CN101134777A - 可拮抗血管内皮细胞生长因子的人源化的免疫球蛋白的制备方法及其组合应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术－重组基因工程领域。本发明报道了用重组基因工程与细胞培养的方法制备出可特异识别与结合血管内皮细胞生长因子的六种人源化的融合免疫球蛋白(其中三种为IgM；三种为IgG)及其组合应用。该六种融合免疫球蛋白的共同特征是其N－端含有数个可结合VEGF的免疫球蛋白样结构区，而C－端含有人免疫球蛋白恒定区。该类免疫球蛋白保留有与VEGF高度结合的生物活性及免疫球蛋白恒定区的双重活性。该类免疫球蛋白可通过中和吸附体内的VEGF而发挥拮抗抑制血管内皮细胞***增生的作用。这六种融合免疫球蛋白作为VEGF的中和吸附剂，既可单个的独立使用，也可几种组合在一起使用，以发挥最大药效作用。

Description

可拮抗血管内皮细胞生长因子的人源化的免疫球蛋白的制备方法及其组合应用

技术领域

本发明属于生物技术-重组基因工程领域。更具体地说，本发明报道了用重组基因工程与细胞培养的方法制备出可特异识别与结合血管内皮细胞生长因子的六种人源化的融合免疫球蛋白(其中三种为IgM；三种为IgG)及其组合应用。该六种融合免疫球蛋白的共同特征是其N-端含有数个可结合VEGF的免疫球蛋白样结构区，而C-端含有人免疫球蛋白恒定区。该类融合免疫球蛋白保留有与VEGF高度结合的生物活性及免疫球蛋白恒定区的双重活性。该类融合免疫球蛋白可通过中和吸附体内的VEGF而发挥拮抗抑制血管内皮细胞***增生的作用。该六种融合免疫球蛋白作为VEGF的中和吸附剂，既可单个的独立使用，也可几种组合在一起使用，以发挥最大药效作用。

背景技术

血管增生或新生(angiogenesis)是指体内的已存在的血管(如毛细血管和小静脉)通过出芽或***的方式而产生新的血管的过程。在生物学上，体内的血管能够不断地新生与增长的关键是其内衬的血管内皮细胞具有不断***增生及定向迁移置入已有的血管管壁的能力。血管内皮细胞的增生受体内正(即刺激血管增生)、负(即抑制血管增生)两大方面因子的调控(Liotta LA.等Cell，1989，64：327；Nyberg P，Xie L and Kalluri R.EndogenousInhibitors of Angiogenesis，Cancer Research，2005，65：3967)。其中以血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在调控血管新生的作用最为重要。事实上，VEGF是目前已知的最强烈的刺激血管内皮细胞***增生的因子。VEGF在血管增生中的重要性也已在VEGF基因剔除小鼠的研究中被证实：如只要当VEGF基因中的一份被敲除后，胚胎中的血管即无法正常形成进而导致胚胎在发育至11至12天时即死亡(Carmeliet P等Nature 1996，380：435；Ferrara N等Nature1996，380：439)。

VEGF通过与表达在血管内皮细胞上的受体的高度结合而介导出刺激血管内皮细胞有丝***及增生的活性(Leung DW等Science 1989，246：1306；Keck PJ等Science，1989，246：1309)。目前已知的血管内皮细胞生长因子的受体主要有三种：即VEGFR1(fms-liketyrosine kinase，简称FLT-1)(Shibuya M等Oncogene，1990，5：519；De Vries等Science1992，255：989)；VEGFR2(Kinase-insert Domain Receptor，简称KDR；在小鼠中称为Flk-1)(Terman BI等Biochem Biophys Res Commun 1992，187：1579-1586)和VEGFR3(简称FLT-4)。VEGF及其受体如KDR和Flt-1在多种实体瘤组织中(如胃癌、肝癌、结、直肠癌、卵巢癌、乳腺癌等)表达阳性，而且其表达水平高低与肿瘤的生长与转移复发成高度正相关(FolkmanJ.Nat Med，1995，1：27；Carmel iet P.Nat Med，2003，9：653；FerraraN.Endocrine Reviews 2004，25：581)。目前，以VEGF及其受体为靶点的抗肿瘤血管增生抑制剂的研发已成为肿瘤药物治疗的重要领域。

在以VEGF及其受体为靶点抗肿瘤血管增生抑制剂的药物研发领域，主要存在两大手段：即1)寻找可直接抑制VEGF受体中内在的酪氨酸蛋白激酶活性的物质，从而达到阻止由VEGF受体介导的促血管内皮细胞***增生中的作用，该类研发的药物主要是各种小分子物抑制剂如PTK787/ZK222584(Wood JM等Cancer Res 2000，60：2178)；2)通过抑制VEGF与其受体的结合，从而达到阻止VEGF及其受体在介导促血管内皮细胞***增生的作用制血管增生的作用，该类研发的药物包括各种抗VEGF或抗VEGF受体的抗体，反义寡核苷酸及小分子抑制剂等(Kim KJ等Nature 1993，362：841；Presta LG等Cancer Res，1997，57：4593；Posey J A等Clinical Cancer Research，2003，9：1323)。其种由美国Genentech公司研发、生产并于2004上市销售的Bevacizumab(商品名Avastin)就是一种可识别与结合VEGF的人源化的单克隆抗体。Avastin通过中和或清除体内VEGF而达到抑制肿瘤血管生长，进而遏制肿瘤的生长和转移的作用(Presta LG等Cancer Res，1997，57：4593；Hurwitz H等N Engl J Med，2004；350：2335)。目前以抑制VEGF与其受体的结合为目的的抗肿瘤血管增生药物的开发更为引人注目。

VEGF的二种受体在结构上很相似，均为I型跨细胞膜糖蛋白，由一含7个免疫球蛋白样结构的胞外区，一个膜穿透区及一含2个酪氨酸激酶的膜内区组成。其中的胞外免疫球蛋白样结构区是维持VEGF受体与其配体VEGF高度结合的关键部位(Davis-Smyth T等EMBO J，1996，15：4919；Fuh G等J Biol Chem，1998，273，11197)。。除了表达在细胞膜上的受体之外，体内还存在有另一种以可溶性蛋白形式流离于细胞外间质的VEGF受体。该类可溶性VEGF受体为截短的VEGF受体：即只含胞外免疫球蛋白样结构区，而不含穿膜区及膜内酪氨酸激酶区。与完整的VEGF膜受体一样，截短的可溶性VEGF受体保留有与VEGF高度结合的生物活性。但与完整的VEGF膜受体不同的是：截短的可溶性VEGF受体由于其不含酪氨酸蛋白激酶区，故在与VEGF结合后，不会介导出刺激血管内皮细胞***及血管新生的活性。目前已知的截短的可溶性VEGF受体仅见于Flt-1受体中(Kendall RL and Thomas KA 1993(Kendall RL and Thomas KA Proc Natl Acad Sci USA，1993，90：1070)。但体内流离的sFlt-1受体基因表达水平低，故很难提取与分离足够量的蛋白质以作进一步研究；而可溶性KDR受体到目前还没见有报道。

本发明则选取VEGF受体Flt-1及KDR的胞膜外区基因为构建靶点，采用重组基因工程与细胞培养的方法制备出可特异识别与结合血管内皮细胞生长因子的六种人源化的融合免疫球蛋白(其中三种为IgM；三种为IgG)。该六种融合免疫球蛋白的共同特征是其N-端含有数个可结合VEGF的免疫球蛋白样结构区，而C-端含有人免疫球蛋白恒定区。故该类融合免疫球蛋白保留有与VEGF高度结合的生物活性及免疫球蛋白的双重活性。该类融合免疫球蛋白可通过中和吸附体内的VEGF而发挥拮抗抑制血管内皮细胞***增生的作用。该六种融合免疫球蛋白作为VEGF的中和吸附剂，既可单个的独立使用，也可几种组合在一起使用，以发挥最大药效作用。

发明内容

本发明选取VEGF的两个主要受体Flt-1及KDR的胞膜外结构区为构建靶点，采用重组基因工程的方法将编码该类胞膜外结构区的基因与编码人免疫球蛋白的恒定区基因相连，获得重组的免疫球蛋白基因表达载体。再通过基因转染与细胞培养的方法表达出该类重组的人源化的融合免疫球蛋白。本发明报导了六种该类融合免疫球蛋白，其中的三种为IgM融合免疫球蛋白；三种为IgG融合免疫球蛋白。这六种该类融合免疫球蛋白保留有与VEGF高度结合的生物活性。这六种融合免疫球蛋白作为VEGF的中和吸附剂，既可单个的独立使用，也可几种组合在一起使用，以发挥最大药效作用。

本发明中的这六种融合免疫球蛋白的代号及名称概述如表1：

表1。融合免疫球蛋白的代号及名称

	免疫球蛋白的代号	免疫球蛋白的名称
			1.2.3.4.5.6.	PF1PF2PK1PK2PF1K1PF2K2	Flt1-D123-IgMFlt1-D123-IgGKDR-D123-IgMKDR-D123-IgGFlt1-D123-IgM/KDR-D123-IgMFlt1-D123-IgG/KDR-D123-IgG

本发明中的这六种免疫球蛋白的结构特征如下：

1。重组免疫球蛋白PF1(Flt1-D123-IgM)由VEGF受体Flt-1的胞膜外结构区中的第1，第2及第3免疫球蛋白样胞结构区(从N-端开始，下同)与人免疫球蛋白的IgM的Fc段(含CH2，CH3区及CH4区)相重组融合而来。

2。重组免疫球蛋白PF2(Flt1-D123-IgG)由VEGF受体Flt-1的胞膜外结构区中的第1，第2及第3免疫球蛋白样胞结构区与人免疫球蛋白的IgG的Fc段(含铰链区，CH2，及CH3区)相重组融合而来。

3。重组免疫球蛋白PK1(KDR-D123-IgM)由VEGF受体KDR的胞膜外结构区中的第1，第2及第3免疫球蛋白样胞结构区与人免疫球蛋白的IgM的Fc段(含CH2，CH3区及CH4区)相重组融合而来。

4。重组免疫球蛋白PK2(KDR-D123-IgG)由VEGF受体KDR的胞膜外结构区中的第1，第2及第3免疫球蛋白样胞结构区与人免疫球蛋白的IgG的Fc段(含铰链区，CH2及CH3区)相重组融合而来。

5。重组免疫球蛋白PF1K1(Flt1-D123-IgM/KDR-D123-IgM)为重组免疫球蛋白PF1(Flt1-D123-IgM)与重组免疫球蛋白PK1(KDR-D123-IgM)的异源二倍体。

6。重组免疫球蛋白PF2K2(Flt1-D123-IgG/KDR-D123IgG)为重组免疫球蛋白PF2(Flt1-D123-IgG)与重组免疫球蛋白PK2(KDR-D123-IgG)的异源二倍体。

本发明中的这六种重组免疫球蛋白都以基因工程与细胞培养的方法而表达生产。

表达生产这六种免疫球蛋白的宿主细胞首选为哺乳动物细胞(如CHO，293细胞等)。蛋白表达生产的包括三大步骤：1)将含重组免疫球蛋白基因的表达质粒转染入哺乳动物细胞如CHO细胞；2)重组基因表达阳性细胞的鉴定与高表达细胞株的筛选；3)融合免疫球蛋的分离纯化。

如将含Flt1-D123-IgM重组基因的表达载体与含KDR-D123-IgM重组基因的表达载体如共转染入哺乳动物细胞，则转染后的细胞可分泌表达出三种重组免疫球蛋白：即Flt1-D123-IgM；KDR-D123-IgM；及Flt1-D123-IgM/KDR-D123-IgM的异源二倍体。

同理，将含Flt1-D123-IgG重组基因的表达载体与含KDR-D123-IgG重组基因的表达载体共转染入哺乳动物细胞，则转染后的细胞也将分泌表达出三种重组免疫球蛋白：即Flt1-D123-IgG；KDR-D123-IgG；及Flt1-D123-IgG/KDR-D123-IgG的异源二倍体。

本发明的另一大内容是将这六种融合免疫球蛋白作为VEGF的中和吸附剂，用于体内及体外拮抗抑制血管内皮细胞***增生。如前所述，该六种融合免疫球蛋白的共同特征在于其N-端含有VEGF受体的胞膜外数个免疫球蛋白样结构区，可保留有与VEGF高度结合的生物活性。但由于其不含酪氨酸蛋白激酶区，故在与VEGF结合后，不会介导出刺激血管内皮细胞***及血管新生的活性。相反的，这六种重组免疫球蛋白由于其C-端都带免疫球蛋白-Fc段，故又具有免疫球蛋白的部分生物活性。本发明在具体实施中其恒定区段来自于人的免疫球蛋白IgM重链及免疫球蛋白IgG1的重链。IgG1及其恒定区段融合蛋白具有如在血清中的半衰期长(14天)，便于检测、分离与纯化等特征；而IgM及其恒定区段融合蛋白则具有可形成五倍体或六倍体结构特征，及强烈激活补体介导的细胞毒作用。重组免疫球蛋白在与VEGF结合后，可通过其免疫球蛋白介导的免疫作用(如Antibody-dependent cell-mediated

cytotoxicity，ADCC，抗体依赖细胞介导的细胞毒作用，及补体介导的细胞毒作用)而加速VEGF的清除。

本发明的另一大特征在于该六种融合免疫球蛋白作为VEGF的中和吸附剂，既可单个的独立使用，也可几种组合在一起使用，以发挥最大药效作用。作为单个使用的制剂，这几种融合免疫球蛋白在中和吸附VEGF的药效效果不尽相同。如按其作用效果由高到低来排序为：则为：Flt1-D123-IgM>KDR-D123-IgM>Flt1-D123-IgG>KDR-D123-IgG。而将各种融合免疫球蛋白组合在一起使用，将可达到更彻底地中和吸附VEGF及干预VEGF介导的血管新生的药效作用。

本发明的具体内容如下：

1。编码本发明中的重组免疫球蛋白的重组基因的克隆扩增及其表达载体的构建。

本发明中的含有能与VEGF特异结合的重组免疫球蛋白的重组基因的克隆扩增及其表达载体的构建的具体技术与操作方法可参见《分子克隆》等书。鉴于重组免疫球蛋白具有分子量大，含二硫键(S_S)及糖基等结构，其表达生产策略将以在真核细胞中的分泌性表达最为理想。真核细胞分泌性表达免疫球蛋白的另一大优点是合成的免疫球蛋白可集聚于细胞培养液中，便于回收分离。

保证重组免疫球蛋白在真核细胞分泌性表达的一大关键因素是需要一段信号肽(signalpeptide)以引导新合成的蛋白质穿透过细胞内质网，并最终分泌到细胞外间质。编码信号肽的基因可来自于VEGF受体基因，免疫球蛋白基因，或其他外源基因如IL-2等基因。

编码本发明中的PF1(Flt1-D123-IgM)和PF2(Flt1-D123-IgG)的VEGF受体Flt-1的胞膜外结构区中的第1，第2及第3免疫球蛋白样胞结构区的D123区可从可采用RT-PCR方法从健康人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)中克隆扩增获得。用于PCR的上、下游引物可参照已报道的Flt-1核苷序列体外合成。

同理，编码本发明中的PK1(KDR-D123-IgM)和PK2(KDR-D123-IgG)的VEGF受体KDR的胞膜外结构区中的第1，第2及第3免疫球蛋白样胞结构区的D123区可从可采用RT-PCR方法从健康人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)中克隆扩增获得。用于PCR的上、下游引物可参照已报道的KDR核苷序列体外合成。

本发明中的免疫球蛋白基因恒定区段可以来自于IgG，IgM，IgA或IgD任一型。本发明在具体实施中其恒定区段来自于人的免疫球蛋白IgM重链及免疫球蛋白IgG1的重链。IgG1及其恒定区段融合蛋白具有如在血清中的半衰期长(14天)，便于检测、分离与纯化等特征；而IgM及其恒定区段融合蛋白则具有可形成五倍体或六倍体结构特征，及强烈激活补体介导的细胞毒作用。

本发明的重组免疫球蛋白基因表达载体的构建可分为两部分：1)克隆出VEGF受体上的免疫球蛋白样结构区基因，并将其定向***到真核细胞表达载体，获得含VEGF受体基因的载体，2)克隆出人免疫球蛋白基因重链恒定区段，并将其与含VEGF受体基因的载体人免疫球相连，从而获得含重组的免疫球蛋白基因表达载体。

1a.Flt1(即VEGF受体1)上的免疫球蛋白样结构区基因的克隆扩增

采用RT-PCR方法从人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcells，HUVEC)中克隆获得。中克隆扩增获得含有能识别与结合VEGF的Flt1的免疫球蛋白样结构区基因的cDNA。用于PCR的上、下游引物可参照已报道的Flt1 cDNA序列体外合成。克隆获得cDNA基因经限制性内切酶酶切处理，再用T4连接酶将其定向***到表达载体中，从而获得带Flt1受体片段基因的载体。

1b.KDR(即VEGF受体2)上的免疫球蛋白样结构区基因的克隆扩增

采用RT-PCR方法从人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcells，HUVEC)中克隆获得。中克隆扩增获得含有能识别与结合VEGF的KDR的免疫球蛋白样结构区基因的cDNA。用于PCR的上、下游引物可参照已报道的KDR cDNA序列体外合成。克隆获得cDNA基因经限制性内切酶酶切处理，再用T4连接酶将其定向***到表达载体中，从而获得带KDR受体片段基因的载体。

1c.免疫球蛋白恒定区段基因的克隆扩增及其表达载体的构建

人类免疫球蛋白重链恒定区段基因可以是cDNA或基因组形。含免疫球蛋白重链恒定区段的cDNA可采用RT-PCR方法从健康人外周血单核细胞(PBMCs)中克隆扩增获得。用于PCR的上、下游引物可参照已报道的cDNA核苷酸序列体外合成。以RT-PCR克隆获得的重链恒定区段cDNA可包含有免疫球蛋白的铰链区(hinge)，CH1区，CH2区及CH3区等。克隆获得的恒定区cDNA经限制性内切酶酶切处理，再用T4连接酶将其与经相应的酶切处理的表达载体相连，经转化入感受细菌，再经筛选，扩增，提取质粒DNA及酶切鉴定，即获得含免疫球蛋白重链恒定区段基因的表达载体。可用于真核细胞表达恒定区基因的载体包括如pcDNA3.1(Invi trogen)，逆转录病毒载体pLXSN(Clonetech)载体，腺病毒(双链DNA)载体等。该类表达载体的特征是包括真核细胞表达启动子/增强子hCMV启动子、5’LTR及polyA等序列在内。

再将含Flt1受体片段基因的或含KDR受体片段基因载体与含免疫球蛋白恒定区段基因的表达载体重组相连，即获得带重组基因Flt1-D123-Ig或重组基因KDR-D123-Ig的表达载体。重组基因Flt1-D123-Ig及重组基因KDR-D123-Ig保持有唯一开放读框(open-reading frame，ORF)。该ORF的编码起始于Flt1或KDR的信号肽，终止于免疫球蛋白重链CH3区。

2.重组免疫球蛋白在哺乳动物细胞中的表达生产

重组免疫球蛋白的表达生产以在哺乳动物细胞中为理想。常用的哺乳动物细胞有CHO，COS-7，Hela，HEK-293等。保证重组免疫球蛋白在哺乳动物细胞中的高效稳定表达的关键因素是1)高效地将表达载体转染入细胞内；2)筛选与扩增出高表达细胞株。

将表达载体转染入哺乳动物细胞(如CHO细胞)有两种主要方式：即瞬时转染与稳定转染。稳定转染的细胞因可进一步用于筛选与扩增高表达细胞株。稳定转染常用的方法包磷酸钙法；阳离子脂质体法；病毒介导法及电穿孔法等。

重组蛋白在转染细胞里的表达可以用免疫组化方法进行检测；也可以通过免疫印迹试验及ELISA方法定量检测细胞培养液中的重组免疫球蛋白。经检测确认转染细胞表达该重组免疫球蛋白后，转染的细胞则转入含筛选药物如G418的培养液中进行筛选。筛选出的表达细胞株再扩增培养，并收集其培养上清液。收集的培养液用于分离提取重组免疫球蛋白。

3.重组免疫球蛋白的分离提取及其理化与生物活性鉴定

重组免疫球蛋白可以用免疫亲和层析柱法从收集的转染细胞培养液中分离提取。用于分离提取重组免疫球蛋白的常用免疫亲和层析柱有protein-A或protein-G亲和层析柱。如以Protein-G免疫亲和层析法柱分离提取重组免疫球蛋白，其操作步骤如下：取收集的细胞培养上清液，经离心及以0.45μm滤膜过滤后，将滤液上样置Protein G-亲合层析柱，重组免疫球蛋白依其重链Fc段与protein-G的非共价的耦联而被特异吸附于亲合层吸柱中。层吸柱先以PBS洗脱去除杂蛋白，再以低pH液(如pH2.7，0.1M甘氨酸)洗脱被吸附的蛋白。再经调节pH至7.0及对PBS透析后即获得纯化的重组免疫球蛋白S2345。

分离提取的重组免疫球蛋白可以用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)，结合考马斯亮蓝染色或免疫印迹试验及ELISA等方法加以鉴定。

本发明的重组免疫球蛋白的一大特征是保持有与VEGF相特异结合的生物活性。一种鉴定重组免疫球蛋白与VEGF特异结合的方法如下：先以含VEGF基因的表达载体转染入哺乳动物细胞如CHO细胞，24-48h后，转染的CHO细胞经1x PBS液漂洗及以固定后，分别加入含重组免疫球蛋白或对照免疫球蛋白，25℃孵育1-2h，以PBS液洗脱，再加入酶标记的抗人IgG-Fc抗体，25℃孵育1-2h，再以PBS液洗脱，然后加入显色液，室温至显色，于显微镜下观察显色结果。如加入重组免疫球蛋白的孔有显色阳性的细胞，而加入对照免疫球蛋白的孔里细胞应无显色，证明重组免疫球蛋白保持有与VEGF相特异结合的生物活性。

4.体外测定重组免疫球蛋白与VEGF的结合活性

重组免疫球蛋白与VEGF的结合活性可通过与¹²⁵I标记的VEGF或biotin标记的VEGF结合实验而测定。如以biotin标记的VEGF为例：先用重组免疫球蛋白包被96孔ELISA板，4℃过夜，经1x PBS液漂洗及2％BSA液室温封闭1～2h后，分别加入同浓度biotin-VEGF在4℃孵育1-2h，经PBS液洗脱后，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的Avidin，4℃孵育1-2h，PBS液洗脱后，加入显色液，室温至显色，再以酶联免疫仪测定特定波长处各孔的吸光值。根据OD值可测定被96孔板上重组免疫球蛋白吸附的VEGF量。

重组免疫球蛋白与VEGF对biotin标记的VEGF的竞争结合：可以固定浓度的biotin标记的VEGF及不同浓度的游离的重组免疫球蛋白与固定在96孔板上的重组免疫球蛋白竞争结合，测定包被蛋白与biotin-VEGF结合量的变化，获得游离/包被重组免疫球蛋白竞争结合biotin-VEGF曲线。从该曲线可推测出各种重组免疫球蛋白与VEGF体外结合的活性强度。

5.重组免疫球蛋白的复方组合应用

本发明的几种免疫球蛋白因具有与VEGF特异结合的活性，故可广泛用于如体内外检测VEGF的表达水平；用于体内外分离吸附VEGF分子及VEGF分泌表达阳性的细胞与组织；用于干预体内VEGF介导的血管新生及肿瘤增长等。本发明的另一大特征在于该六种融合免疫球蛋白作为VEGF的中和吸附剂，既可单个的独立使用，也可几种组合在一起使用，以发挥最大药效作用。作为单个使用的制剂，这几种融合免疫球蛋白在中和吸附VEGF的药效效果不尽相同。如按其作用效果由高到低来排序为：则为：Flt1-D123-IgM>KDR-D123-IgM>Flt1-D123-IgG>KDR-D123-IgG。而将各种融合免疫球蛋白组合在一起使用，将可达到更彻底地中和吸附VEGF的效果。因此，融合免疫球蛋白作为血管靶向治疗药物用于干预VEGF介导的血管新生以及肿瘤增生与转移等以发挥最大药效作用。

5a.重组免疫球蛋白用于体内外吸附及分离VEGF表达阳性细胞与组织

重组免疫球蛋白可用于体内外吸附与分离VEGF表达阳性的细胞与组织。如用Flt1-D123-IgM蛋白体外吸附分离VEGF表达阳性的细胞与组织为例，可先将重组免疫球蛋白Flt1-D123-IgM吸附在适当的固相载体上(固相载体包括如细胞培养板，细胞培养皿，硝酸纤维素膜等)，再加入含VEGF表达阳性的细胞或组织，4℃孵育1-2h，再以1x PBS液洗脱，即达到吸附与分离VEGF表达阳性细胞或组织成分的目的。

5b.重组免疫球蛋白用于体外拮抗VEGF介导的血管皮细胞增殖作用

从健康人人脐静脉)中或提取血管内皮细胞内皮细胞(human umbilical vein endothelialcells，HUVEC)后，将HUVEC细胞置于含有人VEGF的培养皿中培养，再将重组免疫球蛋白按不同剂量(高、中、低剂量)分别加入到HUVEC培养中，以加入正常的免疫球蛋白做为对照组，37℃孵育2-3天。应用流式细胞仪观察血管皮细胞增殖与凋亡的情况。将结果与对照组相比，可判断重组免疫球蛋白体外拮抗VEGF介导的血管细胞增殖***能力。根据体外拮抗试验结果，可从各种重组免疫球蛋白中筛选出拮抗VEGF作用最佳的作为选新药，以用于体内治疗血管增殖性病变(如拮抗抗肿瘤区域内的血管增生等)。

附图说明

图1为单体Flt1-D123-IgM(3)及单体Flt1-D123-IgG(4)的结构示意图。

其中的D1，D2及D3分别代表VEGF受体Flt-1的胞膜外结构区中的第1，第2及第3免疫球蛋白样胞结构区(从N-端开始，下同)。人免疫球蛋白的IgM-Fc段含CH2，CH3区及CH4区；人免疫球蛋白的IgG-Fc段含hinge，CH2，及CH3区。

图2。为单体KDR-D123-IgM(3)及单体KDR-D123-IgG(4)的结构示意图。

其中的D1，D2及D3分别代表VEGF受体KDR的胞膜外结构区中的第1，第2及第3免疫球蛋白样胞结构区。人免疫球蛋白的IgM-Fc段含CH2，CH3区及CH4区；人免疫球蛋白的IgG-Fc段含hinge，CH2，及CH3区。

图3.为Flt1-D123-IgM与KDR-D123-IgM异源双倍体的结构示意图。

图4.为Flt1-D123-IgG与KDR-D123-IgG异源双倍体的结构示意图。

本发明具体实施方式

实施例一：融合免疫球蛋白PF1(Flt1-D123-IgM)和融合免疫球蛋白PF2(Flt1-D123-IgG)的表达载体的构建

本发明中的蛋白PF1(Flt1-D123-IgM)和蛋白PF2(Flt1-D123-IgG)的单体结构如图1所示。这两种免疫球蛋白单体的共同特征在于它们的N-段含人Flt1受体的胞外免疫球蛋白D1，D2及D3区；而其C-段含免疫球蛋白IgM-Fc或IgG-Fc段。编码这两种融合免疫球蛋白的基因的克隆及其达载体的构建如下：

1.人类Flt1-D123基因片段的克隆。

编码人类Flt1受体的胞外免疫球蛋白区D1，D2及D3的基因片段采用多聚酶链式反应(RT-PCR)方法从健康人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)中克隆获得。其具体实施如下：以Trizol按常规方法从获取的HUVEC细胞中提取总RNA。再取1μg总RNA，加入到逆转录酶的反应液里(总体积为20μ，包括5×buffer4μL、Oligo(dT)引物2μL及10mmol/L dNTP 8μL，RNasin1μL，反转录酶5U～10U)，经70℃变性10分钟，42℃1小时，42℃30分钟，70℃15分钟，逆转录反应终止，合成得到cDNA。再以PCR扩增人类Flt1-D123基因片段。该PCR扩增的引物为：

上游引物1.fltl-NcoATG：gcgaagcttGagacc atg gtc agc tac tgg

下游引物2.flt1-RD3a332：gcgggatcc tgt ttt atc ata tat atg cac

PCR扩增用的Taq酶购自大连TAKARA生物公司。PCR的反应总体积为50μl。PCR的反应条件为：94℃预变性2min后，然后94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环，末次循环72℃延伸5min。PCR扩增后获得1.0kb的DNA片段

PCR产物纯化及酶切：取PCR产物(1.0kb band)用HinD III和BamH I酶切，反应完毕后，经1％琼脂糖电泳后，切下酶切扩增片段，再经回收纯化，用20μl去离子水溶解后，置-20℃保存备用。

DNA重组连接及转化感受宿主菌：采用以T4DNA连接酶的方法将上述酶切后的DNA与经同样酶切处理的表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)DNA体外相连。连接反应体系总体积为20μl，在16℃条件下连接16h。之后，取2μl连接反应物在4℃条件下转化感受态细菌宿主菌DH5a(50μl/管)30分钟。转化结束后，将感受细菌接种于LB/agar培养板(含100μg/mlAmp)，37℃孵育过夜，再提取重组质粒DNA及酶切鉴定后获得含Flt1D123基因片段的过渡质粒。

2.IgM-Fc段基因片段的克隆及PF2(Flt1-D123-IgM)的表达载体的构建

长度为1.1kb的人类免疫球蛋白的IgM-Fc段cDNA(含CH2区，CH2区及CH4区)也采用RT-PCR技术从人健康人外周血单核细胞(PBMCs)cDNA基因库中克隆出。用于PCR扩增人免疫球蛋白IgM-Fc段的上下游引物序列如下：

上游引物：hIgM-F：-27bases-GCG GGA TCC ATT GCT GAG CTG CCT CCC AAA

下游引物：hIgM-R1279：-27bases-CAG CAG GGT CAG TAG CAG GTG CCA GCT

PCR扩增反应总体积为50μL。PCR的反应条件为：94℃预变性2min后，然后94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸30s，35个循环，末次循环72℃延伸5min。PCR扩增后获得1.2kb的DNA片段

PCR产物纯化及酶切：取10ul PCR产物(1.2kb)经2％琼脂糖电泳分离后，切下扩增片段，再经回收纯化及BamH1/XhoI双酶切后，用20μl去离子水溶解后，置-20℃保存备用。

DNA重组连接及转化感受宿主菌：采用以T4DNA连接酶的方法将上述酶切后的IgG1-Fc段与经同样双酶切(BamH1/XhoI)处理的含人类Flt1-D123基因段的表达载体相连。在16℃条件下连接16h后，取2μl连接反应物转化感受态细菌宿主菌DH5a。转化结束后，将感受细菌接种于LB/agar培养板(含100μg/ml Amp)，37℃孵育过夜。

重组质粒DNA的提取及酶切鉴定：从含Amp筛选平板上挑取菌落，接种于3ml LB培养基中(含100μg/ml Amp)，37℃振摇过夜。第2天，经离心收集细菌，采用碱裂解法小量提取质粒DNA。提取的质粒DNA经Xho I酶切，或经HinD III和Not I双内切酶酶切后，再进行电泳鉴定。对酶切证明含Flt1-D123-IgM重组基因的质粒(pQY-Flt1-D123-IgM)再经测序鉴定。测序结果表明重组质粒含有方向及序列均正确的重组质粒。其中的重组基因Flt1-D123-IgM的核苷酸序列见序列1。

3.IgG1-Fc段基因片段的克隆及PF2(Flt1-D123-IgG)的表达载体的构建：

长度为0.7kb的人类免疫球蛋白IgG1的Fc段cDNA(含铰链区hinge，CH2区及CH3区)也采用RT-PCR技术从人健康人外周血单核细胞(PBMCs)cDNA基因库中克隆出。用于PCR扩增人免疫球蛋白IgG1-Fc段的上下游引物序列如下：

上游引物(hIgG1-F)：GAG GGA TCC CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT及

下游引物(hIgG1-R)：GTC AGA TCT TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA。

PCR扩增反应总体积为50μL。PCR的反应条件为：94℃预变性2min后，然后94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸30s，35个循环，末次循环72℃延伸5min。

PCR产物纯化及酶切：取10ul PCR产物经2％琼脂糖电泳分离后，切下扩增片段，再经回收纯化及BamH1/XhoI双酶切后，用20μl去离子水溶解后，置-20℃保存备用。

DNA重组连接及转化感受宿主菌：采用以T4DNA连接酶的方法将上述酶切后的IgG1-Fc段与经同样双酶切(BamH1/XhoI)处理的含人类Flt1-D123基因段的表达载体相连。在16℃条件下连接16h后，取2μl连接反应物转化感受态细菌宿主菌DH5a。转化结束后，将感受细菌接种于LB/agar培养板(含100μg/ml Amp)，37℃孵育过夜。

重组质粒DNA的提取及酶切鉴定：从含Amp筛选平板上挑取菌落，接种于3ml LB培养基中(含100μg/ml Amp)，37℃振摇过夜。，经离心收集细菌，采用碱裂解法小量提取质粒DNA。提取的质粒DNA经Xho I酶切，或经HinD III和Not I双内切酶酶切后，再进行电泳鉴定。对酶切证明含重组基因的质粒再经测序鉴定，结果表明重组质粒含有方向及序列均正确的Flt1-D123-IgG重组基因。测序结果表明重组质粒含有方向及序列均正确的重组质粒。所含的重组基因Flt1-D123-IgG重组基因的核苷酸序列见所附的基因序列2。

实施例二：PK1(KDR-D123-IgM)和PK2(KDR-D123-IgG)的表达载体的构建

与前述的蛋白PF1(Flt1-D123-IgM)和蛋白PF2(Flt1-D123-IgG)一样，本发明中的PK1(KDR-D123-IgM)和PK2(KDR-D123-IgG)也为融合免疫球蛋白。这俩种免疫球蛋白的单体结构如图2所示，其共同特征在于它们的N-段含人类KDR受体的胞外免疫球蛋白D1，D2及D3结构区；而其C-段含免疫球蛋白IgM-Fc或IgG-Fc段。编码这两种融合免疫球蛋白的重组基因的克隆及其达载体的构建如下。

1.人类KDR-D123基因片段的克隆。

人类KDR的胞外免疫球蛋白区D1，D2及D3的基因片段也采用多聚酶链式反应(PCR)方法克隆获得。PCR扩增用的PCR的引物为：

上游引物1.KDR-ATG：gcgaagcttcc atg gag agc aag gtg

下游引物2.kdrRD3a328：gcgctcgagagg ttt ttc atg gac cct

PCR扩增反应总体积为50μL。PCR的反应条件为：94℃预变性2min后，然后94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环，末次循环72℃延伸5min。PCR扩增后获得1.0kb的DNA片段。

PCR产物纯化及酶切：取10ul PCR产物(1.0kb)经2％琼脂糖电泳分离后，切下扩增片段.再经回收纯化及BamH1/XhoI双酶切后，用20μl去离子水溶解后，置-20℃保存备用。

DNA重组连接及转化感受宿主菌：采用以T4DNA连接酶的方法将上述酶切后的VEGFR胞外免疫球蛋白样结构区基因与经同样双酶切(BamH1/XhoI)处理的含人类免疫球蛋白恒定区基因段的表达载体相连。在16℃条件下连接16h后，取2μl连接反应物转化感受态细菌宿主菌DH5a。转化结束后，将感受细菌接种于LB/agar培养板(含100μg/ml Amp)，37℃孵育过夜。再提取重组质粒DNA及酶切鉴定后获得含KDR-D123基因片段的过渡质粒。

2.PK1(KDR-D123-IgM)表达载体的构建：

采用T4DNA连接酶的方法将经BamH1/NotI酶切后的含人类KDR-D123基因段与经同样双酶切的含人类IgM-Fc段基因段的表达载体相连。在16℃条件下连接16h后，取2μl连接反应物转化感受态细菌宿主菌DH5a。转化结束后，将感受细菌接种于LB/agar培养板(含100μg/ml Amp)，37℃孵育过夜。

重组质粒DNA的提取及酶切鉴定：从含Amp筛选平板上挑取菌落，接种于3ml LB培养基中(含100μg/ml Amp)，37℃振摇过夜。经离心收集细菌，采用碱裂解法小量提取质粒DNA。提取的质粒DNA经Xho I酶切，或经HinD III和Not I双内切酶酶切后，再进行电泳鉴定。对酶切证明含重组基因的质粒再经测序鉴定。测序结果表明重组质粒含有方向及序列均正确的重组质粒。所含的KDR-D123-IgM重组基因的核苷酸序列见所附的基因序列3。

3.PK1(KDR-D123-IgG)表达载体的构建：

采用T4DNA连接酶的方法将经BamH1/NotI酶切后的含人类KDR-D123基因段与经同样双酶切的含人类IgG-Fc段基因段的表达载体相连。在16℃条件下连接16h后，取2μl连接反应物转化感受态细菌宿主菌DH5a。转化结束后，将感受细菌接种于LB/agar培养板(含100μg/ml Amp)，37℃孵育过夜。

重组质粒DNA的提取及酶切鉴定：从含Amp筛选平板上挑取菌落，接种于3ml LB培养基中(含100μg/ml Amp)，37℃振摇过夜。经离心收集细菌，采用碱裂解法小量提取质粒DNA。提取的质粒DNA经Xho I酶切，或经HinD III和Not I双内切酶酶切后，再进行电泳鉴定。对酶切证明含重组基因的质粒再经测序鉴定。

实施例三：重组免疫球蛋白的表达生产与分离纯化。

鉴于本发明中的重组免疫球蛋白具有分子量大，含二硫键S_S及糖基，其表达以在哺乳动物细胞为好。在本发明实施中，选以免疫球蛋白KDR-D123-IgM与免疫球蛋白KDR-D123-IgG在哺乳动物细胞中的表达生产为例。融合免疫球蛋白PF1(Flt1-D123-IgM)和融合免疫球蛋白PF2(Fl t1-D123-IgG)的表达生产应与此例大致相同。

免疫球蛋白KDR-D123-IgM与KDR-D123-IgG在哺乳动物细胞中的表达生产包括三大步骤：1)将含融合免疫球蛋白重组基因的表达质粒转染入CHO细胞；2)重组基因表达阳性CHO细胞的鉴定与高表达细胞株的筛选；3)融合免疫球蛋的分离纯化。

1。表达质粒转染入CHO细胞及检测细胞培养上清液中的重组免疫球蛋白：

转染CHO细胞可采用fugen6介导的方法：取对数生长期的CHO细胞，胰酶/5mM EDTA常规消化后，以1×105细胞/孔接种6-孔塑料培养板，37℃，5％CO2培养过夜.第2天，在100μL无血清、无抗生素的DMEM加入6μL fugen6与不同量的重组质粒及阴性对照空载体DNA(1-2μg)混匀，制备成fugen6-DNA混合液，室温放置15min后，缓慢滴加至CHO细胞中，于37℃、5％CO2条件下培养培养4-6h后，加入3ml DMEM-5％fcs/孔，转染24h后，换无血清DMEM培养基，48h～72h后，收集培养细胞上清液。

收集的细胞培养上清液用ELISA方法测定重组免疫球蛋白(IgG或IgM)。如用ELISA方法测定重组免疫球蛋白IgM，其操作步骤如下：用羊抗人IgM-Fc单抗(2μg/ml，50μL/孔，抗体购自Sigma，)包被96-well ELISA板，4℃过夜，经1x PBS液漂洗及2％BSA(in PBS-0.1％tween 20液)室温封闭1～2h后，分别加入含KDR-D123-IgM的质粒或空载体转染的CHO细胞上清液，37℃2h，PBS-0.1％tween20洗板×3，再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgM多克隆抗体(抗体购自Sigma，1∶1000稀释)，37℃孵育1h；以PBS-0.1％tween20洗板×3，然后加入显色液(邻苯二胺)-3％H202，室温10min，1mol/L HCL终止反应，以酶联免疫仪测定以酶标仪(Microplate reader 550，Bio-Rad)测定490nm波长处各孔的吸光值。

2。重组免疫球蛋白KDR-D123-IgM的分离提纯

重组免疫球蛋白KDR-D123-IgM的分离提纯采用免疫亲和层析柱法从收集的转染细胞培养液中分离提取。采用的层析柱填充物为经羊抗人IgM多克隆抗体交联的粒珠(抗体粒珠购自Sigma)。以该免疫亲和层析柱分离提纯KDR-D123-IgM的其操作步骤如下：取收集的含重组免疫球蛋白的细胞培养上清液50ml，经离心及以0.45μm滤膜过滤后，将滤液上样于亲合层析柱上。上样结束后，先以10倍于层析柱体积的PBS液洗脱层吸柱，共2次，再以2ml0.1M的甘氨酸(pH2.7)液洗脱被吸附的蛋白；再经调节pH至7.0及对PBS透析后即获得纯化的重组免疫球蛋白KDR-D123-IgM。

3。重组免疫球蛋白IgM理化活性鉴定

上述分离提纯的重组免疫球蛋白KDR-D123-IgM可以用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)，结合免疫印迹试验方法加以鉴定。其操作步骤如下：纯化的重组免疫球蛋白KDR-D123-IgM上样于10％SDS-PAGE凝胶，进行电泳分离。SDS-PAGE电泳结束后，取下凝胶，将蛋白质转印至PVDF膜(30V，4℃，16h)，再以1％BSA封闭，室温1～2h后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记-山羊抗人IgM多克隆抗体(抗体购自Sigma，1∶1000稀释)，37℃孵育1h。膜经充分漂洗后，加入显色液(邻苯二胺，3％H202)，至显色条带出现后，蒸馏水漂洗终止反应。根剧免疫印迹试验结果可推断分离提纯的重组免疫球蛋白KDR-D123-IgM的分子量，多倍体数及免疫球蛋白活性等指标。

实施例四：免疫球蛋白异源双倍体(Flt1-D123-IgM/KDR-D123-IgM)的表达生产。

本发明中的免疫球蛋白异源双倍体(Flt1-D123-IgM/KDR-D123-IgM)的表达生产可以通过将含Flt1-D123-IgM的表达质粒与含KDR-D123-IgM的表达质粒共转染入CHO细胞后而获得。两种表达质粒共转染的细胞可分泌表达出三种不同组合的重组免疫球蛋白：即Flt1-D123-IgM/Flt1-D123-IgM同源双倍体；KDR-D123-IgM/KDR-D123-IgM同源双倍体；及Flt1-D123-IgM/KDR-D123-IgM异源双倍体。与同源双倍体一样，异源双倍体(Flt1-D123-IgM/KDR-D123-IgM)的蛋白分离提纯也采用免疫亲和层析柱法从收集的转染细胞培养液中分离提取。

同理，将本发明中的Flt1-D123-IgG与KDR-D123-IgG如共转染入细胞(如CHO细胞)，则转染后的细胞也可分泌表达出另外三种重组免疫球蛋白：即Flt1-D123-IgG/Flt1-D123-IgG同源双倍体；KDR-D123-IgG/KDR-D123-IgG同源双倍体；及Flt1-D123-IgM/KDR-D123-IgM异源双倍体。

与同源双倍体一样，异源双倍体(Flt1-D123-IgM/KDR-D123-IgM)及异源双倍体(Flt1-D123-IgM/KDR-D123-IgM)可作为VEGF的中和吸附剂用于分离吸附VEGF分子及VEGF分泌表达阳性的细胞与组织；及用于体内外拮抗抑制VEGF介导的肿瘤区域血管的新生等。

附：序列表

序列表

<110>上海思坦维生物技术有限公司

<120>可拮抗血管内皮细胞生长因子的人源化的免疫球蛋白的制备方法及其组合应用

<160>3

<170>PatantIn Vesion 3.3

<210>1

<211>2117

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ccatggtcag ctactgggac accggggtcc tgctgtgcgc gctgctcagc tgtctgcttc      60

tcacaggatc tagttcaggt tcaaaattaa aagatcctga actgagttta aaaggcaccc      120

agcacatcat gcaagcaggc cagacactgc atctccaatg caggggggaa gcagcccata      180

aatggtcttt gcctgaaatg gtgagtaagg aaagcgaaag gctgagcata actaaatctg      240

cctgtggaag aaatggcaaa caattctgca gtactttaac cttgaacaca gctcaagcaa      300

accacactgg cttctacagc tgcaaatatc tagctgtacc tacttcaaag aagaaggaaa      360

cagaatctgc aatctatata tttattagtg atacaggtag acctttcgta gagatgtaca      420

gtgaaatccc cgaaattata cacatgactg aaggaaggga gctcgtcatt ccctgccggg      480

ttacgtcacc taacatcact gttactttaa aaaagtttcc acttgacact ttgatccctg      540

atggaaaacg cataatctgg gacagtagaa agggcttcat catatcaaat gcaacgtaca      600

aagaaatagg gcttctgacc tgtgaagcaa cagtcaatgg gcatttgtat aagacaaact      660

atctcacaca tcgacaaacc aatacaatca tagatgtcca aataagcaca ccacgcccag      720

tcaaattact tagaggccat actcttgtcc tcaattgtac tgctaccact cccttgaaca      780

cgagagttca aatgacctgg agttaccctg atgaaaaaaa taagagagct tccgtaaggc      840

gacgaattga ccaaagcaat tcccatgcca acatattcta cagtgttctt actattgaca      900

aaatgcagaa caaagacaaa ggactttata cttgtcgtgt aaggagtgga ccatcattca      960

aatctgttaa cacctcagtg catatatatg ataaagcagg atccattgct gagctgcctc      1020

ccaaagtgag cgtcttcgtc ccaccccgcg acggcttctt cggcaacccc cgcagcaagt      1080

ccaagctcat ctgccaggcc acgggtttca gtccccggca gattcaggtg tcctggctgc      1140

gcgaggggaa gcaggtgggg tctggcgtca ccacggacca ggtgcaggct gaggccaaag      1200

agtctgggcc cacgacctac aaggtgacca gcacactgac catcaaagag agcgactggc      1260

tcagccagag catgttcacc tgccgcgtgg atcacagggg cctgaccttc cagcagaatg      1320

cgtcctccat gtgtgtcccc gatcaagaca cagccatccg ggtcttcgcc atccccccat      1380

cctttgccag catcttcctc accaagtcca ccaagttgac ctgcctggtc acagacctga      1440

ccacctatga cagcgtgacc atctcctgga cccgccagaa tggcgaagct gtgaaaaccc      1500

acaccaacat ctccgagagc caccccaatg ccactttcag cgccgtgggt gaggccagca      1560

tctgcgagga tgactggaat tccggggaga ggttcacgtg caccgtgacc cacacagacc      1620

tgccctcgcc actgaagcag accatctccc ggcccaaggg ggtggccctg cacaggcccg      1680

atgtctactt gctgccacca gcccgggagc agctgaacct gcgggagtcg gccaccatca      1740

cgtgcctggt gacgggcttc tctcccgcgg acgtcttcgt gcagtggatg cagagggggc      1800

agcccttgtc cccggagaag tatgtgacca gcgccccaat gcctgagccc caggccccag      1860

gccggtactt cgcccacagc atcctgaccg tgtccgaaga ggaatggaac acgggggaga   1920

cctacacctg cgtggtggcc catgaggccc tgcccaacag ggtcaccgag aggaccgtgg   1980

acaagtccac cgagggggag gtgagcgccg acgaggaggg ctttgagaac ctgtgggcca   2040

ccgcctccac cttcatcgtc ctcttcctcc tgagcctctt ctacagtacc accgtcacct   2100

tgttcaaggt gaaatga                                                  2117

<210>2

<211>1703

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ccatggtcag ctactgggac accggggtcc tgctgtgcgc gctgctcagc tgtctgcttc    60

tcacaggatc tagttcaggt tcaaaattaa aagatcctga actgagttta aaaggcaccc    120

agcacatcat gcaagcaggc cagacactgc atctccaatg caggggggaa gcagcccata    180

aatggtcttt gcctgaaatg gtgagtaagg aaagcgaaag gctgagcata actaaatctg    240

cctgtggaag aaatggcaaa caattctgca gtactttaac cttgaacaca gctcaagcaa    300

accacactgg cttctacagc tgcaaatatc tagctgtacc tacttcaaag aagaaggaaa    360

cagaatctgc aatctatata tttattagtg atacaggtag acctttcgta gagatgtaca    420

gtgaaatccc cgaaattata cacatgactg aaggaaggga gctcgtcatt ccctgccggg    480

ttacgtcacc taacatcact gttactttaa aaaagtttcc acttgacact ttgatccctg    540

atggaaaacg cataatctgg gacagtagaa agggcttcat catatcaaat gcaacgtaca    600

aagaaatagg gcttctgacc tgtgaagcaa cagtcaatgg gcatttgtat aagacaaact    660

atctcacaca tcgacaaacc aatacaatca tagatgtcca aataagcaca ccacgcccag    720

tcaaattact tagaggccat actcttgtcc tcaattgtac tgctaccact ccct tgaaca   780

cgagagttca aatgacctgg agttaccctg atgaaaaaaa taagagagct tccgtaaggc    840

gacgaattga ccaaagcaat tcccatgcca acatattcta cagtgttctt actattgaca    900

aaatgcagaa caaagacaaa ggactttata cttgtcgtgt aaggagtgga ccatcattca    960

aatctgttaa cacctcagtg catatatatg ataaagcagg atccaagccc aaatcttgtg    1020

acaaaac tcacacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct    1080

tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat    1140

gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg    1200

gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc    1260

gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt    1320

gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag    1380

ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga    1440

accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt    1500

gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg    1560

acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga    1620

acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc    1680

tctccctgtc tcccgggaaa tga                                            1703

<210>3

<211>2103

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atgcagagca aggtgctgct ggccgtcgcc ctgtggctct gcgtggagac ccgggccgcc   60

tctgtgggtt tgcctagtgt ttctcttgat ctgcccaggc tcagcataca aaaagacata   120

cttacaatta aggctaatac aactcttcaa attacttgca ggggacagag ggacttggac   180

tggctttggc ccaataatca gagtggcagt gagcaaaggg tggaggtgac tgagtgcagc   240

gatggcctct tctgtaagac actcacaatt ccaaaagtga tcggaaatga cactggagcc   300

tacaagtgct tctaccggga aactgacttg gcctcggtca tttatgtcta tgttcaagat   360

tacagatctc catttattgc ttctgttagt gaccaacatg gagtcgtgta cattactgag   420

aacaaaaaca aaactgtggt gattccatgt ctcgggtcca tttcaaatct caacgtgtca   480

ctttgtgcaa gatacccaga aaagagattt gttcctgatg gtaacagaat ttcctgggac   540

agcaagaagg gctttactat tcccagctac atgatcagct atgctggcat ggtcttctgt   600

gaagcaaaaa ttaatgatga aagttaccag tctattatgt acatagttgt cgttgtaggg   660

tataggattt atgatgtggt tctgagtccg tctcatggaa ttgaactatc tgttggagaa   720

aagcttgtct taaattgtac agcaagaact gaactaaatg tggggattga cttcaactgg   780

gaataccctt cttcgaagca tcagcataag aaacttgtaa accgagacct aaaaacccag   840

tctgggagtg agatgaagaa atttttgagc accttaacta tagatggtgt aacccggagt   900

gaccaaggat tgtacacctg tgcagcatcc agtgggctga tgaccaagaa gaacagcaca   960

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Claims (6)

1.六种可特异识别与结合血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的人源化的融合免疫球蛋白。该六种免疫球蛋白的共同特征是其N-端含有数个可结合VEGF的免疫球蛋白样结构区，而其C-端含有人免疫球蛋白恒定区。该类免疫球蛋白保留有与VEGF高度结合的生物活性及免疫球蛋白的双重活性。这六种融合免疫球蛋白的代号及名称分别为：

  融合蛋白的代号     融合蛋白的名称     1.PF12.PF23.PK14.PK25.PF1K16.PF2K2     Flt1 D123-IgMFlt1-D123-IgGKDR-D123-IgM，KDR-D123-IgGFlt1-D123-IgM/KDR-D123-IgMFlt1-D123-IgG/KDR-D123-IgG

其中的免疫球蛋白PF1(Flt1-D123-IgM)和PF2(Flt1-D123-IgG)的N-端含VEGF受体Flt-1的胞膜外结构区中的第1，第2及第3免疫球蛋白样胞结构区(即Flt1-D123)；而免疫球蛋白PK1(KDR-D123-IgM)和PK2(KDR-D123-IgG)的N-端含VEGF受体KDR的胞膜外结构区中的第1，第2及第3结构区(即KDR-D123)。而免疫球蛋白PF1K1(Flt1-D123-IgM/KDR-D123-IgM)为PF1(Flt1-D123-IgM)与PK1(KDR-D123-IgM)相结合的异源二倍体；免疫球蛋白PF2K2(Flt1-D123-IgG/KDR-D123-IgG)为PF2(Flt1-D123-IgG)与PK2(KDR-D123-IgG)相结合的异源二倍体。

2.一种制备权利要求1的六种免疫球蛋白的方法，其步骤包括：a)以多聚酶链式反应(PCR)及重组基因工程方法构建含有Flt-1或KDR胞膜外结构区D123与人免疫球蛋白恒定区(IgM或IgG的Fc-段基因)相连的重组基因的表达载体；  该类表达载体的特征在于其具有如基因序列表1至表3所示的重组基因核苷酸序列；b)表达载体转染入哺乳动物细胞及鉴定、检测重组免疫球蛋白在转染细胞中的分泌性表达；c)重组免疫球蛋白表达阳性细胞的筛选、扩增培养及上清液的收集；d)以免疫亲和层析柱法从收集的细胞培养上清液中分离提取重组免疫球蛋白。

3.用权利要求1的重组免疫球蛋白为试剂盒成分进行体内或体外检测VEGF表达水平的方法；其特征在于被检测的VEGF是以流离降级的可溶性物质形式存在于体液(如血清、血浆、唾液等)与细胞培养上清液中或以膜蛋白形式表达于细胞/组织中。

4.用权利要求1所述的重组免疫球蛋白为吸附剂，体内外分离或清除VEGF及VEGF表达阳性细胞或组织的方法。

5.权利要求1所述的每种免疫球蛋白作为VEGF的中和吸附剂，单个独立使用以中和吸附体内外VEGF。权利要求1所述的几种免疫球蛋白按其中和吸附VEGF作用的效果大小由高到低排序为：Flt1-D123-IgM＞KDR-D123-IgM＞Flt1-D123-IgG＞KDR-D123-IgG

6.将权利要求1所述的各种免疫球蛋白组合在一起使用，以达到更彻底地中和吸附VEGF及拮抗抑制VEGF介导的血管新生的药用方法。

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