BRPI0512286B1

BRPI0512286B1 - Proteínas quiméricas inibidoras da angiogênese e o uso

Info

Publication number: BRPI0512286B1
Application number: BRPI0512286-4A
Authority: BR
Inventors: Zheng Liu
Original assignee: Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd.
Priority date: 2004-06-08
Filing date: 2005-06-08
Publication date: 2020-03-24
Also published as: PT1767546E; CA2569108A1; EP1767546B1; JP2008503243A; RU2006146995A; EP1767546A4; RU2355414C2; CA2569108C; KR100897379B1; US20100215655A1; US20080206238A1; ES2381014T3; KR20070029204A; BRPI0512286A; EP1767546A1; US7750138B2; BRPI0512286B8; DK1767546T3; PL1767546T3; WO2005121176A1

Abstract

proteínas quiméricas inibidoras da angiogénese e o uso. a presente invenção é direcionada a seqüências de dna codificando proteínas quiméricas recombinantes inibidoras da angiogênese per se, o uso farmacêutico das proteínas quiméricas, e a composição farmacêutica contendo a proteína recombinante e a formulação derivada.

Description

PROTEÍNAS QUIMÉRICAS INIBIDORAS DA ANGIOGÊNESE E O USO

Campo da Invenção

A presente invenção se relaciona a tecnologia da engenharia de genes, mais especificamente a sequências de DNA codificando proteínas quiméricas recombinantes inibidoras da angiogênese, as proteínas quiméricas codificadas aqui, aplicações terapêuticas decorrentes, composição medicinal e formulação contendo proteínas quiméricas.

Fundamento da Invenção

A angiogênese é um processo de crescimento de novos vasos sanguíneos de vasos sanguíneos existentes. A maioria do sistema vascular adulto é quiescente, somente ocorre angiogênese em alguns mecanismos fisiológicos e patológicos, tais como tumor, retinopatia por diabetes, artrite, anemia, hiperplasia do endométrio, etc. A angiogênese tem papel chave no crescimento rápido de células tumorais durante o desenvolvimento do tumor (Hanahan and Folkman: Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis, Cell, 1996, 86:353-364). Estudos de modelos de câncer animais e processos clínicos humanos já provaram que a inibição da angiogênese de tumores pode efetivamente inibir o crescimento e desenvolvimento do tumor, por consequência prolongar a vida do paciente. A angiogênese é mediada e regulada através de muitos fatores biológicos. As principais células mediadoras da angiogênese são células endoteliais vasculares que formam a parede interna dos vasos sanguíneos. Vários fatores de crescimento podem se ligar a receptores relevantes na superfície das células endoteliais vasculares, regular processos celulares através da 25 transdução de sinal intracelular, e por consequência mediar a angiogênese.

2/20

Entre vários fatores de crescimento, o VEGF (fator de crescimento de célula endotelial vascular) é o fator de angiogênese mais importante (Ferrara: VEGF and the quest for tumor angiogenesis factor, Nat. Rev. Cancer, 2002, 10: 795-803; Ferrara: Role of vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis: therapeutic implications, Semin. Oncol, 2002,29 (6 sumppl): 10-14). O VEGF pode ser secretado por muitos tipos de células, mas sempre superexpressado nas células de tumores. O VEGF funciona através da ligação a receptores apropriados. Principalmente há dois tipos de receptores VEGF: FLT-1 (tirosina quinase 1 tipo fms) e KDR. Em termos de estruturas moleculares, estes dois receptores consistem ambos de três regiões funcionais diferentes: a primeira região é a região extracelular, consistida de sete domínios tipo imunoglobulina (tipo Ig) (d1-d7), que tem afinidade específica para o VEGF, e é a região chave para a ligação do VEGF; a segunda região é a região trans-membrana contendo resíduos de aminoácido hidrofóbico; a terceira região é o domínio intracelular que contém o grupo funcional tirosina quinase, que fica fosforilado depois do receptor ser ativado pelo VEGF, acionando a transdução de sinal intracelular, levando a efeitos funcionais de células endoteliais e angiogênese.

FLT-1 e KDR estão principalmente distribuídos nas células endoteliais vasculares. Assim a atividade de mediação do VEGF em células endoteliais vasculares é altamente especifica. O VEGF promove a diferenciação de células endoteliais, guia as migrações de células endoteliais, inibe a apoptose, induz modificações morfológicas vasculares, e é um fator próangiogênese altamente efetivo.

O nível de expressão de VEGF em tecidos tumorais é maior do

3/20 que nos tecidos normais. Em adição, o rápido crescimento das células tumorais geralmente leva à hipóxia dentro do tumor, e a hipóxia ainda induz a expressão de VEGF. Assim, VEGF é o fator chave promovendo a angiogênese do tumor. Muitos estudos em animais mostraram que a inibição da ligação de VEGF a seus receptores pode inibir efetivamente a angiogênese do tumor, e por conseqüência inibir o crescimento do tumor. Em outras doenças ligadas à angiogênese, tais como retinopatia por diabetes e artrite, etc. VEGF também está intimamente envolvido no desenvolvimento destas doenças (Ferrara: Role of vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis: therapeutic implications. Semin. Oncol. 2002, 29 (6 sumppl): 1014).

Devido aos papéis críticos do VEGF em câncer e outras doenças, proteínas ou química que inibem especificamente VEGF possuem potencial terapêutico. Por exemplo, estudos mostraram que anticorpo neutralizante contra VEGF pode inibir efetivamente o crescimento do tumor (Jain: Tumor angiogenesis and accessibility: role of vascular endothelial growth factor, Semin. Oncol., 2002, 29 (6 suppl): 3-9). Por conseqüência, é importante ο desenvolvimento de novos inibidores de VEGF efetivos em pesquisa clinica. Desde que FLT-1 e KDR são ligantes naturais de VEGF, houve estudos que investigaram os papéis antiangiogênese do FLT-1 solúvel (o domínio extracelular de FLT-1) e o KDR solúvel (o domínio extracelular de KDR) (Yoko Hasumi: Soluble FLT-1 Expression Suppresses Carcinomatous Ascites in Nude Mice Bearing Ovarian Cancer. Cancer Research 62, 2002:2019-2023). O FLT1 solúvel pode inibir efetivamente o crescimento de células endoteliais vasculares in vitro, mas possui uma meia vida sérica curta e não pode atingir

4/20 concentrações séricas efetivas. Similarmente, o KDR solúvel também foi capaz de inibir o crescimento de células endoteliais vasculares in vitro, mas sua atividade anti-tumoral em cobaias não foi satisfatório (Yoko Hasumi: Soluble FLT-1 Expression Suppresses Carcinomatous Ascites in Nude Mice Bearing 5 Ovarian Cancer. Cancer Research 62, 2002:2019-2023).

Para superar as deficiências do estado da técnica, a presente invenção fornece novas proteínas quiméricas contendo diferentes fragmentos de FLT-1 e KDR para bloquear efetivamente a atividade biológica de VEGF e 1 inibir a angiogênese.

Resumo da Invenção

O primeiro aspecto da invenção é fornecer novas proteínas quiméricas recombinantes que bloqueiem a atividade biológica de VEGF e inibem a angiogênese.

O segundo aspecto da invenção é fornecer sequências de DNA 15 codificando as proteínas quiméricas acima mencionadas.

O terceiro aspecto da invenção é fornecer vetores contendo as seqüências de códigos de DNA das proteínas quiméricas e hospedeiros recombinantes derivados.

O quarto aspecto da invenção é fornecer o uso de proteínas quiméricas na preparação de medicamentos que bloqueiam a atividade de VEGF e inibem a angiogênese, e composição medicinal contendo as proteínas quiméricas e veículos medicinais apropriados e forma de dosagem derivada, assim como aplicações terapêuticas da composição medicinal.

Pontos chaves da invenção são para desenho e construção de séries de proteínas quiméricas com diferentes fragmentos de FLT-1 ou KDR,

5/20 que preferivelmente contêm a porção Fc da imunoglobulina humana (método de construção é mostrado na Figura 1), e então selecionar a proteína quimérica com alta afinidade para VEGF usando ensaios incluindo o ensaio de ligação ao

VEGF, e finalmente obter o inibidor de VEGF apropriado. A construção de proteínas quiméricas é baseada na tecnologia de clonagem molecular convencional. A metodologia experimental detalhada pode ser encontrada em manuais de laboratório tal como Molecular Cloning, a 2- ou a 3^§ edição (Joseph

Sambrook).

De acordo com a presente invenção, as proteínas quiméricas feitas através da tecnologia de DNA recombinante contêm diferentes fragmentos dos receptores de VEGF FLT-1 e KDR, em que as proteínas quiméricas são selecionadas dos seguintes grupos:

a.

Consistidas do 1^o domínio tipo Ig de KDR, o 2^o domínio tipo Ig de FLT-1, e o 3^o domínio tipo Ig de KDR, designadas como

KDRd1-FLTd2-KDRd3;

b.

Consistidas do 2^o domínio tipo Ig de FLT-1, e o 3^o e o 4^o domínios tipo Ig de KDR, designadas como FLTd2-KDRd3,4;

Consistidas do 2^o domínio tipo Ig de FLT-1, o 3^o domínio tipo Ig de KDR, e o 4^o domínio tipo Ig de FLT-1, designadas como

FLTd2-KDRd3-FLTd4;

d.

Consistidas do 2^o domínio tipo Ig de FLT-1, e o 3^o, o 4^o e o 5^o domínios tipo Ig de KDR, designadas como FLTd2-KDRd3, 4, 5;

e.

Consistidas do 2^o domínio tipo Ig de FLT-1, o 3^o domínio tipo Ig de KDR, e o 4^o e o 5^o domínios tipo Ig de FLT-1, designadas como FLTd2-KDRd3-FLTd4,5.

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A seqüência de aminoácidos de FLTd2 é mostrada na ID SEQ n° 1. A seqüência de aminoácidos de FLTd4 é mostrada na ID SEQ n° 2. A seqüência de aminoácidos de KDRdl é mostrada na ID SEQ n°3. A seqüência de aminoácidos de KDRd3 é mostrada na ID SEQ n° 4. A seqüência de aminoácidos de KDRd4 é mostrada na ID SEQ n°5.

Conforme usado aqui, FLT se refere à seqüência FLT-1, KDR se refere à seqüência KDR; d/se refere ao P domínio tipo Ig em FLT-1 ou KDR.

Preferivelmente, a presente invenção fornece uma classe de proteínas quiméricas que contém a porção Fc da imunoglobulina humana, e preferivelmente são selecionadas dos seguintes grupos:

FP2’ designada como KDRdl-FLTd2-KDRd3-Fc;

FP3’ designada como FLTd2-KDRd3,4-Fc;

FP4’ designada como FLTd2-KDRd3-FLTd4-Fc;

FP5’ designada como FLTd2-KDRd3,4,5-Fc;

FP6’ designada como FLTd2-KDRd3-FLTd4,5-Fc.

Conforme usado aqui, Fc se refere à porção Fc da imunoglobulina humana derivada do FC da imunoglobulina humana tais como IgG, IgM, e IgA, ou subclasses lgG1, lgG2, lgG3, e lgG4. A região Fc pode ser toda a extensão da seqüência Fc ou um fragmento da seqüência Fc de CH2, CH3, ou região de divagem.

Conforme mostrado na Figura 1, a proteína quimérica conhecida no estado da técnica (designada como FP1’) consiste do 2^o domínio tipo Ig de FLT-1 (FLTd2), o 3^o domínio tipo Ig de KDR (KDRd3), e a porção Fc da imunoglobulina humana. A proteína quimérica FP2’ fornecida na invenção tem seqüência de aminoácidos adicional do 1^o domínio tipo Ig de KDR (KDRdl) na

7/20

FPT, o que aumenta os sítios de ligação para VEGF e eleva a afinidade para VEGF. As proteínas quiméricas FP3’ e FP4’ possuem sequências adicionais do 4^o domínio tipo Ig de KDR (KDRd4) ou o 4^o domínio tipo Ig de FLT-1 (FLTd4) baseado na FPT, respectivamente. FP5’ e FP6’ possuem adicionais o 4^o e o 5^odomínios tipo Ig de KDR (KDRd4, 5) e o 4^o and o 5^o domínios tipo Ig de FLT-1 (FLT-1 d4, 5) baseado na FP1’, respectivamente. Estas sequências adicionais podem ajudar a dimerização das proteínas quiméricas, enovefamento tridimensional das estruturas favoráveis para ligação do VEGF, e a elevação da afinidade para VEGF.

Mais preferivelmente, a presente invenção fornece uma proteína quimérica FP3 com seqüência de aminoácido mostrada como ID SEQ n°7.

As proteínas quiméricas descritas na invenção podem ser obtidas através de tecnologia convencional de DNA recombinante. Por primeiro, as seqüências de códigos de DNA recombinante das proteínas quiméricas acima mencionadas podem ser obtidas, em que as seqüências de código de DNA de FLT-1 e KDR estão disponíveis no GenBank, NCBI (National Center for Biotechnology Information). Em segundo, as seqüências de códigos de DNA das proteínas quiméricas acima mencionadas são clonadas em vetores após a síntese por PCR. Os vetores comumente aqui podem ser usados plasmídios, vírus, ou fragmentos de DNA em biologia molecular. A seqüência de sinal secretório é inserida no terminal da seqüência de DNA dos peptídeos quiméricos acima mencionados para assegurar a secreção fora das células. A seqüência do vetor inclui uma região promotora que habilita a transcrição do gene, sinais de início e parada para translação de proteínas, e uma seqüência poli A. O vetor contém um gene resistente aos antibióticos para propagação em

8/20 bactéria. Em adição, o vetor contém um gene de seleção de célula eucariótica para seleção de linhas de células transfectadas estáveis.

Por não haver limite absoluto das seqüências de aminoácidos de todos os domínios tipo Ig em FLT-1 e KDR, o comprimento da seqüência destes domínios pode ter variações. Assim as seqüências das proteínas quiméricas descritas na invenção podem ter variações similares. Deve ser apreciado que todas estas variações das seqüências não devem ser consideradas como sendo além do escopo da invenção.

Após a construção dos plasmídios das proteínas quiméricas acima mencionadas, os plasmídios podem ser usados para transfectar as células hospedeiras para expressar as proteínas quiméricas Há muitos sistemas de expressão para estas proteínas quiméricas, incluindo (mas não limitando) células de mamíferos, bactérias, leveduras, e células de insetos. Entre elas, as células de mamíferos e insetos são células eucarióticas, enquanto que as células de bactérias e leveduras são células procarióticas. As proteínas expressadas de células de mamíferos são glicosiladas. Desde que as proteínas quiméricas da invenção contêm sítios de glicosilação, as células de mamíferos são as melhores células para expressá-las. Há muitos tipos de células de mamíferos adequados para a produção de proteínas em larga escala, tal como as células 293, células CHO, células SP20, células NSO, células COS, células BHK, células PerC6, e etc. Muitos outros tipos de células também podem ser usados para expressar e produzir estas proteínas, e todas estão dentro do escopo da invenção. Os plasmídios codificando estas proteínas acima mencionadas podem ser transfectados em células. Os métodos de transfecção incluem, mas não são limitados a, eletroporação,

9/20 transfecção mediada por lipossomas, precipitação de cálcio, e etc.

Sistemas de expressão que não sejam células de mamíferos também podem ser usados para expressar estas proteínas quiméricas, tais como bactérias, leveduras, células de insetos, e etc. Todos eles devem ser considerados como dentro do escopo da invenção. Estes sistemas de expressão têm um maior rendimento de produção de proteína comparado com o das células de mamíferos, no entanto, eles produzem proteínas não glicosiladas ou com cadeias de carboidratos glicosiladas diferentes daquelas das células dos mamíferos.

Após a expressão das proteínas quiméricas, as concentrações das proteínas quiméricas no meio de cultura das células podem ser medidas por Elisa ou outros ensaios. Desde que as proteínas quiméricas contêm a região Fc da imunoglobulina, elas podem ser purificadas usando cromatografia de afinidade para Proteína A.

Após várias proteínas quiméricas serem obtidas do meio de cultura das células hospedeiras recombinantes, elas foram ensaiadas em experimentos de ligação de VEGF para comparar suas afinidades para VEGF. Suas atividades de inibição de VEGF foram ainda ensaiadas em um experimento de proliferação de células endoteliais vasculares humanas induzidas por VEGF. Os resultados dos experimentos mostraram que todas as proteínas quiméricas construídas de acordo com a presente invenção podem se ligar ao VEGF com alta afinidade (Figura 2), comparando com FP1’ do estado da técnica. Em adição, elas podem bloquear efetivamente a ativação do VEGF de células endoteliais vasculares e inibir o crescimento das células endoteliais. Experimentos posteriores mostraram que FP3 tem a melhor

atividade bloqueadora do VEGF e é a proteína quimérica bloqueadora do VEGF mais efetiva da invenção.

Assim, as proteínas quiméricas construídas na invenção possuem atividades bloqueadoras do VEGF superiores, e todas têm atividades biológicas de antiangiogênese, por conseqüência podem ser usadas para tratar a angiogênese ou doenças relacionadas ao VEGF, incluindo, mas não limitado a, vários tumores, retinopatia por diabetes, artrite, anemia, hiperplasia endotelial, etc.

De modo a ainda fundamentar o efeito antiangiogênese das proteínas quiméricas in vivo, também foram feitos alguns experimentos em modelos animais. Os resultados destes experimentos mostraram que no melanoma B16F10 em modelo animal nude (sem timo) e no tumor de próstata PC-3 humano em modelo animal xenoenxertado, as proteínas quiméricas da invenção foram muito melhores do que FP1’ do estado da técnica, e inibiram efetivamente o crescimento do tumor e prolongaram a vida do animal. Assim, as proteínas quiméricas da invenção têm maior atividade anticancerígena.

A presente invenção também fornece composições medicinais compreendendo as proteínas quiméricas descritas acima e veículos medicinais apropriados. Ditas composições podem ser formuladas em qualquer forma de dosagem de acordo com as metodologias convencionais de formulação, preferivelmente na forma de dosagem para injeção, e mais preferivelmente em um formato liofilizado.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra as estruturas de cinco proteínas quiméricas de acordo com a incorporação preferida da invenção e FP1 do estado da técnica.

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Elas são construídas com diferentes fragmentos de FLT-1, KDR e a região Fc da imunoglobulina usando a tecnologia da engenharia genética.

A Figura 2 exibe os resultados de ligação ao VEGF das cinco proteínas quiméricas em uma incorporação preferida da invenção, em comparação com a do FP1’ do estado da técnica, em que as leituras de DO se referem aos sinais de ligação das proteínas quiméricas ao VEGF. Os resultados mostraram que todas as cinco proteínas quiméricas ligaram ao VEGF com muito maiores afinidades do que FP1, entre elas FP3 tem a maior afinidade.

A Figura 3 mostra que as proteínas quiméricas da invenção podem efetivamente inibir o crescimento in vivo das células endoteliais vasculares humanas, em comparação com FP1.

A Figura 4 mostra que a proteína quimérica FP3 pode efetivamente inibir o crescimento do tumor melanoma B16F10 em camundongos.

A Figura 5 mostra que a proteína quimérica FP3 pode efetivamente inibir o crescimento do tumor de próstata PC-3 humano em camundongos.

A Figura 6 compara as atividades anti-crescimento do tumor da proteína quimérica FP3 da invenção com a do FP1 do estado da técnica. Incorporações Específicas

Os exemplos seguintes fornecem descrição detalhada de construção, metodologia experimental e aplicação das proteínas quiméricas descritas na invenção. Mas estes exemplos não devem ser construídos para limitar o escopo de proteção da invenção.

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Incorporação 1: Clonagem das sequências de DNA codificando as proteínas quiméricas e construção dos vetores recombinantes

Outra que não a seqüência de DNA codificando a porção Fc da imunoglobulina, sequências de DNA codificando as várias proteínas quiméricas da invenção vêm de cDNAs de FLT-1 e KDR. Desde que FLT-1 e KDR são principalmente expressados em células endoteliais vasculares, o RNA total foi extraído das células endoteliais das veias umbilicais humanas (HUVEC) usando um kit de purificação de RNA (QIAGEN); então cDNAs foram sintetizados do RNA usando Transcriptase Reversa AMV (Promega); então vários fragmentos FLT-1 e KDR foram amplificados por PCR com diferentes iniciadores (primers)·, finalmente as seqüências de FLT-1, KDR, e a porção Fc da imunoglobulina humana (Feda lgG1) foram fusionadas juntas por PCR para construir seqüências de DNA recombinante codificando varias proteínas quiméricas. As estruturas de todas as seis proteínas quiméricas (incluindo FP1 do estado da técnica) são mostradas na Figura 1.

Exemplo 1: Construção da seqüência codificando FP3 e vetor recombinante.

Células HUVEC (Clonetics) foram cultivadas em meio EGM2 (Clonetics) em frascos T-175. 1 x 10⁷ células foram coletadas e submetidas à extração do RNA total usando o kit de purificação de RNA da Qiagem, e então cDNA foi sintetizado usando o kit cDNA Invitrogen. O produto cDNA foi armazenado a -80 °C até o uso. Foram usados os seguintes iniciadores para amplificar por PCR vários domínios FLT-1 e KDR do cDNA das HUVEC.

O Fc da lgG1 humana foi amplificado por PCR usando os seguintes iniciadores específicos de cDNA de gânglios linfáticos (BD Clontech).

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Iniciadores:

FLT-1 d2 “forward”:	5’-cctttcgtagagatgtacagtga-3’
FLT-1 d2 “reverse”:	5’-tatgattgtattggtttgtccat-3’
KDR d3-4 “forward’:	5’-gatgtggttctgagtccgtctca-3’
KDR d3-4 “reverse”:	5’-cggtgggacatacacaaccaga-3’

Fc da lgG1 Humana “forward’·. 5'-gacaaaactcacacatgcccac

Fc da IgGI Humana “reverse”: 5’-tcatttacccggagacagggagag-3'

Os domínios tipo lg e o fragmento Fc da lgG1 humana foram amplificados por POR em condições de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 56 °C por 45 segundos, extensão a 72 °C por 2 minutos, e 30 ciclos. Os produtos POR foram então clonados no plasmídio pCR2,1 (Invitrogen) usando kit de clonagem TA. Após transformação em E.coli (JM 109), foram selecionadas colônias brancas e cultivadas de um dia para outro em meio LB. Plasmídios de DNA foram preparados usando o kit Qiagen e submetidos à digestão enzimática e sequenciamento de DNA.

Os cDNAs de FLT-1, KDR e Fc da IgG foram fusionados juntos por PCR usando iniciadores contendo o sítio EcoRI. Após digestão com EcoRI, o fragmento de DNA foi purificado com o kit de purificação Qiagen e clonado no plasmídio pcDNA3,1. Após transformadas em E.coli (JM 109), as colônias positivas foram escolhidas e cultivadas de um dia para o outro em meio LB. Os plasmídios de DNA foram extraídos com o kit de purificação de plasmídios e então submetidos à digestão enzimática e sequenciamento de DNA. A seqüência de códigos de DNA da FP3 obtida é mostrada na ID SEQ n° 6. Os plasmídios confirmados foram usados para transfectar as células 293 ou células CHO para obter linhas de células estáveis expressando FP3. A

14/20 seqüência de aminoácidos de FP3 é mostrada como ID SEQ n° 7.

Exemplo 2: Construção de gene FP1 e vetor recombinante

FP1 foi construído similarmente como no Exemplo 1. A única diferença foi que o DNA recombinante almejado foi construído fusionando juntos o 2^a domínio tipo Ig de FLT-1, o 3^a domínio tipo Ig de KDR, e o mesmo Fc da IgG humana como no Exemplo 1.

Exemplo 3: Construção de gene FP2 e vetor recombinante

FP2 foi construído similarmente como no Exemplo 1. A única diferença foi que o DNA recombinante almejado foi construído fusionando juntos o 1^a domínio tipo Ig de KDR, o 2^a domínio tipo Ig de FLT-1, o 3^a domínio tipo Ig de KDR, e o mesmo Fc da IgG humana como no Exemplo 1.

Exemplo 4: Construção de gene FP4 e vetor recombinante

FP4 foi construído similarmente como no Exemplo 1. A única diferença foi que o DNA recombinante almejado foi construído fusionando juntos o 2^a domínio tipo Ig de FLT-1, o 3^a domínio tipo Ig de KDR, o 4^a domínio tipo Ig de FLT-1, e o mesmo Fc da IgG humana como no Exemplo 1.

Exemplo 5: Construção de gene FP5 e vetor recombinante

FP5 foi construído similarmente como no Exemplo 1. A única diferença foi que o DNA recombinante almejado foi construído fusionando juntos o 2^a domínio tipo Ig de FLT-1, o 3^a e 5^a domínios tipo Ig de KDR, e o mesmo Fc da IgG humana como no Exemplo 1.

Exemplo 6: Construção de gene FP6 e vetor recombinante

FP6 foi construído similarmente como no Exemplo 1. A única diferença foi que o DNA recombinante almejado foi construído fusionando juntos o 2^a domínio tipo Ig de FLT-1, o 3^a domínio tipo Ig de KDR, o 4- e 5^a

15/20 domínios tipo Ig de FLT-1, e o mesmo Fc da IgG humana como no Exemplo 1.

Incorporação 2: Expressão das proteínas quiméricas em células

Exemplo 7: Expressão das proteínas quiméricas FP3

Após a construção dos plasmídios recombinantes acima mencionados, foram obtidos plasmídios de DNA de alta qualidade usando kit de plasmídio da Qiagen, e então foram transfectados nas células 293 (ATCC) usando kit de transfecção FUGEN6 (Roche). Foram usados dois métodos diferentes para expressar as proteínas quiméricas dependendo da quantidade necessária de proteínas.

O primeiro método foi um método de transfecção transitória. Uma pequena quantidade de proteínas quiméricas foi produzida usando este método. Primeiramente, as células 293 foram cultivadas em meio DMEM com FBS 10% em placas de cultura de tecidos. Na confluência de 60-80% das células, a mistura de plasmídio de DNA e reagente FUGEN6 foi adicionada na cultura. O meio de cultura foi trocado por DMEM livre de soro no dia seguinte e as células continuaram a ser cultivadas por mais 3 dias antes do meio ser coletado. Estes meios continham as proteínas quiméricas expressadas, e a concentração das proteínas quiméricas foi ensaiada por ELISA.

O segundo método foi um método de transfecção estável. A linha de células estável foi estabelecida para produzir uma grande quantidade de proteínas quiméricas. As células hospedeiras foram novamente as células 293 (ATCC). A etapa de transfecção do plasmídio recombinante foi a mesma como aquela da transfecção transitória descrita acima. No entanto, no 2® dia, as células foram cultivadas em DMEM com neomicina e clonadas por diluição limitada. Após cerca de 21 dias, clones resistentes a neomocina foram

16/20 escolhidos e cultivados em uma escala maior. Finalmente, as proteínas quiméricas foram expressadas em frascos agitadores. A concentração das proteínas quiméricas foi ensaiada por ELISA.

FP3 foi purificada do meio de cultura usando ensaios incluindo cromatografia de afinidade e filtração em gel, etc. O peso molecular de FP3 foi 140 kDa.

Exemplo 8: Expressão de outras proteínas quiméricas

Proteínas quiméricas FP1, FP2, FP4, FP5, e FP6 foram obtidas de acordo com os métodos do exemplo 7.

Incorporação 3: Experimento de ligação das proteínas quiméricas ao VEGF

As afinidades das proteínas quiméricas com VEGF foram determinadas por ensaios de ligação ao VEGF na presente invenção. Primeiramente, proteínas VEGF recombinantes (Chemicom) foram revestidas em uma placa de Elisa com 96 poços, e sítios de ligação de proteínas não específicas da placa então foram bloqueados usando solução de leite 5%. Em segundo lugar, diferentes concentrações de várias proteínas quiméricas foram adicionadas em cada poço, e incubadas por 2 horas a 37 ^eC. Após a lavagem, foi adicionado anti-humano Ig-HRP de coelho (Sigma) em cada poço, e finalmente foram adicionados na placa substratos enzimáticos colorimétricos. As leituras de DO em absorbância foram gravadas com o uso de uma leitora de placa de ELISA. Um valor de DO maior indicou uma afinidade de ligação mais forte das proteínas quiméricas ao VEGF.

Conforme mostrado na Figura 2, todas as cinco proteínas quiméricas construídas e expressadas nas incorporações da presente invenção

17/20 foram capazes de ligar ao VEGF, e tiveram melhor afinidade do que FP1 do estado da técnica. A ligação foi detectável em baixas concentrações de 1 μ/ml. Preferivelmente, FP3 teve a melhor afinidade e foi o melhor inibidor do VEGF. Sua meia concentração de ligação máxima foi cerca de 5 vezes mais baixa do que a de FP1. FP5 teve uma afinidade para VEGF um pouco mais baixa do que a de FP3. Este resultado sugere que o 4^a domínio tipo Ig de KDR pode aumentar substancialmente a atividade de bloqueio da proteína quimérica do VEGF. No entanto, adicionando mais dos domínios KDR tal como o 5^S domínio tipo Ig não pode aumentar mais o efeito inibitório do VEGF. As outras três proteínas quiméricas exibiram afinidades mais baixas comparando ao FP3 e FP5, mas maiores afinidades do que FP1.

Incorporação 4: As proteínas quiméricas efetivamente inibiram a proliferação de células endoteliais vasculares humanas in vitro

Esta incorporação preferida da invenção é para provar que as proteínas quiméricas efetivamente bloqueiam o crescimento induzido por VEGF de células endoteliais vasculares. No experimento, células HUVEC (Clonetics) foram semeadas em uma placa de cultura de tecidos com 96 poços em meio EBM com FBS 2% e 15 ng/ml de VEGF. Diferentes quantidades do sobrenadante com células 293 contendo as proteínas quiméricas foram adicionadas na placa. Meio com células 293 não transfectadas sem conter proteínas quiméricas foi usado como controle negativo. Todas as células HUVEC forem cultivadas a 37^s C por 3 dias antes das densidades das células serem determinadas através de contador de células.

O experimento de proliferação de células HUVEC mostrou que todas as cinco proteínas quiméricas construídas de acordo com a invenção

18/20 podem inibir a proliferação de células endoteliais vasculares mais efetivamente do que FP1 do estado da técnica (Figura 3). Desde que a proliferação das células HUVEC no experimento foi induzida pela ativação do VEGF, é sugerido, portanto que todas as cinco proteínas quiméricas foram capazes de inibir a ativação do receptor de VEGF, e todas elas possuíam atividades antiangiogênese. Entre as quais, FP3 teve o melhor efeito inibitório no crescimento de células HUVEC com IC50 de cerca de 3 ng/ml. O IC 50 de FP1 do estado da técnica foi cerca de 12 ng/ml, e os IC50 de FP2, FP4, FP5 e FP6 foram cerca de 5-8 ng/ml.

Incorporação 5: Os polipeptídios quiméricos inibiram o crescimento do tumor em camundongos

Exemplo 9: Preparação de formulação de injeção contendo as proteínas quiméricas

A formulação de injeção foi preparada de acordo com quaisquer metodologias convencionais, para formulações de injeção usando 24 mg/ml de FP3, 5 mM de PB, 100 mM de NaCI, e sacarose 20%.

Exemplo 10: As proteínas quiméricas efetivamente inibiram o crescimento de células de melanoma B16F10 em camundongos

Uma aplicação das proteínas quiméricas da invenção é para ser usada em terapia anticancerígena como inibidoras do VEGF. Devido ao seu efeito bloqueador altamente efetivo do VEGF, FP3 foi escolhida para realizar experimentos anti-tumor em modelos animais.

O modelo animal foi com células de melanoma murino B16F10 que é um tipo de células de tumor de crescimento rápido. No experimento, 1 x 10⁵ células B16F10 em 0,05 ml primeiro foram injetadas subcutaneamente no

dorso de camundongos BALB/C sem timo. Então a proteína quimérica purificada foi injetada intraperitonealmente com 400 pg em cada camundongo (média de peso dos camundongos 22g), duas vezes por semana. Mesma quantidade da porção Fc da imunoglobulina humana foi injetada nos camundongos controle negativo. As curvas de crescimento do tumor foram mostradas na Figura 4, indicando que a proteína quimérica FP3 efetivamente inibiu o crescimento das células de melanoma (P<0,01).

Exemplo 11: As proteínas quiméricas efetivamente inibiram o crescimento de células PC-3 de câncer de próstata xenoenxertado em camundongos

Modelo xenoenxertado de células de tumor humano crescendo em camundongos sem timo é um dos modelos animais, que é o mais similar aos tumores humanos. Camundongos sem timo carecem de rejeição imunológica, assim muitas células de tumor humano podem crescer em camundongos sem timo e formar o tumor. A proteína quimérica FP3 foi testada para inibição do crescimento de células PC-3 (ATCC) de tumor de próstata humano em camundongos BALB/C sem timo. Neste modelo, 1 x 10⁵ células PC-3 em 0,05 ml primeiro foram injetadas subcutaneamente no dorso do camundongo. Então a proteína quimérica purificada foi injetada intraperitonealmente com 400 em cada camundongo, duas vezes por semana. A mesma quantidade de Fc da imunoglobulina humana purificada foi injetada no camundongo controle negativo. Os resultados do experimento foram mostrados na Figura 5. No camundongo controle, o tumor cresceu mais do que 1000 mm³ em 45 dias após a implantação. No entanto, nos camundongos administrados com as proteínas quiméricas, FP3 inibiu quase

20/20 completamente o crescimento do tumor (P<0,01), demonstrando um efeito terapêutico anti-tumor significativo.

Incorporação 6: Estudo Comparativo das proteínas químéricas FP3 e FP1 do estado da técnica na inibição do crescimento do tumor em camundongos.

De modo a ainda demonstrar a atividade anticancerígena superior de FP3, os efeitos de FP1 e FP3 foram comparados em um experimento de crescimento de tumor. 10 camundongos BALB/C sem time saudáveis foram escolhidos e em cada um foi injetado subcutan earn ente no dorso com 1 x 10⁵células C6 de glioblastoma de rato em 0,05ml. Então, 2,5 mg/kg de FP1 ou FP3 purificados foram injetados intraperitonealmente duas vezes por semana, respectivamente, até 31 dias. A mesma quantidade de Fc da imunoglobulina humana purificada foi injetada no camundongo controle negativo. Os resultados do experimento são mostrados na Figura 6. Ambos, FP1 e FP3 tiveram um efeito terapêutico significativo no tumor. No 35^a dia, os volumes do tumor no rato que foi administrado com FP1 e FP3 foram 1167,3 e 557,6, respectivamente, enquanto que o volume do tumor do camundongo controle tratado com Fc já tinha atingido 1312,3 no 24^a dia. Por conseqüência, FP3 teve efeito mais significativo (P<0,05) do que FP1 do estado da técnica.

Tomado tudo em conjunto, as proteínas químéricas construídas de acordo com a invenção tiveram alta afinidade para VEGF, foram capazes de inibir a proliferação das células endoteliais vasculares in vitro, e inibiram efetivamente o crescimento do tumor in vivo. Desde que a angiogênese é critica no crescimento de todo tumor, as proteínas químéricas da invenção podem ser usadas em aplicações terapêuticas contra muitos tumores.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. “PROTEÍNAS QUIMÉRICAS”, compreendendo diferentes fragmentos dos receptores FLT-1 e KDR, caracterizada pela proteína consistir na sequência de aminoácido de acordo com a ID SEQ n° 7.
2. “DNA RECOMBINANTE”, caracterizado por compreender a sequência de DNA mostrada como ID SEQ n^o 6 ou uma sequência degenerada da mesma que codifica a proteína quimérica de acordo com a reivindicação 1.
3. “VETOR”, compreendendo as sequências de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo vetor ser selecionado de plasmídio, vírus ou fragmento de DNA.
4. “BACTÉRIAS OU CÉLULAS DE LEVEDURA CONTENDO O

VETOR RECOMBINANTE”, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelas por serem células eucarióticas ou procarióticas.
5. “COMPOSIÇÃO FARMACEUTICA”, caracterizado por compreender uma proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 1, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
6. “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pela composição farmacêutica ser uma solução de injeção.
7. “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada por ser para o tratamento de doenças relacionadas à angiogênese incluindo tumor, retinopatia por diabetes, artrite, anemia e hiperplasia endometrial.
8. “USO DAS PROTEÍNAS QUIMÉRICAS”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado para preparação de medicamentos para uma

Petição 870190048701, de 24/05/2019, pág. 6/13

2/2 doença relacionada a angiogênese incluindo tumor, retinopatia por diabetes, artrite, anemia e hiperplasia endometrial.