JP2003529370A - 血管浸透性に対する有害な作用を有さないｖｅ−カドヘリンに対する拮抗薬抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はホ乳類ＶＥ−カドヘリンのＮ−末端の１５個のアミノ酸に特異的な抗体又はそれらの免疫学的に活性を有する断片に関連する。抗体及び抗体断片は、正常な脈管構造に有害な作用をすることなく、隣接する内皮細胞間のＶＥ−カドヘリン−仲介親和性相互作用の拮抗薬として働く。好適な実施態様に於いて、当該抗体はヒトに於いて使用する為のヒトＶＥ−カドヘリンと反応するヒト化抗体を示す。本発明は又、これら抗体及び抗体断片、当該抗体の調製及び当該抗体の使用法並びに新脈管形成を阻害、腫瘍の転移を阻害又は細胞増殖性疾患の治療を含んで成る医薬組成物を供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、既存の結合の統合性を妨害することなく、新しい接着分子結合（ａ
ｄｈｅｒｅｎｓ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）の形成を阻害する、ＶＥ−カドヘリンの
抗体拮抗薬に関連する。そのような抗体は又、例えば腫瘍の血管新生を予防する
為等、様々な病状に於いて新脈管形成を予防する為に有用である。これらの抗体
は内皮細胞の増殖性の疾患の治療に対しても又有用である。

【０００２】 発明の背景 様々な疾患は、血管の異常な増殖と関連している。新血管形成の過程は、新脈
管形成と呼ばれる。正常又は非病理学的条件下で、新脈管形成は、ケガの治癒の
ような明確な状態下で乏血に応答し並びに胚及び胎児が発育する間に起こる。し
かしながら、持続性又は未制御の新脈管形成は、様々な病勢又は病状につながり
、固形腫瘍の場合、病勢を保つに至る必須の状態でありうる。例えば、新脈管形
成は、腫瘍性の疾患と共に特に固形腫瘍を伴い、慢性関節リウマチの如き膠原血
管の疾患、及び糖尿病性網膜症、水晶体後方の線維増殖症（ｒｅｔｒｏｌｅｎｔ
ａｌ ｆｉｂｒｏｐｌａｓｉａ）及び血管新生緑内障の如き所定の眼科学的状態
に於いて起こる。このような疾患の治療の為のある治療方法は、病んだ細胞又は
組織に対して血液供給を制限、減少、除去することであった。例えば、数mm超の
固形腫瘍は血管新生段階に入り、そのような血管新生なくして、更なる腫瘍増殖
はありえないので、かくして血管新生の阻害は腫瘍の大きさを制約することだろ
う。

【０００３】 腫瘍を供給する血管を閉塞することにより、当該腫瘍の血液供給を限定する為
に、治療戦略が試みられて来た。そのような治療について、腫瘍の部位は既知で
なければならず、腫瘍に接近可能でなければならない。従って、注目の位置を知
ること又は注目の部位に対する接近性に依存しない治療の方法は有用であり、特
異的に疾患部位を標的可能な治療学的な抗−新脈管形成剤の全身的投与を可能に
する。

【０００４】 疾患の進行に於いて、新脈管形成が果たす役割の為、新脈管形成阻害剤の開発
に於ける実質的な注目が現在の治療法が最適に至らない所で特にある。内皮細胞
は血管形成の完全な部分なので、そのような細胞の特異的な阻害薬は、もし、当
然、その阻害薬に関連する最大限の毒性があれば、新脈管形成を阻害することに
於いて有効である。ある特殊な注目の標的は、細胞内接着結合を形成するカドヘ
リン、ＶＥ−カドヘリンである。

【０００５】 カドヘリンは、特異的な細胞−細胞接触の形成に連坐する細胞接着分子群のフ
ァミリーである（Takeichi, Ann. Rev. Biochem. 59 : 237-252 (1990)；Geiger & Ayalon, Ann Rev. Cell Biol. 8 : 302-332 (1992)；Uemura, Cell 93 : 109
5-1098 (1998)）。多数の群が同定又は特性決定されて来た。カドヘリンは、分
子量１２０〜１４０kDを有する単鎖経膜糖タンパク質である。このファミリーの
メンバーはカルシウム依存同種親和性相互作用を示し、器官が発達する間、様々
な細胞型がそれらの適切な位置に配置される為に欠せない、選択的細胞認識及び
接着の原因である。カドヘリンは又多細胞構造の完全性を維持することに於いて
重要な役割を果たす。胚の形態形成の間、カドヘリンファミリーの様々な群は、
空間的且つ時間的に調節され機能的な構造に至る様々な細胞型の整然とした集成
を機能させる（Takeichi, Ann. Rev. Biochem. 59 : 237-252 (1990)）。

【０００６】 カドヘリンファミリーのメンバーは典型的な構造的特徴を持ち、少なからぬ配
列の相同性（４３〜５８％）を共有する。一般的にそれらの細胞外領域は、約１
１０個のアミノ配列の繰り返しドメインを含む。Ｎ−末端ドメインは、分子キメ
ラ、モノクローナル抗体及びペプチド阻害薬での実験により明らかにされたよう
に、ホモタイプ細胞間相互作用に於いて重要であると示されている（Noseら、Ce
ll 54 : 993-1001 (1998))。Ｎ−カドヘリン及びＥ−カドヘリンの３次元構造が
解明されている（Shapiroら、Nature 374 : 327-337 (1995))；Overdiamら、Sci
ence 267 : 386-389 (1995) ; Nagarら、Nature 380 : 360-364 (1996)）。従っ
て、カドヘリン形態の二量体は、ジッパー様成分及びあるいはジスルフィド結合
により支持されていると考えられる。カドヘリンの短い細胞内部分はそれらの最
も高次に保存された領域であり、カドヘリンを細胞骨格へと固定すること及びカ
ドヘリンのリン酸化を通じてシグナリング機能を司ることによる、古典的なカド
ヘリン機構に於いて欠かせぬ役割を果たす。（図１を参照のこと。）

【０００７】 ＶＥ−カドヘリンは、細胞対細胞の接触に於ける細胞内結合（接着分子結合）
で局在化されることが示されている（Lampugnaniら、J. Cell. Biol. 118 : 151
1-1522 (1992) ; Breviarioら、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 15 : 1229
1239 (1995) ; Breierら、Blood 87 : 630-641 (1996) ; Lampugnaniら、J. Cel
l Biol. 129 : 203-217 (1995)）。数多くの実験観察は、このカドヘリンが、内
皮細胞の管構造への集成等、新脈管形成に関連する血管生物学の様々な局面を連
坐することを示唆している（Bachら、Experimental Cell Research 238 : 324-3
34 (1998))。例えば、トロンビン−誘導血管浸透性が、内皮細胞接着結合の分解
に関連して示される。（Rabietら、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16 : 4
88-496 (1996) ; Dejana, J. Clin Invest. 100 : S7-10. (1997) ; Dejanaら、
FASEB J., 9 : 910-918 (1995) ; Dejanaら、Ann Y YAcad Sci. 811 : 36-43 (1
997) ; Gotschら、J. Cell. Sci. 110 : 583-588 (1997) ; Kevilら、J. Biol.
Chem. 273 : 15099-15103 (1998) ; Coradaら、Proc. Natl. Acad. Sci. 96 : 9
815-9820 (1999)）。ＶＥ−カドヘリン及びそのＮ−末端は、内皮細胞の密度依
存性増殖（Yapら、J. Cell Biol. 141 : 779-789 (1998) ; Cavedaら、J. Clin.
Invest. 98 : 886-893 (1996)）及び移動（Breviarioら、Arterioscler. Throm
b. Vasc. Biol. 15 : 1229-1239 (1995)）を阻害する。 他の実験に於いて、ＶＥ−カドヘリンは、トランスフェクション細胞（Brevia
rioら、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 15 : 1229-1239 (1995) ; Breier
ら、Blood 87 : 630-641 (1996) ; Ali et al., Microcirculation 4 : 267-277
(1997)）、に対して接着特性を付与することが示され、血管形成に於けるＶＥ
−カドヘリンに欠かすことのできない役割は、ＶＥ−カドヘリンを有さないマウ
スに於いて示されている。これらのマウスに於いて、血管構造の集成の激しい損
傷は、胚の致死的な表現型（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｌｅｔｈａｌ ｐｈｅｎｏｔ
ｙｐｅ）につながる（Vittetら、Proc. Natl. Acad. Sci. 94 : 6273-6278 (199
7) ; Faureら、Development 128 : 2093-2102 (1999) ; Carmelietら、Cell 98
: 147-157 (1999)）。これらの発見は、血管新生を阻害する為の魅力的な医薬的
標的として強く、ＶＥ−カドヘリンを有効にする。

【０００８】 本発明以前、新脈管形成を予防する為にＶＥ−カドヘリン抗体を使用する試み
は、当該抗体の正常な脈管構造に対する毒性により制限されてきた。例えば、新
脈管形成を予防又は阻害する為に十分な量に於いて所定の抗−カドヘリン抗体を
投与することは、血管漏出症候群、出血及び死を伴う、正常な脈管構造の完全性
に於ける混乱をもたらしている。例えば、抗−ＶＥ−カドヘリン抗体１９Ｅ６は
、その抗体が、既存のＶＥ−カドヘリン−仲介細胞結合を混乱させ並びに、新規
ＶＥ−カドヘリン−仲介細胞接着結合の形成を妨げるので、肺の血管の浸透性の
増加をもたらした。本発明の目的は、ＶＥ−カドヘリン上の部位に対して割り当
てられる改良されたＶＥ−カドヘリン抗体を供し、そのような問題に打ち勝つこ
とにある。

【０００９】 本発明の概要 本発明は、ＶＥ−カドヘリンの拮抗薬である、抗体又は抗体断片に関する。本
発明の抗体及び抗体断片は、ＶＥ−カドヘリン上の部位であり、ＶＥ−カドヘリ
ンのドメイン１の約１５〜約２０個のＮ−末端アミノ酸の内にある部位、ＶＥ−
カドヘリンのドメイン１の約１５〜２０個のＮ−末端アミノ酸の内に当該部位が
あり、且つ当該Ｎ−末端アミノ酸は、天然のＶＥ−カドヘリンアミノ酸配列と比
較して１から約５アミノ酸の挿入、欠失又は置換を持つＶＥ−カドヘリン上の部
位 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１(DEIWNQMHIDEEKNE）のアミノ酸配列を持つペプチド、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２(DWIWNQMHIDEEKNE）のアミノ酸配列を持つペプチド、
及び ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３(DWIWNQMHIDEEKNT）のアミノ酸配列を持つペプチド； から成る群から選択される分子に対して特異的に結合できる。 更に本発明の抗体及び抗体断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＶＥ−カドヘリンが仲
介する接着分子結合の形成を阻害するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで傍細胞浸透性に対
して任意の有意又は実質的な効果を発揮しない。このような抗体及び抗体断片は
ｉｎ ｖｉｖｏで血管浸透性に対する任意の有為もしくは実質的な効果を発揮し
ないが、動物もしくはホ乳動物に投与された時に、実質的に無毒性である。更に
、当該抗体又は抗体断片は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの新脈管形
成及び腫瘍の転移を阻害できる。本発明の抗体及び抗体断片は、既存の接着分子
結合を混乱させることなく新規の接着分子結合の形成を阻害することにより活動
する。本発明の好適な実施態様は、モノクローナル抗体である。同様に、好適な
抗体断片は、モノクローナル抗体由来である。更に好適な実施態様に於いて、当
該モノクローナル抗体はモノクローナル抗体Ｅ４Ｂ９である。本発明の好適な実
施態様は、ヒトである。

【００１０】 当該発明の抗体及び抗体断片は、単鎖抗体、ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）、
キメラ化二重特異性又は、非相同のポリペプチドに融合した抗体でありうる。

【００１１】 発明の他の局面は、本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマに
関する。

【００１２】 本発明の他の局面は、医薬的に許容できる担体又は賦形剤との混合物中の本発
明の抗体又は抗体断片を含んで成る医薬組成物を供する。

【００１３】 更に本発明の局面は、ホ乳動物に於いて本発明の医薬組成物をホ乳動物に対し
て新脈管形成を阻害する為に有効な時間及び量に於いて投与することにより新脈
管形成を阻害する方法に関連する。

【００１４】 尚、本発明の他の局面は、ホ乳動物に於いて本発明の医薬組成物をホ乳動物に
対し新脈管形成を阻害する為に有効な時間及び量に於いて投与することにより腫
瘍の転移を阻害する方法に関する。

【００１５】 更に尚、本発明は、ホ乳動物に於いて本発明の医薬組成物をホ乳類に対し、正
常な脈管構造を混乱することなく内皮細胞の増殖を阻害する為に有効な時間及び
量に於いて投与することにより血管新生と関連する細胞増殖性疾患を治療する方
法に関連する。細胞増殖性疾患、例えば限定しないが、血管増殖性疾患、線維症
疾患、新脈管形成、腫瘍成長、腫瘍転移、リウマチ関節炎、及び加齢性黄斑変性
である。

【００１６】 更に本発明の実施態様は、本発明の医薬組成物をホ乳動物に対し存在の脈管構
造に逆に作用することなく血管形成を阻害するに至る有効な量に於いて投与する
即ちいわば、既存の脈管構造に有害に作用することなく腫瘍に対して血流を除去
又は実質的に減少又は制限するホ乳動物に於いて、腫瘍脈管構造を減少又は阻害
する方法を供する。

【００１７】 本発明は又、本発明に従い抗体又は抗体断片当該抗体の可変領域又は当該抗体
の超可変領域に対するコーディング配列をコードするヌクレオチド配列を供する
。

【００１８】 更に尚好適実施態様に於いて、本発明は、ホ乳類宿主に対して本発明の抗原又
は抗原断片を配する遺伝子治療の方法に関する。本発明は、所定の部位で、新脈
管形成又は腫瘍血管新生を阻害する為の有効な時間及び量に於いて、所望の抗体
又は抗体断片をコードする核酸をホ乳動物に対して投与することを含んで成る。

【００１９】 本発明の詳細な説明 本発明は、既に形成された接着分子結合を実質的に混乱させることなく、ＶＥ
−カドヘリン間の相互作用を阻害する、ＶＥ−カドヘリンに対する抗体拮抗薬を
供する。そのようにすることに於いて、当該拮抗薬は実質的に新たな接着分子結
合の細胞内形成を、既に形成された接着分子結合を混乱することなく、実質的に
阻害又は予防する。従って、完全な抗体の抗原特性を保持していることで、これ
ら抗体及び断片は、ホ乳類ＶＥ−カドヘリンのドメイン１の１５〜２０個のＮ−
末端アミノ酸で、ホ乳類ＶＥ−カドヘリン上の部位に特異的に結合でき、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでＶＥ−カドヘリン仲介接着結合を阻害することができるが、任意の
有為な実質的効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで傍細胞浸透性に対して発揮しない。当該
結合部位は好適に当該ＶＥ−カドヘリンの前記Ｎ−末端の１５個のアミノ酸の内
にある。

【００２０】 代わって、特異的な結合は、ＶＥ−カドヘリンのドメイン１の約１５〜約２０
個のＮ−末端アミノ酸内のホ乳類ＶＥ−カドヘリン上の部位に対するものであり
うる。 ここに於いて、Ｎ−末端アミノ酸はＶＥ−カドヘリンアミノ酸配列に関連する
約１〜５個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有する。同様に、（１）ＶＥ−カ
ドヘリンの任意対立変異の１５個のＮ−末端アミノ酸を伴う部位（２）ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１(DEIWNQMHIDEEKNE）；のアミノ酸配列を持つペプチド；もしくは
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２(DWIWNQMHIDEEKNE）；のアミノ酸配列を持つペプチド；
もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３(DWIWNQMHIDEEKNT）のアミノ酸配列を持つペプ
チドに対する特異的な結合でありうる。全ての場合、抗体は既存の結合を混乱さ
せることなく新規結合の形成を阻害する能力を保持している。

【００２１】 故に本発明の抗体及び抗体断片は、ｉｎ ｖｉｖｏでの血管浸透性に対して任
意の有為又は実質的な作用を発揮しない。同様に、本発明抗体及び抗体断片は、
動物又はホ乳動物に対して投与した時実質的に無毒である。本発明の好適な抗体
は、ネズミのモノクローナル抗体Ｅ４Ｂ９である。

【００２２】 本発明のホ乳動物は、限定されないが、家畜化した動物（例えばウシ、ブタ、
イヌ及びネコ）、ネズミ、霊長類及びヒトである。ヒトは好ましい動物である。

【００２３】 本発明の抗体及び抗体断片は、新脈血形成を阻害する方法：腫瘍転移を阻害す
る方法；血管新生に関連した細胞増殖疾患を治療する方法及び、腫瘍脈血構造を
減少又は阻害する方法に於いて使用できうる。

【００２４】 本発明は又、キメラ、単鎖及びヒト化抗体並びに二重特異性抗体、三重特異性
抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ発現ライブラリーの産物等である。

【００２５】 本発明の抗体は当業界で周知である汎用の方法により調製されうる。好適に、
当該抗体は、モノクローナル抗体であるが、本発明は又、単一特異性ポリクロー
ナル抗体の使用も予測される。単一特異性ポリクローナル抗体は、適切なＶＥ−
カドヘリンを伴い調製されたポリクローナル抗体の製剤から不都合な特性を外す
ことにより調製できうる。当該抗体の調製に対して適切なイムノゲンは限定しな
いが、ホ乳類ＶＥ−カドヘリン、ホ乳類ＶＥ−カドヘリンの断片、好適にはＶＥ
−カドヘリン由来の細胞外ドメイン、及びホ乳類ＶＥ−カドヘリンのＮ−末端ド
メイン１由来のペプチド及びこれらいずれによる融合タンパク質等である。当該
分子（例えばペプチド）は、ＢＳＡ、ＫＬＨ又は当業界で周知の他の任意の担体
のような担体分子に接着できうることが適切である。好適なイムノゲンは本質的
にホ乳類ＶＥ−カドヘリンの１５個のＮ−末端アミノ酸残基から成るペプチドで
ある。

【００２６】 モノクローナル抗体を調製する為の技術は、限定しないが、ハイブリドーマ技
術（Kohler & Milstein Nature 256 : 495-497 (1995))ファージディスプレイ（
ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）技術、トリオマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトβ細
胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、Immunology Today 4 : 72, (1983))及びヒト
モノクローナル抗体を産生するに至るＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole.ら、1
985. In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp 77-96). 等である。

【００２７】 本発明の他の実施態様は本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ等である。ラット抗−マウスＶＥ−カドヘリンＥ４Ｂ９を産生するそのような
ハイブリドーマはＡＴＣＣ、メリーランド州、ロックビルに寄託されており、割
り当て受諾番号は 。

【００２８】 単鎖抗体（米国特許第４，９４６，７７８号、本明細書中で参照により組み込
まれた）の生産の為に記載された技術は、本発明のイムノゲンポリペプチド産物
に至る単鎖抗体の生産に適用される。

【００２９】 本発明の抗体は例えば、ＶＥ−カドヘリンペプチド並びに断片、アナログ及び
ＶＥ−カドヘリンペプチドの誘導体に対して生じうる。用語、タンパク質ペプチ
ド及びポリペプチドは、本明細書中で同義として使用される。用語「断片」「誘
導体」及び「アナログ」はポリペプチドに関連し、ポリペプチドは実質的に同様
の生物学的機能もしくはＶＥ−カドヘリンポリペプチドとしての活性を保持する
又は、当該ポリペプチドは膜ポリペプチドの溶解形態のようなケモカインレセプ
ターとして機能しないがリガンドに対して結合する能力を保持する。本発明のポ
リペプチドは、例えば、組換えポリペプチド、自然のポリペプチド又は合成ポリ
ペプチドを含んで成る。

【００３０】 アナログは、例えば、活性を有する成熟ポリペプチドを生産する為のタンパク
質部分の***により活性化するプロタンパク質である。ＶＥ−カドヘリンポリペ
プチドの断片は、図２のアミノ酸配列を含んで成るＮ−末端断片を持つＶＥ−カ
ドヘリンペプチド又はこれらの断片等である。図２のポリペプチドの誘導体又は
アナログは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１〜３の１又は複数の配列及び例えば（ｉ）
１又は複数のアミノ酸残基が保存されたもしくは非保存されたアミノ酸残基によ
り置換されているペプチド、（ii）１又は複数のアミノ酸残基が置換基を含んで
いるペプチド（iii ）前記成熟ポリペプチドが、当該ポリペプチドの半減期を延
長する為の化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような他の化合物と融
合されたポリペプチド（iv）ポリペプチドの精製の為に前記成熟ポリペプチドに
更なるアミノ酸が付加されたペプチド（ｖ）ポリペプチドの断片が溶解性、即ち
、膜結合でないが、膜結合ペプチド又はレセプターに尚リガンドを結合させるポ
リペプチド、又は（vi）（ｖ）に対する（ｉ）の組み合わせを含んで成る。その
ような断片、誘導体及びアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内に
あるものとみなされる。

【００３１】 本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、好適に単離された形態に於い
て供され、好適なものは、均質に精製される。しかしながらこれは常に必要では
ない。更に、本発明のポリペプチドは、１又は複数のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１〜
３のペプチドに対する７０％以上の類似性（好適には７０％の同一性）、１又は
複数のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１〜３のペプチドに対する、好適には９０％以上の
類似性（更に好適には９０％同一性）、更に一層好適には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
．１〜３のポリペプチド及びそのようなペプチドの部分に対する９５％の類似性
を有する。

【００３２】 当業者に周知である、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、第２のポリペ
プチドの配列に対して、当該ポリペプチドに対するアミノ酸配列及び保存された
アミノ酸配列を比較することにより決定される。

【００３３】 本発明の他の実施態様に従い、本発明の抗体は、既知の抗体の全又は一部をク
ローニング及び発現させることによる、組換えＤＮＡ技術により調製できうる。
そのような、当業界で周知の技術を使用することで、非−ヒト抗体のヒト化版が
調製できうる。例えば、モノクローナルＥ４Ｂ９のヒト化版は、適切な発現ベク
ターに於いて、この抗体をコードする遺伝子をクローニングすることにより容易
に調製できうる。これに関して有用な核酸は、可変領域、超可変領域又は正常な
脈管構造を混乱することなく、新たな接着分子結合を阻害するに至るＶＥ−カド
ヘリンペプチドの細胞外ドメインのドメイン１に特異的に結合するモノクローナ
ル抗体の両方を含んで成るアミノ酸配列をコードするアミノ酸配列である。

【００３４】 更に実際上、本発明は又、大まかに上に記載したような１又は複数の配列を含
んで成る組換え構築体等を含んで成る。構築体は、プラスミド、ウィルスベクタ
ーのような、本発明の配列が正又は逆向きの方向に於いて挿入されているベクタ
ーである。本実施態様の好適な実施態様に於いて構築体は更に、例えば配列に作
用可能式に結合したプロモーター等制御配列を含んで成る。多数の適切なベクタ
ー及びプロモーターは当業者に周知であり、商業的に入手可能である。以下のベ
クターは実施例により供される。 細菌のｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ
１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ
Ｋ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３
、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核生物の：ｐＷＬＮＥ
Ｏ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしな
がら、他の任意のプラスミド又はベクターは、宿主中でそれらが複製可能及び生
存可能である限り使用されて良い。

【００３５】 宿主細胞中の構築体は、組換え配列によりコードされた遺伝子産物を生産する
為に汎用の方法に於いて使用される。原核及び真核宿主と共に用いる為の適切な
クローニング及び発現ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning : A Labora
tory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989) により記述
された。

【００３６】 本発明の他に局面に従い、本発明のイムノゲンポリペプチド産物に対するヒト
化抗体を発現するトランスジェニック動物が供される。霊長類特にヒトを除き、
新たなトランスジェニックホ乳類宿主が供され、当該宿主は、イムノゲンに対す
る免応答を増幅でき、当該応答は、霊長類、特にヒトが持つ抗体定常及び／又は
可変領域もしくはそのような注目のエフェクターペプチド配列を生産する。

【００３７】 前記宿主は、内因性の免疫グロブリンサブユニットをコードする遺伝子座の置
換及び／又は不活性化によりもたらされる外因性のもしくは修飾化抗体を生産で
きることにより特性決定される。当該修飾体は、機能性ペプチドに対するＣ−末
端で結合した可変領域結合部位の集成を司る定常領域の一部以上を保持する。当
該機能性ペプチドは、様々な形態又はコンホメーションをとり、例えば酵素、増
殖因子、結合タンパク質、リガンド、サイトカイン、エフェクタータンパク質、
キレートタンパク質等として働く。抗体は、イソ型、即ちＩｇＡ，ＩｇＤ，Ｉｇ
Ｅ，ＩｇＧ，ＩｇＭ又はイソ型の中のサブ型のいずれかである。

【００３８】 トランスジェニック宿主は例えばマウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ
ネコ等である。他の動物は、同様の手順に従い容易にマウスに対して置換されて
良いものと解すべきである。

【００３９】 ヒト化及びキメラ抗体は以下の戦略に従い調製される。ある戦略に於いて、ヒ
ト重及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、マウス胚系統に導入され、別の段
階に於いて、対応のマウス遺伝子は無機能的に精製される。ヒト重及び軽鎖をコ
ードするポリヌクレオチドは、適切な原核及び真核微生物中で構築され、次いで
生じたポリヌクレオチド断片は、滅菌マウス卵母細胞又は胚性幹細胞中へと導入
される。内因性マウス免疫グロブリン座の不活性化は、マウス胚性幹細胞に於け
る相同的組換による、適切な座の標的***（ｔａｒｇｅｔ ｄｉｓｒａｐｔｉｏ
ｎ）により達成される。各場合に於いて、キメラ動物が生成され、それらは、修
飾化胚性幹細胞の一部から生じ、胚系統を通じて、遺伝子修飾の伝達ができる。
不活性化免疫グロブリン座を有するマウスに対してヒト免疫グロブリン座を有す
るマウスの交配は、純粋なヒト抗体を生産する動物を産む。

【００４０】 他の戦略に於いて、ヒト重及び軽鎖免疫グロブリン座の断片は、マウス胚性幹
細胞中での相同的組換えにより、直接対応のマウスの遺伝子座を置換する為に使
用される。これは、キメラトランスジェニック動物の生成に従う。生じたヒト抗
体は、例えば他のタンパク質から、アフィニティーカラムを使用することにより
、例えばタンパク質Ａ等のＦｃ結合成分を有し単離される。

【００４１】 様々な動物に於いて、関連の、各々のドメインをコードするエキソンの位置及
び、スプライシング部位及び転写要素の位置は、通常当業者により周知である。
例えば、ヒトに於いて、免疫グロブリン重鎖座は第１４染色体上に位置する。５
′→３′方向の転写に於いて、当該座は、結合（Ｊ_H ）領域及び定常（Ｃ_H ）遺
伝子クラスターに続き、可変領域遺伝子（Ｖ_H ）₁ 多様性（Ｄ）領域遺伝子の大
きなクラスターを含んで成る。当該座の大きさは約２，５００キロベース（Kb）
であると見積もられる。Ｂ−細胞が発達する間、胚系統ＩｇＨ座由来の不連続な
遺伝子セグメントは、ＤＮＡの物理的再配置により並置される。

【００４２】 機能性重鎖免疫グロブリンポリペプチドの生産は、機能的なユニットを生じる
、特異的な連続様式に於いて結合される、Ｖ_H 、Ｄ及びＪ_H 領域由来の不連続な
３つのＤＮＡセグメントを要求する。一度これらのユニットが形成されると、特
異的な重鎖は、免疫グロブリン座の転写に従い生産される。免疫グロブリン軽（
ＩｇＬ）鎖、ヒト第２染色体上のκ座及びヒト第２２番染色体上のλ座に対する
２つの座がある。当該ＩｇＬ座の構造は、Ｄ領域が存在しないことを除いて、Ｉ
ｇＨ座のそれに類似している。

【００４３】 Ｖ領域の全体又は当該Ｖ領域の様々な断片は、高親和性抗体の遍くスペクトル
を生産する為に使用される。例えば、ヒト重及び軽鎖Ｉｇ座の周知のＶ領域のサ
ブセット（Bermanら、EMBO J. 7 : 727-738 (1998)）は、強い免疫応答を増強及
び高い親和性抗体を供するトランスジェニック宿主を生産する為に使用される。

【００４４】 前記トランスジェニック宿主由来のＢ細胞を生産する抗体もしくは抗体アナロ
グは、例えば汎用の方法、即ちガン細胞によるトランスジェニックによりハイブ
リドーマもしくは不死化した（細胞）を生産する為に、マウス骨髄性細胞に対し
て融合させる為に使用される。次いで、これら不死化細胞は、例えば連続培養又
は、腹水の生産の為の適合性ホストの腹膜への導入に於いて増殖する。

【００４５】 先に論じたように、本発明は又、本発明の抗体の活性を維持して供された、ポ
リクローナルヒト抗−血清もしくはヒトモノクローナル抗体もしくは抗体アナロ
グの生産を供する。本発明のエピトープ結合成分は、免疫グロブリンリンスーパ
ーファミリーの遺伝子（即ち、本明細書中に参照により組み込まれたThe Immuno
globulin Gene Superfamily, Williams & Barclay In : Immunoglobulin Genes,
Honjo, Alt, and Rabbitts, eds., (1989))により実質的にコードされる１又は
複数のポリペプチドから成るタンパク質に関連する。例えば、エピトープ結合成
分は、重鎖の一部もしくは全部、軽鎖の一部もしくは全部又は両方を含んで成る
。しかしながら、エピトープ結合部位は、特異的な標的に対して結合する能力を
保持する免疫グロブリンスーパーファミリー遺伝子産物の十分な部分又はエピト
ープを含有しなければならない。

【００４６】 本発明の範囲内の例は、様々な結合特性を有する連結２エピトープ結合成分に
より形成される二重特異性抗体である。

【００４７】 「成熟」免疫グロブリンの天然形態が、アミノ酸配列に於いて１又は複数のア
ミノ酸の欠失、置換、挿入又は添加により長さに関して幾分変わることは十分周
知である。従って、可変及び定常領域は共に実質的な自然修飾を受けるが、「実
質的に同一」であり尚、それぞれの活性を保持できる。

【００４８】 ヒト定常及び可変領域をコードするポリヌクレオチドは、様々なヒト細胞、好
適には不死化Ｂ細胞から十分周知の手法に従い単離される。非−ヒト資源から非
−ヒト免疫グロブリンを単離する為に、類似の方法が使用される。ポリヌクレオ
チドに対する適切な細胞資源及びそれらの発現及び分泌産物は、米国型細胞所蔵
品（「Catalogue of Cell Cines and Hybridowa」Fifth edition (1985) Rockvi
lle, Md., U.S.A.）のような多くの源から得られる。

【００４９】 免疫グロブリンのこれら天然形態に加え、「実質的に同一な」修飾化重及び軽
鎖は、当業者に十分周知の様々な組換え技術を使用して、容易に設計及び製造さ
れる。例えば、いくつかのアミノ酸の置換、終末及び中間体添加及び欠失等によ
り一次構造レベルで、天然の配列から鎖が変わる。代わって一次構造の一部のみ
を含んで成るポリペプチド断片が生産されその断片は１又は複数の免疫グロブリ
ン活性（即ち、結合活性）を有する。

【００５０】 特に多く遺伝子等、それぞれが１又は複数の別々の生物学的活性を持つ、別々
の機能領域を含む免疫グロブリン−関連遺伝子が留意される。概して、所望のエ
ピトープ結合成分をコードする遺伝子の修飾は、部位特異的突然変異誘発（どち
らも参照により組み込まれたGillman & Smith, Gene 8 : 81-97 (1979) and Rob
erts, et al., Nature 328 : 731-734 (1987) を参照のこと）のような十分周知
の様々な技術により容易に達成される。

【００５１】 本発明の好適な実施態様に於いて、本発明の抗体のエピトープ結合成分は、「
キメラ」又は「ヒト化」免疫グロブリン遺伝子によりコードされる（概して本明
細書中で参照に組み入れたQueen (1991) Nature 351 : 501 を参照のこと）。一
度発現した、ＶＥ−カドヘリン抗体、エピトープ結合成分、それらの二量体、又
は各重鎖及び軽鎖は、当業界で周知の標準的手法、例えば、硫酸アンモニウム沈
殿、分画カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等（概して、Scopes, Protei
n Purification, Springer-Verlag N.Y. (1982) を参照のこと）に従い精製され
る。一度精製されると、部分的に又は所望された均一性で、抗体及びこれらの断
片は、例えば治療学的、分析学的、ドラッグスクリーニング技術に於いて又は、
抗体蛍光染色のような、アッセイ手法の開発及び実施等に於いて使用される。

【００５２】 一度、候補の抗−ＶＥ−カドヘリンが試験されそしてｉｎ ｖｉｖｏで血管浸
透性に於ける増加が無いことが確かめられると、抗体及び抗体断片のｉｎ ｖｉ
ｖｏ活性及び／又は効果は、当業者に周知の多くの方法により決定されうる。そ
のようなアッセイは、限定しないが、ｉｎ ｖｉｖｏ新脈管形成アッセイ等であ
る。３つのｉｎ ｖｉｖｏ新脈管形成アッセイである角膜のミクロポケット、マ
トリゲル栓（Ｍａｔｒｉｇｅｌ ｐｌｕｇ）及びアルギン酸−封入腫瘍細胞アッ
セイは、ＶＥ−カドヘリンモノクローナル抗体の抗−新脈管形成活性の評価の為
に特に有用である。一般的に、このアッセイ（角膜のミクロポケットアッセイ）
は他のアッセイよりも試験する為の抗体をより少なく要し、時間を消費しないの
で抗体（又は抗体断片）は、角膜のミクロポケットアッセイに於いて試験される
。様々な量の抗体は外科的に移植されるペレット剤に組み込まれる又は全身的な
方法に於いて投与される。角膜の血管新成に対して為意な阻害活性を伴うこれら
抗体は更に、マトリゲル栓アッセイに於いて試験される。当該マトリゲル栓及び
アルギン酸アッセイは、抗−ＶＥ−カドヘリン抗体の抗−新脈管形成活性を確か
め、様々な抗体とコントロールの間の抗−新脈血形成活性の定量を可能にする為
に働く。ｉｎ ｖｉｖｏで新脈血形成の阻害を示す抗−ＶＥ−カドヘリン抗体は
更に、腫瘍モデルに於いてそれらの抗−腫瘍活性に対する試験をされる。ヒトＡ
４３１類表皮癌異種移植片モデル、ルイス肺皮下腫瘍モデル及びルイス肺転移モ
デルはこれらの研究の為に使用される。

【００５３】 実施例５は、更なるアッセイ並びに本発明の抗体及び／又は抗体断片を更に評
価する為のアッセイ及び技術を適用する詳細な実施例を供する。

【００５４】 本発明の抗体拮抗薬を含んで成る医薬的組成物は、これらを要請する患者に於
いて、患者に対して投与する為に有用である。投与は様々な投与経路、例えば経
口又は非経口（皮下、筋肉間又は静脈内）等により達成される。非経口投与の為
の組成物は共通に、当該抗体の溶液又は許容できる担体、好適には、水性担体中
に溶解したこれらのカクテルを含んで成る。様々な水性の担体、即ち、水、緩衝
化水、０．４％の食塩水、０．３％グリシン等が使用される。これらの溶液は滅
菌され、一般的に粒状物質がない。これらの組成物は、例えば汎用の十分周知の
滅菌技術により滅菌される。

【００５５】 本発明の組成物の担体又は賦形剤は、例えば生理学的な条件を要求された時pH
調製及び緩衝試薬、毒性調整試薬等のような例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリ
ウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等、医薬的に許容できる
補助試薬を含んで成る。これら製剤中の前記試薬の濃度は、遍く、即ち約０．０
１重量％未満好適に約０．１重量％以上から約５重量％に至り変わる。濃度範囲
は、流体体積、粘度又は特に、選択された投与の方式に主に基づいて選択される
。

【００５６】 従って筋肉内の注射に対する典型的な医薬的組成物は、例えば約１mlの滅菌緩
衝水及び約１mgの前記試薬を含有し作成される。皮下注射の為の典型的な組成物
は、例えば約２５０mlの滅菌リンガー溶液及び１０mgの前記試薬を含むように作
成される。非経口的に投与できる組成物を調製する為の実際の方法は、当業者に
周知又は自明であり、例えば本明細書中参照として組み込んだRemington's Phar
maceutical Science, 15th Ed., Mack Publishing Campany (1980) に記載があ
る。

【００５７】 本発明の抗体は、例えば、保存の為に凍結乾燥され、使用前に適切な担体中で
再構築される。この技術は、汎用の免疫グロブリン及び業界で周知の凍結乾燥及
び再構築技術を使用することで有効であると示されている。本抗体又はこれらの
カクテルを含有する組成物は、予防法及び／又は治療学的な治療の為に投与され
る。

【００５８】 本発明に従い、新脈血形成を阻害する方法は、本発明の抗体又は抗体断片を含
有する組成物をホ乳動物に対して、新脈管形成を阻害する為の有効な時間及び量
に於いて投与することを含んで成る。同様に、本発明の抗体を含有する組成物を
ホ乳動物に対して腫瘍の転移を阻害する為に有効な時間及び量に於いて投与する
ことにより、本発明の抗体及び抗体断片はホ乳動物に於ける腫瘍の転移を阻害す
る方法に於いて使用できうる。

【００５９】 ある実施態様に於いて、本発明は、抗体又は抗体断片を含有する組成物を正常
な脈管構造を阻害することなく内皮細胞の増殖を阻害する為に有効な時間及び量
に於いてホ乳動物に対して投与することを含んで成る、ホ乳動物に於ける血管新
生に関連する細胞増殖性疾患を治療する方法を供する。

【００６０】 他の実施態様は、抗体もしくは抗体断片を含有する組成物を、既存の脈血構造
に有害に作用することなく血管形成を阻害するに至る有効な量に於いて投与する
ことを含んで成る、ホ乳動物に於ける腫瘍脈血構造の減少もしくは阻害する為の
方法に関連する。本発明に係り治療できうる腫瘍は、限定しないが、癌、神経膠
腫、肉腫、腺癌、腫肉腫、腫瘍並びに白血病及びリンパ系の腫瘍のような液体腫
瘍である。これらの腫瘍は体の全ての部分、例えば、脳、胸、肺、結腸、腎臓、
膀胱、頭部及び頸部、卵巣、前立腺、膵臓、皮膚、骨組織、骨髄、血液、胸線、
子宮、精巣、頸並びに肝に於いて起って良い。

【００６１】 本明細書中で使用した「細胞増殖性疾患」は、多細胞生物中の１又は複数の細
胞のサブセットの不都合な細胞増殖が、多細胞生物に対して害（即ち、不快又は
生命予測の減少）をもたらすことを引き起こすことに関連する。様々な型の動物
及びヒトに於いて細胞増殖性疾患並びに例えば血管増殖性疾患、線繊症疾患、新
脈血形成、腫瘍増殖、慢性関節リウマチ及び加齢性黄斑変性が引き起こる。

【００６２】 他の実施態様に於いて、本発明は、本発明の抗体又は抗体断片をコードする核
酸をホ乳動物に対して、予定した部位で新規の脈管形成を防げる又は腫瘍の新脈
血形成を阻害するに至る有効な時間且つ量に於いて投与することを含んで成る、
遺伝子治療の方法を供する。遺伝子治療の方法は当業界に於いて周知である。こ
の方法は、本明細書中で述べた新脈管形成に関連する疾患を治療すること並びに
上に列挙した腫瘍の阻害する為に適用可能である。

【００６３】 本発明に係る、治療学的用途は、治療、予防及び改善を含んで成る。もし治療
が企図されれば、組成物は特定の疾患により既に影響された患者に対して、その
状態及び合併症を治療又は少なくとも抑止するに至る十分な量に於いて投与され
る。これを達成する為に適切な量は「治療学的に有効な投与量」として定義され
る。この使用法の為に有効な量は、状態の症度及び患者自身の免疫系の一般的な
状態に依存するが、投与量あたり約０．０１から約１００mgの抗体又は抗体断片
の範囲で一般的に、一層一般的には患者につき約１から約１０mgの投与量で用い
られる。

【００６４】 予防薬の用途に於いて、抗体拮抗薬又は、もし有利ならばそれらのカクテルを
含有する組成物が、患者の抵抗力を高める為に、既に疾患状態に入ってはいない
患者に対して投与される。そのような量は「予防学的に有効な投与量」であると
定義される。この使用法に於いて、重ねて適切な量が患者の健康状態及び免疫の
レベルに依存するが、一般的に投与につき約０．１から１００mg、好適には患者
につき約１から約１０mgの範囲（で用いられる）。当該組成物の単一又は複合投
与は、治療する内科医により選択される投与レベル及びパターンにより実行され
る。いずれの事象に於いて、医薬製剤は、有効に患者を治療する為に十分な量の
本発明の試薬を供するべきである。

【００６５】 本出願を通じて、様々な刊行物、特許及び特許出願を参照にしている。これら
刊行物、特許及び特許出願はその全体に於いて、本発明の属する技術の状態を一
層完全に記述するこの出願へと参照により組み込まれた。

【００６６】 実験的な実施態様に於いて開示された、本明細書中の発明の原則に於ける変形
体は当業者により作成されるものと解され、例えば修飾体、変異体及び置換体等
は本発明の範囲内に列を挙げられることを意図する。

【００６７】 実施例１ 方法 モノクローナル抗体の調製：ルイスラット（６〜８週齢メス）に２５目盛りの
注射針を使用してフレウンドの完全なアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍ
ｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）と０．１mlのタンパク又はペプチド〔タンパク
質濃度？？〕を混合して皮下（Ｓ．Ｃ）投与した。ラットを２〜３週間おきに抗
原により増強され、毎週尾の静脈を介して出血させた。３つの増強する免疫化の
後又は血清力価が最大レベルに至った時、マウスをＣＯ₂ 吸入により犠牲にした
。汎用の技術によりモノクローナル抗体を生成する為に、脾臓を犠牲にした動物
から回収した。

【００６８】 抗体のスクリーニング：ハイブリドーマ上清を、酵素−結合免疫吸着アッセイ
（ＥＬＩＳＡ）により、ＶＥ−カドヘリンに結合した抗体を同定する為にスクリ
ーニングした。

【００６９】 結合の形成／Ｃａ転換アッセイ：結合形成アッセイは、カルシウム転換アッセ
イ（Gumbiner, B., & Simons, K., Cell Biol. 102 : 457-468 (1986)）に基づ
いて開発された。ＶＥ−カドヘリンを発現するトランスフェクション体ＣＨＯ細
胞又は上皮細胞をスライドガラス上に対し配し、コンフルエントな単層を形成す
ることを可能にした。５mMのＥＧＴＡで３０分に渡るインキュベーションにより
培養培地からカルシウムを涸渇することにより人工的に単層の接着結合を阻害し
た。次いでＥＧＴＡ含有培地を除去し、接着分子結合の形成を可能にする為にカ
ルシウムを含有する新鮮培地を添加した。接着分子結合の阻害は、カルシウム含
有新鮮培地を添加した時に、様々な濃度のＶＥ−カドヘリンの添加により測定さ
れる。結合阻害及び結合再形成過程の速度論は、接着分子結合に於けるＶＥ−カ
ドヘリンの消失と再発生とに相関する。接着分子結合の形成は、マウス又はヒト
ＶＥ−カドヘリンに対して特異的なポリクローナル抗体を伴い蛍光染色すること
により視覚化される。他の接着結合分子（ＣＤ３１）に対する免疫染色を、いつ
も決まって処理された細胞単層が後退しないことを確かめる為に挙げる。

【００７０】 傍細胞浸透性のアッセイ：細胞浸透性のアッセイを、コースタートランスウェ
ル（Ｃｏａｓｔａｒ ｔｒａｎｓｗｅｌｌｓ）の先端の***に於いて、ＶＥ−カ
ドヘリンを発現するＣＨＯ細胞又は上皮細胞を観察することにより行なう。培地
を接着分子結合及び融合性の細胞単層の形成を可能にする為に２日間に渡りイン
キュベートした。次いで試験抗体をＦＩＴＣ−デキストランに沿って細胞の先端
の***に添加した。細胞浸透性に対する当該抗−ＶＥ−カドヘリンの作用（結合
の阻害）を底の***に浸透するＦＩＴＣ−デキストランの関数として測定した。

【００７１】 浸透性アッセイは、ハイブリドーマ培養上清中で発現させたモノクローナル抗
体の早期スクリーニングの為の有用な形態に適用できうる。要するに、ハイブリ
ドーマ細胞をトランスウェル（Ｃｏｓｔｅｒ、直径６．０mm／孔の大きさ０．３
μｍ）の底の***中へと播種し、先端の膜上でマウスＶＥ−カドヘリンを発現し
ている細胞の単層と共培養する。このアッセイ中で使用する細胞は、全長マウス
ＶＥ−カドヘリン分子を発現するＣＨＯトランスフェクション細胞及びマウスＨ
５Ｖ上皮細胞系統である。３〜５日に渡る共培養の後、ＦＩＴＣ−デキストラン
（１mg／ml）を先端の***に添加し、底の***中へと入る細胞単層と組み合わせ
るＦＩＴＣ−デキストランの関数として蛍光光度法により測定した。候補のモノ
クローナル抗体の浸透性活性（接着結合の阻害）を、無関係なコントロールのラ
ットモノクローナル抗体を含有するコントロールのウェルと比較し、ＶＥ−カド
ヘリン発現細胞の浸透性の増加の百分率として計算した。浸透性活性は、様々な
ハイブリドーマクローンの間の成長率及び抗体生産率に於ける変動に対するコン
トロールに対してハイブリドーマ細胞数及び全ラットＩｇ生産率により標準化さ
れる。 新たなモノクローナル抗体の結合阻害活性は、高い結合阻害活性（浸透性増加
＞１５０％）を有するものと知られる、抗体１９Ｅ６と比較される。阻害がない
（浸透性増加約２５％）又は穏当な阻害（浸透性増加約２５〜７５％）活性を示
すこれらの抗体のみを、結合形成アッセイに於いてそれらの結合阻害活性に対す
る更なるスクリーニングに掛ける。

【００７２】 角膜のポケットアッセイ：Ｃ５７／ＢＬマウス（６〜８週齢メス）を塩酸ケタ
ミンにより麻酔をし、フォンＧｒａｅｆｅ白内障ナイフ（ｖｏｎ Ｇｒａｅｆｅ
ｃｏｎｔａｒａｃｔ ｋｎｉｆｅ）を使用して両眼中に角膜のポケットを創っ
た。次いで様々な投与量での試験抗体を有す又は有さない塩基性ＦＧＦを含有す
るハイドロンペレット剤（Ｈｙｄｒｏｎ ｐｅｌｌｅｔ）を各眼のポケットへ移
植した。代わって、塩基性ＦＧＦを含有するハイドロンペレットを移植し、マウ
スを、様々な投与量で試験抗体を２５目盛りの注射針による３日おきの注射によ
り処理した。６〜７日後、新脈管形成応答を細隙灯生物顕微鏡及び撮影により検
査した。ネズミをＣＯ₂ 吸入により犠牲にし、更なる組織学的解析の為に眼を摘
出し調製した。

【００７３】 実施例２ 既存の結合を混乱することなく接着分子結合形成を阻害するＶＥ−カドヘリン
モノクローナル抗体

【００７４】 ２つの群のルイスラットを、ネズミのＶＥ−カドヘリンのＮ−末端ドメイン１
由来の配列を有する４つのＫＬＨ−連結ペプチドの混合物又はＣＨＯ細胞中で発
現しているアフィニティー精製溶解性マウスＶＥ−カドヘリン（ｓｍＶＥＣ−Ｉ
ｇ）により免疫化した。このイムノゲンは、ヒトＦｃ鎖に融合したマウスＶＥ−
カドヘリンの細胞外領域全体を包含する。生じたハイブリドーマクローンを汎用
のＥＬＩＳＡ形態を使用してＶＥ−カドヘリンに対する結合活性を有する抗体の
生産の為の試験をした。このスクリーニングで２０のラットの抗−マウスＶＥ−
カドヘリン抗体を同定し、１０（抗体）は最初から免疫化したラットの群の各々
から（同定した）。

【００７５】 これらモノクローナル抗体のいくつかの特性を検査し、結果を表１及び表２中
に要約した。

【００７６】 ２０の候補ＶＥ−カドヘリン抗体をそれらの結合形成阻害活性及び既存の結合
混乱させる活性をそれぞれ検査する為に、「カルシウム転換」及び「浸透性」ア
ッセイに於いて試験した。これら２０抗体の間で、Ｅ４Ｂ９は正常な脈血構造に
、対し有害に作用することなく、特異的に接着結合を阻害することが示された（
図３及び４）。更に一層、当該Ｅ４Ｂ９抗体が又ｉｎ ｖｉｖｏ新脈管形成アッ
セイに於いて試験され８０％超の角膜の血管新生の阻害を示した（図５）。一方
他の抗体（１０Ｇ４）が又ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ基準により、ＶＥ−カドヘリ
ンが仲介する接着結合の形成の潜在的な阻害物として同定され、この抗体は既存
の結合を破壊する（図３）。これら２つの抗体の鍵となる生物学的活性を、他の
マウス及びヒト−抗−ＶＥ−カドヘリン抗体からのデータに沿って、表３に要約
した。

【表１】

【表２】

【表３】

【００７７】 実施例３ ヒトＶＥ−カドヘリンと交差反応するＥ４Ｂ９

【００７８】 マウスのエピトープ配列は、抗体Ｅ４Ｂ９（ペプチド１）がヒトＶＥ−カドヘ
リンと１００％の相同性を共有することにより認識され、その為この抗体を、ヒ
トＶＥ−カドヘリンと交差反応するかを決定する為に試験した。ヒト及びマウス
細胞が発現するいくつかのＶＥ−カドヘリンのウェスタンブロット解析で、Ｅ４
Ｂ９は完全にヒトＶＥ−カドヘリンと交差反応することが示された。この発見は
、いくつかのマウスモデルに於いて抗−腫瘍活性が十分に試験できうるので「ヒ
ト化」Ｅ４Ｂ９抗体の開発及び前臨床開発に於ける成功を促進する。

【００７９】 実施例４ エピトープマッピング

【００８０】 各新たなモノクローナル抗体により標的にされる特異的なＶＥ−カドヘリンド
メインを明らかにする為に、一連のｓｍＶＥ−カドヘリン−Ｉｇ切断体を組換え
で生成した。エピトープマッピング戦略を図７に示す。 これらＶＥ−カドヘリン−Ｉｇ切断−耐性プラスミドをトランスフェクション
したＣＯＳ細胞由来の培養上清を、各モノクローナル抗体に対するエピトープド
メインを決定する為にＥＬＩＳＡで使用した。３つの機能的な塊状モノクローナ
ル抗体（Ｅ４Ｂ９，１９Ｅ６及び１０Ｇ４）のファインエピトープマッピングを
作成した。１９Ｅ６及び１０Ｇ４認識領域は、モノクローナル抗体Ｅ４Ｂ９のそ
れと異ることを最初の結果が示した。

【００８１】 他の抗体（１９Ｅ，１０Ｇ４及びＣａｄ−５）は既存の結合を阻害する一方、
抗体Ｅ４Ｂ９は既存の結合を混乱させることなく新規結合形成を阻害する。一方
、新脈血形成のより後の段階の間、おそらく最初に同じ細胞（鎖二量体）、次い
で反対の細胞（接着二量体）から、ＶＥ−カドヘリンの同種の接着により仲介さ
れる、毛細血管様管状構造中へと、剥離した細胞が集成されなければならない。
それ故、「鎖二量体」、形成を阻害化する（Ｅ４Ｂ９のような）抗体は、新たな
結合形成を阻害する為に十分である。対照的に、既存の結合の阻害は逆の、即ち
、「接着二量体」から「鎖二量体」への過程である。従って、「接着二量体」に
特異的なこれら抗体拮抗薬は、既存の脈管構造に対して一層の阻害をする。この
モデルを支持する証はＶＥ−カドヘリンのファインペプチドマッピング及び結晶
構造である。

【００８２】 実施例５ 多方面に渡るｉｎ ｖｉｖｏ評価

【００８３】 組織に於ける血管浸透性を、本明細書中で参照に組み込んだいくつかの改良を
伴うマイルス型アッセイ（Corda,ら Proc. Natl. Acad. Sci. 96 : 9815-9820 (
1999)）により解析した。要するに、試験抗体又は断片を様々な投与量（５０〜
１０００μｇ／投与量）でマウスに対し腹腔内又は静脈内に投与する。血管浸透
性の増加を、様々な時間（６時間、１２時間、２４時間及び４８時間）で、エバ
ンスブルー染料を静脈内に注射することにより決定する。投与の後、一般的に２
０分後、マウスを塩酸ケタミンにより麻酔し、約２０mlのＰＢＳにより灌流した
。マウスの器官を取り除き、ＴＣＡ／エタノール（１：１ｖ／ｖ）中でホモジナ
イズした。組織ホモジネート中のエバンスブルー含有率を分光測光（ＯＤ＝５１
０nm）により定量した。血管浸透性に対する抗体の作用を、コントロールの抗体
と比較してエバンスブルー染料の増加に於ける百分率として測定した。

【００８４】 ルイス肺皮下の一次腫瘍モデルルイス肺転移モデル及びヒト類表皮腫（Ａ４３
１）皮下異種移植片モデルに於いて抗−マウスＶＥ−カドヘリンモノクローナル
抗体をそれらの抗腫瘍作用に対する評価をする。一次皮下ルイス肺腫瘍を、２２
−目盛りの注射針を用いて、右のわき腹へと、ハンクス平衡塩溶液の懸濁中の１
×１０⁵ 腫瘍細胞の皮下注射により、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢メス）
中で確立した。マウス（マウス１０匹／群）をＶＥ−カドヘリン抗体（５０〜１
０００μｇ）又は無関係なコントロールラットＩｇＧにより３〜４週間に渡り３
〜４日おき又はマウスが瀕死に至る迄処理した。腫瘍の大きさをカリバスを使用
して毎週２度測定し、公式（π／６・直径² ）を使用して計算する。各処理群に
於けるマウス由来の腫瘍を組織学の為に外科的に取り除き、血管密度を評価する
為に抗−ＣＤ３１抗体により染色する。ルイス肺転移モデルに於いて、一次腫瘍
をＣ５７ＢＬ／６マウスの支脚血中で確立した。２８日後、腫瘍が約１００mm³
に亙り、当該一次腫瘍を除去し、２４時間経過したマウスをＶＥ−カドヘリン抗
体（５０〜１０００μｇ）又は非対応のコントロールラットＩｇＧにより３日お
きに腹腔内に投与した。処理の４週間後、マウスを犠牲にし、腫を腫瘍転移に対
して試験した。肺を又微小転移巣の痕跡に対して血管密度を評価する為に組織学
により検査し、抗ＣＤ３１抗体で染色する。

【００８５】 ヒト類表皮腫細胞系統Ａ４３１を腺腫マウスの右側のわき腹中へと皮下に注射
する。一度腫瘍が１５０mm³ に至ると、マウスをランダムに処理グループ（マウ
ス１０匹／群）に分割し、ＶＥ−カドヘリン抗体（５０〜１０００μｇ）又は無
関係のコントロールラットＩｇＧを４週に渡り３日おきに投与する。腫瘍を２週
間測定し、マウスが瀕死になった後又は４週間で除去する。血管密度を評価する
為に腫瘍を又組織学により検査し、抗−ＣＤ３１抗体により染色する。ＶＥ−カ
ドヘリン治療の評価は腫瘍増殖率、腫瘍の血管新生の組織学的評価及び腫瘍の後
退に基づく。各腫瘍モデルに於ける抗体の活性をポジティブコントロールとして
働く１９Ｅ６モノクローナル（抗体）と比較する。腫瘍増殖の統計学的解析を、
ｐ値＜０．０５が有意であるとされる、両側学生検定を用いて決定する。

【００８６】 マトリゲル封入アッセイに於いて、Ｃ５７／ＢＬマウス（６〜８週齢メス）に
２５目盛りの注射針を使用してマトリゲル中で混合した新脈血形成因子０．５ml
を皮下に注射する。次いでマウスに３日おきに２５目盛りの注射針により様々の
投与量のＶＥ−カドヘリン抗体を腹腔内に投与する。１０日後マウスを、更なる
組織学的解析に向けてＣＯ₂ 吸入により犠牲にし、動物から封入物を回収する。

【００８７】 動揺包含腫瘍細胞アッセイ（Agitate Encapsulated Tumor Cell assay ）に於
いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢メス）を塩酸カタミンにより麻酔し、
次いで４つの粒を後方上１／３の皮下に移植し、切開部位から押し出す。この切
開は外科的切り取りに近い。次いでマウスに２５目盛りの注射針により様々なＶ
Ｅ−カドヘリン抗体又はコントロールの投与量で３日おきに皮下に注射する。１
２日後、マウスに静脈内に１００mg／kg ＦＩＣＤ−デキストラン溶液（ＭＷ−
１５０，０００）を１００μｌ注射する。動物をＣＯ₂ 吸入により犠牲にし、粒
を除去し暗中で維持しＦＩＴＣ定量化の為の過程を経た。

【００８８】 ヒト腫瘍異種移植片モデルに於いて、胸腺ヌード（nu／nu）マウス（６〜８週
齢メス）に２２目盛りの注射針を使用して右側わき腹へとハンクス平衡塩溶液の
懸濁中の２×１０６Ａ４３１ヒト類肉腫腫瘍細胞を皮下に注射する。一度腫瘍が
大きさ１００〜２００mm³ に至ると、抗体もしくはコントロール抗体をマウスに
対して毎週２度６週に渡りもしくはマウスが瀕死になる迄に注射する。腫瘍の大
きさをカリパスで毎週２度測定する。処理終了後８週間以内、動物は研究の間腫
瘍がなくなる。次いで、研究が修了又は瀕死になるマウスをＣＯ₂ 吸入により犠
牲にする。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＶＥ−カドヘリンの二量体化である。ＶＥ−カドヘリン二量体の２つの形態は
Ｎ及びＥ−カドヘリンを決定する結晶構造に基づき提案される。「鎖二量体」（
左のパネル）は同じ細胞の表層上の２つのＶＥ−カドヘリン分子間の親和性相互
作用を説明する。「接着二量体」（右のパネル）は反対の細胞上に位置するＶＥ
−カドヘリン間の親和性相互作用を説明する。

【図２】 ４つの古典的なカドヘリンの配列の並びである。ＶＥ−カドヘリンに対するド
メイン１の４つの領域は、鎖二量体又は接着二量体の結合表層を包含することが
予測される。４つのペプチド（下のパネル）は、特異的な抗体阻害薬を生成する
為にこれらの領域をとり囲み合成される。 ペプチド１：DEIWNQMHIDEEKNE−システイン；２：YVKDQSNYNRQNAKY−システイ
ン；３：KYVLQGEFAGKIFGVDA−システイン及び４：LIVDKNTNKNLEQP−システイン
。 これらのペプチドはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１及び４〜６に相当する
。ＫＬＨ結合の為の各ペプチドのカルボキシル末端にシステイン残基は付加され
た。

【図３】 抗−ＥＣＤ１（細胞外ドメイン）ペプチド抗体の、Ｈ５Ｖ細胞の傍細胞浸透性
に対する作用である。

【図４】 抗体Ｅ４Ｂ９は傍細胞浸透性に対して有為な作用を示さない。抗体Ｅ４Ｂ９及
び６Ｄ１０は血管浸透性に対する劇的な作用を発揮しない。

【図５Ａ及び５Ｂ】 抗体Ｅ４Ｂ９はマウス角膜ミクロポケットアッセイに於いて強い抗−新脈管形
成活性を示す。各実験動物群（マウス６匹／群）由来の相当する眼が試験される
。抗体Ｅ４Ｂ９は角膜の血管新生に対して阻害率＞８０％を有する。

【図６】 抗体Ｅ４Ｂ９はヒトＶＥ−カドヘリンと交差反応する。

【図７】 新規モノクローナル抗体のエピトープマッピングである。ｍＡｂ１９Ｅ６及び
６Ｄ１０のエピトープをマッピングする為の戦略である。

【図８】 抗−ＥＣＤ１ペプチド抗体に対するエピトープ情報の要約である。抗体１０Ｇ
４エピトープは、先に図７中に記載した同様の戦略を使用して、マウスＶＥ−カ
ドヘリンのドメイン１に対してマッピングされた。

【図９】 抗体１９Ｅ６及び１０Ｇ４に対する予測されたエピトープ領域である。下線を
引いた領域はそれぞれ、抗体Ｅ４Ｂ９及びＣａｄ−５に対するエピトープである
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/02 Ａ６１Ｐ 27/02 ４Ｈ０４５ 27/02 27/06 27/06 35/02 35/02 35/04 35/04 37/00 37/00 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 19/00 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヒックリン，ダニエル ジェイ． アメリカ合衆国，ニュージャージー 07028，グレン リッジ，ストーンハウス ロード 169 (72)発明者 ボーレン，ピーター アメリカ合衆国，ニューヨーク 10021， ニューヨーク，イースト エイティース ストリート 178 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA53 CA04 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 EA02 EA04 GA11 HA12 4B064 AG27 CA02 CA05 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 DA05 4B065 AA91X AA92Y AB05 BA08 CA25 CA44 4C084 AA13 NA10 ZA332 ZA962 ZB072 ZB262 ZB272 4C085 AA13 AA14 AA16 BB11 BB41 CC02 CC23 DD63 DD88 EE01 GG02 GG03 GG04 4H045 AA11 AA30 CA40 DA76 EA28 FA72

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗体又は抗体断片であって、 ＶＥ−カドヘリンのドメイン１の約１５個のＮ−末端アミノ酸の内のＶＥ−カ
   ドヘリン上の部位、 天然のＶＥ−カドヘリンアミノ酸配列に比較して１〜約５個のアミンの酸の挿
   入、欠失、置換を持つ前記ＶＥ−カドヘリンのドメイン１の約１５個のＮ−末端
   アミノ酸配列の内のＶＥ−カドヘリン上の部位、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１(DEIWNQMHIDEEKNE）のアミノ酸配列を有するペプチド
   、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２(DWIWNQMHIDEEKNE）のアミノ酸配列を有するペプチド
   、及び ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３(DWIWNQMHIDEEKNT）のアミノ酸配列を有するペプチド
   ；からなる群から選択されるいずれかに特異的に結合でき、 ここに於いて、前記抗体又は抗体断片はＶＥ−カドヘリンが仲介する接着分子
   結合（ａｄｈｅｒｅｎｓ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の形成をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害
   できるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで傍細胞浸透性に対して任意の有為又は実質的な作
   用を発揮しない、抗体又は抗体断片。
2. 【請求項２】 前記抗体又は抗体断片が、ｉｎ ｖｉｖｏで血管浸透性に対
   して任意の有為もしくは実質的な作用を発揮しない請求項１記載の抗体又は抗体
   断片。
3. 【請求項３】 前記抗体もしくは抗体断片が、動物もしくはホ乳動物に対し
   て投与された時、実質的に無毒である請求項１記載の抗体又は抗体断片。
4. 【請求項４】 前記抗体もしくは抗体断片が、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ
   ｖｉｔｒｏで新脈管形成を阻害もしくは腫瘍転移を阻害する請求項１記載の抗
   体又は抗体断片。
5. 【請求項５】 前記抗体もしくは抗体断片が、既存の接着分子結合を混乱す
   ることなく新たな接着分子結合の形成を阻害する請求項１記載の抗体又は抗体断
   片。
6. 【請求項６】 前記抗体がモノクローナル抗体であるか又は前記抗体断片が
   モノクローナル抗体由来である、請求項１記載の抗体又は抗体断片。
7. 【請求項７】 前記モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体Ｅ４Ｂ
   ９である、請求項１記載の抗体又は抗体断片。
8. 【請求項８】 請求項６記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドー
   マ。
9. 【請求項９】 請求項７記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドー
   マ。
10. 【請求項１０】 前記抗体もしくは抗体断片が単鎖抗体、ヒト化、キメラ化
    もしくは二重特異性である請求項１記載の抗体又は抗体断片。
11. 【請求項１１】 前記抗体又は抗体断片が異種ポリペプチドに融合されてい
    る請求項１記載の抗体又は抗体断片。
12. 【請求項１２】 請求項１〜１１のいずれか１項記載の抗体もしくは抗体断
    片及び医薬的に許容できる担体もしくは賦形剤を含んで成る医薬組成物。
13. 【請求項１３】 請求項１２記載の医薬組成物をホ乳動物に対して、新脈管
    形成を阻害する為に有効な時間及び量に於いて投与することを含んで成る、ホ乳
    類に於いて新脈管形成を阻害する方法。
14. 【請求項１４】 新脈管形成が、腫瘍性の疾患、固形腫瘍、自己免疫疾患、
    膠原性血管疾患、慢性関節リウマチ、眼科学的状態、糖尿病性網膜症、水晶体後
    線維増殖症又は血管新生緑内障のいずれかに関連する、請求項１３記載の方法。
15. 【請求項１５】 請求項１２記載の医薬組成物をホ乳動物に対して腫瘍の転
    移を阻害する為に有効な時間及び量に於いて投与することを含んで成る、ホ乳動
    物に於いて腫瘍転移を阻害する方法。
16. 【請求項１６】 前記腫瘍が癌、神経膠腫症、肉腫、腺癌、腺肉腫、腺腫、
    白血病性の腫瘍及びリンパ球の腫瘍からなる群から選択される、請求項１５記載
    の方法。
17. 【請求項１７】 請求項１２記載の医薬組成物を、前記ホ乳動物に対して、
    正常な脈管構造を混乱させること無く、内皮細胞の増殖を阻害するのに有効な量
    に於いて投与することを含んで成る、ホ乳動物に於いて血管新生に関連する細胞
    増殖性疾患を治療する方法。
18. 【請求項１８】 前記細胞増殖性疾患が血管増殖性疾患、線維症疾患、新脈
    管形成、腫瘍増殖、腫瘍転移、慢性関節リウマチ、及び加齢性黄斑変性である請
    求項１７記載の方法。
19. 【請求項１９】 請求項１２記載の医薬組成物をホ乳動物に対して、既存の
    脈管構造に有害に作用すること無く、血管形成を阻害するのに有効な量に於いて
    投与することを含んで成る、ホ乳動物に於いて腫瘍脈管構造を減少又は阻害する
    為の方法。
20. 【請求項２０】 抗体もしくは抗体断片、前記抗体の可変領域もしくは前記
    抗体の超可変領域のコーディング配列をコードするヌクレオチド配列を含んで成
    り、ここに於いて当該抗体又は抗体断片は請求項１〜１１のいずれか１項記載由
    来の抗体である、単離された核酸。
21. 【請求項２１】 ヌクレオチド配列の発現を制御する為に、配列に作用可能
    式に結合した請求項２０記載の核酸を含んで成る発現ベクター。
22. 【請求項２２】 請求項２０記載の核酸を所定の部位で新脈管形成を阻害又
    は腫瘍血管新生を阻害するのに有効な量且つ時間に渡りホ乳動物に対して投与す
    ることを含んで成る、遺伝子治療の方法。