PT1682178E

PT1682178E - Métodos de terapêutica para cancros que expressam o antigénio cd40

Info

Publication number: PT1682178E
Application number: PT04810421T
Authority: PT
Inventors: Li Long; Mohammad Luqman; Asha Yabannavar; Isabel Zaror; Deborah Hurst; Daniel E Lopes De Menezes
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic; Xoma Technology Ltd
Priority date: 2003-11-04
Filing date: 2004-11-04
Publication date: 2010-10-21
Also published as: CY1110803T1; HK1139964A1; IL175225A0; EP2149585B1; CN1938045B; SI1682178T1; CA2544949C; EP1682178A2; AU2004287879A1; PL2149585T3; PT1682180E; EP1694360A2; HK1094156A1; WO2005044854A2; WO2005044854A3; JP2011126900A; ATE473016T1; RS51230B; DE602004028037D1; MA28331A1

Description

DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "MÉTODOS DE TERAPÊUTICA PARA CANCROS QUE EXPRESSAM O ANTIGÉNIO CD40"

Campo técnico A presente invenção relaciona-se com métodos de terapêutica combinada para cancros compreendendo células neoplásicas que expressam o antigénio CD40, incluindo cancros relacionados com células B e tumores sólidos.

Antecedentes da invenção

Mais de um milhão de americanos são diagnosticados com cancro todos os anos. Só nos Estados Unidos, 100.000 indivíduos são atingidos por leucemias, linfomas e mielomas. Os tumores sólidos, como o cancro da mama, o cancro do ovário e o cancro do pulmão, afectam ainda um número superior de indivíduos. Para combater estas doenças, foi desenvolvida a imunoterapia. Em geral, a imunoterapia estimula a resposta anti-tumoral do paciente contra as células tumorais alvo. A terapêutica com citocinas constitui um método de imunoterapia que activa a imunovigilância, especialmente contra tumores e antigénios tumorais. Alternativamente, as células tumorais podem constituir alvos directos mediante o uso da terapêutica com anticorpos. Estes anticorpos são específicos contra antigénios individuais da superfície celular que são expressos pelas células tumorais, e os resultados dos ensaios clínicos têm-se revelado promissores. Têm sido obtidos resultados terapêuticos positivos usando anticorpos que têm como alvo antigénios como o CD20 (expresso por células B normais e por 1 muitos linfomas a células B) e HER2 (expresso por muitos carcinomas da mama).

Uma grande percentagem dos casos de cancro é caracterizada por um crescimento descontrolado de células neoplásicas que expressam o antigénio CD40. 0 antigénio CD40 é um antigénio da superfície celular com 55 kDa que se encontra presente à superfície das células B humanas normais e neoplásicas, das células dendriticas, de outras células apresentadoras de antigénio (APCs), das células endoteliais, dos monócitos e das células epiteliais. A ligação do ligando de CD40 ao CD40 a nivel da membrana das células B proporciona um sinal coestimulatório positivo que estimula a activação e proliferação das células B, resultando na maturação da célula B até um plasmócito que segrega niveis elevados de imunoglobulina solúvel. As células transformadas de pacientes com linfomas de células B de alto grau e de baixo grau, leucemia linfoblástica aguda de células B, mieloma múltiplo, leucemia linfocitica crónica e doença de Hodgkin expressam CD40. A expressão de CD40 é igualmente detectada em dois terços dos casos de leucemia mieloblástica aguda e em 50% dos casos de linfomas relacionados com SIDA. As células B malignas provenientes de diversos tumores da linhagem celular B expressam CD40 em elevado grau e parecem depender da sinalização por CD40 para a sua sobrevivência e proliferação. A expressão do antigénio CD40 foi igualmente detectada em muitos cancros de células não-B. Os carcinomas que expressam CD40 incluem o carcinoma vesical (Paulie et al. (1989) J. Immunol. 142:590-595; Braesch-Andersen et al. (1989) J. Immunol. 142:562-567), carcinoma da mama (Hirano et al. (1999) Blood 93:2999-3007; Wingett et al. (1998) Breast Câncer Res. Treat. 50:27-36); cancro da próstata (Rokhlin et al. (1997) Câncer Res. 57:1758-1768), carcinoma de células renais (Kluth et al. (1997) Câncer Res. 57:891-899), carcinoma 2 indiferenciado da nasofaringe (LTNPC) (Agathanggelou et al. (1995) Am. J. Pathol. 147:1152-1160), carcinoma de células escamosas (SCC) (Amo et al. (2000) Eur. J. Dermatol. 10:438— 442; Posner et al. (1999) Clin. Câncer Res. 5:2261-2270), carcinoma papilar da tiróide (Smith et al. (1999) Thyroid 9:749-755), melanoma cutâneo maligno (van den Oord et al. (1996) Am. J. Pathol. 149:1953-1961), cancro do ovário (Ciaravino et al. (2004) Eur. J. Gynaecol. Oncol. 25:27-32), cancro do pulmão (Sabei et al. (2000) Câncer Immunol.

Immunother. 49:101-8), cancro do colo do útero (Altenberg et al. (1999) J. Immunol. 162:4140-4147), carcinoma gástrico (Yamaguchi et al. (2003) Int. J. Oncol. 23(6):1697-702), sarcomas (ver, por exemplo, Lollini et al. (1998) Clin. Câncer

Res. 4(8):1843-849, para uma exposição sobre o osteosarcoma humano e o sarcoma de Ewing), e carcinoma hepático (ver, por exemplo, Sugimoto et al. (1999) Hepatology 30(4):920-26, para uma exposição sobre o carcinoma hepatocelular). O papel do antigénio CD40 nestes carcinomas de células não-B não está ainda bem esclarecido. Alguns estudos evidenciaram que a ligação a CD40 em células transformadas poderá resultar em morte celular por apoptose. No entanto, em alguns cancros como o melanoma maligno e o cancro do pulmão, a expressão de CD40 poderá constituir um marcador de prognóstico negativo (ver, por exemplo, Sabei et al. (2000) Câncer Immuno. Immunother. 49(2):101-108; Ottaiano et al. (2004) Clin. Câncer Res. 10 (8) :2824-2831) . A interleucina 2 (IL-2) é uma citocina que funciona como um potente estimulador da proliferação e função das células natural killer (NK) e das células T (ver, por exemplo, Morgan et al. (1976) Science 193:1007-1011; Weil-Hillman et al. (1989) Câncer Res. 49(13):3680-3688). A IL-2 exibe actividade anti-tumoral contra diversas doenças malignas, tanto isoladamente como em combinação com células killer linfocina- 3 activadas (LAK) ou com linfócitos tumor-infiltrantes (TIL) (ver, por exemplo, Rosenberg et al. (1987) N. Engl. J.

Med. 316:889-897; Rosenberg (1988) Ann. Surg. 208:121-135; Topalian et al. (1988) J. Clin. Oncol. 6:839-853; Rosenberg et al. (1988) N. Engl. J. Med. 319:1676-1680; e Weber et al. (1992) J. Clin. Oncol. 10:33-40). Se bem que a actividade anti-tumoral da IL-2 esteja melhor descrita em pacientes com melanoma metastizado e carcinoma de células renais, outras doenças, incluindo o linfoma, parecem também responder ao tratamento com IL-2 (ver, por exemplo, Dutcher e Wiernik (1993) Sem. Oncol. 20 (6 Supl. 9) :33-40) . No entanto, as elevadas doses de IL-2 usadas para atingir resultados terapêuticos positivos relativamente ao crescimento do tumor frequentemente causam efeitos colaterais graves, incluindo derrames dos capilares, hipotensão e alterações neurológicas (ver, por exemplo, Duggan et al. (1992) J. Immunotherapy 12:115-122; Gisselbrecht et al. (1994) Blood 83:2081-2085; e

Sznol e Parkinson (1994) Blood 83:2020-2022). Adicionalmente, as respostas clinicas à IL-2 são variáveis. Por exemplo, a mediana da taxa de sobrevivência para subgrupos de pacientes com carcinoma de células renais tratados com IL-2 pode variar entre 28 e 5 meses, dependendo dos factores de risco (Palmer et al. (1992) Ann. Oncol. 3:475-80).

Se bem que qualquer dos agentes imunoterapêuticos existentes possa proporcionar benefícios ao paciente, é necessário que se desenvolvam outros métodos para reduzir a toxicidade, melhorar a eficácia e melhorar os resultados do tratamento. Ainda, o cancro pode frequentemente tornar-se resistente ao tratamento com uma oncoterapia de um só agente, tanto em resultado da resistência inicial a uma terapêutica com um só anticorpo ou uma só citocina, como em resultado da resistência que se desenvolve durante um ou mais cursos de terapia com um só anticorpo ou uma só citocina. 4

Consequentemente, a descoberta de uma imunoterapia de combinação que possa simultaneamente melhorar os resultados do tratamento relativamente à oncoterapia de agente único e reduzir a toxicidade de qualquer agente imunoterápico poderá reduzir grandemente a mortalidade e morbilidade entre os pacientes com cancro, especialmente os afectados por tumores sólidos, mielomas, leucemias e linfomas.

As patentes WO 01/83755, WO 02/28480 e WO 02/28904 descrevem anticorpos com a capacidade de se ligar ao CD40, métodos para a produção desses anticorpos e métodos para o seu uso.

Ellmark et al. (Immunology 2002, 106, 456-463) refere a modulação da interacção CD40-ligando de CD40 usando fragmentos de anticorpos de cadeia única anti-CD40 humano.

Breve sumário da invenção A invenção fornece um anticorpo anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, para uso num método de tratamento de um indivíduo humano para um cancro que compreende células neoplásicas que expressam o antigénio CD40, sendo o referido método caracterizado por compreender a administração ao referido indivíduo de uma terapêutica de combinação, sendo a referida terapêutica careacterizada por compreender a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio em combinação com uma interleucina 2 (IL-2) ou uma sua variante biologicamente activa, sendo que o dito anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio é significativamente isento de actividade agonista quando ligado ao antigénio CD40 e é seleccionado a partir do grupo que consiste em: 5 a) um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga a um epitopo capaz de se ligar ao anticorpo monoclonal CHIR-5. .9, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou o anticorpo monoclonal CHIR-12 :. 12, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543; b) Um anticorpo ou um seu fragmento de ligação a um antigénio que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-87 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou na SEQ ID NO:12; c) Um anticorpo ou um seu fragmento de ligação a um antigénio que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-89 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO:10 ou na SEQ ID NO:12; e d) Um anticorpo ou um seu fragmento de ligação a um antigénio que compete com o anticorpo monoclonal CHIR- 5.9, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543, num ensaio de ligação competitiva. A invenção proporciona ainda o uso de uma quantidade eficaz do anticorpo anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio em combinação com uma interleucina 2 (IL-2) ou uma sua variante biologicamente activa no fabrico de um medicamento para o tratamento de um indivíduo humano para um cancro que compreende células neoplásicas que expressam o antigénio CD40 por terapêutica de combinação, sendo que o referido anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao 6 antigénio é isento de actividade agonista significativa quando ligado ao antigénio CD40 e é seleccionado a partir do grupo que consiste em: a) um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga a um epitopo capaz de se ligar ao anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543; b) Um anticorpo ou um seu fragmento de ligação a um antigénio que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-87 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO: 10 ou na SEQ ID NO:12; c) Um anticorpo ou um seu fragmento de ligação a um antigénio que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-89 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO: 10 ou na SEQ ID NO:12; e d) Um anticorpo ou um seu fragmento de ligação a um antigénio que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que pode ser obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543, num ensaio de ligação competitiva.

Outros aspectos da invenção são apresentados nas Reivindicações anexas.

Breve sumário da exposição São apresentados métodos de tratamento de um indivíduo para um cancro que compreende células neoplásicas que 7 expressam o antigénio de superfície celular CD40. Os métodos compreendem a terapêutica de combinação com interleucina 2 (IL-2) ou uma sua variante biologicamente activa e pelo menos um anticorpo anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio. A administração destes dois agentes em combinação proporciona maior eficácia do que a obtida com cada agente em separado, resultando numa resposta terapêutica positiva. Em algumas formas de realização, ocorre um efeito terapêutico sinérgico, tornando a exposição especialmente útil no âmbito do tratamento de cancros que são resistentes à monoterapia.

De acordo com os métodos aqui apresentados, um indivíduo que necessita da terapêutica recebe a administração de uma combinação de uma IL-2 ou de uma sua variante biologicamente activa e de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio. As moléculas de interleucina adequadas incluem a IL-2 humana e suas variantes biologicamente activas, tais como a muteína de IL-2 aldesleucina (interleucina-2 humana des-alanil-1, serina-125) . Os anticorpos antagonistas anti-CD40 adequados para uso com os métodos aqui apresentados incluem anticorpos monoclonais ou os seus fragmentos de ligação ao antigénio que têm a capacidade de se ligar especificamente a um antigénio CD40 humano expresso à superfície de uma célula humana. Estes anticorpos antagonistas anti-CD40 estão isentos de actividade agonista significativa mas exibem actividade antagonista quando ligados ao antigénio CD40 em células humanas, particularmente quando ligados ao antigénio CD40 em células neoplásicas humanas. Os anticorpos anti-CD40 monoclonais adequados possuem regiões constantes humanas; preferencialmente, possuem também regiões de "framework" totalmente ou parcialmente humanizadas; e mais preferencialmente são anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, inteiramente humanos. 8

Entre os exemplos de tais anticorpos antagonistas anti-CD40 monoclonais encontram-se os anticorpos aqui designados como CHIR-5.9 e CHIR-12.12, que podem ser produzidos por via recombinante; os anticorpos monoclonais produzidos pelas linhas celulares de hibridoma designadas como 131.2F8.5.9 (aqui referida como linha celular 5.9) e 153.8E2.D10.D6.12.12 (aqui referida como linha celular 12.12); um anticorpo monoclonal compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste na sequência apresentada em SEQ ID NO: 6, a sequência apresentada em SEQ ID NO:7, a sequência apresentada em SEQ ID NO:8, ambas as

sequências apresentadas em SEQ ID NO: 6 e em SEQ ID NO: 7, e ambas as sequências apresentadas em SEQ ID NO: 6 e em SEQ ID NO: 8; um anticorpo monoclonal compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste na sequência apresentada em SEQ ID NO:2, a sequência apresentada em SEQ ID NO: 4, a sequência apresentada em SEQ ID NO: 5, ambas as sequências apresentadas em SEQ ID NO: 2 e em SEQ ID NO: 4, e

ambas as sequências apresentadas em SEQ ID NO: 2 e em SEQ ID NO: 5; um anticorpo monoclonal compreendendo uma sequência de aminoácidos codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos seleccionada a partir do grupo que consiste na sequência apresentada em SEQ ID N0:1, a sequência apresentada em SEQ ID NO:3, e ambas as sequências apresentadas em SEQ ID N0:1 e em SEQ ID NO: 3; e fragmentos de ligação ao antigénio destes anticorpos monoclonais que retêm a capacidade de se ligar especificamente ao CD40 humano, e que são isentos de actividade agonista significativa mas exibem actividade antagonista quando se ligam ao antigénio CD40 nas células humanas. Os exemplos de tais anticorpos monoclonais anti-CD40 incluem igualmente um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo com a capacidade de se ligar ao anticorpo monoclonal produzido pela linha 9 celular de hibridoma 12.12 ou ao produzido pela linha celular de hibridoma 5.9; um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo compreendendo os resíduos 82-87 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12; um anticorpo monoclonal que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 num ensaio de ligação competitiva; e um anticorpo monoclonal que constitui um fragmento de ligação ao antigénio do anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou de qualquer dos anticorpos monoclonais aqui referidos, sendo que o fragmento retém a capacidade de se ligar especificamente ao antigénio CD40 humano.

Em algumas formas de realização, estes dois agentes terapêuticos são administrados concorrentemente sob a forma de duas composições separadas, uma contendo IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa, a outra contendo o anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio adequado, sendo cada uma administrada de acordo com um regime de dosagem particular. A composição farmacêutica compreendendo o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio é administrada de acordo com um regime de dosagem semanal, ou é alternativamente doseada uma vez em cada duas, três ou quatro semanas. O anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio pode ser doseado ao longo de um período de tratamento ou durante um intervalo de tempo fixo dentro de um período de tratamento. A composição farmacêutica compreendendo IL-2 ou a sua variante biologicamente activa é administrada de acordo com um regime de dosagem constante de IL-2, ou é administrada de acordo com um regime de dosagem de dois níveis de IL-2. O regime de dosagem constante de IL-2 compreende um período durante o qual é administrada ao indivíduo uma dose semanal total constante de IL-2 ou da sua variante 10 biologicamente activa, seguindo-se um período em que a dosagem de IL-2 é interrompida. São administrados um ou mais ciclos de um regime de dosagem constante de IL-2 a um indivíduo que dele necessita. A dose semanal total a ser administrada durante cada ciclo do regime de dosagem constante de IL-2 poderá ser administrada como dose única. Alternativamente, a dose semanal total administrada durante cada ciclo do regime de dosagem constante de IL-2 poderá ser repartida por uma série de doses equivalentes que são administradas de acordo com um esquema de dosagem de duas, três, quatro, cinco, seis ou sete vezes por semana. 0 regime de dosagem de dois níveis de IL-2 compreende um primeiro período de dosagem de IL-2, durante o qual é administrada ao indivíduo uma dose semanal total mais elevada de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa, seguindo-se um segundo período de dosagem de IL-2, durante o qual é administrada ao indivíduo uma dose semanal total mais baixa de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa. A dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa durante o segundo período de dosagem de IL-2 é mais baixa do que a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa que é administrada durante o primeiro período de dosagem de IL-2. A dose semanal total a administrar durante o primeiro período e/ou durante o segundo período de dosagem de IL-2 pode ser administrada sob a forma de dose única. Alternativamente, a dose semanal total administrada durante um dos, ou ambos os, primeiro e segundo períodos de dosagem de IL-2 poderá ser repartida por uma série de doses equivalentes que são administradas de acordo com um esquema de dosagem de duas, três, quatro, cinco, seis ou sete vezes por semana. Os métodos aqui expostos proporcionam igualmente uma interrupção no regime de dosagem de dois níveis de IL-2, em que o indivíduo tem um período de interrupção da administração de 11 IL-2, e, opcionalmente, um período de interrupção da dosagem de anticorpo anti-CD40, antes dos primeiro e segundo períodos do regime de dosagem de dois níveis de IL-2. A terapia combinada com estes dois agentes terapêuticos poderá compreender a administração de um ou mais ciclos de um regime de dosagem de dois níveis de IL-2 em combinação com o regime de dosagem aconselhado para o anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio adequado.

Os métodos aqui expostos são úteis para o tratamento de indivíduos com um cancro que compreende células neoplásicas que expressam o antigénio de superfície celular CD40. Os exemplos de tais cancros incluem, de modo não limitativo, tumores sólidos, tais como os cancros do pulmão, ovário, bexiga, rim, fígado, estômago, próstata, pele e mama, e sarcomas, e neoplasias relacionadas com células B, tais como linfomas não-Hodgkin (linfomas de alto grau, de grau intermédio ou de baixo grau), doença de Hodgkin, leucemias linfoblásticas agudas, mielomas, leucemias linfocíticas crónicas e leucemias mieloblásticas.

Breve descrição das figuras A Figura 1 apresenta as sequências de aminoácidos das cadeias leve e pesada do mAb CHIR-12.12. As regiões leader (resíduos 1-20 da SEQ ID NO:2), variável (resíduos 21-132 da SEQ ID NO:2), e constante (resíduos 133-239 da SEQ ID NO:2) da cadeia leve são apresentadas na Figura IA. As regiões leader (resíduos 1-19 da SEQ ID NO:4), variável (resíduos 20-139 da

SEQ ID NO:4), e constante (resíduos 140-469 da SEQ ID NO:4) da cadeia pesada são apresentadas na Figura 1B. A região constante alternativa para a cadeia pesada do mAb 12.12 apresentada na Figura 1B reflecte uma substituição do resíduo de alanina por um resíduo de serina na posição 153 da SEQ ID 12 NO:4. A sequência completa para esta variante da cadeia pesada do mAb CHIR-12.12 é apresentada na SEQ ID NO:5. A Figura 2 mostra a sequência codificante da cadeia leve (Figura 2A; SEQ ID NO:l) e da cadeia pesada (Figura 2B; SEQ ID NO:3) para o mAb CHIR-12.12. A Figura 3 expõe as sequências de aminoácidos das cadeias leve e pesada do mAb CHIR-5.9. As regiões leader (resíduos 1-20 da SEQ ID NO:6), variável (resíduos 21-132 da SEQ ID NO:6), e constante (resíduos 133-239 da SEQ ID NO:6) da cadeia leve são apresentadas na Figura 3A. As regiões leader (resíduos 1-19 da SEQ ID NO:7), variável (resíduos 20-144 da SEQ ID NO:7), e constante (resíduos 145-474 da SEQ ID NO:7) da cadeia pesada são apresentadas na Figura 3B. A região constante alternativa para a cadeia pesada do mAb CHIR-5.9 apresentada na Figura 3B reflecte uma substituição do resíduo de alanina por um resíduo de serina na posição 153 da SEQ ID NO: 4. A sequência completa para esta variante da cadeia pesada do mAb CHIR-5.9 é apresentada na SEQ ID NO:8. A Figura 4 mostra a sequência codificante (Figura 4A; SEQ ID NO: 9) para a isoforma curta do CD40 humano (sequência de aminoácidos apresentada na Figura 4B; SEQ ID NO:10) e a sequência codificante (Figura 4C; SEQ ID NO:11) para a isoforma longa do CD40 humano (sequência de aminoácidos apresentada na Figura 4D; SEQ ID NO:12). A Figura 5 demonstra uma actividade anti-tumoral in vivo aumentada em resultado do tratamento de combinação com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 e com IL-2, usando um modelo Namalwa de xenotransplante de linfoma não Hodgkin (NHL) humano. A Figura 6 apresenta a temperatura de fusão térmica de CHIR-12.12 em diferentes formulações de pH, medida por calorimetria diferencial de varrimento (DSC). 13

Descrição detalhada da invenção A presente invenção relaciona-se com métodos para tratamento de um indivíduo humano para um cancro que compreende células neoplásicas que expressam o antigénio CD40, incluindo, de forma não limitativa, tumores sólidos, linfomas, tal como o linfoma a células B, leucemias e mielomas. Os métodos compreendem a terapêutica de combinação com interleucina 2 (IL-2) ou uma sua variante biologicamente activa e pelo menos um anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, cada um dos quais é administrado de acordo com um regime de dosagem particular aqui exposto. Em algumas formas de realização da invenção, estes regimes de dosagem são seguidos até à suspensão da terapêutica com anticorpo anti-CD40 ao indivíduo, por exemplo, quando o indivíduo exibe uma resposta completa ou exibe um ou mais sintomas de toxicidade por anticorpo anti-CD40, ou até à suspensão da terapêutica com IL-2 ao indivíduo devido ao desenvolvimento dos sintomas de toxicidade por IL-2 que adiante serão referidos. Quando o indivíduo suspende a terapêutica com IL-2 devido à toxicidade, a terapêutica com anticorpo anti-CD40 poderá continuar, segundo o regime de dosagem de anticorpo recomendado, ou ser descontinuada; e uma vez reduzidos ou resolvidos os sintomas de toxicidade por IL-2, a terapêutica com IL-2, ou a terapêutica com IL-2 e a terapêutica com anticorpo anti-CD40 no caso de a terapêutica com anticorpo ter sido descontinuada, poderão ser reintroduzidas usando o mesmo regime de dosagem de IL-2 e a mesma dose de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa, o mesmo regime de dosagem de IL-2 com uma dose mais baixa deste agente terapêutico, ou um regime de dosagem de IL-2 diferente, segundo aqui exposto.

Em outras formas de realização da invenção, o regime de dosagem para a terapêutica com anticorpo anti-CD40 é seguido 14 durante um intervalo de tempo fixo, por exemplo, de 2 a 16 semanas, e é administrado em combinação com um regime de dosagem de IL-2 aqui descrito, sendo que um dado período de tratamento compreende um período de sobreposição durante o qual o indivíduo recebe tanto a terapêutica com anticorpo anti-CD40 como a terapêutica com IL-2, de acordo com os regimes de dosagem e as doses que aqui se apresentam. Em tais formas de realização, geralmente a duração da administração do anticorpo anti-CD40 está entre cerca de 4 semanas e cerca de 12 semanas, incluindo 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 semanas. A duração da administração de IL-2 depende do regime de dosagem de IL-2 usado. A terapêutica de combinação com estes dois agentes terapêuticos proporciona a actividade anti-tumoral. Por "actividade anti-tumoral" pretende-se indicar uma redução na taxa de proliferação celular, e deste modo um declínio na taxa de crescimento de um tumor existente ou de um tumor que se desenvolve durante a terapêutica, e/ou a destruição de células neoplásicas (tumorais) existentes ou de células neoplásicas recém-formadas, e deste modo uma diminuição da dimensão total de um tumor durante a terapêutica. Os indivíduos submetidos à terapêutica com uma combinação de IL-2 (ou uma sua variante) e de pelo menos um anticorpo antagonista anti-CD40 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio) experimentam uma resposta fisiológica benéfica no que diz respeito ao tratamento de um cancro que compreende células neoplásicas que expressam o antigénio CD40, incluindo, de modo não limitativo, as neoplasias relacionadas com células B e os tumores sólidos aqui mais adiante referidos.

Apesar de os métodos aqui apresentados se dirigirem ao tratamento de um cancro existente, assinala-se que os métodos poderão ser úteis na prevenção de desenvolvimentos tumorais adicionais que possam ocorrer durante a terapêutica. A 15 terapêutica de combinação com IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa) e um anticorpo antagonista anti-CD40 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio) proporciona um beneficio terapêutico que é superior ao proporcionado por cada um destes agentes terapêuticos quando usado isoladamente. Ainda, estes dois agentes terapêuticos podem ser usados em combinação para tratar tumores que se mostraram resistentes ao tratamento com qualquer um destes agentes quando usado isoladamente (i.e., em monoterapêutica) , tanto em resultado de resistência inicial à monoterapêutica com anticorpo ou à monoterapêutica com citocina, como em resultado de uma resistência que se desenvolve ao longo de um ou mais cursos de terapêutica com o anticorpo isolado ou a citocina isolada. Em ainda outras formas de realização, a terapêutica de combinação com estes dois agentes terapêuticos exibe um efeito terapêutico sinérgico contra tumores que são resistentes ou que não são resistentes (i.e., que respondem) à terapêutica com um só agente. O termo "oncoterapia" pretende indicar qualquer tratamento contra o cancro, incluindo quimioterapia, radioterapia, imunoterapia, combinações destas, e semelhantes. Os agentes usados em oncoterapia são aqui referidos como "agentes oncoterápicos". O termo "imunoterapia" é aplicável a qualquer terapia contra o cancro em que o sistema imunológico é modulado, e inclui a administração de citocinas, administração de anticorpos, administração/vacinação com antigénios, administração de células imunes, activação de células imunes, combinações destas, e semelhantes. 0 termo "tumor", tal como aqui é usado, refere-se a todos os processos tumorais de crescimento e proliferação celular, benignos ou malignos, e a todas as células e tecidos pré-cancerosos ou cancerosos. 0 termo "neoplasia", tal como aqui é usado, refere-se a qualquer forma de crescimento celular 16 anormalmente regulado ou não regulado, seja maligno ou benigno, gue resulte num desenvolvimento anormal de tecidos. Por "célula neoplásica que expressa CD40" pretende-se indicar qualquer célula neoplásica, seja maligna ou benigna, que expresse o antigénio de superfície celular CD40. Os métodos para a detecção da expressão de CD40 pelas células são bem conhecidos neste campo técnico e incluem, de modo não limitativo, técnicas de PCR, imunohistoquimica, citometria de fluxo, Western blot, ELISA e semelhantes.

Os termos "cancro" e "canceroso" referem-se a, ou descrevem, o estado fisiológico em mamíferos que é tipicamente caracterizado por um crescimento celular desregulado. Os exemplos de cancro incluem, de modo não limitativo, linfoma, leucemia, mieloma e tumores sólidos, incluindo, de modo não limitativo, cancro do pulmão, cancro da mama, cancro do ovário, carcinomas renais, carcinomas hepáticos, carcinomas gástricos, cancro do cólon, cancro da próstata, cancro da pele, sarcomas, e semelhantes.

Por "resistente", no contexto de um cancro, pretende-se indicar que esse cancro em particular é resistente, ou não responde, à terapêutica com um agente terapêutico particular. Um cancro pode ser resistente à terapêutica com um agente terapêutico particular desde o início do tratamento com esse agente terapêutico particular (i.e., não responder à exposição inicial ao agente terapêutico) , ou a resistência ao agente terapêutico poderá desenvolver-se no decurso de um primeiro período de tratamento com o agente terapêutico ou durante um período de tratamento subsequente com o agente terapêutico. 0 termo "interleucina 2" (IL-2), tal como aqui é usado, refere-se a uma citocina com um peso molecular reportado no intervalo de 13.000 a 17.000 daltons (Gillis e Watson (1980) J. Exp. Med. 159:1709) e com um ponto isoeléctrico no intervalo de 6 - 8,5. A IL-2 é naturalmente produzida pelas 17 células T normais e encontra-se presente no organismo em baixas concentrações. A IL-2 foi pela primeira vez descrita por Morgan et al. (1976) Science 193:1007-1008 e foi inicialmente designada por "factor de crescimento das células T" devido à sua capacidade para induzir a proliferação dos linfócitos T estimulados. "Anticorpos" e "imunoglobulinas" (Igs) são glicoproteinas que possuem as mesmas características estruturais. Os termos são usados como sinónimos. Em alguns casos, a especificidade antigénica da imunoglobulina poderá ser conhecida. O termo "anticorpo" é usado no sentido mais lato e abrange anticorpos de estrutura completa, fragmentos de anticorpos que se podem ligar ao antigénio (p.ex., Fab, F(ab)' , Fv, anticorpos de cadeia única, diacorpos, quimeras de anticorpos, anticorpos híbridos, anticorpos biespecíficos, anticorpos humanizados e semelhantes), e péptidos recombinantes compreendendo os aqui referidos.

Os termos "anticorpo monoclonal" e "mAb", tal como aqui são usados, referem-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, i.e., os anticorpos individuais que formam a população são idênticos excepto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que estejam presentes em quantidades diminutas. Tal como aqui é usado, o termo "anticorpo anti-CD40" abrange qualquer anticorpo que reconheça especificamente o antigénio CD40 da superfície celular, incluindo anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos de cadeia única, e fragmentos destes tais como Fab, F(ab') , F e outros 2 v fragmentos que retêm a função de ligação ao antigénio do anticorpo anti-CD40 progenitor. De particular interesse para a prática dos métodos aqui revelados são os anticorpos anti-CD40 ou os seus fragmentos de ligação ao antigénio que possuem as 18 propriedades de ligação exibidas pelos anticorpos monoclonais anti-CD40 humanos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 abaixo descritos.

Os "anticorpos nativos" e as "imunoglobulinas nativas" são geralmente glicoproteinas heterotetraméricas com cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e por duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada através de uma ligação dissulfito covalente, enquanto que entre as cadeias pesadas o número de ligações dissulfito varia segundo os diferentes isotipos de imunoglobulinas. Cada cadeia leve e pesada possui ainda pontes dissulfito intra-cadeia a espaços regulares. Cada cadeia pesada possui numa extremidade um dominio variável (V ) seguido por diversos domínios constantes.

H

Cada cadeia leve possui um domínio variável (V ) numa

L extremidade e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Crê-se que certos resíduos particulares de aminoácidos formem uma interface entre os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas. O termo "variável" refere-se ao facto de que certas porções dos domínios variáveis diferem extensamente quanto à sequência entre os diversos anticorpos. As regiões variáveis conferem a especificidade na ligação ao antigénio. No entanto, a variabilidade não se encontra distribuída de modo uniforme ao longo dos domínios variáveis dos anticorpos. Está concentrada em três segmentos designados por regiões determinantes da complementaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis que existem nos domínios variáveis tanto das cadeias leves como das cadeias pesadas. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são designadas 19 por regiões de "framework" (FR) . Cada um dos domínios variáveis das cadeias pesadas e leves nativas compreende quatro regiões FR, as quais se encontram principalmente numa configuração em folha β pregueada, ligadas por três CDRs, as quais formam "loops" que ligam, e em alguns casos integram, a estrutura em folha β. As CDRs em cada cadeia são mantidas em estreita proximidade por meio das regiões FR e, juntamente com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antigénio nos anticorpos (ver Kabat et al. (1991) NIH Publ. No. 91-3242, Vol. 1, págs. 647-669).

Os domínios constantes não se encontram directamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas exibem diversas funções efectoras, tais como a ligação ao receptor de Fc (FcR), a participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpos, a opsonização, a iniciação da citotoxicidade dependente do complemento e a desgranulação dos mastócitos. 0 termo "região hipervariável", tal como aqui é usado, refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antigénio. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos de uma "região determinante da complementaridade" ou "CDR" (i.e., os resíduos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest (5a Ed., Public Health Service,

National Institute of Health, Bethesda, MD) e/ou os resíduos de um "loop hipervariável" (i.e., os resíduos 26-32 (Ll), 50- 52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável da cadeia leve e (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Clothia and Lesk (1987), J. Mol. Biol. 196:901-917). Os resíduos "de framework" ou "FR" são os resíduos do domínio 20 variável que não fazem parte dos resíduos da região hipervariável, como aqui considerado.

Os "fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, preferencialmente a região de ligação ao antigénio ou a região variável do anticorpo intacto. Os exemplos de fragmentos de anticorpos incluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (Zapata et al, (1995) Protein Eng. 10:1057-1062); moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. A digestão dos anticorpos pela papaína produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antigénio, designados por fragmentos "Fab", cada um com um único local de ligação ao antigénio, e um fragmento residual "Fc", cujo nome reflecte a sua capacidade para cristalizar com facilidade. O tratamento com pepsina fornece um fragmento F(ab')2 que possui dois locais de combinação com o antigénio e tem a capacidade de estabelecer duas ligações com os antigénios. "Fv" corresponde ao mínimo fragmento de anticorpo que contém um local completo de reconhecimento e ligação ao antigénio. Esta região consiste num dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em estreita associação não covalente. É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação ao antigénio à superfície do dímero V -V .

H L

Colectivamente, as seis CDRs conferem ao anticorpo a especificidade de ligação ao antigénio. No entanto, mesmo um só domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDRs específicos para um antigénio) tem a capacidade de reconhecer e de se ligar a um antigénio, se bem que com uma afinidade mais baixa do que a do local de ligação completo. 21 0 fragmento Fab contém igualmente o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (C 1) da cadeia

H pesada. Os fragmentos Fab diferem dos fragmentos Fab' pela adição de alguns resíduos à extremidade carboxi do domínio de cadeia pesada C 1, incluindo uma ou mais cisteínas da região de

H "dobradiça" do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui dada a um Fab' no qual o(s) resíduo (s) de cisteína dos domínios constantes integra (m) um grupo tiol livre. Os fragmentos Fab' foram produzidos pela redução da ponte dissulfito da cadeia pesada dos fragmentos F(ab')2. São ainda conhecidas outras associações químicas entre fragmentos de anticorpos.

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem pertencer a um de dois tipos claramente distintos, designados por kappa (k) e lambda (λ) segundo as sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.

As imunoglobulinas dividem-se em classes diferentes consoante a sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas humanas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e algumas destas podem ainda subdividir-se em subclasses (isotipos), P-ex., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são designados por alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas das subunidades e a configuração tridimensional das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. Os diferentes isotipos possuem diferentes funções efectoras. Por exemplo, os isotipos humanos IgGl e IgG3 medeiam a actividade ADCC (citotoxicidade mediada por células e dependente de anticorpos). 22 0 termo "marcador", tal como aqui é usado, refere-se a um composto ou composição detectável que é conjuqado directamente ou indirectamente com o anticorpo para gerar um anticorpo "marcado". 0 marcador poderá ser detectável por si só (p.ex., marcadores radioisotópicos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, poderá catalisar a alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável. Os radionuclidos que podem funcionar como marcadores detectáveis incluem, por exemplo, 1-131, 1-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212 e Pd-109. 0 marcador poderá também corresponder a uma entidade não detectável, tal como uma toxina. 0 termo "antagonista" é usado no seu sentido mais lato e inclui qualquer molécula que bloqueia parcialmente ou completamente, inibe ou neutraliza uma actividade biológica de um alvo nativo aqui exposto, ou a transcrição ou tradução deste. A designação "veículos", tal como aqui é usada, inclui veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizadores que não são tóxicos para a célula ou mamífero que a estes é exposto às dosagens e concentrações utilizadas. Frequentemente o veículo fisiologicamente aceitável corresponde a uma solução aquosa de pH tamponado. Os exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato, succinato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular (com menos de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como a polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monosacáridos, disacáridos e outros hidratos de carbono, incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como o EDTA; açúcares alcoólicos tais como manitol 23 ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tais como o sódio; e/ou surfactantes não iónicos tais como Tween, polietilenoglicol (PEG) e plurónicos. A administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui a administração simultânea (em conjunto) e a administração consecutiva (i.e., sequencial) em qualquer ordem. 0 termo "célula hospedeira", tal como aqui é usado, refere-se a um microorganismo ou a uma célula ou linha celular eucariótica cultivada como entidade unicelular que poderá ser, ou foi, usada como receptor para um vector recombinante ou para outros polinucleótidos de transferência, e inclui a descendência da célula original que foi transfectada. Deve entender-se que a descendência de uma única célula poderá não ser necessariamente idêntica por completo, em morfologia ou em DNA genómico ou total, à célula progenitora original, devido aos fenómenos de mutação natural, acidental ou deliberada.

As "células efectoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e que realizam funções efectoras. Preferencialmente, as células expressam pelo menos FcyRIII e desempenham a função efectora de citotoxicidade mediada por células e dependente do antigénio (ADCC). Os exemplos de leucócitos humanos que funcionam como mediadores na ADCC incluem as células mononucleadas do sangue periférico (CMSP), células natural killer (NK), monócitos, macrófagos, eosinófilos e neutrófilos, sendo preferidas as CMSPs e as células NK. Os anticorpos com actividade ADCC são tipicamente dos isotipos IgGl ou IgG3. De notar que, para além de isolar anticorpos IgGl e IgG3, poderão produzir-se anticorpos mediadores da ADCC construindo-os a partir de uma região variável de um anticorpo não-ADCC, ou de um fragmento da região variável, e de uma região constante do isotipo IgGl ou IgG3. 24 "receptor de Fc" ou

Os termos "receptor de Fc" ou "FcR" são usados para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. 0 FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Ademais, um FcR preferido será aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama), estando incluídos receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII e também as variantes alélicas e as formas de splicing alternativo destes receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor activador") e FcyRIIB (um "receptor inibidor"), os quais têm sequências de aminoácidos semelhantes que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. 0 receptor activador FcyRIIA contém um motivo de activação do imunoreceptor baseado em tirosina (ITAM) no seu domínio citoplasmático. 0 receptor inibidor FcyRIIB contém um motivo de inibição do imunoreceptor baseado em tirosina (ITIM) no seu domínio citoplasmático (ver Daeron (1997) Annu. Rev. Immunol. 15:203-234). Os FcRs são expostos em Ravetch e Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capei et al. (1994) Immunomethods 4:25-34; e de Haas et al. (1995) J. Lab. Clin.

Med. 126:330-341. Outros FcRs, incluindo os que serão identificados no futuro, são abrangidos pelo termo "FcR" aqui citado. O termo inclui igualmente o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer et al. (1976) J. Immunol. 117:587 e Kim et al. (1994) J. Immunol. 24:249). O termo "sinergia" é usado para descrever um efeito combinado de dois ou mais agentes activos que é superior à soma dos efeitos individuais de cada agente activo respectivo. Assim, quando o efeito combinado de dois ou mais agentes resulta numa "inibição sinérgica" de uma actividade ou processo, por exemplo, o crescimento tumoral, pretende-se indicar que a inibição da actividade ou processo é superior à soma dos efeitos inibitórios de cada agente activo respectivo. 25 refere-se a um efeito 0 termo "efeito terapêutico sinérgico" terapêutico observado com uma combinação de duas ou mais terapêuticas em que o efeito terapêutico (tal como medido por qualquer um de diversos parâmetros) é superior à soma dos efeitos terapêuticos individuais observados com as respectivas terapêuticas individuais.

Os termos "dose terapeuticamente eficaz", "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" pretendem indicar uma quantidade de anticorpo antagonista anti-CD40 (ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio) ou de interleucina-2 (ou uma sua variante) que, quando administrada como uma parte de uma terapia combinada que compreende, pelo menos esses dois agentes, induz uma resposta terapêutica positiva no que diz respeito ao tratamento de um paciente para um cancro compreendendo células neoplásicas.

Terapêutica de Combinação com Anticorpos Antagonistas Anti- CD40 e com IL-2 0 presente invento relaciona-se com métodos para o tratamento de um indivíduo com um cancro caracterizado por crescimento celular neoplásico. Os métodos aqui expostos abrangem a terapêutica de combinação com um anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio e IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa. Os métodos aqui apresentados são especialmente úteis para o tratamento de cancros compreendendo células neoplásicas que expressam o antigénio de superfície celular CD40, tais como muitos tumores sólidos e linfomas a células B.

Os tumores sólidos que podem ser tratados usando os métodos aqui apresentados incluem, de modo não limitativo, cancro do ovário, pulmão (por exemplo, cancro de células não-pequenas do pulmão dos tipos de carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma e carcinoma de grandes células, e 26 cancro de pulmão de células pequenas), mama, cólon, rim (incluindo, por exemplo, carcinomas de células renais), bexiga, fígado (incluindo, por exemplo, carcinomas hepatocelulares) , estômago, colo do útero, próstata, nasofaringe, tiróide (por exemplo, carcinoma papilar da tiróide), cancros da pele como o melanoma, e sarcomas (incluindo, por exemplo, osteosarcomas e sarcomas de Ewing). Os cancros relacionados com células B, como os linfomas, incluem linfomas de células B de grau baixo, intermédio, e alto, linfomas imunoblásticos, linfomas não-Hodgkin, doença de Hodgkin, linfomas induzidos pelo vírus de Epstein-Barr (EBV) e linfomas relacionados com a SIDA, assim como leucemia linfoblástica aguda de células B, mielomas, leucemias linfocíticas crónicas, leucemias mieloblásticas agudas, e semelhantes, tal como abaixo referido.

Assim, os métodos aqui expostos encontram utilidade no tratamento de linfomas não-Hodgkin relacionados com a proliferação ou acumulação anormal e incontrolável de células B. Para os fins da presente exposição, tais linfomas serão designados de acordo com o esquema de classificação do Working Formulation, que categoriza os linfomas de células B em linfomas de baixo grau, grau intermédio e alto grau (ver "The Non-Hodgkin's Lymphoma Pathologic Classification Project", Câncer 49(1982):2112-2135). Assim, os linfomas de células B de baixo grau incluem os linfomas linfocíticos de pequenas células, os linfomas foliculares de pequenas células clivadas e os linfomas foliculares mistos de pequenas células clivadas e de grandes células; os linfomas de grau intermédio incluem os linfomas foliculares de grandes células, os linfomas difusos de pequenas células clivadas, os linfomas difusos mistos de pequenas e grandes células e os linfomas difusos de grandes células; e os linfomas de alto grau incluem os linfomas imunoblásticos de grandes células, os linfomas 27 linfoblásticos e os linfomas de pequenas células não clivadas do tipo Burkitt e não-Burkitt. É reconhecido que os métodos aqui expostos são úteis no tratamento dos linfomas de células B que são classificados de acordo com o sistema REAL (Revised European and American Lymphoma Classification) . Tais linfomas de células B incluem, de modo não limitativo, os linfomas classificados como neoplasias de células B precursoras, tais como leucemia/linforna linfoblástico B; neoplasias de células B periféricas, incluindo leucemia linfocitica crónica de células B/linfoma linfocitico de pequenas células, linfoma linfoplasmocitóide/imunocitoma, linfoma de células do manto (MCL), linfoma dos centros foliculares (folicular) (incluindo os linfomas difusos de pequenas células, os linfomas difusos mistos de pequenas e grandes células e os linfomas difusos de grandes células) linfomas de células B da zona marginal (incluindo os tipos extranodulares, nodulares e esplénicos), tricoleucemia, plasmacitoma/mieloma, linfoma difuso de grandes células B do subtipo primário mediastinico (timico), linfoma de Burkitt, e linfoma B Burkitt-like de alto grau; leucemias agudas; leucemia linfocitica aguda; leucemias mieloblásticas; leucemias mielociticas agudas; leucemia promielocítica; leucemia mielomonocítica; leucemia monocítica; eritroleucémia; leucemia granulocitica (leucemia mielocitica crónica); leucemia linfocitica crónica; policitémia vera; mieloma múltiplo; macroglobulinémia de Waldenstrom; doença das cadeias pesadas; e linfomas inclassificáveis de células B de baixo grau ou de alto grau.

Em particular, os métodos aqui apresentados são úteis para o tratamento de tumores sólidos compreendendo células neoplásicas que expressam o antigénio CD40 e de linfomas a células B, incluindo os acima listados. 0 termo "tratamento" é aqui definido como a aplicação ou administração a um indivíduo 28 de um anticorpo antagonista anti-CD40, ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio, ou a aplicação ou administração de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio a um tecido ou linha celular isolados de um indivíduo, em combinação com a aplicação ou administração de IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa) ao indivíduo, ou a um tecido ou linha celular isolados do indivíduo, sendo que o indivíduo sofre de uma doença, um sintoma de doença ou uma predisposição para uma doença e sendo o propósito desta aplicação ou administração o de curar, aliviar, alterar, remediar, melhorar ou afectar a doença, os sintomas da doença ou a predisposição para a doença. Por "tratamento" pretende-se igualmente significar que a combinação do anticorpo antagonista anti-CD40 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio) e de IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa) pode ser aplicada ou administrada ao indivíduo, ou ao um tecido ou linha celular isolados do indivíduo, como parte de de uma composição farmacêutica única, ou alternativamente como parte de composições farmacêuticas individuais, cada uma compreendendo o anticorpo antagonista anti-CD40 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio) ou IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa), sendo que paciente sofre de uma doença, um sintoma de doença ou uma predisposição para uma doença e o propósito do tratamento é o de curar, aliviar, alterar, remediar, melhorar ou afectar a doença, os sintomas da doença ou a predisposição para a doença.

Breve descrição dos agentes oncoterápicos. Os anticorpos antagonistas anti-CD40 adequados para uso com os métodos aqui expostos ligam-se de modo específico a um antigénio CD40 humano expresso à superfície de uma célula humana e são isentos de actividade agonista significativa, mas exibem 29 actividade antagonista quando ligados ao antigénio CD40 numa célula humana que expressa CD40, incluindo células humanas normais e neoplásicas (tanto malignas como benignas) . Em algumas formas de realização, a sua ligação ao CD40 exposto à superfície das células humanas resulta na inibição da proliferação e diferenciação destas células humanas. Assim, os anticorpos antagonistas anti-CD40 adequados para uso com os métodos aqui descritos incluem os anticorpos monoclonais que têm a capacidade de exibir actividade antagonista relativamente a células humanas normais e neoplásicas que expressam o antigénio de superfície celular CD40.Estes anticorpos anti-CD40 e os seus fragmentos de ligação ao antigénio são aqui referidos como "anticorpos antagonistas anti-CD40". Tais anticorpos incluem, de modo não limitativo, os anticorpos monoclonais inteiramente humanos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 abaixo descritos e os anticorpos monoclonais que possuem as características de ligação dos anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12. Estes anticorpos monoclonais, que podem ser produzidos por via recombinante, são descritos abaixo.

Para além dos anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12, outros anticorpos anti-CD40 que seriam úteis para a colocação em prática dos métodos a qui descritos incluem, de modo não limitativo, os seguintes: (1) os anticorpos monoclonais produzidos pelas linhas celulares de hibridoma designadas como 131.2F8.5.9 (aqui referida como linha celular 5.9) e 153.8E2.D10.D6.12.12 (aqui referida como linha celular 12.12), depositadas na ATCC como Depósito Patenteado n° PTA-5542 e Depósito Patenteado n° PTA-5543, respectivamente; (2) um anticorpo monoclonal compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste na sequência mostrada em SEQ ID NO:2, a sequência mostrada em SEQ ID NO:4, a sequência mostrada em SEQ ID NO:5, ambas as 30 sequências mostradas em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, e ambas as sequências mostradas em SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO: 5; (3) um anticorpo monoclonal compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste na sequência mostrada em SEQ ID NO:6, a sequência mostrada em SEQ ID NO:7, a sequência mostrada em SEQ ID NO:8, ambas as sequências mostradas em SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7, e ambas as sequências mostradas em SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8; (4) um anticorpo monoclonal possuindo uma sequência de aminoácidos codificada por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleótidos seleccionada a partir do grupo que consiste na sequência de nucleótidos mostrada em SEQ ID NO:l, a sequência de nucleótidos mostrada em SEQ ID NO:3, e ambas as sequências mostradas em SEQ ID N0:1 e SEQ ID NO: 3; (5) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que tem a capacidade de se ligar ao anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma 5.9 ou pela linha celular de hibridoma 12.12; (6) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os residuos 82-87 da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 10 ou em SEQ ID NO: 12; (7) um anticorpo monoclonal que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 num ensaio de ligação competitiva; e (8) um anticorpo monoclonal que consiste num fragmento de ligação ao antigénio do anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou dos anticorpos monoclonais referidos nos pontos (1)-(7) anteriores, sendo que o fragmento retém a capacidade de se ligar especificamente ao antigénio CD40 humano. Os peritos na técnica reconhecerão que os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antigénio destes anticorpos adequados para uso nos métodos aqui descritos incluem anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antigénio que são produzidos por via recombinante utilizando métodos bem conhecidos da técnica e aqui descritos mais adiante, estando incluídos, por exemplo, 31 os anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 produzidos por via recombinante.

Os fragmentos dos anticorpos anti-CD40 aqui descritos são adequados para uso aos métodos da invenção desde que retenham a desejada afinidade do anticorpo de extensão completa. Assim, um fragmento de um anticorpo anti-CD40 reterá a capacidade de se ligar ao antigénio CD40 da superfície das células B. Tais fragmentos são caracterizados por propriedades semelhantes às do anticorpo de extensão completa correspondente. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo antagonista anti-CD40 ligar-se-ão especificamente a um antigénio CD40 humano expresso à superfície de uma célula humana e estão isentos de actividade agonista significativa mas exibem actividade antagonista quando ligados a um antigénio CD40 numa célula que expressa CD40 humano. Tais fragmentos são aqui referidos como fragmentos "de ligação ao antigénio".

Para além da utilização dos anticorpos antagonistas anti-CD40 acima mencionados, e descritos em maior detalhe abaixo, os métodos aqui descritos podem ser colocados em prática usando anticorpos que possuem as características de ligação dos anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 e que interferem competitivamente com a ligação desses anticorpos aos respectivos antigénios ou se ligam aos mesmos epitopos. Um perito na técnica poderá determinar, recorrendo a métodos padronizados, se um dado anticorpo interfere competitivamente com CHIR-5.9 ou CHIR-12.12. A IL-2, ou a sua variante biologicamente activa, para uso com os métodos aqui expostos pode provir de qualquer fonte, mas preferencialmente corresponderá a IL-2 recombinante, mais particularmente IL-2 humana recombinante. Por "IL-2 recombinante" pretende-se indicar uma IL-2 que tem uma actividade biológica comparável à IL-2 de sequência nativa e que foi preparada por técnicas de DNA recombinante tal como 32 descrito em, por exemplo, Taniguchi et al. (1983) Nature 302:305-310 e Devos (1983) Nucleic Acids Res. 11:4307-4323 ou a IL-2 alterada por mutação tal como descrito por Wang et al. (1984) Science 224:1431-1433. Genericamente, o gene codificando para a IL-2 é clonado e então expresso em organismos transformados, preferencialmente num microorganismo, por exemplo E. coli, tal como aqui se descreve. O organismo hospedeiro expressa o gene estranho para produzir IL-2 sob condições de expressão. A IL-2 recombinante sintética também pode ser produzida em eucariotas, tais como células de leveduras ou humanas. Os processos de cultura, recolha, lise ou extracção da IL-2 a partir das células foram substancialmente descritos em, por exemplo, as Patentes dos EUA nos. 4.604.377/ 4.738.927/ 4.656.132/ 4.569.790/ 4.748.234/ 4.530.787/ 4.572.798/ 4.748.234/ e 4.931.543.

Para obter exemplos de proteínas variantes de IL-2, ver o Pedido de Patente Europeia EP 0136489/ Pedido de Patente Europeia EP 0091539/ Pedido de Patente Europeia EP 0088195/ as muteínas recombinantes de IL-2 descritas no Pedido de Patente Europeia EP 0109748, que é equivalente à Patente Belga n° 893.016, propriedade comum da Patente dos EUA n° 4.518.584/ as muteínas descritas na Patente dos EUA n° 4.752.585 e WO 99/60128/ e a muteína de IL-2 des-alanil-1, serina 125 da IL-2 humana (também referida como "aldesleucina") , usada nos exemplos aqui apresentados e descrita na Patente dos EUA n° 4.931.543, assim como as outras muteínas de IL-2 descritas nesta patente dos EUA. Adicionalmente, a IL-2 pode ser modificada com polietilenoglicol para proporcionar uma solubilidade aumentada e um perfil farmacocinético alterado (ver a Patente dos EUA n° 4.766.106) . Ver também a exposição abaixo, em que as variantes de IL-2 adequadas são expostas em maior detalhe. 33

Em algumas formas de realização, os métodos aqui descritos compreendem uma terapêutica de combinação com IL-2, por exemplo, IL-2 humana, e o anticorpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12. Em outras formas de realização, os métodos aqui descritos compreendem uma terapêutica de combinação com IL-2, por exemplo, IL-2 humana, e o anticorpo monoclonal anti-CD40 CHIR-5.9. Ainda em outras formas de realização, os métodos aqui descritos compreendem uma terapêutica de combinação com IL-2, por exemplo, IL-2 humana, e um fragmento de ligação ao antigénio do anticorpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12 ou CHIR-5.9.

Em formas de realização alternativas, os métodos aqui apresentados compreendem a terapêutica de combinação com uma variante biologicamente activa de IL-2, por exemplo, a muteina de IL-2 des-alanil-1, serina 125 da IL-2 humana (também referida como "aldesleucina", que se encontra disponivel no mercado sob o nome comercial de Proleukin® (Chiron Corporation, Emeryville, Califórnia)) , e o anticorpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12 ou CHIR-5.9. Em outras formas de realização, os métodos aqui apresentados compreendem a terapêutica de combinação com uma variante biologicamente activa de IL-2, por exemplo, a muteina des-alanil-1, serina 125 da IL-2 humana, e um fragmento de ligação ao antigénio do anticorpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12 ou CHIR-5.9. A terapêutica de combinação aqui descrita poderá compreender outras variações, desde que o antigénio CD40 constitua o alvo do processo de tratamento.

Medições da eficácia clinica. De acordo com os métodos aqui descritos, a IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa e pelo menos um anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, tal como definido em outro local desta descrição, são usados em combinação para promover uma resposta terapêutica positiva relativamente a um 34 cancro compreendendo células neoplásicas que expressam o antigénio CD40. Por "resposta terapêutica positiva" pretende-se indicar uma melhoria da doença em associação à actividade anti-tumoral combinada destes agentes terapêuticos administrados, e/ou uma melhoria dos sintomas associados à doença. Assim, por exemplo, uma resposta terapêutica positiva referir-se-ia a um ou mais das seguintes melhorias da doença: (1) redução da dimensão do tumor; (2) redução do número de células cancerosas (i.e., neoplásicas); (3) incremento da morte das células neoplásicas; (4) inibição da sobrevivência das células neoplásicas; (5) inibição (i.e., algum grau de retardamento, preferencialmente paragem) do crescimento do tumor; (6) inibição (i.e., algum grau de retardamento, preferencialmente paragem) da infiltração de células cancerosas nos orgãos periféricos; (7) inibição (i.e., algum grau de retardamento, preferencialmente suspensão) da metastização do tumor; (8) prevenção do desenvolvimento de outros tumores; (9) uma taxa aumentada de sobrevivência do paciente; e (10) algum grau de alivio de um ou mais sintomas associados ao cancro. Tais respostas terapêuticas poderão ainda ser caracterizadas em maior detalhe segundo o grau de melhoria. Assim, por exemplo, uma melhoria da doença pode ser caracterizada como uma resposta completa. Por "resposta completa" pretende-se indicar a ausência de doença clinicamente detectável com normalização de quaisquer resultados anteriormente anormais dos estudos radiográficos, da medula óssea e do liquido cefaloraquidiano (LCR). Uma tal resposta terá de persistir durante pelo menos um mês após o tratamento de acordo com os métodos aqui expostos. Uma resposta completa poderá ser classificada como não confirmada se não for efectuada nenhuma repetição da avaliação do estado do tumor pelo menos um mês após a avaliação da resposta inicial. Alternativamente, uma melhoria da doença pode ser 35 categorizada como uma resposta parcial. Por "resposta parcial" pretende-se indicar uma diminuição de pelo menos cerca de 50% de toda a massa tumoral mensurável (i.e., o número de células tumorais presentes no indivíduo) na ausência de novas lesões e persistindo pelo menos durante um mês. Uma tal resposta é aplicável apenas a tumores mensuráveis. Múltiplos parâmetros poderão ser indicativos da eficácia do tratamento. Estes parâmetros incluem, de modo não limitativo, redução da dimensão da massa tumoral; redução da invasão metastática pelo tumor; redução da taxa de crescimento tumoral; diminuição da gravidade ou incidência de sequelas relacionadas com o tumor, tais como caquexia e produção de ascites; diminuição e/ou prevenção das complicações relacionadas com o tumor, tais como fracturas ósseas patológicas, anemia hemolitica autoimune, transformação prolinfocitica e síndroma de Richter, etc.; sensibilização do tumor à quimioterapia e outros tratamentos; aumento da taxa de sobrevivência do paciente; aumento das correlações clínicas de melhoria do prognóstico observadas, tais como o aumento de infiltração do tumor pelos linfócitos e a diminuição da vascularização do tumor; e semelhantes. Assim, em algumas formas de realização, a administração da combinação terapêutica resultará numa melhoria de um ou mais destes parâmetros num paciente (i.e., indivíduo) submetido a tratamento. Em outras formas de realização, as melhorias verificadas no paciente serão sinérgicas relativamente a alguns parâmetros, mas aditivas relativamente a outros. A resposta do tumor pode ser avaliada face às alterações de morfologia do tumor (i.e., massa tumoral total, dimensão do tumor e semelhantes) usando técnicas de avaliação tais como imagiologia por ressonância magnética (IRM), imagiologia por raios X, tomografia axial computorizada (TAC), citometria de fluxo ou análise de separação de células activadas por 36 fluorescência (FACS) , imagiologia bioluminescente, por exemplo, imagiologia com luciferase, cintigrafia óssea e biópsia do tumor, incluindo medulograma. Para além destas respostas terapêuticas positivas, o indivíduo submetido a terapia poderá experienciar o efeito benéfico de uma melhoria dos sintomas associados à doença. Assim, para os tumores de células B, o indivíduo poderá experienciar uma redução dos chamados sintomas B, i.e., sudação nocturna, febre, perda de peso e/ou urticária.

Um dos métodos de predição da eficácia clínica consiste em medir os efeitos da terapêutica de combinação com estes dois agentes terapêuticos num modelo adequado, por exemplo, o uso da combinação de IL-2 ou de uma sua variante biologicamente activa e de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio em um ou mais modelos de cancro em murinos. Para os linfomas, estes modelos incluem, por exemplo, os modelos de xenotransplante tumoral em ratinho nu como os que utilizam as linhas celulares humanas de linfoma de Burkitt conhecidas como Namalwa e Daudi. Assim, em algumas formas de realização, a actividade anti-tumoral da combinação destes dois agentes terapêuticos é ensaiada num modelo Namalwa de xenotransplante de NHL humano tal como descrito nos exemplos abaixo. A linha celular Namalwa dá origem a tumores agressivos resistentes ao rituximab quando implantada em ratinhos nus.

Noutras formas de realização preferidas, a actividade antitumoral da combinação destes dois agentes terapêuticos é ensaiada num modelo faseado de xenotransplante tumoral em ratinho nu usando a linha celular Daudi de linfoma humano. Um modelo faseado de xenotransplante tumoral em ratinho nu é geralmente mais eficaz na distinção da eficácia terapêutica de um dado protocolo terapêutico do que um modelo não faseado, uma vez que no modelo faseado a dosagem terapêutica é iniciada 37 apenas depois de o tumor ter atingido uma dimensão mensurável. No modelo não faseado, a dosagem terapêutica é iniciada geralmente passado 1 dia da inoculação do tumor e antes que esteja presente um tumor palpável. A capacidade de um regime terapêutico da combinação para exibir uma actividade antitumoral aumentada num modelo faseado constitui uma forte indicação de que o regime terapêutico de combinação será terapeuticamente eficaz.

Existem outros modelos tumorais bem conhecidos neste campo técnico. Por exemplo, para o mieloma múltiplo (MM), os modelos tumorais incluem, de modo não limitativo, modelos nos quais as linhas celulares são cultivadas em ratinhos imunodeficientes e os ratinhos são então tratados com os agentes terapêuticos de interesse, e modelos em que as células de mieloma do paciente são implantadas juntamente com osso fetal em ratinhos imunodeficientes e os ratinhos são então tratados com os agentes terapêuticos de interesse. Assim, por exemplo, a actividade anti-tumoral da combinação destes dois agentes terapêuticos pode ser ensaiada in vivo num modelo IM-9 de xenotransplante de MM humano, o qual usa a linha celular IM-9 de MM humano. Deste modo, a eficácia da terapêutica de combinação com IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa e um anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio pode ser avaliada usando um modelo não faseado de sobrevivência condicional, em que o tratamento com estes agentes terapêuticos é iniciado um dia após a inoculação intravenosa das células tumorais IM-9. Alternativamente, a eficácia desta terapêutica de combinação pode ser avaliada usando um modelo subcutâneo faseado, em que as células IM-9 são injectadas SC em ratinhos SCID, iniciando-se então o tratamento com estes agentes terapêuticos quando o tumor atinge uma dimensão mensurável. 38 A actividade anti-tumoral da terapêutica de combinação com IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa e um anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio pode ser avaliada num modelo de tumor sólido em murinos. Os exemplos incluem, de modo não limitativo, um modelo de xenotransplante de cancro do cólon usando a linha celular humana de carcinoma do cólon HCT 116, a qual expressa CD40; um modelo murino ortotópico não faseado (profiláctico) de cancro do ovário usando a linha celular de cancro do ovário SK0V3i.p.l; e um modelo murino faseado (terapêutico) de cancro do ovário usando a linha celular de cancro do ovário SK0V3Í.p.1.

Modos de administração. Para efectuar a terapêutica de combinação aqui descrita, as composições farmacêuticas contendo estas duas classes de agentes terapêuticos (i.e., a citocina e o anticorpo anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio) como componentes terapeuticamente activos podem ser administradas usando qualquer método aceitável conhecido neste campo. Assim, por exemplo, uma composição farmacêutica compreendendo IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa), uma composição farmacêutica contendo anticorpo antagonista anti-CD40 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio), ou uma composição farmacêutica compreendendo IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa) e um anticorpo antagonista anti-CD40 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio) pode ser administrada através de qualquer forma de injecção, incluindo a injecção intravenosa (IV), intratumoral (IT), intraperitoneal (IP), intramuscular (IM) ou subcutânea (SC) . Em algumas formas de realização, uma composição farmacêutica compreendendo IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa) é administrada por injecção IV, IM, IP ou SC, e uma composição farmacêutica compreendendo anticorpo antagonista anti-CD40 (ou um seu fragmento de 39 ligação ao antigénio) é administrada por injecção IV, IP ou SC. Em outras formas de realização, uma composição farmacêutica compreendendo IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa) é administrada por injecção IV, IT ou SC, e uma composição farmacêutica compreendendo anticorpo antagonista anti-CD40 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio) é administrada por injecção IV ou SC.

Em algumas das formas de realização aqui expostas, uma composição farmacêutica compreendendo IL-2 ou uma sua variante é administrada por injecção SC e uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio é administrada intravenosamente. Quando administrada intravenosamente, a composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio pode ser administrada por infusão ao longo de um periodo de cerca de 1 a cerca de 10 horas. Em algumas formas de realização, a infusão ocorre ao longo de um periodo de cerca de 2 a cerca de 8 horas, um periodo de cerca de 3 a cerca de 7 horas, um periodo de cerca de 4 a cerca de 6 horas, ou um periodo de cerca de 6 horas, dependendo do anticorpo antagonista anti-CD40 que é administrado.

Terapêutica de combinação. Os métodos aqui apresentados compreendem a utilização de uma terapêutica de combinação. O termo "combinação" é usado no seu sentido mais lato e significa que um indivíduo é tratado com pelo menos dois agentes terapêuticos. Assim, o termo "terapêutica de combinação" pretende indicar o tratamento de um indivíduo com pelo menos dois agentes oncoterápicos, mais particularmente com pelo menos IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa em combinação com pelo menos um anticorpo antagonista anti-CD4 0 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, podendo no entanto variar o horário de administração dos diferentes 40 regimes oncoterápicos, desde que os efeitos benéficos da combinação destes dois agentes terapêuticos sejam atingidos. 0 tratamento com IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa em combinação com um anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio pode ser simultâneo (concorrente), consecutivo (sequencial, por qualquer ordem), ou usar uma combinação destes tipos. Assim, um indivíduo a receber uma terapêutica de combinação poderá receber o tratamento com ambos os agentes terapêuticos ao mesmo tempo (i.e., em simultâneo) ou em tempos diferentes (i.e., sequencialmente, por qualquer ordem, no mesmo dia ou em dias diferentes), desde que o efeito terapêutico da combinação das duas substâncias se verifique no indivíduo que recebe a terapêutica. Em algumas formas de realização, a combinação de IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa e do anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio será administrada em simultâneo numa dosagem, mas outras dosagens incluirão uma administração sequencial, por qualquer ordem, no mesmo dia ou em dias diferentes. A administração sequencial pode ser efectuada independentemente da resposta do indivíduo ao primeiro agente terapêutico administrado. Quando os dois agentes terapêuticos são administrados em simultâneo, estes podem ser administrados sob a forma de composições farmacêuticas separadas, cada uma compreendendo ou a IL-2(ou uma sua variante biologicamente activa) ou o anticorpo antagonista anti-CD40 (ou o seu fragmento de ligação ao antigénio), ou ambos poderão ser administrados como uma só composição farmacêutica compreendendo ambos os agentes terapêuticos. 0 efeito da terapêutica de combinação pode ainda ser optimizado fazendo variar o horário de administração da IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa) e/ou do anticorpo antagonista anti-CD40 (ou um seu fragmento de ligação ao 41 antigénio). Assim, em algumas formas de realização, a IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa, tal como a muteina de IL-2 humana des-alanil C125S) será administrada em simultâneo com o anticorpo antagonista anti-CD40, tal como o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio) . Em outras formas de realização, a IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa, tal como a muteina de IL-2 humana des-alanil C125S) será administrada em primeiro lugar, sendo então administrado a seguir o anticorpo antagonista anti-CD40, tal como o anticorpo monoclonal CHIR- 12.12 ou CHIR-5.9 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio). Em ainda outras formas de realização, o anticorpo antagonista anti-CD40, tal como o anticorpo monoclonal CHIR- 12.12 ou CHIR-5.9 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio) será administrado em primeiro lugar, e a IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa, tal como a muteina de IL-2 humana des-alanil C125S) será administrada a seguir. Em algumas formas de realização, a combinação de IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa, tal como a muteina de IL-2 humana des-alanil C125S) e do anticorpo antagonista anti-CD40, tal como o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio) será administrada em simultâneo para uma dosagem, mas as outras dosagens incluirão a administração sequencial, por qualquer ordem, no mesmo dia ou em dias diferentes. Tal como anteriormente referido, quando a IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa, tal como a muteina de IL-2 humana des-alanil C125S) e o anticorpo antagonista anti-CD40, tal como o anticorpo monoclonal CHIR- 12.12 ou CHIR-5.9 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio) são administrados em simultâneo, estes podem ser administrados sob a forma de composições farmacêuticas separadas, cada uma compreendendo ou a IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa) ou o anticorpo antagonista 42 anti-CD40 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio), ou poderão ser administrados numa só composição farmacêutica compreendendo ambos os agentes terapêuticos. A terapêutica com uma quantidade eficaz da combinação de IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa) com pelo menos um anticorpo antagonista anti-CD40 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio) promove uma resposta terapêutica positiva num cancro que compreende células neoplásicas que expressam o antigénio CD40, incluindo linfomas relacionados com células B e tumores sólidos, tal como definido noutro local desta exposição. A terapêutica em simultâneo com ambos estes agentes anti-tumorais potência a actividade anti-tumoral de cada um dos agentes, deste modo proporcionando uma resposta terapêutica positiva que é melhorada em comparação com a observada com a administração de IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa) isoladamente ou com a administração do anticorpo antagonista anti-CD40 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio) isoladamente. A melhoria da resposta terapêutica positiva poderá ser de natureza aditiva ou sinérgica. No caso de ser sinérgica, a terapêutica em simultâneo com IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa) e pelo menos um anticorpo antagonista anti-CD40 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio) resulta numa resposta terapêutica positiva que é superior à soma das respostas terapêuticas positivas obtidas com os componentes separados de IL-2(ou uma sua variante biologicamente activa) e de anticorpo antagonista anti-CD40 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio).

Adicionalmente, o tratamento poderá ser efectuado variando tanto as doses como os regimes de dosagem, desde que a combinação destas doses seja eficaz no tratamento de qualquer um, ou mais, dos diversos parâmetros terapêuticos. Estes regimes de tratamento baseiam-se em doses e esquemas de 43 dosagem que maximizam os efeitos terapêuticos, tal como abaixo descrito. Os peritos na técnica reconhecerão que uma dose de qualquer anticorpo monoclonal ou de qualquer citocina como a IL-2 poderá não se mostrar terapeuticamente eficaz quando administrada individualmente, mas será terapeuticamente eficaz quando administrada em combinação com o outro agente. Assim, em algumas formas de realização, a dose terapeuticamente eficaz de uma combinação de IL-2 e de anticorpo antagonista anti-CD40 poderá compreender doses de agentes activos individuais que, quando administrados isoladamente, não seriam terapeuticamente eficazes ou teriam uma eficácia terapêutica menor do que quando administrados em combinação entre si.

Uma vez que a administração combinada destes dois agentes terapêuticos potência a eficácia de ambos estes agentes, poderá atingir-se uma resposta terapêutica positiva semelhante à conseguida com uma dose particular de IL-2 isolada usando doses mais baixas deste agente. A importância deste facto é dupla. Em primeiro lugar, os efeitos terapêuticos potenciais do tratamento de doenças malignas a células B ou de tumores sólidos com IL-2 ou uma sua variante podem ser atingidos com doses de IL-2 que minimizam as respostas de toxicidade normalmente associadas à administração de doses elevadas de IL-2. Tais respostas de toxicidade incluem, de modo não limitativo, fadiga crónica, náusea, hipotensão, febre, arrepios, ganho de peso, prurido ou rash, dispneia, azotémia, confusão, trombocitopénia, enfarte do miocárdio, toxicidade gastrointestinal e síndroma de derrame vascular (ver, por exemplo, Allison et al. (1989) J. Clin. Oncol. 7(1):75-80). Em segundo lugar, o direccionamento dos anticorpos monoclonais para moléculas específicas das células da superfície de um tumor poderá promover a selecção de clones que não são reconhecidos pelo anticorpo ou não são afectados pela sua ligação, resultando no escape do tumor e na perda de eficácia 44 terapêutica do tratamento. A actividade anti-tumoral melhorada do anticorpo antagonista anti-CD40 (ou do seu fragmento de ligação ao antigénio) administrado em combinação com IL-2 (ou uma sua variante) poderá traduzir-se em aumento da potência dos anticorpos monoclonais, administração menos frequente dos anticorpos monoclonais, e/ou dose mais baixa dos anticorpos monoclonais, deste modo reduzindo o potencial para escape do tumor. Ainda, a actividade ADCC do anticorpo monoclonal poderá também resultar da actividade das populações de neutrófilos e monócitos/macrófagos. Ver, por exemplo, Hernandez-Illzaliturri et al. (2003) Clin. Câncer Res. 9(16, Pt 1):5866-5873/ e

Uchida et al. (2004) J. Exp. Med. 199(12):1659-1669. Uma vez que é sabido que a IL-2 activa estas populações celulares, a terapêutica de combinação do anticorpo antagonista anti-CD40 com IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa pode melhorar a actividade anti-tumoral mediada por ADCC por parte do anticorpo. A quantidade de pelo menos um anticorpo antagonista anti-CD40 (ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio) a ser administrada em combinação com uma quantidade de IL-2 (ou de uma sua variante) e a quantidade de cada um destes agentes terapêuticos que é necessária para potenciar a eficácia do outro agente terapêutico são prontamente determinadas por um técnico de perícia média, sem recurso a experimentação indevida, tendo como base a presente exposição. Os factores que influenciam o modo de administração e a quantidade respectiva de IL-2 (ou uma variante desta) e do anticorpo antagonista anti-CD40 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio) administrados em combinação incluem, de modo não limitativo, o linfoma ou o tumor sólido particulares que são alvo da terapia, a gravidade da doença, a história da doença, e a idade, altura, peso, estado de saúde e forma física do indivíduo sujeito a terapia. De forma similar, a quantidade 45 destes agentes terapêuticos a administrar numa terapia de combinação será dependente do modo de administração e de o regime a aplicar ao indivíduo consistir numa dose única ou em doses múltiplas de cada um destes agentes terapêuticos. Geralmente, é preferida uma dose mais elevada do agente de anticorpo em função do aumento de peso do indivíduo a tratar.

Exemplos de Protocolos para a Terapêutica de Combinação de IL-2/Anticorpo Antagonista Anti-CD40

Em algumas formas de realização da exposição, a terapêutica de combinação é efectuada administrando doses semanais totais recomendadas de uma composição farmacêutica compreendendo IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa) em combinação com doses terapeuticamente eficazes recomendadas de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo antagonista anti-CD40 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio), cada uma sendo administrada de acordo com um regime de dosagem particular. Por "dose ou quantidade terapeuticamente eficaz" pretende-se indicar uma quantidade de um destes dois agentes terapêuticos que, quando administrada com uma dose ou quantidade terapeuticamente eficaz do outro destes dois agentes terapêuticos, proporciona uma resposta terapêutica positiva no tratamento de cancros que compreendem células neoplásicas que expressam o antigénio de superfície celular CD40. Tal como previamente assinalado acima, a administração das composições farmacêuticas separadas pode dar-se em simultâneo ou a tempos diferentes, desde que o efeito terapêutico da combinação das duas substâncias se manifeste no indivíduo submetido à terapêutica.

De acordo com algumas formas de realização desta exposição, o indivíduo humano submetido a tratamento com uma ou mais doses semanais do anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio, tal como aqui abaixo 46 definido, recebe também a administração de IL-2 ou de uma sua variante biologicamente activa, tal como aqui abaixo definido, de acordo com um regime de dosagem constante de IL-2 ou de acordo com um regime de dosagem de dois niveis de IL-2. Um aspecto importante desta terapêutica de combinação reside num período de sobreposição durante o qual ambos os agentes terapêuticos são administrados ao indivíduo, cada um de acordo com o regime de dosagem particular aqui exposto. Deste modo, quando a terapêutica de combinação compreende este período de sobreposição de dosagem com estes dois agentes terapêuticos, a terapêutica de combinação é também referida como "terapêutica concorrente". A primeira dose terapeuticamente eficaz administrada ao indivíduo poderá ser a do anticorpo antagonista anti-CD40 (ou do seu fragmento de ligação ao antigénio) ou a de IL-2 (ou da sua variante biologicamente activa) . Nos dias em que tanto o anticorpo antagonista anti-CD40 (ou o seu fragmento de ligação ao antigénio) como a IL-2 (ou a sua variante biologicamente activa) estão agendados para administração ao indivíduo, estes agentes terapêuticos poderão ser administrados ao mesmo tempo (i.e., administração simultânea) ou em tempos diferentes (i.e., administraçao sequencial, em qualquer ordem) . Se bem que a discussão que se segue sobre regimes de dosagem preferidos se refira à dosagem de um anticorpo antagonista anti-CD40 tal como aqui definido em combinação com IL-2 tal como aqui definida, reconhece-se que os protocolos (i.e., início do tratamento, duração do tratamento com anticorpo e IL-2, regimes de dosagem de anticorpo e de IL-2, interrupção da dosagem de IL-2, cursos subsequentes de terapêutica de combinação com IL-2/anticorpo antagonista anti-CD40, esquema de dosagem de IL-2, e semelhantes) são igualmente aplicáveis à dosagem com um fragmento de ligação ao antigénio de um anticorpo antagonista anti-CD40 tal como aqui definido em combinação com IL-2 tal 47 como aqui definida, à dosagem com um fragmento de ligação ao antigénio de um anticorpo antagonista anti-CD40 tal como aqui definido em combinação com uma variante biologicamente activa da IL-2 tal como aqui definida, ou à dosagem com um anticorpo antagonista anti-CD40 tal como aqui definido em combinação com uma variante biologicamente activa da IL-2 tal como aqui definida.

Terapêutica concorrente: inicio do tratamento. Quando a terapêutica concorrente com IL-2 e anticorpo antagonista anti-CD40 compreende um ou mais ciclos de um regime de dosagem constante de IL-2, o agente terapêutico inicial a ser administrado ao indivíduo no início de um período de tratamento poderá ser tanto a IL-2 como o anticorpo antagonista anti-CD40, desde que exista um período de sobreposição durante o qual ambos os agentes terapêuticos são administrados ao indivíduo, cada um de acordo com o regime de dosagem particular aqui descrito.

Assim, em uma das formas de realização, a terapêutica concorrente com estes dois agentes terapêuticos compreende a iniciação do regime de dosagem constante de IL-2 antes de se iniciar a administração das doses terapeuticamente eficazes de anticorpo antagonista anti-CD40, as quais são administradas semanalmente ou, alternativamente, uma vez em cada duas, três ou quatro semanas. Deste modo, é administrada uma primeira dose de IL-2 no máximo até um mês antes da administração da primeira dose de anticorpo antagonista anti-CD40. Por "no máximo até um mês" pretende-se indicar que a primeira dose de IL-2 é administrada pelo menos um dia antes de se iniciar a administração de anticorpo antagonista anti-CD40, mas não mais do que um mês (i.e., 30 dias) antes de se iniciar a administração de anticorpo antagonista anti-CD40. Assim, a administração de IL-2 poderá começar, por exemplo, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias (i.e., 1 semana), 48 10 dias, 14 dias (i.e., 2 semanas), 17 dias, 21 dias (i.e., 3 semanas), 24 dias, 28 dias (i.e., 4 semanas), ou até um mês (i.e., 30 ou 31 dias) antes da administração da primeira dose terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40.

Em outras formas de realização, o regime de dosagem constante de IL-2 e a administração de anticorpo antagonista anti-CD40 começam concorrentemente no mesmo dia, ao mesmo tempo (i.e., administração simultânea) ou a tempos diferentes (i.e., administração sequencial, por qualquer ordem). Assim, por exemplo, em uma forma de realização em que a terapêutica concorrente com estes dois agentes terapêuticos começa no dia 1 de um período de tratamento, uma primeira dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 e uma primeira dose de IL-2 seriam ambas administradas no dia 1 deste período de tratamento. Numa tal forma de realização, a dose de anticorpo antagonista anti-CD40 é administrada em primeiro lugar, seguindo-se a administração da dose de IL-2 no espaço de cerca de 10 minutos a cerca de 4 horas após concluída a administração da dose de anticorpo antagonista anti-CD40, tal como passados cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210 ou 240 minutos.

Em formas de realização alternativas, o agente terapêutico inicial a ser administrado ao indivíduo no início de um período de tratamento é o anticorpo antagonista anti-CD40, enquanto que o primeiro ciclo de dosagem constante de IL-2 é iniciado pela administração de uma primeira dose de IL-2 subsequentemente, por exemplo, no espaço de 10 dias após a administração da primeira dose terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, passados 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dias. Em algumas formas de realização, o primeiro ciclo de dosagem constante de IL-2 é iniciado administrando a primeira dose de IL-2 no espaço de 7 dias após a administração da primeira dose terapeuticamente 49 eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo passados 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias. Assim por exemplo, numa das formas de realização é administrada uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40 no dia 1 do periodo de tratamento, e o primeiro ciclo de dosagem constante de IL-2 é iniciado 7 dias mais tarde, i.e., através da administração da dose inicial de IL-2 no dia 8 do periodo de tratamento.

Após terminado o primeiro ciclo de dosagem constante de IL-2, um indivíduo humano que está a receber doses terapeuticamente eficazes do anticorpo antagonista anti-CD40 de acordo com um esquema de dosagem semanal ou, alternativamente, uma vez em cada duas, três ou quatro semanas, poderá receber a administração de um ou mais ciclos subsequentes de dosagem constante de IL-2. Durante o segundo e todos os ciclos subsequentes da dosagem constante de IL-2, geralmente o primeiro agente terapêutico a ser administrado ao individuo é o anticorpo antagonista anti-CD40, sendo o segundo ou subsequentes ciclos de dosagem constante de IL-2 iniciados pela administração de uma primeira dose de IL-2 no espaço de 24 horas, tal como passadas 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ou 24 horas da administração da dose de anticorpo antagonista anti-CD40. Nos dias em que tanto o anticorpo antagonista anti-CD40 como a IL-2 estão agendados para administração ao individuo, estes agentes terapêuticos poderão ser administrados ao mesmo tempo (i.e., administração simultânea) ou em tempos diferentes (i.e., administração sequencial, por qualquer ordem). Numa tal forma de realização, a dose de anticorpo antagonista anti-CD40 é administrada em primeiro lugar, seguindo-se a administração da dose de IL-2 no espaço de cerca de 10 minutos a cerca de 4 horas após concluida a administração da dose de anticorpo antagonista anti-CD40, tal como passados 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210 ou 240 minutos. 50

Quando a terapêutica concorrente com IL-2 e anticorpo antagonista anti-CD40 compreende um ou mais ciclos de um regime de dosagem de dois niveis de IL-2, o agente terapêutico inicial a ser administrado ao indivíduo no inicio de um período de tratamento poderá ser tanto a IL-2 como o anticorpo antagonista anti-CD40, desde que exista um período de sobreposição durante o qual ambos os agentes terapêuticos são administrados ao indivíduo, cada um de acordo com o regime de dosagem particular aqui descrito.

Assim, em uma das formas de realização, a terapêutica concorrente com estes dois agentes terapêuticos compreende a iniciação do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 antes de iniciar a administração das doses terapeuticamente eficazes de anticorpo antagonista anti-CD40, sendo que uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo é administrada de acordo com um esquema de dosagem de uma vez por semana ou, alternativamente, de uma vez em cada duas, três ou quatro semanas. Deste modo, é administrada uma primeira dose de IL-2 no máximo até um mês antes da administração da primeira dose de anticorpo antagonista anti-CD40. Por "no máximo até um mês" pretende-se indicar que a primeira dose de IL-2 é administrada pelo menos um dia antes de se iniciar a administração de anticorpo antagonista anti-CD40, mas não mais do que um mês (i.e., 30 dias) antes de se iniciar a administração de anticorpo antagonista anti-CD40. Assim, a administração de IL- 2 poderá começar, por exemplo, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias (i.e., 1 semana), 10 dias, 14 dias (i.e., 2 semanas) , 17 dias, 21 dias (i.e., 3 semanas) , 24 dias, 28 dias (i.e., 4 semanas), ou até um mês (i.e., 30 ou 31 dias) antes da administração da primeira dose terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40.

Em outras formas de realização, o regime de dosagem de dois níveis de IL-2 e a administração de anticorpo antagonista 51 anti-CD40 começam concorrentemente no mesmo dia, ao mesmo tempo (i.e., administração simultânea) ou a tempos diferentes (i.e., administração sequencial, por qualquer ordem). Assim, por exemplo, em uma forma de realização em que a terapêutica concorrente com estes dois agentes terapêuticos começa no dia 1 de um período de tratamento, uma primeira dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 e uma primeira dose de IL-2 seriam ambas administradas no dia 1 deste período de tratamento. Numa tal forma de realização, a dose de anticorpo antagonista anti-CD40 é administrada em primeiro lugar, seguindo-se a administração da dose de IL-2 no espaço de cerca de 10 minutos a cerca de 4 horas após concluída a administração da dose de anticorpo antagonista anti-CD40, tal como passados cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210 ou 240 minutos.

Em formas de realização alternativas, é administrada ao indivíduo uma primeira dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, no dia 1 de um período de tratamento, e o regime de dosagem de dois níveis de IL-2 é iniciado pela administração de uma primeira dose de IL- 2 no espaço de 10 dias após a administração da primeira dose terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40. Em tais formas de realização, o regime de dosagem de dois níveis de IL-2 é preferencialmente iniciado administrando uma primeira dose de IL-2 no espaço de 7 dias após a administração da primeira dose terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo passados 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias.

Dependendo da gravidade da doença, do estado físico do paciente e da história anterior de doença do paciente, poderão administrar-se um ou mais ciclos de um regime de dosagem de dois níveis de IL-2 concorrentemente com a terapêutica com anticorpo antagonista anti-CD40, sendo que as doses 52 terapeuticamente eficazes do anticorpo são administradas semanalmente ou, em alternativa, uma vez em cada duas, três ou quatro semanas.

Duração do tratamento com anticorpo e IL-2. De acordo com os métodos aqui expostos, é administrada uma dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antaqonista anti-CD40 semanalmente, ou a mesma é administrada uma vez em cada duas, três ou quatro semanas, em combinação com um ou mais ciclos de um regime de dosagem constante de IL-2 ou em combinação com um ou mais ciclos de um regime de dosagem de dois niveis de IL-2. Quando um indivíduo se encontra a receber uma terapêutica concorrente com estes dois agentes terapêuticos segundo aqui exposto, a duração da administração de anticorpo antagonista anti-CD40 e a duração de qualquer ciclo particular de qualquer dos regimes de dosagem de IL-2 dependerá do estado físico geral do indivíduo, da história de progressão da doença e da tolerância ao protocolo particular de administração de anticorpo antagonista anti-CD40/IL-2.

Assim, em algumas formas de realização, são administradas doses terapeuticamente eficazes do anticorpo antagonista anti-CD40 semanalmente (i.e., uma vez por semana), ou uma vez em cada duas a quatro semanas, por exemplo, uma vez em cada duas semanas, uma vez em cada três semanas ou uma vez em cada quatro semanas, ao longo de um período de tratamento, sendo que o período de tratamento inclui um ou mais ciclos de um regime de dosagem constante de IL-2 ou um ou mais ciclos de um regime de dosagem de dois níveis de IL-2.

Alternativamente, a terapêutica com anticorpo anti-CD40 poderá ter uma duração fixa dentro de um período de tratamento. Deste modo, uma dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 é administrada semanalmente, ou é administrada uma vez em cada duas, três ou quatro semanas, durante um intervalo de tempo fixo de cerca de 4 53 semanas a cerca de 16 semanas, incluindo 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 semanas, em combinação com um ou mais ciclos de um regime de dosagem constante de IL-2 ou em combinação com um ou mais ciclos de um regime de dosagem de dois niveis de IL-2. Assim, por exemplo, quando o anticorpo é administrado semanalmente durante um periodo de 4 semanas ou de 8 semanas, por exemplo, o indivíduo recebe quatro ou oito doses terapeuticamente eficazes do anticorpo anti-CD40, respectivamente, durante a terapêutica concorrente com IL-2. Similarmente, quando o anticorpo é administrado uma vez em cada duas semanas durante um período de 4 semanas ou de 8 semanas, por exemplo, o indivíduo recebe duas ou quatro doses terapeuticamente eficazes do anticorpo anti-CD40, respectivamente, durante a terapêutica concorrente com IL-2. Quando o anticorpo é administrado uma vez em cada três semanas durante um período de 6 semanas, 9 semanas, 12 semanas ou 15 semanas, por exemplo, o indivíduo recebe duas, três, quatro ou cinco doses terapeuticamente eficazes do anticorpo anti-CD40, respectivamente, durante a terapêutica concorrente com IL-2. Similarmente, quando o anticorpo é administrado uma vez em cada quatro semanas durante um período de 8 semanas, 12 semanas ou 16 semanas, por exemplo, o indivíduo recebe duas, três ou quatro doses terapeuticamente eficazes do anticorpo anti-CD40, respectivamente, durante a terapêutica concorrente com IL-2. A duração da administração de IL-2 durante a terapêutica concorrente com estes dois agentes terapêuticos depende do regime de dosagem de IL-2 usado. De modo geral, a IL-2 é administrada de acordo com os protocolos expostos, e um indivíduo pode repetir um ou mais ciclos de um regime de dosagem constante ou de dois níveis de IL-2 segundo necessário, a não ser que se desenvolvam sintomas de toxicidade por IL-2. Se se desenvolverem tais sintomas, o 54 indivíduo poderá suspender a dosagem de IL-2 até à resolução completa de quaisquer sintomas de toxicidade observados. Tais respostas de toxicidade à IL-2 incluem, de modo não limitativo, fadiga crónica, náusea, hipotensão, febre,

arrepios, ganho de peso, prurido ou rash, dispneia, azotémia, confusão, trombocitopénia, enfarte do miocárdio, toxicidade gastrointestinal e síndroma de derrame vascular (ver, por exemplo, Allison et al. (1989) J. Clin. Oncol. 7(1):75-80). O indivíduo poderá retomar a terapêutica concorrente com estes dois agentes terapêuticos, segundo necessário, após a resolução dos sinais e sintomas de toxicidade por IL-2. A retoma da terapêutica concorrente com estes dois agentes terapêuticos poderá envolver qualquer dos protocolos de administração de anticorpo antagonista anti-CD40/IL-2 aqui expostos (i.e., anticorpo antagonista anti-CD40 com o regime de dosagem constante de IL-2 ou anticorpo antagonista anti-CD40 com o regime de dosagem de dois níveis de IL-2), dependendo do estado físico geral do indivíduo, do estado da doença e da tolerância relativamente ao protocolo de administração de anticorpo anti-CD40/IL-2 particular.

Regime de dosagem constante de IL-2. Em algumas formas de realização da exposição, o indivíduo submetido a terapêutica concorrente com estes dois agentes terapêuticos recebe a administração de um ou mais ciclos de um regime de dosagem constante de IL-2 em combinação com o esquema de dosagem de anticorpo antagonista anti-CD40 aqui exposto (i.e., doses terapeuticamente eficazes de anticorpo antagonista anti-CD40 administradas semanalmente, ou administradas uma vez em cada duas, três ou quatro semanas, ao longo de um período de tratamento ou durante um intervalo de tempo fixo dentro do período de tratamento, tal como referido acima). Por "regime de dosagem constante de IL-2" pretende-se indicar que o indivíduo submetido a terapêutica concorrente com IL-2 e 55 anticorpo antagonista anti-CD40 recebe a administração de uma dose semanal total constante de IL-2 no decurso de qualquer um dos ciclos de administração de IL-2. Um ciclo completo de um regime de dosagem constante de IL-2 compreende a administração de uma dose semanal total constante de IL-2 durante um periodo de cerca de 2 semanas a cerca de 12 semanas, tal como cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 semanas, seguindo-se um período de suspensão da dosagem de IL-2, o qual tem uma duração de cerca de 1 semana a cerca de 4 semanas, incluindo 1, 2, 3 ou 4 semanas. Assim, cada ciclo de um regime de dosagem constante de IL-2 compreende um primeiro período durante o qual o indivíduo recebe a administração de uma dose semanal total constante de IL-2, e um segundo período durante o qual a dosagem de IL-2 é suspensa (i.e., um período "de descanso" ou "de férias" da administração de IL-2) . Preferencialmente, o indivíduo recebe a administração da dose semanal total constante de IL-2 durante pelo menos 4 semanas e até cerca de 12 semanas, altura em que a dosagem de IL-2 é suspensa durante um período de cerca de 1 semana a cerca de 4 semanas. Tal como acima se fez notar, qualquer destes agentes terapêuticos poderá ser administrado em primeiro lugar para dar início ao protocolo de terapêutica concorrente.

Quando é pretendido que o indivíduo receba a terapêutica de anticorpo antagonista anti-CD40 ao longo de um período de tratamento (i.e., um período durante o qual o indivíduo se encontra a receber uma terapêutica concorrente com estes dois agentes terapêuticos) , durante cada ciclo do regime de dosagem constante de IL-2, o indivíduo permanece no regime de dosagem recomendado para o anticorpo antagonista anti-CD40, e deste modo recebe uma dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 de acordo com um esquema de dosagem semanal, ou de acordo com um esquema de dosagem de uma vez em 56 cada duas semanas, uma vez em cada três semanas ou uma vez em cada quatro semanas.

Alternativamente, quando se pretende que o indivíduo receba a terapêutica com anticorpo antaqonista anti-CD40 durante um intervalo de tempo fixo no decurso de um período de tratamento, o período de tratamento compreenderá a administração de uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD40 durante um intervalo de tempo fixo de cerca de 4 semanas a cerca de 16 semanas, em que o anticorpo é administrado uma vez por semana, uma vez em cada duas semanas, uma vez em cada três semanas ou uma vez em cada quatro semanas, e a administração de um ou mais ciclos do regime de dosagem constante de IL-2. Assim, por exemplo, em algumas formas de realização, o indivíduo recebe a administração de uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40 uma vez por semana durante um intervalo de tempo fixo de 4 semanas ou 8 semanas, em combinação com pelo menos um ciclo de um regime de dosagem constante de IL-2. Em tais formas de realização, cada ciclo completo do regime de dosagem constante de IL-2 compreende a administração de uma dose semanal total constante de IL-2 durante um período de cerca de 2 semanas a cerca de 12 semanas, tal como cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 semanas, seguindo-se um período de suspensão da dosagem de IL-2, o qual tem a duração de cerca de 1 semana a cerca de 4 semanas, incluindo 1, 2, 3 ou 4 semanas.

De acordo com a escolha do médico assistente, o indivíduo que se encontra a receber a administração semanal de anticorpo antagonista anti-CD40, ou a administração do anticorpo antagonista anti-CD40 uma vez em cada duas, três ou quatro semanas, poderá continuar a receber a dose semanal total constante de IL-2 durante um período de tempo que se prolonga para além de 12 semanas, por exemplo, durante um período adicional de 1-8 semanas, desde que o protocolo de anticorpo 57 antagonista anti-CD40/dosagem constante de IL-2 seja bem tolerado e o indivíduo exiba sinais mínimos de toxicidade por anticorpo antagonista anti-CD40 e/ou por IL-2. Numa tal forma de realização, a conclusão da dosagem de IL-2 será seguida por um período de cerca de 1 semana a cerca de 4 semanas durante o qual a dosagem de IL-2 será suspensa para permitir ao indivíduo algum tempo de descanso deste agente terapêutico antes de iniciar um ciclo subsequente do regime de dosagem constante de IL-2 .

Numa das formas de realização, um indivíduo que necessita da terapêutica concorrente com anticorpo antagonista anti-CD40 e IL-2 recebe a administração de uma dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 uma vez por semana ao longo de um período de tratamento, ou recebe a administração de uma dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 uma vez em cada três semanas ao longo deste período de tratamento, começando no dia 1 deste período de tratamento, e o primeiro ciclo de um regime de dosagem constante de IL-2 tem início no dia 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 do mesmo período de tratamento. Numa destas formas de realização, o primeiro ciclo do regime de dosagem constante de IL-2 tem início no dia 8 (i.e., no início da semana 2) do período de tratamento, e tem uma duração de administração de IL-2 de cerca de 4 semanas a cerca de 12 semanas, seguindo-se um período de suspensão da administração de IL-2 que tem a duração de cerca de 1 semana a cerca de 4 semanas. No final deste primeiro ciclo do regime de dosagem constante de IL-2, o indivíduo recebe um ou mais ciclos subsequentes do regime de dosagem constante de IL-2, tal como acima referido.

Em outra forma de realização, o indivíduo recebe a administração de uma dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 uma vez por semana ao longo de um período de tratamento, ou recebe a administração de uma dose 58 terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 uma vez em cada três semanas ao longo deste período de tratamento, começando no dia 1 deste período de tratamento, e um primeiro ciclo do regime de dosagem constante de IL-2 tem início no dia 8 (i.e., no início da semana 2) do período de tratamento e tem uma duração de administração de IL-2 de cerca de 4 semanas, seguindo-se um período de suspensão da administração de IL-2 com a duração de 1 semana. Segundo o critério do médico assistente, o indivíduo recebe então a administração de um ou mais ciclos subsequentes deste regime de dosagem constante de IL-2, i.e., a administração da dose semanal total constante de IL-2 durante 4 semanas, seguindo-se 1 semana de suspensão da administração de IL-2. Durante todo o período de tratamento, o indivíduo continua a receber a dose terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40 de acordo com o esquema de dosagem de uma vez por semana, ou com o esquema de dosagem de uma vez em cada três semanas, desde que o indivíduo não exiba sintomas de toxicidade pelo anticorpo antagonista anti-CD40. Assim, por exemplo, se o indivíduo receber três ciclos do regime de dosagem constante de IL-2 em combinação com a administração semanal (i.e., uma vez por semana) de anticorpo antagonista anti-CD40, começando o primeiro ciclo de administração de IL-2 no dia 8 de um período de tratamento (i.e., o dia 1 da semana 2) , serão administradas a este indivíduo doses terapeuticamente eficazes do anticorpo antagonista anti-CD40 no dia 1 de cada semana de tratamento (i.e., o dia 1 das semanas 1-16), e uma dose semanal total constante de IL-2 será administrada durante as semanas 2-5, 7-10 e 12-15, ocorrendo o período de suspensão da dosagem de IL-2 durante as semanas 6, 11 e 16.

Em formas de realização alternativas, um indivíduo que necessita da terapêutica concorrente com anticorpo antagonista anti-CD40 e IL-2 recebe a administração de uma dose 59 terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 uma vez por semana, ou recebe a administração de uma dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 uma vez em cada duas semanas, durante um intervalo de tempo fixo de 4 semanas ou de 8 semanas que começa no dia 1 de um periodo de tratamento, e o primeiro ciclo de um regime de dosagem constante de IL-2 tem inicio no dia 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 do mesmo periodo de tratamento. Numa destas formas de realização, o primeiro ciclo do regime de dosagem constante de IL-2 tem inicio no dia 8 (i.e., no inicio da semana 2) do período de tratamento, e tem uma duração de administração de IL-2 de cerca de 4 semanas a cerca de 12 semanas, seguindo-se um período de suspensão da administração de IL-2 que tem a duração de cerca de 1 semana a cerca de 4 semanas. No final deste primeiro ciclo do regime de dosagem constante de IL-2, o indivíduo recebe um ou mais ciclos subsequentes do regime de dosagem constante de IL-2, tal como acima referido.

Em outra forma de realização, o indivíduo recebe a administração de uma dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 uma vez por semana, ou uma vez em cada duas semanas, durante um intervalo de tempo fixo de 4 semanas ou de 8 semanas que começa no dia 1 de um período de tratamento, e um primeiro ciclo do regime de dosagem constante de IL-2 tem início no dia 8 (i.e., no início da semana 2) do período de tratamento e tem uma duração de administração de IL-2 de 4 semanas, seguindo-se um período de suspensão da administração de IL-2 com a duração de 1 semana. Segundo o critério do médico assistente, o indivíduo recebe então a administração de um ou mais ciclos subsequentes deste regime de dosagem constante de IL-2, i.e., a administração da dose semanal total constante de IL-2 durante 4 semanas, seguindo-se 1 semana de suspensão da administração de IL-2. Assim, por exemplo, se o indivíduo receber três ciclos do regime de 60 dosagem constante de IL-2 em combinação com a administração semanal (i.e., uma vez por semana) de anticorpo antagonista anti-CD40 durante um intervalo de tempo fixo de 4 semanas, começando o primeiro ciclo de administração de IL-2 no dia 8 de um período de tratamento (i.e., no dia 1 da semana 2), serão administradas a este indivíduo doses terapeuticamente eficazes do anticorpo antagonista anti-CD40 no dia 1 das semanas 1-4 do período de tratamento, e uma dose semanal total constante de IL-2 será administrada durante as semanas 2-5, 7- 10 e 12-15, ocorrendo o período de suspensão da dosagem de IL- 2 durante as semanas 6, 11 e 16. Alternativamente, se o indivíduo receber três ciclos do regime de dosagem constante de IL-2 em combinação com a administração semanal (i.e., uma vez por semana) de anticorpo antagonista anti-CD40 durante um intervalo de tempo fixo de 8 semanas, começando o primeiro ciclo de administração de IL-2 no dia 8 de um período de tratamento (i.e., o dia 1 da semana 2), serão administradas a este indivíduo doses terapeuticamente eficazes do anticorpo antagonista anti-CD40 no dia 1 das semanas 1-8 do período de tratamento, e uma dose semanal total constante de IL-2 será administrada durante as semanas 2-5, 7-10 e 12-15, ocorrendo o período de suspensão da dosagem de IL-2 durante as semanas 6, 11 e 16.

Regime de dosagem de dois níveis de IL-2. Em outras formas de realização da exposição, a terapêutica concorrente com anticorpo antagonista anti-CD40 e IL-2 compreende a administração de uma dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 uma vez por semana, ou uma vez em cada duas, três ou quatro semanas, ao longo de um período de tratamento ou durante um intervalo de tempo fixo dentro do período de tratamento, em combinação com um ou mais ciclos de um "regime de dosagem de dois níveis de IL-2" no decurso deste período de tratamento. Por "regime de dosagem de dois níveis 61 de IL-2" pretende-se indicar que o individuo submetido a terapêutica concorrente com IL-2 e anticorpo antagonista anti-CD40 recebe a administração de IL-2 durante dois períodos de dosagem com IL-2, os quais têm a duração combinada de cerca de 2 semanas a cerca de 16 semanas, incluindo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 , 15 ou 16 semanas. Em uma das formas de realização, o regime de dosagem de dois níveis de IL-2 possui uma duração combinada de cerca de 4 semanas a cerca de 12 semanas; em outras formas de realização, o regime de dosagem de dois níveis de IL-2 tem uma duração combinada de cerca de 4 semanas a cerca de 8 semanas, incluindo cerca de 4, 5, 6, 7 ou 8 semanas. A dose semanal total de IL-2 que será administrada durante os primeiro e segundo períodos do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 é escolhida de modo a que uma dose semanal total mais elevada de IL-2 seja administrada durante o primeiro período e uma dose semanal total mais baixa de IL-2 seja administrada durante o segundo período. A duração dos primeiro e segundo períodos individuais de qualquer dos ciclos do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 pode variar, dependendo do estado de saúde do indivíduo e da história de progressão da doença. De modo geral, o indivíduo recebe a administração de doses semanais totais mais elevadas de IL-2 durante pelo menos 1 semana das 4 a 16 semanas correspondentes ao regime de dosagem de dois níveis de IL-2. Em uma das formas de realização, são administradas doses semanais totais mais elevadas de IL-2 durante a primeira metade do regime de dosagem de dois níveis de IL-2, sendo administradas doses semanais totais mais baixas de IL-2 durante a segunda metade do regime de dosagem de dois níveis de IL-2. Assim, por exemplo, se um ciclo completo do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 tiver uma duração combinada de 8 semanas, as doses semanais totais mais elevadas de IL-2 deverão ser administradas durante as primeiras 4 semanas de 62 dosagem com IL-2, e as doses semanais totais mais baixas de IL-2 deverão ser administradas durante as segundas 4 semanas de dosagem com IL-2.

Se se pretende que o indivíduo receba a terapêutica com anticorpo antagonista anti-CD40 ao longo de um período de tratamento (i . e., um período durante o qual o indivíduo se encontra a receber uma terapêutica concorrente com estes dois agentes terapêuticos), durante cada ciclo do regime de dosagem de dois níveis de IL-2, o indivíduo permanece no regime de dosagem recomendado para o anticorpo antagonista anti-CD40, e deste modo recebe uma dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 de acordo com um esquema de dosagem semanal, ou de acordo com um esquema de dosagem de uma vez em cada duas semanas, uma vez em cada três semanas ou uma vez em cada quatro semanas.

Alternativamente, quando se pretende que o indivíduo receba a terapêutica com anticorpo antagonista anti-CD40 durante um intervalo de tempo fixo no decurso de um período de tratamento, o período de tratamento compreenderá a administração de uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD40 durante um intervalo de tempo fixo de cerca de 4 semanas a cerca de 16 semanas, em que o anticorpo é administrado uma vez por semana, uma vez em cada duas semanas, uma vez em cada três semanas ou uma vez em cada quatro semanas, e a administração de um ou mais ciclos do regime de dosagem de dois níveis de IL-2. Assim, por exemplo, em algumas formas de realização, o indivíduo recebe a administração de uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40 uma vez por semana durante um intervalo de tempo fixo de 4 semanas ou 8 semanas, em combinação com pelo menos um ciclo de um regime de dosagem de dois níveis de IL-2, como referido acima. 63

Apesar de alguns regimes de dosagem específicos terem sido abaixo expostos, deve reconhecer-se que a exposição abrange qualquer protocolo de administração que proporcione uma terapêutica concorrente com um anticorpo antagonista anti-CD40 e um ou mais ciclos de um regime de dosagem de dois níveis de IL-2 que proporcione uma exposição inicial a doses semanais totais mais elevadas de IL-2 e uma exposição subsequente a doses semanais totais mais baixas de IL-2. Sem se pretender uma vinculação a qualquer teoria, acredita-se que a administração de uma dose mais elevada de IL-2 durante as fases iniciais de dosagem com IL-2 proporciona uma estimulação inicial da actividade das células NK que pode ser mantida usando uma dose mais baixa durante as semanas subsequentes de dosagem com IL-2. Uma vez que os efeitos secundários da IL-2 estão relacionados com a dose, a dose mais baixa de IL-2 aumentará a tolerabilidade deste agente terapêutico durante o período alargado de tratamento.

Assim, os métodos aqui descritos contemplam regimes de tratamento nos quais uma dose terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo antagonista anti-CD40 é administrada uma vez por semana ao longo de um período de tratamento, ou é administrada uma vez em cada duas, três ou quatro semanas ao longo deste período de tratamento, em combinação com um regime de dosagem de dois níveis de IL-2 que tem uma duração combinada de cerca de 2 semanas a cerca de 16 semanas, incluindo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 semanas. Qualquer um dos agentes poderá ser administrado em primeiro lugar, tal como acima se expôs em relação a este regime de dosagem de dois níveis de IL-2. Por exemplo, em uma das formas de realização, uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40 é administrada em primeiro lugar, por exemplo no dia 1 de um período de tratamento, seguindo-se a iniciação do regime de dosagem de dois níveis de 64 IL-2 no espaço de até 10 dias, preferencialmente no espaço de até 7 dias após a primeira administração do anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo após 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias. Durante o regime de dosagem de dois niveis de IL-2, é administrada uma dose semanal total mais elevada de IL-2 durante o primeiro período do regime de dosagem de dois níveis de IL-2, por exemplo, ao longo das primeiras 1-4 semanas de administração de IL-2, sendo administradas doses semanais totais mais baixas de IL-2 durante o segundo período do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 (i.e., ao longo do curso remanescente do regime de dosagem de dois níveis de IL-2).

Em uma das formas de realização, os métodos aqui expostos proporcionam a administração de uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo antagonista anti-CD40 semanalmente (i.e., uma vez por semana) ao longo de um período de tratamento, ou a administração desta dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 uma vez em cada três semanas ao longo deste período de tratamento, em combinação com um ou mais ciclos de um regime de dosagem de dois níveis de IL-2 no decurso deste período de tratamento, sendo que cada ciclo do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 tem a duração combinada de 4 a 8 semanas, incluindo 4, 5, 6, 7 ou 8 semanas. Assim, por exemplo, se o anticorpo antagonista anti-CD40 for administrado uma vez por semana, uma dose terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo antagonista anti-CD40 será administrada no dia 1 de cada semana do período de tratamento, e o primeiro ciclo de um regime de dosagem de dois níveis de IL-2 com a duração de 4-8 semanas terá início no dia 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 do mesmo período de tratamento.

Em uma destas formas de realização, as doses terapeuticamente eficazes da composição farmacêutica compreendendo o anticorpo antagonista anti-CD40 são 65 administradas semanalmente, começando no dia 1 de um periodo de tratamento e continuando ao longo do periodo de tratamento, e um primeiro ciclo do regime de dosagem de dois niveis de IL-2 tem inicio no dia 8 do mesmo periodo de tratamento e continua durante 8 semanas (i.e., durante as semanas 2-9 do periodo de tratamento).

Alternativamente, os métodos aqui apresentados contemplam regimes de tratamento para um indivíduo que deles necessite nos quais uma dose terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo antagonista anti-CD40 é administrada uma vez por semana, ou é administrada uma vez em cada duas semanas, durante um intervalo de tempo fixo de 4 semanas ou de 8 semanas, em combinação com um regime de dosagem de dois níveis de IL-2 com a duração combinada de cerca de 2 semanas a cerca de 16 semanas, incluindo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 semanas. Qualquer dos agentes poderá ser administrado em primeiro lugar, tal como acima apontado para este regime de dosagem de dois níveis de IL-2. Por exemplo, em uma das formas de realização, uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40 é administrada em primeiro lugar, por exemplo no dia 1 de um período de tratamento, seguindo-se a iniciação do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 no espaço de até 10 dias, preferencialmente no espaço de até 7 dias após a primeira administração do anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo após 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias. Durante o regime de dosagem de dois níveis de IL-2, é administrada uma dose semanal total mais elevada de IL-2 durante o primeiro período do regime de dosagem de dois níveis de IL-2, por exemplo, ao longo das primeiras 1-4 semanas de administração de IL-2, sendo administradas doses semanais totais mais baixas de IL-2 durante o segundo período do regime de dosagem de dois níveis 66 de IL-2 (i.e., ao longo do curso remanescente do regime de dosagem de dois níveis de IL-2).

Em uma das formas de realização, os métodos aqui expostos proporcionam a administração de uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo antagonista anti-CD40 semanalmente (i.e., uma vez por semana) , ou uma vez em cada duas semanas, ao longo de um intervalo de tempo fixo de 4 semanas ou de 8 semanas, em combinação com um ou mais ciclos de um regime de dosagem de dois níveis de IL-2 no decurso deste período de tratamento, sendo que cada ciclo do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 tem a duração combinada de 4 a 8 semanas, incluindo 4, 5, 6, 7 ou 8 semanas. Assim, por exemplo, se o anticorpo antagonista anti-CD40 for administrado uma vez por semana durante um período de 4 semanas, uma dose terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo antagonista anti-CD40 será administrada no dia 1 das semanas 1-4 do período de tratamento, e o primeiro ciclo de um regime de dosagem de dois níveis de IL-2 com a duração de 4-8 semanas terá início no dia 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 do mesmo período de tratamento.

Em uma destas formas de realização, as doses terapeuticamente eficazes da composição farmacêutica compreendendo o anticorpo antagonista anti-CD40 são administradas semanalmente ao longo de um intervalo de tempo fixo de 4 semanas, começando no dia 1 de um período de tratamento, e um primeiro ciclo do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 tem início no dia 8 do mesmo período de tratamento e continua durante 8 semanas (i.e., durante as semanas 2-9 do período de tratamento).

Interrupção da dosagem de IL-2. Os métodos aqui expostos contemplam igualmente formas de realização segundo as quais um indivíduo ao qual é administrado o anticorpo antagonista anti-CD4 0 de acordo com o esquema de dosagem aqui recomendado em 67 combinação com a administração de um ou mais ciclos de um regime de dosagem de dois niveis de IL-2 terá um período de "férias de fármaco" correspondente a um período de suspensão da dosagem de IL-2, ou a um período de suspensão da dosagem de IL-2 e da dosagem de anticorpo antagonista anti-CD40, entre a conclusão do primeiro período de tempo de qualquer um dos ciclos do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 e a iniciação do segundo período de tempo desse mesmo ciclo do regime de dosagem de dois níveis de IL-2. Nestas formas de realização, o regime de dosagem de dois níveis de IL-2 é interrompido de modo a que a dosagem de IL-2 seja suspensa durante um período de cerca de 1 semana a cerca de 4 semanas após a conclusão do primeiro período de tempo de um dado ciclo do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 durante o qual foi administrada a dose semanal total mais elevada. Durante este período de suspensão da dosagem de IL-2, o indivíduo poderá continuar a receber uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40 de acordo com o esquema de dosagem aqui recomendado (i.e., uma vez por semana, ou uma vez em cada duas, três ou quatro semanas), ou, alternativamente, a dosagem de anticorpo antagonista anti-CD40 poderá igualmente ser suspensa. A duração desta interrupção da dosagem de IL-2 dependerá do estado de saúde do indivíduo, da história de progressão da doença e da resposta do indivíduo à terapêutica inicial com IL-2/anticorpo recebida durante o primeiro período de tempo de qualquer um dos ciclos do regime de dosagem de dois níveis de IL-2. De modo geral, a dosagem de IL-2 é interrompida durante um período de cerca de 1 semana a cerca de 4 semanas, após o que o indivíduo recebe a administração correspondente ao segundo período do regime de dosagem de dois níveis de IL-2, no qual são administradas doses semanais totais mais baixas de IL-2 em combinação com a administração semanal de doses terapeuticamente eficazes do anticorpo 68 antagonista anti-CD40. De modo a completar qualquer um dos ciclos de um regime de dosagem de dois niveis de IL-2, um indivíduo terá de receber a administração das doses semanais totais mais elevadas correspondentes ao primeiro período e das doses semanais totais mais baixas correspondentes ao segundo período.

Durante estas "férias de fármaco" (i.e., o período de suspensão da administração de IL-2, ou período de suspensão da administração de IL-2 e de anticorpo antagonista anti-CD40), as contagens de células natural killer (NK) são monitorizadas para determinar em que altura o regime de dosagem de dois níveis de IL-2, ou o regime de dosagem de dois níveis de IL-2 e a administração semanal do anticorpo antagonista anti-CD40, deve(m) ser recomeçado(s). Os níveis de células NK acima de 200 células/PI poderão constituir um importante factor de influência sobre a resposta clínica positiva à terapêutica com anticorpo antagonista anti-CD40. Deste modo, a monitorização da contagem de células NK durante, no final, e após qualquer um dos ciclos de dosagem de IL-2 proporciona um meio para determinar quando e se a terapêutica com IL-2 deve ser reinstituída após um período de suspensão da dosagem de IL-2, o qual poderá ou não incluir um período de suspensão da administração de anticorpo antagonista anti-CD40.

Deste modo, as contagens de células NK são medidas bi-semanalmente ou mensalmente durante o regime de dosagem de dois níveis de IL-2, e na conclusão do primeiro período do regime de dosagem de dois níveis de IL-2, antes do início das férias de fármaco. Quando a contagem de células NK ultrapassa o limiar de aceitabilidade, o regime de dosagem de dois níveis de IL-2 pode ser interrompido. Por "limiar de aceitabilidade" pretende-se indicar que o indivíduo submetido ao tratamento possui uma contagem de células NK que corresponde a cerca de 150 células/μΐ ou superior, preferencialmente a 200 células/μΐ 69 ou superior. Após a descontinuação da dosagem de IL-2, que poderá ou não incluir a descontinuação da administração de anticorpo antagonista anti-CD40, as contagens de células NK serão então medidas uma vez por semana ou duas vezes por semana, ou poderão ser monitorizadas menos frequentemente, por exemplo, uma vez em cada duas semanas ou uma vez em cada três semanas. Uma contagem de células NK abaixo do limiar de aceitabilidade de cerca de 150 células/μΐ, por exemplo, uma contagem de células NK inferior a 150 células/μΐ, é indicativa da necessidade de retomar o regime de dosagem de dois niveis de IL-2, ou o regime de dosagem de dois niveis de IL-2 e o regime de dosagem do anticorpo antagonista anti-CD40 no caso de as férias de fármaco terem também incluído a suspensão da administração de anticorpo antagonista anti-CD40. Preferencialmente, o regime de dosagem de dois níveis de IL-2 é retomado quando a contagem de células NK desce abaixo de um limiar de cerca de 200 células/μΐ, i.e., uma contagem de células NK inferior a 200 células/μΐ. Nesta altura, o indivíduo recebe a administração correspondente ao segundo período do regime de dosagem de dois níveis de IL-2, em que doses semanais totais mais baixas de IL-2 são administradas em combinação com o anticorpo antagonista anti-CD40, e em que uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo é administrada uma vez por semana ou uma vez em cada duas, três ou quatro semanas.

Dependendo do estado geral de saúde do indivíduo, da resposta clínica e da tolerabilidade da terapêutica concorrente com estes dois agentes terapêuticos, após a conclusão de um primeiro ciclo de um regime de dosagem de dois níveis de IL-2 o indivíduo poderá receber a administração de um ou mais ciclos subsequentes de um regime de dosagem de dois níveis de IL-2 em combinação com a administração de doses 70 terapeuticamente eficazes de anticorpo antagonista anti-CD40, sendo uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo administrada uma vez por semana ou uma vez em cada duas, três ou quatro semanas. Em tais formas de realização, o médico assistente poderá conceder umas férias de fármaco ou um período de suspensão da administração de IL-2 entre ciclos sucessivos. Assim, ao terminar um dado ciclo de um regime de dosagem de dois níveis de IL-2, o qual por sua vez poderá ou não incluir um período de suspensão da administração de IL-2 entre o primeiro e o segundo períodos da dosagem de IL-2, o indivíduo poderá fazer uma interrupção da administração de IL-2 antes de iniciar um ciclo subsequente do regime de dosagem de dois níveis de IL-2. De modo geral, o período de suspensão da administração de IL-2 entre qualquer dos ciclos do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 é de cerca de 1 semana a cerca de 4 semanas, incluindo cerca de 1, 2, 3 ou 4 semanas. Durante as férias do fármaco IL-2, o indivíduo poderá continuar a receber doses terapeuticamente eficazes de anticorpo antagonista anti-CD40, as quais podem ser administradas uma vez por semana ou uma vez em cada duas, três ou quatro semanas, ou, alternativamente, a dosagem de anticorpo antagonista anti-CD40 poderá igualmente ser interrompida.

Cursos subsequentes de terapêutica de combinação com IL-2/anticorpo antagonista anti-CD40.

Se um indivíduo a seguir uma terapêutica de acordo com os regimes de dosagem previamente mencionados exibir uma resposta parcial, ou uma recidiva depois de um período prolongado de remissão, poderão ser necessários cursos subsequentes de terapêutica concorrente para atingir a remissão completa da doença. Assim, subsequentemente a um período de suspensão de um primeiro período de tratamento, o qual poderá ter 71 compreendido um regime de dosagem constante de IL-2 ou um regime de dosagem de dois niveis de IL-2 em combinação com a terapêutica com anticorpo antagonista anti-CD40 ao longo de todo o periodo de tratamento ou durante um intervalo de tempo fixo dentro do periodo de tratamento, um indivíduo poderá receber um ou mais períodos de tratamento adicionais compreendendo regimes de dosagem constantes ou de dois níveis de IL-2 em combinação com a administração de anticorpo antagonista anti-CD40, sendo que o anticorpo pode ser administrado ao longo de todo(s) o(s) período(s) adicional(is) de tratamento ou ser administrado durante um intervalo de tempo fixo dentro do período de tratamento. Um tal período de interrupção entre períodos de tratamento é aqui referido como período de descontinuação. É sabido que a extensão do período de descontinuação depende do grau de resposta do tumor (i.e., completa versus parcial) atingida com quaisquer períodos anteriores de terapêutica concorrente com estes dois agentes terapêuticos.

Assim, por exemplo, para um indivíduo a seguir uma terapêutica concorrente com doses semanais de anticorpo antagonista anti-CD40 e um regime de dosagem de dois níveis de IL-2, o qual poderá ou não incluir umas férias de fármaco entre o primeiro e o segundo períodos do regime de dosagem de dois níveis de IL-2, o regime de tratamento poderá incluir múltiplas sessões de tratamento, cada uma das quais compreende a terapêutica concorrente com doses semanais de anticorpo antagonista anti-CD40 e um regime de dosagem de dois níveis de IL-2. Estas sessões múltiplas de tratamento são aqui referidas como ciclos de manutenção, sendo que cada ciclo de manutenção compreende a administração de anticorpo antagonista anti-CD40 em combinação com um regime de dosagem de dois níveis de IL-2 completo. Por "regime de dosagem de dois níveis de IL-2 completo" pretende-se indicar que o indivíduo recebeu a 72 administração tanto do primeiro periodo de dosagem semanal total mais elevada como do segundo periodo de dosagem semanal total mais baixa. A necessidade de múltiplos ciclos de manutenção pode ser avaliada através da monitorização da contagem de células NK de um modo similar ao usado para determinar se se deve instituir um periodo de férias do fármaco e quando um tal periodo de férias do fármaco deve ser finalizado. Assim, no final do regime de dosagem de dois niveis de IL-2 num dado ciclo de manutenção, o clinico responsável pelo tratamento obtém uma contagem de células NK. Este indicador é então medido a intervalos mensais (i.e., uma vez por mês) após terminado um dado regime de dosagem de dois niveis de IL-2. Tal como acontece com as férias de fármaco, uma contagem de células NK que desça abaixo de um limiar de aceitabilidade (i.e., abaixo de cerca de 150 célulasZ/μΙ, preferencialmente abaixo de cerca de 200 células/ΖμΙ) é indicativa da necessidade de administrar outro ciclo de manutenção ao indivíduo. O intervalo entre os ciclos de manutenção poderá ser de cerca de 1 mês a cerca de 6 meses, incluindo 1 mês, 1,5 meses, 2 meses, 2,5 meses, 3 meses, 3,5 meses, 4 meses, 4,5 meses, 5 meses, 5,5 meses, 6 meses ou outros períodos de tempo que estejam dentro do intervalo de cerca de 1 mês a cerca de 6 meses.

Assim, os métodos de administração aqui expostos proporcionam um meio melhorado para o tratamento de cancros que compreendem células que expressam CD40, por exemplo, cancros relacionados com células B tais como linfomas, mielomas e leucemia, e cancros sólidos, tais como o do rim (incluindo, por exemplo, carcinomas de células renais), bexiga, fígado (incluindo, por exemplo, carcinomas hepatocelulares), estômago, colo uterino, próstata, nasofaringe, tiróide (por exemplo, carcinoma papilar da tiróide), cancros da pele como o melanoma, e sarcomas 73 osteosarcomas e os sarcomas de (incluindo, por exemplo,

Ewing) . Sem que se pretenda um vinculo a qualquer teoria, o esquema de dosagem constante de IL-2 com interrupções entre doses proporciona um esquema de dosagem intermitente que permite uma administração menos frequente de IL-2 durante a terapêutica com anticorpo antagonista anti-CD40, e melhor tolerabilidade da terapêutica de longo termo com IL-2. 0 regime de dosagem de dois niveis de IL-2 oferece a oportunidade de fornecer ao paciente doses semanais totais mais elevadas de IL-2, as quais proporcionam uma expansão dos números de células NK que pode ser mantida usando uma dose mais baixa durante as semanas subsequentes de dosagem com IL-2. Este protocolo de administração possui a atracção adicional de possibilitar férias do fármaco IL-2 entre as doses semanais totais mais elevadas e as mais baixas do esquema de dosagem de IL-2, assim como férias de IL-2 entre ciclos concluídos do regime de dosagem de dois níveis de IL-2, de novo contribuindo para a tolerabilidade aumentada da terapêutica concorrente com anticorpo antagonista anti-CD40 e IL-2. É reconhecido que, quando um indivíduo que segue uma terapêutica de acordo com os regimes de dosagem previamente mencionados exibe uma resposta parcial, ou uma recidiva na sequência de um período prolongado de remissão, o indivíduo poderá receber o anticorpo antagonista anti-CD40 como único agente terapêutico ou em combinação com outra oncoterapia. Assim, um indivíduo que tenha recebido anteriormente uma terapêutica concorrente com IL-2 e anticorpo antagonista anti-CD40 para o tratamento de um cancro compreendendo células neoplásicas que expressam CD40, e que tenha a necessidade de receber tratamento adicional para o seu cancro, poderá receber uma terapêutica com um anticorpo antagonista anti-CD40 isolado, ou com um anticorpo antagonista anti-CD40 e pelo menos uma outra oncoterapia antes de, ou como alternativa a, 74 receber novamente uma terapêutica concorrente com anticorpo antagonista anti-CD40 e IL-2. Entre os outros tipos de oncoterápicos incluem-se, de modo não limitativo, os que abaixo se descrevem.

Esquema de dosagem de IL-2. Para indivíduos humanos a receber uma terapêutica concorrente com anticorpo antagonista anti-CD40 de acordo com o esquema de administração aqui recomendado em combinação com um ou mais ciclos de um regime de dosagem constante de IL-2 ou um ou mais ciclos de um regime de dosagem de dois níveis de IL-2, a dose semanal total de IL-2 a ser administrada durante os períodos de dosagem de IL-2 pode ser administrada sob a forma de dose única, ou pode ser repartida numa série de doses equivalentes que são administradas de acordo com um esquema de dosagem de duas, três, quatro, cinco, seis ou sete vezes por semana. Quando se pretende a administração de doses semanais totais mais elevadas durante um primeiro período, e de doses semanais totais mais baixas durante um segundo período, não é necessário que a dose semanal total seja administrada do mesmo modo no decurso de ambos os períodos de dosagem. Assim, por exemplo, a dose semanal total mais elevada do primeiro período de um regime de dosagem de dois níveis de IL-2 poderá ser administrada como dose única ou ser repartida numa série de doses equivalentes que são administradas de acordo com um esquema de dosagem de duas, três, quatro, cinco, seis ou sete vezes por semana. Similarmente, a dose semanal total mais baixa do segundo período de um regime de dosagem de dois níveis de IL-2 poderá ser administrada como dose única ou ser repartida numa série de doses equivalentes que são administradas de acordo com um esquema de dosagem de duas, três, quatro, cinco, seis ou sete vezes por semana.

Para os fins da presente invenção, um "esquema de dosagem de duas, três, quatro, cinco, seis ou sete vezes por semana" 75 pretende indicar que a dose semanal total é repartida em duas, três, quatro, cinco, seis ou sete doses equivalentes, respectivamente, as quais são administradas ao indivíduo no decurso de um período de 7 dias, em que não mais do que uma dose equivalente é administrada por período de 24 horas. A série de doses equivalentes pode ser administrada em dias sequenciais, ou pode ser administrada de modo a que exista um espaçamento de um ou mais dias entre quaisquer duas doses consecutivas, dependendo do número total de doses equivalentes administradas por semana.

Assim, por exemplo, quando é administrada uma série de duas doses equivalentes de IL-2 por semana (i.e., ao longo de um período de 7 dias) e a primeira dose equivalente daquela semana é administrada no dia 1, a segunda dose equivalente de IL-2 poderá ser administrada no dia 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dessa semana. Em uma das formas de realização, a dose semanal total de IL-2 é repartida por duas doses equivalentes que são administradas ao indivíduo dentro de um período de 7 dias, sendo permitido um mínimo de 72 horas entre as doses e um máximo de 96 horas entre as doses.

Similarmente, quando é administrada uma série de três doses equivalentes de IL-2 por semana e a primeira dose equivalente dessa semana é administrada no dia 1, a segunda dose equivalente poderá ser administrada no dia 2, 3, 4, 5 ou 6 dessa semana, e a terceira dose equivalente poderá ser administrada no dia 3, 4, 5, 6 ou 7 dessa semana, desde que ocorram cerca de 24 horas entre a administração das segunda e terceira doses equivalentes. Em uma das formas de realização, a dose semanal total de IL-2 é repartida em três doses equivalentes que são administradas ao indivíduo dentro de um período de 7 dias, sendo permitido um mínimo de 25 horas entre doses e um máximo de 72 horas entre doses. 76

Quando é administrada uma série de quatro doses equivalentes de IL-2 por semana e a primeira dose equivalente dessa semana é administrada no dia 1, a segunda dose equivalente poderá ser administrada no dia 2, 3, 4 ou 5 dessa semana, a terceira dose equivalente poderá ser administrada no dia 3, 4, 5 ou 6 dessa semana e a quarta dose equivalente pode ser administrada no dia 4, 5, 6 ou 7 dessa semana, desde que ocorram cerca de 24 horas entre a administração de quaisquer duas doses consecutivas (i.e., entre as primeira e segunda doses equivalentes, entre as segunda e terceira doses equivalentes e entre as terceira e quarta doses equivalentes).

Quando é administrada uma série de cinco doses equivalentes de IL-2 por semana e a primeira dose equivalente dessa semana é administrada no dia 1, a segunda dose equivalente poderá ser administrada no dia 2, 3 ou 4 dessa semana, a terceira dose equivalente poderá ser administrada no dia 3, 4 ou 5 dessa semana, a quarta dose equivalente pode ser administrada no dia 4, 5 ou 6 dessa semana e a quinta dose equivalente pode ser administrada no dia 5, 6 ou 7 dessa semana, desde que ocorram cerca de 24 horas entre a administração de quaisquer duas doses consecutivas (i.e., entre as primeira e segunda doses equivalentes, entre as segunda e terceira doses equivalentes, entre as terceira e quarta doses equivalentes e entre as quarta e quinta doses equivalentes).

Quando é administrada uma série de seis doses equivalentes de IL-2 por semana e a primeira dose equivalente dessa semana é administrada no dia 1, a segunda dose equivalente poderá ser administrada no dia 2 ou 3 dessa semana, a terceira dose equivalente poderá ser administrada no dia 3 ou 4 dessa semana, a quarta dose equivalente pode ser administrada no dia 4 ou 5 dessa semana, a quinta dose equivalente pode ser administrada no dia 5 ou 6 dessa semana e a sexta dose 77 equivalente pode ser administrada no dia 6 ou 7 dessa semana, desde que ocorram cerca de 24 horas entre a administração de quaisquer duas doses consecutivas (i.e., entre as primeira e segunda doses equivalentes, entre as segunda e terceira doses equivalentes, entre as terceira e quarta doses equivalentes, entre as quarta e quinta doses equivalentes e entre as quinta e sexta doses equivalentes).

Em uma das formas de realização, a dose semanal total de IL-2 é repartida por sete doses equivalentes, as quais são administradas diariamente ao longo do periodo de 7 dias, ocorrendo cerca de 24 horas entre cada dose consecutiva. Não é necessário que o mesmo esquema de dosaqem seja seguido ao longo de um regime de dosagem constante de IL-2, ou que o mesmo esquema de dosagem seja seguido em ambos os períodos, primeiro e segundo, do regime de dosagem de dois níveis de IL-2. Assim, o esquema de dosagem pode ser ajustado para acomodar a tolerância do indivíduo à terapêutica prolongada com IL-2 em combinação com a terapêutica com anticorpo antagonista anti-CD40, e para reflectir a resposta do indivíduo à terapêutica concorrente com estes dois agentes terapêuticos. 0 esquema de dosagem preferido durante o regime de dosagem constante de IL-2 e os dois períodos do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 é facilmente determinado pelo médico assistente tendo em conta a história médica do paciente e as orientações aqui fornecidas.

Intervalos de Dose de Anticorpo Antagonista Anti-CD40 para Uso na Terapêutica de Combinação com IL-2/Anticorpo Antagonista Anti-CD40

Para os fins da presente invenção, a dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio, tal como definido em outro ponto nesta descrição, a ser administrada em combinação com a 78 terapêutica com IL-2 tal como aqui definido, varia entre cerca de 0,003 mg/kg e cerca de 50 mg/kg, entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 40 mg/kg, entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 30 mg/kg, entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 30 mg/kg, entre cerca de 0,5 mg/kg e cerca de 30 mg/kg, entre cerca de 1 mg/kg e cerca de 30 mg/kg, entre cerca de 3 mg/kg e cerca de 30 mg/kg, entre cerca de 3 mg/kg e cerca de 25 mg/kg, entre cerca de 3 mg/kg e cerca de 20 mg/kg, entre cerca de 5 mg/kg e cerca de 15 mg/kg, ou entre cerca de 7 mg/kg a cerca de 12 mg/kg. Assim, por exemplo, a dose de um qualquer anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio, por exemplo o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, poderá ser de 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, ou quaisquer outras doses dentro do intervalo de cerca de 0,003 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Poderá ser administrada a mesma dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio ao longo de cada semana de dosagem com anticorpo. Alternativamente, poderão usar-se diferentes doses terapeuticamente eficazes de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio no decurso de um período de tratamento.

Assim, em algumas formas de realização da invenção, a dose terapeuticamente eficaz inicial de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio, tal como definido em outro local desta exposição, pode encontrar-se na gama de dosagens mais baixa (i.e., de cerca de 0,003 mg/kg a cerca de 20 mg/kg) , encontrando-se as doses subsequentes na gama de dosagens mais elevada (i.e., de cerca de 20 mg/kg a cerca de 50 mg/kg). 79

Em formas de realização alternativas, a dose terapeuticamente eficaz inicial de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio, tal como definido em outro local desta exposição, pode encontrar-se na gama de dosagens mais elevada (i.e., de cerca de 20 mg/kg a cerca de 50 mg/kg) , encontrando-se as doses subsequentes na gama de dosagens mais baixa (i.e., de cerca de 0,003 mg/kg a cerca de 20 mg/kg) . Assim, em uma forma de realização, a dose terapeuticamente eficaz inicial de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio é de cerca de 20 mg/kg a cerca de 35 mg/kg, incluindo cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg e cerca de 35 mg/kg, e as doses terapeuticamente eficazes subsequentes de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio são de cerca de 5 mg/kg a cerca de 15 mg/kg, incluindo cerca de 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg e cerca de 15 mg/kg.

Em algumas das formas de realização da invenção, a terapêutica com anticorpo antagonista anti-CD40 é iniciada pela administração de uma "dose de carga" do anticorpo ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio a um indivíduo que necessita da terapêutica de combinação com anticorpo antagonista anti-CD40/IL-2. Por "dose de carga" pretende-se indicar uma dose inicial de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio que é administrada ao indivíduo, sendo que a dose administrada de anticorpo ou do seu fragmento de ligação ao antigénio se encontra na gama de dosagens mais elevada (i.e., de cerca de 20 mg/kg a cerca de 50 mg/kg). A "dose de carga" pode ser administrada sob a forma de administração única, por exemplo, uma infusão única em que o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio é administrado por via IV, ou em administrações múltiplas, por exemplo, infusões múltiplas em 80 que o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio é administrado por via IV, desde que a "dose de carga" completa seja administrada dentro de um periodo de cerca de 24 horas. Após a administração da "dose de carga", o indivíduo recebe então a administração de uma ou mais doses terapeuticamente eficazes adicionais do anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio. As doses terapeuticamente eficazes subsequentes podem ser administradas de acordo com um regime de dosagem semanal, ou uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas ou uma vez a cada quatro semanas, tal como acima se referiu. Em tais formas de realização, as doses terapeuticamente eficazes subsequentes encontram-se geralmente na gama de dosagens mais baixa (i.e., 0,003 mg/kg a cerca de 20 mg/kg). Alternativamente, em algumas formas de realização, após a "dose de carga", as doses terapeuticamente eficazes subsequentes do anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio são administradas de acordo com um "regime de manutenção", em que a dose terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio é administrada uma vez por mês, uma vez a cada 6 semanas, uma vez a cada 2 meses, uma vez a cada 10 semanas, uma vez a cada três meses, uma vez a cada 14 semanas, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada 18 semanas, uma vez a cada cinco meses, uma vez a cada 22 semanas, uma vez a cada seis meses, uma vez a cada 7 meses, uma vez a cada 8 meses, uma vez a cada 9 meses, uma vez a cada 10 meses, uma vez a cada 11 meses, ou uma vez a cada 12 meses. Em tais formas de realização, as doses terapeuticamente eficazes do anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio encontram-se na gama de dosagens mais baixa (i.e., 0,003 mg/kg a cerca de 20 mg/kg), particularmente quando as doses subsequentes são administradas 81 a intervalos mais frequentes, desde, por exemplo, uma vez a cada duas semanas até uma vez por mês, ou na gama de dosagens mais elevada (i.e., de cerca de 20 mg/kg a cerca de 50 mg/kg), particularmente quando as doses subsequentes são administradas a intervalos menos frequentes, por exemplo quando as doses subsequentes são administradas com um espaçamento entre si de cerca de um mês a cerca de 12 meses.

Intervalos de Dose de IL-2 para Uso na Terapêutica de Combinação com IL-2/Anticorpo Antagonista Anti-CD40

Para os fins da presente discussão de doses terapeuticamente eficazes de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a ser administradas em combinação com a terapêutica com anticorpo antagonista anti-CD40, é usada a composição farmacêutica de IL-2 disponível no mercado sob o nome comercial de Proleukin® (Chiron Corporation, Emeryville, Califórnia) como padrão de referência de IL-2. Por "padrão de referência de IL-2" pretende-se indicar a formulação de IL-2 que serve como base para a determinação das doses terapeuticamente eficazes de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a administrar a um indivíduo humano com um cancro compreendendo células que expressam CD40 em combinação com a terapêutica com anticorpo antagonista anti-CD40. A molécula activa usada neste produto de IL-2 é a muteína de IL-2 humana recombinante aldesleucina (referida como interleucina 2 humana des-alanil-1, serina-125; ver a Patente dos EUA n° 4.931.543).

Assim, por exemplo, quando a fonte de IL-2 é Proleukin®, a dose semanal total de IL-2 Proleukin® a ser administrada em combinação com a terapêutica com anticorpo antagonista anti-CD4 0 encontra-se no intervalo de cerca de 18 milhões de unidades internacionais (MIU) a cerca de 54 MIU, dependendo do 82 historial médico do paciente submetido à terapêutica e do regime de dosagem de IL-2 recomendado (por exemplo, regime de dosagem constante versus de dois niveis de IL-2). Quando se pretende a administração de doses mais elevadas de IL-2, a dose semanal total de IL-2 Proleukin® poderá encontrar-se no intervalo de cerca de 42,0 MIU a cerca de 54,0 MIU, incluindo cerca de 42,0 MIU, 43,5 MIU, 45,0 MIU, 46,5 MIU, 48,0 MIU, 49,5 MIU, 51,0 MIU, 52,5 MIU e 54,0 MIU, e outros valores que estejam contidos neste intervalo. Quando se pretende a administração de valores intermédios de IL-2, a dose semanal total de IL-2 Proleukin® poderá encontrar-se no intervalo de cerca de 30,0 MIU a cerca de 42,0 MIU, incluindo cerca de 30,0 MIU, 31,5 MIU, 33,0 MIU, 34,5 MIU, 36,0 MIU, 37,5 MIU, 39,0 MIU, 40,5 MIU e 42,0 MIU, e outros valores que estejam contidos neste intervalo. Quando se pretende a administração de valores mais baixos de IL-2, a dose semanal total de IL-2 Proleukin® poderá encontrar-se no intervalo de cerca de 18,0 MIU a cerca de 30,0 MIU, incluindo cerca de 18,0 MIU, 19,5 MIU, 21,0 MIU, 22,5 MIU, 24,0 MIU, 25,5 MIU, 27,0 MIU, 28,5 MIU e 30,0 MIU, e outros valores que estejam contidos neste intervalo.

Doses recomendadas para o regime de dosagem constante com IL-2. Quando a IL-2 Proleukin® se destina a ser administrada de acordo com um regime de dosagem constante de IL-2 em combinação com a terapêutica com anticorpo antagonista anti-CD40, a dose total semanal deste padrão de referência de IL-2 é de cerca de 18,0 MIU a cerca de 54,0 MIU. Assim, por exemplo, em algumas formas de realização, a quantidade total de IL-2 Proleukin® a administrar por semana como parte de um regime de dosagem constante de IL-2 é de cerca de 18,0 MIU, 20 MIU, 22,0 MIU, 24,0 MIU, 26,0 MIU, 28,0 MIU, 30,0 MIU, 32,0 83 MIU, 34,0 MIU, 36,0 MIU, 38,0 MIU, 40,0 MIU, 42,0 MIU, 44,0 MIU, 46,0 MIU, 48,0 MIU, 50,0 MIU, 52,0 MIU ou 54,0 MIU, e outros valores que estejam contidos neste intervalo de cerca de 18,0 MIU a cerca de 54,0 MIU. Em algumas formas de realização, a dose semanal total de IL-2 Proleukin® encontra-se no intervalo de cerca de 42,0 MIU a cerca de 54,0 MIU, por exemplo, 42,0 MIU, 44,0 MIU, 46,0 MIU, 48,0 MIU, MIU, 50,0 MIU, 52,0 MIU ou 54,0 MIU. Em outras formas de realização, a dose semanal total de IL-2 Proleukin® encontra-se no intervalo de cerca de 30,0 MIU a cerca de 42,0 MIU, por exemplo, cerca

de 30,0 MIU, 32,0 MIU, 34,0 MIU, 36,0 MIU, 38,0 MIU, 40,0 MIU ou 42,0 MIU. Em formas de realização alternativas, a dose semanal total de IL-2 Proleukin® encontra-se no intervalo de cerca de 18,0 MIU a cerca de 30,0 MIU, por exemplo, 18,0 MIU, 20,0 MIU, 22,0 MIU, 24,0 MIU, 26,0 MIU, 28,0 MIU ou 30,0 MIU.

Tal como anteriormente se fez notar, a dose semanal total de IL-2 durante um regime de dosagem constante de IL-2 pode ser administrada como dose única ou pode ser repartida numa série de doses equivalentes que são administradas de acordo com um esquema de dosagem de duas, três, quatro, cinco, seis ou sete vezes por semana. Assim, por exemplo, quando a dose semanal total de IL-2 Proleukin® é de 54,0 MIU, as três doses equivalentes desta fonte de IL-2 a serem administradas em cada semana correspondem a 18,0 MIU, e as duas doses equivalentes desta fonte de IL-2 a serem administradas em cada semana correspondem a 27,0 MIU. De forma similar, quando a dose semanal total de IL-2 Proleukin® é de 42,0 MIU, as três doses equivalentes desta fonte de IL-2 a serem administradas em cada semana correspondem a 14,0 MIU, e as duas doses equivalentes desta fonte de IL-2 a serem administradas em cada semana correspondem a 21,0 MIU. Quando a dose semanal total de IL-2 Proleukin® é de 30,0 MIU, as três doses equivalentes desta 84 fonte de IL-2 a serem administradas em cada semana correspondem a 10,0 MIU, e as duas doses equivalentes desta fonte de IL-2 a serem administradas em cada semana correspondem a 15,0 MIU. Similarmente, quando a dose semanal total de IL-2 Proleukin® é de 18,0 MIU, as três doses equivalentes desta fonte de IL-2 a serem administradas em cada semana correspondem a 6,0 MIU, e as duas doses equivalentes desta fonte de IL-2 a serem administradas em cada semana correspondem a 9,0 MIU.

De acordo com os métodos aqui expostos, o indivíduo recebe a administração deste regime constante de IL-2 em combinação com doses terapeuticamente eficazes do anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio, sendo que a dose terapeuticamente eficaz do anticorpo ou do seu fragmento de ligação ao antigénio é administrada de acordo com um regime de dosagem aqui apresentado (i.e., uma vez por semana, uma vez em cada duas semanas, uma vez em cada três semanas ou uma vez em cada quatro semanas ao longo de um período de tratamento ou durante um intervalo de tempo fixo dentro de um período de tratamento). A dose terapeuticamente eficaz de anticorpo anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio a ser administrada varia entre cerca de 0,003 mg/kg e cerca de 50 mg/kg, incluindo de cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 30 mg/kg. Assim, por exemplo, em algumas formas de realização, a quantidade total do anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio é de cerca de 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, ou quaisquer outras doses dentro do intervalo de cerca de 0,003 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. 85

Assim, por exemplo, em algumas formas de realização, a quantidade total de IL-2 Proleukin® a ser administrada por semana como parte de um regime de dosagem constante de IL-2 corresponde a cerca de 42,0 MIU, 44,0 MIU, 46,0 MIU, 48,0 MIU, 50,0 MIU, 52,0 MIU ou 54,0 MIU, e a dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio a ser administrada em combinação com o regime de dosagem constante de IL-2 é de cerca de 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg ou 50 mg/kg, sendo que esta dose de anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio é administrada uma vez por semana, uma vez em cada duas semanas, uma vez em cada três semanas ou uma vez em cada quatro semanas, ao longo de um período de tratamento ou durante um intervalo de tempo fixo dentro de um período de tratamento. Em uma destas formas de realização, a quantidade total de IL-2 Proleukin® a ser administrada por semana como parte de um regime de dosagem constante de IL-2 corresponde a cerca de 42,0 MIU, e a dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio a ser administrada em combinação com o regime de dosagem constante de IL-2 é de cerca de 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg ou 35 mg/kg, sendo que esta dose de anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio é administrada uma vez por semana, uma vez em cada duas semanas , uma vez em cada três semanas ou uma vez em cada quatro semanas, ao longo de um periodo de tratamento ou durante um intervalo de tempo fixo dentro de um período de tratamento. Em formas de realização preferidas, esta dose semanal total de 42,0 MIU de IL-2 Proleukin® é repartida por 86 duas ou três doses equivalentes que são administradas de acordo com um esquema de dosaqem de duas vezes ou de três vezes por semana, respectivamente. Deste modo, as duas doses equivalentes desta fonte de IL-2 a administrar durante cada semana do reqime de dosaqem constante de IL-2 seriam de 21,0 MIU, e as três doses equivalentes desta fonte de IL-2 a administrar durante cada semana do regime de dosagem constante de IL-2 seriam de 14,0 MIU.

Em outras formas de realização, a quantidade total de IL-2 Proleukin® a ser administrada por semana como parte de um regime de dosagem constante de IL-2 corresponde a cerca de 30.0 MIU, 32,0 MIU, 34,0 MIU, 36,0 MIU, 38,0 MIU, 40,0 MIU ou 42.0 MIU, e a dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio a ser administrada em combinação com o regime de dosagem constante de IL-2 é de cerca de 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg ou 50 mg/kg, sendo que esta dose de anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio é administrada uma vez por semana, uma vez em cada duas semanas, uma vez em cada três semanas ou uma vez em cada quatro semanas, ao longo de um período de tratamento ou durante um intervalo de tempo fixo dentro de um período de tratamento. Em uma destas formas de realização, a quantidade total de IL-2 Proleukin® a ser administrada por semana como parte de um regime de dosagem constante de IL-2 corresponde a cerca de 30,0 MIU, e a dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio a ser administrada em combinação com o regime de dosagem constante de IL-2 é de cerca de 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg ou 35 mg/kg, sendo que esta dose de anticorpo 87 antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio é administrada uma vez por semana, uma vez em cada duas semanas , uma vez em cada três semanas ou uma vez em cada quatro semanas, ao longo de um período de tratamento ou durante um intervalo de tempo fixo dentro de um período de tratamento. Em formas de realização preferidas, esta dose semanal total de 30,0 MIU de IL-2 Proleukin® é repartida por duas ou três doses equivalentes que são administradas de acordo com um esquema de dosagem de duas vezes ou de três vezes por semana, respectivamente. Deste modo, as duas doses equivalentes desta fonte de IL-2 a administrar durante cada semana do regime de dosagem constante de IL-2 seriam de 15,0 MIU, e as três doses equivalentes desta fonte de IL-2 a administrar durante cada semana do regime de dosagem constante de IL-2 seriam de 10,0 MIU.

Em ainda outras formas de realização, a quantidade total de IL-2 Proleukin® a ser administrada por semana como parte de um regime de dosagem constante de IL-2 corresponde a cerca de 18.0 MIU, 20,0 MIU, 22,0 MIU, 24,0 MIU, 26,0 MIU, 28,0 MIU ou 30.0 MIU, e a dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio a ser administrada em combinação com o regime de dosagem constante de IL-2 é de cerca de 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg ou 50 mg/kg, sendo que esta dose de anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio é administrada uma vez por semana, uma vez em cada duas semanas , uma vez em cada três semanas ou uma vez em cada quatro semanas, ao longo de um período de tratamento ou durante um intervalo de tempo fixo dentro de um período de tratamento. Em uma destas formas de realização, a quantidade 88 total de IL-2 Proleukin® a ser administrada por semana como parte de um regime de dosagem constante de IL-2 corresponde a cerca de 18,0 MIU, e a dose terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio a ser administrada em combinação com o regime de dosagem constante de IL-2 é de cerca de 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg ou 35 mg/kg, sendo que esta dose de anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio é administrada uma vez por semana, uma vez em cada duas semanas , uma vez em cada três semanas ou uma vez em cada quatro semanas, ao longo de um periodo de tratamento ou durante um intervalo de tempo fixo dentro de um periodo de tratamento. Em formas de realização preferidas, esta dose semanal total de 18,0 MIU de IL-2 Proleukin® é repartida por duas ou três doses equivalentes que são administradas de acordo com um esquema de dosagem de duas vezes ou de três vezes por semana, respectivamente. Deste modo, as duas doses equivalentes desta fonte de IL-2 a administrar durante cada semana do regime de dosagem constante de IL-2 seriam de 9,0 MIU, e as três doses equivalentes desta fonte de IL-2 a administrar durante cada semana do regime de dosagem constante de IL-2 seriam de 6,0 MIU.

Doses recomendadas para o regime de dosagem de dois níveis de IL-2. Quando a IL-2 Proleukin® se destina a ser administrada de acordo com um regime de dosagem constante de IL-2 em combinação com a terapêutica com anticorpo antagonista anti-CD40, a dose total semanal mais elevada deste padrão de referência de IL-2 que é administrada durante o primeiro período deste regime de dosagem com IL-2 está entre cerca de 30,0 MIU e cerca de 54,0 MIU, e a dose total semanal mais 89 baixa deste padrão de referência de IL-2 que é administrada durante o segundo periodo deste regime de dosagem com IL-2 está entre cerca de 18,0 MIU e cerca de 39,0 MIU. Tal como anteriormente se fez notar, a dose semanal total administrada durante o primeiro periodo do regime de dosagem de dois niveis de IL-2, por exemplo, durante a primeira metade deste regime de dosagem, é sempre mais elevada do que a dose semanal total que é administrada durante o segundo periodo do regime de dosagem de dois niveis de IL-2, por exemplo, durante a segunda metade deste regime de dosagem.

Assim, em algumas formas de realização, a dose semanal total mais elevada de IL-2 Proleukin® a administrar durante o primeiro periodo do regime de dosagem de dois niveis de IL-2 está entre cerca de 30,0 MIU e cerca de 54,0 MIU, incluindo cerca de 30,0 MIU, 32,0 MIU, 35,0 MIU, 37,0 MIU, 40,0 MIU, 42.0 MIU, 45,0 MIU, 47,0 MIU, 50,0 MIU, 52,0 MIU ou 54,0 MIU, e outros valores que estejam contidos neste intervalo de dosagem mais elevada; e a dose semanal total mais baixa de IL-2 Proleukin® está entre cerca de 18,0 MIU e cerca de 39,0 MIU, incluindo 18,0 MIU, 20,0 MIU, 23,0 MIU, 25,0 MIU, 27,0 MIU, 30.0 MIU, 32,0 MIU, 35,0 MIU, 37,0 MIU ou 39,0 MIU, e outros valores que estejam contidos neste intervalo de dosagem mais baixa.

Tal como anteriormente se fez notar, a dose semanal total de IL-2 durante os primeiro e segundo períodos de um regime de dosagem de dois níveis de IL-2 pode ser administrada como dose única ou pode ser repartida numa série de doses equivalentes que são administradas de acordo com um esquema de dosagem de duas, três, quatro, cinco, seis ou sete vezes por semana. Assim, por exemplo, quando a dose semanal total de IL-2 Proleukin® durante o primeiro período do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 é de 42,0 MIU, as três doses equivalentes 90 deste padrão de referência de IL-2 a serem administradas em cada semana corresponderiam a 14,0 MIU, e as duas doses equivalentes deste padrão de referência de IL-2 a serem administradas em cada semana corresponderiam a 21,0 MIU. De forma similar, quando a dose semanal total de IL-2 Proleukin® durante o sequndo periodo do reqime de dosaqem de dois niveis de IL-2 é de 30,0 MIU, as três doses equivalentes deste padrão de referência de IL-2 a serem administradas em cada semana corresponderiam a 10,0 MIU, e as duas doses equivalentes deste padrão de referência de IL-2 a serem administradas em cada semana corresponderiam a 15,0 MIU.

De acordo com os métodos aqui apresentados, o indivíduo recebe a administração deste regime de dosagem de dois níveis de IL-2 em combinação com doses terapeuticamente eficazes do anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio, sendo que a dose terapeuticamente eficaz do anticorpo ou do seu fragmento de ligação ao antigénio é administrada uma vez por semana, uma vez em cada duas semanas, uma vez em cada três semanas ou uma vez em cada quatro semanas ao longo de um período de tratamento ou durante um intervalo de tempo fixo dentro de um período de tratamento. A dose terapeuticamente eficaz de anticorpo anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio a ser administrada varia entre cerca de 0,003 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, incluindo cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg. Assim, por exemplo, em algumas formas de realização, a dose terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio poderá corresponder a cerca de 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, ou quaisquer 91 outras doses dentro do intervalo de cerca de 0,003 mg/kg a cerca de 50 mg/kg.

Em uma das formas de realização, as doses terapeuticamente eficazes do anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio, como acoma referido, são administradas uma vez por semana, uma vez em cada duas semanas, uma vez em cada três semanas ou uma vez em cada quatro semanas ao longo de um periodo de tratamento ou durante um intervalo de tempo fixo dentro de um periodo de tratamento, e o regime de dosagem de dois niveis de IL-2 a ser administrado em combinação com este regime de dosagem de anticorpo antagonista anti-CD40 tem uma duração combinada de 4 a 8 semanas, em que a dose semanal total mais elevada de IL-2 Proleukin® que é administrada durante o primeiro periodo do regime de dosagem de dois niveis de IL-2 está entre cerca de 30.0 MIU e cerca de 54,0 MIU, tal como 30,0 MIU, 32,0 MIU, 35.0 MIU, 37,0 MIU, 40,0 MIU, 42,0 MIU, 45,0 MIU, 47,0 MIU, 50.0 MIU, 52,0 MIU ou 54,0 MIU, e a dose semanal total mais baixa de IL-2 Proleukin® que é administrada durante o segundo periodo do regime de dosagem de dois niveis de IL-2 está entre cerca de 18,0 MIU e cerca de 39,0 MIU, tal como 18,0 MIU, 20,0 MIU, 23, 0 MIU, 25, 0 MIU, 27,0 MIU, 30 ,0 MIU, 32,0 MIU, 35, 0 MIU, 37,0 MIU ou 3 9 , 0 MIU. Numa tal forma de realização, a dose semanal total mais elevada de IL-2 Proleukin® que é administrada durante o primeiro periodo do regime de dosagem de dois niveis de IL-2 é de 42,0 MIU e a dose semanal total mais baixa de IL-2 Proleukin® que é administrada durante o segundo periodo do regime de dosagem de dois niveis de IL-2 é de 30,0 MIU.

Assim, por exemplo, em algumas formas de realização, o indivíduo é submetido a uma terapêutica concorrente que inclui a administração semanal de anticorpo antagonista anti-CD40 ou 92 do seu fragmento de ligação ao antigénio e um regime de dosagem de dois níveis de IL-2, com uma duração combinada de 8 semanas. Nesta forma de realização particular, a dosagem com IL-2 começa no dia 1 da semana 2 (i.e., no dia 8 após a primeira dosagem com anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio efectuada no dia 1 deste período de tratamento). Deste modo, a dose semanal total de IL-2 Proleukin® a administrar durante as semanas 2-5 do período de tratamento encontra-se no intervalo de cerca de 30.0 MIU a cerca de 54,0 MIU, tal como 30,0 MIU, 32,0 MIU, 35.0 MIU, 37,0 MIU, 40,0 MIU, 42,0 MIU, 45,0 MIU, 47,0 MIU, 50.0 MIU, 52,0 MIU ou 54,0 MIU, ou outros valores que estejam contidos neste intervalo de dosagem mais elevada. Nesta forma de realização, a dose semanal total de IL-2 Proleukin® a administrar durante as semanas 6-9 do período de tratamento encontra-se no intervalo de cerca de 18,0 MIU a cerca de 39,0 MIU, tal como 18,0 MIU, 20,0 MIU, 23,0 MIU, 25,0 MIU, 27,0 MIU, 30,0 MIU, 32,0 MIU, 35,0 MIU, 37,0 MIU ou 39,0 MIU, e outros valores que estejam contidos neste intervalo. Tal como anteriormente se fez notar, as doses semanais totais a serem administradas durante os primeiro e segundo períodos do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 são escolhidas a partir destes intervalos de tal modo que uma dose semanal total mais elevada seja administrada durante o primeiro período do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 (por exemplo, as semanas 2-5 de um período de tratamento de 9 semanas) , e uma dose semanal total mais baixa seja administrada durante o segundo período do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 (por exemplo, as semanas 6-9 do mesmo período de tratamento de 9 semanas). Assim, por exemplo, se a dose semanal total de IL-2 durante o primeiro período do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 estiver entre cerca de 42,0 MIU e cerca de 54,0 MIU, a dose 93 semanal total de IL-2 Proleukin® durante o segundo período de dosagem com IL-2 estará de preferência contida no intervalo de cerca de 18,0 MIU a cerca de 39,0 MIU.

Assim, quando a duração de um período de tratamento correspondente a uma terapêutica concorrente com uma dosagem semanal de anticorpo antagonista anti-CD40 e um regime de dosagem de dois níveis de IL-2 é de cerca de 9 semanas, em uma das formas de realização a dose semanal total de IL-2 Proleukin® a administrar durante as semanas 2-5 do período de tratamento é de cerca de 30,0 MIU a cerca de 54,0 MIU, ou de cerca de 30,0 MIU a cerca de 42,0 MIU, e a dose semanal total de IL-2 Proleukin® durante as semanas 6-9 deste período de tratamento é de cerca de 18,0 MIU a cerca de 30,0 MIU.

Em uma das formas de realização, a dose semanal total de IL-2 Proleukin® durante as semanas 2-5 é de cerca de 42,0 MIU,e a dose semanal total de IL-2 Proleukin® durante as semanas 6-9 é de cerca de 30,0 MIU. Nesta forma de realização, cada uma das doses semananais totais, a mais elevada e a mais baixa, de IL-2 Proleukin® são repartidas em duas doses equivalentes que são administradas de acordo com um esquema de dosagem de duas vezes por semana, sendo que as duas doses equivalentes são administradas ao indivíduo no decurso de um período de 7 dias, permitindo-se um mínimo de 72 horas entre as doses e um máximo de 96 horas entre as doses. Numa forma de realização alternativa, cada uma das doses semanais totais, a mais elevada e a mais baixa, de IL-2 Proleukin® são repartidas em três doses equivalentes que são administradas de acordo com um esquema de dosagem de três vezes por semana, sendo que as três doses equivalentes são administradas ao indivíduo no decurso de um período de 7 dias, permitindo-se um mínimo de 25 horas entre as doses e um máximo de 72 horas entre as doses. Tal como acima se realçou, a dose terapeuticamente eficaz do 94 anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio que se destina a ser administrada em combinação com o regime de dosagem de dois níveis de IL-2 é de cerca de 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, ou qualquer outra dose abrangida pelo intervalo de cerca de 0,03 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, sendo que esta dose do anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio é administrada semanalmente, ao longo de todo o período de tratamento ou durante um intervalo de tempo fixo de 4 a 8 semanas dentro do período de tratamento. Numa forma de realização alternativa, esta dose terapeuticamente eficaz do anticorpo ou do seu fragmento de ligação ao antigénio é administrada uma vez em cada duas semanas, uma vez em cada três semanas ou uma vez em cada quatro semanas ao longo de um período de tratamento, ou é administrada uma vez a cada duas semanas durante um intervalo de tempo fixo de 4 a 8 semanas dentro do período de tratamento, sendo que o indivíduo recebe também a administração do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 acima descrito.

Doses relativas vs. absolutas na dosagem de IL-2. As doses semanais totais de IL-2 Proleukin® que se seguem são expressas em termos de MIU e representam as quantidades totais ou doses absolutas que serão administradas a um indivíduo humano numa base semanal. A dose semanal total relativa correspondente de IL-2 Proleukin® a ser administrada a um indivíduo poderá facilmente ser calculada. Uma pessoa média tem uma área de superfície corporal de aproximadamente 1,7 m . Assim, quando a dose semanal total absoluta de IL-2 Proleukin® a ser 95 administrada é de cerca de 42,0 MIU a cerca de 54,0 MIU, a dose semanal total relativa correspondente de IL-2 Proleukin® é de cerca de 24,7 MIU/m2 a cerca de 31,8 MIU/m2. Similarmente, quando a dose semanal total absoluta é de cerca de 30,0 MIU a cerca de 42,0 MIU, a dose semanal total relativa correspondente é de cerca de 17,6 MIU/m2 a cerca de 24,7 MIU/m2. Quando a dose semanal total relativa é de cerca de 18,0 MIU a cerca de 30,0 MIU, a dose semanal total relativa correspondente é de cerca de 10,6 MIU/m2 a cerca de 17,6 MIU/m2. A unidade internacional (IU) para a actividade biológica da IL-2 foi estabelecida em 1988 pelo International Laboratory for Biological Standards da Organização Mundial de Saúde (OMS). Os materiais biológicos de referência para a IL-2 fornecidos pelo National Institute for Biological Standards and Controls (NIBSC), o qual pertence à OMS, estão doseados a 100 unidades internacionais por ampola de IL-2 humana nativa derivada de células Jurkat. A actividade de um produto de IL-2 pode ser medida contra este padrão internacional num ensaio de potência in vitro medindo a proliferação de células HT-2. Assim, por exemplo, a IL-2 Proleukin® possui uma actividade biológica de cerca de 16,36 MIU por mg deste produto de IL-2, tal como medido através de um ensaio de proliferação de células HT-2 (ver, por exemplo, Gearing e Thorpe (1988) J. Immunological Methods 114:3-9; Nakanishi et al. (1984) J. Exp. Med. 160(6):1605-1621). A molécula activa usada neste produto é a muteina de IL-2 humana recombinante aldesleucina (referida como interleucina humana des-alanil-1, serina-125; ver Patente dos EUA n° 4.931.543). Usando esta informação, poderá calcular-se a dose terapeuticamente eficaz absoluta recomendada de IL-2 Proleukin® em microgramas. 96

Assim, quando a dose semanal total absoluta de IL-2 Proleukin® a ser administrada é de cerca de 18,0 MIU a cerca de 54,0 MIU, a correspondente dose semanal total absoluta de IL-2 Proleukin® em microgramas é de cerca de 1100 μg a cerca de 3300 μg deste produto. Similarmente, quando a dose semanal total absoluta em MIU é de cerca de 18,0 MIU a cerca de 30,0 MIU, a correspondente dose semanal total absoluta de IL-2 Proleukin® em μρ é de cerca de 1100 μρ a cerca de 1834 μρ. Quando a dose semanal total absoluta de IL-2 Proleukin® em MIU é de cerca de 30,0 MIU a cerca de 42, 0 MIU, a correspondente dose semanal total absoluta de IL -2 Proleukin® em μυ é de cerca de 1833 μρ a cerca de 2567 μυ . Assim, dada uma dose semanal total absoluta de IL-2 Proleukin® expressa em MIU, um perito na técnica poderá facilmente calcular a correspondente dose total absoluta expressa em μρ deste produto de IL-2 em particular. Cálculo das doses de IL-2 para diferentes formulações de aldesleucina. Para fins de descrição desta invenção, as doses de IL-2 foram apresentadas usando IL-2 Proleukin® como o padrão de referência de IL-2. Um perito na técnica poderá facilmente determinar quais serão as doses correspondentes para diferentes formulações e vias de administração de aldesleucina usando um factor de conversão baseado em dados farmacocinéticos (FC) comparativos e na curva de concentração sérica-tempo (AUC) produzida com os dados FC recolhidos durante um período de 24 horas para a IL-2 Proleukin®. Usando os dados FC, foi determinada a exposição a IL-2 em indivíduos humanos aos quais foi administrada uma dose única do padrão de referência da IL-2. Foram seleccionados indivíduos que não tinham previamente recebido uma terapêutica exógena com IL-2 97 (i.e., indivíduos que eram "naive" relativamente à terapêutica com IL-2). Por "terapêutica exógena com IL-2" pretende-se indicar qualquer intervenção por meio da qual um indivíduo é exposto a uma fonte exógena de IL-2, por oposição à exposição que resulta da produção por parte do organismo da IL-2 de ocorrência natural. Alguns destes indivíduos receberam uma dose única de 4,5 MIU do padrão de referência de IL-2, enquanto que outros receberam uma dose única de 7,5 ou de 18,0 MIU do padrão de referência de IL-2.

Após a administração da dose única do padrão de referência de IL-2, a exposição a IL-2 no soro foi monitorizada ao longo das primeiras 10 a 12 horas após a injecção, sendo então extrapolada para 24 horas, e foi calculada a área sob a curva de concentração sérica-tempo (AUC) resultante para os dados recolhidos durante aquele período de 24 horas. Esta área sob a curva de concentração sérica-tempo é aqui referida como AUC0-24 · Os métodos para medição da exposição à IL-2 por esta via são bem conhecidos neste campo técnico. Ver, por exemplo, Gustavson (1998) J. Biol. Response Modifiers 1998:440-449/ Thompson et al. (1987) Câncer Research 47:4202-4207/ Kirchner et al. (1998) Br. J. Clin. Pharmacol. 46:5-10/ Piscitelli et al. (1996) Pharmacotherapy 16(5):754-759/ e o Exemplo 8 abaixo. Assim, para os indivíduos que receberam uma dose de 4,5 MIU (275 μρ) de IL-2 Proleukin®, o valor de AUC0-24 foi de 51 IU*h/ml (SD = 14) / para os indivíduos que receberam uma dose de 7,5 MIU (458 μρ) de IL-2 Proleukin®, o valor de AUC0-24 foi de 79 IU*h/ml (SD = 29)/ e para os indivíduos que receberam a dose de 18,5 MIU (1100 μρ) de IL-2 Proleukin®, o valor de AUC0-24 foi de 344 IU*h/ml (SD = 127) . Quando os dados de AUC0-24 são determinados para o padrão de referência de IL-2, IL-2 Proleukin®, as doses terapeuticamente eficazes aqui descritas resultam numa exposição a IL-2 num intervalo de 98 cerca de 23 IU*hr/ml de soro a cerca de 598 IU*hr/ml de soro (ver o Exemplo 8 abaixo). A soma das AUC0-24 individuais resultantes das doses individuais corresponde à AUC0-24 semanal total das doses individuais repartidas. Por exemplo, para uma dose de 18 MIU que é administrada três vezes por semana, a AUC0-24 individual é estimada como 344 IU*hr/ml, e a AUC0-24 semanal total será de 1032 IU*hr/ml, com base na premissa de incremento linear da AUCo-24 com a dose, tal como mostra a Tabela 1 abaixo.

Tabela 1: valores de AUCo-24 obtidos após administração de IL-2

Proleukin®

Dose de IL-2 Proleukin® AUCo-24 (IU*hr/ml) (MIU/μς) 18/1100 344 30/1834 574 42/2567 803 54/3300 1032 A mesma AUCo-24 semanal total de 1032 IU*hr/ml poderá ainda ser obtida com uma dose de 27 MIU administrada duas vezes por semana ou com uma dose de cerca de 11 MIU administrada cinco vezes por semana.

Para qualquer outra formulação de aldesleucina, uma dose recomendada comparável para uso com os métodos aqui descritos pode ser determinada com base nestes dados de AUCo-24 para IL-2 Proleukin®. Deste modo, uma dose única da formulação de aldesleucina de interesse é administrada a um indivíduo humano, e a concentração de IL-2 no soro após esta exposição inicial a IL-2 é determinada através da recolha de dados FC e da criação de uma AUCo-24 para a formulação de aldesleucina de 99 interesse. Por "exposição inicial a IL-2" pretende-se indicar que o indivíduo usado para a medição da exposição a IL-2 não foi anteriormente submetido a terapêutica com uma fonte exógena de IL-2, tal como acima referido. Esta AUC0-24 é então comparada com a AUC0-24 de IL-2 Proleukin® para determinar um factor de conversão que poderá ser usado para calcular uma dose da formulação de aldesleucina de interesse que é comparável à dose recomendada para IL-2 Proleukin®. Ver, por exemplo, os cálculos para uma formulação de IL-2 monomérica representativa, L2-7001, que são apresentados no Exemplo 8 abaixo. Assim, para qualquer outra formulação de aldesleucina usada com os métodos aqui apresentados, a dose semanal total de IL-2 a ser administrada durante um regime de dosagem constante de IL-2, ou durante um regime de dosagem de dois níveis de IL-2, será equivalente à dose semanal total recomendada do padrão de referência de IL-2, i.e., IL-2 Proleukin®, tal como determinado pela área sob a curva de concentração sérica-tempo construída a partir de dados FC no homem. Cálculo das doses de IL-2 para diferentes moléculas de IL-2. As variantes biologicamente activas de IL-2 poderão possuir uma actividade biológica intrínseca alterada. Para estimar a dose de uma variante de IL-2 diferente da aldesleucina ou a dose de IL-2 de sequência nativa que será comparável às doses de aldesleucina aqui expostas, a actividade biológica relativa da variante de IL-2 ou da IL-2 de sequência nativa deve ser determinada através do teste do seu efeito biológico. A actividade biológica relevante de uma IL-2 ou de uma sua sua variante de acordo com a presente invenção consiste na capacidade de activar e/ou conseguir a expansão de células NK humanas para a mediação da actividade killer activada por 100 linfocinas (LAK) e da citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Tal actividade é medida usando um ensaio padronizado tal como o descrito em Nagler et al. (1989) J. Immunol. 143:3183-3191. Para determinar as doses adequadas de variantes de IL-2 diferentes da aldesleucina ou as doses adequadas de IL-2 de sequência nativa, é administrada uma série de doses da molécula de IL-2 de interesse (i.e., uma variante de IL-2 diferente da aldesleucina ou da IL-2 de sequência nativa) a individuos humanos pela mesma via de administração, e um isolado fresco de CMSP (células mononucleares do sanque periférico) obtido a partir dos individuos é testado quanto à citotoxicidade NK contra células K562 tal como descrito, por exemplo, por Naqler et al. (1989), supra. A actividade estimuladora das NK da molécula de IL-2 em teste é comparada com a do padrão de referência de IL-2 (i.e., aldesleucina tal como formulada em Proleukin®) quando administrado na mesma quantidade de μg pela mesma via de administração e usando o mesmo procedimento descrito para a molécula de IL-2 em teste. Alternativamente, as doses adequadas poderão ser determinadas in vitro, usando CMSP humanas não tratadas, submetidas a uma série de doses da molécula de IL-2 de interesse. A molécula de IL-2 de interesse (i.e., uma variante de IL-2 diferente da aldesleucina ou da IL-2 de sequência nativa) terá uma potência estimuladora das células NK (i.e., uma actividade) correspondente a, de preferência, pelo menos 100% da evidenciada pela mesma quantidade do padrão de referência de IL-2 (i.e., aldesleucina tal como formulada em Proleukin®), ou a 95%, 90%, 80%, 70% ou 60% da evidenciada pela mesma quantidade do padrão de referência de IL-2. A variante de IL-2 deverá substancialmente ser biologicamente activa, ou seja, possuir pelo menos 50% da actividade estimuladora das NK que é evidenciada pela mesma 101 dose do padrão de referência de IL-2, administrada pela mesma via.

Assim, para a administração a um indivíduo de uma terapêutica de combinação com anticorpo antagonista anti-CD40 e um regime de dosagem constante de IL-2, a dose semanal total de qualquer IL-2 ou de uma sua variante biologicamente activa corresponde a uma quantidade equivalente à de uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 (i.e., aldesleucina tal como formulada em Proleukin®) no intervalo de cerca de 1100 μρ (i.e., cerca de 18,0 MIU) a cerca de 3300 μρ (i.e., cerca de 54,0 MIU), preferencialmente no intervalo de cerca de 1100 μg a cerca de 2567 μρ (i.e., cerca de 42,0 MIU), sendo que a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 50% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada pela dose semanal total do padrão de referência de IL-2 (i.e., aldesleucina tal como formulada em Proleukin®) .

Em algumas formas de realização, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a administrar no regime de dosagem constante de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 60% da actividade estimuladora de NK de uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 administrado no intervalo de cerca de 1100 μρ a cerca de 3300 μρ, por exemplo, pelo menos 60% da actividade estimuladora das NK de uma dose semanal total do padrão de referência de IL- 2 correspondente a cerca de 1100 μυ (18,0 MIU) , 1222 μυ (20,0 MIU) , 1345 μυ (22,0 MIU) , 1467 μυ (24,0 MIU) , 1589 μυ (26, 0 MIU) , 1711 μυ (28,0 MIU) , 1834 μυ (30,0 MIU) , 1956 μυ (32,0 MIU) , 2078 μυ (34,0 MIU) , 2200 μυ (36, 0 MIU) , 2323 μυ (38,0 MIU) , 2445 μυ (40,0 MIU) , 2567 μυ (42,0 MIU) , 2689 μυ (44,0 MIU) , 2812 μυ (46,0 MIU) , 2934 μυ 102 (48,0 MIU) , 3056 μg (50,0 MIU) , 3178 μg (52,0 MIU) ou 3300 μg (54,0 MIU) . Em outras formas de realização, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a ser administrada no regime de dosagem constante de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 70% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1100 μρ a cerca de 3300 μρ, por exemplo, pelo menos 7 0% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1100 μg (18, 0 MIU) , 1222 μg (20, 0 MIU), 1345 μg (22,0 MIU), 1467 μρ (24,0 MIU) , 1589 μυ (26, 0 MIU) , 1711 μυ (28,0 MIU), 1834 μυ (30,0 MIU) , 1956 μυ (32,0 MIU) , 2078 μυ (34,0 MIU) , 2200 μυ (36, 0 MIU) , 2323 μυ (38,0 MIU) , 2445 μυ (40,0 MIU) , 2567 μυ (42,0 MIU) , 2689 μυ (44,0 MIU) , 2812 μυ (46,0 MIU) , 2934 μυ (48,0 MIU) , 3056 μυ (50,0 MIU) , 3178 μυ (52,0 MIU) ou 3300 μg (54,0 MIU).

Em algumas formas de realização, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a ser administrada no regime de dosagem constante de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 80% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1100 μρ a cerca de 3300 μρ, por exemplo, pelo menos 80% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1100 μρ (18, 0 MIU) , 1222 μρ (20, 0 MIU), 1345 μυ (22,0 MIU) , 1467 μυ (24,0 MIU) , 1589 μυ (26, 0 MIU) , 1711 μυ (28,0 MIU) , 1834 μυ (30,0 MIU) , 1956 μυ (32,0 MIU) , 2078 μυ (34,0 MIU) , 2200 μυ (36, 0 MIU) , 2323 μυ (38,0 MIU) , 2445 μυ (40,0 MIU) , 2567 μυ (42,0 MIU) , 2689 μυ (44,0 MIU) , 2812 μυ (46,0 103 MIU) , 2934 μς (48,0 MIU) , 3056 μg (50,0 MIU) , 3178 μg (52,0 MIU) ou 3300 μg (54,0 MIU) . Em formas de realização alternativas, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a ser administrada no regime de dosagem constante de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 90% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1100 μρ a cerca de 3300 μρ, por exemplo, pelo menos 90% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL -2 de cerca de 1100 μρ (18,0 MIU) , 1222 μρ (20,0 MIU) , 1345 μρ (22,0 MIU) , 1467 μρ (24,0 MIU) , 1589 μρ (26, 0 MIU) , 1711 μρ (28,0 MIU) , 1834 μρ (30,0 MIU) , 1956 μρ (32,0 MIU) , 2078 μρ (34,0 MIU) , 2200 μρ (36, 0 MIU) , 2323 μρ (38,0 MIU) , 2445 μρ (40,0 MIU) , 2567 μρ (42,0 MIU) , 2689 μρ (44,0 MIU) , 2812 μρ (46,0 MIU) , 2934 μρ (48,0 MIU) , 3056 μq (50,0 MIU), 3178 μς (52,0 MIU) ou 3300 μρ (54,0 MIU).

Ainda em outras formas de realização, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a ser administrada no regime de dosagem constante de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 95% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1100 μρ a cerca de 3300 μρ, por exemplo, pelo menos 95% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1100 μρ (18, 0 MIU) , 1222 μρ (20, 0 MIU), 1345 μρ (22,0 MIU) , 1467 μρ (24,0 MIU) , 1589 μρ (26, 0 MIU) , 1711 μρ (28,0 MIU) , 1834 μρ (30,0 MIU) , 1956 μρ (32,0 MIU) , 2078 μρ (34,0 MIU) , 2200 μρ (36, 0 MIU) , 2323 μρ (38,0 MIU) , 2445 μρ (40,0 MIU) , 2567 μρ (42,0 MIU) , 2689 μρ (44,0 MIU) , 2812 μρ (46,0 104 MIU) , 2934 μg (48,0 MIU) , 3056 μg (50,0 MIU) , 3178 μg (52,0 MIU) ou 3300 μg (54,0 MIU).

Em algumas formas de realização, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a ser administrada no regime de dosagem constante de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 100% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1100 μρ a cerca de 3300 μqr por exemplo, pelo menos 100% da actividade estimuladora das ΝΚ que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL -2 de cerca de 1100 μq (18,0 MIU) , 1222 μρ (20,0 MIU) , 1345 μρ (22,0 MIU) , 1467 μρ (24,0 MIU) , 1589 μρ (26, 0 MIU) , 1711 μρ (28,0 MIU) , 1834 μρ (30,0 MIU) , 1956 μρ (32,0 MIU) , 2078 μρ (34,0 MIU) , 2200 μρ (36, 0 MIU) , 2323 μρ (38,0 MIU) , 2445 μρ (40,0 MIU) , 2567 μρ (42,0 MIU) , 2689 μρ (44,0 MIU) , 2812 μρ (46, 0 MIU) , 2934 μρ (48,0 MIU) , 3056 μρ (50,0 MIU) , 3178 μρ (52,0 MIU) ou 3300 μρ (54,0 : MIU) .

Similarmente, para a administração a um indivíduo de uma terapêutica de combinação com anticorpo antagonista anti-CD40 e um regime de dosagem de dois níveis de IL-2, a dose semanal total de qualquer IL-2 ou de uma sua variante biologicamente activa a ser administrada durante o primeiro período ou durante o segundo período do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 pode ser expressa como uma quantidade equivalente à de uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 que é administrada durante o regime de dosagem de dois níveis de IL-2. Assim, a dose semanal total de qualquer IL-2 ou de uma variante biologicamente activa a ser administrada durante o primeiro período do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 corresponde a uma quantidade equivalente a uma dose semanal 105 total do padrão de referência de IL-2 (i.e., aldesleucina tal como formulada em Proleukin®) no intervalo de cerca de 1834 μρ (i.e., 30,0 MIU) a cerca de 3300 μρ (i.e., cerca de 54,0 MIU), sendo que a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biolopicamente activa corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 50% da actividade estimuladora das NK relativamente à dose semanal total do padrão de referência de IL-2 (i.e., aldesleucina tal como formulada em Proleukin®). De modo similar, a dose semanal total de qualquer IL-2 ou de uma sua variante biolopicamente activa a ser administrada durante o sepundo período do repime de dosapem de dois níveis de IL-2 corresponde a uma quantidade equivalente a uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 (i.e., aldesleucina tal como formulada em Proleukin®) no intervalo de cerca de 1100 μρ (i.e., 18,0 MIU) a cerca de 2384 μρ (i.e., cerca de 39,0 MIU), sendo que a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biolopicamente activa corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 50% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada pela dose semanal total do padrão de referência de IL-2 (i.e., aldesleucina tal como formulada em Proleukin®) . Tal como anteriormente se referiu, a dose semanal total administrada durante o primeiro período do repime de dosapem de dois níveis de IL-2, por exemplo, durante a primeira metade deste repime de dosapem, é sempre mais elevada do que a dose semanal total que é administrada durante o sepundo período do repime de dosapem de dois níveis de IL-2, por exemplo, durante a sepunda metade deste repime de dosapem.

Assim, em alpumas formas de realização, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biolopicamente activa a administrar no primeiro período do repime de dosapem de dois níveis de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 60% da actividade estimuladora de NK que é 106 proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1834 μρ (i.e., cerca de 30,0 MIU) a cerca de 3300 μρ (i.e., cerca de 54,0 MIU) , por exemplo, pelo menos 60% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1834 μρ (30,0 MIU), 1956 μρ (32,0 MIU), 2078 μρ (34,0 MIU), 2200 μρ (36,0 MIU), 2323 μρ (38,0 MIU), 2445 μρ (40,0 MIU), 2567 μρ (42,0 MIU), 2689 μρ (44,0 MIU), 2812 μρ (46,0 MIU), 2934 μρ (48,0 MIU), 3056 μρ (50,0 MIU), 3178 μρ (52,0 MIU) ou 3300 μρ (54,0 MIU). Para estas formas de realização, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biolopicamente activa a administrar no sepundo periodo do repime de dosapem de dois níveis de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 60% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1100 μρ (i.e., cerca de 18,0 MIU) a cerca de 2384 μρ (i.e., cerca de 39,0 MIU), por exemplo, pelo menos 60% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1100 μρ (18,0 MIU), 1222 μρ (20,0 MIU), 1406 μρ (23,0 MIU), 1528 μρ (25,0 MIU), 1650 μρ (27,0 MIU), 2834 μρ (30,0 MIU), 1956 μρ (32,0 MIU), 2139 μρ (35,0 MIU), 2262 μρ (37,0 MIU) ou 2384 μρ (39,0 MIU). Alternativamente, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biolopicamente activa a administrar no sepundo periodo do repime de dosapem de dois níveis de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou até 100% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1100 μρ (i.e., cerca de 18,0 MIU) a cerca de 2384 μρ 107 (i.e., cerca de 39,0 MIU) , por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou até 100% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1100 μρ (18,0 MIU) , 1222 μυ (20, 0 MIU) , 1406 μρ (23,0 MIU) , 1528 μυ (25, 0 MIU) , 1650 μυ (27, 0 MIU) , 2834 μρ (30,0 MIU) , 1956 μυ (32,0 MIU) , 2139 μυ (35, 0 MIU) , 2262 μρ (37,0 MIU) ou 2384 μg (39,0 MIU).

Em outras formas de realização, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a administrar no primeiro período do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 70% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1834 μg (i.e., cerca de 30,0 MIU) a cerca de 3300 μg (i.e., cerca de 54,0 MIU), por exemplo, pelo menos 70% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1834 μυ (30,0 MIU) , 1956 μυ (32,0 MIU), 2078 μυ (34,0 MIU) , 2200 μq (36, 0 MIU) , 2323 μq (38,0 MIU), 2445 μυ (40,0 MIU) , 2567 μυ (42,0 MIU) , 2689 μυ (44,0 MIU), 2812 μυ (46,0 MIU) , 2934 μυ (48,0 MIU) , 3056 μυ (50,0 MIU), 3178 μρ (52,0 MIU) ou 3300 μυ (54,0 MIU) . Para estas formas de realização, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a administrar no segundo período do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 60% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1100 μρ (i.e., cerca de 18,0 MIU) a cerca de 2384 μρ (i.e., cerca de 39,0 MIU) , por exemplo, pelo menos 60% da actividade estimuladora 108 das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1100 μυ (18,0 MIU) , 1222 μυ (20,0 MIU), 1406 μg (23, 0 MIU), 1528 μυ (25,0 MIU) , 1650 μυ (27,0 MIU), 2834 μρ (30, 0 MIU), 1956 μυ (32,0 MIU) , 2139 μq (35,0 MIU), 2262 μρ (37,0 MIU) ou 2384 μq (39,0 MIU) .

Alternativamente, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a administrar no segundo periodo do regime de dosagem de dois niveis de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou até 100% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1100 μρ (i.e., cerca de 18,0 MIU) a cerca de 2384 μρ (i.e., cerca de 39,0 MIU), por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou até 100% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de μυ (18,0 MIU) , 1222 μυ (20,0 MIU) , 1406 μυ (23,0 MIU) μυ (25, 0 MIU) , 1650 μυ (27,0 MIU) , 2834 μυ (30,0 MIU) 1956 μg (32,0 MIU), 2139 μq (35,0 MIU), 2262 μρ (37,0 MIU) ou 2384 μρ (39,0 MIU).

Ainda em outras formas de realização, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a administrar no primeiro período do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 80% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1834 μρ (i.e., cerca de 30,0 MIU) a cerca de 3300 μρ (i.e., cerca de 54,0 MIU), por exemplo, pelo menos 80% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de 109 cerca de 1834 μg (30,0 MIU), 1956 μg (32,0 MIU), 2078 μg (34,0 MIU) , 2200 μg (36,0 MIU), 2323 μg (38,0 MIU), 2445 μg (40,0 MIU), 2567 μg (42,0 MIU), 2689 μg (44,0 MIU), 2812 μg (46,0 MIU), 2934 μg (48,0 MIU), 3056 μg (50,0 MIU), 3178 μg (52,0 MIU) ou 3300 μυ (54,0 MIU). Para estas formas de realização, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a administrar no segundo periodo do regime de dosagem de dois niveis de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 60% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1100 μg (i.e., cerca de 18,0 MIU) a cerca de 2384 μρ (i.e., cerca de 39,0 MIU) , por exemplo, pelo menos 60% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1100 μρ (18,0 MIU), 1222 μρ (20,0 MIU), 1406 μρ (23,0 MIU), 1528 μρ (25,0 MIU), 1650 μg (27,0 MIU), 2834 μρ (30,0 MIU), 1956 μρ (32,0 MIU), 2139 μρ (35,0 MIU), 2262 μρ (37,0 MIU) ou 2384 μρ (39,0 MIU). Alternativamente, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a administrar no segundo periodo do regime de dosagem de dois niveis de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou até 100% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1100 μρ (i.e., cerca de 18,0 MIU) a cerca de 2384 μρ (i.e., cerca de 39,0 MIU), por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou até 100% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1100 μρ (18,0 MIU), 1222 μρ (20,0 MIU), 1406 μρ (23,0 MIU), 110 1528 μς (25,0 MIU) , 1650 μg (27,0 MIU) , 2834 μς (30,0 MIU) , 1956 μς (32,0 MIU) , 2139 μg (35,0 MIU) , 2262 μg (37,0 MIU) ou 2384 μg (39,0 MIU).

Em formas de realização alternativas, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a administrar no primeiro periodo do regime de dosagem de dois niveis de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 90% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1834 μρ (i.e., cerca de 30,0 MIU) a cerca de 3300 μρ (i.e., cerca de 54,0 MIU), por exemplo, pelo menos 90% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1834 μρ (30,0 MIU), 1956 \iq (32,0 MIU), 2078 μρ (34,0 MIU), 2200 μρ (36,0 MIU), 2323 μρ (38,0 MIU), 2445 μρ (40,0 MIU), 2567 μρ (42,0 MIU), 2689 μρ (44,0 MIU), 2812 μρ (46,0 MIU), 2934 μρ (48,0 MIU), 3056 μρ (50,0 MIU), 3178 μρ (52,0 MIU) ou 3300 μρ (54,0 MIU) . Para estas formas de realização, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a administrar no segundo periodo do regime de dosagem de dois niveis de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 60% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1100 μρ (i.e., cerca de 18,0 MIU) a cerca de 2384 μρ (i.e., cerca de 39,0 MIU) , por exemplo, pelo menos 60% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1100 μρ (18,0 MIU), 1222 μρ (20,0 MIU), 1406 μρ (23,0 MIU), 1528 μρ (25,0 MIU), 1650 μρ (27,0 MIU), 2834 μρ (30,0 MIU), 1956 μρ (32,0 MIU), 2139 μρ (35,0 MIU), 2262 μρ (37,0 MIU) ou 2384 μρ (39,0 MIU). 111

Alternativamente, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a administrar no segundo período do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 corresponde a uma guantidade que proporciona pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou até 100% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1100 μg (i.e., cerca de 18,0 MIU) a cerca de 2384 μg (i.e., cerca de 39,0 MIU), por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou até 100% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1100 μρ (18,0 MIU) , 1222 μρ (20,0 MIU) , 1406 μρ (23,0 MIU) 1528 μρ (25, 0 MIU) , 1650 μρ (27,0 MIU) , 2834 μρ (30,0 MIU) 1956 μρ (32,0 MIU), 2139 μρ (35,0 MIU), 2262 μρ (37,0 MIU) ou 2384 μρ (39,0 MIU).

Ainda em outras formas de realização, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a administrar no primeiro período do regime de dosagem de dois níveis de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 95% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1834 μρ (i.e., cerca de 30,0 MIU) a cerca de 3300 μρ (i.e., cerca de 54,0 MIU), por exemplo, pelo menos 95% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1834 μρ (30,0 MIU) , 1956 μρ (32, 0 MIU), 2078 μρ (34,0 MIU) , 2200 μρ (36,0 MIU), 2323 μρ (38,0 MIU) , 2445 μρ (40,0 MIU) , 2567 μρ (42,0 MIU), 2689 μρ (44,0 MIU) , 2812 μρ (46, 0 MIU) , 2934 μρ (48,0 MIU), 3056 μρ (50,0 MIU) , 3178 μρ (52,0 MIU) ou 3300 μρ (54,0 MIU) . Para estas formas de realização, a 112 dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a administrar no segundo periodo do regime de dosagem de dois niveis de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 60% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1100 μρ (i.e., cerca de 18,0 MIU) a cerca de 2384 μρ (i.e., cerca de 39,0 MIU) , por exemplo, pelo menos 60% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1100 μρ (18,0 MIU), 1222 μρ (20,0 MIU), 1406 μρ (23,0 MIU), 1528 μρ (25,0 MIU), 1650 μρ (27,0 MIU), 2834 μρ (30,0 MIU), 1956 μρ (32,0 MIU), 2139 μρ (35,0 MIU), 2262 μρ (37,0 MIU) ou 2384 μρ (39,0 MIU). Alternativamente, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a administrar no segundo periodo do regime de dosagem de dois niveis de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou até 100% da actividade estimuladora de NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1100 μρ (i.e., cerca de 18,0 MIU) a cerca de 2384 μρ (i.e., cerca de 39,0 MIU), por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou até 100% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1100 μυ (18,0 MIU) , 1222 μυ (20,0 MIU) , 1406 μυ (23,0 MIU) , 1528 μυ (25, 0 MIU) , 1650 μυ (27,0 MIU) , 2834 μυ (30,0 MIU) , 1956 μρ (32,0 MIU), 2139 μρ (35,0 MIU), 2262 μρ (37,0 MIU) ou 2384 μρ (39,0 MIU).

Em algumas formas de realização, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a administrar no 113 primeiro periodo do regime de dosagem de dois niveis de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona 100% da actividade estimuladora de NK total que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1834 μρ (i.e., cerca de 30,0 MIU) a cerca de 3300 μρ (i.e., cerca de 54,0 MIU), por exemplo, 100% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1834 μς (30,0 MIU), 1956 μg (32,0 MIU), 2078 μρ (34,0 MIU), 2200 μρ (36,0 MIU), 2323 μρ (38,0 MIU), 2445 μρ (40,0 MIU), 2567 μρ (42,0 MIU), 2689 μρ (44,0 MIU), 2812 μρ (46,0 MIU), 2934 μρ (48,0 MIU), 3056 μρ (50,0 MIU), 3178 μρ (52,0 MIU) ou 3300 μρ (54,0 MIU). Para estas formas de realização, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a administrar no segundo periodo do regime de dosagem de dois niveis de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 60% da actividade estimuladora de NK total que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1100 μυ (i .e., cerca de 18,0 MIU) a cerca de 2384 μρ (i.e., cerca de 39, 0 MIU) , por exemplo, pelo menos 60% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1100 μυ (18,0 MIU) , 1222 μυ (20,0 MIU), 1406 μυ (23, 0 MIU), 1528 μυ (25,0 MIU) , 1650 μυ (27,0 MIU), 2834 μυ (30, 0 MIU), 1956 μυ (32,0 MIU) , 2139 μυ (35,0 MIU), 2262 μυ (37,0 MIU) ou 2384 μυ (39,0 MIU) .

Alternativamente, a dose semanal total de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa a administrar no segundo periodo do regime de dosagem de dois niveis de IL-2 corresponde a uma quantidade que proporciona pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou até 100% da 114 actividade estimuladora de NK total que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1100 μρ (i.e., cerca de 18,0 MIU) a cerca de 2384 μρ (i.e., cerca de 39,0 MIU), por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou até 100% da actividade estimuladora das NK que é proporcionada por uma dose semanal total do padrão de referência de IL-2 de cerca de 1100 μς (18,0 MIU), 1222 μς (20,0 MIU), 1406 μς (23,0 MIU), 1528 μρ (25,0 MIU), 1650 μς (27,0 MIU), 2834 μς (30,0 MIU), 1956 μρ (32,0 MIU), 2139 μς (35,0 MIU), 2262 μς (37,0 MIU) ou 2384 μρ (39,0 MIU).

Oncoterapia Adicional para Uso com a Terapêutica de Combinação de IL-2/Anti-CD40

Os peritos na técnica reconhecerão que os métodos de terapêutica de combinação aqui apresentados poderão ser usados antes, depois ou concorrentemente com outras formas de oncoterapia. Tais oncoterapias poderão incluir regimes de quimioterapia como o tratamento com CVP (ciclofosfamida, vincristina e prednisona) , CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisona), ICE (ifosfamida, carboplatina e etoposido), mitozantrona, citarabina, DVP (daunorubicina, prednisona e vincristina), ATRA (ácido all-trans-retinóico), idarubicina, regime de quimioterapia Hoelzer, regime de quimioterapia La La, ABVD (adriamicina, bleomicina, vinblastina e dacarbazina) , CEOP (ciclofosfamida, epirubicina, vincristina e prednisona), CEOP-BE (ciclofosfamida, epirubicina, vincristina, prednisona, bleomicina e etoposido), 2-CdA (2-clorodesoxiadenosina (2-CDA), FLAG e IDA (fludarabina, citarabina e idarubicina; com ou sem tratamento subsequente com GCSF), VAD (vincristina, doxorubicina e dexametasona), M e P (melfalan e prednisona), C-Semanal 115 (ciclofosfamida e prednisona), ABCM (adriamicina (doxorubicina), BCNU, ciclofosfamida e melfalan), MOPP (mostarda de azoto, oncovina, procarbazina e prednisona), DHAP (dexametasona, ara-C em dose elevada e platinol), fludarabina e ciclofosfamida. Alternativamente, tais oncoterapias poderão incluir cirurgia ou procedimentos cirúrgicos, tratamento com radiações, incluindo terapias mieloablativas, ou outras terapias antitumorais com anticorpos monoclonais. Assim, os métodos aqui apresentados encontram utilidade como tratamento concorrente na destruição das células tumorais residuais, tanto in vivo como ex vivo após tais oncoterapias.

Deste modo, a terapêutica de combinação com IL-2 (ou uma sua variante biologicamente activa) e os anticorpos antagonistas anti-CD40 aqui descritos, ou os seus fragmentos de ligação ao antigénio, pode ser usada em combinação com pelo menos uma outra terapia anti-tumoral, incluindo, de modo não limitativo, cirurgia ou outros procedimentos cirúrgicos (p.ex. esplenectomia, hepatectomia, linfadenectomia, leucoferese, transplante de medula óssea e semelhantes); radioterapia; quimioterapia, opcionalmente em combinação com o transplante autólogo de medula, sendo que os agentes quimioterápicos adequados incluem, de modo não limitativo, fludarabina ou fosfato de fludarabina, clorambucil, vincristina, pentostatina, 2-clorodesoxiadenosina (cladribina) , ciclofosfamida, doxorubicina, prednisona e combinações destes, por exemplo, regimes contendo antraciclinas como CAP (ciclofosfamida, doxorubicina com prednisona), CHOP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona com doxorubicina), VAD (vincristina, doxorubicina com dexametasona), MP (melfalan com prednisona), e outros agentes citotóxicos e/ou terapêuticos usados em quimioterapia, tais como mitoxantrona, daunorubicina, idarubicina, asparaginase e antimetabolitos, incluindo, de modo não limitativo, citarabina, metotrexato, 5- 116 fluorouracilo, dacarbazina, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina e nelarabina; outras terapêuticas anti-neoplásicas com anticorpos monoclonais (por exemplo, alemtuzumab (Campath®) ou outro anticorpo anti-CD52 que se dirija contra a glicoproteina de superfície celular CD52 expressa em células B malignas; rituximab (Rituxan®), o anticorpo inteiramente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/tositumomab 1-131 (Bexxar®), ibritumomab tiuxetan (Zevalin®) , ou outro anticorpo terapêutico anti-CD20 que se direccione contra o antigénio CD20 das células B malignas; anticorpo anti-CD19 (por exemplo, MT103, um anticorpo biespecifico); anticorpo anti-CD22 (por exemplo, o anticorpo monoclonal humanizado epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) ou outro anticorpo antineoplásico que se dirija contra o factor de crescimento do endotélio vascular humano; anticorpo anti-CD22, dirigido contra o antigénio CD22 nas células B malignas (por exemplo, o anticorpo monoclonal BL-22, uma toxina alfa-CD22); o anticorpo α-Μ-CSF, dirigido contra o factor estimulador de colónias de macrófagos; anticorpos dirigidos contra o activador do receptor do factor nuclear-kappaB (RANK) e o seu ligando (RANKL), os quais são sobreexpressos no mieloma múltiplo; anticorpo anti-CD23 dirigido contra o antigénio CD23 nas células B malignas (por exemplo, IDEC-152); anticorpo anti-CD80 dirigido contra o antigénio CD80 (por exemplo, IDEC-114) ; 0 anticorpo anti-CD38 dirigido contra o antigénio CD38 nas células B malignas; anticorpos dirigidos contra receptores de classe II do complexo major de histocompatibilidade (anticorpos anti-MHC) expressos em células B malignas; outros anticorpos anti-CD40 (por exemplo, SGN-40) dirigidos contra o antigénio CD40 nas células B malignas; e anticorpos dirigidos contra o receptor 1 do ligando indutor de apoptose relacionado com o factor de necrose tumoral (TRAIL-R1) (por exemplo, o anticorpo 117 monoclonal agonista humano HGS-ETR1) e TRAIL-R2, expressos por diversos tumores sólidos e tumores de origem hematopoiética; terapêutica antitumoral baseada em moléculas pequenas, incluindo, de modo não limitativo, inibidores dos microtúbulos e/ou da topoisomerase (por exemplo, o inibidor mitótico dolastatina e os análogos da dolastatina; o agente de ligação à tubulina T900607; XL119; e o inibidor da topoisomerase aminocamptotecina), SDX-105 (cloridrato de bendamustina), ixabepilona (um análogo da epotilona, também conhecido como BMS-247550), inibidores da proteína quinase C, por exemplo, midostaurina (PKC-412, CGP 41251, N-benzoilstaurosporina), pixantrona, eloxatina (um agente antineoplásico), ganite (nitrato de gálio), Thalomid® (talidomida), derivados imunomoduladores da talidomida (por exemplo, revlimid (anteriormente revimid), Affinitak™ (inibidor anti-senso da proteína quinase C-alfa), SDX-101 (R-etodolac, que induz a apoptose dos linfócitos malignos) , análogos de segunda geração do nucleósido purina tais como clofarabina, inibidores da produção da proteína Bcl-2 pelas células neoplásicas (por exemplo, os agentes anti-senso oblimersen e Genasense®) , inibidores dos proteossomas (por exemplo, Velcade™ (bortezomib)), inibidores de pequena molécula da quinase (por exemplo, CHIR-258), inibidores de pequena molécula do VEGF (por exemplo, ZD-6474), inibidores de pequena molécula da proteína de choque térmico (HSP) 90 (por exemplo, 17-AAG), inibidores de pequena molécula das histona desacetilases (por exemplo, agentes de citodiferenciação híbrida/polar (HPC) tais como o ácido suberanilohidroxâmico (SAHA), e FR—901228) e agentes apoptóticos tais como o Trisenox® (trióxido de arsénio) e Xcytrin® (motexafin-gadolínio); terapêuticas antineoplásicas baseadas em vacinas/imunoterapias, incluindo, de modo não limitativo, abordagens de vacinação (por exemplo, Id-KLH, oncofagos, vitaletina), imunoterapia personalizada ou 118 imunoterapia de idiotipos activos (por exemplo, a Imunoterapia Personalizada MyVax®, formalmente designada por GTOP-99) , Promune® (CpG 7909, um agonista sintético para o receptor "toll-like" 9 (TLR9)), terapia com interferão alfa e terapia com IL-12; terapia com esteróides; ou outra terapia antineoplásica; sendo que a terapêutica antineoplásica adicional é administrada antes, durante ou após a terapêutica de combinação com IL-2/anticorpo antagonista anti-CD40. Assim, quando as terapias combinadas compreendem a terapêutica de combinação com IL-2/anticorpo antagonista anti-CD40 em combinação com a administração de outro agente terapêutico, tal como quimioterapia, radioterapia, outra terapia anti-tumoral com anticorpos, terapia anti-tumoral baseada em pequenas moléculas ou terapia anti-tumoral baseada em vacinas/imunoterapia, os métodos aqui apresentados abrangem a co-administração, usando formulações separadas ou uma formulação farmacêutica única, e/ou a administração consecutiva por qualquer ordem. Quando os métodos aqui expostos compreendem regimes terapêuticos combinados, estas terapias poderão ser administradas em simultâneo, i.e., a terapêutica de combinação com IL-2/anticorpo antagonista anti-CD40 é administrada concorrentemente ou dentro da mesma janela temporal que a outra terapêutica anti-tumoral (i.e., as terapêuticas são efectuadas concorrentemente, mas a terapêutica de combinação com IL-2/anticorpo antagonista anti-CD40 não é administrada precisamente ao mesmo tempo que a outra terapêutica anti-tumoral). Alternativamente, a terapêutica de combinação com IL-2/anticorpo antagonista anti-CD40 poderá também ser administrada antes ou depois da outra terapêutica antineoplásica. Independentemente de o indivíduo tratado ter respondido ou não ao primeiro curso de terapia, a administração sequencial das diferentes terapêuticas 119 antineoplásicas pode ser efectuada para reduzir a possibilidade de recidivas.

Assim, por exemplo, em algumas formas de realização, um indivíduo submetido à terapêutica de combinação com IL-2/anticorpo antagonista anti-CD40 aqui exposta recebe igualmente tratamento com FCR (fludarabina, ciclofosfamida e rituximab). Em outras formas de realização, um indivíduo submetido à terapêutica de combinação com IL-2/anticorpo antagonista anti-CD40 aqui exposta recebe igualmente tratamento com CHOP-R (CHOP com rituximab), ou CFAR (fludarabina, ciclofosfamida, rituximab e alemtuzumab). Em formas de realização alternativas, um indivíduo submetido à terapêutica de combinação com IL-2/anticorpo antagonista anti-CD40 aqui exposta recebe igualmente tratamento com FC (fludarabina, ciclofosfamida) e qualquer outro anticorpo anti-CD20 direccionado para o antigénio CD20 à superfície das células malignas, incluindo, de modo não limitativo, o anticorpo inteiramente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-105, AME-133, tositumomab/tositumomab 1-131 (Bexxar®) , e ibritumomab tiuxetan (Zevalin®) . Em ainda outras formas de realização, um indivíduo submetido à terapêutica de combinação com IL-2/anticorpo antagonista anti-CD40 aqui exposta recebe igualmente tratamento com CHOP e outro anticorpo anti-CD20 ou com CFA (fludarabina, ciclofosfamida e alemtuzumab) com outro anticorpo anti-CD20, sendo que o outro anticorpo anti-CD20 se direcciona contra o antigénio CD20 à superfície das células malignas, incluindo, de modo não limitativo, o anticorpo inteiramente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-105, AME-133, tositumomab/tositumomab 1-131 (Bexxar®), e ibritumomab tiuxetan (Zevalin®) . 120

Interleucina 2 e Suas Variantes Biologicamente Activas A IL-2 descrita nas formulações farmacêuticas aqui apresentadas e que se destina a uso com os métodos aqui expostos poderá ser nativa ou obtida por técnicas recombinantes, e poderá advir de qualquer fonte, incluindo fontes de mamíferos tais como, p.ex., ratinho, rato, coelho, primata, porco e humano. Quando o indivíduo submetido a tratamento é um ser humano, a IL-2 deriva preferencialmente de uma fonte humana, e inclui IL-2 humana produzida por via recombinante, tal como polipéptidos de IL-2 recombinantes produzidos por hospedeiros microbianos. A IL-2 humana é inicialmente traduzida para um polipéptido precursor, apresentado na SEQ ID NO:14, o qual é codificado por uma sequência de nucleótidos tal como a apresentada na SEQ ID NO:13. 0 polipéptido precursor inclui uma sequência de sinal a nível dos resíduos 1-20 da SEQ ID NO:14. O termo "IL-2 humana madura" refere-se à sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:16, a qual é codificada por uma sequência de nucleótidos tal como a exposta em SEQ ID NO:15. Os termos "IL-2 humana des-alanil-1, C125S" e "IL-2 humana des-alanil-1, serina-125" referem-se a uma muteína da IL-2 humana madura que possui uma serina em substituição da cisteína na posição de aminoácido 125 da sequência da IL-2 humana madura e que não possui a alanina N-terminal que reside na posição 1 da sequência de IL-2 humana madura (i.e., na posição 1 da SEQ ID NO: 16) . A IL-2 humana des-alanil-1, C125S possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:18, que é codificada por uma sequência nucleotídica tal como a apresentada na SEQ ID NO: 17. A muteína de IL-2 humana des-alanil-1, C125S produzida recombinantemente por E. coli, a qual é designada por "aldesleucina", está disponível no mercado como uma formulação com o nome comercial de Proleukin® (Chiron Corporation, Emeryville, Califórnia). A IL-2 121

Proleukin® serve como o padrão de referência de IL-2 para a determinação de intervalos de dosagem de IL-2 adequados para os protocolos de terapêutica de combinação com IL-2/anticorpo antagonista anti-CD40 aqui descritos.

Variantes biologicamente activas de IL-2. As composições farmacêuticas com utilidade para os métodos aqui expostos poderão compreender variantes de IL-2 biologicamente activas. Tais variantes deverão reter a actividade biológica desejada do polipéptido nativo, de tal modo que a composição farmacêutica compreendendo o polipéptido variante possua o mesmo efeito terapêutico que a composição farmacêutica compreendendo o polipéptido nativo quando administrada a um indivíduo; ou seja, o polipéptido variante servirá como componente terapeuticamente activo na composição farmacêutica de um modo similar ao observado para o polipéptido nativo. Encontram-se disponíveis neste campo técnico métodos para determinar se um polipéptido variante retém a actividade biológica desejada e se, deste modo, serve como agente terapeuticamente activo na composição farmacêutica. A actividade biológica pode ser medida usando ensaios especificamente concebidos para medir a actividade do polipéptido ou proteína nativos, incluindo os ensaios aqui descritos.

Adicionalmente, os anticorpos desenvolvidos contra um polipéptido nativo biologicamente activo podem ser testados quanto à sua capacidade de se ligar ao polipéptido variante, sendo que a ligação efectiva é indicativa de um polipéptido com uma conformação semelhante ao do polipéptido nativo.

Para os fins do presente invento, a actividade biológica de interesse da IL-2 corresponde à capacidade de activação e/ou expansão das células natural killer (NK) para mediar a actividade killer activada por linfocinas (LAK) e a 122 citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Assim, uma variante de IL-2 (por exemplo, uma muteína de IL-2 humana) para uso com os métodos aqui apresentados activará e/ou expandirá as células natural killer (NK) para mediar a actividade killer activada por linfocinas (LAK) e a citotoxicidade celular activada por anticorpos (ADCC). As células NK medeiam a citotoxicidade espontânea ou natural contra certos alvos celulares in vitro, referidos como alvos "sensiveis a células NK", tal como a linha celular K562 de eritroleucemia humana. Após a activação por IL-2, as células NK adquirem actividade LAK. Uma tal actividade LAK pode ser ensaiada através da capacidade que as células NK activadas por IL-2 exibem para destruir uma grande variedade de células tumorais e outros alvos "NK-insensíveis", tal como a linha Daudi de linfoma de células B, que são normalmente resistentes à lise por células NK em repouso (não activadas) . Similarmente, a actividade ADCC pode ser ensaiada através da capacidade exibida pelas células NK activadas por IL-2 para lisar células-alvo "NK-insensiveis", tal como a linha Daudi de linfoma de células B, ou outras células-alvo não prontamente lisadas por células NK em repouso na presença de concentrações óptimas de anticorpos relevantes específicos para as células tumorais. Os métodos para gerar e medir a actividade citotóxica das células NK/LAK e a ADCC são conhecidos neste campo. Ver, por exemplo, Current Protocols in Immunology: Immunologic Studies in Humans, Supl. 17, Unids. 7.7, 7.18 e 7.27 (John Wiley & Sons, Inc., 1996).

Para os fins da presente invenção, as células NK activadas por uma variante de IL-2 a utilizar com os métodos aqui expostos demonstram uma actividade de lise especifica de células NK-insensiveis na presença (actividade ADCC) ou ausência (actividade LAK) de anticorpo, mais particularmente de células Daudi NK-insensiveis na presença de anticorpos 123 específicos de células B que incluem o rituximab, que é superior em pelo menos cerca de 20%, ou em pelo menos cerca de 25%, ou 30%, ou 35%, ou 40%, à actividade basal de lise das células NK em repouso (i.e., não activadas), tal como medido usando razões de efector para alvo de desde 12,5 até 50:1 num ensaio de citotoxicidade padronizado de libertação de 51Cr em 4 h (ver Current Protocols in Immunology: Immunologic Studies in Humans, Unid. 7.7, Supl. 17, Secção 17.18.1 (John Wiley & Sons, Inc., 1996).

Em algumas formas de realização, a actividade de lise específica destas células NK activadas pela variante de IL-2 é pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75% ou pelo menos cerca de 80% superior à actividade basal de lise das células NK em repouso quando medida como acima se refere.

As variantes biologicamente activas adequadas da IL-2 nativa ou de ocorrência natural podem ser fragmentos, análogos e derivados daquele polipéptido. Por "fragmento" pretende-se indicar um polipéptido que consiste em apenas uma parte da sequência e estrutura do polipéptido intacto, e que pode corresponder a uma delecção C-terminal ou a uma delecção N-terminal do polipéptido nativo. Por "análogo" pretende-se indicar um análogo do polipéptido nativo ou de um fragmento do polipéptido nativo, em que o análogo compreende uma sequência e estrutura do polipéptido nativo com uma ou mais substituições, inserções ou delecções de aminoácidos. As "muteínas", tais como as aqui descritas, e os péptidos possuindo um ou mais peptóides (mimetizadores de péptidos) são igualmente abrangidos pela designação de "análogo" (ver a Publicação Internacional n° WO 91/04282). Por "derivado" pretende-se indicar qualquer modificação adequada do polipéptido nativo de interesse, ou de um fragmento do 124 polipéptido nativo, ou dos seus respectivos análogos, tal como glicosilação, fosforilação, conjugação de polímeros (por exemplo, com polietilenoglicol) ou outra adição de porções moleculares "estranhas", com a ressalva de que a actividade biológica desejada do polipéptido nativo seja conservada. Os métodos para produzir fragmentos polipeptídicos, análogos e derivados estão geralmente disponíveis neste campo técnico.

Por exemplo, poderão preparar-se variantes da sequência de aminoácidos do polipéptido através de mutações da sequência de DNA clonada que codifica para o polipéptido nativo de interesse. Os métodos de mutagénese e alteração de sequências nucleotídicas são bem conhecidos da técnica. Ver, por exemplo, Walker e Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154:367-382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York); Patente dos EUA N° 4.873.192; e as referências aí citadas. Podem encontrar-se orientações sobre substituições apropriadas de aminoácidos que não afectam a actividade biológica do polipéptido de interesse no modelo de Dayhoff et al. (1978), em Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).

As substituições conservativas, tais como a troca de um aminoácido por outro com propriedades semelhantes, poderão ser preferidas. Os exemplos de substituições conservativas incluem, de modo não limitativo, GlyOAla, ValoileOLeu, AspOGlu, LysOArg, AsnOGln, e PheOTrpOTyr.

Ao construir variantes do polipéptido IL-2 de interesse, são efectuadas modificações de tal modo que as variantes continuem a possuir a actividade desejada. Obviamente, quaisquer mutações feitas no DNA que codifica para o polipéptido variante não devem colocar a sequência fora do 125 molde de leitura e preferencialmente não criarão regiões complementares que poderiam produzir uma estrutura secundária de mRNA. Ver a Publicação de Pedido de Patente EP n° 75.444.

Adicionalmente, a região constante de um anticorpo antagonista anti-CD40 pode ser alvo de mutação de modo a alterar a função efectora de diversos modos. Por exemplo, ver a Patente dos EUA N° 6.737.056B1 e a Publicação do Pedido de Patente dos EUA N° 2004/0132101A1, que expõem mutações dos Fc que optimizam a ligação dos anticorpos aos receptores de Fc.

As variantes biologicamente activas de IL-2 exibirão geralmente pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente cerca de 90 a 95% ou mais, e ainda mais preferencialmente pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da molécula polipeptidica de referência, que serve como base para comparação. Assim, quando a molécula de IL-2 de referência é a IL-2 humana, uma sua variante biologicamente activa terá pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente cerca de 90 a 95% ou mais, e ainda mais preferencialmente pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da IL-2 humana.

Para os fins da presente invenção, a percentagem de identidade de sequência entre as sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de busca de homologias de Smith-Waterman, usando uma análise de espaçamentos (gaps) com os parâmetros de gap open penalty de 12 e gap extension penalty de 2, matriz BLOSUM de 62. O algoritmo de busca de homologias de Smith-Waterman é exposto em Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489. Uma variante poderá, por exemplo, diferir da sequência de IL-2 de referência em apenas 1 a 15 residuos de aminoácidos ou apenas 1 a 10 residuos de 126 aminoácidos, tal como apenas 6-10, apenas 5, apenas 4, 3, 2, ou até apenas 1 resíduo de aminoácido.

No que diz respeito ao alinhamento óptimo de duas sequências de aminoácidos, o segmento contíguo da sequência variante de aminoácidos poderá ter resíduos adicionais de aminoácidos ou ter sofrido uma delecção de aminoácidos relativamente à sequência de aminoácidos de referência. O segmento contíguo usado para comparação com a sequência de aminoácidos de referência incluirá pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos, podendo chegar a 30, 40, 50, 100 ou mais resíduos de aminoácidos. Podem estabelecer-se correcções quanto à identidade de sequência associadas a substituições conservativas de aminoácidos ou a espaçamentos na sequência (ver o algoritmo de busca de homologias de Smith-Waterman). A estrutura química precisa de um polipéptido possuindo a actividade de IL-2 depende de diversos factores. Uma vez que se encontram presentes na molécula grupos amino e carboxilo ionizáveis, poderá obter-se um polipéptido particular sob a forma de sal acídico ou básico, ou na forma neutra. Todas as preparações deste tipo que retenham a sua actividade biológica quando colocadas em condições ambientais adequadas são incluídas na definição de polipéptidos possuindo actividade de IL-2, tal como aqui é usada. Ainda, a sequência primária de aminoácidos do polipéptido poderá ser aumentada por derivatização usando porções moleculares de açúcar (glicosilação) ou outras moléculas suplementares tais como lípidos, fosfato, grupos acetilo e semelhantes. A sequência poderá ainda ser aumentada por conjugação com sacáridos. Certos aspectos de tal aumento são atingidos através dos sistemas de processamento pós-tradução do hospedeiro produtor; outras modificações poderão ser introduzidas in vitro. Em qualquer caso, tais modificações são incluídas na definição de um polipéptido IL-2 tal como aqui é usada, com a ressalva de 127 que a actividade de IL-2 do polipéptido não seja destruída. Será de esperar que tais modificações possam afectar quantitativa ou qualitativamente a actividade, aumentando ou reduzindo a actividade do polipéptido, nos diversos ensaios. Ainda, os resíduos individuais de aminoácidos na cadeia poderão ser modificados por oxidação, redução ou outra derivatização, e o polipéptido poderá ser submetido a corte para obter fraqmentos que retêm a actividade. Tais alterações que não destroem a actividade não afastam a sequência polipeptídica da definição de polipéptidos de IL-2 de interesse, tal como esta é aqui usada.

Os desenvolvimentos técnicos neste campo fornecem orientações substanciais relativas à preparação e uso de variantes polipeptídicas. Na preparação de variantes de IL-2, um perito na técnica poderá prontamente determinar as modificações da sequência de nucleótidos ou da sequência de aminoácidos da proteína nativa que resultarão numa variante adequada para uso como um componente terapeuticamente activo de uma composição farmacêutica a utilizar em associação aos métodos aqui expostos.

Para obter exemplos de proteínas IL-2 variantes, ver a Publicação de Patente Europeia (EP) n° EP 136.489 (que expõe uma ou mais das seguintes alterações na sequência de aminoácidos na IL-2 de ocorrência natural: Asn26 para Gln26; Trpl21 para Phel21; Cys58 para Ser58 ou Ala58, Cysl05 para Serl05 ou Alal05; Cysl25 para Serl25 ou Alal25; delecção de todos os resíduos que se seguem a Argl20; e as suas formas Met-1); e as muteínas de IL-2 recombinante descritas no Pedido de Patente Europeia EP 0 109 748, que é equivalente à Patente Belga n° 893.016, e na patente de propriedade comum US 4.518.584 (as quais descrevem a muteína de IL-2 humana recombinante em que a cisteína na posição 125, numerada de acordo com a IL-2 humana nativa, sofre delecção ou é 128 substituída por um aminoácido neutro; IL-2 alanil-serl25; e IL-2 des-alanil-serl25) . Ver igualmente a Patente dos EUA n° 4.752.585 (que expõe as seguintes proteínas variantes de IL-2: IL-2 alal04 serl25, IL-2 alal04, IL-2 alal04 alal25, IL-2 vall04 serl25, IL-2 vall04, IL-2 vall04 alal25, IL-2 des-alal alal04 serl25, IL-2 des-alal alal04, IL-2 des-alal alal04 alal25, IL-2 des-alal vall04 serl25, IL-2 des-alal vall04, IL-2 des-alal vall04 alal25, IL-2 des-alal des-pro2 alal04 serl25, IL-2 des-alal des-pro2 alal04, IL-2 des-alal des-pro2 alal04 alal25, IL-2 des-alal des-pro2 vall04 serl25, IL-2 des-alal des-pro2 vall04, IL-2 des-alal des-pro2 vall04 alal25, IL-2 des-alal despro2 des-thr3 alal04 serl25, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 alal04, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 alal04 alal25, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 vall04 serl25, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 vall04, IL-2 des-alal des-pro2 desthr3 vall04 alal25, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 alal04 serl25, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 alal04, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 alal04 alal25, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 vall04 serl25, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 vall04, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 vall04 alal25, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 alal04 serl25, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 alal04, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 alal04 alal25, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 vall04 serl25, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 vai 104, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 vall04 alal25, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 alal04 alal25, IL-2 des-alal despro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 alal04, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 alal04 serl25, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 vall04 serl25, IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 vall04, e IL-2 129 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 vall04 alal25) e a patente dos EUA n° 4.931.543 (que expõe a muteína da IL-2 humana des-alanil-1, serina-125 usada nos Exemplos desta exposição, assim como outras muteinas de IL-2).

Ver igualmente a Publicação de Patente Europeia n° EP 200.280 (publicada em 10 de Dezembro de 1986), que expõe muteinas recombinantes de IL-2 em que a metionina na posição 104 foi substituída por um aminoácido conservativo. Os exemplos incluem as seguintes muteinas: IL-2 ser4 des-ser5 alal04; IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 alal04 alal25 ; IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 glul04 serl25; IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 glul04; IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 glul04 alal25; IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 desser4 des-ser5 des-ser6 alal04 alal25; IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 alal04; IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 alal04 serl25; IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 glul04 serl25; IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 glul04; e IL-2 des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 glul04 alal25 . Ver também a Publicação de Patente Europeia n° EP 118.617 e a Patente dos EUA n° 5.700.913, que expõem variantes não glicosiladas da IL-2 humana portadoras de alanina no lugar da metionina da IL-2 nativa como aminoácido N-terminal; uma IL-2 humana não glicosilada com a delecção da metionina inicial, de tal modo que a prolina constitui o aminoácido N-terminal; e uma IL-2 humana não glicosilada com uma alanina inserida entre os aminoácidos N-terminais metionina e prolina.

Outras muteinas de IL-2 incluem as expostas em WO 99/60128 (substituições do aspartato da posição 20 com histidina ou isoleucina, da asparagina na posição 88 com arginina, glicina ou isoleucina, ou da glutamina na posição 126 com leucina ou 130 ácido glutâmico), as quais são reportadas como possuindo actividade selectiva para receptores de IL-2 de alta afinidade expressos por células que expressam receptores de células T preferencialmente às células NK, e uma toxicidade IL-2 reduzida; as muteinas apresentadas na Patente dos EUA n° 5.229.109 (substituições da arginina na posição 38 com alanina, ou substituições da fenilalanina na posição 42 com lisina), as quais exibem uma ligação reduzida ao receptor de IL-2 de alta afinidade quando comparadas com a IL-2 nativa, mantendo no entanto a capacidade de estimular as células LAK; as muteinas apresentadas na Publicação Internacional n° WO 00/58456 (alteração ou delecção de uma sequência (x)D(y) de ocorrência natural na IL-2 nativa em que D é ácido aspártico, (x) é leucina, isoleucina, glicina ou valina, e (y) é valina, leucina ou serina), as quais são reivindicadas como reduzindo o síndroma de derrame vascular; o péptido pl-30 de IL-2 apresentado na Publicação Internacional n° WO 00/04048 (correspondendo aos primeiros 30 aminoácidos de IL-2, contém a a-hélice A inteira de IL-2 e interage com a cadeia b do receptor de IL-2), que é reportado como estimulando as células NK e induzindo as células LAK; e uma forma mutante do péptido pl-30 de IL-2 também apresentada em WO 00/04048 (substituição do ácido aspártico na posição 20 por lisina) , sobre a qual se refere que não induz derrames vasculares mas mantém a capacidade para gerar células LAK. Adicionalmente, a IL-2 pode ser modificada com polietilenoglicol para proporcionar uma solubilidade aumentada e um perfil farmacocinético alterado (ver a Patente dos EUA n° 4.766.106).

Outras muteinas de IL-2 possuem perfis funcionais melhorados preditores de toxicidades reduzidas. As muteinas induzem um nível mais baixo de produção de citocinas pró-inflamatórias por parte das células NK, mantendo ou aumentando, todavia, a proliferação de células NK, mantendo as 131 funções citolíticas NK, LAK e ADCC mediadas pelas células NK, e mantendo a função de proliferação das células T quando comparadas com as muteinas des-alanil-1, C125S de IL-2 humana ou C125S de IL-2 humana. Os exemplos destas muteinas de IL-2 melhoradas incluem. , de : modo não limitativo, T7A, L36G, P65E, R81L, T7D, L36H, P65F, R81M, T7R, L36I, P65G , R81N , K8L, L36K, P65H, R81P, K9A, L36M, P65I, R81T, K9D, L36N , P65K ., D84R, K9R, L36P, P65L, S87T, K9S, L36R, P65N, N88D, K9V, L36S, P65Q, N88H, K9W, L36W, P65R, N88T, T10K, L36Y, P65S, V91A, T10N, R38D, P65T, V91D, Q11A, R38G, P65V, V91E, Q11R, R38N, P65W, V91F, QHT, R38P, P65Y, V91G, E15A, R38S, L 6 6A, V91Q, H16D, L40D, L66F, V91W, H16E, L40G, E67A, V91N, L19D, L40N, L72G, L94A, L19E, L40S, L72N, L941, D20E, T41E, L72T, L94T, I24L, T41G, F78S, L94V, K32A, F42A, F78W, L94Y, K32W, F42E, H79F, E95D, N33E, F42R, H7 9M, E95G, P34E, F42T, H79N, E95M, P34R, F42V, H79P, T102S, P34S, K43H, H79Q, T102V, P34T, F44K, H79S, M104G, P34V , M46I, H79V, E106K, K35D, E61K, L80E, Y107H, K35I, E61M, L80F, Y107K, K35L , E61R, L80G, Y107L, K35M, E62T, L80K, Y107Q, K35N , E62Y, L80N, Y107R, K35P, K64D, L80R, Y107T, K35Q, K64E, L80T, E116G, K35T, K64G, L80V, N119Q, L36A, K64L, L80W, T123S, L36D , K64Q, L80Y, T123C, L36E, K64R, R81E, Q126I, L36F, P65D, R81K e Q126V , em que a posição do resíduo > é relativa à posição no interior da sequência de IL-2 humana madura apresentada na SEQ ID NO:16. Os exemplos destas muteinas combinatoriais de IL-2 incluem, de modo não limitativo, 19D40D, 19D81K, 36D42R, 36D61R, 36D65L,40D36D, 40D61R, 40D65Y, 40D72N, 40D80K, 40G36D, 40G65Y, 80K36D, 80K65Y, 81K36D, 81K42E, 81K61R, 81K65Y, 81K72N, 81K88D, 81K91D, 81K107H, 81L107H, 91N95G, 107H36D, 107H42E, 107H65Y, 107R36D, 107R72N, 40D81K107H, 40G81K107H e 91N94Y95G, em que a posição do resíduo é relativa à posição no interior da sequência de IL-2 humana madura apresentada na SEQ ID NO:16. 132 0 termo "IL-2", tal como aqui é usado, pretende igualmente incluir fusões ou conjugados de IL-2 que compreendem IL-2 fundida a uma segunda proteína ou covalentemente conjugada a poliprolina ou a um polímero solúvel em água para reduzir as frequências de dosagem ou para melhorar a tolerabilidade à IL-2. Por exemplo, a IL-2 (ou uma sua variante tal como aqui definida) pode ser fundida com a albumina humana ou com um fragmento de albumina usando métodos conhecidos neste campo técnico (ver WO 01/79258). Alternativamente, a IL-2 pode ser covalentemente conjugada com homopolímeros de poliprolina ou de polietilenoglicol e com polióis polioxietilados, em que o homopolímero não é substituído ou está substituído numa extremidade com um grupo alquilo e o poliol não é substituído, usando métodos conhecidos neste campo (ver, por exemplo, as Patentes dos EUA nos. 4.766.106, 5.206.344 e 4.894.226).

Formulações farmacêuticas de IL-2 ou de uma sua variante. Qualquer formulação farmacêutica compreendendo IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa adequada como o componente terapeuticamente activo pode ser usada em associação aos métodos aqui expostos. Tais composições farmacêuticas são conhecidas da técnica e incluem, de modo não limitativo, as apresentadas nas Patentes dos EUA nos. 4.604.377/ 4.745.180; 4.766.106; 4.816.440; 4.894.226; 4.931.544/ 4.992.271; 5.078.997; e 6.525.102. Assim, as composições líquidas, liofilizadas ou secas por spray comprendendo IL-2 ou as suas variantes conhecidas da técnica poderão ser preparadas sob a forma de soluções ou suspensões aquosas ou não aquosas para subsequente administração a um indivíduo de acordo com os métodos aqui expostos. Cada uma das composições compreenderá IL-2 ou suas variantes como componente terapeuticamente ou profilacticamente activo. Por "componente terapeuticamente ou profilacticamente activo" pretende-se indicar que a IL-2, ou a 133 sua variante, é especificamente incorporada na composição para proporcionar uma resposta terapêutica ou profiláctica desejada no que respeita ao tratamento, prevenção ou diagnóstico de uma doença ou estado patológico de um individuo quando a composição farmacêutica é administrada a esse individuo. Preferencialmente, as composições farmacêuticas compreendem agentes estabilizantes apropriados, excipientes ou ambos, para minimizar os problemas associados à perda de estabilidade e de actividade biológica da proteína durante a preparação e o armazenamento.

Por exemplo, a Patente dos EUA n° 4.604.377 apresenta uma formulação de IL-2 que possui uma quantidade terapêutica de IL-2, sendo que a formulação está substancialmente isenta de proteína não-IL-2 e de endotoxinas e inclui um transportador fisiologicamente aceitável solúvel em água e uma quantidade suficiente de um agente tensioactivo para solubilizar a IL-2, tal como o dodecilsulfato de sódio. Poderão incluir-se outros ingredientes, tais como açúcares. A Patente dos EUA n° 4.766.106 apresenta formulações que incluem IL-2 modificada por polietilenoglicol (PEG). A Publicação do Pedido de Patente Europeia n° 268.110 apresenta formulações de IL-2 com diversos surfactantes não iónicos seleccionados a partir do grupo que consiste em ésteres de ácidos gordos de polioxietileno-sorbitano (Tween-80), monoestearato de polietilenoglicol e compostos de octilfenoxi-polietoxietanol (Triton X405). A Patente dos EUA n° 4.992.271 apresenta formulações de IL-2 compreendendo albumina sérica humana e a Patente dos EUA n° 5.078.997 apresenta formulações de IL-2 compreendendo albumina sérica humana e aminoácidos. A Patente dos EUA n° 6.525.102 apresenta formulações de IL-2 compreendendo uma base de aminoácido, que serve como o agente estabilizador primário do polipéptido, e um ácido e/ou a sua forma de sal para tamponar a solução dentro de um intervalo de pH aceitável para a 134 estabilidade do polipéptido. A Patente US 2003/198602 apresenta formulações de IL-2 adequadas para a administração pulmonar.

Anticorpos Antagonistas Anti-CD40 e Suas Variantes Adequadas

Os anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 representam anticorpos antagonistas anti-CD40 adequados para uso com os métodos da presente invenção. Os anticorpos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 são anticorpos monoclonais inteiramente humanos anti-CD40 do isotipo IgG^ produzidos pelas linhas celulares de hibridoma 131.2F8.5.9 (aqui referida como linha celular 5.9) e 153.8E2.D10.D6.12.12 (aqui referida como linha celular 12.12). Estas linhas celulares foram criadas usando esplenócitos de ratinhos xenotípicos imunizados contendo o locus da cadeia pesada de IgG humana e o locus da cadeia κ humana (tecnologia Xenomouse®; Abgenix; Fremont, Califórnia). Os esplenócitos foram fundidos com as células SP2/0 de mieloma de ratinho (Sierra BioSource). Os hibridomas resultantes foram sub-clonados por diversas vezes para criar as linhas celulares monoclonais estáveis 5.9 e 12.12. Os outros anticorpos da invenção podem ser preparados de modo similar usando ratinhos transgénicos para os locus de imunoglobulinas humanas ou por outros métodos conhecidos da técnica e/ou aqui descritos.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos das regiões variáveis do anticorpo CHIR-12.12, e as sequências de aminoácidos das regiões variáveis do anticorpo CHIR-5.9, são aqui apresentadas. Mais particularmente, as sequências de aminoácidos das regiões leader, variável e constante da cadeia leve e da cadeia pesada do mAb CHIR-12.12 são expostas nas Figuras IA e 1B, respectivamente. Ver igualmente a SEQ ID NO:2 (sequência completa da cadeia leve do mAb CHIR-12.12), SEQ ID NO: 4 (sequência completa da cadeia pesada do mAb CHIR-12.12), 135 e SEQ ID NO: 5 (sequência completa de uma variante da cadeia pesada do mAb CHIR-12.12 apresentada na SEQ ID NO:4, sendo que a variante compreende uma substituição, por serina, do residuo de alanina na posição 153 da SEQ ID NO:4). As sequências nucleotidicas codificando para a cadeia leve e para a cadeia pesada do mAb CHIR-12.12 são expostas nas Figuras 2A e 2B, respectivamente. Ver igualmente a SEQ ID N0:1 (sequência codificante para a cadeia leve do mAb CHIR-12.12) e a SEQ ID NO: 3 (sequência codificante para a cadeia pesada do mAb CHIR-12.12). As sequências de aminoácidos das regiões leader, variável e constante da cadeia leve e da cadeia pesada do mAb CHIR-5.9 são expostas nas Figuras 3A e 3B, respectivamente. Ver igualmente a SEQ ID NO: 6 (sequência completa da cadeia leve do mAb CHIR-5.9), SEQ ID NO: 7 (sequência completa da cadeia pesada do mAb CHIR-5.9), e SEQ ID NO:8 (sequência completa de uma variante da cadeia pesada do mAb CHIR-5.9 apresentada na SEQ ID NO:7, sendo que a variante compreende uma substituição, por serina, do residuo de alanina na posição 158 da SEQ ID N0:7). Adicionalmente, os hibridomas que expressam anticorpos CHIR-12.12 e CHIR-5.9 foram depositados na ATCC com as designações de depósito patenteado PTA-5542 e PTA-5543, respectivamente.

Para além da actividade antagonista, é preferível que os anticorpos anti-CD40 desta invenção possuam outro mecanismo de acção contra uma célula tumoral. Por exemplo, os anticorpos nativos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 possuem actividade ADCC. Alternativamente, as regiões variáveis dos anticorpos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 poderão ser expressas em outro isotipo de anticorpo que possua actividade ADCC. É igualmente possível conjugar formas nativas, formas recombinantes ou fragmentos de ligação ao antigénio de CHIR-5.9 ou de CHIR-12.12 com uma citotoxina, um agente terapêutico ou radioisótopo. 136

Os anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 ligam-se ao CD40 solúvel em ensaios de tipo ELISA, evitam a ligação do ligando de CD40 ao CD40 da superfície celular e deslocam o ligando de CD40 pré-ligado, tal como determinado por ensaios de citometria de fluxo. Os anticorpos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 competem um com o outro para a ligação ao CD40 mas não com o 15B8, o anticorpo monoclonal anti-CD40 descrito na patente W002/28904. Quando testados in vitro relativamente aos efeitos sobre a proliferação de células B de indivíduos humanos normais, CHIR-5.9 e CHIR-12.12 agem como anticorpos antagonistas anti-CD40. Adicionalmente, CHIR-5.9 e CHIR-12.12 não induzem uma forte proliferação dos linfócitos humanos dos indivíduos normais. Estes anticorpos têm a capacidade de destruir as células-alvo que expressam CD40 por citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). A afinidade de -8 ligação de CHIR-5.9 para o CD40 humano é de 1,2 x 10 M e a -10 afinidade de ligação de CHIR-12.12 é de 5 x 10 M, tal como determinado pelo ensaio Biacore™.

Os anticorpos antagonistas anti-CD40 adequados para uso com os métodos da presente invenção exibem uma forte afinidade de ligação a local único para o antigénio da superfície celular CD40. Os anticorpos monoclonais da invenção exibem uma constante de dissociação em equilíbrio (K^) para o CD40 de pelo -5 -5 menos 10 M, pelo menos 3 x 10 M, preferencialmente pelo -6 -7 -8 menos 10 M a 10 M, mais preferencialmente pelo menos 10 a -12 10 M, tal como medido usando um ensaio padronizado como o Biacore™. A análise Biacore é bem conhecida neste campo técnico e os seus detalhes são expostos no "BIAapplications

Handbook". Os métodos descritos na WO 01/27160 podem ser usados para modular a afinidade de ligação. 137

Por "antigénio CD40", "antigénio de superfície celular CD40", "receptor CD40" ou "CD40" pretende-se designar uma glicoproteína transmembranar que pertence à família de receptores do factor de necrose tumoral (TNF) (ver, por exemplo, as patentes dos EUA nos. 5.674.492 e 4.708.871; Stamenkovic et al. (1989) EMBO 8:1403; Clark (1990) Tissue

Antigens 36:33; Barclay et al. (1997) The Leucocyte Antigen Facts Book (2a Ed.; Academic Press, San Diego) ) . Foram já identificadas duas isoformas do CD40 humano, codificadas por variantes de transcrição por splicing alternativo deste gene. A primeira isoforma (também conhecida por "a isoforma longa" ou "isoforma 1") é expressa sob a forma de um polipéptido precursor de 277 aminoácidos (SEQ ID NO:12 (reportada pela primeira vez com o N° de Acesso Genbank CAA43045, e identificada como isoforma 1 com o N° de Acesso Genbank NP_001241), codificado pela SEQ ID NO:ll (ver os Nos. de Acesso Genbank X60592 e NM_001250)), a qual tem uma sequência de sinal representada pelos primeiros 19 resíduos. A segunda isoforma (também conhecida por "isoforma curta" ou "isoforma 2") é expressa sob a forma de um polipéptido precursor de 203 aminoácidos (SEQ ID NO:10 (N° de Acesso Genbank NP_690593), codificado pela SEQ ID NO:9 (N° de Acesso Genbank NM_152854)), que possui igualmente uma sequência de sinal representada pelos primeiros 19 resíduos. Os polipéptidos precursores destas duas isoformas do CD40 humano têm em comum os seus primeiros 165 resíduos (i.e., resíduos 1-165 da SEQ ID NO:10 e da SEQ ID NO:12). O polipéptido precursor da isoforma curta (mostrada na SEQ ID NO: 10) é codificado por uma variante de transcrição (SEQ ID NO:9) ao qual falta um segmento codificante, o que conduz a uma alteração do molde de leitura (frameshifting); a isoforma de CD40 resultante contém uma forma diferente, mais curta, da extremidade C (resíduos 166-203 da SEQ ID NO:10) relativamente à contida na isoforma longa 138 da CD40 (extremidade C mostrada nos resíduos 166-277 da SEQ ID NO:12). Para os fins da presente invenção, os termos "antigénio CD40", "antigénio de superfície celular CD40", "receptor CD40" ou "CD40" abrangem ambas as formas, curta e longa, do CD40. Os anticorpos anti-CD40 da presente invenção ligam-se a um epitopo do CD40 humano que reside no mesmo local tanto na isoforma curta como na isoforma longa deste antigénio de superfície celular, tal como abaixo se faz notar. 0 antigénio CD40 é apresentado à superfície de uma variedade de tipos celulares, tal como se descreve em outro local desta exposição. Por "apresentado à superfície" e "expresso na superfície" pretende-se significar que o todo ou parte do antigénio CD40 se encontra exposto no exterior da célula. 0 antigénio CD40 apresentado ou expresso poderá estar parcialmente ou inteiramente glicosilado.

Por "actividade agonista" pretende-se indicar que a substância funciona como um agonista. Um agonista combina-se com um receptor conhecido numa célula e inicia uma reacção ou actividade que é similar ou idêntica à iniciada pelo ligando natural do receptor; p.ex., a transdução de um sinal para a célula. Um agonista do CD40 induz qualquer uma, ou todas, das respostas que se seguem, indicadas de modo não limitativo: proliferação e diferenciação de células B, produção de anticorpos, adesão intercelular, geração de células B de memória, mudança de isotipo, regulação positiva da expressão à superfície celular de moléculas de Classe II do MHC e de CD80/86, e secreção de citocinas pró-inflamatórias tais como IL-8, IL-12 e TNF. Por "actividade antagonista" pretende-se indicar que a substância funciona como um antagonista. Um antagonista do CD40 evita ou reduz a indução de qualquer das respostas induzidas pela ligação do receptor CD40 a um ligando agonista, particularmente o CD40L. 0 antagonista pode reduzir a indução de qualquer uma ou mais do que uma das respostas à 139 ligação de um agonista em 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30 3- "3 R°-o , O o , preferencialmente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, ma is preferencialmente 70%, 80%, 85%, e ainda mais preferencialmente 90%, 95%, 99% ou 100% . Os métodos para a medição da especificidade de ligação do anticorpo anti-CD40 e do ligando de CD40 e da actividade antagonista são conhecidos dos peritos na técnica e incluem, de forma não limitativa, ensaios de ligação competitiva padronizados, ensaios para a monitorização da secreção de imunoglobulinas pelas células B, ensaios de proliferação de células B, ensaios de proliferação de células B de tipo Banchereau, ensaios de células T helper para produção de anticorpos, ensaios de co-estimulação da proliferação de células B e ensaios de regulação positiva dos marcadores de activação das células B. Ver, por exemplo, os ensaios apresentados em WO 00/75348 e na Patente dos EUA n° 6.087.329.

Por actividade agonista "significativa" pretende-se referir uma actividade agonista de pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% superior à actividade agonista que é induzida por uma substância neutra ou por um controlo negativo, tal como medido por um ensaio de uma resposta das células B. Preferencialmente, uma actividade agonista "significativa" corresponde a uma actividade agonista que é pelo menos 2 vezes superior ou pelo menos 3 vezes superior à actividade agonista induzida por uma substância neutra ou por um controlo negativo, tal como medido por um ensaio de resposta das células B. Assim, por exemplo, quando a resposta das células B pretendida é a proliferação de células B, uma actividade agonista "significativa" seria a indução de um nivel de proliferação de células B pelo menos 2 vezes superior ou pelo menos 3 vezes superior ao nivel de proliferação de células B que é induzido por uma substância neutra ou um controlo negativo. Em uma das formas de 140 realização, uma imunoglobulina não específica, por exemplo IgGl, que não se liga ao CD40 serve como controlo negativo. Uma substância "isenta de actividade agonista significativa" exibe uma actividade agonista que não supera em mais do que cerca de 25% a actividade agonista exibida por uma substância neutra ou um controlo negativo, preferencialmente superando em não mais do que cerca de 20%, não mais que 15%, não mais que 10%, não mais que 5%, não mais que 1%, não mais que 0,5%, ou até em não mais do que 0,1% a actividade agonista induzida por uma substância neutra ou um controlo negativo, tal como medido por um ensaio de resposta de células B. Os anticorpos antagonistas anti-CD40 úteis em associação aos métodos desta invenção são isentos de actividade agonista significativa, tal como acima indicado, quando ligados a um antigénio CD40 numa célula humana. Em uma das formas de realização desta invenção, o anticorpo antagonista anti-CD40 é isento de actividade agonista significativa relativamente a uma resposta das células B. Em outra forma de realização da invenção, o anticorpo antagonista anti-CD40 é isento de actividade agonista significativa em ensaios de mais do que uma resposta das células B (p.ex., proliferação e diferenciação, ou proliferação, diferenciação e produção de anticorpos).

Os anticorpos monoclonais contra CD40 são já conhecidos neste campo técnico. Ver, por exemplo, as secções dedicadas aos antigénios de células B em McMichael, ed. (1987/ 1989)

Leukocyte Typing III e IV (Oxford University Press, New York); Patentes dos EUA nos. 5.674.492; 5.874.082; 5.677.165; 6.056.959; WO 00/63395; Publicações Internacionais nos. WO 02/28905 e WO 02/28904; Gordon et al. (1988) J. Immunol. 140:1425; Valle et al. (1989) Eur. J. Immunol. 19:1463; Clark et al. (1986) PNAS 83:4494; Paulie et al. (1989) J. Immunol. 142:590; Gordon et al. (1987) Eur. J. Immunol. 17:1535; Jabara et al. (1990) J. Exp. Med. 172:1861; Zhang et al. (1991) J. 141

Immunol. 146:1836; Gascan et al. (1991) J. Immunol. 147:8;

Banchereau et al. (1991) Clin. Immunol. Spectrum 3:8; e

Banchereau et al. (1991) Science 251:70. De particular interesse para a presente invenção são os anticorpos antagonistas anti-CD40 aqui descritos que partilham as caracteristicas de ligação dos anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 acima descritos. Tais anticorpos incluem, de modo não limitativo, os seguintes: (1) os anticorpos monoclonais produzidos pelas linhas celulares de hibridoma designadas como 131.2F8.5.9 (aqui referida como linha celular 5.9) e 153.8E2.D10.D6.12.12 (aqui referida como linha celular 12.12), depositadas na ATCC como Depósito Patenteado n° PTA-5542 e Depósito Patenteado n° PTA-5543, respectivamente; (2) um anticorpo monoclonal compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste na sequência mostrada em SEQ ID NO:2; a sequência mostrada em SEQ ID NO:4; a sequência mostrada em SEQ ID NO:5; ambas as sequências mostradas em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, e ambas as sequências mostradas em SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:5; (3) um anticorpo monoclonal compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste na sequência mostrada em SEQ ID NO:6, a sequência mostrada em SEQ ID NO:7, a sequência mostrada em SEQ ID NO:8, ambas as sequências mostradas em SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7, e ambas as sequências mostradas em SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8; (4) um anticorpo monoclonal possuindo uma sequência de aminoácidos codificada por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleótidos seleccionada a partir do grupo que consiste na sequência de nucleótidos mostrada em SEQ ID NO:l, a sequência de nucleótidos mostrada em SEQ ID NO:3, e ambas as sequências mostradas em SEQ ID NO:l e SEQ ID NO: 3; (5) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que tem a capacidade de se ligar ao anticorpo monoclonal produzido pela 142 linha celular de hibridoma 5.9 ou pela linha celular de hibridoma 12.12; (6) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-87 da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:10 ou em SEQ ID NO:12; (7) um anticorpo monoclonal que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 num ensaio de ligação competitiva; e (8) um anticorpo monoclonal que consiste num fragmento de ligação ao antigénio do anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou dos anticorpos monoclonais referidos nos pontos (1)-(7) anteriores, sendo que o fragmento retém a capacidade de se ligar especificamente ao antigénio CD40 humano.

Produção de anticorpos antagonistas anti-CD40. Os anticorpos antagonistas anti-CD40 que se destinam a uso nos métodos aqui descritos podem ser produzidos usando qualquer método de produção de anticorpos conhecido dos peritos na técnica. Assim, podem ser preparados soros policlonais recorrendo a métodos convencionais. Em geral, uma solução contendo o antigénio CD40 é inicialmente usada para imunizar um animal adequado, de preferência um ratinho, rato, coelho ou cabra. Os coelhos ou as cabras são preferidos para a preparação de soros policlonais devido ao volume de soro que é possivel obter e à facilidade de acesso a anticorpos marcados anti-coelho e anti-cabra.

Os soros policlonais podem ser preparados num animal transgénico, preferencialmente um ratinho portador de locus de imunoglobulinas humanas. Numa forma de realização preferida, são usadas como imunogénio células Sf9 que expressam CD40. A imunização pode também ser realizada misturando ou emulsifiçando a solução que contém o antigénio em soro fisiológico, preferencialmente num adjuvante como o adjuvante completo de Freund, e injectando a mistura ou emulsão parentericamente (em geral subcutaneamente ou 143 intramuscularmente). Uma dose de 50-200 μg/injecção é tipicamente suficiente. A imunização é geralmente reforçada 2-6 semanas mais tarde com uma ou mais injecções da proteina em soro fisiológico, preferencialmente usando adjuvante incompleto de Freund. Alternativamente, podem gerar-se anticorpos por imunização in vitro usando métodos conhecidos neste campo, procedimento que, para os fins da presente invenção, é considerado como equivalente à imunização in vivo. São obtidos antisoros policlonais sangrando o animal imunizado para um contentor de plástico ou vidro, incubando o sangue a 25°C durante uma hora e, por fim, incubando-o a 4°C durante 2-18 horas. O soro é recuperado por centrifugação (p.ex., a 1000 x g durante 10 minutos) . Podem obter-se cerca de 20-50 ml por colheita a partir de coelhos. A produção das células Sf9 (de Spodoptera frugiperda) é descrita na Patente dos EUA N°.6.004.552. Abreviadamente, as sequências codificando para o CD40 humano foram recombinadas num baculovirus usando vectores de transferência. Os plasmideos foram co-transfectados com DNA de baculovirus de tipo selvagem em células Sf9. As células Sf9 infectadas com baculovirus recombinante foram identificadas e purificadas por clonagem.

De preferência, o anticorpo será de natureza monoclonal. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um só local antigénico, i.e., o antigénio de superfície celular CD40. Adicionalmente, em contraste com o que acontece com as preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um só determinante no antigénio. A designação de "monoclonal" identifica o tipo de anticorpo como tendo sido obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, tal como a produção 144 por uma população clonal de células B, e não deve ser interpretado como exigindo a preparação do anticorpo através de qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a usar de acordo com a presente invenção poderão ser produzidos por recurso ao método de hibridomas inicialmente descrito por Kohler et al. (1975) Nature 258:495, ou utilizando métodos de DNA recombinante (ver, p.ex., a Patente dos EUA N° 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas fágicas de anticorpos usando as técnicas descritas em, por exemplo, Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Marks et al. (1991) J Mol. Biol. 222:581-597; e Patente dos EUA n° 5.514.548.

Por "epitopo" pretende-se indicar a parte de uma molécula antigénica contra a qual é produzido um anticorpo e à qual o anticorpo se ligará. Os epitopos poderão compreender residuos de aminoácidos lineares (i.e., os residuos do epitopo estão dispostos sequencialmente um após o outro num arranjo linear), residuos de aminoácidos não lineares (aqui referidos como "epitopos não lineares"; estes epitopos não estão dispostos sequencialmente), ou ainda compreender tanto residuos de aminoácidos lineares como residuos não lineares.

Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando o método de Kohler et al. (1975) Nature 256:495-496, ou uma modificação deste. Tipicamente, um ratinho é imunizado com uma solução contendo um antigénio. A imunização pode ser realizada misturando ou emulsifiçando a solução que contém o antigénio em soro fisiológico, preferencialmente num adjuvante tal como o adjuvante completo de Freund, e injectando a mistura ou emulsão parentericamente. Qualquer método de imunização conhecido da técnica poderá ser usado para obter os anticorpos monoclonais da invenção. Após a imunização do animal, o baço (e, opcionalmente, diversos gânglios linfáticos grandes) são removidos e dissociados em células isoladas. Os esplenócitos 145 podem ser rastreados aplicando uma suspensão de células a uma placa ou poço revestido com o antigénio de interesse. As células B que expressam imunoglobulinas ligadas à membrana especificas para o antigénio ligam-se à placa e não são eliminadas pela lavagem. As células B resultantes, ou todas as células do baço dissociadas, são então induzidas a fundir-se com as células de mieloma para formar hibridomas e são cultivadas num meio selectivo. As células resultantes são plaqueadas por diluição em série e são ensaiadas quanto à produção de anticorpos que se liguem especificamente ao antigénio de interesse (e que não se liguem a antigénios não relacionados). Os hibridomas secretores do anticorpo monoclonal (mAb) seleccionado são então cultivados in vitro (p.ex., em frascos de cultura celular ou em reactores de fibras ocas) , ou in vivo (como ascites em ratinhos) .

Quando os anticorpos antagonistas anti-CD40 da invenção se destinam a ser preparados usando métodos de DNA recombinante, o DNA codificando para os anticorpos monoclonais é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (p.ex., usando sondas oligonucleotidicas que têm a capacidade de se ligar especificamente a genes que codificam para as cadeias leves e pesadas de anticorpos murinos). As células de hibridoma aqui descritas servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vectores de expressão, os quais são então transfectados em células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de simio, células de ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que de outro modo não produziriam a imunoglobulina, de modo a obter a sintese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. As revisões de conjunto sobre a expressão recombinante em bactérias de DNA codificando para o anticorpo incluem Skerra et al. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256 e Phickthun (1992) Immunol. Revs. 130:151. 146

Alternativamente ao uso de hibridomas, o anticorpo poderá ser produzido numa linha celular tal como uma linha celular CHO, tal como exposto nas Patentes dos EUA nos. 5.545.403/ 5.545.405 e 5.998.144. Abreviadamente, a linha celular é transfectada com vectores com a capacidade de expressar uma cadeia leve e uma cadeia pesada, respectivamente. Através da transfecção das duas proteínas em vectores separados, podem produzir-se anticorpos quiméricos. Outra vantagem consiste na glicosilação correcta do anticorpo.

Em algumas formas de realização, o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, é produzido em células CHO usando o sistema de expressão genética GS (Lonza Biologics, Portsmouth, New Hampshire), que utiliza a glutamina sintetase como marcador. Ver igualmente as Patentes dos EUA nos. 5.122.464; 5.591.639; 5.658.759; 5.770.359; 5.827.739; 5.879.936; 5.891.693; e 5.981.216. O termo "epitopo antigénico", tal como aqui é usado, refere-se a uma estrutura molecular tridimensional (linear ou conformacional) que tem a capacidade de exibir imunoreactividade com o anticorpo monoclonal anti-CD40. Os epitopos antigénicos poderão compreender proteínas, fragmentos de proteínas, péptidos, hidratos de carbono, lípidos e outras moléculas, mas para os fins da presente invenção serão mais comumente proteínas, oligopéptidos curtos, emuladores de oligopéptidos (i.e., compostos orgânicos que emulam as propriedades de ligação ao anticorpo do antigénio CD40), ou combinações destes. Os emuladores de oligopéptidos adequados são descritos, inter alia, no pedido de patente PCT US 91/04282 .

Adicionalmente, o termo "anticorpo", tal como aqui é usado, abrange anticorpos quiméricos anti-CD40. Os anticorpos quiméricos anti-CD40 destinados a uso nos métodos da invenção 147 possuem as características de ligação dos anticorpos monoclonais anti-CD40 CHIR-5.9 e CHIR-12.12 aqui descritos. Por anticorpos "quiméricos" pretende-se referir anticorpos que são preferencialmente obtidos usando técnicas de DNA recombinante e que compreendem tanto componentes humanos (incluindo espécies imunologicamente "aparentadas", p.ex., chimpanzés) como componentes não humanos. Assim, a região constante do anticorpo quimérico é, mais preferencialmente, substancialmente idêntica à região constante de um anticorpo humano natural; a região variável do anticorpo quimérico é mais preferencialmente obtida a partir de uma fonte não humana e possui a especificidade antigénica desejada face ao antigénio de superfície celular CD40. A fonte não humana poderá corresponder a qualquer fonte de vertebrado que possa ser usada para gerar anticorpos contra um antigénio humano de superfície celular CD40 ou contra material que compreenda um antigénio humano de superfície celular CD40. Tais fontes não humanas incluem, de forma não limitativa, roedores (p.ex., coelho, rato, ratinho, etc.; ver, por exemplo, a Patente dos EUA n° 4.816.567) e primatas não humanos (p.ex., macaco do Velho Mundo, outros macacos, etc.; ver, por exemplo, as Patentes dos EUA nos. 5.750.105 e 5.756.096). Tal como aqui é usada, a expressão "imunologicamente activo", quando usada em referência a anticorpos quiméricos anti-CD40, indica um anticorpo quimérico que se liga ao CD40 humano.

Os anticorpos anti-CD40 humanizados representam anticorpos anti-CD40 adicionais que são adequados para uso com os métodos aqui descritos. O termo "humanizado" pretende referir formas de anticorpos anti-CD40 que contêm uma sequência mínima derivada de sequências de imunoglobulinas não humanas. Na sua maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais os resíduos de uma região hipervariável (também conhecida como região 148 determinante da complementaridade ou CDR) do receptor são substituídas por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como o ratinho, rato, coelho, ou primata não humano possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. A expressão "região determinante da complementaridade" refere-se a sequências de aminoácidos que em conjunto definem a afinidade de ligação e a especificidade da região Fv natural do local de ligação de uma imunoglobulina nativa. Ver, p.ex., Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Kabat et al. (1991) U.S. Dept. of Health and Human Services, Publicação NIH N° 91-3242). O termo "região constante" refere-se à porção da molécula de anticorpo que confere as funções efectoras. Nos desenvolvimentos anteriores dirigidos para a produção de anticorpos não imunogénicos destinados a uso na terapêutica de doenças humanas, as regiões constantes de ratinho foram substituídas por regiões constantes humanas. As regiões constantes dos anticorpos humanizados derivavam de imunoglobulinas humanas. No entanto, estes anticorpos humanizados ainda provocavam uma resposta imune indesejável e potencialmente perigosa em seres humanos e verificou-se uma perda de afinidade. Os anticorpos anti-CD40 humanizados a usar em associação aos métodos da presente invenção possuem características de ligação similares às exibidas pelos anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 aqui descritos. A humanização pode essencialmente ser efectuada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), substituindo sequências CDR de roedores ou sequências CDR mutantes de roedores pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Ver igualmente as Patentes dos EUA nos. 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. Em alguns casos, 149 os resíduos dentro das regiões de "framework" de uma ou mais regiões variáveis da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes (ver, por exemplo, as Patentes dos EUA nos. 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; e 6.180.370). Adicionalmente, os anticorpos humanizados poderão compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem no anticorpo dador. Estas modificações são feitas para conseguir um refinamento adicional do desempenho do anticorpo (i.e., para obter a afinidade desejada). Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente o total de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, sendo que todas ou substancialmente todas as regiões hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas, ou substancialmente todas, as regiões de "framework" correspondem as de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado compreenderá também, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes consultar Jones et al. (1986) Nature 331:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; e Presta (1992) Curr. Op.

Struct. Biol. 2:593-596. Deste modo, tais anticorpos "humanizados" poderão incluir anticorpos nos quais substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos da CDR e possivelmente alguns resíduos da FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores. Ver, por exemplo, as Patentes dos EUA nos. 5.225.539; 5.585.089;

5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. Ver também a Patente dos EUA n° 6.180.370 e Publicação Internacional N° WO 01/27160, nas quais são expostos anticorpos humanizados e técnicas para a 150 produção de anticorpos humanizados possuindo uma afinidade melhorada para um antigénio predeterminado. São também abrangidos pelo termo "anticorpos anti-CD40" os anticorpos anti-CD40 xenogénicos ou modificados produzidos num hospedeiro mamífero não humano, mais particularmente um ratinho transgénico, caracterizado por locus inactivados de imunoglobulinas (Ig) endógenas. Nestes animais transgénicos, os genes endógenos competentes para a expressão de subunidades leves e pesadas das imunoglobulinas do hospedeiro são colocados em situação de não funcionalidade e são substituídos pelos locus análogos de imunoglobulinas humanas. Estes animais transgénicos produzem anticorpos humanos na ausência substancial de subunidades leves ou pesadas das imunoglobulinas do hospedeiro. Ver, por exemplo, as Patentes dos EUA nos. 5.877.397 e 5.939.598.

De preferência, são obtidos anticorpos inteiramente humanos contra CD40 através da imunização de ratinhos transgénicos. Este tipo de ratinhos é obtido usando a tecnologia XenoMouse® (Abgenix; Fremont, Califórnia), que é exposta nas Patentes dos EUA nos. 6.075.181, 6.091.001 e 6.114.598. Para produzir os anticorpos aqui referidos, os ratinhos transgénicos para o locus de cadeia pesada de IgG humana e para o locus de cadeia leve κ humana foram imunizados com células Sf9 que expressam CD40 humano. Os ratinhos podem ainda ser transgénicos para outros isotipos. Os anticorpos inteiramente humanos com utilidade em associação aos métodos aqui revelados são caracterizados por propriedades de ligação similares às exibidas pelos anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 aqui expostos.

Os fragmentos de ligação ao antigénio de um anticorpo que são considerados como adequados compreendem uma porção de um anticorpo de extensão completa, geralmente a sua região de ligação ao antigénio ou a sua região variável. Os exemplos de 151 fragmentos de anticorpos incluem, de modo não limitativo, os fragmentos Fab, F(ab') e Fv e as moléculas de anticorpo de cadeia única. Por "Fab" entende-se um fragmento monovalente de ligação ao antigénio de uma imunoglobulina que é composto pela cadeia leve e por parte da cadeia pesada. Por F(ab') entende- se um fragmento bivalente de ligação ao antigénio de uma imunoglobulina que contém ambas as cadeias leves e parte de ambas as cadeias pesadas. Os fragmentos de anticorpos de tipo "Fv de cadeia única" ou "sFv" são fragmentos que compreendem os dominios V e V de um anticorpo, sendo que estes domínios se

H L encontram presentes numa só cadeia polipeptídica. Ver, por exemplo, as Patentes dos EUA nos. 4.946.778, 5.260.203, 5.455.030 e 5.856.456. Geralmente, o polipéptido Fv compreende ainda um linker polipeptídico entre os domínios V e V que

H L permite que o sFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antigénio. Para uma revisão dos sFv, ver Pluckthun (1994) em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, ed. Rosenburg & Moore (Springer-Verlag, New York), págs. 269-315.

Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas fágicas de anticorpos geradas usando as técnicas descritas em, por exemplo, McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554 (1990) e Patente dos EUA n° 5.514.548. Clackson et al., (1991) Nature 352:624-628, e Marks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597, descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, usando bibliotecas fágicas. As publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (da gama dos nM) por rearranjo de cadeias (Marks et al. (1992) Biol/Technology 10:779-783), assim como a infecção combinatória e recombinação in vivo como estratégia para a construção de bibliotecas fágicas de grande extensão (Waterhouse et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21:2265-2266). 152

Assim, estas técnicas constituem alternativas viáveis às técnicas tradicionais de hibridomas para o isolamento de anticorpos monoclonais.

Foram desenvolvidas diversas técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos derivavam da digestão proteolitica de anticorpos intactos (ver, p.ex., Morimoto et al. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) e Brennan et al. (1985) Science 229:81) . No entanto, estes fragmentos podem agora ser directamente produzidos por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir das bibliotecas fágicas de anticorpos acima referidas. Alternativamente, podem recuperar-se fragmentos Fab'-SH directamente a partir de E. coli, os quais podem ser quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167). De acordo com outra abordagem, os fragmentos F(ab')2 poderão ser isolados directamente a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos tornar-se-ão evidentes para o técnico experimentado.

Os anticorpos com utilidade para os métodos da presente invenção incluem os anticorpos antagonista anti-CD40 tais como os anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 aqui expostos, que diferem nas regiões não-CDR; e anticorpos com uma ou mais adição (ões), delecção (ões) ou substituição(ões) de aminoácidos. A invenção abrange ainda os anticorpos antagonistas anti-CD40 desimunizados (humanizados), que podem ser produzidos tal como descrito em, por exemplo, as Publicações Internacionais nos. WO 98/52976 e WO 00/34317. Deste modo, os residuos dos anticorpos úteis na prática dos métodos aqui revelados são modificados de modo a tornar os anticorpos não imunogénicos ou menos imunogénicos para os 153 seres humanos, mantendo no entanto a sua especificidade de ligação e a sua actividade biológica, sendo tal actividade medida através dos ensaios apontados em outro local desta descrição. São também abrangidas pelo âmbito destas reivindicações as proteínas de fusão que compreendem os anticorpos antagonistas anti-CD40 da invenção, ou um seu fragmento, podendo estas proteínas de fusão ser sintetizadas ou expressas a partir dos vectores polinucleotídicos correspondentes, tal como é já conhecido neste campo técnico. Tais proteínas de fusão estão descritas em referência à conjugação de anticorpos, tal como se refere mais adiante.

Os anticorpos úteis na prática dos métodos aqui revelados poderão apresentar variações de sequência que são produzidas usando os métodos descritos em, por exemplo, as Publicações de Patentes nos. EP 0 983 303 Al, WO 00/34317 e WO 98/52976.

Por exemplo, foi já demonstrado que as sequências contidas na CDR podem fazer com que um anticorpo se ligue às moléculas de classe II do MHC e desencadeie uma resposta indesejada por parte das células T helper. Uma substituição conservativa permitirá que o anticorpo retenha a actividade de ligação mas perca a capacidade de desencadear uma resposta indesejada por parte das células T helper. Quaisquer destas substituições, conservativas ou não conservativas, podem ser efectuadas usando métodos conhecidos da técnica, tais como os métodos referidos em outro local desta descrição, e os anticorpos obtidos estarão abrangidos pelo âmbito desta invenção. Os anticorpos variantes podem ser testados por métodos de rotina quanto à sua actividade antagonista, afinidade e especificidade usando os métodos aqui descritos.

Um anticorpo antagonista anti-CD40 produzido por quaisquer dos métodos referidos anteriormente, ou por qualquer outro método não referido nesta descrição, encontra-se abrangido pela presente invenção se possuir as seguintes actividades 154 biológicas: inibição da secreção de imunoglobulinas pelas células B periféricas humanas normais estimuladas por células T; inibição da proliferação das células B periféricas humanas normais estimuladas por células T Jurkat; inibição da proliferação das células B periféricas humanas normais estimuladas por células que expressam CD40L ou por CD40 solúvel; e inibição da proliferação de células B humanas malignas, tal como abaixo referido.

Ver igualmente os ensaios descritos em Schultze et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:8200-8204; Denton et al. (1998) Pediatr. Transplant. 2:6-15; Evans et al. (2000) J.

Immunol. 164:688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17-22; Lederman et al. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86;

Coligan et al. (1991) Current Protocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom et al. (1993) Immunology 79:439-444; e as Patentes dos EUA nos. 5.674.492 e 5.847.082.

Um ensaio representativo para a detecção de anticorpos antagonistas anti-CD40 específicos para os epitopos do antigénio CD40 aqui identificados é designado por "ensaio de ligação competitiva". Os ensaios de ligação competitiva são ensaios serológicos nos quais os anticorpos desconhecidos são detectados e quantificados em função da sua capacidade para inibir a ligação de um ligando marcado conhecido ao seu anticorpo específico. Estes ensaios são também referidos como ensaios de inibição competitiva. Num ensaio de ligação competitiva representativo, o polipéptido CD40 marcado é precipitado por anticorpos candidatos numa amostra, por exemplo, em combinação com anticorpos monoclonais dirigidos contra um ou mais epitopos dos anticorpos monoclonais da invenção. Os anticorpos anti-CD40 que reagem especificamente contra um epitopo de interesse podem ser identificados através do rastreio de uma série de anticorpos preparados contra uma proteína CD40 ou um fragmento da proteína que compreende o 155 epitopo particular da proteína CD40 de interesse. Por exemplo, para o CD40 humano, os epitopos de interesse incluem epitopos que compreendem resíduos de aminoácidos lineares e/ou não

lineares da isoforma curta do CD40 humano (ver o N° de Acesso Genbank NP_690593) apresentada na Figura 4B (SEQ ID NO:10), codificada pela sequência apresentada na Figura 4A (SEQ ID

NO: 9; ver também o N° de Acesso Genbank NM_152854) , ou da isoforma longa do CD40 humano (ver os Nos. de Acesso Genbank CAA43045 e NP_001241) apresentada na Figura 4D (SEQ ID NO:12), codificada pela sequência apresentada na Figura 4C (SEQ ID NO:ll; ver os Nos. de Acesso Genbank X60592 e NM_001250). Alternativamente, poderão usar-se ensaios de ligação competitiva com anticorpos antagonistas anti-CD40 adequados e previamente identificados com o fim de seleccionar anticorpos monoclonais comparáveis aos anticorpos previamente identificados.

Quaisquer dos anticorpos antagonistas anti-CD40 anteriormente descritos ou (seus fragmentos de ligação ao antigénio) podem ser conjugados antes de serem utilizados nos métodos desta invenção. Os métodos para a produção de anticorpos conjugados são conhecidos neste campo técnico. Assim, o anticorpo anti-CD40 pode ser marcado usando uma marcação indirecta ou uma abordagem de marcação indirecta. Por "marcação indirecta" ou "abordagem de marcação indirecta" pretende-se indicar gue um agente guelante está covalentemente ligado a um anticorpo e gue pelo menos um radionuclido é inserido no agente guelante. Ver, por exemplo, os agentes quelantes e os radionuclidos descritos em Srivastava e Mease (1991) Nucl. Med. Bio. 18:589-603.

Os marcadores adequados incluem fluoróforos, cromóforos, 32 125 átomos radioactivos (particularmente P e I), reagentes densos aos electrões, enzimas e ligandos gue possuem parceiros de ligação específica. Os enzimas são tipicamente detectados 156 através da sua actividade. Por exemplo, a peroxidase de rábano (HRP) é geralmente detectada através da sua capacidade para converter a 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) em um pigmento azul, quantificável com um espectrofotómetro. O termo "parceiro de ligação especifica" refere-se a uma proteína que tem a capacidade de se ligar a uma molécula de ligando com uma elevada especificidade, como por exemplo no caso de um antigénio e de um anticorpo monoclonal específico para este. Outros parceiros de ligação específica incluem a biotina e a avidina ou a estreptavidina, IgG e proteína A, e os numerosos pares de receptor-ligando conhecidos da técnica. Deve notar-se que a descrição acima não pretende categorizar os diferentes marcadores em classes distintas, uma vez que o mesmo marcador 125 pode funcionar de diversos modos. Por exemplo, ο I pode servir como marcador radioactivo ou como um reagente denso aos electrões, e a HRP poderá funcionar como uma enzima ou como um antigénio para um mAb. Ainda, podem combinar-se vários marcadores para obter o efeito desejado. Por exemplo, os mAbs e a avidina requerem também marcadores para a colocação em prática desta invenção; assim, poder-se-á marcar um mAb com 125 biotina e detectar a sua presença com avidina marcada com I, ou com um mAb anti-biotina marcado com HRP. Outras permutas e possibilidades se tornarão evidentes a um técnico de perícia média neste campo, sendo consideradas como equivalentes no âmbito da presente invenção.

Alternativamente, o anticorpo anti-CD40 pode ser marcado usando uma "marcação directa" ou uma "abordagem de marcação directa", em que um radionuclido é covalentemente ligado directamente a um anticorpo (tipicamente através de um resíduo de aminoácido) . Os radionuclidos preferidos são indicados em Srivastava e Mease (1991), supra. A abordagem de marcação indirecta é particularmente preferida. Ver também, por 157 exemplo, as Publicações Internacionais Nos. WO 00/52031 e WO 00/52473, em que é usado um linker para ligar um marcador radioactivo a anticorpos; e as formas marcadas de anticorpos descritas na Patente dos EUA n° 6.015.542.

Adicionalmente, um anticorpo (ou um seu fragmento) pode ser conjugado com uma porção molecular terapêutica tal como uma citotoxina, um agente terapêutico ou um ião metálico radioactivo ou radioisótopo. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é lesivo para as células. Os exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticóides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol, e purimicina e seus análogos ou homólogos. Os agentes terapêuticos incluem, de modo não limitativo, antimetabolitos (p.ex., fludarabina, 2-clorodesoxiadenosina (cladribina), metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, dacarbazina, 5-fluorouracilo), agentes alquilantes (p.ex., mecloretamina, tiotepa, clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina-platina (II) (DDP)cisplatina), antraciclinas (p.ex., daunorubicina (anteriormente daunomicina) e doxorubicina), antibióticos (p.ex., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)), e agentes anti-mitóticos (p.ex., vincristina e vinblastina). Os radioisótopos incluem, de modo não limitativo, 1-131, 1-123, 1-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111 e semelhantes. Os conjugados da invenção podem ser usados para modificar uma dada resposta biológica; a porção 158 molecular de fármaco não deve ser tomada como limitada aos agentes quimioterápicos clássicos. Por exemplo, a porção molecular de fármaco pode ser uma proteína ou polipéptido possuindo uma actividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina tal como a abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas ou toxina da difteria; uma proteína tal como o factor de necrose tumoral, interferão alfa, interferão beta, factor de crescimento dos nervos, factor de crescimento derivado das plaquetas, activador do plasminogénio tecidular; ou modificadores da resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-β ("IL-6"), factor estimulador das colónias de granulócitos/macrófagos ("GM-CSF"), factor estimulador das colónias de granulócitos ("G-CSF"), ou outros factores de crescimento.

As técnicas para a conjugação de tais porções moleculares terapêuticas com anticorpos são bem conhecidas. Ver, por exemplo, Arnon et al. (1985) "Monoclonal Antibodies for

Immunotargeting of Drugs in Câncer Therapy", em "Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), págs. 243-256; ed. Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2a ed.; Mareei Dekker, Inc.), págs. 623- 653; Thorpe (1985), "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Câncer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinicai Applications, ed. Pinchera et al., págs. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Itália, 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies for Câncer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), págs. 303-316; e Thorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62:119-158. 159

Alternativamente, um anticorpo pode ser conjugado com um segundo anticorpo para formar um heteroconjugado de anticorpo, tal como descrito na Patente dos EUA N° 4.67 6.980. Adicionalmente, poderão usar-se linkers entre os marcadores e os anticorpos da invenção (ver a Patente dos EUA N° 4.831.175). Os anticorpos, ou os seus fragmentos de ligação ao antigénio, poderão ser directamente marcados com iodo radioactivo, indio, itrio ou outra partícula radioactiva conhecida neste campo técnico (Patente dos EUA N° 5.595.721). O tratamento poderá consistir numa combinação do tratamento com anticorpos conjugados e não conjugados administrados simultaneamente ou sequencialmente por qualquer ordem, no mesmo dia ou em dias diferentes (WO 00/52031 e WO 00/52473).

Variantes biologicamente activas de anticorpos antagonistas anti-CD40. As composições farmacêuticas úteis para os métodos aqui descritos podem compreender variantes biologicamente activas dos anticorpos antagonistas anti-CD40 da invenção. Tais variantes retêm a actividade biológica desejada do polipéptido nativo, de tal modo que a composição farmacêutica que compreende o polipéptido variante possui o mesmo efeito terapêutico que a composição farmacêutica que compreende o polipéptido nativo quando administrada a um indivíduo. Isto é, o anticorpo variante anti-CD40 funciona como um componente terapeuticamente activo na composição farmacêutica de um modo semelhante ao observado com o anticorpo antagonista nativo, por exemplo CHIR-5.9 ou CHIR-12.12, expressos pelas linhas celulares de hibridoma 5.9 ou 12.12, respectivamente. Encontram-se disponíveis neste campo técnico diversos métodos para determinar se um anticorpo variante anti-CD40 retém a actividade biológica desejada e se, deste modo, pode servir como agente terapeuticamente activo na composição farmacêutica. A actividade biológica das variantes de 160 anticorpos pode ser medida usando ensaios especificamente concebidos para a medição da actividade do anticorpo antagonista nativo, incluindo os ensaios aqui descritos. As variantes biologicamente activas adequadas dos anticorpos antagonistas anti-CD40 reterão as propriedades de ligação desejadas do anticorpo progenitor, i.e., do anticorpo antagonista anti-CD40 progenitor. Os métodos para a produção de variantes de anticorpos estão bastante difundidos neste campo técnico.

Por exemplo, podem preparar-se variantes de sequências de aminoácidos de um anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, os anticorpos monoclonais CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 aqui descritos, efectuando os métodos de mutagénese e alteração de sequências nucleotidicas que são descritos em outro lugar desta descrição em relação à IL-2. Ver, por exemplo, Walker e Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154:367-382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York); Patente dos EUA N° 4.873.192; e as referências ai citadas.

Podem encontrar-se orientações sobre substituições apropriadas de aminoácidos que não afectam a actividade biológica do polipéptido de interesse no modelo de Dayhoff et al. (1978), em Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.). As substituições conservativas, tais como a troca de um aminoácido por outro com propriedades semelhantes, poderão ser preferidas. Os exemplos de substituições conservativas incluem, de modo não limitativo, GlyOAla, ValoileOLeu, AspOGlu, LysOArg, AsnOGln, e PheOTrpOTyr.

De forma semelhante ao verificado com as variantes de IL-2, as variantes de anticorpo antagonista anti-CD40 são 161 produzidas de modo a que as variantes continuem a possuir a actividade desejada, i.e., uma afinidade de ligação semelhante, a capacidade de se ligar especificamente a um antigénio CD40 expresso à superfície de uma célula humana, respectivamente, e no caso do anti-CD40, a ausência de actividade agonista significativa, exibindo por outro lado actividade antagonista quando em ligação a um antigénio CD40 numa célula humana que expressa CD40. Da mesma forma que com as variantes de IL-2, quaisquer mutações efectuadas no DNA codificando para o polipéptido variante anti-CD40 não devem colocar a sequência fora do molde de leitura e, preferencialmente, não criarão regiões complementares que poderiam produzir uma estrutura secundária de mRNA. Ver a Publicação do Pedido de Patente EP N° 75.444.

Preferencialmente, as variantes de um anticorpo antagonista anti-CD40 possuem sequências de aminoácidos que têm pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80% de identidade de sequência, mais preferencialmente cerca de 90% a 95% ou mais, e mais preferencialmente pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da molécula de polipéptido de referência que serve como base de comparação (por exemplo uma molécula de referência de anticorpo antagonista anti-CD40, tal como os anticorpos monoclonais CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 aqui descritos), ou com uma porção mais curta da molécula do anticorpo de referência.

Para os fins da presente invenção, a percentagem de identidade de sequência para os anticorpos antagonistas anti-CD40 é determinada da forma descrita para a IL-2. Assim, a percentagem da identidade de sequência é determinada usando o algoritmo de busca de homologias de Smith-Waterman, usando uma análise de espaçamentos (gaps) com os parâmetros de gap open penalty de 12 e gap extension penalty de 2, matriz BLOSUM de 162 62. Uma variante poderá, por exemplo, diferir do anticorpo antagonista anti-CD40 de referência em apenas 1 a 15 residuos de aminoácidos ou apenas 1 a 10 residuos de aminoácidos, tal como apenas 6-10, apenas 5, apenas 4, 3, 2, ou até apenas 1 residuo de aminoácido.

Tal como previamente descrito em outro local desta descrição, no que diz respeito ao alinhamento óptimo de duas sequências de aminoácidos, o segmento contiguo da sequência variante de aminoácidos poderá ter residuos adicionais de aminoácidos ou ter sofrido uma delecção de residuos de aminoácidos relativamente à sequência de aminoácidos de referência, por exemplo os anticorpos CHIR-12.12 e CHIR-5.9. O segmento contiguo usado para comparação com a sequência de aminoácidos de referência incluirá pelo menos 20 residuos de aminoácidos contíguos, podendo corresponder a 30, 40, 50 ou mais resíduos de aminoácidos. Podem estabelecer-se correcções quanto à identidade de sequência associadas às substituições conservativas de resíduos ou a espaçamentos na sequência (ver o algoritmo de busca de homologias de Smith-Waterman).

Tal como acontece em relação a IL-2, a estrutura química precisa de um polipéptido que tem a capacidade de se ligar especificamente ao CD40 e de reter a actividade antagonista, particularmente quando ligado ao antigénio em células B malignas, depende de diversos factores. Uma vez que se encontram presentes na molécula grupos amino e carboxilo ionizáveis, poderá obter-se um polipéptido particular sob a forma de sal acídico ou básico, ou na forma neutra. Todas as preparações deste tipo que retenham a sua actividade biológica quando colocadas em condições ambientais adequadas são incluídas na definição de anticorpos antagonistas anti-CD40, tal como aqui é usada. Ainda, a sequência primária de aminoácidos do polipéptido poderá ser aumentada por derivatização usando porções moleculares de açúcar 163 (glicosilação) ou outras moléculas suplementares tais como lipidos, fosfato, grupos acetilo e semelhantes. A sequência poderá ainda ser aumentada por conjugação com sacáridos. Certos aspectos de tal aumento são atingidos através dos sistemas de processamento pós-tradução do hospedeiro produtor; outras modificações poderão ser introduzidas in vitro. Em qualquer caso, tais modificações são incluídas na definição de um anticorpo anti-CD40 tal como aqui é usada, com a ressalva de que as propriedades de ligação do anticorpo anti-CD40 (incluindo a actividade antagonista) não sejam destruídas. Será de esperar que tais modificações possam afectar quantitativa ou qualitativamente a actividade, aumentando ou reduzindo a actividade do polipéptido, nos diversos ensaios. Ainda, os resíduos individuais de aminoácidos na cadeia poderão ser modificados por oxidação, redução ou outra derivatização, e o polipéptido poderá ser submetido a corte para obter fragmentos que retêm a actividade. Tais alterações que não destroem a actividade desejável do anticorpo não modificado não afastam a sequência polipeptídica da definição de anticorpos anti-CD40 de interesse, tal como esta é aqui usada.

Como previamente referido, os desenvolvimentos técnicos neste campo fornecem orientações substanciais relativas à preparação e uso de variantes polipeptidicas. Na preparação de variantes dos anticorpos, um perito na técnica poderá prontamente determinar as modificações da sequência de nucleótidos ou da sequência de aminoácidos da proteina nativa que resultarão numa variante adequada para uso como um componente terapeuticamente activo de uma composição farmacêutica a utilizar em associação aos métodos aqui expostos. 164

Formulações farmacêuticas de anticorpos antagonistas anti-CD40.Os anticorpos antagonistas anti-CD40 desta invenção são administrados a uma concentração que é terapeuticamente eficaz para evitar ou tratar a leucemia linfocitica crónica. Para atingir este objectivo, os anticorpos poderão ser formulados usando uma variedade de excipientes aceitáveis conhecidos da técnica. Tipicamente, os anticorpos são administrados por injecção, por exemplo intravenosa, intraperitoneal ou subcutânea. Os métodos para realizar esta administração são conhecidos dos técnicos de perícia média. É igualmente possível obter composições que podem ser administradas por via tópica ou oral, ou que podem ser transmitidas através de membranas mucosas.

Uma composição farmacêutica da invenção é formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Os exemplos de vias de administração possíveis incluem a administração parentérica (p.ex., intravenosa (IV), intramuscular (IM), intradérmica, subcutânea (SC) ou infusão), oral e pulmonar (p.ex., inalação), nasal, transdérmica (tópica), transmucosa e rectal. As soluções ou suspensões usadas para aplicação parentérica, intradérmica ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril como a água para injecção, soro fisiológico, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tais como álcool benzilico ou metilparabenos; antioxidantes como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes como o ácido etilenodiaminatetraacético; tampões como os acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose. 0 pH pode ser ajustado com ácidos e bases, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parentérica pode ser armazenada em 165 ampolas, seringas descartáveis ou frascos multidose de vidro ou de plástico.

Os anticorpos são tipicamente fornecidos por técnicas padronizadas num veiculo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, soro fisiológico estéril, água tamponada estéril, propilenoglicol, combinações dos anteriores, etc. O anticorpo antagonista anti-CD40 (ou um seu fragmento de ligação ao antigénio) pode ser formulado em composições farmacêuticas separadas ou pode ser formulado numa composição farmacêutica única com IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa para uma admnistração simultânea. Os métodos de preparação dos agentes administráveis por via parentérica estão descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences (18a Ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990). Ver também, por exemplo, WO 98/56418, que descreve as formulações farmacêuticas estabilizadas de anticorpos adequadas para uso em associação aos métodos aqui descritos.

Os anticorpos antagonistas anti-CD40 ou os seus fragmentos de ligação ao antigénio presentes nas composições farmacêuticas aqui descritas e destinados a uso com os métodos aqui expostos poderão ser nativos ou obtidos por técnicas recombinantes, e poderão advir de qualquer fonte, incluindo fontes de mamiferos tais como, p.ex., ratinho, rato, coelho, primata, porco e humano. Preferencialmente, tais polipéptidos derivam de uma fonte humana, e mais preferencialmente são proteínas humanas recombinantes derivadas de linhas celulares de hibridoma.

Qualquer composição farmacêutica que compreenda um anticorpo antagonista anti-CD40, ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, possuindo as caracteristicas de ligação aqui descritas como componente terapeuticamente activo pode ser usada com os métodos aqui descritos. Assim, podem preparar-se composições liquidas, liofilizadas ou secas em spray 166 compreendendo um ou mais anticorpos antagonistas anti-CD40 da invenção, ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, sob a forma de uma solução ou suspensão aquosa ou não aquosa para administração subsequente a um indivíduo de acordo com os métodos aqui expostos. Cada uma destas composições compreenderá pelo menos um dos anticorpos antagonistas anti-CD40 da presente invenção, ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, como componente terapeuticamente ou profilacticamente activo. Por "componente terapeuticamente ou profilacticamente activo" pretende-se indicar que o anticorpo anti-CD40, ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, é especificamente incorporado na composição para produzir uma resposta terapêutica ou profiláctica desejada no que diz respeito ao tratamento, prevenção ou diagnóstico de uma doença ou distúrbio num indivíduo quando a composição farmacêutica é administrada a esse indivíduo. De preferência, as composições farmacêuticas compreendem os apropriados agentes estabilizantes, agentes formadores de volume ou ambos, para minimizar os problemas associados à perda de estabilidade e de actividade biológica das proteínas durante a preparação e armazenagem.

Poderão adicionar-se agentes de formulação às composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo antagonista anti-CD40 da invenção, ou o seu fragmento de ligação ao antigénio. Estes agentes de formulação poderão incluir, de modo não limitativo, óleos, polímeros, vitaminas, hidratos de carbono, aminoácidos, sais, tampões, albumina, surfactantes ou agentes formadores de volume. Preferencialmente, os hidratos de carbono incluem açúcares ou açúcares alcoólicos como os mono-, di- ou polisacáridos, ou glucanos solúveis em água. Os sacáridos ou glucanos podem incluir frutose, glucose, manose, sorbose, xilose, maltose, sacarose, dextrano, pululano, dextrina, α e β-ciclodextrina, amido solúvel, hidroxietilamido 167 "açúcar e carboximetilcelulose, ou suas misturas. O termo alcoólico" é definido como um hidrocarboneto C4 a C8 possuindo um grupo hidroxilo, e inclui galactitol, inositol, manitol, xilitol, sorbitol, glicerol e arabitol. Estes açúcares ou açúcares alcoólicos podem ser usados individualmente ou em combinação. A concentração de açúcar ou de açúcar alcoólico encontra-se entre 1,0% e 7% p/v, mais preferencialmente entre 2,0% e 6,0% p/v. De preferência, os aminoácidos incluem as formas levógiras (L) da carnitina, arginina e betaína; no entanto, poderão adicionar-se outros aminoácidos. Os polímeros preferidos incluem polivinilpirrolidona (PVP) com um peso molecular médio entre 2.000 e 3.000, ou polietilenoglicol (PEG) com um peso molecular médio entre 3.000 e 5.000. Os surfactantes que podem ser adicionados à formulação são expostos nas EP nos. 270.799 e 268.110.

Adicionalmente, os anticorpos podem ser quimicamente modificados por conjugação covalente com um polímero para aumentar a sua semi-vida circulante, por exemplo. Os polímeros preferidos, e os métodos para os conjugar com péptidos, são expostos nas Patentes dos EUA Nos. 4.766.106/ 4.179.337/ 4.495.285/ e 4.609.546. Os polímeros preferidos são os polióis polioxietilados e o polietilenoglicol (PEG). O PEG é solúvel em água à temperatura ambiente e possui a fórmula geral de R(0-CH —CHO ) 0--R em que R pode ser hidrogénio ou um grupo 2 2 n protector tal como um grupo alquilo ou alcanol. De preferência, o grupo protector possui entre 1 e 8 átomos de carbono, correspondendo mais preferencialmente a metilo. O símbolo n é um número inteiro positivo, preferencialmente entre 1 e 1.000, mais preferencialmente entre 2 e 500. O PEG possui um peso molecular médio preferido de entre 1.000 a 40.000, mais preferencialmente entre 2.000 e 20.000 e ainda mais preferencialmente entre 3.000 e 12.000. De preferência, o PEG possui pelo menos um grupo hidroxi, correspondendo este 168 mais preferencialmente a um grupo hidroxi terminal. É este grupo hidroxi que é preferencialmente activado para reagir com um grupo amino livre do inibidor. No entanto, deve notar-se que o tipo e quantidade dos grupos reactivos pode fazer-se variar de modo a se obter um conjugado covalente de PEG/anticorpo da presente invenção.

Os polióis polioxietilados solúveis em água são também úteis para a presente invenção. Estes incluem sorbitol polioxietilado, glucose polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG), e semelhantes. É preferido o POG. Uma das razões para tal é a de que a estrutura principal de glicerol do glicerol polioxietilado é a mesma estrutura principal que ocorre naturalmente em, por exemplo, os mono-, di- e triglicéridos dos animais e dos seres humanos. Deste modo, esta ramificação não corresponderá necessariamente à introdução de um agente estranho no organismo. 0 POG possui um peso molecular preferido na mesma gama que o PEG. A estrutura do POG é apresentada em Knauf et al. (1988) J. Bio. Chem. 263:15064-15070, e é encontrada uma exposição sobre conjugados de POG/IL-2 na Patente dos EUA N° 4.766.106.

Um outro sistema de administração de fármacos destinado a aumentar a semi-vida de circulação é o lipossoma. Os métodos de preparação dos sistemas de administração com lipossomas são expostos em Gabizon et al. (1982) Câncer Research 42:4734/ Cafiso (1981) Biochem Biophys Acta 649:129; e Szoka (1980) Ann. Rev. Biophys. Eng. 9:467. Existem outros sistemas de administração de fármacos bem conhecidos neste campo técnico que se encontram descritos em, p.ex., Poznansky et al. (1980)

Drug Delivery Systems (R.L. Juliano, ed., Oxford, N.Y.) págs. 253-315; Poznansky (1984) Pharm Revs 36:277.

Os agentes de formulação a incorporar numa composição farmacêutica deverão proporcionar estabilidade ao anticorpo antagonista anti-CD40 ou ao seu fragmento de ligação ao 169 antigénio. Isto é, o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio deverão reter a sua estabilidade física e/ou química e possuir a actividade biológica desejada, i.e., uma ou mais das actividades antagonistas aqui anteriormente definidas, incluindo, de modo não limitativo, a inibição da secreção de imunoglobulinas pelas células B periféricas humanas normais estimuladas por células T; inibição da sobrevivência e/ou proliferação das células B periféricas humanas normais estimuladas por células T Jurkat; inibição da sobrevivência e/ou proliferação das células B periféricas humanas normais estimuladas por células que expressam CD40L ou pelo ligando de CD40 solúvel (sCD40L); inibição dos sinais intracelulares anti-apoptóticos de "sobrevivência" em qualquer célula estimulada por sCD40L ou por CD40L em fase sólida; inibição da transdução de sinal por CD40 em qualquer célula em consequência da ligação ao sCD40L ou ao CD40L em fase sólida; e inibição da proliferação de células B humanas malignas, tal como já referido em outro local desta descrição.

Os métodos para a monitorização da estabilidade das proteínas são bem conhecidos da técnica. Ver, por exemplo, Jones (1993) Adv Drug Delivery Rev. 10:29-90; Lee, ed. (1991) Peptide and Protein Drug Delivery (Mareei Dekker, Inc., New York, New York); e os ensaios de estabilidade abaixo descritos. Geralmente, a estabilidade da proteína é medida a uma temperatura escolhida durante um período especificado de tempo. Em formas de realização preferidas, uma formulação farmacêutica estável de anticorpos proporciona estabilidade ao anticorpo antagonista anti-CD40 ou ao seu fragmento de ligação ao antigénio quando armazenada à temperatura ambiente (a cerca de 25°C) durante pelo menos 1 mês, pelo menos três meses ou pelo menos 6 meses, e/ou é estável a cerca de 2-8°C durante 170 pelo menos 6 meses, pelo menos 9 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses, pelo menos 24 meses.

Uma proteína tal como um anticorpo, quando formulada numa composição farmacêutica, é considerada como retendo a sua estabilidade física num dado ponto de tempo se não evidenciar sinais visuais (i.e ., descoloração ou perda de limpidez) ou sinais mensuráveis (por exemplo, usando a cromatografia de exclusão molecular (SEC) ou a dispersão da luz UV) de precipitação, agregação e/ou desnaturação naquela composição farmacêutica. Em relação à estabilidade química, uma proteína tal como um anticorpo, quando formulada numa composição farmacêutica, é considerada como retendo a sua estabilidade química num dado ponto de tempo se as medições de estabilidade química forem indicativas de que a proteína (i.e., o anticorpo) retém a actividade biológica de interesse naquela composição farmacêutica. Os métodos para monitorização de alterações da estabilidade química são bem conhecidos da técnica e incluem, de modo não limitativo, métodos para a detecção de formas quimicamente alteradas da proteína como as que resultam de cortes de ligações, usando, por exemplo, SDS-PAGE, SEC e/ou espectrometria MALDI/TOF; e a degradação associada a alterações da carga molecular (por exemplo, associada à desamidação) , usando, por exemplo, a cromatografia de troca iónica. Ver, por exemplo, os métodos abaixo expostos.

Um anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, quando formulado numa composição farmacêutica, é considerado como retendo uma actividade biológica desejada a um dado ponto de tempo se a actividade biológica desejada àquele tempo diferir em não mais do que cerca de 30%, preferencialmente em não mais do que cerca de 20% da actividade biológica desejada exibida na altura em que a composição farmacêutica foi preparada, tal como determinado por um ensaio adequado para a actividade biológica desejada. 171

Os ensaios para a medição da actividade biológica desejada dos anticorpos antagonistas anti-CD40 aqui apresentados, e dos seus fragmentos de ligação ao antigénio, podem ser efectuados tal como descrito nos Exemplos. Ver igualmente os ensaios descritos em Schultze et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:8200-8204; Denton et al. (1998) Pediatr. Transplant. 2:6-15; Evans et al. (2000) J. Immunol. 164:688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17-22; Lederman et al. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86; Coligan et al. (1991) Current Protocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom et al. (1993) Immunology 79:439-444; e as Patentes dos EUA Nos. 5.674.492 e 5.847.082 .

Em algumas formas de realização desta invenção, o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, é formulado numa formulação farmacêutica liquida. O anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio pode ser preparado usando qualquer método conhecido neste campo, incluindo os métodos expostos acima. Em uma das formas de realização, o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio é produzido por via recombinante numa linha celular CHO.

No seguimento da sua preparação e purificação, o anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio pode ser formulado como uma formulação farmacêutica liquida do modo aqui exposto. Quando o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio se destina a ser armazenado antes da sua formulação, este poderá ser congelado, por exemplo, a ^-20°C, sendo depois descongelado à temperatura ambiente para se proceder à formulação. A formulação farmacêutica liquida compreende uma 172 quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio. A quantidade de anticorpo ou do fragmento de ligação ao antigénio presente na formulação tem em consideração a via de administração e o volume da dose desejado.

Deste modo, a composição farmacêutica liquida compreende o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio numa concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 50.0 mg/ml, cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 40,0 mg/ml, cerca de 1.0 mg/ml a cerca de 30,0 mg/ml, cerca de 5,0 mg/ml a cerca de 25.0 mg/ml, cerca de 5,0 mg/ml a cerca de 20,0 mg/ml, ou cerca de 15,0 mg/ml a cerca de 25,0 mg/ml. Em algumas formas de realização, a composição farmacêutica liquida compreende o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio a uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 5,0 mg/ml, cerca de 5,0 mg/ml a cerca de 10,0 mg/ml, cerca de 10,0 mg/ml a cerca de 15,0 mg/ml, cerca de 15,0 mg/ml a cerca de 20,0 mg/ml, cerca de 20,0 mg/ml a cerca de 25,0 mg/ml, cerca de 25,0 mg/ml a cerca de 30,0 mg/ml, cerca de 30.0 mg/ml a cerca de 35,0 mg/ml, cerca de 35,0 mg/ml a cerca de 40,0 mg/ml, cerca de 40,0 mg/ml a cerca de 45,0 mg/ml, ou cerca de 45,0 mg/ml a cerca de 50,0 mg/ml. Em outras formas de realização, a composição farmacêutica liquida compreende o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio numa concentração de cerca de 15,0 mg/ml, cerca de 16,0 mg/ml, cerca de 17,0 mg/ml, cerca de 18,0 mg/ml, cerca de 19,0 mg/ml, cerca de 20,0 mg/ml, cerca de 21,0 mg/ml, cerca de 22,0 mg/ml, cerca de 23,0 mg/ml, cerca de 24,0 mg/ml ou cerca de 25,0 mg/ml. A composição farmacêutica liquida compreende o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, e um tampão que mantém o pH da formulação dentro 173 do intervalo de pH de cerca de 5,0 a cerca de 7,0, incluindo o pH de cerca de 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5, 8, 5, 9, 6,0, 6, 1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0 e outros valores dentro do intervalo de pH de cerca de 5,0 a cerca de 7,0 . Em algumas formas de realização, o tampão mantém ο ρΗ da formulação no intervalo de pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,5, cerca de 5,0 a cerca de 6,0, cerca de 5,0 a cerca de 5,5, cerca de 5,5 a cerca de 7,0, cerca de 5,5 a cerca de 6,5 ou cerca de 5,5 a cerca de 6,0.

Qualquer tampão adequado que mantenha o pH da formulação líquida de anticorpo anti-CD40 no intervalo de pH de cerca de 5,0 a cerca de 7,0 pode ser usado na formulação, desde que a estabilidade fisico-química e a actividade biológica desejada do anticorpo sejam mantidas, tal como acima se fez notar. Os tampões adequados incluem, de modo não limitativo, ácidos convencionais e os seus sais, podendo o contra-ião corresponder a, por exemplo, sódio, potássio, amónio, cálcio ou magnésio. Os exemplos de ácidos convencionais e dos seus sais que podem ser usados para tamponar a formulação farmacêutica líquida incluem, de modo não limitativo, os tampões de ácido succínico ou succinato, ácido cítrico ou citrato, ácido acético ou acetato, ácido tartárico ou tartarato, ácido fosfórico ou fosfato, ácido glucónico ou gluconato, ácido glutâmico ou glutamato, ácido aspártico ou aspartato, ácido maleico ou maleato, e ácido málico ou malato. A concentração de tampão na formulação pode corresponder a cerca de 1 mM a cerca de 50 mM, incluindo cerca de 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM ou outros valores dentro do intervalo de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM. Em algumas formas de realização, a concentração de tampão na formulação está entre cerca de 5 mM e cerca de 15 mM, incluindo cerca de 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 174 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mm, 13 mM, 14 mM, 15 mM ou outros valores dentro do intervalo de cerca de 5 mM a cerca de 15 mM.

Em algumas formas de realização da invenção, a formulação farmacêutica liquida compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, e um tampão de succinato ou de citrato a uma concentração que mantém o pH da formulação no intervalo de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, preferencialmente de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,5. Por "tampão de succinato" ou "tampão de citrato" pretende-se indicar um tampão que compreende um sal de ácido succinico ou um sal de ácido cítrico, respectivamente. Numa forma de realização preferida, o contra-ião do succinato ou do citrato é o catião de sódio, e deste modo o tampão corresponde a succinato de sódio ou a citrato de sódio, respectivamente. No entanto, é de esperar que qualquer catião seja eficaz. Outros catiões possíveis para o succinato ou para o citrato incluem, de modo não limitativo, potássio, amónio, cálcio e magnésio. Tal como acima se fez notar, a concentração de tampão succinato ou citrato na formulação pode variar entre cerca de 1 mM e cerca de 50 mM, incluindo cerca de 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 MM ou outros valores dentro do intervalo de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM. Em algumas formas de realização, a concentração de tampão na formulação encontra-se no intervalo de cerca de 5 mM a cerca de 15 mM, incluindo cerca de 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM ou cerca de 15 mM. Em outras formas de realização, a formulação farmacêutica líquida compreende o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, a uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 50,0 mg/ml, ou 175 cerca de 5,0 mg/ml a cerca de 25,0 mg/ml e tampão de succinato ou de citrato, por exemplo, tampão de succinato de sódio ou de citrato de sódio, a uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 20 mM, ou cerca de 5 mM a cerca de 15 mM, preferencialmente cerca de 10 mM.

Nos casos em que é desejável que a formulação farmacêutica liquida esteja perto da isotonicidade, a formulação farmacêutica liquida compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, e um tampão para manter o pH da formulação no intervalo de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, poderá ainda conter uma porção de um agente isotonicizante que seja suficiente para tornar a formulação praticamente isotónica. Por "praticamente isotónica" pretende-se indicar que a formulação aquosa tem uma osmolaridade de cerca de 240 mmol/kg a cerca de 360 mmol/kg, preferencialmente de cerca de 240 a cerca de 340 mmol/kg, mais preferencialmente de cerca de 250 a cerca de 330 mmol/kg, ainda mais preferencialmente de cerca de 260 a cerca de 320 mmol/kg, e mais preferencialmente ainda de cerca de 270 a cerca de 310 mmol/kg. Os métodos para a determinação da isotonicidade de uma solução são bem conhecidos dos peritos neste campo técnico. Ver, por exemplo, Setnikar et al. (1959) J. Am. Pharm. Assoe. 48:628.

Os peritos na técnica conhecem diversos solutos farmaceuticamente aceitáveis que serão úteis para proporcionar isotonicidade a composições farmacêuticas. O agente isotonicizante poderá corresponder a qualquer reagente que tenha a capacidade de ajustar a pressão osmótica da formulação farmacêutica liquida da presente invenção até um valor que praticamente iguale a de um fluido corporal. Deve utilizar-se um agente isotonicizante que seja fisiologicamente aceitável. 176

Assim, a formulação farmacêutica liquida compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, e um tampão para manter o pH da formulação no intervalo de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, poderá ainda conter componentes destinados a proporcionar isotonicidade, por exemplo, cloreto de sódio; aminoácidos como alanina, valina e glicina; açúcares e açúcares alcoólicos (polióis), incluindo, de modo não limitativo, glucose, dextrose, frutose, sacarose, maltose, manitol, trealose, glicerol, sorbitol e xilitol; ácido acético, outros ácidos orgânicos ou os seus sais, e quantidades relativamente pequenas de citratos ou fosfatos. Um técnico de perícia média conhecerá ainda outros agentes adequados para proporcionar uma tonicidade óptima à formulação líquida.

Em algumas formas de realização preferidas, a formulação farmacêutica líquida compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, e um tampão para manter o pH da formulação no intervalo de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, compreende ainda cloreto de sódio como agente isotonicizante. A concentração de cloreto de sódio na formulação dependerá da contribuição dos outros componentes para a tonicidade. Em algumas formas de realização, a concentração de cloreto de sódio está entre cerca de 50 mM a cerca de 300 mM, cerca de 50 mM a cerca de 250 mM, cerca de 50 mM a cerca de 200 mM, cerca de 50 mM a cerca de 175 mM, cerca de 50 mM a cerca de 150 mM, cerca de 75 mM a cerca de 175 mM, cerca de 75 mM a cerca de 150 mM, cerca de 100 mM a cerca de 175 mM, cerca de 100 mM a cerca de 200 mM, cerca de 100 mM a cerca de 150 mM, cerca de 125 mM a cerca de 175 mM, cerca de 177 125 mM a cerca de 150 mM, cerca de 130 mM a cerca de 170 mM, cerca de 130 mM a cerca de 160 mM, cerca de 135 mM a cerca de 155 mM, cerca de 140 mM a cerca de 155 mM, ou cerca de 145 mM a cerca de 155 mM. Numa destas formas de realização, a concentração de cloreto de sódio é de cerca de 150 mM. Em outras formas de realização semelhantes, a concentração de cloreto de sódio é de cerca de 150 mM, o tampão é succinato de sódio ou citrato de sódio a uma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 15 mM, a formulação farmacêutica liquida compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, e a formulação possui um pH de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,0, ou cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,5. Em outras formas de realização, a formulação farmacêutica liquida compreende o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, a uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 50,0 mg/ml, ou cerca de 5,0 mg/ml a cerca de 25,0 mg/ml, cerca de 150 mM de cloreto de sódio e cerca de 10 mM de succinato de sódio ou de citrato de sódio, a um pH de cerca de 5,5. A degradação de proteinas resultante do ciclo de congelamento e descongelamento ou da fragmentação mecânica durante o processamento das formulações farmacêuticas liquidas desta invenção pode ser inibida pela incorporação de surfactantes na formulação de modo a reduzir a tensão superficial na interface solução-ar. Assim, em algumas formas de realização, a formulação farmacêutica liquida compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, um tampão para manter o pH da formulação dentro do 178 intervalo de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, e ainda um surfactante. Em outras formas de realização, a formulação farmacêutica liquida compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, um tampão para manter o pH da formulação dentro do intervalo de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, um agente isotonicizante como o cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 50 mM a cerca de 300 mM, e ainda um surfactante.

Os surfactantes tipicos utilizados são os surfactantes não iónicos, incluindo os ésteres de polioxietileno-sorbitol tais como o polisorbato 80 (Tween 80) e o polisorbato 20 (Tween 20); ésteres de polioxipropileno-polioxietileno como o Pluronic F68; álcoois polioxietilénicos como o Brij 35; simeticone; polietilenoglicol, tal como PEG400; lisofosfatidilcolina; e polioxietileno-p-t-octilfenol, tal como Triton X-100. O processo clássico de estabilização de composições farmacêuticas através de surfactantes ou de emulsificantes está descrito em, p.ex., Levine et al. (1991) J. Parenteral Sei. Technol. 45(3):160-165. Um surfactante preferido utilizado na prática da presente invenção é o polisorbato 80. Quando a formulação inclui um surfactante, este é tipicamente adicionado numa quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 1,0% (p/v), cerca de 0,001% a cerca de 0,5%, cerca de 0,001% a cerca de 0,4%, cerca de 0,001% a cerca de 0,3%, cerca de 0,001% a cerca de 0,2%, cerca de 0,005% a cerca de 0,5%, cerca de 0,005% a cerca de 0,2%, cerca de 0,01% a cerca de 0,5%, cerca de 0,01% a cerca de 0,2%, cerca de 0,03% a cerca de 0,5%, cerca de 0,03% a cerca de 0,3%, cerca de 0,05% a cerca de 0,5%, ou cerca de 0,05% a cerca de 0,2%.

Assim, em algumas formas de realização, a formulação farmacêutica liquida compreende uma quantidade 179 terapeuticamente eficaz do anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio; o tampão é o succinato de sódio ou o citrato de sódio a uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM, cerca de 5 mM a cerca de 25 mM, ou cerca de 5 mM a cerca de 15 mM; a formulação possui um pH de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,0 ou cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,5; e a formulação compreende ainda um surfactante, por exemplo, polisorbato 80, numa quantidade de cerca de 0,001% até cerca de 1,0% ou de cerca de 0,001% a cerca de 0,5%. Tais formulações poderão também opcionalmente incluir um agente isotonicizante, tal como cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 50 mM a cerca de 300 mM, cerca de 50 mM a cerca de 200 mM, ou cerca de 50 mM a cerca de 150 mM. Em outras formas de realização, a formulação farmacêutica liquida compreende o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, a uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 50,0 mg/ml, ou de cerca de 5,0 mg/ml a cerca de 25,0 mg/ml, incluindo cerca de 20 mg/ml; cerca de 50 mM a cerca de 200 mM de cloreto de sódio, incluindo cerca de 150 mM de cloreto de sódio; succinato de sódio ou citrato de sódio entre cerca de 5 mM a cerca de 20 mM, incluindo cerca de 10 mM de succinato de sódio ou de citrato de sódio; cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 50 mM a cerca de 200 mM, incluindo cerca de 150 mM; e opcionalmente um surfactante, por exemplo, polisorbato 80, numa quantidade de cerca de 0,001% até cerca de 1,0%, incluindo de cerca de 0,001% a cerca de 0,5%; sendo que a formulação farmacêutica liquida tem um pH de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,0, cerca de pH 5,0 a cerca de pH 5,5, cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,5, ou cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,0. 180 A formulação farmacêutica liquida poderá estar essencialmente isenta de conservantes e de outros veículos, excipientes ou estabilizantes tais como os acima referidos. Alternativamente, a formulação poderá conter um ou mais conservantes, por exemplo, agentes antibacterianos, veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes como os acima descritos, desde que estes não afectem adversamente a estabilidade fisico-química do anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio. Os exemplos de veículos, excipientes e estabilizantes adequados incluem, de modo não limitativo, agentes tamponantes adicionais, co-solventes, surfactantes, antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina, agentes quelantes como o EDTA, complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína), e polímeros biodegradáveis tais como poliésteres. Pode encontrar-se uma exposição aprofundada sobre a formulação e selecção de veículos, estabilizantes e isomólitos farmaceuticamente aceitáveis em Remington's Pharmaceutical Sciences (18a ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990).

Após a preparação da formulação farmacêutica líquida ou de outra composição farmacêutica tal como aqui descrito, esta pode ser liofilizada para evitar a degradação. Os métodos para a liofilização de composições líquidas são bem conhecidos dos técnicos de perícia média. Imediatamente antes do uso, a composição poderá ser reconstituída com um diluente estéril (solução de Ringer, água destilada ou soro fisiológico estéril, por exemplo) que poderá incluir ingredientes adicionais. Após a reconstituição, a composição é preferencialmente administrada aos indivíduos utilizando os métodos já conhecidos dos peritos neste campo técnico. 181

Uso de Anticorpos Antagonistas Anti-CD40 no Fabrico de

Medicamentos A presente invenção proporciona igualmente o uso de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio no fabrico de um medicamento que se destina ao tratamento de um indivíduo para um cancro que expressa CD40, sendo o medicamento coordenado com o tratamento com IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa. Por "cancro que expressa CD40" pretende-se significar qualquer cancro que compreenda células neoplásicas que expressam o antigénio de superfície celular CD40. Como acima se referiu, tais cancros incluem, de modo não limitativo, os cancros relacionados com células B, por exemplo, linfoma não-Hodgkin, leucemia linfocitica crónica, mieloma múltiplo, linfoma de células B, linfoma de células B de alto grau, linfoma de células B de grau intermédio, linfoma de células B de baixo grau, leucemia linfoblástica aguda de células B, leucemia mieloblástica, doença de Hodgkin, plasmacitoma, linfoma folicular, linfoma folicular de pequenas células clivadas, linfoma folicular de grandes células clivadas, linfoma folicular misto de pequenas células clivadas, linfoma difuso de pequenas células clivadas, linfoma difuso de pequenos linfócitos, leucemia prolinfocitica, linfoma

linfoplasmocitico, linfoma da zona marginal, linfoma do tecido linfóide associado às mucosas, linfoma de células B monocitóides, linfoma esplénico, tricoleucémia, linfoma difuso de grandes células, linfoma mediastinico de grandes células B, granulomatose linfomatóide, linfomatose intravascular, linfoma difuso de células mistas, linfoma difuso de grandes células, linfoma imunoblástico, linfoma de Burkitt, linfoma relacionado com SIDA, e linfoma das células do manto; e tumores sólidos que expressam o antigénio CD40, incluindo, de modo não limitativo, cancro do ovário, pulmão (por exemplo, cancro de 182 células não-pequenas do pulmão dos tipos de carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma e carcinoma de grandes células, e cancro de pulmão de células pequenas), mama, cólon, rim (incluindo, por exemplo, carcinomas de células renais), bexiga, figado (incluindo, por exemplo, carcinomas hepatocelulares), estômago, colo do útero, próstata, nasofaringe, tiróide (por exemplo, carcinoma papilar da tiróide), cancros da pele como o melanoma, e sarcomas (incluindo, por exemplo, osteosarcomas e sarcomas de Ewing).

Por "coordenado" pretende-se indicar que o medicamento que compreende o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio se destina a ser usado antes de, durante, ou após o tratamento do indivíduo com IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa. Em tal modalidade, a presente invenção proporciona a utilização do anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 no fabrico de um medicamento para tratar um indivíduo com cancro que expressa CD-40, em que o medicamento é coordenado com o tratamento com IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa, por exemplo, a IL-2 humana ou a muteína des-alanina-1, serina-125 da IL-2 humana, sendo que o medicamento se destina a ser usado antes, durante ou após tratamento do indivíduo com IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa.

Em algumas formas de realização, o medicamento compreendendo o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, os anticorpos monoclonais CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 aqui apresentados, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio é coordenado com o tratamento com IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa e pelo menos um outro tipo de terapêutica anti-neoplásica. Os exemplos de outras terapêuticas anti-neoplásicas incluem, de modo não limitativo, as referidas acima nesta descrição, i.e., cirurgia ou procedimentos cirúrgicos (p.ex., esplenectomia, hepatectomia, 183 linfadenectomia, leucoferese, transplante de medula e semelhantes); radioterapia; quimioterapia, opcionalmente em combinação com o transplante autólogo de medula, sendo que os agentes quimioterápicos adequados incluem, de modo não limitativo, fludarabina ou fosfato de fludarabina, clorambucil, vincristina, pentostatina, 2-clorodesoxiadenosina (cladribina), ciclofosfamida, doxorubicina, prednisona e combinações destes, por exemplo, regimes contendo antraciclinas como CAP (ciclofosfamida, doxorubicina com prednisona), CHOP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona com doxorubicina), VAD (vincristina, doxorubicina com dexametasona), MP (melfalan com prednisona), e outros agentes citotóxicos e/ou terapêuticos usados em quimioterapia, tais como mitoxantrona, daunorubicina, idarubicina, asparaginase, e antimetabolitos, incluindo, de modo não limitativo, citarabina, metotrexato, dacarbazina, 5-fluorouracilo, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina e nelarabina; outras terapêuticas anti-neoplásicas com anticorpos monoclonais (por exemplo, alemtuzumab (Campath®) ou outro anticorpo anti-CD52 direccionado contra a glicoproteína de superfície celular CD52 expressa em células B malignas; rituximab (Rituxan®), o anticorpo inteiramente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/tositumomab 1-131 (Bexxar®), ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), ou qualquer outro anticorpo terapêutico anti-CD20 direccionado contra o antigénio CD20 nas células B malignas; anticorpo anti-CD19 (por exemplo, MT103, um anticorpo biespecífico); anticorpo anti-CD22 (por exemplo, o anticorpo monoclonal humanizado epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) ou outro anticorpo antineoplásico que se dirija contra o factor de crescimento do endotélio vascular humano; anticorpo anti-CD22, dirigido contra o antigénio CD22 nas células B malignas (por exemplo, o anticorpo monoclonal BL-22, uma toxina alfa-CD22); o anticorpo cx-M-CSF, dirigido contra o 184 factor estimulador de colónias de macrófagos; anticorpos dirigidos contra o receptor activador do factor nuclear-kappaB (RANK) e o seu ligando (RANKL), os quais são sobreexpressos no mieloma múltiplo; anticorpo anti-CD23 dirigido contra o antigénio CD23 nas células B malignas (por exemplo, IDEC-152); anticorpo anti-CD80 dirigido contra o antigénio CD80 (por exemplo, IDEC-114); anticorpo anti-CD38 dirigido contra o antigénio CD38 nas células B malignas; anticorpos dirigidos contra receptores de classe II do complexo major de histocompatibilidade (anticorpos anti-MHC) expressos em células B malignas; outros anticorpos anti-CD40 (por exemplo, SGN-40) dirigidos contra o antigénio CD40 nas células B malignas; e anticorpos dirigidos contra o receptor 1 do ligando indutor de apoptose relacionado com o factor de necrose tumoral (TRAIL-R1) (por exemplo, o anticorpo monoclonal agonista humano HGS-ETR1), e TRAIL-R2 expresso por diversos tumores sólidos e tumores de origem hematopoiética; terapêutica antitumoral baseada em moléculas pequenas, incluindo, de modo não limitativo, inibidores dos microtúbulos ou da topoisomerase (por exemplo, o inibidor mitótico dolastatina e os análogos da dolastatina; o agente de ligação à tubulina T900607; XL119; e o inibidor da topoisomerase aminocamptotecina), SDX-105 (cloridrato de bendamustina), ixabepilona (um análogo da epotilona, também conhecido como BMS-247550), inibidores da proteína quinase C, por exemplo, midostaurina (PKC-412, CGP 41251, N-benzoilstaurosporina), pixantrona, eloxatina (um agente antineoplásico), ganite (nitrato de gálio), Thalomid® (talidomida), derivados imunomoduladores da talidomida (por exemplo, revlimid (anteriormente revimid), Affinitak™ (inibidor anti-sentido da proteína quinase C-alfa), SDX-101 (R-etodolac, que induz a apoptose dos linfócitos malignos) , análogos de segunda geração do nucleósido purina tais como clofarabina, inibidores da 185 produção da proteína Bcl-2 pelas células neoplásicas (por exemplo, os agentes anti-senso oblimersen e Genasense®) , inibidores dos proteossomas (por exemplo, Velcade™ (bortezomib)), inibidores de pequena molécula da quinase (por exemplo, CHIR-258), inibidores de pequena molécula do VEGF (por exemplo, ZD-6474), inibidores de pequena molécula da proteína de choque térmico (HSP) 90 (por exemplo, 17-AAG), inibidores de pequena molécula das histona desacetilases (por exemplo, agentes de citodiferenciação híbrida/polar (HPC) tais como o ácido suberanilohidroxâmico (SAHA), e FR—901228) e agentes apoptóticos tais como o Trisenox® (trióxido de arsénio) e Xcytrin® (motexafin-gadolínio); terapêuticas antineoplásicas baseadas em vacinas/imunoterapias, incluindo, de modo não limitativo, abordagens de vacinação (por exemplo, Id-KLH, oncofagos, vitaletina), imunoterapia personalizada ou imunoterapia de idiotipos activos (por exemplo, a Imunoterapia Personalizada MyVax®, formalmente designada por GTOP-99), Promune® (CpG 7909, um agonista sintético para o receptor "toll-like" 9(TLR9)), terapia com interferão alfa, terapia com IL-12, terapia com IL-15 e terapia com IL-21; terapia com esteróides; ou outra terapia antineoplásica; sendo que o tratamento com IL-2 ou outra variante biologicamente activa desta e com a terapêutica antineoplásica adicional, ou com as terapêuticas anti-neoplásicas adicionais, ocorre antes, durante ou depois do tratamento do indivíduo com o medicamento compreendendo o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, tal como acima referido. Quando o medicamento compreendendo o anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio é coordenado com IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa e pelo menos uma outra terapêutica anti-neoplásica, o uso do medicamento poderá ter lugar antes, durante ou após o 186 tratamento do indivíduo com uma, ou mais do que uma, das outras terapêuticas anti-neoplásicas. A presente invenção proporciona igualmente o uso de uma combinação sinérgica de um anticorpo antagonista anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio no fabrico de um medicamento para o tratamento de um cancro expressando CD40 num indivíduo, tal como acima se definiu, sendo que o medicamento é coordenado com o tratamento com IL-2 ou com uma sua variante biologicamente activa. Por "combinação sinérgica" pretende-se significar que o medicamento compreende uma quantidade do anticorpo antagonista anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio que proporciona um efeito terapêutico sinérgico quando o medicamento é coordenado com o tratamento com IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa da forma acima exposta. "Efeito terapêutico sinérgico" refere-se a um efeito terapêutico observado com uma combinação de duas ou mais terapêuticas (neste caso, a terapêutica com anticorpo antagonista anti-CD40 e a terapêutica com IL-2), em que o efeito terapêutico (tal como medido através de qualquer um de diversos parâmetros, incluindo as medições de eficácia descritas acima) é superior à soma dos efeitos terapêuticos individuais respectivos observados com as terapêuticas individuais respectivas.

Numa destas formas de realização, a presente invenção proporciona o uso de uma combinação sinérgica do anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 no fabrico de um medicamento para o tratamento de um cancro expressando CD40 num indivíduo, sendo o medicamento coordenado com o tratamento com IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa, por exemplo, a IL-2 humana ou a muteína de IL-2 humana des-alanil-1, serina-125, e destinando-se o medicamento a ser usado antes, durante ou após o tratamento do indivíduo com IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa. Em algumas formas de realização, o 187 medicamento compreendendo a combinação sinérgica do anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, os anticorpos monoclonais CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 aqui apresentados, ou do seu fragmento de ligação ao antigénio é coordenado com o tratamento com IL-2 ou com a sua variante biologicamente activa e com pelo menos um outro tipo de terapêutica para o cancro, tal como acima referido. A invenção proporciona ainda o uso de um anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, os anticorpos monoclonais CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 aqui expostos, ou do seu fragmento de ligação ao antigénio no fabrico de um medicamento para o tratamento de um indivíduo para um cancro que expressa CD40, tal como acima definido, sendo o medicamento usado num indivíduo que foi pré-tratado com IL-2 ou com uma sua variante biologicamente activa. Por "pré-tratado" ou "pré-tratamento" pretende-se indicar que o indivíduo recebeu uma terapêutica com IL-2 (i.e., foi tratado com IL-2 ou com uma sua variante biologicamente activa) antes de receber o medicamento que compreende o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio. 0 conceito de "pré-tratado" ou de "pré-tratamento" abrange indivíduos que foram tratados com IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa, isoladamente ou em combinação com outras terapêuticas para o cancro, no intervalo de 2 anos, 18 meses, 1 ano, 6 meses, 2 meses, 6 semanas, 1 mês, 4 semanas, 3 semanas, 2 semanas, 1 semana, 6 dias, 5 dias, 4 dias, 3 dias, 2 dias ou mesmo 1 dia antes de se iniciar o tratamento com o medicamento compreendendo o anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, os anticorpos monoclonais CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 aqui expostos, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio. Não é necessário que o indivíduo tenha respondido ao pré-tratamento com a terapêutica anterior com IL-2, ou à terapêutica anterior com IL-2 e com outras terapêuticas para o cancro. Assim, o 188 indivíduo que recebe o medicamento compreendendo o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio poderá ter respondido, ou poderá não ter respondido, ao pré-tratamento com a terapêutica com IL-2 anterior, ou a uma ou mais terapêuticas para o cancro nos casos em que o pré-tratamento compreendeu múltiplas terapêuticas para o cancro das quais uma correspondeu à terapêutica com IL-2, por exemplo, terapêutica com IL-2 e outra terapêutica anti-neoplásica com anticorpos, por exemplo, rituximab ou outra terapêutica com anticorpos anti-CD20; terapêutica com IL-2 e cirurgia; terapêutica com IL-2 e quimioterapia; ou terapêutica com IL-2, quimioterapia e outra terapêutica anti-neoplásica com anticorpos.

Assim, em algumas formas de realização, a invenção proporciona o uso de um anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo os anticorpos monoclonais CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 aqui apresentados, ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio no fabrico de um medicamento que é usado num indivíduo a necessitar de tratamento para um cancro que expressa CD40 tal como acima definido, tendo o indivíduo sido pré-tratado com uma terapêutica com IL-2, ou pré-tratado com uma terapêutica com IL-2 e uma ou mais de outras terapêuticas anti-neoplásicas que se seguem: cirurgia ou procedimentos cirúrgicos (p.ex., esplenectomia, hepatectomia, linfadenectomia, leucoferese, transplante de medula e semelhantes); radioterapia; quimioterapia, opcionalmente em combinação com o transplante autólogo de medula, sendo que os agentes quimioterápicos adequados incluem, de modo não limitativo, fludarabina ou fosfato de fludarabina, clorambucil, vincristina, pentostatina, 2-clorodesoxiadenosina (cladribina) , ciclofosfamida, doxorubicina, prednisona e combinações destes, por exemplo, regimes contendo antraciclinas como CAP (ciclofosfamida, doxorubicina com prednisona), CHOP 189 (ciclofosfamida, vincristina, prednisona com doxorubicina), VAD (vincristina, doxorubicina com dexametasona) , MP (melfalan com prednisona), e outros agentes citotóxicos e/ou terapêuticos usados em quimioterapia, tal como mitoxantrona, daunorubicina, idarubicina, asparaginase, e antimetabolitos, incluindo, de modo não limitativo, citarabina, metotrexato, dacarbazina, 5-fluorouracilo, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina e nelarabina; outras terapêuticas antitumorais com anticorpos monoclonais (por exemplo, alemtuzumab (Campath®) ou outro anticorpo anti-CD52 dirigido contra a glicoproteina de superfície celular CD52 expressa em células B malignas; rituximab (Rituxan®), o anticorpo inteiramente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMU-10 6, TRU-015, ΔΜΕ-133, tositumomab/tositumomab 1-131 (Bexxar®), ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), ou qualquer outro anticorpo terapêutico anti-CD20 dirigido contra o antigénio CD20 nas células B malignas; anticorpo anti-CD19 (por exemplo, MT103, um anticorpo biespecifico); anticorpo anti-CD22 (por exemplo, o anticorpo monoclonal humanizado epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) ou outro anticorpo antitumoral dirigido contra o factor de crescimento do endotélio vascular humano; anticorpo anti-CD22, dirigido contra o antigénio CD22 nas células B malignas (por exemplo, o anticorpo monoclonal BL-22, uma toxina alfa-CD22); o anticorpo α-Μ-CSF, dirigido contra o factor estimulador de colónias de macrófagos; anticorpos dirigidos contra o receptor activador do factor nuclear-kappaB (RANK) e o seu ligando (RANKL), os quais são sobreexpressos no mieloma múltiplo; anticorpo anti-CD23 dirigido contra o antigénio CD23 nas células B malignas (por exemplo, IDEC-152); anticorpo anti-CD80 dirigido contra o antigénio CD80 (por exemplo, IDEC-114); anticorpo anti-CD38 dirigido contra o antigénio CD38 nas células B malignas; anticorpos dirigidos contra receptores de classe II do complexo major de histocompatibilidade 190 (anticorpos anti-MHC) expressos em células B malignas; outros anticorpos anti-CD40 (por exemplo, SGN-40) dirigidos contra o antigénio CD40 nas células B malignas; e anticorpos dirigidos contra o receptor 1 do ligando indutor de apoptose relacionado com o factor de necrose tumoral (TRAIL-R1)(por exemplo, o anticorpo monoclonal agonista humano HGS-ETR1) e contra o TRAIL-R2, expressos por diversos tumores sólidos e tumores de origem hematopoiética; terapêutica antitumoral baseada em moléculas pequenas, incluindo, de modo não limitativo, inibidores dos microtúbulos e/ou da topoisomerase (por exemplo, o inibidor mitótico dolastatina e os análogos da dolastatina; o agente de ligação à tubulina T900607; XL119; e o inibidor da topoisomerase aminocamptotecina), SDX-105 (cloridrato de bendamustina), ixabepilona (um análogo da epotilona, também conhecido como BMS-247550), inibidores da proteina quinase C, por exemplo, midostaurina (PKC-412, CGP 41251, N-benzoilstaurosporina), pixantrona, eloxatina (um agente antineoplásico), ganite (nitrato de gálio), Thalomid® (talidomida), derivados imunomoduladores da talidomida (por exemplo, revlimid (anteriormente revimid), Affinitak™ (inibidor anti-sentido da proteina quinase C-alfa), SDX-101 (R-etodolac, que induz a apoptose dos linfócitos malignos), análogos de segunda geração do nucleósido purina tais como clofarabina, inibidores da produção da proteina Bcl-2 pelas células cancerosas (por exemplo, os agentes anti-senso oblimersen e Genasense®) , inibidores dos proteossomas (por exemplo, Velcade™ (bortezomib)), inibidores de pequena molécula da quinase (por exemplo, CHIR-258), inibidores de pequena molécula do VEGF (por exemplo, ZD-6474), inibidores de pequena molécula da proteina de choque térmico (HSP) 90 (por exemplo, 17-AAG), inibidores de pequena molécula das histona desacetilases (por exemplo, agentes de citodiferenciação hibrida/polar (HPC) tais como o ácido suberanilohidroxâmico 191 (SAHA), e FR—901228) e agentes apoptóticos tais como Trisenox® (trióxido de arsénio) e Xcytrin® (motexafin-gadolínio) ; terapêuticas antineoplásicas baseadas em vacinas/imunoterapias, incluindo, de modo não limitativo, abordagens de vacinação (por exemplo, Id-KLH, oncofagos, vitaletina), imunoterapia personalizada ou imunoterapia de idiotipos activos (por exemplo, a Imunoterapia Personalizada MyVax®, formalmente designada por GTOP-99), Promune® (CpG 7909, um agonista sintético para o receptor "toll-like" 9(TLR9)), terapia com interferão alfa, terapia com IL-12, terapia com IL-15 e terapia com IL-21; terapia com esteróides; ou outra terapia antineoplásica. O presente invento proporciona igualmente o uso de 11-2 ou de uma sua variante biologicamente activa no fabrico de um medicamento para o tratamento de um cancro que expressa CD40 num indivíduo, tal como acima exposto, sendo o medicamento coordenado com o tratamento com um anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio. Nestas formas de realização, "coordenado" pretende indicar que o medicamento compreendendo a IL-2 ou a sua variante biologicamente activa se destina a ser usado antes, durante ou após o tratamento do indivíduo com o anticorpo antagonista anti-CD40 ou com um seu fragmento de ligação ao antigénio. Em uma destas formas de realização, a presente invenção proporciona 0 uso de IL-2 ou de uma sua variante biologicamente activa, por exemplo, IL-2 humana ou a muteina des-alanil-1, serina-125 da IL-2 humana, no fabrico de um medicamento para o tratamento de um cancro que expressa CD40 num indivíduo, em que o medicamento é coordenado com o tratamento com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, e destinando-se o medicamento a ser usado antes, durante ou após o tratamento do indivíduo com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9. 192

Em algumas formas de realização, o medicamento compreendendo IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa é coordenado com o tratamento com um anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, e com pelo menos um outro tipo de terapêutica para o cancro. Os exemplos de outras terapêuticas para o cancro incluem, de modo não limitativo, os aqui anteriormente descritos, i.e., cirurgia ou procedimentos cirúrgicos (p.ex., esplenectomia, hepatectomia, linfadenectomia, leucoferese, transplante de medula e semelhantes); radioterapia; quimioterapia, opcionalmente em combinação com o transplante autólogo de medula, sendo que os agentes quimioterápicos adequados incluem, de modo não limitativo, fludarabina ou fosfato de fludarabina, clorambucil, vincristina, pentostatina, 2-clorodesoxiadenosina (cladribina), ciclofosfamida, doxorubicina, prednisona e combinações destes, por exemplo, regimes contendo antraciclinas como CAP (ciclofosfamida, doxorubicina com prednisona), CHOP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona com doxorubicina), VAD (vincristina, doxorubicina com dexametasona), MP (melfalan com prednisona), e outros agentes citotóxicos e/ou terapêuticos usados em quimioterapia, tal como mitoxantrona, daunorubicina, idarubicina, asparaginase, e antimetabolitos, incluindo, de modo não limitativo, citarabina, metotrexato, dacarbazina, 5-fluorouracilo, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina e nelarabina; outras terapêuticas antitumorais com anticorpos monoclonais (por exemplo, alemtuzumab (Campath®) ou outro anticorpo anti-CD52 que se dirija contra a glicoproteína de superfície celular CD52 expressa em células B malignas; rituximab (Rituxan®), o anticorpo inteiramente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/tositumomab 1-131 (Bexxar®), ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), ou qualquer outro anticorpo 193 terapêutico anti-CD20 dirigido contra o antigénio CD20 nas células B malignas; anticorpo anti-CD19 (por exemplo, MT103, um anticorpo biespecifico); anticorpo anti-CD22 (por exemplo, o anticorpo monoclonal humanizado epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) ou outro anticorpo antitumoral dirigido contra o factor de crescimento do endotélio vascular humano; anticorpo anti-CD22, dirigido contra o antigénio CD22 nas células B malignas (por exemplo, o anticorpo monoclonal BL-22, uma toxina alfa-CD22); o anticorpo α-Μ-CSF, dirigido contra o factor estimulador de colónias de macrófagos; anticorpos dirigidos contra o receptor activador do factor nuclear-kappaB (RANK) e o seu ligando (RANKL), os quais são sobreexpressos no mieloma múltiplo; anticorpo anti-CD23 dirigido contra o antigénio CD23 nas células B malignas (por exemplo, IDEC-152); anticorpo anti-CD80 dirigido contra o antigénio CD80 (por exemplo, IDEC-114); anticorpo anti-CD38 dirigido contra o antigénio CD38 nas células B malignas; anticorpos dirigidos contra receptores de classe II do complexo major de histocompatibilidade (anticorpos anti-MHC) expressos em células B malignas; outros anticorpos anti-CD40 (por exemplo, SGN-40) dirigidos contra o antigénio CD40 nas células B malignas; e anticorpos dirigidos contra o receptor 1 do ligando indutor de apoptose relacionado com o factor de necrose tumoral (TRAIL-R1)( (por exemplo, o anticorpo monoclonal agonista humano HGS-ETR1) e contra o TRAIL-R2, expressos por diversos tumores sólidos e tumores de origem hematopoiética; terapêutica antitumoral baseada em moléculas pequenas, incluindo, de modo não limitativo, inibidores dos microtúbulos ou da topoisomerase (por exemplo, o inibidor mitótico dolastatina e os análogos da dolastatina; o agente de ligação à tubulina T900607; XL119; e o inibidor da topoisomerase aminocamptotecina), SDX-105 (cloridrato de bendamustina), ixabepilona (um análogo da epotilona, também 194 conhecido como BMS-247550), inibidores da proteína quinase C, por exemplo, midostaurina (PKC-412, CGP 41251, N-benzoilstaurosporina), pixantrona, eloxatina (um agente antineoplásico), ganite (nitrato de gálio) , Thalomid® (talidomida), derivados imunomoduladores da talidomida (por exemplo, revlimid (anteriormente revimid), Affinitak™ (inibidor anti-sentido da proteína quinase C-alfa), SDX-101 (R-etodolac, que induz a apoptose dos linfócitos malignos) , análogos de segunda geração do nucleósido purina tais como clofarabina, inibidores da produção da proteína Bcl-2 pelas células cancerosas (por exemplo, os agentes anti-senso oblimersen e Genasense®), inibidores dos proteossomas (por exemplo, Velcade™ (bortezomib)) , inibidores de pequena molécula da quinase (por exemplo, CHIR-258), inibidores de pequena molécula do VEGF (por exemplo, ZD-6474), inibidores de pequena molécula da proteína de choque térmico (HSP) 90 (por exemplo, 17-AAG), inibidores de pequena molécula das histona desacetilases (por exemplo, agentes de citodiferenciação híbrida/polar (HPC) tais como o ácido suberanilohidroxâmico (SAHA), e FR—901228) e agentes apoptóticos tais como Trisenox® (trióxido de arsénio) e Xcytrin® (motexafin-gadolínio) ; terapêuticas antineoplásicas baseadas em vacinas/imunoterapias, incluindo, de modo não limitativo, abordagens de vacinação (por exemplo, Id-KLH, oncofagos, vitaletina), imunoterapia personalizada ou imunoterapia de idiotipos activos (por exemplo, a Imunoterapia Personalizada MyVax®, formalmente designada por GTOP-99) , Promune® (CpG 7909, um agonista sintético para o receptor "toll-like" 9(TLR9)), terapia com interferão alfa, terapia com IL-12, terapia com IL-15 e terapia com IL-21; terapia com esteróides; ou outra terapia antineoplásica; sendo que o tratamento com o anticorpo antagonista anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio e com a(s) terapêutica (s) adicional (is) contra o 195 cancro ocorre antes, durante ou após o tratamento do indivíduo com o medicamento compreendendo IL-2 ou uma sua variante, tal como acima se fez notar. Quando o medicamento compreendendo IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa é coordenado com o tratamento com o anticorpo antagonista anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio e com pelo menos uma outra terapêutica contra o cancro, o uso do medicamento pode fazer-se antes, durante ou após o tratamento do indivíduo com uma, ou mais do que uma, das outras terapêuticas contra o cancro.

Os exemplos que se seguem são apresentados com fins ilustrativos e não com o intuito de limitar a invenção.

EXPERIMENTAÇÃO

Introdução

Os anticorpos antagonistas anti-CD40 usados nos Exemplos abaixo são os anticorpos CHIR-5.9 e CHIR-12.12. Os anticorpos anti-CD40 CHIR-5.9 e CHIR-12.12 são anticorpos monoclonais (mAbs) anti-humanos do subtipo IgG humano, gerados por imunização de ratinhos transgénicos portadores do locus de cadeia pesada de IgG humana e do locus de cadeia leve κ humana (tecnologia Xenomouse®; Abgenix; Fremont, Califórnia). Como imunogénio, foram usadas células de insectos SF9 que expressam o domínio extracelular CD40.

Resumidamente, fundiram-se esplenócitos de ratinhos imunizados com células de mieloma murino SP 2/0 ou P 3 x 63Ag8.653 a uma razão de 10:1 usando polietilenoglicol a 50% tal como previamente descrito por de Boer et al. (1988) J. Immunol. Meth. 113:143. As células fundidas foram ressuspensas em meio IMDM completo suplementado com hipoxantina (0,1 mM), aminopterina (0,01 mM) , timidina (0,016 mM) e 0,5 ng/ml de hIL-6 (Genzyme, Cambridge, Massachusetts). As células fundidas 196 foram então distribuídas pelos poços de placas de cultura de tecidos com 96 poços, de modo a que cada poço contivesse em média um hibridoma em desenvolvimento.

Após 10-14 dias, os sobrenadantes das populações de hibridoma foram rastreados quanto à produção de anticorpos específicos. Para o rastreio da produção de anticorpos específicos pelos clones de hibridoma, os sobrenadantes de cada poço foram reunidos num pool e inicialmente testados por ELISA quanto à especificidade da actividade anti-CD40. Os positivos foram então usados para a marcação por fluorescência das células B transformadas por EBV, utilizando um ensaio FACS padronizado. As células de hibridoma positivas foram clonadas duas vezes por diluição limitante em IMDM/FBS contendo 0,5 ng/ml de hIL-6.

Fundiu-se um total de 31 baços de ratinho com as células de mieloma de ratinho SP2/0 para gerar 895 anticorpos que reconhecem o CD40 recombinante em ensaios ELISA. Em média, aproximadamente 10% dos hibridomas produzidos usando a tecnologia XenoMouse® da Abgenix (Abgenix; Fremont, Califórnia) poderão conter cadeia leve lambda de ratinho em vez de cadeia kappa humana. Os anticorpos contendo cadeia leve lambda de ratinho foram seleccionados e eliminados. Um subconjunto de 260 anticorpos que evidenciou igualmente a ligação ao CD40 da superfície celular foi seleccionado para análise mais completa. Os hibridomas estáveis seleccionados durante uma série de procedimentos de subclonagem foram usados para caracterização mais detalhada através de ensaios de ligação e funcionais.

Os clones de 7 outros hibridomas foram identificados como possuindo actividade antagonista. Com base na sua potência antagonista relativa e nas actividades ADCC, foram seleccionados dois clones de hibridoma para avaliação mais 197 detalhada (Tabela 2, abaixo). Estes clones são designados por 131.2F8.5.9 (5.9) e 153.8E2.D10.D6.12.12 (12.12).

Tabela 2. Resumo do conjunto inicial de dados obtidos com os anticorpos IgGl anti-CD40 CHIR-5.9 e CHIR-12.12

Hibridoma progenitor Clones de hibridoma Ligação à superfície celular Antagonista ADCC CDC CMCC# Sequência de DNA da região V 131.2F5 131.2F5.8.5.9 +++ +++ + + - 12047 Sim 153.8E2 153.8E2D10D6.12.12 +++ +++ + + + + - 12056 Sim A linha de hibridoma de ratinho 131.2F8.5.9 (CMCC#12047) e a linha de hibridoma 153.8E2.D10.D6.12.12 (CMCC#12056) foram depositadas na American Type Culture Collection [ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, Virgínia 20110-2209 (USA)] sob os Números de Depósito Patenteado PTA-5542 e PTA-5543, respectivamente.

Os cDNAs codificando para as regiões variáveis dos anticorpos candidatos foram amplificados por PCR, clonados e sequenciados. As sequências de aminoácidos para a cadeia leve e para a cadeia pesada do anticorpo CHIR-12.12 são apresentadas nas Figuras IA e 1B, respectivamente. Ver também a SEQ ID NO:2 (cadeia leve para o mAb CHIR-12.12) e a SEQ ID NO:4 (cadeia pesada para o mAb CHIR-12.12). É apresentada na Figura 1B uma variante para a cadeia pesada do mAb CHIR-12.12 (ver também a SEQ ID NO:5), que difere da SEQ ID NO:4 no facto de possuir um resíduo de serina a substituir o resíduo de alanina da posição 153 da SEQ ID NO:4. As sequências de nucleótidos codificando para a cadeia leve e para a cadeia pesada do anticorpo CHIR-12.12 são apresentadas nas Figuras 2A e 2B, respectivamente. Ver também a SEQ ID NO:l (sequência codificante para a cadeia leve para o mAb CHIR-12.12) e a SEQ ID NO: 3 (sequência codificante para a cadeia pesada do mAb 198 CHIR-12.12). As sequências de aminoácidos para a cadeia leve e para a cadeia pesada do anticorpo CHIR-5.9 são apresentadas nas Figuras 3A e 3B, respectivamente. Ver também a SEQ ID NO:6 (cadeia leve para o mAb CHIR-5.9) e a SEQ ID NO: 7 (cadeia pesada para o mAb CHIR-5.9) . É apresentada na Figura 3B uma variante para a cadeia pesada do mAb CHIR-5.9 (ver também a SEQ ID NO:8), que difere da SEQ ID NO:7 no facto de possuir um resíduo de serina a substituir o resíduo de alanina na posição 158 da SEQ ID NO:7.

Tal como esperado para os anticorpos que derivam de hibridomas independentes, existe uma variação substancial nas sequências de nucleótidos das regiões determinantes da complementaridade (CDRs). Crê-se que a diversidade na região CDR3 de V seja a que mais significativamente determina a

H especificidade do anticorpo.

Tal como evidenciado por análise FACS, os anticorpos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 ligam-se especificamente ao CD40 humano e podem evitar a ligação do ligando de CD40. Ambos os mAbs podem competir com o ligando de CD40 pré-ligado ao CD40 da superfície celular. A afinidade de ligação de CHIR-5.9 ao CD40 -8 humano é de 1,2 x 10 M e a afinidade de ligação de CHIR-12.12 -10 ao CD40 humano é de 5 x 10 M.

Os anticorpos monoclonais CHIR-12.12 e CHIR-5.9 são antagonistas fortes e inibem a proliferação, mediada pelo ligando de CD4 0, das células B normais in vitro, assim como inibem a proliferação , mediada pelo ligando de CD40, das células cancerosas de doentes com NHL e LLC in vitro. In vitro, ambos os anticorpos destroem por ADCC as células cancerosas primárias de doentes com NHL. Verificou-se uma actividade antitumoral dependente da dose num modelo de xenotransplante de linfoma humano. 199

Exemplo 1: CHIR-5.9 e CHIR-12.12 Ligam-se a um Epitopo no CD40 que é Diferente do de 15B8

Os anticorpos monoclonais candidatos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 competem entre si para a ligação ao CD40 mas não competem com 15B8, um mAb anti-CD40 IgG2 (ver Publicação Internacional N° WO 02/28904). Foram concebidos estudos de ligação competitiva de anticorpos usando Biacore que utilizam chips biosensores CM5 com proteina A imobilizada através de acoplamento por amina, os quais foram usados para capturar os anticorpos anti-CD40, CHIR-12.12 ou 15B8. Observaram-se curvas normais de associação/dissociação com concentrações variáveis de CD40-his (dados não apresentados). Para os estudos de competição, o mAb CHIR-12.12 ou o mAb 15B8 foram capturados à superfície da proteina A. Subsequentemente foi passado um fluxo do complexo Fab CD40-his/CHIR-5.9 (100 nM CD40:1 μΜ Fab de CHIR-5.9), a concentrações variáveis, sobre a superfície modificada. No caso de CHIR-12.12, não se observou a associação do complexo, o que indica que CHIR-5.9 bloqueia a ligação de CHIR-12.12 ao CD40-his. Com o anticorpo 15B8, observou-se a associação do complexo Fab de CHIR-5.9, o que indica que CHIR-5.9 não bloqueia a ligação de 15B8 ao local de ligação no CD40. No entanto, a taxa de deslocamento do complexo aumentou de forma muito marcada (dados não apresentados).

Foi igualmente determinado que os anticorpos 15B8 e CHIR-12.12 não competem para a ligação ao CD40-his. Esta experiência foi efectuada capturando o anticorpo CHIR-12.12 sobre o chip biosensor com proteína A, bloqueando os locais de ligação residuais da proteína A com hlgG de controlo, promovendo a ligação com CD40-his e seguidamente fazendo passar um fluxo de 15B8 sobre a superfície modificada. O anticorpo 15B8 ligou-se sob estas condições, o que indica que CHIR-12.12 não bloqueia a ligação de 15B8 ao CD40. 200

Exemplo 2: Propriedades de Ligação dos mAb CHIR-12.12 e CHIR-5.9 A proteína A foi imobilizada sobre os chips biosensores CM5 através de acoplamento por amina. Os anticorpos monoclonais humanos anti-CD40, a 1,5 pg/ml, foram capturados à superfície modificada do biosensor durante 1,5 minutos a 10 μΐ/min. Fez-se passar um fluxo de CD40-his recombinante solúvel sobre a superfície do biosensor a diversas concentrações. O anticorpo e o antigénio foram diluídos em HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, 0,005% Surfactante P20 (HBS-EP). Foram determinadas as constantes cinéticas e de afinidade usando o software Bioevaluation com um modelo de interacção/ajuste global de 1:1.

Tal como mostra a Tabela 3, abaixo, existe uma diferença de 121 vezes entre a taxa de deslocamento de CHIR-5.9 e a de CHIR-12.12, resultando numa afinidade 24 vezes superior do anticorpo CHIR-12.12.

Tabela 3: Resumo das Propriedades de Ligação dos anticorpos anti-CD40 CHIR-5.9 e CHIR-12.12

Anticorpo Ka(M-l seg-1) kd (seg-1) KD (nM) Anti-CD40,CHIR-5.9 (12,35 ± 0,64)xl05 -5 (15,0 ± 1,3)xl0 12,15 ± 0,35 Anti-CD4 0,CHIR-12.12 5 (2,41 ± 0,13)xlO -4 (1,24 ± 0,06)xlO 0,51 ± 0,02

Exemplo 3: Caracterização do Epitopo para os Anticorpos Monoclonais CHIR-12.12 e CHIR-5.9

Para determinar a localização do epitopo de CD40 que é reconhecido pelos anticorpos monoclonais CHIR-12.12 e CHIR-5.9, foram realizadas análises por SDS-PAGE e Western Blot. Usou-se CD40 purificado (0,5 pg) que foi separado num gel NUPAGE a 4-12% sob condições redutoras e não redutoras, transferido para membranas de PVDF e sondado com anticorpos 201 monoclonais à concentração de 10 μg/ml. Os blots foram sondados com IgG anti-humana conjugada com fosfatase alcalina e desenvolvidos usando o substrato estabilizado para a fosfatase alcalina Western Blue® (Promega).

Os resultados indicam que o anticorpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12 reconhece epitopos tanto na forma reduzida como na forma não reduzida de CD40, sendo que a forma não reduzida de CD40 exibe uma maior intensidade do que a forma reduzida de CD40 (Tabela 4; blots não apresentados). O facto de o reconhecimento ser positivo para ambas as formas de CD40 indica que este anticorpo interage com um epitopo conformacional do qual uma parte corresponde a uma sequência linear. O anticorpo monoclonal CHIR-5.9 reconhece principalmente a forma não reduzida de CD40, sugerindo que este anticorpo interage com um epitopo principalmente conformacional (Tabela 4; blots não apresentados).

Tabela 4. Identificação de dominios.

Domínio 1 Domínio 2 Domínio 3 Domínio 4 mAb CHIR.12.12 - + - - mAb CHIR-5.9 - + - - mAb 15B8 + - - -

Para mapear a região antigénica de CD40, os quatro dominios extracelulares de CD40 foram clonados e expressos em células de insecto sob a forma de proteínas de fusão com GST. A secreção dos quatro domínios foi assegurada com um sinal de secreção de GP67. O sobrenadante das células de insecto foi analisado por SDS-PAGE e Western Blot para identificar o domínio que continha o epitopo. O anticorpo monoclonal CHIR-12.12 reconhece um epitopo no Domínio 2 tanto em condições redutoras como em condições não redutoras (Tabela 5; blots não apresentados). Por contraste, o 202 anticorpo monoclonal CHIR-5.9 exibe um reconhecimento muito fraco do Domínio 2 (Tabela 5; blots não apresentados). Nenhum destes anticorpos reconheceu os Domínios 1, 3 ou 4 nesta análise.

Tabela 5. Análise do Domínio 2.

Reduzido Não reduzido mAb CHIR.12.12 ++ +++ mAb CHIR-5.9 + +

Para definir com maior precisão o epitopo reconhecido pelo mAb CHIR-12.12, sintetizaram-se péptidos do Domínio Extracelular 2 de CD40, correspondendo à sequência PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICT (resíduos 61-104 da sequência apresentada em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12). Foram geradas membranas SPOTs (Sigma) contendo trinta e cinco péptidos 10-meros com um offset de 1 aminoácido. Foi efectuada uma análise por Western Blot com mAb CHIR-12.12 e beta-galactosidase-IgG anti-humana como anticorpo secundário. Procedeu-se ao stripping do blot e este foi re-sondado com mAb CHIR-5.9 para determinar a região reconhecida por este anticorpo.

Na análise de SPOTs, a sondagem com o anticorpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12 a 10 pg/ml forneceu reacções positivas nas manchas 18 a 22. A região de sequência abrangida por estes péptidos é apresentada na Tabela 6.

Tabela 6. Resultado da sondagem com o anticorpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12 na análise de SPOTs.

Spot número Região de Sequência 18 HQHKYCDPNL (resíduos 78-87 da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12) 19 QHKYCDPNLG (resíduos 79-88 da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12) 20 HKYCDPNLGL (resíduos 80-89 da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12) 203 21 KYCDPNLGLR (resíduos 81-90 da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12) 22 YCDPNLGLRV (resíduos 82-91 da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12)

Estes resultados correspondem a um epitopo linear de: YCDPNL (resíduos 82-87 da sequência apresentada em SEQ ID NO:10 ou SEQ ID N0:12). Este epitopo contém Y82, D84 e N86, previstos como estando envolvidos na interacção CD40-ligando de CD4 0. A análise de SPOTs com o mAb CHIR-5.9 evidenciou um fraco reconhecimento dos péptidos representados pelas manchas 20-22 e mostrados na Tabela 7, sugerindo o envolvimento da região YCDPNLGL (resíduos 82-89 da sequência apresentada em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12) na sua ligação ao CD40. Deve notar-se que os mAbs CHIR-12.12 e CHIR-5.9 competem entre si para a ligação ao CD40 na análise de BIACORE.

Tabela 7. Resultados da sondagem com o anticorpo monoclonal anti-CD40 CHIR-5.9 na análise de SPOTs.

Spot número Região de Sequência 20 HKYCDPNLGL (resíduos 80-89 da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12) 21 KYCDPNLGLR (resíduos 81-90 da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12) 22 YCDPNLGLRV (resíduos 82-91 da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12)

Os epitopos lineares identificados pelas análises de SPOTs encontram-se no módulo BI de CD40. A sequência do módulo BI de CD40 é: HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTIC (resíduos 80-103 da SEQ ID NO:10 ou da SEQ ID NO:12).

Contido no epitopo linear identificado para o CHIR-12.12 encontra-se C83. Sabe-se que este resíduo de cisteína forma uma ligação dissulfito com C103. É provável que o epitopo conformacional do mAb CHIR-12.12 contenha esta ligação 204 dissulfito (C83-C103) e/ou os aminoácidos circundantes que se encontram conformacionalmente perto de C103.

Exemplo 4: 0 Tratamento de Combinação com CHIR-12.12 e IL-2

Exibe Actividade Anti-Tumoral Aditiva em Modelos Animais É esperado que o mAb CHIR-12.12 produza os efeitos farmacológicos desejados de redução da massa tumoral através de um de dois mecanismos anti-tumorais, ou de ambos: bloqueio do sinal de proliferação/sobrevivência e indução de ADCC. Os modelos de xenotransplante de linfoma humano correntemente disponíveis usam linhas celulares de linfoma em culturas a longo termo que, em contraste com as células cancerosas primárias, não dependem da estimulação por CD40 para o seu crescimento e sobrevivência. Assim, não é esperado que o componente de actividade antitumoral destes mAbs que se baseia no bloqueio do sinal de proliferação/sobrevivência do tumor contribua para a eficácia antitumoral nestes modelos. A eficácia nestes modelos está dependente da ADCC, o segundo mecanismo antitumoral associado ao mAb CHIR-12.12. 0 tratamento de combinação com mAb CHIR-12.12 e com IL-2 foi avaliado num modelo faseado Namalwa de xenotransplante de NHL humano. Para assegurar um crescimento tumoral consistente, fez-se uma irradiação de corpo total com 3Gy a ratinhos nus deficientes em células T para reforçar a supressão do sistema imunitário um dia antes da inoculação do tumor. As células tumorais foram inoculadas subcutaneamente no flanco direito a 6 5 x 10 células por ratinho. O tratamento foi iniciado quando o 3 volume tumoral atingiu cerca de 100-200 mm (cerca de 7 dias após inoculação do tumor). Os ratinhos portadores de tumor foram tratados como se segue: (1) IgGl a 10 mg/kg, intraperitonealmente, uma vez por semana durante 4 semanas; (2) mAb CHIR-12-12 a 1 mg/kg, intraperitonealmente, uma vez 205 por semana durante 4 semanas; (3) IL-2 a 0,5 mg/kg, subcutaneamente, diariamente durante 8 dias; (4) IL-2 a 0,5 mg/kg, subcutaneamente, diariamente durante 8 dias + mAb CHIR-12.12 a 1 mg/kg, intraperitonealmente, uma vez por semana durante 4 semanas e (5) IL-2 a 0,5 mg/kg, subcutaneamente, diariamente durante 8 dias + mAb CHIR-12.12 a 10 mg/kg, intraperitonealmente, uma vez por semana durante 4 semanas. Os volumes dos tumores foram registados duas vezes por semana. Os dados foram analisados usando o programa ANOVA. O anticorpo CHIR-12.12 e a IL-2, usados isoladamente, inibiram ambos o crescimento de tumores Namalwa (N = 10 ratinhos/grupo). A combinação de CHIR-12-12 e de IL-2 resultou em actividade anti-tumoral aditiva (Figura 5).

Exemplo 5: CHIR-12.12 Bloqueia as Vias de Sobrevivência e

Sinalização de CD40 Mediadas por CD40L em Células B Humanas

Normais O ligando de CD40 solúvel (CD40L) activa as células B e induz vários aspectos das respostas funcionais, incluindo o aumento da sobrevivência e da proliferação e a activação das vias de sinalização de NFkB, ERK/MAPK, PI3K/Akt e p38. Adicionalmente, a estimulação de CD40 mediada por CD40L proporciona sinais de sobrevivência através da redução da clivagem de PARP e da indução das proteínas anti-apoptóticas, XIAP e Mcl-1, em células B normais. A estimulação de CD40 mediada por CD40L recruta igualmente TRAF2 e TRAF3 para a ligação ao domínio citoplasmático de CD40.

Os estudos que se seguem demonstram que CHIR-12.12 inibiu directamente todos estes efeitos de estimulação em células B humanas normais. Por exemplo, o tratamento com CHIR-12.12 resultou no aumento da clivagem de caspase-9, caspase-3 e PARP, assim como na redução de XIAP e de Mcl-1 de um modo dependente do tempo e da dose, restabelecendo a apoptose 206 celular. 0 tratamento com CHIR-12.12 inibiu também a fosforilação da quinase IkB (IKK) α e β (via NFkB), ERK, Akt e p38 em resposta à estimulação de CD40 mediada por CD40L. Adicionalmente, verificou-se que CHIR-12.12 não desencadeava estes efeitos apoptóticos sem uma estimulação inicial de CD40 mediada por CD40L. CHIR-12.12 inibiu a sobrevivência mediada pelo ligando de CD40 através da indução da clivagem de PARP. 6

Nestas experiências, 0,6 x 10 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram estimuladas com 1 pg/ml de SCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK) . Foram então adicionados CHIR-12.12 (10 pg/ml) e IgG de controlo. As células foram colhidas aos 0, 20 minutos, 2 horas, 6 horas, 18 horas e 26 horas.

Detectou-se caspase-9 clivada, caspase-3 clivada, PARP clivada e controlos de β-actina por Western Blot nos lisados celulares.

Abreviadamente, observou-se que a estimulação de CD40 mediada por CD40L proporcionou sinais de sobrevivência, uma vez que não resultou no aumento dos níveis de caspase-9 clivada, caspase-3 clivada ou PARP clivada ao longo do tempo, o que indica que as células não estavam a sofrer apoptose. No entanto, o tratamento com CHIR-12.12 resultou num aumento destes produtos de clivagem, indicando que o tratamento com CHIR-12.12 anulou os efeitos da ligação do ligando de CD40 sobre a sinalização de sobrevivência em células B normais estimuladas por sCD40L, restabelecendo a apoptose celular (dados não apresentados). 207 CHIR-12.12 inibiu a expressão de proteínas anti-apoptóticas "de sobrevivência". 6

Nestas experiências, 0,6 x 10 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram estimuladas com 1 pg/ml de sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK) . Foram então adicionados CHIR- 12.12 (10 pg/ml) e IgG de controlo. As células foram colhidas aos 0, 20 minutos, 2 horas, 6 horas, 18 horas e 26 horas.

Detectou-se Mcl-1, XIAP, CD40 e controlos de β-actina por Western Blot nos lisados celulares.

Abreviadamente, a estimulação por sCD40L resultou numa expressão mantida de Mcl-1 e de XIAP ao longo do tempo. No entanto, o tratamento das células estimuladas por sCD40L com CHIR-12.12 resultou numa diminuição da expressão destas proteinas ao longo do tempo (dados não apresentados). Uma vez que Mcl-1 e XIAP constituem sinais "de sobrevivência" capazes de bloquear a via apoptótica, estes resultados demonstram que o tratamento com CHIR-12.12 remove o bloqueio contra a apoptose em células B normais estimuladas por sCD40L. O tratamento com CHIR-12.12 inibiu a fosforilação de IKKol (Serl80) e de IKK β (Ser 181) em células B normais. 6

Nestas experiências, 1,0 x 10 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram estimuladas com 1 pg/ml de sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK) . Foram então adicionados CHIR- 12.12 (10 pg/ml) e IgG de controlo. As células foram colhidas aos 0 e aos 20 minutos. Detectou-se IKKa (Serl80) e IKK β (Ser 181) fosforiladas e controlos de ΙΚΚβ total por Western Blot nos lisados celulares.

Abreviadamente, a estimulação por sCD40L resultou na fosforilação de IKKa (Ser 180) e IKK β (Ser 181) ao longo do 208 tempo; no entanto, o tratamento com CHIR-12.12 anulou esta resposta à estimulação por sCD40L em células B normais (dados não apresentados). O tratamento com CHIR-12.12 inibiu a sobrevivência mediada pelo ligando de CD40 num modo dependente da dose. 6

Nestas experiências, 0,6 x 10 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram estimuladas com 1 pg/ml de sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK) . Foram então adicionados CHIR- 12.12 (0,01, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 pg/ml) e IgG de controlo. As células foram colhidas às 24 horas. Detectou-se PARP clivada e controlos de β-actina por Western Blot nos lisados celulares.

Abreviadamente, o tratamento com CHIR-12.12 resultou num aumento da clivagem de PARP em células estimuladas por sCD40L de um modo dependente da dose, anulando deste modo a via de sinalização de sobrevivência em células B normais estimuladas por sCD40L (dados não apresentados). CHIR-12.12 inibiu a expressão de proteínas anti-apoptóticas "de sobrevivência" num modo dependente da dose. 6

Nestas experiências, 0,6 x 10 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram estimuladas com 1 pg/ml de sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK) . Foram então adicionados CHIR- 12.12 (0,5, 2 e 10 pg/ml) e IgG de controlo. As células foram colhidas às 22 horas. Detectou-se Mcl-1, XIAP, PARP clivada e controlos de β-actina por Western Blot nos lisados celulares.

Abreviadamente, o tratamento com CHIR-12.12 reduziu a expressão de Mcl-1 e XIAP e aumentou a expressão de PARP clivada em células estimuladas por sCD40L de um modo dependente da dose, anulando assim estes bloqueios à via 209 apoptótica em células B normais estimuladas por sCD40L (dados não apresentados). CHIR—12.12 não afectou a expressão de proteínas anti-apoptóticas, PARP clivada e XIAP na ausência de sinalização com CD40L solúvel. 6

Nestas experiências, 1,0 x 10 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram tratadas apenas com CHIR-12.12 (10 pg/ml) e IgG de

controlo (i.e., as células não foram pré-estimuladas com sCD40L antes da adição de anticorpo) . As células foram colhidas às 0, 4, 14 e 16 horas. Detectou-se XIAP, PARP clivada e controlos de β-actina por Western Blot nos lisados celulares.

Abreviadamente, os resultados mostram que, sem a estimulação por sCD40L, as células expressaram concentrações aumentadas de PARP clivada enquanto que a expressão de XIAP permaneceu constante, tanto nas células tratadas com a IgG de controlo como nas tratadas com CHIR-12.12 (dados não apresentados). Estes dados indicam que CHIR-12.12 não desencadeia a apoptose em células B humanas normais sem estimulação por CD40L. CHIR-12.12 inibe a fosforilação de IKKa (Ser 180) e IKK$ (Ser 181), Akt, ERK e p38 em células B normais. 6

Nestas experiências, 1,0 x 10 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram colocadas em privação de soro em meio contendo 1% de FBS e foram estimuladas com 1 pg/ml de sCD40L (Alexis Corp.,

Bingham, Nottinghamshire, UK). As culturas foram tratadas com CHIR-12.12 (1 e 10 pg/ml) e IgG de controlo. As células foram colhidas aos 0 e aos 20 minutos. Detectou-se fosfo-IKKa, fosfo-ΙΚΚβ, ΙΚΚβ total, fosfoERK, ERK total, fosfo-Akt, Akt 210 total, fosfo-p38 e p38 total por Western Blot nos lisados celulares.

Abreviadamente, a estimulação por sCD40L resultou no incremento da fosforilação de ΙΚΚα/β, da fosforilação de ERK, da fosforilação de Akt e da fosforilação de p38, deste modo conduzindo à sobrevivência e/ou proliferação das células. 0 tratamento das células com CHIR-12.12 anulou os efeitos da estimulação por sCD40L sobre estas vias de sinalização em células B normais (dados não apresentados). CHIR-12.12 inibe as vias de sinalização múltipla, tais como as vias de PI3K e MEK/ERK, na cascata de sinalização de CD40. 6

Nestas experiências, 1,0 x 10 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram colocadas em privação de soro em meio contendo 1% de FBS e foram estimuladas com 1 pg/ml de sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK) . As culturas foram também tratadas com CHIR-12.12 (1 e 10 pg/ml), Wortmanin (um inibidor de PI3K/Akt; 1 e 10 μΜ) , LY 294002 (um inibidor de PI3K/Akt; 10 e 30 μΜ) e PD 98095 (um inibidor de MEK; 10 e 30 pg/ml) . As células foram colhidas aos 0 e aos 20 minutos. Detectou-se fosfoERK, fosfo-Akt, Akt total, fosfo-ΙΚΚα/β e total por Western Blot nos lisados celulares.

Abreviadamente, os resultados mostram que a estimulação com CHIR-12.12 anulou a fosforilação de todas estas moléculas de transdução de sinal, enquanto que os inibidores da transdução de sinal exibiram apenas uma anulação especifica da sinalização, indicando que a inibição por CHIR-12.12 se exerce provavelmente a montante destas moléculas de transdução de sinal mediadas pela estimulação por CD40L (dados não apresentados). 211 CHIR-12.12 inibe a ligação das moléculas de sinalização TRAF2 e TRAF3 ao domínio citoplasmático de CD40 em células B normais. 6

Nestas experiências, 4,0 x 10 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram colocadas em privação de soro durante 4 horas em meio contendo 1% de FBS e foram estimuladas com 1 pg/ml de sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK) durante 20 minutos. As células foram colhidas aos 0 e aos 20 minutos. O CD40 foi imunoprecipitado usando anti-CD40 policlonal (Santa Cruz Biotechnology, CA) , e foi sondado num Western Blot com mAb anti-TRAF2 (Santa Cruz Biotechnology, CA) , mAb anti-TRAF3 (Santa Cruz Biotechnology, CA) e mAb anti-CD40 (Santa Cruz Biotechnology, CA).

Abreviadamente, os resultados mostram que TRAF2 e TRAF3 co-precipitaram com CD40 após a estimulação por sCD40L. Por contraste, o tratamento com CHIR-12.12 anulou a formação do complexo de sinalização CD40-TRAF2/3 em células B normais estimuladas por sCD40L. Não ocorreram alterações da expressão de CD40 (dados não apresentados).

Sem que se pretenda uma limitação a qualquer teoria, os resultados destas experiências, e os resultados nos exemplos acima expostos, indicam que o anticorpo CHIR-12.12 é um anticorpo monoclonal antagonista anti-CD40 de dupla acção que possui uma combinação única de atributos. Este anticorpo monoclonal inteiramente humano bloqueia as vias de sinalização por CD40 mediadas por CD40L dirigidas à sobrevivência e proliferação de células B; este antagonismo conduz em última instância à morte celular. CHIR-12.12 medeia igualmente o reconhecimento e a ligação pelas células efectoras, iniciando a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Uma vez estabelecida a ligação entre CHIR-12.12 e as células efectoras, são libertadas enzimas citoliticas, conduzindo à 212 apoptose e lise das células B. CHIR-12.12 evidenciou-se como um anticorpo antitumoral mais potente do que o rituximab nas comparações efectuadas em modelos tumorais pré-clínicos.

Exemplo 6: Formulação Farmacêutica Líquida para os Anticorpos Antagonistas Anti-CD40

Sabe-se que a estabilidade das proteínas é sensível ao pH da solução, uma vez que a carga de superfície de uma proteína varia com o pH da solução, resultando em estabilização ou desestabilização. Assim, formulações não-óptimas de pH podem alterar a interacção electroestática, conduzindo à degradação física de um anticorpo antagonista anti-CD40, tal como agregação, precipitação e semelhantes. A alteração das condições de pH poderá também causar a quebra de ligações covalentes, conduzindo à degradação química, tal como fragmentação, desamidação e semelhantes. Este estudo foi, deste modo, concebido para identificar um pH óptimo em solução para minimizar a degradação de anticorpo antagonista anti-CD40 devida a agregação, fragmentação e desamidação. 0 objectivo deste estudo foi o de investigar os efeitos do pH da solução sobre a estabilidade do anticorpo antagonista anti-CD40 CHIR-12.12, recorrendo a métodos biofísicos e bioquímicos para seleccionar o meio óptimo de solução para este anticorpo. Os resultados da Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) mostraram que a estabilidade de conformação de CHIR-12.12 é óptima em formulações com um pH de 5,5-6,5. Com base numa análise resultante da combinação de SDS-PAGE, HPLC de exclusão molecular (SEC-HPLC) e HPLC de troca catiónica (CEX-HPLC), determinou-se que a estabilidade fisicoquímica de CHIR-12.12 é óptima a um pH de cerca de 5,0-5,5. Tendo em vista estes resultados, uma formulação farmacêutica líquida recomendada compreendendo este anticorpo corresponderá a uma formulação contendo CHIR-12.12 a cerca de 213 20 mg/ml formulado em cerca de 10 mM de succinato de sódio, cerca de 150 mM de cloreto de sódio e possuindo um pH de cerca de 5,5.

Materiais e Métodos O anticorpo CHIR-12.12 usado nos estudos de formulação é um anticorpo monoclonal humano produzido através de um processo de cultura de células CHO. Este mAb tem um peso molecular de 150 kDa e consiste em duas cadeias leves e duas cadeias pesadas ligadas entre si por ligações dissulfito. O anticorpo dirige-se contra o receptor de superficie celular CD40 presente em células que expressam CD40, incluindo células B normais e malignas, com o fim de tratar diversos cancros e doenças autoimunes/inflamatórias. A substância farmacológica anti-CD40 usada neste estudo foi um lote de anti-CD40 (CHIR-12.12) purificado derivado de células CHO. A composição da substância farmacológica foi de 9, 7 mg/ml de anticorpo CHIR-12.12 em 10 mM de citrato de sódio, 150 mM de cloreto de sódio a pH 6,5. A amostra de controlo neste estudo correspondeu à substância farmacológica recebida, que foi congelada a < - 60°C, descongelada à TA e testada juntamente com amostras de teste da estabilidade a pontos de tempo pré-determinados. As amostras para teste da estabilidade foram preparadas por diálise da substância farmacológica contra soluções de diferentes pH e a concentração de CHIR-12.12 em cada amostra foi determinada por UV 280, tal como apresentado na Tabela 8.

Tabela 8. Formulações de CHIR-12.12.

Composição do Tampão pH Concentração de CHIR-12.12 (mg/ml) 10 mM citrato de sódio, 150 mM cloreto de sódio 4,5 9,0 214 10 mM succinato de sódio, 150 mM cloreto de sódio 5, 0 9,3 10 mM succinato de sódio, 150 mM cloreto de sódio 5,5 9,2 10 mM citrato de sódio, 150 mM cloreto de sódio 6, 0 9,7 10 mM citrato de sódio, 150 mM cloreto de sódio 6, 5 9,4 10 mM fosfato de sódio, 150 mM cloreto de sódio 7,0 9,4 10 mM fosfato de sódio, 150 mM cloreto de sódio 7,5 9,5 10 mM glicina, 150 mM cloreto de sódio 9,0 9,5 A estabilidade fisicoquimica do anticorpo CHIR-12.12 nas diversas formulações foi ensaiada usando os protocolos que se seguem.

Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) A estabilidade conformacional das diferentes amostras de formulação foi monitorizada usando um VP-DSC MicroCal com aquecimento entre 15°C e 90°C a l°C/min.

SDS-PAGE A fragmentação e agregação foram estimadas usando um gel de Tris-Glicina a 4-20% sob condições não redutoras e redutoras. A proteina foi detectada por coloração com azul de Coomassie.

Cromatografia de Exclusão Molecular (SEC-HPLC) A fragmentação e agregação da proteina foram igualmente medidas por um aparelho de HPLC Water Alliance com uma coluna 215

Tosohaas TSK-GEL 3000SWXL, 100 mM de fosfato de sódio, pH 7,0 como fase móvel a uma taxa de fluxo de 0,7 ml/min.

Cromatografia de Troca Catiónica (CEX-HPLC) A degradação relacionada com a alteração de carga foi medida usando um sistema de HPLC Waters 600s com uma coluna Dionex Propac WCX-10, com HEPES 50 mM, pH 7,3 como fase móvel A e HEPES 50 mM contendo NaCl 500 mM, pH 7,3 como fase móvel B, a uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min.

Resultados e discussão

Estudo de estabilidade conformacional. O desdobramento térmico de CHIR-12.12 revelou pelo menos duas transições térmicas, provavelmente representando a fusão por desdobramento dos domínios Fab e Fc, respectivamente. A temperaturas superiores, a proteína provavelmente sofreu agregação, resultando na perda do sinal de DSC. Para fins de avaliação da formulação, a temperatura de transição térmica mais baixa foi definida como correspondendo à temperatura de fusão, Tm, neste estudo. A Figura 6 mostra a temperatura de fusão térmica como função dos pHs da formulação. As formulações a pH 5,5-6,5 forneceram anti-CD40 com uma estabilidade conformacional superior, tal como demonstrado pelas temperaturas de fusão térmica mais elevadas.

Análise por SDS-PAGE.

As amostras da formulação de CHIR-12.12 a pH 4,5-9,0 foram incubadas a 40°C durante 2 meses e foram submetidas a análise por SDS-PAGE (dados não apresentados). Sob condições não redutoras, foram observadas espécies com pesos moleculares (PM) de 23 kDa e 27 kDa nas formulações com pH acima de 5,5, tendo-se observado espécies com PM de 51 kDa em todas as 216 formulações, mas aparecendo menos a pH 5,0-5,5. Surgiu uma espécie com PM de 100 kDa a pH 7,5 e a pH 9,0.

Sob condições redutoras, CHIR-12.12 foi reduzido a cadeias pesadas e cadeias leves livres com PMs de 50 kDa e de 24 kDa, respectivamente. A espécie de 100 kDa pareceu não ser completamente redutível e aumentou com o aumento do pH da solução, sugerindo a possível ocorrência de uma associação covalente não-dissulfito nas moléculas. Uma vez que surgiram outras espécies com identidades desconhecidas na análise por SDS-PAGE, a comparação da estabilidade de cada formulação é baseada na pureza remanescente de CHIR-12.12. As formulações a pH 5,0-6,0 proporcionaram um meio mais estável para CHIR-12.12. Foram detectados poucos agregados por SDS-PAGE (dados não apresentados).

Análise por SEC-HPLC. A análise por SEC-HPLC detectou CHIR-12.12 intacto como a espécie do pico principal, uma espécie de agregação como espécie de um pico dianteiro separada da espécie do pico principal, uma espécie de grande fragmento como um pico de "ombro" precedendo a espécie do pico principal, e espécies de pequenos fragmentos foram detectadas após a espécie do pico principal. Após incubação a 5°C e a 25°C durante 3 meses, foram detectadas quantidades negligíveis de fragmentos e de agregados de proteínas (< 1,0%) nas formulações acima e a espécie CHIR-12.12 do pico principal permaneceu com uma pureza superior a 99% (dados não apresentados). No entanto, desenvolveram-se gradualmente fragmentos de proteínas por armazenagem a 40°C, e mais fragmentos se formaram a pH 4,5 e a pH 6,5-9,0, tal como mostra a Tabela 9. Após incubação das formulações de CHIR-12.12 a 40°C durante 3 meses, foram detectados cerca de 2-3% de agregados a pH 7,5 e a pH 9,0, enquanto que nas formulações a outros pH se detectaram menos 217 de 1% de agregados (dados não apresentados). Os resultados de SEC-HPLC indicam que CHIR-12.12 é mais estável ao pH de cerca de 5,0-6,0.

Tabela 9. Resultados de SEC-HPLC das amostras de estabilidade de CHIR-12.12 sob condições de armazenagem em tempo real e aceleradas.

Amostra O “O Pico Principal % Fragmentos t=0 O O O O O O 40°C t=0 o o o O O O O O O lm 2m 3m lm 2m 3m Controlo 99,4 99,2 99, 9 99,5 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 pH 4,5 99,4 93,2 86, 0 81,3 <1,0 6,4 13,2 18,1 pH 5,0 99, 8 98,7 91,3 89,2 <1,0 <1,0 7,8 10,2 pH 5,5 99, 8 98, 9 91,4 90, 6 <1,0 <1,0 7,6 8, 8 pH 6,0 99, 6 97,7 90,4 87,3 <1,0 1,9 8,2 11,7 pH 6,5 99,3 93,4 89, 0 86, 9 <1,0 5, 6 9, 9 12,4 pH 7,0 99,2 93, 9 87,4 85,1 <1,0 5, 5 11,1 13, 5 pH 7,5 99, 1 92,8 84,4 81,9 <1,0 6,4 12,9 16,2 pH 9, 0 99,3 82,4 61,6 50, 6 <1,0 15,4 36,2 47,6

Análise por CEX-HPLC A análise por CEX-HPLC detectou o CHIR-12.12 intacto como formando a espécie do pico principal; as variantes acidicas eluiram mais cedo do que a espécie do pico principal e as variantes de adição C-terminal de lisina eluiram após a espécie do pico principal. A tabela 10 mostra a dependência que as percentagens remanescentes da espécie de CHIR-12.12 do pico principal e das variantes acidicas manifestam relativamente ao pH da solução. A amostra de controlo continha já um elevado grau de espécies acidicas (~33%) , provavelmente devido a processos de fermentação e purificação ocorridos em fases precoces. A susceptibilidade de CHIR-12.12 a soluções de pH mais elevado é evidenciada por dois factos. Em primeiro lugar, a amostra da formulação inicial a pH 9,0 (t=0) gerou à 218 partida mais 12% de espécies acidicas do que o controlo. Em segundo lugar, a percentagem de espécies acidicas registou um aumento acentuado em função do aumento de pH. A degradação relacionada com a mudança de carga é provavelmente devida a desamidação. Os dados acima indicam que este tipo de degradação do anticorpo CHIR-12.12 foi minimizada no intervalo de pH de cerca de 5,0-5,5.

Tabela 10. Percentagem de área de pico, em CEX-HPLC, correspondente a CHIR-12.12 em formulações de diferentes pH sob condições de armazenagem em tempo real e aceleradas.

Amostra % pico principal % variantes acidicas t=0 5 °C 25°C O O O O O Π t=0 5°C 25°C O O Π 2^ O 0 Π 3 m 3 m 1 m 2 m 3 m 3 m 1 m 2 m Controlo 49,2 49, 8 49, 8 49,2 50,3 32,0 33, 7 33, 7 32,0 33, 6 pH 4,5 48, 5 49, 7 43,7 39,7 30, 0 32,5 32,6 38, 0 44,2 56, 4 pH 5,0 49, 6 49, 8 48,3 40, 6 31,4 32,7 31,8 35, 0 44,3 57,1 pH 5,5 50,7 50,3 48, 1 40, 0 30,2 32,6 31,8 37,8 00 to 63,3 pH 6,0 50,2 49, 9 47,9 37,4 23, 9 33, 1 33, 6 38,5 54,9 72,7 pH 6,5 49,4 49, 9 42,3 29,7 14,6 33,3 33, 6 47,7 65,2 84,6 pH 7,0 49,7 49, 9 21,9 - - 34,4 36, 4 64,4 - - pH 7,5 49,3 48,3 12,7 - - 35,5 40, 1 79,2 - - pH 9,0 41,3 31,8 - - - 44,7 59, 9 - - -

Conclusão O pH tem um efeito significativo sobre as estabilidades conformacional e fisicoquímica de CHIR-12.12. A degradação relacionada com a mudança de carga foi determinada como sendo a principal via de degradação de CHIR-12.12, tendo esta sido minimizada a pH 5,0-5,5. Com base nos dados globais de estabilidade, uma formulação farmacêutica liquida recomendada compreendendo este anticorpo será uma formulação compreendendo CHIR-12.12 a cerca de 20 mg/ml formulado em cerca de 10 mM de succinato de sódio, cerca de 150 mM de cloreto de sódio e possuindo um pH de cerca de 5,5. 219

Exemplo 7: Estudos Clínicos com IL-2 e Anticorpos Antagonistas

Anti-CD4 0

Objectivos Clínicos 0 objectivo geral é o de proporcionar uma terapêutica eficaz para tumores sólidos e cancros relacionados com células B que exprimem CD40, tornando-os o alvo de uma combinação de um anticorpo antagonista anti-CD40 e de IL-2, ou de uma sua variante biologicamente activa. Estes tumores incluem tumores sólidos como o carcinoma da bexiga, carcinoma da mama, cancro da próstata, carcinoma de células renais, carcinoma da nasofaringe, carcinoma de células escamosas, carcinoma papilar da tiróide, melanoma, carcinoma do ovário, carcinoma do pulmão, carcinoma do colo do útero, carcinoma do estômago, carcinoma do fígado, e sarcomas. Os cancros relacionados com células B incluem, de modo não limitativo, linfoma a células B, linfoma linfocítico crónico (CLL), leucemia linfoblástica aguda (ALL), mieloma múltiplo (MM), Macroglobulinémia de Waldenstrom, e Doença Sistémica de Castleman. 0 sinal para estas doenças é determinado na fase II, se bem que se possam obter algumas medidas da actividade na fase I. 0 anticorpo antagonista anti-CD40 inicial é o mAb CHIR-12.12, e o produto de IL-2 inicial é Proleukin®, o qual contém a muteína de IL-2 humana recombinantemente produzida des-alanil-1, serina-125.

Fase I

Avaliação da segurança e da farmacocinética - escalamento da dose dessas duas oncoterapias nas neoplasias. • Escolha de doses de cada oncoterapia baseada na segurança, tolerabilidade e alteração nos marcadores séricos dos respectivos alvos, i.e., CD40. Em geral é procurada uma dose terapêutica média para cada um desses anticorpos, quando usados em combinação, mas poderá ser adequado 220 reunir outras indicações de eficácia (deplecção de CD40+, etc) para o estabelecimento da dose. • Consideração do uso de mais do que uma combinação de doses especialmente para diferentes indicações, p.ex., a dose de combinação para LLC pode ser diferente da dose para NHL. Assim, poderá ser necessário transferir algum estabelecimento da dose para a fase II. • A dosagem para os pacientes é estabelecida semanalmente através de amostragem farmacocinética em tempo real (Pk). Inicialmente, um ciclo de 4 semanas corresponde à dosagem máxima permitida. A Pk poderá ser altamente variável, dependendo da doença estudada, da densidade de CD40, etc. • Este(s) ensaio(s) é(são) aberto(s) a indivíduos com tumores sólidos CD40+ e linfomas de células B, LLC e potencialmente outras neoplasias. • A decisão de descontinuar ou continuar os estudos baseia-se na segurança, na dose e nas indicações preliminares de actividade antitumoral, particularmente se de natureza sinérgica. • A actividade da terapia da combinação, determinada através da taxa de resposta, é determinada na Fase II. • Identificar a(s) dose(s) para a Fase II.

Fase II

Serão iniciados diversos ensaios clínicos para os tipos de tumores acima mencionados, com particular concentração nos tumores sólidos e no linfoma de células B, LLC e Mieloma Múltiplo (MM). Poderá ser necessário efectuar ensaios clínicos separados para o NHL de baixo grau e para o NHL de grau intermédio/alto, uma vez que o CD40 poderá ter uma função diferente dependendo do grau do linfoma. Mais do que uma combinação de doses e mais do que um regime poderá ser testado num ambiente randomizado de fase II. 221

Para cada doença, estabelecer como alvo uma população que tenha falhado na resposta ao tratamento padrão actualmente usado: • LLC: pacientes que se mostraram resistentes ao Campath® e à quimioterapia

• NHL de baixo grau: falha na resposta a Rituxan® ou CHOP-R

• NHL intermédio: falha na resposta a CHOP-R • Mieloma Múltiplo: falha na resposta à quimioterapia, falha na resposta a dexametasona com talidomida, ou falha na resposta à quimioterapia de dose elevada com falhas de resposta a transplante de células estaminais.

A decisão de descontinuar ou continuar o estudo é baseada na prova do conceito terapêutico na Fase II - Determinar se um marcador substituto pode ser usado como indicador precoce da eficácia clinica

- Identificar doses para a Fase III

Fase III A fase III dependerá da altura em que o sinal for detectado na fase II, e das terapêuticas competidoras que são consideradas como padrão de referência. Se o sinal surgir numa fase da doença para a qual não exista terapêutica de referência, então poderá delinear-se um ensaio-pivô de um só braço e bem controlado. Se existirem terapêuticas competidoras que são consideradas como terapêuticas de referência, então serão realizados estudos comparativos.

Exemplo 8: Cálculo das Curvas de Concentração Sérica de IL-2-Tempo para as Formulações Farmacêuticas de IL-2 A área sob a curva de concentração sérica-tempo (AUC) de IL-2 Proleukin® administrada subcutaneamente (SC) a 4,5 milhões de unidades internacionais (MIU)(equivalente a aproximadamente 275 μρ de proteína) foi determinada usando 222 dados de um estudo não publicado sobre o HIV. Os perfis de concentração sérica/tempo obtidos de 8 pacientes com HIV que eram anteriormente naive para a IL-2 foram medidos na sequência de uma exposição inicial à dosagem com IL-2 neste estudo. Para cada paciente, a AUC foi calculada usando a regra da linearização trapezoidal até às últimas concentrações mensuráveis e foi extrapolada para as 24 horas (software Winnonlin versão 3.1, Pharsight Corporation, Califórnia). A AUCO-24 média, o SD e os limites inferior e superior do intervalo de confiança de 95% para a dose de 4,5 MIU são apresentados na Tabela 11. 0 valor de AUCO-24 obtido a partir da IL-2 Proleukin® administrada SC em doses equivalentes a 18 MIU (1100 μρ) foi estimado usando os dados de três estudos diferentes nos quais este produto de IL-2 foi administrado SC. Dois destes estudos foram publicados, um em pacientes com HIV (N=3) (Piscitelli et al. (1996) Pharmacotherapy 16(5):754-759) e outro em pacientes com cancro (N=7)(Kirchner et al.(1998)Br. J. Clin. Pharmacol. 46:5-10) . O terceiro é um estudo não publicado no decurso do qual se reuniram dados de concentração sérica/tempo de 6 pacientes com cancro após a administração de doses SC de IL-2. A semelhança das AUC dos pacientes com cancro e dos pacientes infectados com HIV fora já anteriormente estabelecida (dados não publicados). As doses administradas nestes três estudos variaram entre 18 e 34 MIU. Para os dois ensaios publicados, os valores de AUC até às 24 horas (AUCO-24) foram normalizados para a dose de 18 MIU multiplicando a AUC pelo quociente de 18 e dividindo pela dose real em MIU. Por exemplo, se a AUCO-24 para uma dose de 20 MIU tiver sido calculada como correspondendo a 400, a AUCO-24 normalizada seria de 400*18/20 = 360. Para o estudo não publicado sobre pacientes com cancro, os valores individuais de AUC foram calculados a partir dos dados de concentração sérica/tempo usando a regra da 223 linearização trapezoidal até às últimas concentrações mensuráveis e foram extrapolados para as 24 horas (software Winnonlin versão 3.1, Pharsight Corporation, Califórnia), sendo então normalizados para a dose de 18 MIU, tal como acima apontado. A média e SD globais para os três estudos foram calculados como correspondendo à média ponderada das médias e das variâncias, respectivamente, usando as equações 1 e 2, v (n,X, 1- ,r......... . r %

ιΜι|γ14-Φ(n,+n2 +n3-3) ,em que ηχ, n2, n3, Xlf X2, X3 e Si2, S22, S32 correspondem ao número de indivíduos, às médias e às variâncias para cada um dos três estudos, respectivamente. XP e SDP são estimativas da média e do desvio padrão globais. Os valores globais de AUC média, o SD e os limites inferior e superior do intervalo de confiança de 95% para a dose de 18 MIU são igualmente apresentados na Tabela 11.

Tabela 11: média (+ SD) da AUCo-24 obtida após a exposição inicial a uma administração de dose única de IL-2 Proleukin® por via SC.

Dose de IL-2 Proleukin® (MIU/pg) AUCo-24 (IU*hr/ml) SD LI do IC 95%1 LS do IC 95%1 4,5/275 51 14 23 78 6,0/3672 65 22 107 7,5/458 79 29 21 137 224 18/1100 344 127 90 598 1 Limites superior (LS) e inferior (LI) dos intervalos de confiança de 95% (IC). Os IC 95% foram calculados como correspondendo à média ± 2SD. 2 Os valores para 6,0 MIU são estimados com base nos valores reais para 4,5 MIU e para 7,5 MIU.

Tal como aconteceu com a IL-2 Proleukin®, a L2-7001, uma formulação líquida de IL-2 monomérica, foi administrada a pacientes com HIV em doses que variaram entre 50 e 180 μρ (dados não publicados). As exposições obtidas neste estudo, medidas através da AUC, são apresentadas na Tabela 12. Estes valores de exposição estiveram dentro do intervalo de valores de exposição que foram qerados usando IL-2 Proleukin® (Tabela 11) .

Tabela 12: média (± SD) da AUC0-24 obtida após a exposição inicial a uma administração de dose única da formulação de IL-2 monomérica L2-7001.

Dose de L2-7001 (MIU/μς) AU C 0 - 2 4 (IU*hr/ml) SD 0,82/50 60 11 1,5/90 110 36 2,2/135 143 41 2,9/180 275 99

Os dados de exposição a IL-2 (AUC) foram obtidos a partir da literatura publicada sobre a administração SC de IL-2 humana nativa recombinante a 8 pacientes com cancro em doses variando entre 0,1 MU e 3,0 MU. As AUCs médias (% CV) reportadas para as doses de 0,3, 1 e 3 MU foram de 120 (38), 225 177 (36) e 359 (46) U*hr/ml (Gustavson (1998) J. Biol.

Response Modifiers 1998:440-449). Tal como indicado em Thompson et al. (1987) Câncer Research 47:4202-4207, as unidades medidas neste estudo foram normalizadas para unidades BRMP (Rossio et al. (1986) Lymphokine Research 5 (supl 1):S13- S18), sendo posteriormente adoptadas como unidades internacionais (IU) pela OMS (Gearing e Thorpe (1988) J. Immunological Methods 114:3-9). Os valores de AUC gerados sob as condições deste estudo são igualmente concordantes com os obtidos com a exposição estabelecida à IL-2 Proleukin®.

Os peritos no campo técnico a que pertencem estas invenções reconhecerão a possibilidade de efectuar muitas modificações e de criar outras formas de realização das invenções aqui apresentadas, tomando como base os ensinamentos apresentados nesta descrição e nas Figuras. Assim, deve depreender-se que as invenções são devem ser limitadas às formas de realização especificas que foram apresentadas, e que as modificações e outras formas de realização possíveis são entendidas como pertencendo ao âmbito das reivindicações anexas e das formas de realização aqui expostas. Se bem que nesta exposição se tenham utilizado alguns termos específicos, estes foram usados apenas num sentido genérico e descritivo e não com fins limitativos.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Hurst, Deborah Long, Li

Luqman, Mohammad

Lopes de Meneses, Daniel E.

Yabannavar, Asha Zaror, Isabel <120> Métodos Terapêuticos para Cancros Expressando o Antigénio CD40 226 <13Ο> ΡΡ23220.001 (281250) <150> 60/565,710 <151> 2004-04-27 <150> 60/525,579 <151> 2003-11-26 <150> 60/517,337 <151> 2003-11-04 <16 0 > 18

<170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> 1 <211> 720 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência codificante para a cadeia leve do anticorpo humano anti-CD40 (CHIR 12.12) <221> CDS <222> (1)...(720) <400> 1 atg gcg ctc cct SCt cag ctc ctg 999 ctg cta afcg ctc tgg gtc tet 48 Met 1 Ala Leu Bro Ala 5 Gin Leu Leu Gly Leu 10 Leu Met Leu Trp vai 15 Ser gga tcc agt 999 gat att gtg atg act- cag tet cca ctc tcc ctg acc 96 Gly ser ser Gly 20 Asp He Vai Met Thr 25 Gin Ser Pro Leu Ser Leu 30 Thr gtc acc cct gga gag ccg gee tcc ate fccc tgc agg tcc agt cag age 144 Val Thr Fro 35 Gly Glu pro Ala Ser lie 40 Ser Cys Arg Ser 45 Ser Gin Ser etc ctg tat agt aat gga tae aac tat fctg gat tgg tac ctg cag aag 192 Leu Leu Tyr 50 Ser AS» Gly Tyr S5 As» Tyr Leu Asp Trp 60 Tyr Leu Gin Lys cea 399 cag tet CC3 cag gtc ctg ate cct ttg agt tet aat cgg gee 240 Pro 65 Gly Gin Ser Pro Gl» Vai 70 Leu Ile Ser Leu 75 Gly Ser Asn Arg Ala 80 tcc 999 Stc cct gae agg ttc agt ggc agt gga tea ggc aca gat ttt 288 Ser Gly Vai Pro Asp 85 Arg Phe Ser Gly Ser 90 Gly Ser Gly Thr Asp 95 Phe 227 aca ctg aaa ate age aga 9*9 9*9 gcfc gag gat gtt ggg gtt tat tac 33S Thr fcau t-ys He ser Arg Vai Glu Ala Gl» A8p Val Gly val Tyr Tyr 100 105 110 tgc afcg caa gct cga caa act cca ttc act ttc gge cct 990 aee asa 394 Cys Jtefc 31n Ala ftrg Gin Thr Fro Phe Thr Pfee Gly Fro Gly Thr Uia 115 120 135 §t§ gaft ate aga cga act gtg gct gea cca. fccfc gtc ttc ate ttc ccg 432 VAl Asp lie Arg· Arg Thr Vai Ala Ala Fro Ser val Pha He Phe Fro 138 135 140 aca tet gat gag eag tfcg aaa tet 99» act gee tet gtt 9tg tgc ctg 490 Fro Ser Asp 01« Gin JUeu tys Ser Gly Thr Ala ser Val Val Cys teu 14 S ISO 155 ISO ctg aat aac ttc tat ecc aga gag gee &&a gee cag tgg aag gsg gat S28 reu Asn Asa Pha Tyr Fm Arg Glu Ala tys vai Glu Trp rys Val A8p iás 170 175 aac gee etc caa teg ggt aac tce cag 3*9 agt gtc aca gag cag gac S76 Asa Ala leu OlB Ser Giy As» Ser 01« <31 u ser val Thr Glu Gin Asp xos 105 ISO age aag gac age acc fcac age ate age age aec cfcg aeg ctg age aaa 524 Ser tys A»p Ser Thr Tyr Ser leu Ser Ser Thr teu Thr teu Ser l*ye 105 200 205 §ca gac tae Sag aas esc asa gtc tac gee tge gaa gtc acc cat cag 672 Ala Asp ay*1 Glu Lys Hia Lys Vai yyr Ala Cys Glu Val Thr Sia Gin 210 2X5 220 ggc efcg age teg eec gtc aca aag age ttc aac ogg gga §A9 tgt tag 720 Gly I>eu Ser Ser Pro Vai Thr t>ys Ser PJie As» Arg Gly Glu Cyo * 225 230 235

<210 > 2 <211> 239 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia leve do anticorpo humano anti-CD40 CHIR 12.12 <400> 2 228

Leu Leu Gly Leu 1 Λ Leu Met Val tffefc Thr Gin *5C Ser pro Ala Tvr Ser Ile Ser 40 Asn Φ\>ν· < Cys Arg λ ésys 55 val Phe Leu Ile ser Ser Gly ser 4ν*ΠΡ m Leu Gly 75 Gly Ser val 90 Glu Ala Glu 105 Asp val Thr Pro Phe Thr 120 Phe Gly val 135 Ala Ala Pro Ser vai 140 Lys Ser Gly Thr Ala Sér 145 150; 151' ; 1€0 Leu As» Asn Piie Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp tys Val Asp 1ÊS 130 ......... 175 Aen Ala teu Gin Ser Gly As» Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp 180 185 ISO Ser Ly» Aap Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 1S5 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys val Tyr Ala Cya Glu Val Thr His Gin 210 215 220 Gly Léu ser Ser Pr© val Thr Lys Ser Phe Aen Arg Gly Glu Cys 225 230 235 téU frp Vai Ser 15 Leu Ser Leu Thr 30 Ser Ser Gin Ser 45 Tyr Leu Gin Ly» Ser Asn Arg Ala 30 Gly Thr Asp Phe 95 Gly Vai Tyr Tyr 110 Pro Gly Thr Lys 125 Phé i:ie Phe Pro vai Val GyU Leu

Wiiet Ala Leu Pro Ala Gin 1 S

Gly Ser Ser Gly Asp Ile 20

Val Thr Pro Gly Glu Pro 35

Leu teu Tyr Ser Asn Gly 50

Pro· Gly Gin Ser Pro Gin m 70

Ser Gly Val Pro Asp Arg 85

Thr Leu Lys IIe Ser Arg 100

Cya Mec Gin Ala Arg Gin 115

Vai Asp Ile Arg Arg Thr 130 pro Sér Asp Glu Gin Léu

<210> 3 <211> 2016 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência codificante para a cadeia pesada do anticorpo humano anti-CD40 CHIR 12.12 (com introns) <400> 3 229 atggagtttg ggccgagefeg ggcttccccc gttgcfcattt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagttgg tggagtcfcgg gggaggcgtg geccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgfcgcagcct ctggactcac ccxcagtagc catggcatgc actgggtccg ccaggccccs ISO ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttaca tcatacgagg aaagcaat&g ataccaegca 240 gactccgtga agggccgatt caccacctcc agagacaact ccaagatcac gctgtatctg 300 oaaacgaaca gcetcagaac ogaggacaçg gctgcgtatc actgcgcgag agatgggggt 360 atagcageac ctgggccfega ctactggggc cagggaaccc cggfccaccgt ctcctcagca 420 agtaccaagg gcccatccgt cttccccctg gcgcccgcta gcaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgfccgtgg 540 aactcaggçg cectgacçag eggcgtgcac açettceegg cfcgfceqeaca gtcctçagga 600 cfcctactccc tcagcagcgc ggcgaccgtg ccctccagca gcKxgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagçaac accaaggcgg acaagagagt cggcgagagg 720 ccagcacagg gagggagggt gtctgctgga agccaggctc agcgetcctg cctggacgca 780 tcccggccat gcagccccag tccagggcag caaggcaggc cccgtctgcc tcttcacccg 840 gaggcctctg cccgccccac tcacgctcag ggagagggtc ttctggcttt. rtccccaggc SoO tefegggoaiS cacaggetag gtgcccctaa .çççaggceet gcacaesaag gggcaggtgc 960 tgggctcaga cctgccaaga gccat&tccg ggaggaccct gcccctgacc taagcccacc 1020 ccaaaggcca aaceccceac cccctcagct cggacacctt etctcccccs agaccçcagt 1080 aaçtcçcgafc cttctcfcetg cagagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccaee 1140 gtgeccaggt aagccagccc aggcctcgcc ctceagcfcea aggcgggaca ggegccctag 1200 agtagcctgc atccagggac aggccccagc cgggtgctga cacgtcçace tccafcctctc 1260 cctcagcacc tgaacccctg gggggaccgc cagucfctect cttcccccca aaacccaagg 1320 acaccctcac gateteccag acccctgagg tcacafcgcgt ggeggtggae gtgagceacg 1380 aagaceccga ggtcaagfctc aactggtacg cggacggcgt ggaggtgeat aatgccaaga 1440 eaaagccgcg ggaggagcag cacaacagga cgcaccgfcgç ggteagcgtc cçcaccgccc isoo tgcacc&gga ctggctg&at ggcaaggagt acaagtgcaa ggtçtccaaç aaagccctcc 1560 cagcccccat cgagaaaacc acccccaaag ccaaaggtgg gacecgtggg gcgcgagggc 1620 cacatggaca gaggccgget cggcccaccc tccgccctga gagtgaccgc tgcaccaacc 1680 tctgtcccta cagggcagcc ccgagaaocâ caggtgtaca ccctgccecc atcccgggag 1740; gagatgacca agaaccaggt cagcccgacc tgcccggtca aaggcetcta tcecagcgac 1800 âtcgccgtgg agtgggagag c&atgggsag ccggagaâca actacaagac caçgcctccc 1860 gcgccggact ccgacggctc ccacutcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1920 tggcagcagg ggaacgtcct ctcatgctce otgafcgçatg aggctetgca eaacesctac 1980 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggc aaatga 2016

<210> 4 <211> 469 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia pesada do anticorpo humano anti-CD40 CHIR-12.12 <400> 4 230

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Vai Phe Leu vai Ale Ile Leu Arg Gly 1 5 10 15 val Gin CVS Gira Val Gin LSU Vai Glu Ser Gly Gly Gly Val Val 6Í« 20 25 30 Pro Gly Arg ser Léu Ax§ Leu Ser Cys Ale Ala Ser Giy Phe thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Vai Arg Gin.. Ala· Pro Gly Lys Giy Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Vai lie Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala 65 70 75 88 Asp ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys He 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Thr Gltt :Asp: :Thr Ala val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala ,Arg Asp Giy Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pr©í Asp Tyr 115 120 125 iXp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 1 Vai Ser Ser Ala Seir Thr Lys siy Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys Ser Thr Ser Gly Giy: 145 ISO 155 168 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro val 165 170 175 Thr vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val val 195 200 205 Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn MÍ S: Ly«: Pro ,Set Asn thr Lys Vai Asp Lys Arg Val Glu p*o Lys 225 230 235 248 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys AgA Pro Alá Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pto Ser Vai Phe Leu Phe Pm Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Lee· Met lie Ser .Arg Thr Pro Glu Vai thr Cys vai; Val Vai Asp Val 275 280 285 Ser Hís: GlU Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly val 250 295 30® Glu Vai His Asa Ala Lys Thr Lys pró: Arg GiU Glu Gin tyr Asn Ser 3QíS 310 315 320 Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Val Leu His Gín Asp Trp 'Leu 325 330 33:5 Asn Giy LyS Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro· Ala 340 345 350 Pro He Gltt Lys Thr 11« Ser Lys Ala Lys Giy Gin Pro Arg Glu Pro Gin vai 33f5» Tyr Thr Leu íqv Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 365 Thr Lys Asn Gin 320 375 380 Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vel Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala 385 398 395 400 Vai Glu Trp Glu ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 4XS Pro Pro Vai Leu Asp Sèr Asp Gly Ser Phe Phe Léu Tyr Set Lys Leu Thr Vai Asp Lys Sèr Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 430 Ser Cys Ser 435 440 445 Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys ser Leu Ser 450 455 468 Leu Ser Pro Gly Lya

46S 231

<210> 5 <211> 469 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Cadeia pesada da variante do anticorpo anti-CD40 humano CHIR-12.12 <400> 5 232 mt 01 u Pb® Gly Lee Ser Trp Val Phe hm Val Ala II® Leu Arg Gly % 5 10 15 Val Gin Cys Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met Eis Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu $o $s m Glu Trp Vai Ala Vai lie Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala 65 70 75 80 Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp As» Ser Lys Ile SS 50 35

Thr Leu Tyr Tyr Trp Gly 130 Pro Ser 145 Thr Ala Thr Vai Pro Ala Thr Vai 210 Asn Kis 225 Ser Cys Leu Gly Leu Het Ser His 290 Glu Vai 305 Thr Tyr AS» Gly Pro Ile Sl« Vai 370 Vai Ser 385 Vai Glu Pro pro Thr V&l 'Vai: Met

Tyr LéU Gin 100 Cys Ala Arg 115 Gin Gly Thr Vai Phe Pro Ala Leu Gly 165 Ser Trp As» ISO Vai Leu Gin 195 Pro Ser Ser Lys Pro Ser Asp Lys Thr 245 Gly iro Ser:2|0 ile Ser Arg 275 Glu Asp Pro His Âsn AlaArg Vai vai 325 Lys Glu Tyr 340 Glu Lys Thr 355 Tyr Thr Léu Leu Thr Çye Trp Glu Ser 4 0S Vai Leu Asp 420: Asp Lys Ser 435 Kis Glu Ala

Mer An» Asp Gly Leu Vai 13$ Leu Ala ISO Cys Leu Ser Gly Ser Ser Ser Leu 215 Ase Thr 210 His Thr Vai Phe Thr Pro Glu Vai 29S Lys Thr 310 Ser Vai Lys Cys lie Ser Pro Pro 375 Leu Vai 390 Asa Gly Ser Asp Arg Trp leu ais

Ser Leu 105 Gly Ile 120 Thr Vai Pro Ser vai Lys Ala Leu 165 Gly Leu 200 Gly Thr Lys Vai Cys Pro Leu phe 255 Glu Vai 200 Lys Phe Lys pro Leu Thr' Lys Vai 345 Lys Ala 360 Ser Arg Lys Gly Gin Pro

Arg Thsr Glu Asp Ala Ala Ser Ser

Gly ser 42$ Gin Gin "440 Asn His

Ser Lys IS 5 Asp Tyr 170 Thr Ser Tyr Ser Gl» Thr Asp Lys 235 Pro Cys 250 Pro Pro Thr Cys Asn Trp Arg Glu 315 Vai Leu MO Ser Asn Lys Gly Glu Glu Phe Tyr 395 Glu AS» 410 óhe The Sly Asn Tyr Thr

Pr o G ly 125 Ala Ser 14 δ Ser Thr

Phe Pro Gly Vai Leu Ser 205 Tyr Ile 220 Arg Vai Pro Ala Lys Pro Vai Vàl 265 Tyr Vai 300 Glu Gin His Gin. Lys Ala Gin Pro 365 Hefc Thr 380 Pro Ser Asn Tyr Leu Tyr Vàl Phe «45 Gin Lys.

Thr Ala Vai 110 Pro Asp Tyr Thr Lys Gly Ser Gly Gly ISO Glu Pro Vai 17S His Thr Phe 190 Ser val vai Cys Asn Vai Glu Pro Lys 240 Pro Glu Leu 255 Lys Asp Thr 270 Val Asp val Asp Gly Val Tyr Asn Ser 320 Asp Trp Leu 335 Leu Pro Ala 350 Arg Glu Pro Lys Asn Gin Asp Ile Ala 400 Lys Thr Thr 415 Ser Lys Leu 430Ser Cys ser ser Leu :Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys 465 233

<210> 6 <211> 239 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia Leve de anticorpo humano anti-CD40 CHIR-5 <400> 6

Met Ala Leu Leu Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Ala ile Val Met Thr Gin pro Pro Leu Sar Ser Pro 20 25 30 Vai Thr Leu Gly Gin Pr© Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser 35 40 45 Leu vai His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gin Gin Arg 50 55 80 Pro Gly Gin Pr© Pro Arg Leu Leu ile Tyr Lys Phe Phe Arg Arg Leu SS 70 75 80 Ser Gly Vai Pr© Asp Arg Phe ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gin val Thr Gin PfcS Pro His Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg 11S 120 135 Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro ser Aap Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys val Gin Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gin ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp 180 185 190 Ser Lys Aap Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Aap Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala cys Glu Val Thr His Gin 210 215 220 Gly leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

<210> 7 <211> 474 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> CHIR-5.9 <223> Cadeia Pesada do anticorpo humano anti-CD40 <4 0 0>7 234 1 Giy Ser Thr Ala lie Leu Ala Leu Leu Leu Ala Vai Leu Gin * K. Gly vai Cys Ala Glu 20 Vai Gin Lee Vai Gin 25 » V Ser Gly Ala Glu vai 30 Lys Lys í>ra Gly Glu IR Ser IíSÍI: Lys ile Ser Cye LyS: Gly Ser Gly AC Tyr :Ser S>he Thr Ser Tyr Trp iie:: Gly "ΐϊρ %v Vai: &rg Gin Éet Pro Gly Lys Gly Leu m ss 60 Glu Τέρ (4efc Gly Ile Xle 70 Tyr Pro Gly Asp Ser 75 Asp Thr Árg Tyr Ser eo Pto Ser 3*he Gin Gly Gin Vai Thr Ik Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser

Thr Ala Tyr Leu 85 Gin Trp Ser 30 Ser Leu Lys Ala Ser Asp 35 Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 100 Alá Arg Gly Thr 105 Ala Ala Gly Arg Asp Tyr 110 Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 115 Met Asp Vai Trp Giy 120 Gin Gly Thr Thr v»l 125 Thr: Vál Ser Set 130 Ala Ser VAK Thr Lys Gly Pro 135 Ser Vai Phfe Pro Leu \ R'fc 140 Ala Pro Ala Set: w* Ser Thr Ser: Gly Gly Thr Ala Ala Léu Gly Cys Leu Vál Lys Asp Tyr The Pr© Glu Pro 165 vai Thr Vai 170 Ser Trp Asn Ser Gly Ala 175 Leu Thr Ser Gly Vai His ISO Thr Phe Pro Alá: 1S5 Vai Leu Gin Ser Ser Gly 190 Leu Tyr Ser Leu Ser 19:5 Ser vai Vai Thr Vai 200 Pro Ser Ser Ser Leu 205 Gly Thr Gin Thr 210 Tyr ile Cys Aso vai Asn 215 HiS Lys Pro Ser Asn 220 Thr Lys Vai Asp Lys 22S Arg Vai Glu Pire 230 Lys Ser CyS 235 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 240 cye Pro Ala Pro Glu 245 Leu Leu Gly 250 Gly Pro Ser Vál Phe Leu 255 Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 Asp Thr Leu «et 2SS Ile Ser Arg Thr Pro Glu 270 Vai Thr Cys Vai vai 275 Vai Asp Vai Ser His 280 Glu Asp Pro Glu Vál 285 Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 205 Glu Gin Tyr Asn 310 Ser Thr Tyr 315 Arg Vai Vál Ser vaí Léu Thr vai 320 Leu Sis Gin Asp Trp 325 Leu Asn Gly 330 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 335 Vai Ser Asn Lys Ala Leu 340 Pro Ala Pro 11« 345 Glu Lys Thr 11« Ser Lys 350 Ala Lys Gly Gin Pro 355 Arg Glu Pro Gin Vai 360 Tyr Thr L«u Pro Pro 365 Ser Arg Glu Glu 270 Met Thr Lys Asn Gin Vai 375 Ser Leu Thr Cys Leu 388 Vai Lys Gly Phe Tyr 385 Pró Ser Asp ile 380 Ala Vai Glu 395 Trp Glu Ser Asn siy Gin Pro Glu 400 Asn As ti Tyr Lyé Thr 405 Thr Pro Pro 410 Vai Leu Asp Ser Asp Gly 415 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 Lys Leu Thr Vai * '425 Asp Lys Ser Arg Trp Gin 430 Sl» Gly Asn Vai Phe 425 Ser cys Ser Vai Mét 440 His Glu Ala Leu His 445 Asn His Tyr Thr 450 Gin Lys *65 Ser Leu Ser Leu 470 455 Ser Pro Gly Lys 460 235 <210> 8

<211> 474 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Cadeia pesada da variante do anticorpo humano anti-CD40 CHIR-5.9 <400> 8

Met: Gly Ser Thr Ala Ile teu Ala teu teu teu Ala Vai teu Qln Gly 1 S 10 IS

Uai Cys Ala Siu Uai fíln teu ¥al Gin Ser Gly Ala Slu Vai tva Lys 20 25 30 236

rrO euy GAU ser Leu Lys lie Ser Cys :LyS: Gly Ser Gly :Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Vai Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu frp í4e7 Gly Ile He Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr *3% Tyr Ser 65 70 75, SO Pro Ser Phe Gin ciy Gl« Vai Thr He Ser Aie Asp Lys Ser Ile Se r 65 30 35 Thr Ala Tyr Leu Gin Trp ser Ser li&u Lys Ala Ser AéP Thr * Ί Λ Ala Kefe Tyr Tyr Cys Ala Arg Giy Thr Ala Js vr.y? Ala Gly Arg :Asp Tyr Tyr Tyr :Tyr lis J2Q 125 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Giy Thr Thr Val Thr vai Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu :A1« pro Ser Ser Lys tm ISO 1SS 160 Ser Th-X Ser Gly Gly Thr JVX-ã âía Leu Gly cys Leu val Lys Asp Tyr 1:65 170 175 Phe Pro Cl» Pm Val thr Vâi Ser Trp Λ 0& Asn Ser Gly Ala Leu Iflfi Thr Ser Giy :VâI Mis £-&v Thr Phe Pro Ala val Leu Gin ser Ser Giy Léu Tyr ser 19S 200 30S Leu Ser ser Vã 1 val Thr val pro Ser ser ser Leu aiy Thr Gin Thr 210 215 220 Tyr Ile Cys :A©n val Asn His Lys Pro Ser ASJfí Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 260 Arg 1¾¾ QlXk Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr ais Thr cys Pro Pro cys 245 2SQ 255 Pro Ala. Pro Glu i^eu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe pro Pro 250: 265 270 Lys Pro Lys Asp: Thr Leu Mèr lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cye 27S 2S9 285 Val Vai Vai ASp Val Ser kís Glu Asp Pro Glu Vai Lys Pfce Asn Trp 330. 295 30Ô Tyr Vai Asp Giy Val Glu val Hl# Asn Ale Lys Thr Lys Pro Arg <sm 305 310 31$ 320 Glu Gin Tyr ÃSS SçíjT Thr Tyr Arg vai vai ser Val Léu Thr val Leu 325 330 335: K.i« Gin Asp Trp Leu Asn. Gly Lys Glu Tm Lys Cys Lys vai ser Asn 350: 345 350 Lys Ala Leu Pm Ala ir» ile Glu Lys Thr Ile Se* Lys Ala Lys Gly 355 360 365 Gin Pro Arg: Glu Pro Gin· Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 37©: 375 3®6 14efe Thr Lys Gin Val Ser Leu Thr cys Leu vai Lys Gly Phé Tyr 365 .350· 355 400 Pro Ser Asp lie ΛΙ& val Glu Trp Glu S^r A 3h Giy Gin pro Glu Asn 405 410 415 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser phé Phe 420 425 430 Leu Tyr Ser·' Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin GI» Gly àsú 435 440 445: Vai Phe Se» Cys Ser Vai Mer Ris Glu Ala Leu HiS Asn Kis Tyr Thr 450 455 460 Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly LyS 465 ' '470 237 <210> 9 <211> 612 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> caract_mista <222> (0) . . . (0) CD4 0 <223> Sequência codificante para a isoforma curta do humano

<221> CDS <222> (1) . . . (612) <400> 9 238 atg gtt cgt etg cet ctg cag tgc gfec etc &SS ggc tgc ttg ctg acc 48 «et val Arg Leu Pro Leu Gin Cys vai Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 gct gte cafc cca gaa cca ccc act gea tgc aga gaa aaa cag tac cta 96 Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gin Tyr Leu 20 25 30 ata aac agt eag tgc tgt tet ttg tgc cag cca 93« cag aaa ctg 9*9 144 tle km Ser Gin Cys Cys Ser Leu Cya Gin Pro Gly GXn Lys Leu Val 35 40 45 agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc 99* gaa 193 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu cys Leu Pro Cys Gly Glu so ss 60 age gaa ttc cta gac acc tgg aac aga S»3 aca cac tgc cac cag cac 240 Ser Glu Ph® Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr HiS Cys His Gin His es 70 75 80 aaa tac tgc gac ccc aac «ta aaa ctt cgg gte cag cag aag ggc acc 388 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg vai Gin Gin Lys Gly Thr 3S 80 95 tea gaa aca gac &CC ate tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg c ac tgt acg 338 Ser Qlu Thr Asp Thr lie Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp Kis Cys Thr 100 105 110 agt gag gee tgt S»9 age tgt gte ctg cac Ggc tea tgc teg CCC 99G 384 Ser Glu Ala cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 130 125 ttfc ggg gte aag cag att gct aca ggg gtt tet gat acc ate tgc gag 432 Phe Gly Val Lys Gin He Ala Thr Gly Val Ser Asp ftr Ile cya Glu 130 135 140 ccc tgc cca gte 93« ttc ttc tcc aat gfcg tea tet gct ttc gaa aaa 480 Pro Cya Pro Val Gly Pbe Phe Ser Asn val Ser Ser Ala Phe Glu Lya 14 S ISO 155 ISO tgt cac cct tgg aca agg tcc cca 93» teg gct gag age cct ggt ggt 528 Cys Sis Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly 105 170 175 gat ccc cat cat ctt «99 gat cct gtt tgc cat cct ctt 39* S«* ggt 578 Asp Pro His HiS Leu Arg Asp Pro vai Cys His Pro Leu Gly Ala Gly 180 185 190 etc cat caa aaa ggt ggc caa gaa gee aac caa taa 612 Leu Tyr Gin Lys Gly Gly Gin Glu Ala Asn Gin ★ 195 300 <210> 10 <211> 203 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 10

Met Vai Arg Leu Pro Leu Gin Cys Vai Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 239 I 5 10 15

Ala Vai His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gin fyr Leu 20 25 30

Xle Asn Ser Gin Cys Cys Ser Leu Cys Cia Pro Gly Gin Lys Leu vai 35' 40 45:

Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly aiu 50 55 60'

Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asm Arg Glu Thr His Cys His Gin His 65 70: 75 80

Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Vai Gin Gin Lys Gly Thr 0:5 m' 95

Ser Glu Thr Asp Thr Xle Cys Th* Cys Glu Glu Gly Trp Mi: Cys Thr 100 105 110

Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys vai Leu His Arg Ser Cys Ser Piro Gly 115 120 125

Phe Gly Vai Lys Gin Xle Ala Thr Gly Vai ser Asp Thr Xle Cys Glu 130 135 140

Pro Cys Pro Vai Gly Phe Phe Ser Asn Vai Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160

Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly 165 1T0 175

Asp Pro His His Leu Ara Asp Pro Vai Cys Bis Pro Leu Gly Ala Gly 180 185 190

Leu Tyr Gin Lys Gly Gly Gin Glu Ala Asn Gin 155 2Ô0 <210> 11 <211> 834

<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> caract_mista <222> (0) ... (0) <223> Sequência Codificante para a Isoforma Longa do CD40

Humano

<221> CDS <222> (1) ... (834) <400> 11 240 m atg gtfc cgt ctg cm ctg cag fege gtc ctc tgg gge tgc ttg ctg acc

Met V«I Arg Leu Pr» Leu Gin Cys Vai Eeu Trp Gly Cy©: Leu heu Thr 1- " S 10 li gch gtc cat cca gaa cca cce act gea tgc aga gaa aaa cag tac cta Alá Vá! :His Prô 20 Glu Prc Pm Thr Ala 25 Cys Arg Glu lys Gin Tyr 30 LôU ata áác agt eag tgc tgt tet ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg lie Asn Ser 35 Gin Cys Cys Ser Leu Cys 40 Gl» Pr© Gly Gin 45 Lys L&n vai agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgé ctt cct tgc ggt gaa Set Asp 50 Cys Tfer Glu Phe Thr 55 GM Thr Gin Cys Le« Pro 60 Cys Giy Glu age gaa ttc cta gae acc tgg áac aga gag aca cac tgc cac cag cac: Ser Glu £5 Phe Leu Asp Thr 70 Trp fte« Arg Glu Thr 75 His Cys His Gin His 8:0 áaa tac tgc gac cce aac C tá: W9 ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc Lys Tyr Cys Pro 85 Asn Leu mr Léu Arg vai 40 Gin Gin Lys Gly 95 Thr: tea gaa aca gae ãcc ate tgc ace tgt gaa gaa gge tgg cac tgt «cg

M 144 192 240 288 3 36 241 384

Sbv Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys GTu Glu 61 y Trp HíS Cys Thr XOÔ 105 1X0 agt gag gcc tgt gag age tgt gtc ctg cac ege cca tgc teg ccc ggc

Ser GIm Ala Cys ôia Ser Cys Vai teeu His Arg Ser Cys Ser Pro 6ly XIS 120 125 ttt ggg gtc aag cag aro gct aca ggg gtt tet gat acc ate tgc gag

Phe 61 y Vai %s Gin Ile Ala Thr Gly Vai Ser Asp Thr Xle Cys Glu 130 135 149 ccc tgc cca gtc ggc etc etc tec aat gtg tea tet get ttc gaa aaa

Pro Cys pro Vai 61 y Mi® Phe Ser Asn Vai Ser Ser Ala Phe Cia %ym U5 ISO X55 160 tgt cac cct cgg aca age tgt gag acc aaa gae ctg gtt gtg caa cag

XfiS 170 I7S gea ggc aca aac aag set gat gtt gfce tgt ggt ccc cag gat cgg ctg

Ala 61 y Thr Asa l>ys Thr Asp Vai Vai Cys 61y Pro Gin Asp Arg Leu

XOO 185 ISO sga gcc ctg gtg gtg ate ccc ate ate ttc ggg ate ctg ttt gcc ate

Arg Ala Ley Vai Vai Xle Pro Ile Ile Phe Gly Xle fce» Phe Ala lie 105 200 205

Ctc ttg gtg ctg gtc ttt ate aaa aag gtg gcc aag aag cca acc aat heu Xeu Vai heu Vai Pbe Xle t.ys Lys Vai Ala Lys t»ys Pro Thr Asn 310 21S 220 aag gcc ccc cac ccc aag cag gaa ccc; cag gag ate aat ttt ccc gae t>ys Ala Pro His pro bvs Glti 019 Pro Gin slu ile Asn Phe pro Asp 225 230 3 IS 249 gat etc cct ggc tee aac aefc gfifc. gct cca gtg cag gag sete tfca cate

Asp ieu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pto Vai Sln 61« Thr heu His 24 S 250 :2S5 gga tgc caa ccg gtc acc cag gag gat ggc aaa gag agt ege ate tea ©ly Cys 61» Pro Vai Thr Gin Glu Asp Gly X.ys ©ia Ser Arg Ile Ser 2# 255' 270 gtg cag gag aga cag tga

Vai Sln Glu Arg ©1» * 275 432 480 526 575 624 672 720 768 816 834 <210> 12 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapi <4 0 0> 12 242

Pfèt Val Arg teu Pro Leu Gin Cys Vai Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr X S 10 IS 65 145 25 Vai Kis Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu tys Gin Tyr Leu 20 25 30 Asn Ser Gin Cys Cys Ser Leu Cys Gin Pro Gly Gin tys teu Val 35 48 45 Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys teu Pro Cys Gly Glu □ W Glu Phe teu Asp 50 Thr Trp OV Asn Atg GlU Thr Kis Cys His Gin His 70 75 80 Tyr Cys Asp Pro 85 Asn Leu Gly teu Arg Val Gín 90 Gin tys Gly 95 Thr Glu Thr Asp Thr í ftft lie Cys Th* Cys Glu Glu Sly Trp His Cys Thr Gltt: 4Vv Ala Cys Glu Ser Cys iv5 Val teu His Arg Ser *ηΛ 1X0 Cys Ser Pro: Gly: Gly J, Vai ty&: Gin. SIS Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr 11« Cys Glu 130 135 140 Cys Pro Vai Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Λ <££ Ala Phe: Glu tys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr tys Asp Leu Val Val Gin 160 Glh 165 170 175 Gly Thr Asn tys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gin Asp Arg teu 180 185 190 Ala Leu vai Vai Ile Pro Ile He Phe Gly Ile 200 teu Phe Ala 'SÍVC Tle Leu Val teu Vai Phe He tys tys Val Ala tys tys Pro Thr Asn 210 2is 220 Ala Pro His Pro tys Gin Glu Pro Gin Glu Ile Asn phe Pro ftsp 230 23S 240 ueu pro Gly Ser Asn Thr: Ala Ala Pro Val Gin Glu Thr teu HiS 245 250 255 Cys Gin Pro Vai Thr Gin Glu Asp Gly tys Glu Ser Arg Ile Ser 265 270 260

Vai Gin Glu Arg Gin 275 <210> 13 <211> 459 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> Caract mista <222> (0) . . . (0) <223> Precursor de IL-2 Humana <221> CDS <222> (1)...(459) <400> 13 243 48 *69 tac agg aeg caa ctc ctg seu tet Ser tgc att gca efca agt ctt gça ctt Meti X. Tyr Arg Mefc Gin 5 Leu Gys ile xo Ala Seu Ser Leu Ala 15 Leu gte gca Val Ala aac Aac agfe Ser 30 gaa Ala: cct Pro act Thr tea Ser agt Ser 25 tet Ser aca Thr **g Sys aaa Sys aca Thr 30 cag Gin cfc.a Leu caa Gin ctg Leu gag Glu 35 cat His tta Seu ctg Seu ctg Seu gat Asp 40 tta Seu cag Gin atg «et att Xle ttg seu 45 aat Asn 39* G!y att Xle aat As» aac Asn 50 tac Tyr aag Sys aat Asn ccc Pro aaa sys 55 ctc .Lau acc Thr agg Arg atg «et ctc aca seu Thr 50 ttt Phe aag sys ttt Phe tac acg Tyr Mec 55 eec aag Pro Sys aag Lys gee Ala 70 aca Thr gaa Gin ctg Leu aaa Sys cat His 75 ctt Seu cag Gin tgt Cys cta gaa Glu 88 gaa Glu gaa Glu ctc Lêu aaa sys cct Pro 85 ctg Seu gag gaa Glu Gin gtg Val Cta' Seu se aat As» tta seu 9Ct Ala caa Gin age Ser 95 aaa Lys aac Asa ccc Phe eac His tta Leu aga Arg ccc Pro *99 3*e Arg Asp tta seu ate Ele age Ser aac Asn ate lie aac Asn gta Vai ata xle 100 105 1X0 gct ctg gaa cta aag gga fcct gaa aca aca ctc atg tgc gaa tat gct

Vai Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Piie Kefc Cys Glu Tyr Ala XIS 120 XS5 gafe- gag aca gca acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt

Asp Glu Thr Ai a Thr xle Vai Glu Phe seu Asa Arg Trp xle Thr Pbe 130 13S 140 tjgfc;· cag age acc acc cca aca ctg acc Cys Glrv Ser Xle: Xle .Ser: Thr Seu Thr X45 150 M 144 wz 240 388 3:35 384 432 459 <210> 14 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 244

Met Tyr Arg Met Gin teu l S Val Ala ASA Ser A1& Fro 20 Gin Leu Çlu His Leu Leu 35 As» Asn Tyr Lys As» PrO '50

Tyr Met Pzo Lys m Glu Glu Leu Lys :As» Phe His Leu: 100 Val Leu Glu, Leu 11S Asp Glu Thr Ala 130 Cyã: Gin Ser Ile 145

Lys Ala 79: Ρτο Leu 85

Arg Piro Lys <31 y

Thr ile "He Ser 150

Leu ser :Gyg ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu lo is Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu 25 30 Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu As» Gly Ile 40 4S Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe SS 60 Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu 75 80 Glu Glu 'Val Leu As». Leu Ala Gin Ser: :Ly:g: ao m Arg Asp Leu He Ser As» Ile Asn Val lie 105 110 Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala ias i2s Val Glu Phe Leu Asn: Arg Trp He Thr Phe L35 141: Thr Leu Thr <210> 15 <211> 399 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> caract mista <222> (0) . . · (0) <223> IL-2 madura humana <221> CDS <222> (D . . . (399) <400> 15 géa cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag eta caa etg gag cat 48 Ala Pro Thr S«r Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu His 1 5 10 is tta etg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag 96 Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 aat ccc aaa çtc aec agg atg etc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag 144 245

Asa Pro Lys 35 Leu Thr Arg Met Leu m Thr Phe Lys phe Tyr 45 Met Pro Lys sag gee aca gáá ctg aaa catt ctt e«g fcgt efea gaa Géa gaa etc asa 132 Lys Ala 50 Thr Glu Leu Lys Kis 55 Leu Gin Cys Leu Glu 80 Glu Glu Léu Lys ecc eeg gas oaa gfcg cta aat tra :gçt caa age aaa ââ®· ttt: cac teia 240 :Pro: 55 Leu Glu GlU vai Leu 70 Asa Léu Ala Gin Ser 75 Lys Asn Phe Kis Leu »9 aga cct ass gac çca ate age aat âtc aac gta ata gfct çtg· gaa cta 280 Arg Pro Arg Asp Leu lie 85 Ser Asn Xle Asn 90 Vai Ue Vai L«U Glu 95 Leu aag gga tcc gaa aea aca etc atg fcgt gaa cac gct gac gag aca góa. 33S Lys Gly ser Glu 100 Thr Thr Phe «et Cys 103 Glu Tyr Ala Asp Glu 110 Thr Ala aec att gta §aa ttt ctg aac aga tgf att ace ttt tgt cag age ate 384 Thr ate He Xlé tea Ser vai 115 aca Thr Glu ctg Leu Phe Léu act Thr Asn Arg 120 Trp He Tfer phe cys 125 Gin Ser He 339 130 <2 A o \—1 16 <2 11> 133 <2 12> PRT <2 13> Homo <4 A o o 16

Ala Pro 1 LéU Leu Asa Pro í»ys:· Ala 50 Pro Leu ô5 Arg Pro Lys Gly Thr íl® 11« ser 130

Thr se*' SUOU ASp 20 Lys Leu 35 Thr Glu Glu Glu Arg Asp Ser SÍu 100 Vai Glu 115 Thr leu SOir Ser 5 Léu Gin Thr Arg Leu Lys Vai Leu 70 Leu III 85 Thr Thr Phe Leu Thr

Thr Lys Lys Met He Leu 25 Mac Leu Thr 40 Ííis Leu Gin 55 Aon LfeVAia Ser As» He Phe Met Cys 305 Aen Arg Trp 120 ‘Thr Glu 30 Asn Gly Phe Lys Cys Leu

Leu Gin Leu Tle Asa. Asn 30 Phe Tyr Metm Glu Glu Glum Lys Asn Phe

Gin Ser' 75 Asn Vai lie Vai Leu 90 Glu Tyr

Xle Thr

Ala Asp Glu 110 Phe Cys Gin 125

Glu Kis 15 Tyr Lys Pro Lys Leu Lys Bis Leu 80 Glu Leu 35 Thr Ala Ser Xle <210> 17 <211> 396 246

<212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> muteina de IL-2 humana des-alanil 1, C125S

<221> CDS <222> (1)...(396) <4 0 0> 17 ccc act cça agt tet aea aag aaa aça cag çta eas ctg gag eat tta

Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lye Thr Gin teu Gin Leu Glu Hís Leu 1 5 10 15 ctg ctg gat tta eag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag aat Léu LôU Ahp Leu Gin Met Ilé Leu Asn Gly Ile Asn Ag» Tyr Lye Asn 20 2S 30 eee aaa etc acc agg atg etc aca ttt aag ttt tac atg çce aag aag

Pro Lys Loa Thr Arg Met Leu Thr Phe Lya Phe Tyr Mèt pré Lys Lys 35 40 45 gçc aça ssa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa etc aaa cct

Ala Th* Glu Leu Lys Sis Leu Gin Çys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro 50 55 60 ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa age aaa aac ttt çac tta aga

Leu Glu Glu V&l Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Píie Eis Leu Arg €5 70 75 »0 cec agg gac tta ate age aat ate aac gta ata gtt ctg gaa cta aag

Pro Arg Asp LèU lie Ser Asn Ilé Asn Vai Ile Vai Leu Glu Leu Lys 8S 30 95 ' gga tc.t gaa aca aca feifec atg tgt gaa tat gct gat gag aca gea acc

Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr 100 105 110 att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tet cag age ate ate

Ile Vai Glu Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ser Gin Ser xle He

115 120 12S tea aca ctg: aet Ser Thr Leu Thr 130

<210> 18 <211> 132 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

<223> muteina de IL-2 humana des-alanil 1, C125S 48 «MS 144 192 240 288 336 384 396 247 <400> 18

Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu Bis Leu i 5 10 is

Leu Leu Asp Leu Glu Mét Ile Leu Asn Çjy He Ash A®» Tyr Lys Asa ao: as·: ' to

Leu Glu Glu Vai Leu Asa Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe lis Leu .Arf 65 70 75 80

Pro Arg Asp Leu ile ser Asn ile Asn Vai He Vai Leu Glu Leu Lys 8$ ?0 95

Gly Ser Glu Thr Thr Phe mt Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr 100 105 no lie Vai Glu phe: Leu Asn Arg xrp He Thr Phe Ser Gin Ser He Ile; 115 12õ 125

Ser Thr Leu Thr 130

Lisboa, 6 de Outubro de 2010 248

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, para uso num método de tratamento de um indivíduo humano para um cancro que compreende células neoplásicas que expressam o antigénio CD40, sendo o dito método caracterizado pelo facto de compreender a administração ao dito indivíduo de uma terapêutica de combinação, sendo a dita terapêutica caracterizada pelo facto de compreender a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio em combinação com uma interleucina 2(IL-2) ou uma sua variante biologicamente activa, em que o dito anticorpo anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio é isento de actividade agonista significativa quando ligado ao antigénio CD40 e é seleccionado a partir do grupo que consiste em: a) um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga a um epitopo com a capacidade de se ligar ao anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou ao anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543; b) um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-87 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:12; c) um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-89 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:12; e 1 d) um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543, num ensaio de ligação competitiva. 2. 0 uso de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD40 ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio em combinação com uma interleucina 2 (IL-2) ou uma sua variante biologicamente activa no fabrico de um medicamento para o tratamento de um indivíduo humano para um cancro que compreende células neoplásicas que expressam o antigénio CD40 através de uma terapêutica de combinação, caracterizado por o dito anticorpo anti-CD40 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio ser isento de actividade agonista significativa quando ligado ao antigénio CD40 e é seleccionado a partir do grupo que consiste em: a) um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga a um epitopo com a capacidade de se ligar ao anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou ao anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543; b) um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-87 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:12; c) um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga a um epitopo que compreende os resíduos 82-89 da sequência do CD40 humano apresentada na SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:12; e 2 d) um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543, num ensaio de ligação competitiva.
3. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a Reivindicação N°. 1 ou o uso de acordo com a Reivindicação N°2, caracterizado por o referido anticorpo anti-CD40 ser um anticorpo humano. 4. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a Reivindicação N°. 1 ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.2, caracterizado por o referido anticorpo anti-CD40 ser seleccionado a partir do grupo consistindo no anticorpo monoclonal CHIR-5.9, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5542, ou com o anticorpo monoclonal CHIR-12.12, que é obtido a partir da linha celular de hibridoma depositada na ATCC como Depósito Patenteado N° PTA-5543.
5. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a Reivindicação N°. 1 ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.2, caracterizado por o referido anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio ser seleccionado a partir do grupo que consiste em: (i) um anticorpo ou o seu fragmento de ligação ao antigénio compreendendo um dominio variável de cadeia leve que contém os residuos 44-54, 70-76 e 109-117 da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:6; (ii) um anticorpo ou o seu fragmento de ligação ao antigénio compreendendo um domínio variável de cadeia 3 pesada que contém os resíduos 50-54, 69-84 e 114-121 da SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO: 7; (iii) um anticorpo ou o seu fragmento de ligação ao antigénio compreendendo um domínio variável de cadeia leve que contém os resíduos 46-52, 70-72 e 111-116 da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:6; e (iv) um anticorpo ou o seu fragmento de ligação ao antigénio compreendendo um domínio variável de cadeia pesada que contém os resíduos 45-51, 72-74 e 115-120 da SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:7.
6. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.5, caracterizado por o referido anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio compreender uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) resíduos 21-132 da SEQ ID NO:2; (ii) resíduos 21-239 da SEQ ID NO: 2; (iii) SEQ ID NO: 2; (iv) resíduos 20-139 da SEQ ID NO:4; (v) resíduos 20-469 da SEQ ID NO:4; (vi) SEQ ID NO:4; (vii) resíduos 20-469 da SEQ ID NO:5; (viii) SEQ ID NO:5; (ix) resíduos 21-132 da SEQ ID NO:2 e resíduos 20-139 da SEQ ID NO:4; (x) resíduos 21-239 da SEQ ID NO:2 e resíduos 20-469 da SEQ ID NO:4; (xi) resíduos 21-239 da SEQ ID NO:2 e resíduos 20-469 da SEQ ID NO:5; (xii) SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:4; e (xiii) SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:5.
7. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.5, 4 caracterizado por o referido anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio compreender uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) residuos 21-132 da SEQ ID NO:6; (ii) residuos 21-239 da SEQ ID NO: 6; (iii) SEQ ID NO: 6; (iv) residuos 20-144 da SEQ ID NO:7; (v) residuos 20-474 da SEQ ID NO:7; (vi) SEQ ID NO:7; (vii) residuos 20-474 da SEQ ID NO:8; (viii) SEQ ID NO:8; (ix) residuos 21-132 da SEQ ID NO: 6 e residuos 20-144 da SEQ ID NO:7; (x) residuos 21-239 da SEQ ID NO: 6 e residuos 20-474 da SEQ ID NO:7; (xi) residuos 21-239 da SEQ ID NO: 6 e residuos 20-474 da SEQ ID NO:8; (xii) SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7; e (xiii) SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:8.
8. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com qualquer das Reivindicações precedentes, caracterizado por o referido anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio se ligar ao dito antigénio CD40 humano com uma afinidade (K ) de, pelo menos, -6 10 M.
9. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.8, caracterizado por o referido anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio se ligar ao dito antigénio -8 CD40 humano com uma afinidade (K ) de, pelo menos, 10 M. D
10. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com qualquer das Reivindicações 5 precedentes, caracterizado por o referido anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio ser produzido numa linha celular CHO. 11. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a Reivindicação N°. 1 ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.2, caracterizado por a terapêutica de combinação proporcionar um efeito terapêutico sinérgico. 12. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a Reivindicação N°. 1 ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.2, caracterizado por o referido fragmento de ligação ao antigénio do dito anticorpo anti-CD40 ser seleccionado a partir do grupo que consiste em um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv e um fragmento Fv de cadeia única. 13. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a Reivindicação N°. 1 ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.2, caracterizado por a referida IL-2 corresponder a IL-2 humana ou a uma sua variante biologicamente activa. 14. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.13, caracterizado por a dita variante da IL-2 humana corresponder a IL-2 humana des-alanil-1, serina-125. 15. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a Reivindicação N°. 1 ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.2, caracterizado por o cancro corresponder a um cancro relacionado com células B ou a um tumor sólido. 16. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.15, caracterizado por os cancros relacionados com células B serem seleccionados do grupo que consiste em: linfoma não-Hodgkin, 6 leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiplo, linfoma de células B, linfoma de células B de alto grau, linfoma de células B de grau intermédio, linfoma de células B de baixo grau, leucemia linfoblástica aguda de células B, leucemia mieloblástica, doença de Hodgkin, plasmacitoma, linfoma folicular, linfoma folicular de pequenas células clivadas, linfoma folicular de grandes células, linfoma folicular misto de pequenas células clivadas, linfoma difuso de pequenas células clivadas, linfoma difuso de pequenos linfócitos, leucemia prolinfocítica, linfoma linfoplasmocitico, linfoma da zona marginal, linfoma do tecido linfóide associado às mucosas, linfoma de células B monocitóides, linfoma esplénico, tricoleucémia, linfoma difuso de grandes células, linfoma mediastinico de grandes células B, granulomatose linfomatóide, linfomatose intravascular, linfoma difuso de células mistas, linfoma difuso de grandes células, linfoma imunoblástico, linfoma de Burkitt, linfoma relacionado com SIDA, e linfoma das células do manto. 17. 0 anticorpo anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.15, caracterizado por o dito tumor sólido ser seleccionado a partir do grupo que consiste em carcinoma da bexiga, carcinoma da mama, carcinoma do figado, carcinoma do estômago, carcinoma do cólon, cancro da próstata, carcinoma de células renais, carcinoma da nasofaringe, carcinoma de células escamosas, carcinoma papilar da tiróide, melanoma, carcinoma do ovário, carcinoma do pulmão, carcinoma do colo do útero e sarcomas. 18. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a Reivindicação N°. 1 ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.2, caracterizado por a referida IL-2 ou a sua variante e o referido anticorpo anti-CD40 ou o 7 seu fragmento de ligação ao antigénio serem administrados sequencialmente. 19. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a Reivindicação N°. 1 ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.2, caracterizado por a referida IL-2 ou a sua variante e o referido anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio serem administrados simultaneamente.
20. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a Reivindicação N°. 1 ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.2, caracterizado por o referido anticorpo CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio ser administrado de acordo com um esquema de dosagem seleccionado a partir do grupo que consiste em uma vez por semana, uma vez em cada duas semanas, uma vez em cada três semanas e uma vez em cada quatro semanas ao longo de um período de tratamento ou durante um intervalo de tempo fixo de 4 semanas a 16 semanas dentro do referido período de tratamento, em combinação com a administração de um ou mais ciclos de um regime de dosagem constante de IL-2 durante o referido período de tratamento, sendo o referido regime de dosagem constante de IL-2 caracterizado por compreender um primeiro período, durante o qual uma dose semanal total constante de IL-2 ou de uma sua variante biologicamente activa é administrada ao referido indivíduo, e um segundo período, em que a a administração da referida IL-2 ou da sua variante biologicamente activa é retirada ao indivíduo.
21. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.20, caracterizado por o referido primeiro período ter uma duração de cerca de 2 semanas a cerca de 12 semanas, e o referido segundo período uma duração de cerca de 1 semana a cerca de 4 semanas. 8 22. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.21, caracterizado por o referido primeiro período ter uma duração de cerca de 4 semanas e o referido segundo período uma duração de 1 semana. 23. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.21, caracterizado por a primeira administração do referido anticorpo anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio se iniciar no dia 1 do referido período de tratamento, sendo que um primeiro ciclo do referido regime de dosagem constante de IL-2 é iniciado até 10 dias após a referida primeira administração do referido anticorpo anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio.
24. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.23, caracterizado por o referido primeiro ciclo do referido regime de dosagem constante de IL-2 ser iniciado no dia 8 do período de tratamento referido.
25. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.23, sendo o referido período de tratamento caracterizado por compreender um ou mais ciclos subsequentes do dito regime de dosagem constante de IL-2, iniciado(s) até 4 semanas após a conclusão do referido primeiro ciclo do referido regime de dosagem constante de IL-2 ou a conclusão de qualquer ciclo subsequente do referido regime de dosagem constante de IL-2, sendo que a referida administração do referido anticorpo anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio continua ao longo do referido período de tratamento.
26. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.20, caracterizado por a referida dose terapeuticamente eficaz do 9 referido anticorpo anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio se encontrar no intervalo de cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 30,0 mg/kg.
27. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.20, caracterizado por a referida dose semanal total constante de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa ser administrada numa dose única ou ser dividida numa primeira série de doses equivalentes que são administradas de acordo com um esquema de dosagem de duas, três, quatro, cinco, seis ou sete vezes por semana.
28. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.27, caracterizado por a referida IL-2 ou a sua variante biologicamente activa ser administrada por uma via seleccionada a partir do grupo que consiste nas vias intravenosa, intramuscular e subcutânea.
29. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.20, caracterizado por a referida dose semanal total constante da referida IL-2 ou da sua variante biologicamente activa ser uma quantidade equivalente a uma dose semanal total de um padrão de referência de IL-2 administrado pela mesma via e com o mesmo esquema de dosagem, encontrando-se a referida dose semanal total de padrão de referência de IL-2 dentro do intervalo de cerca de 1100 μρ (18,0 MIU) a cerca de 3300 μρ (54,0 MIU), em que a referida dose semanal total constante da referida IL-2 ou da sua variante biologicamente activa proporciona pelo menos 70% da actividade natural das células killer (NK) que é proporcionada pela referida dose semanal total do padrão de referência de IL-2.
30. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.29, 10 caracterizado por a referida dose semanal total do padrão de referência de IL-2 estar entre cerca de 1100 μρ (18,0 MIU) e cerca de 2567 μg (42,0 MIU), e por a referida dose semanal total do padrão de referência de IL-2 ser repartida por três doses equivalentes que são administradas de acordo com um esquema de dosagem de três vezes por semana.
31. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a Reivindicação N°. 1 ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.2, caracterizado por o referido anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio ser administrado de acordo com um esquema de dosagem seleccionado a partir do grupo que consiste em uma vez por semana, uma vez em cada duas semanas, uma vez em cada três semanas e uma vez em cada quatro semanas ao longo de um periodo de tratamento ou durante um intervalo de tempo fixo de 4 semanas a 16 semanas dentro do referido periodo de tratamento, em combinação com a administração de um ou mais ciclos de um regime de dosagem de dois níveis de IL-2 durante o referido período de tratamento, sendo o referido regime de dosagem de dois níveis de IL-2 caracterizado por compreender um primeiro período, durante o qual uma dose semanal total mais elevada de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa é administrada ao referido indivíduo, seguido de um segundo período, durante o qual uma dose semanal total mais baixa de IL-2 ou da sua variante biologicamente activa é administrada ao referido indivíduo.
32. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.31, caracterizado por uma primeira dose da referida IL-2 ou da sua variante biologicamente activa ser administrada ao referido indivíduo antes da administração de uma primeira dose do referido anticorpo anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio. 11 33. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.32, caracterizado por a referida primeira dose da referida IL-2 ou da sua variante biologicamente activa ser administrada até ao primeiro mês depois da primeira dose do referido anticorpo anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio ser administrada ao referido indivíduo. 34. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.33, caracterizado por a referida primeira dose da referida IL-2 ou da sua variante biologicamente activa ser administrada uma semana antes da primeira dose do referido anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio ser administrada a um indivíduo. 35. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.31, caracterizado por uma primeira dose da referida IL-2 ou da sua variante biologicamente activa ser administrada ao referido indivíduo ao mesmo tempo que uma primeira dose do referido anticorpo anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio. 36. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.31, caracterizado por uma primeira dose da referida IL-2 ou da sua variante biologicamente activa ser administrada ao referido indivíduo uma semana depois de uma primeira dose do referido anticorpo anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao antigénio ser administrada ao referido indivíduo. 37. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.31, caracterizado por a referida dose terapeuticamente eficaz do referido anticorpo anti-CD40 ou do seu fragmento de ligação ao 12 antigénio se encontrar no intervalo de cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 30,0 mg/kg.
38. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.31, caracterizado por o referido regime de dosagem de dois niveis de IL-2 ter uma duração combinada de 4 a 16 semanas.
39. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.38, caracterizado por o referido primeiro periodo do referido regime de dosagem de dois niveis de IL-2 ter uma duração de, pelo menos, uma semana para além da referida duração combinada de 4 a 16 semanas. 40. 0 anticorpo anti-CD4 0 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou 0 uso de acordo com a Reivindicação N°. 38, caracterizado por o referido primeiro periodo de tempo do referido regime de dosagem de dois niveis de IL-2 ter uma duração que corresponde a metade da referida duração combinada de 4 a 16 semanas.
41. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.31, caracterizado por a referida dose semanal total mais elevada da referida IL-2 ou a sua variante biologicamente activa ser administrada como uma dose única ou ser dividida em uma primeira série de doses equivalentes de acordo com um esquema de dosagem de duas, três, quatro, cinco, seis ou sete vezes por semana, e a referida dose total semanal mais baixa da referida IL-2 ou da sua variante biologicamente activa ser administrada como uma dose única ou dividida numa segunda série de doses equivalentes que são administradas de acordo com um esquema de dosagem de duas, três, quatro, cinco, seis ou sete vezes por semana.
42. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.41, 13 caracterizado por a referida IL-2 ou uma sua variante biologicamente activa ser administrada por uma via seleccionada a partir do grupo que consiste nas vias intravenosa, intramuscular e subcutânea. 43. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.42, caracterizado por a referida primeira série de doses equivalentes ser administrada de acordo com um esquema de dosagem de três vezes por semana, e a segunda série de doses equivalentes ser administrada de acordo com um esquema de dosagem de três vezes por semana. 44. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.31, caracterizado por: a) a referida dose semanal total mais elevada da referida IL-2 ou da sua variante biologicamente activa se encontrar numa quantidade equivalente a uma dose semanal total mais elevada de um padrão de referência de IL-2 administrada pela mesma via e com o mesmo esquema de dosagem, incluindo-se a referida dose semanal total mais elevada do padrão de referência de IL-2 no intervalo de cerca de 1834 yg (30,0 MIU) a cerca de 3300 yg (54,0 MIU) , sendo que a referida dose semanal total mais elevada da referida IL-2 ou da sua variante biologicamente activa fornece pelo menos 7 0% da actividade natural killer (NK) que é fornecida por uma dose semanal total mais elevada do padrão de referência de IL-2; b) a referida dose semanal total mais baixa da referida IL-2 ou da respectiva variante biologicamente activa se encontrar numa quantidade equivalente a uma dose semanal total mais baixa do padrão de referência de IL-2 administrada pela mesma via e com o mesmo esquema de dosagem, incluindo-se a referida dose semanal total mais 14 baixa do padrão de referência de IL-2 no intervalo de entre cerca de 1100 yg (18.0 MIU) a cerca de 2384 yg (39,0 MIU), sendo que a referida dose total semanal mais baixa da referida IL-2 ou da sua variante biologicamente activa fornece pelo menos 70% da actividade natural das células killer (NK) que é fornecida pela referida dose semanal total mais baixa do padrão de referência de IL-2; e c) a referida dose semanal total mais baixa da referida IL-2 ou da sua variante biologicamente activa é inferior à referida dose semanal total mais elevada da referida IL-2 ou da sua variante biologicamente activa.
45. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.44, caracterizado por a referida dose total semanal mais elevada do padrão de referência de IL-2 se encontrar entre cerca de 1834 yg (30.0 MIU) e cerca de 2567 yg (42.0 MIU), e a referida dose semanal total inferior do padrão de referência de IL-2 se encontrar entre cerca de 1100 yg (18.0 MIU) e cerca de 1834 yg (30.0 MIU).
46. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.45, caracterizado por a referida dose total semanal mais elevada do padrão de referência de IL-2 corresponder a cerca de 2567 yg (42.0 MIU), e a referida dose semanal total mais baixa do padrão de referência de IL-2 corresponder a cerca de 1834 yg (30.0 MIU), sendo que a referida dose total semanal mais elevada do padrão de referência de IL-2 e a referida dose total semanal mais baixa do padrão de referência de IL-2 são, cada uma, divididas em três doses equivalentes que são administradas de acordo com um esquema de dosagem de três vezes por semana. 15 47. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.31, caracterizado por compreender ainda a interrupção no referido regime de dosagem de dois niveis de IL-2, a referida interrupção compreendendo um periodo de tempo sem administração da referida IL-2 ou da sua variante biologicamente activa, entre o referido primeiro periodo e o referido segundo periodo do referido regime de dosagem de dois niveis de IL-2. 48. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.47, caracterizado por a referida interrupção ter uma duração de cerca de uma semana a cerca de 4 semanas. 49. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.31, caracterizado por o referido periodo de tratamento compreender um ou mais ciclos subsequentes do referido regime de dosagem de IL-2 de dois niveis que é iniciado cerca de 1 semana a cerca de 4 semanas após o final de um primeiro ciclo do referido regime de dosagem de IL-2 de dois níveis, ou após o final de qualquer ciclo subsequente do referido regime de dosagem de dois níveis de IL-2, em que a referida administração semanal do referido anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio continua ao longo do referido período de tratamento.
50. O anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com a Reivindicação N°.49, caracterizado por pelo menos um ciclo do referido regime de dosagem de dois níveis de IL-2 compreender uma interrupção no referido regime de dosagem de dois níveis de IL-2, a referida interrupção compreendendo um período de tempo sem administração da referida IL-2 ou da sua variante biologicamente activa entre o referido primeiro periodo e o 16 referido segundo período de qualquer ciclo do referido regime de dosagem de dois níveis de IL-2 que compreende a referida interrupção. 51. 0 anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio ou o uso de acordo com qualquer uma das Reivindicações N°.1 a N°.50, caracterizado por o referido anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento de ligação ao antigénio ser administrado intravenosamente ou subcutaneamente. Lisboa, 6 de Outubro de 2010 17