107417中的SEQ ID NO.272所示)，該信號肽在成熟的IL-2分子中是缺乏的。
“胺基酸突變”包括胺基酸取代、缺失、***、修飾及其任意組合，以實現最終構建體，使得最終構建體擁有期望的特性，例如增強的穩定性。胺基酸序列缺失和***包括胺基和/或羧基端缺失和胺基酸***。末端缺失的例子是在全長人IL-2的位置1缺失丙胺酸殘基。較佳的胺基酸突變是胺基酸取代。為了改變例如IL-2多肽的結合特性，可以將非保守性的胺基酸取代，即將一個胺基酸用具有不同結構和/或化學特性的另一種胺基酸替換。較佳的胺基酸取代包括用親水性胺基酸替換疏水性胺基酸。胺基 酸取代包括由非天然存在的胺基酸或由20種標準胺基酸的天然存在的胺基酸衍生物(例如4-羥脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥賴胺酸)替換。可以使用本領域中公知的遺傳或化學方法生成胺基酸突變，包括定點誘變、PCR、基因合成、化學修飾等方法。
“野生型IL-2”是在其它方面與變體IL-2多肽相同，只是在變體IL-2多肽的每個胺基酸位置具有野生型胺基酸的IL-2形式。例如，如果IL-2變體是全長IL-2(即未與任何其它分子融合或綴合的IL-2)，那麼此變體的野生型形式是全長天然的IL-2。如果IL-2變體是IL-2與在IL-2下游編碼的另一種多肽(例如抗體鏈)之間的融合物，那麼此IL-2變體的野生型形式是具有與相同下游多肽融合的野生型胺基酸序列的IL-2。此外，如果IL-2變體是IL-2的截短形式(在IL-2的非截短部分內的經突變或修飾的序列)，那麼此IL-2變體的野生型形式是具有野生型序列的類似截短的IL-2。為了對各種形式的IL-2變體與相應的IL-2野生型形式比較IL-2受體結合親和力或生物學活性，術語“野生型”涵蓋相比於天然存在的、天然的IL-2，包含一處或多處不影響對IL-2受體結合的胺基酸突變的IL-2形式，例如在與人IL-2的殘基125對應的位置處的半胱胺酸取代為丙胺酸C125A。在一些實施方案中，野生型IL-2包含SEQ ID NO.2所示的胺基酸序列。
“衍生物”旨在被廣義地解釋，包括任意IL-2相關的產品。包括但不限於人和非人的IL-2同系物、片段或截短體、融合蛋白(如與信號肽融合或其他活性、非活性成份融合，活性成份例如抗體或其抗原結合片段)、修飾形式(如PEG化、糖基化、白蛋白綴合/融合、Fc綴和/融合、羥乙基化等)、和保守修飾的蛋白等。
“CD25”或“IL-2受體的α亞基”指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物如靈長類(例如人)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)的任何天然CD25，包括“全長”的未加工的CD25以及源自細胞中的加工的任何形式的CD25，還包括天然存在的CD25變體，例如剪接變體或等位變體。在某些實施方案中，CD25是人CD25，例示性序列如SEQ ID NO.37所示。
“高親和力IL-2受體”指IL-2受體的異型三聚體形式，其由受體γ亞基(也稱為通用細胞因子受體γ亞基、γc或CD132)、受體β亞基(也稱為CD122或p70)和受體α亞基(也稱為CD25或p55)組成。比較而言，“中等親和力IL-2受體”指僅包含γ亞基和β亞基而無α亞基的IL-2受體(參見例如Olejniczak和Kasprzak，MedSci Monit14，RA179-189(2008))。
“親和力”指分子(例如受體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如配體)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另外指示，本文的“結合親和力”指反映結合對的成員(例如受體和配體)之間1：1相互作用的內在結合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力通常可以用解離常數(KD)來表述，其為解離與結合速率常數(分別為K解離和K結合)的比率。如此，相等的親和力可能包含不同的速率常數，只要速率常數的比率保持相同。親和力可以藉由本領域常規的方法來測量，包括本文中所描述的方法。
“調節性T細胞”或“T調節細胞”或“Treg”意指一種能抑制其它T細胞的應答的特殊化CD4+T細胞類型。Treg的特徵在於表達IL-2受體的α亞基(CD25)和轉錄因子叉頭框P3(FOXP3)，並在誘導和維持對抗原(包括那些由腫瘤表達的抗原)的外周自體耐受性中起著關鍵作用。Treg需要IL-2來實現其功能和發育以及其抑制性特徵的誘導。
“效應細胞”指介導IL-2的細胞毒性效果的淋巴細胞群體。效應細胞包括效應T細胞如CD8+細胞毒性T細胞、NK細胞、淋巴因子激活的殺傷(LAK)細胞和巨噬細胞/單核細胞。
“抗原結合模塊”指特異性結合抗原決定簇的多肽分子。在一些實施方案中，抗原結合模塊能指導其連接物(例如，細胞因子(IL-2或其變體)和/或其它抗原結合模塊)到達靶位點，例如到達特定類型的腫瘤細胞或具有特定抗原決定簇的腫瘤間質。抗原結合模塊包括抗體及其抗原片段，較佳的抗原結合模塊包括抗體的抗原結合域，其可以包含抗體重鏈可變區和抗體輕鏈可變區。抗原結合模塊可以包含抗體恆定區，如本領域中已知的，可用的重鏈恆定區包括以下5種同種型中的任意一種：α、δ、ε、γ或μ。可用的輕鏈恆定區包括任意以下2種同種型中的任意一種：κ和λ。IL-2或其變體可藉由一種或多種接頭序列與一個或多個抗原結合模塊連接以形成“免疫綴合物”。
“特異性結合”意指此結合對於抗原是選擇性的，並且能與不想要的或非特異性的相互作用區別開來。抗原結合模塊結合特異性抗原決定簇的能力能經由酶聯免疫吸附測定法(ELISA)或本領域技術人員熟知的其它技術，例如表面等離振子共振技術(在BIAcore儀器上分析)(Liljeblad等，Glyco J17，323-329(2000))，以及傳統的結合測定法來測量(Heeley，Endocr Res28，217-229(2002))。
“抗體”在本文中以最廣義使用，並且涵蓋各種抗體結構，只要它們展現出期望的抗原結合活性，所述抗體包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗原結合片段。抗體可以 包括鼠源抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、駱駝抗體。例示性的，抗體可以是免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
“抗原結合片段”，指具有抗原結合活性的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、單鏈Fv(即sFv)、奈米抗體(即VHH)、VH/VL結構域。Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位點的最小抗原結合片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體(single chain antibody)或單鏈Fv(sFv)。
“保守修飾”適用於胺基酸和核苷酸序列。對於特定的核苷酸序列，保守改性是指編碼相同或基本相同的胺基酸序列的那些核酸，或在核苷酸不編碼胺基酸序列的情況下，是指基本上相同的核苷酸序列。對於胺基酸序列，“保守修飾”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般 而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecμlar Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。
“PEG化”是指至少一個PEG分子與另一個分子(例如治療性蛋白)連接。例如，批准Adagen(腺苷脫胺酶的PEG化製劑)用於治療嚴重聯合免疫缺陷病。已經顯示，聚乙二醇的連接可以防止蛋白水解作用(參見，例如，Sada等人，(1991)J.Fermentation Bioengineering 71：137-139)。在最常見形式中，PEG是在一端與羥基連接的直鏈或支鏈聚醚，並且具有下列常規結構：HO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH。為了使PEG與分子(多肽、多糖、多核苷酸和小的有機分子)偶聯，可以藉由製備一些或兩個末端具有官能團的PEG的衍生物來活化PEG。蛋白的PEG綴合的常見途徑是用官能團活化PEG，該官能團適合與賴胺酸和N-末端胺基酸基團的反應。尤其是，參與綴合的常見反應基團是賴胺酸的α或ε胺基。聚乙二醇化連接基與蛋白的反應可導致PEG部分主要在下列位點處的連接：蛋白的N-末端的α胺基、賴胺酸殘基側鏈上的ε胺基、或組胺酸殘基側鏈上的咪唑基。由於大部分重組蛋白質具有單個α和許多ε胺基和咪唑基，可以根據連接基團的化學性質，產生許多位置異構體。
“載體”、“表達載體”與“表達構建體”同義並指用於導入與其可操作聯合的特定基因並指導其在靶細胞中表達的DNA分子，包括作為自主複製核酸結構的載體以及摻入到其所導入的宿主細胞的基因組中的載體。本文的表達載體包含表達盒，允許轉錄大量穩定的mRNA。一旦表達 載體在靶細胞內，就藉由細胞轉錄和/或翻譯體系生成基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質。
“宿主細胞”、“宿主細胞系”和“宿主細胞培養物”可交換使用並指已引入外源核酸的細胞，包括這類細胞的後代。宿主細胞包括“轉化體”和“經轉化的細胞”，其包括初始轉化的細胞和自其衍生的後代(不考慮繼代數)。後代在核酸內含物上可能與親本細胞不完全相同，但可以含有突變。本文中包括具有與原始轉化細胞中所篩選或選擇的功能或生物學活性相同的功能或生物學活性的突變後代。
“施用”、“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中所述流體與細胞接觸。“施用”、“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“施用”、“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑，諸如包含本公開的任一種IL-2變體及其衍生物或包含該變體或衍生物的組合物，該受試者確診患有、疑似患有、易感於一種或多種疾病症狀，而已知所述治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療受試者或群體中以有效緩解一種 或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床不可測量的程度。
有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。盡本公開的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個患都有的目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Studentt檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。
“有效量”包含足以改善或預防醫學病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定受試者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、受試者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
第1A圖至第1F圖分別為野生型IL-2(WT)及其變體IL-2-01、IL-2-02、IL-2-03、IL-2-04、IL-2-05的熱穩定性實驗結果。
第2圖為藉由ELISA實驗檢測的野生型IL-2(WT)及其變體IL-2-01、IL-2-02、IL-2-03、IL-2-04、IL-2-05、IL-2-06、IL-2-07、IL-2-08、IL-2-09、IL-2-13與IL-2Rα的親和力。
第3A圖至第3C圖分別為經ELISA實驗檢測的IL-2-10、IL-2-22、IL-2-23及PEG化IL-2-10、PEG化IL-2-22、PEG化IL-2-23的促CTLL2細胞增殖實驗結果。
第4A圖至第4C圖分別為經ELISA實驗檢測的IL-2-10、IL-2-22、IL-2-23及PEG化IL-2-10、PEG化IL-2-22、PEG化IL-2-23的促Mo7e細胞增殖實驗結果。
第5圖為經流式細胞法檢測的IL-2-01、IL-2-02、IL-2-07、IL-2-08、IL-2-09對CTLL2細胞中STAT5磷酸化的實驗結果。
第6A圖至第6C圖分別為IL-2-10、IL-2-22、IL-2-23及PEG化IL-2-10、PEG化IL-2-22、PEG化IL-2-23刺激人外周血調節性T細胞Treg(第6A圖)、CD8+T細胞(第6B圖)、NK細胞(第6C圖)STAT5磷酸化的實驗結果。
第7A圖至第7D圖分別為PEG-IL-2-22對小鼠NK細胞(第7A圖)、CD8+ T(第7B圖)細胞、CD4+ T細胞(第7C圖)和Treg細胞(第7D圖)中數量影響的實驗結果。
第8A圖至第8C圖分別為PEG-IL-2-24對小鼠CD8+ T細胞(第8A圖)、CD4+ T細胞(圖8B)、Treg細胞(第8C圖)中數量影響的實驗結果；圖8D-8F分別為相應的CD8+ T細胞在CD3+T細胞中的百分比(第8D圖)、CD4+ T細胞在CD3+T細胞中的百分比(第8E圖)、Treg細胞在CD4+T細胞中的百分比(第8F圖)。
第9圖為PEG-IL-2-22在小鼠CT26結腸癌模型中的抗腫瘤作用結果圖。
第10圖為PEG-IL-2-22在人黑色素瘤A375混合人PBMC皮下移植NCG小鼠模型中的抗腫瘤作用結果圖。
以下結合實施例用於進一步描述本公開，但這些實施例並非限制本公開的範圍。
實施例1：野生型IL-2及其變體的構建和表達
1.基因合成及重組表達載體構建
合成野生型人IL-2核酸序列，在5’端添加Nde I酶切位點，在3’端添加BamH I酶切位點，核酸序列如SEQ ID NO.1所示(Nde I和BamH I的酶切位點如斜體所示)。野生型IL-2的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
>野生型IL-2核酸序列
Figure 108146978-A0101-12-0042-7
Figure 108146978-A0101-12-0042-8
(SEQ ID NO.1)
>野生型IL-2胺基酸序列
Figure 108146978-A0101-12-0042-9
Figure 108146978-A0101-12-0042-10
(SEQ ID NO.2)
合成IL-2核酸序列後，連接至大腸桿菌表達載體pET-9a(Novagen，Cat.69431-3)的Nde I和BamH I兩個酶切位點，得到野生型IL-2的表達載體。
2.在野生型IL-2胺基酸序列中引入本公開中所述的胺基酸突變。
在一種變體中，26位的天冬醯胺置換成穀胺醯胺，將其對應的核苷酸序列76-78位處的密碼子AAC變為CAG，獲得變體IL-2-01。
其中，斜體部分為酶切位點，下劃線部分為突變位點，以下同。
> IL-2-01的核酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0043-11
Figure 108146978-A0101-12-0043-12
(SEQ NO ID.3)
>IL-2-01的胺基酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0043-13
Figure 108146978-A0101-12-0043-14
(SEQ NO ID.4)
在一種變體中，將30位的天冬醯胺置換成絲胺酸，將其對應的核苷酸序列88-90位處的密碼子AAC變為AGC，獲得變體IL-2-02。
> IL-2-02的核酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0044-15
Figure 108146978-A0101-12-0044-16
(SEQ NO ID.5)
> IL-2-02的胺基酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0044-17
Figure 108146978-A0101-12-0044-18
(SEQ NO ID.6)
在一種變體中，將11位的穀胺醯胺置換成半胱胺酸；將其對應的核苷酸序列31-33位處的密碼子CAG變為TGT；將132位的亮胺酸置換成半胱胺酸；將其對應的核苷酸序列394-396位處的密碼子CTG變為TGT，獲得變體IL-2-03。
> IL-2-03的核酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0044-19
Figure 108146978-A0101-12-0045-20
Figure 108146978-A0101-12-0045-21
(SEQ NO ID.7)
> IL-2-03的胺基酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0045-22
Figure 108146978-A0101-12-0045-23
(SEQ ID NO：8)
在一種變體中，70位的亮胺酸置換成半胱胺酸；將其對應的核苷酸序列208-210位處的密碼子CTG變為TGT；將82位的脯胺酸置換成半胱胺酸；將其對應的核苷酸序列244-246位處的密碼子CCG變為TGT，獲得變體IL-2-04。
> IL-2-04的核酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0045-24
Figure 108146978-A0101-12-0046-25
Figure 108146978-A0101-12-0046-26
(SEQ NO ID.9)
> IL-2-04的胺基酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0046-27
Figure 108146978-A0101-12-0046-28
(SEQ ID NO：10)
在一種變體中，27位的甘胺酸置換成半胱胺酸；將其對應的核苷酸序列79-81位處的密碼子GGC變為TGT；將78位的***酸置換成半胱胺酸；將其對應的核苷酸序列232-234位處的密碼子TTT變為TGT，獲得變體IL-2-05。
> IL-2-05的核酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0046-29
Figure 108146978-A0101-12-0046-30
(SEQ NO ID.11)
> IL-2-05的胺基酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0047-31
Figure 108146978-A0101-12-0047-32
(SEQ ID NO：12)
在一種變體中，29-44位的肽段置換為QSMHIDATL；將其對應的核苷酸序列85-132位處的密碼子AACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATTC變為CAGAGCATGCATATTGATGCAACCCTG，獲得變體IL-2-06。
> IL-2-06的核酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0047-33
Figure 108146978-A0101-12-0047-34
(SEQ NO ID.13)
> IL-2-06的胺基酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0047-35
Figure 108146978-A0101-12-0047-36
(SEQ ID NO：14)
在一種變體中，42位的***酸置換成丙胺酸；將其對應的核苷酸序列124-126位處的密碼子TTC變為GCA；將45位的酪胺酸置換成丙胺酸；將其對應的核苷酸序列133-135位處的密碼子TAC變為GCA，獲得變體IL-2-07。
> IL-2-07的核酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0048-37
Figure 108146978-A0101-12-0048-38
(SEQ NO ID.15)
> IL-2-07的胺基酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0048-39
Figure 108146978-A0101-12-0048-40
(SEQ ID NO：16)
在一種變體中，42位的***酸置換成丙胺酸；將其對應的核苷酸序列124-126位處的密碼子TTC變為GCA；將72位的亮胺酸置換成 甘胺酸；將其對應的核苷酸序列214-216位處的密碼子CTG變為GGC，獲得變體IL-2-08。
> IL-2-08的核酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0049-200
Figure 108146978-A0101-12-0049-41
(SEQ NO ID.17)
> IL-2-08的胺基酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0049-42
Figure 108146978-A0101-12-0049-43
(SEQ ID NO：18)
在一種變體中，45位的酪胺酸置換成丙胺酸；將其對應的核苷酸序列133-135位處的密碼子TAC變為GCA；將72位的亮胺酸置換成甘胺酸；將其對應的核苷酸序列214-216位處的密碼子CTG變為GGC，獲得變體IL-2-09。
> IL-2-09的核酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0050-44
Figure 108146978-A0101-12-0050-45
(SEQ NO ID.19)
> IL-2-09的胺基酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0050-46
Figure 108146978-A0101-12-0050-48
(SEQ ID NO：20)
在一種變體中，26位的天冬醯胺置換成穀胺醯胺；將其對應的核苷酸序列76-78位處的密碼子AAC變為CAG；將30位的天冬醯胺置換成絲胺酸；將其對應的核苷酸序列88-90位處的密碼子AAC變為AGC；將42位的***酸置換成丙胺酸；將其對應的核苷酸序列124-126位處的密碼子TTC變為GCA；將72位的亮胺酸置換成甘胺酸；將其對應的核苷酸序列214-216位處的密碼子CTG變為GGC，獲得變體IL-2-10。
> IL-2-10的核酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0050-49
Figure 108146978-A0101-12-0051-50
Figure 108146978-A0101-12-0051-51
(SEQ NO ID.21)
> IL-2-10的胺基酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0051-205
Figure 108146978-A0101-12-0051-53
(SEQ ID NO：22)
在一種變體中，11位的穀胺醯胺置換成半胱胺酸，將其對應的核苷酸序列31-33位處的密碼子CAG變為TGT；將26位的天冬醯胺置換成穀胺醯胺，將其對應的核苷酸序列76-78位處的密碼子AAC變為CAG；將30位的天冬醯胺置換成絲胺酸，將其對應的核苷酸序列88-90位處的密碼子AAC變為AGC；將42位的***酸置換成丙胺酸，將其對應的核苷酸序列124-126位處的密碼子TTC變為GCA；將72位的亮胺酸置換成甘胺酸，將其對應的核苷酸序列214-216位處的密碼子CTG變為GGC；將132位的亮胺酸置換成半胱胺酸，將其對應的核苷酸序列394-396位處的密碼子CTG變為TGT，獲得變體IL-2-11。
> IL-2-11的核酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0052-54
Figure 108146978-A0101-12-0052-55
(SEQ NO ID.23)
> IL-2-11的胺基酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0052-56
Figure 108146978-A0101-12-0052-57
(SEQ ID NO：24)
在一種變體中，26位的天冬醯胺置換成穀胺醯胺，將其對應的核苷酸序列76-78位處的密碼子AAC變為CAG；將30位的天冬醯胺置換成絲胺酸，將其對應的核苷酸序列88-90位處的密碼子AAC變為AGC；將42位的***酸置換成丙胺酸，將其對應的核苷酸序列124-126位處的密碼子TTC變為GCA；將70位的亮胺酸置換成半胱胺酸，將其對應的核苷酸序列208-210位處的密碼子CTG變為TGT；將72位的亮胺酸置換成甘胺酸，將其對應的核苷酸序列214-216位處的密碼子CTG變為GGC；將82位的脯 胺酸置換成半胱胺酸，將其對應的核苷酸序列244-246位處的密碼子CCG變為TGT，獲得變體IL-2-12。
> IL-2-12的核酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0053-58
Figure 108146978-A0101-12-0053-59
(SEQ NO ID.25)
> IL-2-12的胺基酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0053-60
Figure 108146978-A0101-12-0053-61
(SEQ ID NO：26)
在一種變體中，26位的天冬醯胺置換成穀胺醯胺，將其對應的核苷酸序列76-78位處的密碼子AAC變為CAG；將27位的甘胺酸置換成半胱胺酸，將其對應的核苷酸序列79-81位處的密碼子GGC變為TGT；將30位的天冬醯胺置換成絲胺酸，將其對應的核苷酸序列88-90位處的密碼子AAC變為AGC；將42位的***酸置換成丙胺酸，將其對應的核苷酸序列124-126位處的密碼子TTC變為GCA；將72位的亮胺酸置換成甘胺酸，將其 對應的核苷酸序列214-216位處的密碼子CTG變為GGC；將78位的***酸置換成半胱胺酸，將其對應的核苷酸序列232-234位處的密碼子TTT變為TGT，獲得變體IL-2-13。
> IL-2-13的核酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0054-62
Figure 108146978-A0101-12-0054-63
(SEQ NO ID.27)
> IL-2-13的胺基酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0054-64
Figure 108146978-A0101-12-0054-65
(SEQ ID NO：28)
在一種變體中，29位的天冬醯胺置換成絲胺酸，將其對應的核苷酸序列85-87位處的密碼子AAC變為AGC；將42位的***酸置換成丙胺酸，將其對應的核苷酸序列124-126位處的密碼子TTC變為GCA；將72位的亮胺酸置換成甘胺酸，將其對應的核苷酸序列214-216位處的密碼子CTG變為GGG，獲得變體IL-2-14。
> IL-2-14的核酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0055-66
Figure 108146978-A0101-12-0055-67
(SEQ NO ID.29)
> IL-2-14的胺基酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0055-68
Figure 108146978-A0101-12-0055-69
(SEQ ID NO：30)
在一種變體中，26位的天冬醯胺置換成穀胺醯胺，將其對應的核苷酸序列76-78位處的密碼子AAC變為CAG；29位的天冬醯胺置換成絲胺酸，將其對應的核苷酸序列85-87位處的密碼子AAC變為AGC；將42位的***酸置換成丙胺酸，將其對應的核苷酸序列124-126位處的密碼子TTC變為GCA；將72位的亮胺酸置換成甘胺酸，將其對應的核苷酸序列214-216位處的密碼子CTG變為GGC，獲得變體IL-2-21。
> IL-2-21的核酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0056-206
Figure 108146978-A0101-12-0056-71
(SEQ NO ID.31)
> IL-2-21的胺基酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0056-72
Figure 108146978-A0101-12-0056-73
(SEQ ID NO：32)
在一種變體中，26位的天冬醯胺置換成穀胺醯胺，將其對應的核苷酸序列76-78位處的密碼子AAC變為CAG；29位的天冬醯胺置換成絲胺酸，將其對應的核苷酸序列85-87位處的密碼子AAC變為AGC；將42位的***酸置換成丙胺酸，將其對應的核苷酸序列124-126位處的密碼子TTC變為GCA；將71位的天冬醯胺置換成穀胺醯胺，將其對應的核苷酸序列211-213位處的密碼子AAT變為CAG。將72位的亮胺酸置換成甘胺酸，將其對應的核苷酸序列214-216位處的密碼子CTG變為GGC，獲得變體IL-2-22。
> IL-2-22的核酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0057-74
Figure 108146978-A0101-12-0057-75
(SEQ NO ID.33)
> IL-2-22的胺基酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0057-76
Figure 108146978-A0101-12-0057-77
(SEQ ID NO：34)
在一種變體中，11位的穀胺醯胺置換成半胱胺酸，將其對應的核苷酸序列31-33位處的密碼子CAG變為TGT；29-44位的肽段置換為QSMHIDATL，將其對應的核苷酸序列85-132位處的密碼子AACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATTC變為CAGAGCATGCATATTGATGCAACCCTG；將132位的亮胺酸置換成半胱胺酸，將其對應的核苷酸序列394-396位處的密碼子CTG變為TGT，獲得變體IL-2-23。
> IL-2-23的核酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0058-78
Figure 108146978-A0101-12-0058-79
(SEQ NO ID.35)
> IL-2-23的胺基酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0058-80
Figure 108146978-A0101-12-0058-81
(SEQ ID NO：36)
在一種變體中，26位的天冬醯胺置換成穀胺醯胺，將其對應的核苷酸序列76-78位處的密碼子AAC變為CAG；29位的天冬醯胺置換成絲胺酸，將其對應的核苷酸序列85-87位處的密碼子AAC變為AGC；將88位的天冬醯胺置換成精胺酸，將其對應的核苷酸序列262-264位處的密碼子AAT變為CGT，獲得變體IL-2-24。
> IL-2-24的核酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0058-82
Figure 108146978-A0101-12-0059-83
Figure 108146978-A0101-12-0059-84
(SEQ NO ID.40)
> IL-2-24的胺基酸序列：
Figure 108146978-A0101-12-0059-85
Figure 108146978-A0101-12-0059-86
(SEQ NO ID.41)
上述變體的基因序列經合成後，連接至pET-9a的Nde I和BamH I兩個酶切位點，得到IL-2各變體的重組表達載體。
3．野生型IL-2及變體的重組表達與製備
將上述重組表達載體轉化到BL21(DE3)菌株(Novagen，Cat.69450-3)，得到野生型IL-2及變體的重組菌，將重組菌塗佈在含Kan抗性的LB平板進行篩選。
挑取Kan篩選後的單菌落於10mL LB培養基，37℃，220rpm培養至OD600為1.2±0.2，加入50%甘油至終濃度為10%，分裝至凍存管中(1mL/管)，保存於-80℃。
取凍存的甘油管1支，於37℃水浴中復蘇，接種至1L的LB培養基中，37℃，220rpm培養至OD600為0.6~1.0，加入1M的IPTG使其終濃度為1mM，37℃，220rpm誘導培養4h。誘導結束後，收集菌體。
菌體經破碎，包涵體變性、複性、純化，經檢測獲得野生型IL-2及變體的目的蛋白。
實施例2：PEG化的IL-2及其變體的製備
取IL-2蛋白，蛋白濃度為2mg/mL，所處的緩衝體系為10mM乙酸-乙酸鈉緩衝液，pH 5.0，向IL-2蛋白溶液中加入20kDa的mPEG-丁醛水溶液，mPEG-丁醛的物質的量為蛋白量的1-2倍；向反應體系中加入氰基硼氫化鈉水溶液，氰基硼氫化鈉的物質的量為蛋白量的50-100倍；25℃攪拌反應約15-20小時後，加入甘胺酸水溶液終止反應，甘胺酸的終濃度為30mM。終止後的PEG修飾液使用反相高效液相色譜純化，將雙/多修飾、裸蛋白等雜質與單PEG修飾IL-2分開。收集目的組分，置換緩衝液並進行活性、結合能力分析。
經檢測，獲得PEG化的IL-2及其變體。
實施例3：IL-2及其變體的穩定性研究
1、野生型IL-2及其變體的化學穩定性
野生型IL-2樣品(緩衝體系為10mM Tris-HCl，50mg/ml甘露醇，0.18mg/ml SDS，pH 8.5)，置於40℃、30天進行穩定性研究，取樣液質肽圖分析降解情況。
檢測方法：取樣品0.5mL加入0.5mL變性溶液(8mol/L鹽酸胍，0.2mol/L Tris-HCl，pH 9.0)，加入8μl 1mol/L DTT(二硫蘇糖 醇)混勻，25℃水浴1小時。然後加入35μl 0.5mol/L IAC，25℃水浴1小時。經PD-10柱將樣品置換在酶解緩衝液(2moL/L尿素，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.3)中。取置換緩衝液後的樣品0.5mL加入12.5μg胰蛋白酶，25℃水浴18小時，加鹽酸終止反應，進行液質肽圖分析。
液質肽圖檢測結果見表2。放置30天後，含有N26和N29的酶切片段9-32(即第9-32位胺基酸肽段)，檢測到三個脫胺增加明顯的片段(即9-32A、9-32B、9-32C)。在對變體研究的過程中，考察了IL-2-08(F42A/L72G)、IL-2-22(N26Q/N29S/F42A/N71Q/L72G)兩個變體的穩定性，取樣檢測降解情況，方法同野生型IL-2。結果見表2。
實驗結果表明，IL-2-08和野生型IL-2在9-32的肽段上均出現三個脫胺增加明顯的片段，脫胺增加量相似，說明F42A/L72G的突變沒有影響9-32肽段上發生的脫胺。另一方面，IL-2-22和IL-2-24上的N26和N29的突變降低了兩個位點所在片段的脫胺情況，30天後，檢測到脫胺片段增加<0.5%(未統計在表內)，說明N26Q和N29S可以增加IL-2的穩定性。
表2. IL-2變體的穩定性結果(N26和N29位點)
Figure 108146978-A0101-12-0062-87
此外，在IL-2-08(F42A/L72G)中，發現55-76酶切序列上出現脫胺增加較明顯的四個片段(即55-76A、55-76B、55-76C、55-76D)。考察了將N71突變成Q的效果，即IL-2-22(N26Q/N29S/F42A/N71Q/L72G)，其穩定性結果見表3。N71位點的突變，使得55-76酶切序列上脫胺片段數量減少，脫胺增加量降低，顯著改善了脫胺情況，蛋白更加穩定，設計符合預期。
表3. IL-2變體的穩定性結果(N71位點)
Figure 108146978-A0101-12-0063-88
2、野生型IL-2及變體的熱穩定性
用Uncle(Unchained labs)儀器對1mg/mL IL-2樣品(緩衝體系為10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH 4.5，10%海藻糖)進行穩定性研究。樣品的溫度以0.3℃/分鐘的速度從25℃升至95℃，同時以266nm光激發樣品中的色胺酸，並觀測樣品在300-400nm下的發射光(emission)。按照下面的公式計算熔解溫度(Tm)，其中λ為波長(300-400nm)，I(λ)為該波長下發射光強，BCM為重心平均值(barycentric mean)，即以光強加權的波長。
Figure 108146978-A0101-12-0063-89
隨著溫度的增加，樣品的BCM參數發生變化，反映了蛋白質構象的變化。野生型IL-2存在兩個熔解溫度，說明IL-2在完全去折疊前經歷了兩個階段，第一個去折疊階段需要的能量相對於第二階段較低。N26Q和N30S突變雖然基本不影響第一個熔解溫度，但卻使得第二個熔解溫度顯著升高；而IL-2-03、IL-2-04、IL-2-05則不存在第一個熔解溫度，第二個熔解溫度相比野生型也有顯著升高。
IL-2變體的熱穩定性實驗結果見第1A圖至第1F圖和表4。實驗結果說明N26Q、N30S、Q11C/L132C、L70C/P82C、G27C/F78C突變提高了IL-2的熱穩定性。
表4. 野生型IL-2及其變體的溶解溫度
Figure 108146978-A0101-12-0064-201
實施例4：IL-2變體與白介素2受體alpha(IL-2Rα)的結合親和力測定
使用ELISA實驗檢測IL-2及其變體與IL-2Rα的結合特性。包被帶his標簽的IL-2Rα重組蛋白，加入IL-2後，藉由加入HRP偶聯的抗IL-2多株抗體和HRP受質TMB檢測抗體與抗原結合的活性。
用2μg/mL帶his標簽的IL-2Rα重組蛋白(SinoBiological，Cat# 10165-H08H)包被96孔酶標板，4℃孵育過夜。洗液洗三遍，每孔250μl。每次洗滌震盪10秒以保證充分清洗。加入200μl/孔封閉液室溫孵育2小時。洗液洗三遍，每孔250μl。每次洗滌震盪10秒以保證充分清洗。每孔加100μl用稀釋液稀釋好的IL-2及其變體。室溫孵育1小時。洗液洗三遍，每孔250μl。每孔加入100μl用稀釋液按0.1μg/mL的HRP標記的抗IL-2多株抗體(SinoBiological，Cat# 11848-T16)。室溫孵育1小時。洗液洗三遍，每孔250μl。每孔加入100μl TMB，避光反應15分鐘。加入50μl每孔的0.16M硫酸。Thermo MultiSkanFc酶標儀讀取450nm OD值，計算IL-2及其變體與IL-2Rα的結合EC50值。
實施例4中變體與IL-2Rα的ELISA結合數據見第2圖和表5。結果表明，第一類突變，即N26Q、N30S、Q11C/L132C、L70C/P82C、G27C/F78C、N29S突變並不影響IL-2與IL-2Rα的結合。而第二類突變，即F42A/Y45A、F42A/L72G、Y45A/L72G、29-44突變為QSMHIDATL，則極大的降低了IL-2與IL-2Rα的結合，在實驗條件下幾乎觀測不到二者的結合。將兩類突變進行組合時，由於含有第二類突變，也降低了IL-2與IL-2Rα的結合。
>IL-2Rα(His標簽)
Figure 108146978-A0101-12-0066-91
Figure 108146978-A0101-12-0066-92
(SEQ ID NO.37)
表5. ELISA檢測IL-2變體與低親和力受體IL-2Rα結合的EC50
Figure 108146978-A0101-12-0066-93
使用Octet RED96e(Fortebio)來檢測IL-2、PEG-IL-2-10、PEG-IL-2-22、PEG-IL-2-23與IL-2Rα的親和力。
將HIS1K生物傳感器(Fortebio，18-5120)浸泡在200μL的PBS，pH 7.4，0.02% tween-20，0.1% BSA緩衝液中10分鐘，進行濕潤處理。然後，將帶有His標簽的人IL-2Rα(SinoBiological，Cat# 10165-H08H)溶於PBS，pH 7.4，0.02% tween-20，0.1% BSA中，將傳感器置於200μL該溶液中。將傳感器浸泡於200μL PBS，pH 7.4，0.02% tween-20，0.1% BSA緩衝液中，以洗脫多餘的IL-2Rα。然後將PEG-IL-2-10，PEG-IL-2-22，PEG-IL-2-23分別用PBS，pH 7.4，0.02% tween-20，0.1% BSA緩衝液稀釋至133.3nM。將傳感器分別置於不同濃度的IL-2溶液中，進行300秒結合。然後將傳感器再置於200μL 1 X PBS，pH 7.4，0.02% tween-20，0.1% BSA中進行600秒IL-2的解離。表6實驗結果表明，PEG-IL-2-10、PEG-IL-2-22、PEG-IL-2-23不結合IL-2Rα。
表6. IL-2變體與低親和力受體IL-2Rα的結合親和力(Octet)
Figure 108146978-A0101-12-0067-94
 (註：N.A.，檢測不到，由於這些變體與IL-2Rα的結合力較低，在實驗所用濃度範圍內無法藉由擬合數據得到親和力。)
實施例5：IL-2及變體與IL-2受體beta/gamma(IL-2Rβ/γ)的結合親和力測定
Biacore實驗被用來檢測實施例1中IL-2及其變體與IL-2Rβ/γ的結合力。
首先，IL-2Rβ和IL-2Rγ亞基被分別選殖、融合到Fc hole和Fc knob上(SEQ ID NO 38和39)，用於製備工具分子IL-2Rβ/γ-Fc異源二聚體。IL-2Rβ-Fc-hole和IL-2Rγ-Fc-knob被同時轉染到HEK293細胞中。異源二聚體先後用Protein A和分子篩Superdex 200純化。經檢測，獲得IL-2Rβ/γ蛋白。
>IL-2Rβ(Fc hole)
Figure 108146978-A0101-12-0068-95
Figure 108146978-A0101-12-0069-96
Figure 108146978-A0101-12-0069-97
(SEQ NO ID.38)
>IL-2Rγ(Fc knob)
Figure 108146978-A0101-12-0069-98
Figure 108146978-A0101-12-0069-99
(SEQ NO ID.39)
用Biacore儀器(Biacore T200，GE)的Protein A傳感芯片(GE，Cat# 29127556)捕獲IL-2Rβ/γ-Fc，其中IL-2Rβ/γ-Fc用1×HBS-EP稀釋至1μg/mL，以10μL/min的流速持續30秒。然後，在芯片表面以30μL/min的流速流經一系列濃度梯度的IL-2及其變體，結合持續120秒，解離持續360秒，利用Biacore儀器(Biacore X100，GE)實時檢測反應信號，獲得結合和解離曲線。在每個循環解離完成後，用10mM Gly-HCl pH 1.5將芯片洗淨再生。實驗得到的數據以1：1結合模型進行擬合，得出IL-2及其變體與中親和力受體IL-2Rβ/γ的結合力數值，見表7。
結果表明，N26Q、N30S、Q11C/L132C、L70C/P82C、G27C/F78C、F42A/Y45A、F42A/L72G、Y45A/L72G、N26Q/N30S/F42A/L72G、29-44位突變為QSMHIDATL，包括突變之間的組合，均對IL-2與IL-2Rβ/γ的結合影響不大。
表7. IL-2及其變體與中親和力受體IL-2Rβ/γ的親和力
Figure 108146978-A0101-12-0070-100
用類似的方法藉由Biacore檢測PEG-IL-2-10、PEG-IL-2-22、PEG-IL-2-23與IL-2Rβ/γ的親和力，結果見表8。結果顯示，IL-2變體在偶聯了PEG後，與IL-2Rβ/γ的結合有一定程度的降低，但仍保持較強親 和力。實驗結果表明，相比野生型IL-2，IL-2-24幾乎不與IL-2Rβ結合，也即，N26Q/N29S/N88R降低IL-2與IL-2Rβ的結合(此處結果未顯示)。
表8. PEG-IL-2變體與中親和力受體IL-2Rβ/γ的親和力
Figure 108146978-A0101-12-0071-202
實施例6：IL-2及變體的高親和力受體IL-2Rα/β/γ介導的細胞活性
CTLL2為小鼠來源細胞株，同時表達IL-2Rα、β、γ，可用於評估各IL-2變體的高親和力受體IL-2Rα/β/γ介導的細胞活性。依據在不同IL-2或其變體的濃度下，檢測CTLL-2的增殖速率，以評價IL-2或其變體的生物學活性。
完全培養液：RPMI 1640+2mM L-穀胺醯胺+1mM丙酮酸鈉+10%胎牛血清+10% T-STIM，培養物補充有伴刀豆球蛋白A(concanavalin-A)(含有IL-2)；基礎培養基：RPMI 1640+2mM L-穀胺醯胺+1mM丙酮酸鈉+10%胎牛血清。
CTLL-2細胞增殖實驗：CTLL-2細胞用完全培養液於37℃、5% CO2條件下培養至2.0×105個細胞/mL的密度，對細胞進行繼代，3-4天後離心收集CTLL-2細胞，用PBS洗滌3次，重新懸浮於基礎培養液中配製成每mL含2.0×105個細胞的細胞懸液，置於96孔板中，每孔90μL細胞。加入10μL的10×相應濃度的用基礎培養液調配的IL-2濃縮液，把細胞置於37 ℃、5% CO2條件下。培養24小時後，每孔加入裂解液100μL的CELLTITER-Glo試劑(Promega)，混勻細胞板中的液體，放入酶標儀，以630nm為參比波長，在波長570nm處測定吸光度，記錄測定結果。
數據採用計算機程序或四參數回歸計算法進行擬合，並按下式進行計算結果：
供試品相對生物學活性(%)=對照品EC50/供試品EC50(EC50：半最大效應濃度)。
IL-2及其變體的活性數據見表9、表10和第3A圖至第3C圖。結果表明，第一類突變，即N26Q、N29S、N30S、Q11C/L132C、L70C/P82C、G27C/F78C突變並不影響甚至略有增強IL-2對CTLL2細胞的促增殖活性；而第二類突變，即F42A/Y45A、F42A/L72G、Y45A/L72G、29-44突變為QSMHIDATL，則由於降低了IL-2與IL-2Rα的結合，也降低了IL-2對CTLL2細胞的增殖活性。
表9. IL-2變體對CTLL2-細胞的促增殖活性
Figure 108146978-A0101-12-0073-102
表10. IL-2變體對CTLL2-細胞的促增殖活性
Figure 108146978-A0101-12-0074-103
實施例7：IL-2及變體的中親和力受體IL-2Rβ/γ介導的細胞活性
Mo7e為人源細胞系，只表達IL-2Rβ、γ，不表達IL-2Rα，可用於評估各IL-2變體的中親和力受體IL-2Rβ/γ介導的細胞活性。依據在不同IL-2或其變體的濃度下，其細胞依賴株Mo7e的增殖速率，檢測IL-2或其變體的生物學活性。
完全培養液：RPMI 1640+2mM L-穀胺醯胺+1mM丙酮酸鈉+10%胎牛血清+15ng/mL GM-CSF；基礎培養基：RPMI 1640+2mM L-穀胺醯胺+1mM丙酮酸鈉+10%胎牛血清。
Mo7e細胞增殖實驗：Mo7e細胞用完全培養液於37℃、5% CO2條件下培養至2.0×105個細胞/mL的密度，對細胞進行繼代，3-4天後離心收集Mo7e細胞，用PBS洗滌3次，重新懸浮於基礎培養液中配製成每mL含2.0×105個細胞的細胞懸液，置於96孔板中，每孔90μL細胞。加入10μL 10×相應濃度的用基礎培養液調配的IL-2濃縮液，把細胞置於37℃、5% CO2條件下。培養72小時後，每孔加入裂解液100μL CELLTITER-Glo試劑(Promega)，混勻細胞板中的液體，放入酶標儀，以630nm為參比波長，在波長570nm處測定吸光度，記錄測定結果。用實施例6中相同方法計算相對生物學活性。
IL-2及其變體的Mo7e細胞增殖活性數據見表11和第4A圖至第4C圖。結果表明，第一類突變，即N26Q、N29S、N30S、Q11C/L132C、L70C/P82C、G27C/F78C突變，和第二類突變即F42A/Y45A、F42A/L72G、Y45A/L72G、29-44突變為QSMHIDATL突變，均不影響IL-2的促Mo7e細胞的增殖活性，即，不影響IL-2與IL-2Rβ/γ的親和力。在IL-2上偶聯PEG雖然會在一定程度上降低IL-2的促Mo7e細胞的增殖活性，但仍能保持較好結合。
表11. IL-2及其變體的促Mo7e-細胞增殖活性
Figure 108146978-A0101-12-0076-104
實施例8：IL-2及變體對CTLL2細胞STAT5磷酸化活性的測定
依據在不同的IL-2或其變體的濃度下，其細胞依賴株CTLL-2中STAT5磷酸化水平，檢測IL-2或其變體的生物學活性。
完全培養液：RPMI 1640+2mM L-穀胺醯胺+1mM丙酮酸鈉+10%胎牛血清+10% T-STIM culture supplement with concanavalin-A(含有IL-2)；基礎培養基：RPMI 1640+2mM L-穀胺醯胺+1mM丙酮酸鈉+10%胎牛血清。
CTLL-2細胞STAT5磷酸化實驗：CTLL-2細胞用完全培養液於37℃、5% CO2條件下培養至每mL2.0×105個細胞的密度，用PBSA(PBS，pH7.2，1% BSA)洗滌1次，調整密度至每mL含1.0×106個細胞， 按每管500μL的體積分裝至流式管中，加入相應濃度的用基礎培養液調配的IL-2濃縮液，室溫孵育20分鐘後，立即加入多聚甲醛，至終濃度1.5%，渦旋混勻，室溫孵育10分鐘。加入1mL PBS，4℃、1400rpm離心5分鐘，去除多聚甲醛。重新懸浮細胞，加入1mL4℃預冷的100%甲醇，渦旋混勻，4℃孵育20分鐘。加入3mLPBSA緩衝液，4℃、1400rpm離心5分鐘，清洗細胞2次。加入偶聯了Alexa Fluor 647的抗STAT5-pY694抗體(BD，Cat# 612599)室溫避光孵育30分鐘。加入3mL PBSA清洗兩次，用流式細胞儀進行檢測。用實施例6中相同方法計算相對生物學活性。
IL-2及其變體的CTLL2細胞STAT5磷酸化活性數據見第5圖和表12。結果表明，N26Q、N29S、N30S突變並不影響甚至略有增強IL-2的CTLL2細胞STAT5磷酸化活性，而F42A/Y45A、F42A/L72G、Y45A/L72G降低了IL-2的CTLL2細胞STAT5磷酸化活性，進而能夠證明N26Q、N29S、N30S不影響IL-2與高親和力受體IL-2Rα/β/γ的結合，而F42A/Y45A、F42A/L72G、Y45A/L72G會降低IL-2與高親和力受體IL-2Rα/β/γ的結合。
表12. IL-2野生型及其變體的CTLL2-細胞STAT5磷酸化活性
Figure 108146978-A0101-12-0078-204
實施例9：IL-2及變體對人外周血(PBMC)STAT5磷酸化活性的測定
依據在IL-2或其變體的不同濃度下，人外周血中各細胞群體(包括Treg，NK細胞，CD4+ T細胞，CD8+ T細胞)中STAT5磷酸化水平，檢測IL-2的生物學活性。
基礎培養基：RPMI 1640+10%胎牛血清。
抗體混合物：CD3 APC-Cy7(BD 557832)，CD4 BB515(BD 564419)，CD8 BB700(BD 566452)，CD25 BV421(BD 564033)，FOXP3 PE(BD 560852)，CD56 BV650(BD 564057)，pSTAT5 AF647(BD 562076)。
人PBMC STAT5磷酸化實驗：將新鮮分離的人PBMC細胞用基礎培養基調整至每mL6.0×106個細胞的密度，取90μL置於96孔板中。將 IL-2及其變體和衍生物用基礎培養基稀釋至1000nM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM，取10μL加入90μL PBMC中，37℃刺激15分鐘。之後立即用預熱的BD Cytofix緩衝液(BD，Cat No.554655)在37℃固定細胞10分鐘。350g 4℃離心7分鐘。去除上清液，加入200μL在-20℃預冷的BD Phosflow Perm Buffer III(BD，Cat No.558050)在冰上破膜30分鐘。450g 4℃離心7分鐘。去除上清液，加入200μL PBS，pH 7.4洗滌兩次。加入100μL按1：200稀釋的FcR blocker，在4℃下溫育20分鐘。450g 4℃離心7分鐘。去除上清液，加入100μL抗體混合物，對細胞在室溫下染色40分鐘。450g 4℃離心7分鐘。去除上清液，加入200μL PBS，pH 7.4洗滌一次，用200L μL PBS，pH 7.4重新懸浮PBMC，用流式細胞儀檢測。NK細胞定義為CD3-CD56+的細胞，CD8+ T細胞定義為CD3+CD4-CD8+的細胞，Treg定義為CD3+CD4+CD25+Foxp3+的細胞。
對上述三個細胞群在不同IL-2濃度條件下的pSTAT5螢光數值(MFI)進行統計，採用計算機程序或四參數回歸計算法進行擬合，用實施例6中相同方法計算相對生物學活性。
結果表明，F42A/L72G和IL-2-10以及IL-2-23中的突變，由於只降低IL-2與IL-2Rα的結合，但並不影響IL-2與IL-2Rβ/γ的結合，使得這些突變對Treg活性的降低大於對CD8+T細胞和NK細胞活性的降低。相反，N88R由於不影響IL-2與IL-2Rα的結合，但降低IL-2與IL-2Rβ的結合，使得IL-2對Treg活性的降低小於對CD8+T細胞活性的降低。在IL-2上偶聯PEG，均會導致一定程度上IL-2對CD8+T細胞和NK細胞激活活性的降低。
IL-2變體的PBMC細胞STAT5磷酸化活性數據見表13、表14、表15和第6A圖至第6C圖。
表13. IL-2及其變體的人Treg細胞STAT5磷酸化活性
Figure 108146978-A0101-12-0080-106
表14. IL-2及其變體的人CD8+ T細胞磷酸化活性
Figure 108146978-A0101-12-0080-107
表15. IL-2及其變體的人NK細胞STAT5磷酸化活性
Figure 108146978-A0101-12-0081-108
實施例10：IL-2及其變體對Balb/c小鼠外周血免疫細胞影響的測定
BALB/c小鼠(購自上海靈暢生物科技有限公司)，雌性，4-8週齡，體重18-20g，在正式實驗前，適應性飼養5天。所有的BALB/c小鼠飼養於SPF級動物房IVC恆溫恆壓系統中，其中溫度20~26℃，濕度40~70%，光照週期12小時明/12小時暗。每個籠盒內飼養不多於6隻BALB/c小鼠，籠盒大小為325mm×210mm×180mm，籠盒內使用墊料為玉米芯，每週更換兩次。在整個實驗過程中，所有實驗小鼠均可以自由飲食，飼料和水均經過高壓滅菌，每週更換2次。所有出入動物飼養室或實驗操作人員均穿戴滅菌實驗服、一次性醫用口罩和橡膠手套。每只飼養籠均有對應的明確的詳細標簽，標簽內容包括：IACUC批准號LDIACUC006、動物數目、性別、品系、接收日期、項目編號、組別、目前實驗階段和實驗負責人等。在整個實驗過程中，對實驗動物的使用和觀察均按照AAALAC動物使用和管理的相關規定進行。在按照常規實驗過程中，對所有的實驗動物進行行為、進食、進水、體重改變、毛髮光澤和其他一些異常情況的監測和記錄。
小鼠按照體重進行分組，分組後開始給藥，給藥種類、給藥劑量和給藥途徑見表16和第7A圖至第7D圖。模型分組當天為第0天。
每個時間點採血並測定血液體積後，新鮮採集的抗凝血用紅細胞裂解液裂解紅細胞，PBS洗一次。用含有1% FBS的PBS配製混合染色液。混合染色液包括CD3 APC-Cy7(Biolegend 100329)、CD8 PE(Biolegend 100708)、CD4 PE-Cy7(eBioscience 25-0042-82)、CD25 PerCP-Cy5.5(BD 561112)和CD49b-APC(Biolegend 108909)。每個樣本加入100μL混合染色液，4度溫育30分鐘。用含有1% FBS的PBS洗兩次。用True-NuclearTM Transcription Factor Buffer Set(Biolegend 424401)進行固定破膜60分鐘，100μL抗小鼠Foxp3抗體(Biolegend 126405)室溫孵育60分鐘。用PBS，pH 7.4洗液洗兩次，最後用500μLPBS，pH 7.4洗液重新懸浮，上機分析。NK細胞定義為CD3-CD49b+的細胞，CD8+ T細胞定義為CD3+CD4-CD8+的細胞，Treg定義為CD3+CD4+CD25+Foxp3+的細胞。根據采血體積，計算各細胞群在外周血中的細胞密度。
表16. PEG-IL-2-22治療的給藥方案
Figure 108146978-A0101-12-0083-109
實驗過程中，PEG-IL-2-22在第0天經尾靜脈注射給藥，並在第0、2、3、4、5、6、10天分別進行小鼠血液採集和流式分析。血液中各細胞群密度結果顯示：與第0天相比，小鼠的全細胞中，CD3-CD49b+的NK細胞，其密度在第3天時出現顯著上升，且呈現劑量依賴，在第10天時基本恢復給藥前密度；CD8+ T細胞密度在第3天時出現顯著上升，且呈現劑量依賴，在第5天時基本恢復給藥前密度；調節性T細胞(Treg)的密度在第3天時出現顯著上升，在第4天時即基本恢復給藥前密度。
實驗過程中，不同劑量PEG-IL-2-22受試藥物組所有小鼠均未出現體重下降和行為異常現象，表明小鼠對該受試劑量下的藥物具有良好的耐受性。
表17. PEG-IL-2-24給藥和治療
Figure 108146978-A0101-12-0084-110
結果顯示，PEG-IL-2-24給藥第三天後，在高(5mg/kg)、中(1mg/kg)、低(0.2mg/kg)下均可以刺激Treg的增殖，並呈現劑量效應；CD4+ T細胞和CD8+ T細胞在CD3+ T細胞中的百分比在三個劑量下均無變化，顯示了PEG-IL-2-24對Treg的優先激活。結果見第8A圖至第8F圖。
實施例11：IL-2及其變體在小鼠的鼠源性結腸癌腫瘤模型中的藥效評估
鼠源性結腸腺癌CT26.WT細胞(來源於中國科學院上海細胞庫(SIBC))，復蘇P4+1***始擴增，培養於含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液中。收集指數生長期的CT26.WT細胞，HBSS重新懸浮至1×106/mL，無菌條件下，移植於BALB/c小鼠皮下，每隻小鼠接種1×105個細胞。當瘤體積達到80-100mm3左右時分組，分組後開始第一次給藥，詳細的給藥方法、給藥劑量和給藥途徑見表18，模型分組當天為第0天。
表18. PEG-IL-2-22給藥方案
Figure 108146978-A0101-12-0085-111
給藥開始後，小鼠每週3次測量體重及腫瘤體積，腫瘤體積(mm3)=0.5×(腫瘤長徑×腫瘤短徑2)計算。相對腫瘤抑制率TGI(%)：TGI %=(1-T/C)×100%。T/C %為相對腫瘤增值率，即在某一時間點，治療組和對照組相對腫瘤體積或瘤重的百分比值。T和C分別為治療組和對照組在某一特定時間點的腫瘤體積(TV)或瘤重(TW)。實驗結果見表19和第9圖。
表19. PEG-IL-2-22在CT26模型腫瘤中的抑瘤效果
Figure 108146978-A0101-12-0085-112
本實驗檢測了不同劑量及不同給藥方式的PEG-IL-2-22在小鼠結腸癌細胞CT26同種移植模型中的藥效。結果顯示，皮下給藥中劑量組(G3)，PEG-IL-2-22 6mg/kg s.c.Q5D*5給藥後第12天，平均腫瘤體積為1297.5±263.52mm3，顯著低於對照組同日腫瘤體積(2577.6±360.91mm3，TGI=51%，p=0.0168)。皮下給藥高劑量組(G4)，PEG-IL-2-22 9mg/kg s.c.Q5D*5給藥後第12天，平均腫瘤體積為1168.6±352.3mm3，顯著低於對照組同日腫瘤體積(2577.6±360.91mm3，TGI=56%，p=0.0190)。靜脈給藥中劑量組(G6)，PEG-IL-2-226mg/kg i.v.Q5D*5給藥後第12天，平均腫瘤體積為1122.2±418.6mm3，顯著低於對照組同日腫瘤體積(2577.6±360.91mm3，TGI=58%，p=0.0265)。
實施例12：IL-2及其變體在小鼠的人源黑色素瘤腫瘤模型中的藥效評估
NCG小鼠，雌性，4-8週，體重約18-22g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司。所有的NCG小鼠按照SPF級動物房IVC恆溫恆壓系統條件培養。
A375細胞培養在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液中。收集指數生長期的A375細胞，HBSS重新懸浮至適合濃度用於NCG小鼠皮下腫瘤接種。共培養所用的A375細胞需經過Mitomycin C處理2h後，PBS洗三次。取正常人外周血，用密度梯度離心法分離人PBMC，計數。然後用RPMI1640培養基(含IL-2和10% FBS)將PBMC重新懸浮至3×106個/mL的濃度，與Mitomycin C處理後的A375細胞共培養。共培養8天後，收 取PBMC，同時收取新鮮消化下來的A375細胞。每隻老鼠接種：PBMC 8×105個，A375細胞4×106個；接種體積：0.2ml/隻(含50% Matrigel)；接種於雌性NCG小鼠右側皮下，總計接種30隻小鼠。根據小鼠體重隨機進行分組給藥，詳細的給藥方法、給藥劑量和給藥途徑見表20，分組給藥當天為第0天。
表20. PEG-IL-2-22給藥方案
Figure 108146978-A0101-12-0087-113
給藥開始後，小鼠每週2次測量體重及腫瘤體積。實驗結果分別見表21和第10圖。
表21. PEG-IL-2-22在小鼠人源A375腫瘤模型中的抑瘤效果
Figure 108146978-A0101-12-0087-114
實驗結束時(給藥後第27天)，與PB組相比，PEG-IL-2-220.03mg/kg，尾靜脈注射)給藥組、PEG-IL-2-22(0.1mg/kg，尾靜脈注 射)給藥組、PEG-IL-2-22(0.03mg/kg，皮下注射)給藥組、PEG-IL-2.22(0.1mg/kg，皮下注射)給藥組的腫瘤體積與重流重量均存在極顯著性差異(P值均小於0.001)，表現出明顯的腫瘤生長的抑制作用。
實施例13：IL-2及其變體的免疫原性分析
經計算機模擬分析，IL-2變體相比野生型IL-2計算模擬的T細胞表位(T cell epitope，TCE)數目大致相當或有所減少，見表22。結果表明，各IL-2變體中的胺基酸突變不會導致對IL-2用於治療相關用途的免疫原性產生不利影響。
表22. IL-2變體的T細胞表位
Figure 108146978-A0101-12-0088-115
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 上海恆瑞醫藥有限公司 上海盛迪醫藥有限公司
<120> 一種人白細胞介素2變體或其衍生物
<130> 719086CPCT
<160> 41
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 417
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(417)
<223> 野生型IL-2核酸序列
<400> 1
Figure 108146978-A0101-12-0089-116
<210> 2
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(134)
<223> 野生型IL-2胺基酸序列
<400> 2
Figure 108146978-A0101-12-0089-117
Figure 108146978-A0101-12-0090-118
<210> 3
<211> 417
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(417)
<223> IL-2-01的核酸序列
<400> 3
Figure 108146978-A0101-12-0090-119
<210> 4
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(134)
<223> IL-2-01的胺基酸序列
<400> 4
Figure 108146978-A0101-12-0090-120
Figure 108146978-A0101-12-0091-121
<210> 5
<211> 417
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(417)
<223> IL-2-02的核酸序列
<400> 5
Figure 108146978-A0101-12-0091-122
<210> 6
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(134)
<223> IL-2-02的胺基酸序列
<400> 6
Figure 108146978-A0101-12-0091-123
Figure 108146978-A0101-12-0092-124
<210> 7
<211> 417
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(417)
<223> IL-2-03的核酸序列
<400> 7
Figure 108146978-A0101-12-0092-125
<210> 8
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(134)
<223> IL-2-03的胺基酸序列
<400> 8
Figure 108146978-A0101-12-0092-126
<210> 9
<211> 417
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 對偶基因
<222> (1)..(417)
<223> IL-2-04的核酸序列
<400> 9
Figure 108146978-A0101-12-0093-127
<210> 10
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(134)
<223> IL-2-04的胺基酸序列
<400> 10
Figure 108146978-A0101-12-0093-128
<210> 11
<211> 417
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(417)
<223> IL-2-05的核酸序列
<400> 11
Figure 108146978-A0101-12-0094-129
<210> 12
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(134)
<223> IL-2-05的胺基酸序列
<400> 12
Figure 108146978-A0101-12-0094-130
<210> 13
<211> 396
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(396)
<223> IL-2-06的核酸序列
<400> 13
Figure 108146978-A0101-12-0095-131
<210> 14
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(124)
<223> IL-2-06的胺基酸序列
<400> 14
Figure 108146978-A0101-12-0095-132
<210> 15
<211> 417
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(417)
<223> IL-2-07的核酸序列
<400> 15
Figure 108146978-A0101-12-0095-133
Figure 108146978-A0101-12-0096-134
<210> 16
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(134)
<223> IL-2-07的胺基酸序列
<400> 16
Figure 108146978-A0101-12-0096-135
<210> 17
<211> 417
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(417)
<223> IL-2-08的核酸序列
<400> 17
Figure 108146978-A0101-12-0096-136
<210> 18
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(134)
<223> IL-2-08的胺基酸序列
<400> 18
Figure 108146978-A0101-12-0097-207
<210> 19
<211> 417
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(417)
<223> IL-2-09的核酸序列
<400> 19
Figure 108146978-A0101-12-0097-138
<210> 20
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(134)
<223> IL-2-09的胺基酸序列
<400> 20
Figure 108146978-A0101-12-0098-139
<210> 21
<211> 417
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(417)
<223> IL-2-10的核酸序列
<400> 21
Figure 108146978-A0101-12-0098-140
<210> 22
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(134)
<223> IL-2-10的胺基酸序列
<400> 22
Figure 108146978-A0101-12-0099-141
<210> 23
<211> 417
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(417)
<223> IL-2-11的核酸序列
<400> 23
Figure 108146978-A0101-12-0099-142
<210> 24
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(134)
<223> IL-2-11的胺基酸序列
<400> 24
Figure 108146978-A0101-12-0100-144
<210> 25
<211> 417
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(417)
<223> IL-2-12的核酸序列
<400> 25
Figure 108146978-A0101-12-0100-145
<210> 26
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(134)
<223> IL-2-12的胺基酸序列
<400> 26
Figure 108146978-A0101-12-0100-146
Figure 108146978-A0101-12-0101-147
<210> 27
<211> 417
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(417)
<223> IL-2-13的核酸序列
<400> 27
Figure 108146978-A0101-12-0101-148
<210> 28
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(134)
<223> IL-2-13的胺基酸序列
<400> 28
Figure 108146978-A0101-12-0101-149
Figure 108146978-A0101-12-0102-150
<210> 29
<211> 417
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(417)
<223> IL-2-14的核酸序列
<400> 29
Figure 108146978-A0101-12-0102-151
<210> 30
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(134)
<223> IL-2-14的胺基酸序列
<400> 30
Figure 108146978-A0101-12-0102-152
Figure 108146978-A0101-12-0103-153
<210> 31
<211> 417
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(417)
<223> IL-2-21的核酸序列
<400> 31
Figure 108146978-A0101-12-0103-157
<210> 32
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(134)
<223> IL-2-21的胺基酸序列
<400> 32
Figure 108146978-A0101-12-0103-156
Figure 108146978-A0101-12-0104-158
<210> 33
<211> 417
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(417)
<223> IL-2-22的核酸序列
<400> 33
Figure 108146978-A0101-12-0104-159
<210> 34
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(134)
<223> IL-2-22的胺基酸序列
<400> 34
Figure 108146978-A0101-12-0104-160
<210> 35
<211> 396
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 對偶基因
<222> (1)..(396)
<223> IL-2-23的核酸序列
<400> 35
Figure 108146978-A0101-12-0105-161
<210> 36
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(127)
<223> IL-2-23的胺基酸序列
<400> 36
Figure 108146978-A0101-12-0105-162
<210> 37
<211> 198
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(198)
<223> IL-2R α(His標簽)
<400> 37
Figure 108146978-A0101-12-0106-208
<210> 38
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(466)
<223> IL-2R β(Fc孔)
<400> 38
Figure 108146978-A0101-12-0106-164
Figure 108146978-A0101-12-0107-165
<210> 39
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(492)
<223> IL-2R γ(Fc紐)
<400> 39
Figure 108146978-A0101-12-0108-166
Figure 108146978-A0101-12-0109-167
<210> 40
<211> 417
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(417)
<223> IL-2-24的核酸序列
<400> 40
Figure 108146978-A0101-12-0109-168
<210> 41
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(134)
<223> IL-2-24的胺基酸序列
<400> 41
Figure 108146978-A0101-12-0109-169
Figure 108146978-A0101-12-0110-170

Claims (41)

  1. 一種IL-2變體或其衍生物，其特徵在於，包含第一類突變，該第一類突變為如下1)-7)任一項所示或其任意組合：
    1)N26Q，
    2)N29S，
    3)N30S，
    4)N71Q，
    5)Q11C和L132C，
    6)L70C和P82C，和
    7)G27C和F78C。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的IL-2變體或其衍生物，其還包含第二類突變或第三類突變，其中：
    該第二類突變能夠消除或降低該IL-2變體或其衍生物對高親和力受體(IL-2Rα/β/γ)的親和力，並保留其對中等親和力受體(IL-2Rβ/γ)的親和力；
    該第三類突變能夠降低該IL-2變體或其衍生物對高親和力受體(IL-2Rα/β/γ)和中等親和力受體(IL-2Rβ/γ)的親和力，但對高親和力受體的親和力比對中等親和力受體的親和力降低得更多。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的IL-2變體或其衍生物，其中，該第二類突變選自8)-11)中的任一項或8)-10)的任意組合：
    8)F42A，
    9)Y45A，
    10)L72G，和
    11)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突變為QSMHIDATL；
    該第三類突變選自12)-14)中的任一項或其任意組合：
    12)N88R或N88G或N88I或N88D，
    13)D20H或D20Y，和
    14)Q126L。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的IL-2變體或其衍生物，其中，
    該第一類突變選自15)-17)中的任一項，或15)-17)中的任一項與5)-7)中的任一項的組合：
    15)N26Q和N29S，
    16)N26Q、N29S和N71Q，和
    17)N26Q和N30S；
    該第二類突變選自18)-20)和11)中的任一項：
    18)F42A和Y45A，
    19)F42A和L72G，和
    20)Y45A和L72G；
    該第三類突變為N88R或N88G或N88I或N88D。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的IL-2變體或其衍生物，其中，該IL-2變體或其衍生物包含21)-29)中任一項所示的突變：
    21)N26Q、N29S、F42A、N71Q和L72G，
    22)N26Q、N29S和N88R，
    23)N26Q、N29S、F42A和L72G，
    24)N26Q、N30S、F42A和L72G，
    25)Q11C、N26Q、N30S、F42A、L72G和L132C，
    26)N26Q、N30S、F42A、L70C、L72G和P82C，
    27)N26Q、G27C、N30S、F42A、L72G和F78C，
    28)N29S、F42A和L72G，和
    29)Q11C、29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突變為QSMHIDATL和L132C。
  6. 一種IL-2變體或其衍生物，其特徵在於該IL-2變體或其衍生物的第29-44位胺基酸替換為QSMHIDATL。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的IL-2變體或其衍生物，其中，該IL-2變體或其衍生物還含有如申請專利範圍第1項中1)-7)任一項所示的突變或其任意組合。
  8. 一種IL-2變體或其衍生物，其特徵在於該IL-2變體或其衍生物含有N71Q和L72G的突變。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的IL-2變體或其衍生物，其中，該IL-2變體或其衍生物還含有1)-3)和5)-9)中任一項所述的突變或其任意組合：
    1)N26Q，
    2)N29S，
    3)N30S，
    5)Q11C和L132C，
    6)L70C和P82C，
    7)G27C和F78C，
    8)F42A和
    9)Y45A。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述的IL-2變體或其衍生物，其穩定性是較之野生型IL-2增加的。
  11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項所述的IL-2變體或其衍生物，其還包括C125A的胺基酸突變。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項所述的IL-2變體或其衍生物，其突變是相對於野生型IL-2發生的突變，該野生型IL-2的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中所示突變的位點編號根據SEQ ID NO.2所示的胺基酸序列從第2位的胺基酸A開始計數。
  13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的IL-2變體或其衍生物，其包含選自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.41中任一項所示的胺基酸。
  14. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的IL-2變體或其衍生物，其是單體、和/或PEG化的、和/或糖基化的、和/或白蛋白綴合或融合的、和/或Fc融合的、和/或羥乙基化的、和/或去除O-糖基化的。
  15. 如申請專利範圍第14項所述的IL-2變體或其衍生物，其中，該PEG連接至IL-2變體的N端。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的IL-2變體或其衍生物，其中，該PEG分子量為5KD至50KD。
  17. 如申請專利範圍第16項所述的IL-2變體或其衍生物，其中，該PEG分子量為20KD。
  18. 一種綴合物，其包含如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的IL-2變體或其衍生物，該IL-2變體或其衍生物直接或藉由接頭間接地與非IL-2模塊連接。
  19. 如申請專利範圍第18項所述的綴合物，其中，該非IL-2模塊是抗原結合模塊。
  20. 如申請專利範圍第19項所述的綴合物，其中，該抗原結合模塊是抗體或其抗原結合片段。
  21. 如申請專利範圍第19項所述的綴合物，其中，該抗體或其抗原結合片段靶向腫瘤細胞上或腫瘤細胞環境中呈現的抗原。
  22. 一種醫藥組成物，其含有申請專利範圍第1至17項中任意一項所述的IL-2變體或其衍生物或申請專利範圍第18至21項中任一項所述的綴合物。
  23. 如申請專利範圍第22項所述的醫藥組成物，其中，該醫藥組成物含有藥學上可接受的稀釋劑、載體或助劑。
  24. 一種核酸分子，其編碼申請專利範圍第1至17項中任意一項所述的IL-2變體或其衍生物。
  25. 如申請專利範圍第24項所述的核酸分子，其中，該核酸分子包含選自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.40中任一項所示的多核苷酸。
  26. 一種表達載體，其包含申請專利範圍第24或25項所述的核酸分子。
  27. 一種宿主細胞，其包含申請專利範圍第26項所述的表達載體，或表達申請專利範圍第1至17項中任一項所述的IL-2變體或其衍生物、申請專利範圍第18至21項中任一項所述的綴合物。
  28. 如申請專利範圍第27項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為原核或真核細胞。
  29. 如申請專利範圍第28項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為細菌或酵母菌或哺乳動物細胞。
  30. 如申請專利範圍第28項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為釀酒酵母或大腸桿菌。
  31. 一種申請專利範圍第1至17項中任一項所述的IL-2變體或其衍生物、申請專利範圍第18至21項中任一項所述的綴合物、或申請專利範圍第22或23項所述的醫藥組成物的用途，其用在製備藥物；
    當IL-2變體或其衍生物含有第二類突變時，該藥物用於治療增生性疾病或轉移性增生性疾病、免疫性疾病、調節T細胞介導的免疫應答、刺激個體免疫系統；
    當IL-2變體或其衍生物含有第三類突變時，該藥物用於治療自身免疫性疾病或器官移植之後的自身免疫反應。
  32. 如申請專利範圍第31項所述的用途，其中，該增生性疾病是腫瘤或癌，該免疫性疾病是糖尿病。
  33. 如申請專利範圍第32項所述的用途，其中，該腫瘤或癌選自上皮細胞癌、內皮細胞癌、鱗狀細胞癌、乳頭狀瘤病毒引起的癌、腺癌、癌腫、黑色素瘤、肉瘤、畸胎癌、肺部腫瘤、轉移性肺癌、淋巴瘤和轉移性腎細胞癌。
  34. 如申請專利範圍第31項所述的用途，其中，該自身免疫疾病選自I型糖尿病、類風濕性關節炎、多發性硬化、系統性紅斑狼瘡(SLE)、濕疹、哮喘。
  35. 一種治療增生性疾病或轉移性增生性疾病、免疫性疾病或調節T細胞介導的免疫應答、刺激個體免疫系統的方法，包括向受試者施用治療有效量的申請專利範圍第1至17項中任一項所述的IL-2變體或其衍生物、申請專利範圍第18至21項中任一項所述的綴合物或申請專利範圍第22或23項所述的醫藥組成物，
    其中，該IL-2變體或其衍生物均含有該第二類突變。
  36. 如申請專利範圍第35項所述的方法，其中，該增生性疾病是腫瘤或癌，該免疫性疾病是糖尿病。
  37. 如申請專利範圍第36項所述的方法，其中，該腫瘤或癌選自上皮細胞癌、內皮細胞癌、鱗狀細胞癌、乳頭狀瘤病毒引起的癌、腺癌、癌腫、黑色素瘤、肉瘤、畸胎癌、肺部腫瘤、轉移性肺癌、淋巴瘤和轉移性腎細胞癌。
  38. 一種治療和/或預防自身免疫性疾病或器官移植之後的自身免疫反應的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的申請專利範圍第1至5和10至17項中任一項所述的IL-2變體或其衍生物、申請專利範圍第18至21項中任一項所述的綴合物或申請專利範圍第22或23項所述的醫藥組成物，
    其中，該IL-2變體或其衍生物均含有該第三類突變。
  39. 如申請專利範圍第38項所述的方法，其中，該自身免疫疾病選自I型糖尿病、類風濕性關節炎、多發性硬化、系統性紅斑狼瘡(SLE)、濕疹和哮喘。
  40. 一種製備如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的IL-2變體或其衍生物的方法，該方法包括：
    向野生型人IL-2中引入突變，或
    使用申請專利範圍第24或25項所述的核酸分子，或
    使用申請專利範圍第26項所述的表達載體，或
    使用申請專利範圍第27至30項中任一項的宿主細胞進行重組表達。
  41. 一種增加IL-2或其衍生物、綴合物穩定性的方法，該方法包括在IL-2或其衍生物、綴合物中引入1)-7)任一項所示的突變或其任意組合：
    1)N26Q，
    2)N29S，
    3)N30S，
    4)N71Q，
    5)Q11C和L132C，
    6)L70C和P82C，和
    7)G27C和F78C。
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11692020B2 (en) 2019-11-20 2023-07-04 Anwita Biosciences, Inc. Cytokine fusion proteins, and their pharmaceutical compositions and therapeutic applications
US11897930B2 (en) 2020-04-28 2024-02-13 Anwita Biosciences, Inc. Interleukin-2 polypeptides and fusion proteins thereof, and their pharmaceutical compositions and therapeutic applications
CN114380919A (zh) * 2020-10-18 2022-04-22 北京志道生物科技有限公司 经修饰的il-2分子及其用途
EP4245768A4 (en) * 2020-11-13 2024-05-29 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co Ltd PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING A VARIANT OF HUMAN INTERLEUKIN 2 OR A DERIVATIVE THEREOF AND ITS USE
EP4357357A1 (en) * 2021-07-30 2024-04-24 Yunquan Biotechnology (Beijing) Co., Ltd. Human interleukin-2 variant and use thereof
CN113831402A (zh) * 2021-07-30 2021-12-24 西安龙腾景云生物科技有限公司 一种人白细胞介素2变体及其用途
WO2023046156A1 (en) * 2021-09-26 2023-03-30 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Il-2 variants and fusion proteins thereof
WO2023180527A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Universität Zürich Adenoviral mediated targeting of activated immune cells
WO2024037572A1 (en) * 2022-08-16 2024-02-22 Kine Biotech Co., Ltd. Interleukin-2 variants and their uses in treating cancers
CN117903283A (zh) * 2022-10-19 2024-04-19 北京志道生物科技有限公司 一种il-2突变体
CN116041539B (zh) * 2022-10-31 2023-07-21 山东博安生物技术股份有限公司 Il-2突变体免疫缀合物

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1985000817A1 (en) * 1983-08-10 1985-02-28 Amgen Microbial expression of interleukin ii
DZ2788A1 (fr) 1998-05-15 2003-12-01 Bayer Ag Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2.
US7371371B2 (en) 2001-08-13 2008-05-13 University Of Southern California Interleukin-2 mutants with reduced toxicity
EP1454138B1 (en) * 2001-12-04 2012-01-18 Merck Patent GmbH Immunocytokines with modulated selectivity
US7569215B2 (en) * 2003-07-18 2009-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (IL-2) polypeptides
AU2005227263A1 (en) * 2004-03-05 2005-10-06 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. In vitro test system for predicting patient tolerability of therapeutic agents
GB2415904B (en) * 2005-02-07 2006-10-25 Chiron Corp Preparing aldesleukin for pharmaceutical use
WO2009061853A2 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (il-2) polypeptides
DE102008023820A1 (de) 2008-05-08 2009-11-12 Aicuris Gmbh & Co. Kg Mittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer Autoimmunerkrankung und zur Bildung von Regulatorischen T-Zellen
MX2011007647A (es) 2009-01-21 2011-09-01 Amgen Inc Composiciones y metodos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes.
CU23923B1 (es) 2010-11-12 2013-07-31 Ct De Inmunología Molecular Polipéptidos derivados de la il-2 con actividad agonista
SI2673294T1 (sl) * 2011-02-10 2016-08-31 Roche Glycart Ag Mutirani polipeptidi interlevkina-2
ES2763198T3 (es) * 2014-07-21 2020-05-27 Delinia Inc Moléculas que selectivamente activan las células T reguladoras para el tratamiento de enfermedades autoinmunes
US11053293B2 (en) 2016-02-05 2021-07-06 Washington University Compositions and methods for targeted cytokine delivery

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