BR122017018105B1 - Molécula de dna genômico de soja transgênica - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se a um evento mon87701 de soja transgênica, e células, sementes, e plantas compreendendo dna diagnóstico para o evento de soja. a invenção também proporciona composições compreendendo sequências de nucleotídeo que são diagnósticas para referido evento de soja em uma amostra biológica, sondas e iniciadores para uso na detecção de sequências de nucleotídeo que são diagnósticas para a presença de referido evento de soja em uma amostra biológica, e métodos para detecção da presença de referido sequências de nucleotídeo de evento de soja em uma amostra biológica. a invenção adicionalmente proporciona métodos de crescimento das sementes de tal evento de soja em plantas de soja, e métodos de geração para produzir plantas de soja compreendendo dna diagnóstico para o evento de soja.
Description
[001] Dividido do PI0820373-3, depositado em 06.11.2008.
[002] Este pedido reivindica o benefício de prioridade ao Pedido Provisório dos Estados Unidos No de Série 60/988,349, depositado em 15 de novembro de 2007, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[003] A presente invenção refere-se ao evento MON87701 de soja transgênica e partes de planta e semente destas. O evento exibe resistência a infestação de inseto de insetos na ordem de Lepidoptera. A presente invenção também se refere a métodos para detecção da presença de referido evento de soja em uma amostra biológica, e proporciona sequências de nucleotídeo que são únicas no evento.
[004] A soja é uma cultura importante e é uma fonte de alimenta ção primária em muitas áreas do mundo. Os métodos de biotecnologia têm sido aplicados à soja para aperfeiçoamento de traços agronômicos e na qualidade do produto. Tal traço agronômico é resistência a inseto.
[005] Seria vantajoso ser capaz de detectar a presença de DNA transgene/genômico de uma planta particular de modo a determinar se progênie de um cruzamento sexual contém o DNA transgene/genômico de interesse. Em adição, um método para detecção de uma planta particular seria proveitoso quando cumprindo com os regimentos que requerem a aprovação de pré-mercado e etiquetação de alimentos derivados das plantas de cultura recombinantes.
[006] As culturas transgênicas que expressam δ-endotoxinas de B. thuringiensis capacitam os cultivadores a reduzirem significantemente o tempo e custo associados com a aplicação de inseticidas químicos, bem como aumentar os rendimentos da cultura em plantas transgênicas crescidas sob pressão pesada de inseto conforme comparada a rendimentos grandemente reduzidos em variedades de planta comerciais não-transgênicas. Apesar deste sucesso, é ainda antecipado que insetos podem desenvolver resistência a B. thuringiensis δ-endotoxinas expressa em plantas transgênicas. Tal resistência, que deve tornar-se difundida, limitaria claramente o valor comercial de genes contendo plasma de germe que codificam alguns B. thuringiensis δ-endotoxinas.
[007] Um modo possível de aumentar a eficiência dos inseticidas transgênicos contra pestes alvos e contemporaneamente reduzindo o desenvolvimento de pestes resistentes a inseticida seria assegurar que culturas transgênicas expressem altos níveis de B. thuringiensis δ-en- dotoxinas (McGaughey e Whalon (1992), Science 258:1451-55; Roush Roush (1994), Biocontrol. Sci. Technol. 4:501-516). Das muitas proteínas inseticidas identificadas de Bacillus thuringiensis, proteínas inseticidas relativamente pouco individuais tais como Cry1's, Cry3's, VIP3A, Cry34, Cry35 e Cry2Ab foram testadas para expressão em plantas. No caso de Cry2Ab, de modo a alcançar altos níveis de expressão in planta, esta proteína inseticida (Cry2Ab) tem que ser alvo para o cloroplasto para evitar efeitos fitotóxicos indesejáveis. A expressão de genes exógenos em plantas é conhecida por ser influenciada por sua posição cromossomal, talvez devido à estrutura da cro- matina (por exemplo, heterocromatina) ou a proximidade de elementos de regulação transcricionais (por exemplo, intensificadores) próximos ao local de integração (Weising et al. (1988), Ann. Rev. Genet 22:421477). Por esta razão, é frequentemente necessário classificar um grande número de eventos de modo a identificar um evento caracterizado por expressão ótima de um gene introduzido de interesse. Por exemplo, tem sido observado em plantas e em outros organismos que pode existir ampla variação nos níveis de expressão de um gene introduzido entre eventos. Podem também existir diferenças em modelos espaciais ou temporais de expressão, por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene em vários tecidos de planta, que não podem corresponder aos modelos esperados de elementos regulatórios transcricionais presentes na construção de gene introduzida. Por esta razão, é comum produzir várias centenas de milhares de eventos diferentes e classificar os eventos para um evento simples que tem os níveis e modelos de expressão transgene desejados para propostas comerciais. Um evento que tem os níveis desejados ou modelos de expressão transgene é útil para introgressão do transgene em outros antecedentes genéticos por cruzamento externo sexual usando-se métodos de geração convencionais. A progênie de tal cruzamento mantém as características da expressão transgene do transformante original. Esta estratégia é usada para assegurar expressão de gene segura em um número de variedades que são adequadamente adaptadas às condições de crescimento locais específicas.
[008] É possível detectar a presença de um transgene por qual quer método de detecção de ácido nucleico bem conhecido tais como a reação de cadeia de polimerase (PCR) ou hibridização de DNA usando sondas de ácido nucleico. Estes métodos de detecção geralmente se focalizam nos elementos genéticos frequentemente usados, tais como promotores, terminadores, genes marcadores, etc. Como um resultado, tais métodos podem não ser úteis para discriminação entre eventos diferentes, particularmente aqueles produzidos usando-se a mesma construção de DNA a menos que a sequência de DNA cromossomal adjacente ao DNA inserido ("DNA de flanqueamento") seja conhecida. Um ensaio de PCR de evento específico é discutido, por exemplo, por Taverniers et al. (J. Agric. Food Chem., 53: 3041-3052, 2005) em que um sistema de traço específico de evento para linhagens de milho transgê- nicas Bt11, Bt176, e GA21 e para canola evento GT73 é demonstrado. Neste estudo, iniciadores de evento específico e sondas foram designados baseados nas sequências das junções genoma/transgene para cada evento. Métodos de detecção de DNA específicos de evento de planta transgênica foram também descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos 6,893,826; 6,825,400; 6,740,488; 6,733,974; 6,689,880; 6,900,014 e 6,818,807.
[009] A presente invenção refere-se à planta de soja transgênica designada MON87701 tendo semente depositada na American Type Culture Collection (ATCC) com No de Acesso PTA-8194. Outro aspecto da invenção são plantas de progênie, ou sementes, ou partes das plantas e sementes do evento de soja MON87701. As partes de planta incluem, mas não são limitadas a, pólen, óvulo, flores, brotos, raízes, caules, folhas, vagens, sementes e tecidos meristemáticos. A planta de soja MON87701 é particularmente resistente a insetos na família Lepidoptera tal como Velvetbean caterpillar (Anticarsia gemmatalis), lagarta da soja looper (Pseudoplusia includens), semente de Soja trigo (Epinotia apo- rema), lagarta amarela Moth (Spilosoma virginica), pestes mariposa espiga (Helicoverpa zea), lagarta do cartucho (Spodoptera frugiperda) e girasol loop (Rachiplusia nu) entre outras, todas das quais são agricul- turalmente pestes de inseto importantes.
[0010] A presente invenção é também relacionada a construção de DNA de planta de soja MON87701 e a detecção da região de inserção transgene/genômica em soja MON87701 e progênie desta.
[0011] Novas composições genéticas contidas no genoma de MON87701 e produtos de MON87701 tais como farelo, farinha, produtos alimentícios, suplementos de proteína e biomassas remanescentes em um campo da qual plantas de soja correspondentes a MON87701 foram coletadas são aspectos adicionais desta invenção.
[0012] De acordo com um aspecto da invenção, composições e mé todos são providos para detecção da presença da região de inserção transgene/genômica de uma nova planta de soja designada MON87701. Sequências de DNA são providas que compreendem pelo menos uma sequência de junção de MON87701 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:1 ([A] correspondentes às posições 5748 a 5767 de SEQ ID NO:6 [F], Figura 2) e SEQ ID NO:2 ([B] correspondente às posições 12,174 a 12,193 de SEQ ID NO:6 [F], Figura 2) e complementos destas. A sequência de junção é uma sequência de nu- cleotídeo que se estende sobre o ponto no qual DNA heterólogo inserido no genoma é ligado ao DNA genômico de célula de soja. A detecção desta sequência em uma amostra biológica contendo o DNA de soja é diagnóstico para a presença do evento de soja MON87701 DNA na referida amostra. Um evento de soja MON87701 e semente de soja compreendendo estas moléculas de DNA é um aspecto desta invenção.
[0013] As sequências de DNA que compreendem nova região trans- gene/de inserção genômica, SEQ ID NO:3 [C], SEQ ID NO:4 [D] e SEQ ID NO:5 [E] ou SEQ ID NO:1 [A], SEQ ID NO:2 [B] e SEQ ID NO:5 [E] (ver Figura 2) do evento de soja MON87701 são também aspectos desta invenção. A planta de soja e semente compreendendo estas moléculas são adicionalmente aspectos desta invenção.
[0014] De acordo com outro aspecto da invenção, duas moléculas de DNA são providas para uso em um método de detecção de DNA. As moléculas de DNA são de comprimento suficiente de nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:5, ou seu complemento para funcionar como iniciadores de DNA ou sondas diagnósticas para DNA extraído de planta de soja MON87701 ou progênie desta. Por exemplo, a primeira molécula de DNA compreende 11 ou mais polinucleotídeos contíguos de qualquer porção da região transgene de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:5, ou complemento destas, e uma segunda molécula de DNA de comprimento similar de qualquer porção de um 5' que flanqueia região de DNA genômico de soja de SEQ ID NO:3, ou complemento desta, onde estas moléculas de DNA quando usadas juntas são úteis como iniciadores de DNA em um método de amplificação de DNA que produz um amplicon. O amplicon produzido usando-se estes iniciadores de DNA no método de amplificação de DNA é diagnóstico para evento de soja MON87701 quando o amplicon contém SEQ ID NO:1. Qualquer amplicon produzido por iniciadores de DNA homólogos ou complementares a qualquer porção de SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:5, e qualquer amplicon que compreende SEQ ID NO:1 é um aspecto da invenção.
[0015] De acordo com outro aspecto da invenção, duas moléculas de DNA são providas para uso em um método de detecção de DNA. As moléculas de DNA são de comprimento suficiente de nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:5, ou seu complemento para funcionar como iniciadores de DNA ou sondas diagnósticas para DNA extraído de planta de soja MON87701, ou progênie desta. Por exemplo, a primeira molécula de DNA compreende 11 ou mais polinucleotídeos contíguos de qualquer porção da região transgene da molécula de DNA de SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:5, ou complemento destas, e uma segunda molécula de DNA de comprimento similar de qualquer porção de um 3' que flanqueia DNA genômico de soja de SEQ ID NO:4, ou complemento deste, onde estas molécula de DNA quando usadas juntas são úteis como iniciadores de DNA em um método de amplificação de DNA. O amplicon produzido usando estes iniciadores de DNA no método de amplificação de DNA é diagnóstico para evento de soja MON87701 quando o amplicon contém SEQ ID NO:2. Quaisquer amplicons produzidos por iniciadores de DNA homólogos ou complementares para qual-quer porção de SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5, e qualquer amplicon que compreende SEQ ID NO:2 é um aspecto da invenção.
[0016] De acordo com outro aspecto da invenção, duas moléculas de DNA são providas para uso em um método de detecção de DNA. As moléculas de DNA são de comprimento suficiente de nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:6 ou seu complemento para funcionar como iniciadores de DNA ou sondas diagnósticas para DNA extraído de planta de soja MON87701 ou progênie desta. Quando usado junto como iniciadores de DNA em um método de amplificação de DNA, um amplicon é produzido que compreende SEQ ID NO:1 e/ou SEQ ID NO:2. O amplicon produzido é diagnóstico para evento de soja MON87701. Quaisquer amplicons produzidos por iniciadores de DNA homolólogos ou complementares a qualquer porção de SEQ ID NO:6, e qualquer amplicon que compreende SEQ ID NO:1 e/ou SEQ ID NO:2 é um aspecto da invenção.
[0017] De acordo com outro aspecto da invenção, métodos de de tecção da presença de DNA correspondente ao evento de soja MON87701 em uma amostra biológica são providos. Tais métodos compreendem: (a) contactar a amostra biológica com um iniciador ajustado que, quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA genômico de evento de soja MON87701, produz um amplicon que é diagnóstico para evento de soja MON87701; (b) realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico, produzindo, desse modo, o amplicon; e (c) detecção do amplicon no qual referido amplicon compreende SEQ ID NO:1 e/ou SEQ ID NO:2, no qual detecção de tal amplicon é indicativo da presença do DNA correspondente ao evento de soja MON87701.
[0018] De acordo com outro aspecto da invenção, métodos de de tecção da presença de um DNA correspondente ao evento MON87701 em uma amostra biológica, tais métodos compreendem: (a) contactar a amostra biológica com uma sonda que hibridiza sob condições de hibri- dização estringentes com DNA genômico de evento de soja MON87701 e não hibridiza sob as condições de hibridização estringentes com uma planta de soja de controle; (b) sujeição da amostra biológica e sonda a condições de hibridização estringentes; e (c) detecção da hibridização da sonda ao DNA de evento de soja MON87701, no qual detecção de tal hibridização no indicativo de presença do DNA correspondente ao evento MON87701. Preferivelmente, a sonda é selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, e complemento destas.
[0019] Uma amostra biológica pode compreender qualquer material orgânico derivado de células de soja ou tecido, incluindo caules, raízes, folhas, flores ou partes de flor, semente ou vagens de semente, e similares, que contêm uma quantidade detectável de uma sequência de nu- cleotídeo correspondente a tal material orgânico. Uma amostra biológica derivada de evento de soja MON87701 compreende as regiões de inserção de transgene/genoma da presente invenção, e particularmente aquelas conforme colocadas na Listagem de Sequência conforme mostrada em SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6, e os complementos destas.
[0020] Kits para a detecção de evento de soja MON87701 são pro vidos que usam iniciadores designados de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:6. Um amplicon produzido usando referido kit é diagnóstico para MON87701 quando o amplicon (1) contém ou sequências de nucleotídeo colocadas como SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2, ou (2) contém ambas SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2. O kit pode ser provido como um meio para especificamente detector somente o presente DNA de evento MON87701 em uma amostra biológica, ou o kit pode ser provido como um meio para detecção de uma multiplicidade de eventos transgênicos diferentes de qualquer número de amostras biológicas diferentes. No último caso, isto é, um kit para detecção de uma multiplicidade de eventos transgênicos diferentes, o kit pode proporcionar sondas ou iniciadores na forma de uma microssérie, ou qualquer tipo de série que proporciona o usuário de referido kit com a capacidade de distinguir diferenças entre amostras transgênicas e não-transgêni- cas, zigosidade de eventos transgênicos, e ainda a presença ou ausência de eventos, se aprovadas ou não-aprovadas para comercialização. A detecção ou contagem da presença ou ausência de certos eventos usando tais kits pode ser por meios fluorométricos, colorimétri- cos, isotópicos, ou luminescentes.
[0021] Outro aspecto da invenção é uma planta de soja, ou se mente, ou produto derivado a partir da planta ou semente de MON87701, em que o DNA genômico quando isolado a partir da planta de soja, ou semente, ou produto compreende uma molécula de DNA incorporando SEQ ID NO:1 e/ou SEQ ID NO:2. Preferivelmente, o DNA genômico deste compreende uma molécula de DNA consistindo essencialmente na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:3 de cerca de posições 1 a 5757, a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:5 de cerca de posições 1 a 6426 e a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:4 de cerca de posições 379 a 2611 (o contig do qual é apresentado como SEQ ID NO:6).
[0022] Um outro aspecto da invenção é uma planta de soja, ou se mente, ou produto derivado a partir da planta ou semente de MON87701, no qual o DNA genômico compreende uma molécula de DNA consistindo essencialmente da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:6 de cerca de posições 1 a 14,416.
[0023] Outro aspecto da invenção é uma planta de soja, ou se mente, ou produto derivado a partir da planta ou semente de MON87701, em que o DNA genômico quando isolado a partir da planta de soja, ou semente, ou produto produz um amplicon em um método de amplificação de DNA, no qual referido amplicon compreende SEQ ID NO:1 e/ou SEQ ID NO:2.
[0024] Outro aspecto da invenção é um método de produção de uma planta de soja resistente a inseto. Este método compreende: (a) cruzamento da planta de soja de MON87701 com outra planta de soja; (b) obtenção de pelo menos uma planta de progênie derivada a partir do cruzamento de (a); e (c) seleção de progênie que compreende sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2. A referida seleção inclui sujeição de pelo menos uma planta de progênie obtida de (b) a uma reação de amplificação de ácido nucleico, no qual progênie que produz um amplicon compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:6 é selecionada, ou sujeição de pelo menos uma planta de pro- gênie obtida de (b) a uma reação de hibridização de ácido nucleico, no qual progênie hibridiza a uma sonda que hibridiza sob condições estrin- gentes com uma ou mais sequências de DNA selecionadas de SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 é selecionada. A progênie assim selecionada é uma planta de soja resistente a inseto.
[0025] Outro aspecto da invenção é um método para proteção de uma planta de soja de infestação de inseto. Este método compreende provisão na dieta de uma peste Lepidopteran de soja de uma quantidade inseticidamente efetiva de célula (s) ou tecido(s) da planta de soja MON87701. A peste Lepidopteran é selecionada a partir do grupo consistindo em Anticarsia, Pseudoplusia, Epinotia, Spilosoma, Helicoverpa, Spodoptera e Rachiplusia.
[0026] Outro aspecto da invenção é produto de base derivado de uma planta de soja, ou semente, ou progênie de semente de MON87701. Tais produtos de base incluem, mas não estão limitados a, sementes de soja inteira ou processada, alimentação de proteína animal, óleo vegetal, farelo, farinha, plásticos não-tóxicos, tintas de impressão, lubrificantes, ceras, fluidos hidráulicos, fluidos de transformador elétrico, solventes, cosméticos, produtos de cuidado de cabelo, leite de soja, manteiga de noz de soja, natto, tempeh, concentrado de proteína de soja, isolados de proteína de soja, concentrado de proteína de soja texturizado, proteína de soja hidrolizada, polpa batida, óleo de cozimento, óleo de salada, encurtamento, lecitina, sojas inteiras comestíveis (crua, assada ou como edamamé), leite de soja, iogurte de soja, queijo de soja, tofu, yuba e biodiesel.
[0027] Outro aspecto da invenção é um método de determinar zigo- sidade da progênie de evento de soja MON87701. O método compreende (a) contactar uma amostra de soja com o par de iniciador SQ3443 (SEQ ID NO:12) e SQ3445 (SEQ ID NO:13), que quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA ge- nômico de evento de soja MON87701, produz um amplicon a partir da combinação de iniciadores SQ3443 e SQ3445 que é diagnóstico para evento de soja MON87701; (b) realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico; (c) detecção de um primeiro amplicon produzido; (d) contato da mesma amostra com o par de iniciador SQ3445 (SEQ ID NO:13) e SQ3446 (SEQ ID NO:14), que, quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA genômico de plantas de soja produz um amplicon a partir da combinação de iniciadores SQ3445 e SQ3446 que é diagnóstica do DNA genômico de soja tipo selvagem homólogo à região genômica de soja de uma inserção transgene identificada como evento de soja MON87701; (e) realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico, e (f) detecção de um segundo amplicon produzido; no qual detecção de ambos amplicons indica que a amostra de soja é heterozigota para DNA de evento de soja MON87701.
[0028] Outro aspecto da invenção é um método de determinação de zigosidade da progênie de evento de soja MON87701 usando-se adici-onalmente sondas etiquetadas com fluoróforo(s). Tal método compreende (a) contactar uma amostra de soja com o par de iniciador SQ3443 (SEQ ID NO:12), SQ3445 (SEQ ID NO:13), e a sonda 6FAM®-etique- tada PB1111 (SEQ ID NO:15), que, quando usada em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA genômico de evento de soja MON87701, produz um amplicon que é diagnóstico para evento de soja MON87701, liberação de um sinal fluorescente a partir da combinação de iniciadores SQ3443 e SQ3445 e sonda 6FAM®-etiquetada PB1111; (b) realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico; (c) detecção de um primeiro amplicon produzido; (d) contato da mesma amostra com o par de iniciador SQ3445 (SEQ ID NO:13) e SQ3446 (SEQ ID NO:14) e um VIC®-etiquetado PB1112 (SEQ ID NO:16), que quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA ge- nômico de plantas de soja, produz um amplicon que é diagnóstico para DNA genômico de soja tipo selvagem homólogo à região genômica de soja de uma inserção transgene identificada como evento de soja MON87701, liberação de um sinal fluorescente a partir da combinação de iniciadores SQ3445 e SQ3446 e sonda VIC®-etiquetada PB1112; (e) realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico; e (f) detecção de um segundo amplicon produzido; no qual detecção de ambos amplicons indica que a amostra de soja compreendendo DNA que é he- terozigoto para a inserção transgene identificada como evento de soja MON87701.
[0029] Os aspectos precedentes e outros da invenção tornar-se-ão mais aparentes a partir da seguinte descrição detalhada.
[0030] A Figura 1 ilustra o mapa de vetor de transformação binário, PMON53570 que foi usado para gerar planta de soja MON87701.
[0031] A Figura 2 ilustra a organização do inserto transgênico no genoma de evento de soja MON87701: [A] corresponde a posição relativa de SEQ ID NO:1 que forma a junção entre SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:5; [B] corresponde a posição relativa de SEQ ID NO:2 que forma a junção entre SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5; [C] corresponde a posição relativa de SEQ ID NO:3, a sequência de genoma de soja que flanqueia a extremidade 5' arbitrariamente transferida/designada do cassete de expressão integrado no genoma no evento MON87701; [D] corresponde a posição relativa de SEQ ID NO:4, a sequência de genoma de soja que flanqueia a extremidade 3' arbitrariamente transferida/designada do cassete de expressão integrado no genoma no evento MON87701; [E] representa os vários elementos compreendendo SEQ ID NO:5 e é a sequência do cassete de expressão inserido no genoma do evento MON87701; e [F] representa a sequência contígua compreendendo, conforme representado na figura da esquerda para a direita, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:4, em que SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 são incorporados conforme colocado acima, a medida que estas sequências estão presentes no genoma no evento MON87701.
[0032] SEQ ID NO:1 - A sequência de 20 nucleotídeos represen tando a junção entre um DNA genômico de soja e o cassete de expressão integrado (ver Figura 2). Esta sequência corresponde às posições 5748 a 5767 de SEQ ID NO:6. Em adição, SEQ ID NO:1 ([A]) é uma sequência de nucleotídeo correspondente às posições 5748 a 5757 de SEQ ID NO:3 ([C]) e a borda direita integrada do cassete de expressão de TIC107 correspondente às posições 1 a 10 de SEQ ID NO:5 ([E]). SEQ ID NO:1 também corresponde às posições 5748 o 5767 da sequência de flanqueamento 5', SEQ ID NO:3 ([C]).
[0033] SEQ ID NO: 2 - Uma sequência de 20 nucleotídeos repre sentando a junção entre o cassete de expressão integrado e o DNA ge- nômico de soja (ver Figura 2). Esta sequência corresponde às posições 12174 a 12193 de SEQ ID NO:6 ([F]). Em adição, SEQ ID NO:2 ([B]) é uma sequência de nucleotídeo correspondendo às posições 6417 a 6426 de SEQ ID NO:5 ([E]) e a sequência de flanqueamento 3' correspondendo às posições 379 a 388 de SEQ ID NO:4 ([D]). SEQ ID NO:2 ([B]) também corresponde às posições 369 a 388 da sequência de flan- queamento 3', SEQ ID NO:4 ([D]).
[0034] SEQ ID NO:3 ([C] da Figura 2) - A 5' sequência de flanque- amento do DNA inserido de MON87701 e incluindo uma região de inserção de DNA de transformação (T-DNA).
[0035] SEQ ID NO:4 ([D] da Figura 2) - A 3' sequência de flanque- amento do DNA inserido de MON87701 até e incluindo uma região de inserção de T-DNA.
[0036] SEQ ID NO:5 ([E] da Figura 2) - A sequência do cassete de expressão integrado TIC107, incluindo da direita para a esquerda sequência ligadora após integração.
[0037] SEQ ID NO:6 ([F] da Figura 2) - Uma sequência de nucleo- tídeo de 14,416 pb representando o contig da 5' sequência que flanqueia o DNA inserido de MON87701 (SEQ ID NO:3), a sequência do cassete de expressão integrado (SEQ ID NO:5) e a 3' sequência que flanqueia o DNA inserido de MON87701 (SEQ ID NO: 4).
[0038] SEQ ID NO:7 - O cassete de expressão TIC107 de pMON53570.
[0039] SEQ ID NO:8 - A sequência do DNA que codifica TIC107, incluindo nucleotídeos que codificam o peptídeo de trânsito de cloro- plasto.
[0040] SEQ ID NO:9 - Iniciador SQ1135 usado para identificar eventos MON87701. Iniciador SQ1135 é complementar a 5' região do cassete de expressão inserido, próximo a borda de inserção de T-DNA direita correspondendo às posições 5790 a 5766 de SEQ ID NO:6 e posições 33 a 9 de SEQ ID NO:5.
[0041] SEQ ID NO:10 - Iniciador SQ1136 usado para identificar eventos MON87701. Iniciador SQ1136 corresponde a uma 5' região que flanqueia o cassete de expressão inserido próximo à borda de inserção de T-DNA direita correspondendo às posições 5705 a 5732 de SEQ ID NO:6 e posições 5705 a 5732 de SEQ ID NO:3. Um amplicon de PCR de cerca de 86 pb produzido usando-se a combinação de iniciadores SQ1135 e SQ1136 é positivo para a presença do evento MON87701.
[0042] SEQ ID NO:11 - Sonda PB63 usada para identificar eventos MON87701. Esta sonda é um oligonucleotídeo sintético 6FAM®-etique- tado cuja sequência é complementar às posições 5763 a 5748 de SEQ ID NO:6. A liberação de um sinal fluorescente em uma reação de amplificação usando iniciadores SQ1135 e SQ1136 em combinação com sonda 6FAM®-etiquetada PB63 é diagnóstica de evento MON87701.
[0043] SEQ ID NO:12 - Iniciador SQ3443 usado para determinar zigosidade de eventos MON87701. Iniciador SQ3443 corresponde a uma região do cassete de expressão inserido, próximo a borda de T- DNA esquerda, correspondendo às posições 12145 a 12168 de SEQ ID NO:6 e às posições 6388 a 6411 de SEQ ID NO:5.
[0044] SEQ ID NO:13 - Iniciador SQ3445 usado para determinar zigosidade de eventos MON87701. Iniciador SQ3445 é complementar a 3' região de flanqueamento do cassete de expressão inserido, próximo a borda de T-DNA esquerda correspondendo às posições 12215 a 12188 de SEQ ID NO:6 e às posições 410 a 383 SEQ ID NO:4. A detecção de um amplicon de PCR usando iniciadores SQ3443 e SQ3445 com ou sem Sonda 6FAM®-etiquetada PB1111 é positiva para presença de evento MON87701 em um ensaio de zigosidade.
[0045] SEQ ID NO:14 - Iniciador SQ3446 usado para determinar zigosidade de eventos MON87701. Iniciador SQ3446 corresponde a uma região do DNA genômico tipo selvagem no qual inserção do cassete de expressão para MON87701 ocorreu. A detecção de um amplicon de PCR usando iniciador SQ3445 e SQ3446 com ou sem sonda de VIC®-etiquetada PB1112 é positiva para a presença do alelo tipo selvagem.
[0046] SEQ ID NO:15 - Sonda PB1111 usada para determinar zi- gosidade de eventos MON87701. Esta sonda é um oligonucleotídeo sintético de 6FAM®-etiquetado cuja sequência corresponde às posições 12172 a 12187 de SEQ ID NO:6. Um amplicon de PCR produzido usando-se iniciadores SQ3443 e SQ3445 causa a liberação de um sinal fluorescente usando sonda PB1111, que é positiva para a presença de evento MON87701 em um ensaio de zigosidade para evento MON87701.
[0047] SEQ ID NO:16 - Sonda PB1112 usada para determinar zi- gosidade de eventos MON87701. Esta sonda é um oligonucleotídeo sintético de VIC®-etiquetado cuja sequência corresponde uma região do DNA genômico tipo selvagem imediatamente seguindo a região de ho- mologia para iniciador SQ3446 no ponto de inserção do cassete de expressão para evento MON87701. Um amplicon de PCR produzido usando iniciadores SQ3445 e SQ3446 causa a liberação de um sinal fluorescente usando sonda PB1112, que é positivo para a presença do alelo tipo selvagem em um ensaio de zigosidade para evento MON87701. A heterozigosidade do evento MON87701 é demonstrada pela detecção fluorescente de duas sondas de amplicons diferentes PB1111 e PB1112 em uma reação de amplificação usando iniciadores SQ3443, SQ3445 e SQ3446.
[0048] As seguintes definições e métodos são providos para melhor definir a presente invenção e para guiar aqueles técnicos no assunto na prática da presente invenção. A menos que de outro modo notado, termos são para serem compreendidos de acordo com uso convencional por aqueles técnicos no assunto relevante. As definições de termos comuns em biologia molecular podem também serem encontradas em Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5a edição, Springer-Verlag: New York, 1991; e Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994.
[0049] Conforme aqui usado, o termo "soja" significa Glicina máx e incluem todas as variedades de planta que pode ser gerada com soja, incluindo espécie de soja tipo selvagem, bem como aquelas plantas per-tencentes à soja Glicina que permite geração entre espécies.
[0050] Conforme aqui usado, o termo "compreendendo" significa "incluindo, mas não limitado a".
[0051] O termo "glifosato" se refere a N-fosfonometilglicina e seus sais. N-fosfonometilglicina é um herbicida bem conhecido que tem atividade em um espectro amplo de espécie de planta.
[0052] Um "produto de base" se refere a qualquer produto que é compreendido de material derivado de soja ou óleo de soja e é vendido aos consumidores. As sojas processadas são as fontes maiores de alimentação de proteína e óleo vegetal no mundo. A planta de soja MON87701 pode ser usada para fabricar produtos de base tipicamente adquiridos da soja. As sojas de MON87701 podem ser processadas em farelo, farinha, bem como serem usadas como uma fonte de proteína em alimentações de animal para ambos animais terrestres e aquáticos. As sojas e óleos de soja de MON87701 podem ser usados na fabricação de muitos produtos diferentes, não limitados a, plásticos não-tóxicos, tintas de impressão, lubrificantes, ceras, fluidos hidráulicos, fluidos de transformadores elétricos, solventes, cosméticos, e produtos de cuidado de cabelo. As sojas e óleos de soja de MON87701 são adequados para uso em uma variedade de alimentos de soja produzidos de sojas inteiras, tais como leite de soja, manteiga de noz de soja, natto, e tempeh, e alimentos de soja produzidos de sojas processadas e óleo de soja, incluindo farelo de soja, farinha de soja, concentrado de proteína de soja, isolados de proteína de soja, concentrado de proteína de soja texturi- zado, proteína de soja hidrolisada, polpa batida, óleo de cozimento, óleo de salada, encurtamento, e lecitin. Sojas inteiras são também comestíveis, e são tipicamente vendidas aos consumidores cruas, assadas, ou como edamamé. O leite de soja, que é tipicamente produzido por em- bebimento e moagem de sojas inteiras, pode ser consumido em outro processamento, secado por pulverização, ou processado para formar iogurte de soja, queijo de soja, tofu, ou yuba.
[0053] Os óleos de soja de MON87701 podem ser usados para pro duzir biodiesel. O uso de biodiesel em motores de diesel convencionais resulta em reduções substanciais de poluentes tais como sulfatos, monóxido de carbono, e particulados comparados a combustível de diesel de petróleo, e uso em ônibus escolares pode reduzir grandemente exposição à exaustão de diesel tóxico. O biodiesel é tipicamente obtido por extração, filtragem e refino de óleo de soja para remover gorduras livres e fosfolipídeos, e, em seguida, transesterificação do óleo com metanol para formar metil ésteres dos ácidos graxos (ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No 5,891,203). Os ésteres de metila de soja resultante são comumente referidos como "biodiesel." O óleo derivado de MON87701 pode também ser usado como um combustível de diesel sem a formação de metil ésteres, tal como, por exemplo, pela mistura de acetais com o óleo (ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No 6,013,114). As sementes de MON87701 usadas para produzir referidos óleos podem ser identificadas pelos métodos da presente invenção. É esperado que óleo purificado de evento MON87701 de eventos de sementes ou misturas de sementes algumas ou todas das quais são MON87701 não terão relativamente DNA disponível para teste. Contudo, as sementes das quais os óleos são extraídos podem ser caracterizadas com o método da presente invenção para identificar a presença do evento MON87701 sem a população de sementes usadas para produzir referidos óleos. Também, despejo de planta a partir do processo usado para produzir referidos óleos pode ser usado nos métodos da presente invenção para identificar a presença de eventos MON87701 dentro de uma mistura de sementes processadas para produzir referidos óleos. Do mesmo modo, fragmentos de planta deixados após produção de um produto de base, ou deixados pela seguinte coleta da semente de soja, podem ser caracterizados pelos métodos da presente invenção para identificar eventos MON87701 dentro das matérias- primas usadas para produzir referidos produtos de base.
[0054] Um "evento" transgênico é produzido por transformação de células de planta com DNA heterólogo, isto é, um construto de ácido nucleico que inclui um transgene de interesse, regeneração de uma população de plantas resultantes da inserção do transgene no genoma da planta, e seleção de uma planta particular caracterizada por inserção em uma localização de genoma particular. O termo "evento" se refere a transformante original e progênie do transformante que inclui o DNA he- terólogo. O termo "evento" também se refere à progênie produzida por um cruzamento externo sexual entre o transformante e outra variedade que inclui o DNA heterólogo. Ainda após cruzamento posterior repetido a uma origem recorrente, o DNA inserido e DNA de flanqueamento da origem transformada está presente na progênie do cruzamento na mesma localização cromossomal. O termo "evento" também se refere a DNA do transformante original compreendendo o DNA inserido e se-quência de flanqueamento genômica imediatamente adjacente ao DNA inserido que seria esperado ser transferido para uma progênie que recebe DNA inserido incluindo o transgene de interesse como o resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e progênie resultante de si mesmo) e uma linhagem parental que não contém o DNA inserido. A presente invenção se refere ao evento MON87701 DNA, células de planta, tecidos, sementes e produtos processados derivados de MON87701.
[0055] É também para ser compreendido que duas plantas transgê- nicas diferentes podem também ser unidas para produzir descendência que contém dois genes exógenos independentemente segregados adicionados. A progênie apropriada pode produzir plantas que são homo- zigotos para ambos os genes exógenos adicionados. Cruzamento posterior a uma planta de origem e cruzamento externo com uma planta não-transgênica são também contemplados como é propagação vege- tativa. As descrições de outros métodos de geração que são comu- mente usadas para traços diferentes e culturas podem ser encontradas em uma de várias referências, por exemplo, Fehr, em Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987).
[0056] Conforme aqui usado quando se refere a uma "molécula de DNA isolada", é pretendido que a molécula de DNA seja uma que esteja presente, sozinha ou em combinação com outras composições, mas não dentro de seu ambiente natural. Por exemplo, uma sequência de codificação, sequência de intron, sequência condutora não-transladada, sequência promotora, sequência de terminação transcricional, e similares, que são naturalmente encontradas dentro de um DNA de um ge- noma de soja não são considerados serem isolados a partir do genoma de soja considerando-se que eles estão dentro do genoma de soja. Contudo, cada um destes componentes, e subpartes destes componentes, seriam "isolados" dentro do escopo desta descrição considerando que as estruturas e componentes não estão dentro do genoma de soja. Similarmente, uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína inseticida Bacillus thuringiensis ou qualquer variante inseticida daquela proteína seria uma sequência de nucleotídeo isolada considerando-se que a sequência de nucleotídeo não estava dentro do DNA da bactéria Bacillus thuringiensis da qual a estrutura foi primeiro observada. Uma sequência de nucleotídeo artificial que codifica a mesma sequência de amino ácido ou uma sequência de aminoácido substancialmente idêntica que a sequência de nucleotídeo nativa de B. thuringiensis codifica seria considerada ser isolada para a proposta desta descrição. Para a proposta desta descrição, qualquer sequência de nucleotídeo transgê- nica, isto é, a sequência de nucleotídeo do DNA inserido no genoma das células do evento MON87701 de planta de soja seria considerada ser uma sequência de nucleotídeo isolada se ela está presente dentro do plasmídeo usado para transformar células de soja das quais o evento MON87701 ocorre, dentro do genoma do evento MON87701, presente em quantidades detectáveis nos tecidos, progênie, amostras biológicas ou produtos de base derivados a partir do evento MON87701. A sequência de nucleotídeo ou qualquer fragmento derivado desta seria, portanto, considerada ser isolada ou isolável se a molécula de DNA pode ser extraída de células, ou tecidos, ou homogenato de uma planta ou semente ou órgão de planta; ou pode ser produzida como um amplicon de DNA extraído ou RNA de células, ou tecidos, ou homogenato de uma planta ou semente ou órgão de planta, quaisquer dos quais é derivado de tais materiais derivados a partir do evento MON87701. Para esta matéria, as sequências de junção conforme colocadas em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, e sequências de nucleotídeo derivadas do evento MON87701 que também contêm estas sequências de junção são consideradas serem isoladas ou isoláveis, se estas sequências estão presentes dentro do genoma das células de evento MON87701, ou presentes em quantidades detectáveis em tecidos, progênie, amostras biológicas ou produtos de base derivados a partir do evento MON87701.
[0057] Uma "sonda" é um ácido nucleico isolado ao qual é fixada uma etiqueta detectável convencional ou molécula repórter, por exemplo, um isótopo radioativo, ligante, agente quimiluminescente, ou enzima. Tal sonda é complementar a uma fita de um ácido nucleico alvo, no caso da presente invenção, a um trancado de DNA genômico de evento de soja MON87701 se de uma planta de soja ou de uma amostra que inclui DNA do evento. Sondas de acordo com a presente invenção não incluem somente ácidos deoxirribonucleico ou ribonucleico, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a uma sequência de DNA alvo e tal ligação pode ser usada para detectar a presença daquela sequência de DNA alvo.
[0058] "Iniciadores" são ácidos nucleicos isolados que são fortaleci dos a uma fita de DNA alvo complementar por hibridização de ácido nucleico para formar um híbrido entre o iniciador e a fita de DNA alvo, e em seguida estendido ao longo da fita de DNA alvo por uma polimerase, por exemplo, uma polimerase de DNA. Pares de iniciador da presente invenção se referem ao seu uso para amplificação de uma sequência de ácido nucléico-alvo, por exemplo, por reação de cadeia de polime- rase (PCR) ou outros métodos de amplificação de ácido nucleico convencionais.
[0059] Sondas e iniciadores são geralmente 11 nucleotídeos ou mais de comprimento, preferivelmente 18 nucleotídeos ou mais, mais preferivelmente 24 nucleotídeos ou mais, e mais preferivelmente 30 nu- cleotídeos ou mais. Tais sondas e iniciadores hibridizam especificamente a uma sequência-alvo sob condições de hibridização de alta es- tringência. Preferivelmente, sondas e iniciadores de acordo com a presente invenção têm similaridade complete de sequência com a sequência-alvo, embora sondas difiram da sequência alvo e que retêm a capacidade de hibridizar a sequências-alvos podem ser designadas por métodos convencionais.
[0060] Métodos para preparação e uso de sondas e iniciadores são descritas, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (daqui para frente, "Sambrook et al., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing e Wiley-Interscience, New York, 1992 (com atualizações periódicas) (daqui para frente, "Ausubel et al., 1992"); e Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Pares de PCR-iniciador podem ser derivados de uma sequência conhecida, por exemplo, pelo uso de programas de computador pretendidos para proposta tal como Iniciador (Version 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).
[0061] Iniciadores e sondas baseados no DNA de flanqueamento e sequências de inserto aqui reveladas podem ser usados para confirmar (e, se necessário, corrigir) as sequências reveladas por métodos convencionais, por exemplo, por reclonagem e sequenciamento de tais sequências.
[0062] As sondas de ácido nucleico e iniciadores da presente inven ção hibridizam sob condições estringentes a uma sequência de DNA alvo. Qualquer hibridização de ácido nucleico convencional ou método de amplificação pode ser usado para identificar a presença de DNA de um evento transgênico em uma amostra. As moléculas de ácido nu- cleico ou fragmentos destas são capazes de hibridizarem especificamente entre si a outras moléculas de ácido nucleico sob certas circunstâncias. Conforme aqui usado, duas moléculas de ácido nucleico são referidas para serem capazes de hibridizarem especificamente entre si se as duas moléculas são capazes de formarem uma estrutura de ácido nucleico de fita dupla antiparalela. Uma molécula de ácido nucleico é referida para ser "complemento" de outra molécula de ácido nucleico se elas exibem complementaridade completa. Conforme aqui usado, moléculas são referidas para exibirem "complementaridade completa" quando todo nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são referidas para serem "minimamente complementares" se elas podem hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permiti-las permanecerem fortalecidas entre si sob pelo menos condições de "baixa estringência" convencionais. Similarmente, as moléculas são referidas para serem "complementares" se elas podem hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permiti- las permanecerem reforçadas entre si sob condições convencionais de "alta estringência". As condições convencionais de estringência são descritas por Sambrook et al., 1989, e por Haymes et al., In: Ácido nucleico Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985), Partidas de complementaridade complete são, portanto, per- missíveis, considerando-se que tais partidas não impedem completamente a capacidade das moléculas formarem uma estrutura de fita dupla. De modo a um ácido nucleico servir como um iniciador ou sonda, ele necessita somente ser suficientemente complementar na sequência para ser capaz de formar uma estrutura de fita dupla sob o solvente particular e concentrações de sal empregadas.
[0063] Conforme aqui usado, uma "sequência substancialmente ho móloga" é uma sequência de ácido nucleico que hibridizará especificamente ao complemento da sequência de ácido nucleico ao qual ela está sendo comparada sob condições de alta estringência. Condições de es- tringência apropriadas que promovem hibridização de DNA, por exemplo, 6,0 x de cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido por uma lavagem de 2,0 x SSC a 50°C, são conhecidas àqueles técnicos no assunto, ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma baixa estringência de cerca de 2,0 x SSC a 50°C a uma alta estringência de cerca de 0,2 x SSC a 50°C. Em adição, a tempera-tura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições de baixa estringência à temperatura ambiente, cerca de 22°C, a condições de alta estringência a cerca de 65°C. Ambos temperatura e sal podem ser variados, ou qualquer temperatura ou a concentração de sal podem ser mantidas constantes enquanto a outra variável é mudada. Em uma concretização preferida, um ácido nucleico da presente invenção hibridizará especificamente a uma um mais das moléculas de ácido nucleico colocadas em SEQ ID NO:1 e 2 ou complementos destas ou fragmentos de quaisquer ou sob condições moderadamente estringentes, por exemplo, a cerca de 2,0 x SSC e cerca de 65°C. Em uma concretização particularmente preferida, um ácido nucleico da presente invenção hi- bridizará especificamente a uma ou mais das moléculas de ácido nu- cleico colocadas em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou complementos ou fragmentos sob condições de alta estringência. Em um aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora preferida da presente invenção tem a sequência de ácido nucleico colocada em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou complementos destas ou fragmentos. Em outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora preferida da presente invenção compartilha 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% e 100% de identidade de se-quência com a sequência de ácido nucleico colocada em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou complemento destas ou fragmentos. Em um aspecto adicional da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora preferida da presente invenção compartilha 95% 96%, 97%, 98%, 99% e 100% de identidade de sequência com a sequência colocada em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou complemento destas ou fragmentos. SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 podem ser usadas como marcadores em métodos de geração de planta para identificar a progênie de cruzamentos genéticos similares aos métodos descritos para análise de marcador de DNA de repetição de sequência simples, em "marcadores de DNA: Protocolos, aplicações e resumos: (1997) 173-185, Cregan, et al., eds., Wiley-Liss NY"; todos dos quais são aqui incorporados por referência. A hibridização da sonda da molécula de DNA alvo pode ser detectada por qualquer número de métodos conhecidos àqueles técnicos no assunto, estes podem incluir, mas não estão limitados a, etiquetas fluorescentes, etiquetas radioativas, etiquetas baseadas em anticorpo, e etiquetas qui- miluminescentes.
[0064] Com relação à amplificação de uma sequência de ácido nu- cleico alvo (por exemplo, por PCR) usando um par de iniciador de amplificação particular, "condições estringentes" são condições que permitem que o iniciador hibridize somente para a sequência de ácido nu- cleico a qual um iniciador tendo a sequência tipo selvagem correspondente (ou seu complemento) se ligaria e preferivelmente para produzir um produto de amplificação único, o amplicon, em uma reação de amplificação térmica de DNA.
[0065] O termo "específico para (uma sequência-alvo)" indica que uma sonda ou iniciador hibridiza sob condições de hibridização estrin- gentes somente para sequência-alvo em uma amostra compreendendo a sequência-alvo.
[0066] Conforme aqui usado, "DNA amplificado" ou "amplicon" se referem ao produto de amplificação de ácido nucleico de uma sequência de ácido nucléico-alvo que é parte de um gabarito de ácido nucleico. Por exemplo, para determinar se a planta de soja resultante de um cruzamento sexual contém DNA genômico de evento transgênico a partir da planta de soja da presente invenção, DNA extraído de uma amostra de tecido de planta de soja pode ser submetido a método de amplificação de ácido nucleico usando um par de iniciador que inclui um iniciador derivado de sequência de flanqueamento no genoma da planta adjacente ao local de inserção do DNA heterólogo inserido, e um segundo iniciador derivado a partir do DNA heterólogo inserido para produzir um amplicon que é diagnóstico para a presença do evento de DNA. O amplicon é de um comprimento e tem uma sequência que é também diagnóstica para o evento. O amplicon pode variar em comprimento a partir do comprimento combinado dos pares de iniciador mais um par de base de nucleotídeo, preferivelmente mais cerca de cinquenta pares de base de nucleotídeo, mais preferivelmente mais cerca de duzentos e cinquenta pares de base de nucleotídeo, e ainda mais preferivelmente mais cerca de quatrocentos e cinquenta pares de base de nucleotídeo. Alter-nativamente, um par de iniciador pode ser derivado de sequência de flanqueamento em ambos os lados do DNA inserido de modo a produzir um amplicon que inclui a sequência de nucleotídeo de inserto total. Um membro de um par de iniciador derivado a partir da sequência genômica de planta pode estar localizado a uma distância a partir da molécula de DNA inserida, esta distância pode variar de um par de base de nucleo- tídeo até cerca de vinte mil pares de base de nucleotídeo. O uso do termo "amplicon" especificamente exclui dímeros de iniciador que podem ser formados na reação de amplificação térmica de DNA.
[0067] A amplificação de ácido nucleico pode ser acompanhada por qualquer um dos vários métodos de amplificação de ácido nucleico conhecidos àqueles técnicos no assunto, incluindo a reação de cadeia de polimerase (PCR). Uma variedade de métodos de amplificação é conhecida na técnica e são descritas, inter alia, nas Patentes dos Estados Unidos Nos 4,683,195 e 4,683,202 e em PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic Press, San Diego, 1990. Os métodos de amplificação de PCR foram desenvolvidos para amplificar até 22 kb de DNA genômico e até 42 kb de DNA de bacterió- fago (Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699, 1994). Estes métodos, bem como outros métodos conhecidos na técnica de amplificação de DNA podem ser usados na prática da presente invenção. A sequência do inserto de DNA heterólogo ou sequência de flanquea- mento do evento de soja MON87701 com amostras de semente depositadas como ATCC PTA-8194 pode ser verificada (e corrigida se necessário) por amplificação de tais sequências a partir do evento usando iniciadores derivados a partir das sequências aqui providas seguido por sequenciamento de DNA padrão do amplicon de PCR ou do DNA clo- nado.
[0068] O amplicon produzido por estes métodos pode ser detectado por uma pluralidade de técnicas. Tal método é Genetic Bit Analysis (Nikiforov, et al. Acido nucleic Res. 22:4167-4175, 1994), onde um oligonucleotídeo de DNA é designado que sobrepõe ambas as sequências de DNA genômica de flanqueamento adjacente e a sequência de DNA inserida. O oligonucleotídeo é imobilizado em cavidades de uma placa de microcavidade. Em seguida ao PCR da região de interesse (usando um iniciador na sequência inserida e um na sequência genô- mica de flanqueamento adjacente), produto de PCR de fita simples pode ser hibridizado ao oligonucleotídeo imobilizado e serve como um gabarito para uma reação de extensão de base simples usando uma polime- rase de DNA e dNTPs etiquetados específicos para a próxima base esperada. A leitura pode ser de base fluorescente ou ELISA. Um sinal indica presença da sequência de inserto/flanqueamento decido a amplifi-cação bem-sucedida, hibridização, e extensão de base simples.
[0069] Outro método é a técnica de Pirossequenciamento conforme descrita por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). Neste método, um oligonucleotídeo é designado que sobrepõe o DNA genômico adjacente e junção de DNA de inserto. O oligonucleotídeo é hibridizado a produto de PCR de fita simples a partir da região de interesse (um iniciador na sequência inserida e uma na sequência genômica de flan- queamento) e incubado na presença de uma polimerase de DNA, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5' fosfosulfato e luciferin. dNTPs são adicionados individualmente e a incorporação resulta em um sinal de luz que é medido. Um sinal de luz indica a presença da sequência de inserto transgene/de flanqueamento devido à amplificação bem- sucedida, hibridização, e extensão de base simples e multibase.
[0070] Polarização de Fluorescência conforme descrito por Chen, et al., (Genome Res. 9:492-498, 1999) é um método que pode ser usado para detectar o amplicon da presente invenção. Usando-se este método um oligonucleotídeo é designado que sobrepõe a junção de flanquea- mento genômica e de DNA inserido. O oligonucleotídeo é hibridizado para produto de PCR de fita única a partir da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um iniciador na sequência de DNA genô- mica de flanqueamento) e incubado na presença de uma polimerase de DNA e um ddNTP etiquetado fluorescente. A extensão de base simples resulta na incorporação do ddNTP. A incorporação pode ser medida como uma mudança na polarização usando um fluorômetro. Uma mudança na polarização indica a presença da sequência de inserto de transgene/de flanqueamento devido à amplificação bem-sucedida, hibri- dização, e extensão de base simples.
[0071] TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) é des crito como um método de detecção e quantificação da presença de uma sequência de DNA e é totalmente compreendido nas instruções providas por um fabricante. Brevemente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é designada que sobrepõe a junção de flanqueamento genômica e junção de DNA de inserto. A onda FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserto e um na sequência genômica de flanqueamento) são ciclizados na presença de uma polimerase ter- moestável e dNTPs. A hibridização da sonda FRET resulta em clivagem e liberação da porção fluorescente fora da porção de extinção na sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de flan- queamento/de inserto transgene devido à amplificação bem-sucedida e hibridização.
[0072] Sinais moleculares foram descritos para uso na detecção de sequência conforme descrito em Tyangi, et al. (Nature Biotech.14:303- 308, 1996). Brevemente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é designada que sobrepõe a junção genômica de flanqueamento e junção de DNA de inserto. A estrutura única da sonda FRET resulta em ela conter estrutura secundária que mantém as porções fluorescentes e porções de extinção em proximidade. A sonda FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserto e um iniciador na sequência genômica de flanqueamento) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Em seguida a amplificação de PCR bem-sucedida, hibridização da sonda FRET à sequência-alvo resulta na remoção da estrutura secundária de sonda e separação espacial das porções fluorescentes e de extinção que, por sua vez, resulta na produção de um sinal fluorescente. O sinal fluorescente indica a presença da sequência de flanqueamento/de inserto transgene devido à amplificação bem-sucedida e hibridização.
[0073] Outros métodos descritos, tais como, microfluídicos (Publi cação de Patente dos Estados Unidos 2006068398, Patente dos Estados Unidos No 6,544,734) proporcionam métodos e dispositivos para separar e amplificar amostras de DNA. Corantes óticos usados para detectar e quantificar moléculas de DNA específicas (WO/05017181). Dispositivos de nanotubo (WO/06024023) que compreendem um sensor eletrônico para a detecção de moléculas de DNA ou nanogotas que se ligam a moléculas de DNA específicas e podem, em seguida, ser detectadas.
[0074] Kits de detecção de DNA podem ser desenvolvidos usando- se as composições aqui reveladas e os métodos bem conhecidos na técnica de detecção de DNA. Os kits são úteis para a identificação de DNA de evento de soja MON87701 em uma amostra e podem ser aplicados a métodos para geração de plantas de soja contendo o evento de DNA apropriado. Os kits podem conter iniciadores de DNA ou sondas que são homólogas ou complementares a SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6, ou iniciadores de DNA ou sondas homólogas ou complementares a sequência de DNA dos elementos genéticos contidos no inserto transgene. Estas sequências de DNA podem ser usadas como iniciadores em reações de amplificação de DNA ou as sondas em um método de hibridização de DNA. As sequências do DNA genômico e elementos genéticos transgenes contidos no genoma de soja de MON87701, conforme ilustrado na Figura 2, consiste em uma porção da região de borda direita (RB) de Agrobacterium tumefaciens, uma sequência promotora derivada do gene de subunidade pequena de Arabidopsis ribulose 1,5- bisfosfato carboxilase (aqui referida como P-RbcS4 localizado em posições 155 a 1850 na SEQ ID NO:5) é operavelmente ligada a uma sequência condutora não-transladada derivada do gene de subunidade pequena de Arabidopsis ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase (aqui referida como L-RbcS4 localizada nas posições 1851 a 1877 na SEQ ID NO:5) operavelmente conectada a sequência de codificação de toxina de inseto, TIC107, que é compreendida de um peptídeo de trânsito de cloroplasto derivado de sequência de peptídeo de trânsito do gene de subunidade pequena de Arabidopsis ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase e uma toxina de inseto derivada de Cry1Ac (aqui referida como TIC107 localizada nas posições 1889 a 2141 para o peptídeo de trânsito e po-sições 2142 a 5678 para a sequência de codificação de toxina, respec-tivamente em SEQ ID NO:5) e é operavelmente conectada a uma região de terminação 3' derivada do gene de proteína de armazenamento Gli- cina máx 7S alfa' beta conglicinina (aqui referido como T-Sphas localizado em posições 5688 a 6126 em SEQ ID NO:5) e uma porção da região de borda esquerda (LB) de Agrobacterium tumefaciens. Moléculas de DNA úteis como iniciadores em métodos de amplificação de DNA podem ser derivadas a partir das sequências dos elementos genéticos do inserto transgene contido no evento MON87701. Estas moléculas de iniciador podem ser usadas como parte de um iniciador ajustado que também inclui uma molécula de iniciador de DNA derivada do genoma que flanqueia o inserto transgene de evento MON87701 conforme apresentado em SEQ ID NO:3 de bases 1 a 5747 e SEQ ID NO:4 de bases 389 a 2611.
[0075] A planta de soja MON87701 foi produzida por um processo de transformação mediado por Agrobacterium de uma linhagem de soja endogâmica com o construto de plasmídeo pMON53570 (conforme mostrado na Figura 1). O método de transformação usado é similar àquele descrito na Patente dos Estados Unidos 5,914,451. O construto de plasmídeo pMON53570 contém os cassetes de expressão de planta ligados com os elementos genéticos regulatórios necessários para expressão da proteína de TIC107 em células de planta de soja. Células de soja foram regeneradas nas plantas de soja intactas e plantas individuais foram selecionadas a partir da população de plantas que mostram integridade dos cassetes de expressão de planta e resistência a dano de alimentação de larvas de inseto, bem como uma perda do cassete de seleção de resistência a glifosato não-ligado. Uma planta de soja que contém em seu genoma os cassetes de expressão de planta ligados de pMON53570 é um aspecto da presente invenção.
[0076] O DNA de plasmídeo inserido no genoma de planta de soja MON87701 foi caracterizado por análise molecular detalhada. Estas análises incluem: o número de inserto (número de locais de integração dentro do genoma de soja), o número de cópia (o número de cópias do T-DNA dentro de um local), e a integridade dos cassetes de gene inseridos. As sondas moleculares de DNA foram usadas que incluem a região de codificação de TIC107 intacta e seus respectivos elementos re- gulatórios, os promotores, íntrons, e sequências de polialdenilação dos cassetes de expressão de planta, e a região de DNA de suporte de pMON53570 de plasmídeo. Os dados mostram que MON87701 contém uma inserção de T-DNA simples com uma cópia do cassete de expressão TIC107. Nenhum elemento adicional a partir do vetor de transformação pMON53570, ligado ou não-ligado a cassetes de gene intactos, foram detectados no genoma de MON87701. Finalmente, análises de PCR Inverso e sequência de DNA foram realizadas para determinar as junções de genoma de inserto para planta 5' e 3', confirmam a organização dos elementos dentro do inserto (Figura 2), e determinam a sequência de DNA completa do inserto na planta de soja MON87701 (SEQ ID NO:5).
[0077] A presente invenção é direcionada a uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ou complemento destas. A molécula de DNA preferivelmente compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, ou complemento destas. Ainda preferivelmente, a molécula de DNA consiste essencialmente da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:3 das posições 1 a 5757, a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:5 das posições 1 a 6426, e a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:4 das posições 379 a 2611, ou complemento destas, ou essencialmente da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:6, ou complemento desta.
[0078] A presente invenção é também direcionada a uma planta de soja, ou partes desta, ou semente que compreende a molécula de DNA.
[0079] Uma composição derivada da planta de soja, ou partes desta, da presente invenção é também provida. Tal composição compreende uma quantidade detectável da molécula de DNA e é um produto de base selecionado de farelo de soja, farinha de soja, concentrado de proteína de soja, isolados de proteína de soja, concentrado de proteína de soja texturizado, proteína de soja hidrolisada, óleo de soja e polpa batida.
[0080] A presente invenção é adicionalmente direcionada a um mé todo de produção de uma planta de soja resistente a inseto. Este método compreende: (a) cruzamento da planta de soja de MON87701 com outra planta de soja; (b) obtenção de pelo menos uma planta de progê- nie derivada do cruzamento de (a); e (c) seleção de progênie que compreende sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2. A referida seleção inclui submeter a pelo menos uma planta de progênie obtida de (b) a uma reação de amplificação de ácido nucleico, no qual progênie que produz um amplicon compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:6 é selecionada, ou submetendo a pelo menos uma planta de progênie obtida de (b) a uma reação de hibridização de ácido nucleico, no qual progênie hibridiza a uma sonda que hibridiza sob condições estringentes com uma ou mais sequências de DNA selecionada de SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 é selecionada. A progênie assim selecionada é uma planta de soja resistente a inseto.
[0081] A presente invenção é ainda adicionalmente direcionada a um método para proteção de uma planta de soja de infestação de inseto. Este método compreende provisão na dieta de uma peste Lepidopteran de soja de uma quantidade inseticidamente eficaz de célula(s) ou te- cido(s) da planta de soja MON87701. A peste Lepidopteran é selecionada a partir do grupo consistindo em Anticarsia, Pseudoplusia, Epino- tia, Spilosoma, Helicoverpa, Spodoptera e Rachiplusia.
[0082] Ainda adicionalmente provido na presente invenção é um par de moléculas de DNA compreendendo uma primeira molécula de DNA e uma segunda molécula de DNA, no qual as moléculas de DNA são de comprimento suficiente de nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:5, ou seu complemento; ou SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:5, ou seu complemento; ou SEQ ID NO:6, ou seu complemento; para funcionar como iniciadores de DNA ou sondas diagnósticas para DNA extraído de planta de soja MON87701 ou progênie desta.
[0083] Por exemplo, a primeira molécula de DNA do par compre ende 11 ou mais nucleotídeos contíguos de qualquer porção da região transgene de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:5, ou complemento deste, e a segunda molécula de DNA do par compreende um comprimento similar de uma região de DNA genômico de flanqueamento 5' de SEQ ID NO:3, ou complemento desta. Um exemplo específico é que a primeira molécula de DNA compreende SEQ ID NO:9 e a segunda molécula de DNA compreende SEQ ID NO:10.
[0084] Outro exemplo é que a primeira molécula de DNA do par compreende 11 ou mais nucleotídeos contíguos de qualquer porção da região transgene de SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:5, ou complemento destas, e a segunda molécula de DNA do par compreende um comprimento similar de uma região de DNA genômico de soja de flanquea- mento 3' de SEQ ID NO:4, ou complemento deste. Um exemplo específico é que a primeira molécula de DNA compreende SEQ ID NO:12 e a segunda molécula de DNA compreende SEQ ID NO:13.
[0085] A presente invenção é adicionalmente direcionada a um mé todo de detecção da presença de uma molécula de DNA selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6 em uma amostra biológica. Este método compreende: (a) contactar a amostra biológica com um par de iniciador de DNA compreendendo moléculas de iniciador de DNA de comprimento suficiente de nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:3, ou seu complemento, SEQ ID NO:4, ou seu complemento, SEQ ID NO:5, ou seu complemento, ou SEQ ID NO:6, ou seu complemento, para funcionar como iniciadores de DNA ou sondas diagnósticas para DNA extraído de planta de soja MON87701 ou progênie desta; (b) provisão de uma condição de reação de amplificação de ácido nucleico; (c) realização da reação de amplificação de ácido nucleico, produzindo, desse modo, uma molécula de amplicon de DNA; e (d) detecção da molécula de amplicon de DNA assim produzida. A detecção de um amplicon compreendendo pelo menos uma de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 e complemento destas é indicativa da presença da molécula de DNA na amostra biológica.
[0086] A amostra biológica pode compreender qualquer material or gânico derivado de células ou tecido de soja, incluindo caules, raízes, folhas, flores ou partes de flor, semente ou vagens de semente, e similares, que contêm uma quantidade detectável de uma sequência de nu- cleotídeo correspondente a tal material orgânico. Uma amostra biológica derivada de evento de soja MON87701 compreende as regiões de inserção de transgene/genoma da presente invenção, e particularmente aquelas colocadas na Listagem de Sequência conforme mostrada em SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6, e os complementos destas. Por exemplo, a amostra biológica adequada para a presente invenção pode ser farelo de soja, farinha de soja, concentrado de proteína de soja, isolados de proteína de soja, concentrado de proteína de soja texturizado, proteína de soja hidrolizada e polpa batida. A amostra sendo testada pode ser uma amostra de DNA extraída de uma planta de soja.
[0087] A presente invenção é ainda adicionalmente direcionada a um método de detecção da presença de uma molécula de DNA selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6 em uma amostra biológica. Tal método compreende: (a) contactar a amostra biológica com uma sonda de DNA que hibridiza sob condições estringentes com referida molécula de DNA, e não hibridiza sob as condições estringentes com uma amostra biológica não contendo a molécula de DNA; (b) sujeição da amostra biológica e sonda de DNA a condições de hibridização estringentes; e (c) detecção da hibridização da sonda de DNA à amostra biológica. A detecção de hibridização é indicativa da presença da molécula de DNA na amostra biológica. Por exemplo, a amostra biológica sendo testada pode ser uma amostra de DNA extraída de uma planta de soja.
[0088] As sondas usadas no método de detecção acima podem compreender SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2, ou complemento destas, ou compreendem SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:15. Exemplos específicos de tal sonda inclui SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:15. Tal sonda pode adicionalmente ser etiquetada com pelo menos um fluoróforo.
[0089] A presente invenção é ainda adicionalmente direcionada a um kit de detecção de DNA compreendendo: pelo menos uma molécula de DNA de comprimento suficiente de nucleotídeos contíguos homólogos ou complementares a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, ou SEQ ID NO:6 para funcionar como um iniciador de DNA ou sonda específica para evento de soja MON87701 e/ou sua progênie. A pelo menos uma molécula de DNA pode compreender SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ou complemento destas. Um exemplo específico de tal molécula de DNA é SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ou complemento destas.
[0090] A presente invenção é ainda adicionalmente direcionada a um método de determinação da zigosidade de DNA de um genoma de planta de soja compreendendo evento de soja MON87701 em uma amostra de soja. Este método compreende: (a) contactar a amostra com um primeiro par de iniciador de SEQ ID NO:12 e SEQ ID NO:13, que, quando usado junto em uma reação de amplificação de ácido nucleico com evento de soja MON87701 DNA, produz um amplicon que é diagnóstico para evento de soja MON87701; (b) realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico; (c) detecção de um primeiro amplicon assim produzido; (d) contato da amostra com um segundo par de iniciador de SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14, que, quando usado junto em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA genômico de soja outro do que DNA de evento de soja MON87701 DNA, produz um amplicon que é diagnóstico para DNA genômico de soja outro do que DNA de evento de soja MON87701; (e) realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico; e (f) detecção de um segundo amplicon assim produzido. A detecção de ambos o amplicon que é diagnóstico para evento de soja MON87701 e o amplicon que é diagnóstico para DNA genômico de soja outro do que DNA de evento de soja MON87701 que a amostra é heterozigota para DNA de evento de soja MON87701. Preferivelmente, o primeiro par de iniciador é adicionalmente usado junto com sonda de SEQ ID NO:15, e/ou o Segundo par de iniciador é adicionalmente usado com sonda de SEQ ID NO:16.
[0091] Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar exem plos de certas concretizações preferidas da invenção. Deve ser apreciado por aqueles técnicos no assunto que as técnicas reveladas nos exemplos que se seguem representam aproximações que os inventores verificaram funcionarem bem na prática da invenção, e, desse modo, podem ser considerados constituírem exemplos de modos preferidos para sua prática. Contudo, aqueles técnicos no assunto devem, à luz da presente descrição, apreciarem que muitas mudanças podem ser feitas nas concretizações específicas que são reveladas e ainda obtêm um resultado similar sem fugir do espírito e escopo da invenção.
[0092] A planta de soja MON87701 transgênica foi gerada por uma transformação mediada por Agrobacterium de células de soja com um fragmento de DNA derivado de pMON53570 (Figura 1). O vetor de transformação de planta binário, pMON53570, contém dois cassetes de transformação de planta ou T-DNAs. Cada cassete é flanqueado por sequências de borda direita e esquerda nas extremidades 5' e 3' do cassete de transformação, respectivamente. Um cassetete de expressão, apresentado como SEQ ID NO:7, é usado para a expressão de uma toxina de inseto. O cassete de expressão é compreendido de um promotor e sequência condutora derivada a partir do gene de subunidade pequena de Arabidopsis ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase (P-RbcS4, Krebbers et al., (1988) Plant Mol. Biol. 11: 745-759) que é clonado diretamente a montante da sequência de codificação de toxina de inseto, TIC107, que, por sua vez, é clonado diretamente a montante de uma sequência terminadora derivada a partir do gene de proteína de armazenamento Glicina máx 7S alfa' beta conglicinin (T-Sphas, ver, por exemplo, Schuler et al., (1982) Acid nucleics Res. 10: 8225-8244). A sequência de codificação de toxina de inseto, TIC107, é apresentada como SEQ ID NO:8. A sequência de ácido nucleico colocada como SEQ ID NO:8 é uma sequência sintética ou artificial que codifica uma toxina inseticida derivada de Cry1Ac (Patente dos Estados Unidos 5,880,275) com uma sequência de codificação de peptídeo de trânsito de cloro- plasto derivada a partir do gene de subunidade pequena de Arabidopsis ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase clonado diretamente a montante da sequência de codificação de toxina de inseto.
[0093] O vetor de transformação de planta, pMON53570, foi mobili zado em cepa desarmada de Agrobacterium tumefaciens ABI por ele- troporação e selecionado em espectinomicina e cloramfenicol. Explantes de variedade de soja Asgrow A5547 foram transformados com pMON53570 usando um método similar àquele descrito na Patente dos Estados Unidos 5,914,451. Explantes de soja e A. tumefaciens induzido contendo pMON53570 foram misturados dentro de 14 horas a partir do tempo de iniciação de germinação de semente e ferimento por sonica- ção. Em seguida ao ferimento, os explantes foram colocados na cultura por dois a cinco dias após o qual, eles foram transferidos para meio de seleção contendo glifosato para seleção de célula de planta transformada e antibióticos.
[0094] A seleção e formação de brotos transgênicos foram permiti das proceder por seis a oito semanas. O desenvolvimento de brotos foi amostrado e ensaiado por PCR para a presença do cassete TIC107 usando-se iniciadores baseados na sequência de cassete de expressão TIC107. Aproximadamente eventos de 100-R0 transformação foram produzidos e testados para a presença de uma cópia simples do cassete transgene. Análise de Southern usada como uma primeira classificação de passagem empregou uma endonuclease de restrição que cliva o cassete de expressão uma vez. Um local simples de EcoRV foi inserido imediatamente dentro da borda direita do cassete de expressão. Esta enzima cliva com frequência suficiente no genoma de soja como para genoma conforme usualmente desassocia cópias proximamente ligadas do transgene em eventos de cópia múltiplos. A análise de TAQMAN® foi também realizada para confirmar número de cópia na geração R0 conforme descrito abaixo. Quarenta e dois dos eventos R0 demonstraram uma inserção de cópia simples do cassete transgene e foram permitidas se autopolinizarem para gerar progênie F1. Setenta e cinco plantas F1 foram crescidas de semente de cada dos selecionados quarenta e dois eventos R0. Uma pulverização não-letal de glifosato foi aplicada no todo da progênie F1. Aquela progênie F1 em que o cassete de resistência à glifosato foi não-ligada, tornou-se amarela demonstrando a ausência do cassete de seleção de glifosato. Cento e cinquenta plantas foram identificadas como eventos não-ligados. Cento e cinquenta plantas F1 foram permitidas recuperar a partir da aplicação de glifosato e em seguida testada para resistência a inseto para alimentação contra Anitcarsia gem- matalis e Pseudoplusia includens em estágios de crescimento R1 e R7. Todos os eventos passam o critério de bioensaio de menos do que 10% de alimentação contra Anitcarsia e Pseudoplusia.
[0095] Análise de Southern foi realizada em cento e cinquenta plan tas F1 selecionadas para confirmar a presença do cassete de expressão e ausência de sequências de nucleotídeo indesejadas a partir do vetor de transformação. Doze eventos foram selecionados a partir da reunião de cento e quinze como os eventos mais adequados para avaliação adicional de F1 de número de cópia por análise de Southern. TAQMAN® e ensaios de zigosidade foram também realizados nos eventos de F1 selecionados conforme descrito abaixo. Fora dos doze eventos de F1 selecionados, nove demonstraram por análise de Southern preliminar uma cópia simples do cassete de expressão de toxina. Várias linhagens a partir dos nove eventos foram conduzidas por avanço para a geração F2 e F3 para ensaios de inseto adicionais e caracterização genética. Somente uma planta de F1 simples de cada linhagem foi selecionada para gerar semente para gerações sucessivas.
[0096] Na geração de F3, uma análise de Southern mais detalhada foi realizada em quatro linhagens selecionadas para construir um mapa de enzima de restrição mais detalhado do cassete de expressão inserido. Fora dos nove eventos, um evento foi completamente livre de suporte, o cassete de resistência a glifosato e a origem de plasmídeo de replicação. Este evento foi mais tarde descoberto para ter dois cassetes de expressão de toxina de inseto não-ligados e ocorrem em várias linhagens de progênie. Uma linhagem de progênie também designada evento MON87701 foi selecionada na geração de F3 após suas características de desempenho e caracterização molecular. Sequência de flanqueamento foi gerada para cada das linhagens de geração de F3 selecionadas usando PCR inverso conforme descrito abaixo. A seleção de evento R0 e análise de zigosidade de F1 foram realizadas conforme descrito abaixo usando sequências deduzidas através de PCR inverso das linhagens transformadas e tipo selvagem.
[0097] Sequências que flanqueiam a inserção de T-DNA em MON87701 foram determinadas usando-se PCR inverso conforme descrito em Ochman et al., 1990 (PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc.). O DNA genômico de planta foi isolado de ambos Asgrow A5547 e as linhagens transgênicas de crescimento de tecido sob condições de alojamento verdes para análise de Southern e TAQMAN®. Aproximadamente 1 grama de tecido de folha de trifoliato jovem foi combinado com nitrogênio líquido e moído a um pó fino usando um pilão. O DNA foi extraído usando um kit de extração de DNA de Nucleon Plant (RPN8511, Amersham, Piscataway, NJ) de acordo com as instruções do protocolo do fabricante. Após a etapa de precipitação final, DNAs foram ressuspensos em 0,5 ml de TE (10 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1 mM de EDTA). Este método pode ser modificado por um técnico no assunto para extrair DNA de qualquer tecido de soja, incluindo, mas não limitado a, semente.
[0098] Uma alíquota de DNA foi digerida com endonucleases de restrição selecionadas sob análise de restrição do T-DNA. Após autoli- gação de fragmentos de restrição, PCR foi realizado usando iniciadores designados de sequência de T-DNA que amplificaria sequências que se estendem para fora a partir das extremidades 5' e 3' do T-DNA. Os produtos de PCR foram separados por eletroforese de gel de agarose e purificados usando um kit de purificação de gel de QIAGEN (Qiagen, Valencia, CA). Os produtos subsequentes foram sequenciados diretamente usando-se protocolos de sequenciamento padrão. A sequência de flanqueamento 5' que se estendem na sequência de borda direita do cassete de expressão TIC107 T-DNA é apresentada como SEQ ID NO:3 ([C], ver Figura 2). A sequência de flanqueamento 3' que se estende na sequência de borda esquerda do cassete de expressão TIC107 T-DNA é apresentada como SEQ ID NO:4 ([D], ver Figura 2). A porção do DNA de cassete de expressão TIC107 (SEQ ID NO:7) que foi totalmente integrada no DNA genômico A5547 é apresentada como SEQ ID NO:5 ([E], ver Figura 2).
[0099] As sequências isoladas foram comparadas a sequência de T-DNA para identificar a sequência de flanqueamento e o fragmento de T-DNA coisolado. A confirmação da presença do cassete de expressão foi alcançada por PCR com iniciadores designados baseados nos dados de sequência de flanqueamento deduzida e a sequência de T-DNA conhecida. A sequência tipo selvagem A5547 correspondente a mesma região na qual o T-DNA foi integrado na linhagem transformada foi isolada usando iniciadores designados a partir das sequências de flanque- amento em MON87701. As reações de PCR foram realizadas usando o sistema de amplificação Elongase (Invitrogen, Carlsbad, CA). As sequências de flanqueamento MON87701 e a sequência tipo selvagem A5547 foram analisadas contra nucleotídeo múltiplo e bases de dados de proteína. Esta informação foi usada para examinar o relacionamento do transgene para o genoma de planta e para olhar a integridade do local de inserção. A sequência de flanqueamento e sequências tipo selvagem foram usadas para designar iniciadores para ensaios de ponto terminal TAQMAN® usados para identificar os eventos e determinar zi- gosidade conforme descrito no exemplo 3.
[00100] Os métodos usados para identificar evento MON87701 em uma amostra são descritos em um TAQMAN® PCR de ponto terminal de evento específico para qual exemplos de condições são descritos na Tabela 1 e Tabela 2. Os iniciadores de DNA usados no ensaio de ponto terminal são iniciadores SQ1135 (SEQ ID NO:9), SQ1136 (SEQ ID NO:10) e 6FAM® iniciador etiquetado PB63 (SEQ ID NO:11). 6FAM® é um produto corante fluorescente de Applied Biosystems (Foster City, CA) fixado ao iniciador de DNA. Para sondas TAQMAN® MGB, a atividade de 5'exonuclease de Taq DNA polimerase cliva a sonda a partir da extremidade 5', entre o fluoróforo e extintor. Quando hibridizados ao fita de DNA alvo, extintor e fluoróforo são separados bastante para produzir um sinal fluorescente, liberando, desse modo, fluorescência.
[00101] SQ1135 (SEQ ID NO:9) e SQ1136 (SEQ ID NO:10) quando usados nestes métodos de reação com PB63 (SEQ ID NO:11) produzem um amplicon de DNA que é diagnóstico para evento de DNA de MON87701. Os controles para esta análise devem incluir um controle positivo de soja contendo evento de DNA de MON87701, um controle negativo de soja não-transgênica e um controle negativo que não contém DNA gabarito.
[00102] Estes ensaios são otimizados para uso com um Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 ou Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, ou termociclizador Eppendorf Mastercycler Gradient. Outros métodos e aparelhos conhecidos àqueles técnicos no assunto que produzem amplicons que identificam o evento de DNA de MON87701 está dentro da técnica conhecida.
[00103] Proceder com a amplificação de DNA em um Stratagene Ro- bocycler, ou MJ Engine, ou Perkin-Elmer 9700, ou termociclizador Ep- pendorf Mastercycler Gradient ou Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 ou ciclizador térmico MJ Research DNA Engine PTC-225 usando os seguintes parâmetros de ciclização. Quando se opera o PCR em Eppendorf Mastercycler Gradient ou MJ Engine, o termociclizador deve ser operado no modo calculado. Quando se opera o PCR no Perkin-Elmer 9700, a operação do termociclizador com a velocidade de rampa ajustada a um máximo. Tabela 1. TAQMAN® PCR de Ponto terminal de Evento Específico de Soja MON87701
Tabela 2. Condições de termociclizador de TAQMAN® de ponto terminal
[00104] Plantas R0 demonstrando a presença do cassete de expressão de TIC107 foram permitidas se desenvolverem em plantas totalmente maduras. As plantas R0 foram avaliadas para a ocorrência de ligação entre o cassete de expressão de TIC107 e o cassete de expressão de resistência a glifosato usando análise de Southern com uma enzima de restrição de DNA conhecida para não cortar em ambos os cassetes e a região entre cada cassete no plasmídeo, PacI. Sondas designadas baseadas nas sequências do cassete de resistência à glifosato, o cassete de TIC107 e a origem da replicação (OU-Ec.oriV-RK2) que reside entre os dois cassetes de expressão em pMON53570 foram usados para manchas de Southern de sonda para determinar ligação. As plantas R0 foram também avaliadas para um número de cópia do cassete de expressão de TIC107 usando uma combinação de análise de Southern e TAQMAN® de ponto terminal. As plantas R0 que demonstram um relacionamento não-ligado entre o cassete de resistência de Glifosato e o cassete de expressão de TIC107 foram permitidas autopo- lizarem e produzirem progênie de F1.
[00105] As plantas F1 foram ensaiadas para a ausência do cassete de resistência a glifosato devido à segregação que ocorre na população de F1 de eventos transformados de R0 autopolinizados não-ligados. Uma aplicação não-letal de glifosato foi aplicada aos F1 individuais. Aquelas plantas em que a resistência de cassete foi perdida devido à segregação demonstra dano a partir da aplicação de glifosato. Estas plantas foram permitidas recuperarem e desenvolverem-se normalmente. Ensaios de zigosidade para o cassete de expressão de TIC107 foram realizados nas plantas de F1 usando um ensaio de ponto terminal TAQMAN® conforme descrito abaixo.
[00106] Os métodos usados para determinar zigosidade para evento MON87701 em uma amostra são descritos em um evento específico de zigosidade de TAQMAN PCR de ponto terminal para qual exemplos de condições são descritos na Tabela 3 e Tabela 4. Os iniciadores de DNA usados no ensaio de zigosidade são iniciadores SQ3443 (SEQ ID NO:12), SQ3445 (SEQ ID NO:13), SQ3446 (SEQ ID NO:14), 6FAM®- iniciador etiquetado PB1111 (SEQ ID NO:15) e VIC®-iniciador etiquetado PB1112 (SEQ ID NO:16). 6FAM® e VIC® são produtos de corante fluorescente de Applied Biosystems (Foster City, CA) fixados aos iniciadores de DNA. Para sondas de TAQMAN MGB, a atividade de 5'exonu- clease de Taq DNA polimerase cliva a sonda a partir da extremidade 5', entre o fluoróforo e extintor. Quando hibridizados à fita de DNA alvo, extintor e fluoróforo são separados bastante para produzir um sinal fluorescente, liberando, desse modo, fluorescência.
[00107] SQ3443 (SEQ ID NO:12) e SQ3445 (SEQ ID NO:13) quando usados nestes métodos de reação com PB1111 (SEQ ID NO:15) produz um amplicon de DNA que é diagnóstico para evento de DNA de MON87701. Os controles para esta análise devem incluir um controle positivo de soja contendo evento de DNA de MON87701, um controle negativo de soja não-transgênica e um controle negativo que não contém DNA de gabarito.
[00108] SQ3445 (SEQ ID NO:13) e SQ3446 (SEQ ID NO:14) quando usados nestes métodos de reação com PB1112 (SEQ ID NO:16) produ-zem um amplicon de DNA que é diagnóstico para o alelo tipo selvagem.
[00109] A heterozigosidade é determinada pela presença de ambos amplicons demonstrada pela liberação de sinal fluorescente de ambas as sondas PB1111 e PB1112.
[00110] Estes ensaios são otimizados para uso com um Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 ou Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, ou termociclizador Eppendorf Mastercycler Gradient. Outros métodos e aparelho conhecidos àqueles técnicos no assunto que produzem amplicons que identificam o evento de DNA de MON87701 estão dentro da técnica conhecida.
[00111] Proceder com a amplificação de DNA em um Stratagene Ro- bocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, ou termociclizador Eppendorf Mastercycler Gradient ou Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 ou ciclizador térmico MJ Research DNA Engine PTC-225 usando os seguintes parâmetros de ciclização. Quando se opera o PCR no Ep- pendorf Mastercycler Gradient ou MJ Engine, o termociclizador deve ser operado no modo calculado. Quando se opera o PCR no Perkin-Elmer 9700, opera-se o termociclizador com a velocidade de rampa ajustada a um máximo. Tabela 3. TAQMAN® PCR de Ponto final de Zigosidade Específica de Evento de Soja MON87701
Tabela 4. Condições de termociclizador de TAQMAN®de Ponto terminal de Zigosidade
[00112] As plantas F1 de evento MON87701 foram também testadas para resistência à Anticarsia e Pseudoplusia. A resistência foi definida como menos do que 10% de alimentação nos estágios de crescimento R1 e R7. A análise de número de cópia foi adicionalmente realizada nos F1 individuais selecionados usando análise de Southern e uma endonuclease de restrição conhecidas para cortar em uma localização simples dentro do cassete de expressão de TIC107, EcoRV. A expressão da proteína de TIC107 na população de F1 foi confirmada usando tiras deteste de proteína (EnviroLogix, Kit QuickStix® para Cry1Ac Cotton Leaf & Seed, Cat. # AS 003, Portland, Maine 04103) seguindo o protocolo do manufaturador. Análise de Southern foi realizada nos eventos selecio-nados na população de F3 para confirmar a presença de um inserto de T-DNA intacto simples. A última seleção de linhagem foi baseada nas características de desempenho no teste de campo, expressão de proteína e caracterização molecular.
[00113] O seguinte exemplo descreve como se pode identificar o evento MON87701 dentro da progênie de qualquer evento de geração usando soja de MON87701.
[00114] Os pares de iniciador de evento são usados para produzir um amplicon diagnóstico para evento de soja MON87701. Um amplicon diagnóstico para MON87701 compreende pelo menos uma sequência de junção, SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2 ([A] e [B], respectivamente conforme ilustrado na Figura 2). SEQ ID NO:1 ([A] da Figura 2) é uma sequência de nucleotídeo correspondente à junção da sequência de flanqueamento 5' (posições 5748 a 5757 de SEQ ID NO:3 [C], ver Figura 2) e a borda direita integrada do cassete de expressão de TIC107 (po-sições 1 a 10 de SEQ ID NO:5 [E], ver figura 2). SEQ ID NO:1 também corresponde às posições 5748 a 5767 da sequência de flanqueamento 5', SEQ ID NO:3 ([C], ver Figura 2). SEQ ID NO:2 ([B], ver Figura 2) é uma sequência de nucleotídeo correspondente à junção da borda esquerda integrada do cassete de expressão de TIC107 (posições 6417 a 6426 de SEQ ID NO:5 [E], ver Figura 2) e a sequência de flanqueamento 3' (posições 379 a 388 de SEQ ID NO:4 [D], ver Figura 2). SEQ ID NO:2 ([C], ver Figura 2) também corresponde às posições 369 a 388 da se-quência de flanqueamento 3', SEQ ID NO:4 ([D], ver Figura 2).
[00115] Pares de iniciador de evento que produzirão um amplicon di-agnóstico para MON87701 inclui pares de iniciador baseados nas se-quências de flanqueamento e o cassete de expressão de TIC107 inserido. Para adquirir um amplicon diagnóstico em que pelo menos 11 nu- cleotídeos de SEQ ID NO:1 são encontrados, designar-se-ia um iniciador de avanço baseado em SEQ ID NO:3 de bases 1 a 5747 e um iniciador reverso baseado no cassete de expressão de TIC107 inserido, SEQ ID NO:5 das posições 10 a 6416. Para adquirir um amplicon diagnóstico em que pelo menos 11 nucleotídeos de SEQ ID NO:2 são encontrados, designar-se-ia um iniciador de avanço baseado no cassete de expressão de TIC107 inserido, SEQ ID NO:5 das posições 10 a 6416 e um iniciador reverso baseado na sequência de flanqueamento 3', SEQ ID NO:4 de bases 389 a 2611. Para propostas práticas, deve-se designar iniciadores que produzem amplicons de uma faixa de tamanho limitada, preferivelmente entre 200 a 1000 bases. Amplicons de tamanhos menores em geral são mais seguramente produzidos em reações de PCR, permitem tempos de ciclo mais curtos, e podem ser facilmente separados e visualizados em géis de agarose ou adaptados para uso em ensaios de ponto terminal similares a TAQMAN®. Em adição, amplicons produzidos usando referidos pares de iniciador podem ser clona- dos em vetores, propagados, isolados e sequenciados, ou podem ser sequenciados diretamente com métodos bem estabelecidos na técnica. Qualquer par de iniciador derivado a partir da combinação de SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:5, ou a combinação de SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5 que são úteis em um método de amplificação de DNA para produzir um amplicon diagnóstico para MON87701 ou progênie deste é um aspecto da presente invenção. Qualquer molécula de iniciador de polinucleotí- deo de DNA isolada compreendendo pelo menos 11 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:3, ou seu complemento que é útil em um método de amplificação de DNA para produzir um amplicon diagnóstico para MON87701 ou progênie deste é um aspecto da presente invenção. Qualquer molécula de iniciador de polinucleotídeo de DNA isolada compreendendo pelo menos 11 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:4, ou seu complemento que é útil em um método de amplificação de DNA para produzir um amplicon diagnóstico para MON87701 ou progênie deste é um aspecto da presente invenção. Qualquer molécula de iniciador de polinucleotídeo de DNA isolada simples compreendendo pelo menos 11 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:5, ou seu complemento que é útil em um método de amplificação de DNA para produzir um amplicon diagnóstico para MON87701 ou progênie desta é um aspecto da presente invenção.
[00116] Um exemplo das condições de amplificação para esta análise é ilustrado na Tabela 5 e Tabela 6. Contudo, qualquer modificação destes métodos ou o uso de iniciadores de DNA homólogos ou comple-mentares a SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 ou sequências de DNA dos elementos genéticos contidos no inserto transgene (SEQ ID NO:5) de MON87701 que produz um amplicon diagnóstico para MON87701, está dentro da técnica. Um amplicon diagnóstico compreende uma molécula de DNA homóloga ou complementar a pelo menos um DNA de junção transgene/genômico (SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2), ou uma porção substancial deste.
[00117] Uma análise para amostra de tecido de planta de evento MON87701 deve incluir um controle de tecido positivo de evento MON87701, um controle negativo de uma planta de soja que não é evento MON87701, por exemplo, mas não limitado a A5547, e um controle negativo que não contém DNA genômico de soja. Um par de iniciador que amplificará uma molécula de soja endógena de DNA servirá como um controle interno para as condições de amplificação de DNA. As sequências de iniciador adicionais podem ser selecionadas de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:5 por aqueles técnicos no assunto de métodos de amplificação de DNA, e condições selecionadas para a produção de um amplicon pelos métodos mostrados na Tabela 5 e Tabela 6 podem diferir, mas resultam em um amplicon diagnóstico para DNA de evento de MON87701. O uso destas sequências de iniciador de DNA com modificações aos métodos da Tabela 5 e Tabela 6 está dentro do escopo da invenção. O amplicon produzido por pelo menos uma sequência de iniciador de DNA derivada de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:5 que é diagnóstica para MON87701 é um aspecto da invenção.
[00118] Kits de detecção de DNA que contêm pelo menos um iniciador de DNA derivado de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:5, que, quando usado em um método de amplificação de DNA, produz um amplicon diagnóstico para MON87701 ou sua progênie é um aspecto da invenção. Uma planta de soja ou semente, no qual seu genoma pro-duzirá um amplicon diagnóstico para MON87701 quando testado em um método de amplificação de DNA é um aspecto da invenção. O ensaio para o amplicon de MON87701 pode ser realizado pelo uso de um Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 ou Stratagene Ro- bocycler, ou MJ Engine, ou Perkin-Elmer 9700, ou termociclizador Ep- pendorf Mastercycler Gradient, ou qualquer outro sistema de amplificação que pode ser usado para produzir um amplicon diagnóstico de MON87701 conforme mostrado na Tabela 6. Tabela 5. Ensaio de PCR Específico de Evento de Soja MON87701
Tabela 6 Condições de Termociclizador de Evento de Soja MON87701
[00119] Um depósito do evento de semente de soja MON87701 revelado acima e recitado nas reivindicações foi efetuado sob o Tratado de Budapeste com o American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110. O número de acesso ATCC é PTA-8194. O depósito será mantido no depositário por um período de 30 anos, ou 5 anos após a última requisição, ou pelo prazo efetivo da patente, ou mais longo, e será substituído conforme necessário durante este período.
[00120] Tendo-se ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deve ser aparente àqueles técnicos no assunto que a invenção pode ser modificada no arranjo e detalhe sem fugir de tais princípios. Reivindicaram-se todas modificações que estão dentro do espírito e es-copo das reivindicações em anexo.
Claims (1)
1. Genoma de soja transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos das posições 5.758 a 12.183 de SEQ ID NO: 6 inserida na região cromossômica definida na borda 5' pela região flanqueadora genômica com a sequência nucleotí- dica das posições 1 a 5.757 da SEQ ID NO: 6 e na borda 3' pela região flanqueadora genômica com a sequência de nucleotídeos das posições 12.184 a 14.416 de SEQ ID NO: 6.
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