BR112013004585B1 - Lipídeo catiônico, composição de lnp, e, uso de um lipídeo catiônico - Google Patents

Lipídeo catiônico, composição de lnp, e, uso de um lipídeo catiônico Download PDF

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Abstract

lipídeo catiônico, composição de linp, e, uso de um lipídeo catiônico. a presente invenção fornece lipídeos catiônicos inéditos que podem ser usados em combinação com outros componentes lipídicos, tais como colesterol e lipídeos-peg, para formar nanopartículas de lipídeos com oligonucleotídeos. é um objetivo da presente invenção fornecer um suporte de lipídeo catiônico que demonstra melhor eficiência associado a menos toxicidade para o fígado, em função de menores níveis lipídicos no fígado. a presente invenção emprega lipídeos catiônicos de baixo peso molecular com uma cadeia curta de lipídeo para melhorar a eficiência e tolerabilidade de distribuição in vivo de rnasi.

Description

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção diz respeito aos lipídeos catiônicos inéditos que podem ser usados em combinação com outros componentes lipídicos, tais como colesterol e lipídeos-PEG, para formar nanopartículas de lipídeo com oligonucleotídeos, para facilitar a absorção celular e escape endossomal e silenciar o RNAm alvo tanto in vitro quanto in vivo.
[0002] Os lipídeos catiônicos e o uso dos lipídeos catiônicos em nanopartículas de lipídeo para a distribuição de oligonucleotídeos, em particular RNAsi e RNAmi, foram previamente revelados. As nanopartículas de lipídeo e o uso de nanopartículas de lipídeo para a distribuição de oligonucleotídeos, em particular RNAsi e RNAmi, foi previamente revelado. Os oligonucleotídeos (incluindo RNAsi e RNAmi) e a síntese de oligonucleotídeos foram previamente revelados. (Ver pedidos de patente U.S.: U.S. 2006/0083780, U.S. 2006/0240554, U.S. 2008/0020058, U.S. 2009/0263407 e U.S. 2009/0285881 e pedidos de patente PCT: WO 2009/086558, WO2009/127060, WO2009/132131, WO2010/042877,WO2010/054384, WO2010/054401, WO2010/054405 e WO2010/054406). Ver também Semple S. C. et al., Rational design of cationic lipids for siRNA delivery, Nature Biotechnology, 2010, 28, 172-176.
[0003] Outros lipídeos catiônicos são revelados em pedidos de patente U.S.: U.S. 2009/0263407, U.S. 2009/0285881, U.S. 2010/0055168, U.S. 2010/0055169, U.S. 2010/0063135, U.S. 2010/0076055, U.S. 2010/0099738 e U.S. 2010/0104629.
[0004] Os lipídeos catiônicos tradicionais, tais como CLinDMA e DLinDMA, foram empregados para a distribuição de RNAsi no fígado, mas resultam em eficiência de distribuição não ideal associada à toxicidade hepática em doses mais elevadas. É um objetivo da presente invenção fornecer um suporte de lipídeo catiônico que demonstra melhor eficiência associada a menos toxicidade para o fígado em função de níveis lipídicos mais baixos no fígado. A presente invenção emprega lipídeos catiônicos de baixo peso molecular com uma cadeia curta de lipídeo para melhorar a eficiência e tolerabilidade de distribuição in vivo de RNAsi.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0005] A presente invenção fornece lipídeos catiônicos inéditos que podem ser usados em combinação com outros componentes lipídicos, tais como colesterol e lipídeos-PEG, para formar nanopartículas de lipídeo com oligonucleotídeos. É um objetivo da presente invenção fornecer um suporte de lipídeo catiônico que demonstra melhor eficiência associada a menos toxicidade para o fígado em função de níveis lipídicos mais baixos no fígado. A presente invenção emprega lipídeos catiônicos de baixo peso molecular com uma cadeia curta de lipídeo para melhorar a eficiência e tolerabilidade de distribuição in vivo de RNAsi.BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURASA figura 1 mostra a eficiência de LNP (composto 1) em camundongos.A figura 2 mostra a eficiência de LNP (compostos 32 e 33) em rato (RNAsi de ApoB).A figura 3 mostra os níveis de lipídeo catiônico (compostos 32 e 33) no fígado de rato.A figura 4 mostra a eficiência de LNP (compostos 32 e 33, RNAsi de ApoB) em NHP.A figura 5 mostra a eficiência de LNP (composto 32 e 33, RNAsi de β-catenina) em NHP.A figura 6 mostra pico de níveis ALT em NHP após a dose de LNP (composto 32 e 33).A figura 7 mostra os níveis de lipídeo catiônico (compostos 32 e 33) no fígado em NHP.A figura 8 mostra KD RNAm de β-catenina no fígado em camundongos TRE-Met (composto 33).A figura 9 mostra KD RNAm de β-catenina no tumor em camundongos TRE-Met (composto 33).A figura 10 mostra a inibição do crescimento de tumor (composto 33) em camundongos TRE-met.A figura 11 mostra a eficiência de LNP (compostos 32 e 33) em camundongos.A figura 12 mostra KD RNAm de β-catenina no fígado em camundongos TRE-Met (composto 32).A figura 13 mostra KD RNAm de β-catenina no tumor em camundongos TRE-Met (composto 32).A figura 14 mostra a inibição do crescimento do tumor (composto 32) em camundongos TRE-met.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0006] Os vários aspectos e modalidades da invenção dizem respeito à utilidade dos lipídeos catiônicos inéditos, usados em nanopartículas de lipídeo para distribuir oligonucleotídeos, em particular RNAsi e RNAmi, em qualquer gene alvo. (Ver pedidos de patente U.S.: U.S. 2006/0083780, U.S. 2006/0240554, U.S. 2008/0020058, U.S. 2009/0263407 e U.S. 2009/0285881 e pedidos de patente PCT: WO 2009/086558, WO2009/127060, WO2009/132131, WO2010/042877, WO2010/054384, WO2010/054401, WO2010/054405 e WO2010/054406). Ver também Semple S. C. et al., Rational design of cationic lipids for siRNA delivery, Nature Biotechnology, 2010, 28, 172-176.
[0007] Os lipídeos catiônicos da presente invenção são componentes utilizados em uma nanopartícula de lipídeo para a distribuição de oligonucleotídeos, especificamente RNAsi e RNAmi.
[0008] Em uma primeira modalidade desta invenção, os lipídeos catiônicos são ilustrados pela fórmula A:
Figure img0001
em que:R1 e R2 são independentemente selecionados de H, alquila (C1-C6), heterociclila e poliamina, em que a dita alquila, heterociclila e poliamina são opcionalmente substituídas por um a três substituintes selecionados de R’, ou R1 e R2 podem ser obtidos juntos com o nitrogênio no qual são anexados para formar um heterociclo monocíclico com 4-7 elementos contendo opcionalmente, além do nitrogênio, um ou dois heteroátomos adicionais selecionados de N, O e S, o dito heterociclo monocíclico sendo opcionalmente substituído por um a três substituintes selecionados de R’;R3 é independentemente selecionado de H e alquila (C1-C6), a dita alquila opcionalmente substituída por um a três substituintes selecionados de R’;R’ é independentemente selecionado de halogênio, R’’, OR’’, SR’’, CN, CO2R’’ ou CON(R’’)2;R’’ é independentemente selecionado de H e alquila (C1-C6), em que a dita alquila é opcionalmente substituída por halogênio e OH;n é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5;L1 é selecionado de alquila C4-C24 e alquenila C4-C24, a dita alquila e alquenila sendo opcionalmente substituídas por um ou mais substituintes selecionados de R’; eL2 é selecionado de alquila C3-C9 e alquenila C3-C9, a dita alquila e alquenila sendo opcionalmente substituídas por um ou mais substituintes selecionados de R’;ou qualquer sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero destes.
[0009] Em uma segunda modalidade, a invenção apresenta um composto com a fórmula A,
[00010] em que:
[00011] R1 e R2 são cada qual metila;
[00012] R3 é H;
[00013] n é 0;
[00014] L1 é selecionado de alquila C4-C24 e alquenila C4-C24; e
[00015] L2 é selecionado de alquila C3-C9 e alquenila C3-C9;
[00016] ou qualquer sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero destes.
[00017] Em uma terceira modalidade, a invenção apresenta um composto que apresenta a fórmula A, em que:R1 e R2 são cada qual metila;R3 é H;n é 2;L1 é selecionado de alquila C4-C24 e alquenila C4-C24; eL2 é selecionado de alquila C3-C9 e alquenila C3-C9;ou qualquer sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero destes.
[00018] Os lipídeos catiônicos específicos são:(20Z,23Z)-N,N-dimetil-nonacosa-20,23-dien-10-amina(composto 1);(17Z,20Z)-N,N-dimetil-hexacosa-17,20-dien-9-amina(composto 2);(16Z,19Z)-N,N-dimetil-pentacosa-16,19-dien-8-amina(composto 3);(13Z,16Z)-N,N-dimetil-docosa-13,16-dien-5-amina (composto 4);(12Z,15Z)-N,N-dimetil-henicosa-12,15-dien-4-amina(composto 5);(14Z,17Z)-N,N-dimetil-tricosa-14,17-dien-6-amina (composto 6);(15Z,18Z)-N,N-dimetil-tetracosa-15,18-dien-7-amina(composto 7);(18Z,21Z)-N,N-dimetil-heptacosa-18,21-dien-10-amina(composto 8);(15Z,18Z)-N,N-dimetil-tetracosa-15,18-dien-5-amina(composto 9);(14Z,17Z)-N,N-dimetil-tricosa-14,17-dien-4-amina (composto 10);(19Z,22Z)-N,N-dimeti-loctacosa-19,22-dien-9-amina(composto 11);(18Z,21Z)-N,N-dimetil-heptacosa-18,21-dien-8-amina(composto 12);(17Z,20Z)-N,N-dimetil-hexacosa-17,20-dien-7-amina(composto 13);(16Z,19Z)-N,N-dimetil-pentacosa-16,19-dien-6-amina(composto 14);(22Z,25Z)-N,N-dimetil-hentriaconta-22,25-dien-10-amina(composto 15);(21Z,24Z)-N,N-dimetil-triaconta-21,24-dien-9-amina(composto 16);(18Z)-N,N-dimetil-heptacos-18-en-10-amina (composto 17);(17Z)-N,N-dimetil-hexacos-17-en-9-amina (composto 18);(19Z,22Z)-N,N-dimetil-octacosa-19,22-dien-7-amina(composto 19); e N,N-dimetil-heptacosan-10-amina (composto 20);(20Z,23Z)-N-etil-N-metil-nonacosa-20,23-dien-10-amina(composto 21);1-[(11Z,14Z)-1-nonilicosa-11,14-dien-1-il]pirrolidina(composto 22);(20Z)-N,N-dimetil-heptacos-20-en-10-amina (composto 23);(15Z)-N,N-dimetil-heptacos-15-en-10-amina (composto 24);(14Z)-N,N-dimetilnonacos-14-en-10-amina (composto 25);(17Z)-N,N-dimetilnonacos-17-en-10-amina (composto 26);(24Z)-N,N-dimetil-tritriacont-24-en-10-amina (composto 27);(20Z)-N,N-dimetilnonacos-20-en-10-amina (composto 28);(22Z)-N,N-dimetil-hentriacont-22-en-10-amina (composto 29);(16Z)-N,N-dimetil-pentacos-16-en-8-amina (composto 30);(12Z,15Z)-N,N-dimetil-2-nonil-henicosa-12,15-dien-1-amina (composto 31);(13Z,16Z)-N,N-dimetil-3-nonil-docosa-13,16-dien-1-amina(composto 32);N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]heptadecan-8-amina (composto 33);1-[(1S,2R)-2-hexilciclopropil]-N,N-dimetilnonadecan-10-amina (composto 34);N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]nonadecan-10-amina (composto 35);N,N-dimetil-21-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]henicosan-10-amina (composto 36);N,N-dimetil-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-pentilciclopropil]metil} ciclopropil]nonadecan-10-amina (composto 37);N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]hexadecan-8-amina (composto 38);N,N-dimetil-1-[(1R,2S)-2-undecilciclopropil]tetradecan-5- amina (composto 39);N,N-dimetil-3-{7-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]heptil}dodecan-1-amina (composto 40)1-[(1R,2S)-2-heptilciclopropil]-N,N-dimetiloctadecan-9-amina (composto 41);1-[(1S,2R)-2-decilciclopropil]-N,N-dimetilpentadecan-6- amina (composto 42);N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]pentadecan-8-amina(composto 43); e(11E,20Z,23Z)-N,N-dimetilnonacosa-11,20,23-trien-10-amina (composto 44); ou qualquer sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero destes.
[00019] Em uma outra modalidade, os lipídeos catiônicos revelados são usados na preparação de nanopartículas de lipídeo.
[00020] Em uma outra modalidade, os lipídeos catiônicos revelados são componentes utilizados em uma nanopartícula de lipídeo para a distribuição de oligonucleotídeos.
[00021] Em uma outra modalidade, os lipídeos catiônicos revelados são componentes utilizados em uma nanopartícula de lipídeo para a distribuição de RNAsi e RNAmi.
[00022] Em uma outra modalidade, os lipídeos catiônicos revelados são componentes utilizados em uma nanopartícula de lipídeo para a distribuição de RNAsi.
[00023] Os lipídeos catiônicos da presente invenção podem apresentar centros assimétricos, eixos quirais e planos quirais (da maneira descrita em: E.L. Eliel e S.H. Wilen, Stereochemistry of Carbon Compounds, John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1994, páginas 1119-1190), e ocorrer como racematos, misturas racêmicas e como diastereômeros individuais, com todos os possíveis isômeros e misturas destes, incluindo isômeros óticos que são incluídos na presente invenção. Além do mais, os lipídeos catiônicos aqui revelados podem existir como tautômeros, pretende-se que e ambas as formas tautoméricas sejam incluídas pelo escopo da invenção, mesmo se apenas uma estrutura tautomérica for representada.
[00024] Entende-se que os substituintes e os padrões de substituição nos lipídeos catiônicos da presente invenção podem ser selecionados pelos versados na técnica para fornecer lipídeos catiônicos que são quimicamente estáveis, e que podem ser facilmente sintetizados por técnicas conhecidas na tecnologia, bem como aqueles métodos apresentados a seguir, a partir de materiais de partida facilmente disponíveis. Se um substituinte for ele mesmo substituído por mais de um grupo, entende-se que estes grupos múltiplos podem estar no mesmo carbono ou em diferentes carbonos, contanto que resulte em estrutura estável.
[00025] Entende-se que um ou mais átomos de Si podem ser incorporados nos lipídeos catiônicos da presente invenção pelos versados na técnica para fornecer lipídeos catiônicos que são quimicamente estáveis, e que podem ser facilmente sintetizados por técnicas conhecidas na tecnologia a partir de materiais de partida facilmente disponíveis.
[00026] Nos compostos da fórmula A, os átomos podem exibir suas abundâncias isotópicas naturais, ou um ou mais dos átomos podem ser enriquecidos artificialmente em um isótopo particular com o mesmo número atômico, mas uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa predominantemente encontrado na natureza. A presente invenção deve incluir todas as variações isotópicas adequadas dos compostos da fórmula A. Por exemplo, as diferentes formas isotópicas diferentes de hidrogênio (H) incluem prótio (1H) e deutério (2H). O prótio é o isótopo predominante de hidrogênio encontrado na natureza. O enriquecimento com deutério pode fornecer certas vantagens terapêuticas, tais como aumentar a meia vida in vivo ou reduzir as exigências de dosagem, ou pode fornecer um composto uado como um padrão para caracterização de amostras biológicas. Os compostos enriquecidos isotopicamente na fórmula A podem ser preparados sem experimentação indevida, por técnicas convencionais bem conhecidas pelos versados na técnica ou por processos análogos àqueles descritos no esquema e exemplos aqui, usando reagentes e/ou intermediários isotopicamente apropriados.
[00027] Da maneira aqui usada, “alquila” significa um hidrocarboneto alifático saturado ramificado, cíclico ou de cadeia reta com o número especificado de átomos de carbono.
[00028] Da maneira aqui usada, “alquenila” significa um hidrocarboneto alifático insaturado ramificado, cíclico ou de cadeia reta com o número especificado de átomos de carbono incluindo, mas sem limitação, hidrocarbonetos alifáticos insaturados de dieno, trieno e tetraeno.
[00029] Exemplos de uma “alquil” ou “alquenila” cíclicas incluem:
Figure img0002
[00030] Da maneira aqui usada, “heterociclila” ou “heterociclo” significa um heterociclo aromático ou não aromático com 4 a 10 elementos, contendo de 1 a 4 heteroátomos selecionados do grupo que consiste em O, N e S, e inclui grupos bicíclicos. “Heterociclila”, portanto, inclui os seguintes: benzoimidazolila, benzofuranila, benzofurazanila, benzopirazolila, benzotriazolila, benzotiofenila, benzoxazolila, carbazolila, carbolinila, cinolinila, furanila, imidazolila, indolinila, indolila, indolazinila, indazolila, isobenzofuranila, isoindolila, isoquinolila, isothiazolila, isoxazolila, naftpiridinila, oxadiazolila, oxazolila, oxazolina, isoxazolina, oxetanila, piranila, pirazinila, pirazolila, piridazinila, piridopiridinila, piridazinila, piridila, pirimidila, pirrolila, quinazolinila, quinolila, quinoxalinila, tetra- hidropiranila, tetrazolila, tetrazolopiridila, tiadiazolila, tiazolila, thienila, triazolila, azetidinila, 1,4-dioxanila, hexa-hidroazepinila, piperazinila, piperidinila, pirrolidinila, morfolinila, tiomorfolinila, di-idrobenzoimidazolila, di-idrobenzofuranila, di-idrobenzotiofenila, di-idrobenzoxazolila, di- idrofuranila, di-idroimidazolila, di-idroindolila, di-idroisooxazolila, di- idroisotiazolila, di-idrooxadiazolila, di-idrooxazolila, di-idropirazinila, di- idropirazolila, di-idropiridinila, di-idropirimidinila, di-idropirrolila, di- idroquinolinila, di-idrotetrazolila, di-idrotiadiazolila, di-idrotiazolila, di- idrotienila, di-idrotriazolila, di-idroazetidinila, metilenodioxibenzoila, tetra- hidrofuranila e tetra-hidrotienila, e N-óxidos destes, em que todos são opcionalmente substituídos por um a três substituintes selecionados de R’’.
[00031] Da maneira aqui usada, “poliamina” significa compostos com dois ou mais grupos amino. Exemplos incluem putrescina, cadaverina, espermidina e espermina.
[00032] Da maneira aqui usada, “halogênio” significa Br, Cl, F e I.
[00033] Em uma modalidade da fórmula A, R1 e R2 são independentemente selecionados de H e alquila (C1-C6), em que a dita alquila é opcionalmente substituída por um a três substituintes selecionados de R’, ou R1 e R2 podem ser obtidos juntos com o nitrogênio no qual são anexados para formar um heterociclo monocíclico com 4-7 elementos contendo opcionalmente, além do nitrogênio, um ou dois heteroátomos adicionais selecionados de N, O e S, o dito heterociclo monocíclico sendo opcionalmente substituído por um a três substituintes selecionados de R’.
[00034] Em uma modalidade da fórmula A, R1 e R2 são independentemente selecionados de H, metila, etila e propila, em que as ditas metila, etila e propila são opcionalmente substituídas por um a três substituintes selecionados de R’, ou R1 e R2 podem ser obtidos juntos com o nitrogênio no qual são anexados para formar um heterociclo monocíclico com 4-7 elementos contendo opcionalmente, além do nitrogênio, um ou dois heteroátomos adicionais selecionados de N, O e S, o dito heterociclo monocíclico sendo opcionalmente substituído por um a três substituintes selecionados de R’.
[00035] Em uma modalidade da fórmula A, R1 e R2 são independentemente selecionados de H, metila, etila e propila.
[00036] metila. Em uma modalidade da fórmula A, R1 e R2 são cada qual
[00037] Em uma modalidade da fórmula A, R3 é independentemente selecionado de: H e metila.
[00038] Em uma modalidade da fórmula A, R3 é H.
[00039] Em uma modalidade da fórmula A, R’ é R’’.
[00040] Em uma modalidade da fórmula A, R’’ é independentemente selecionado de H, metila, etila e propila, em que as ditas metila, etila e propila são opcionalmente substituídas por um ou mais halogênio e OH.
[00041] Em uma modalidade da fórmula A, R’’ é independentemente selecionado de H, metila, etila e propila.
[00042] Em uma modalidade da fórmula A, n é 0, 1, 2 ou 3.
[00043] Em uma modalidade da fórmula A, n é 0, 1 ou 2.
[00044] Em uma modalidade da fórmula A, n é 0, 1 ou 2.
[00045] Em uma modalidade da fórmula A, n é 0.
[00046] Em uma modalidade da fórmula A, n é 2.
[00047] Em uma modalidade da fórmula A, L1 é selecionado de alquila C4-C24 e alquenila C4-C24, que são opcionalmente substituídas por halogênio e OH.
[00048] Em uma modalidade da fórmula A, L1 é selecionado de alquila C4-C24 e alquenila C4-C24.
[00049] Em uma modalidade da fórmula A, L1 é selecionado de alquenila C4-C24.
[00050] Em uma modalidade da fórmula A, L1 é selecionado de alquenila C12-C24.
[00051] Em uma modalidade da fórmula A, L1 é alquenila C19.
[00052] Em uma modalidade da fórmula A, L1 é:
Figure img0003
[00053] Em uma modalidade da fórmula A, L1 é:
Figure img0004
[00054] Em uma modalidade da fórmula A, L2 é selecionado de alquila C3-C9 e alquenila C3-C9, que são opcionalmente substituídas por halogênio e OH.
[00055] Em uma modalidade da fórmula A, L2 é selecionado de alquila C5-C9 e alquenila C5-C9, que são opcionalmente substituídas por halogênio e OH.
[00056] Em uma modalidade da fórmula A, L2 é selecionado de alquila C7-C9 e alquenila C7-C9, que são opcionalmente substituídas por halogênio e OH.
[00057] Em uma modalidade da fórmula A, L2 é selecionado de alquila C3-C9 e alquenila C3-C9.
[00058] Em uma modalidade da fórmula A, L2 é selecionado de alquila C5-C9 e alquenila C5-C9.
[00059] Em uma modalidade da fórmula A, L2 é selecionado de alquila C7-C9 e alquenila C7-C9.
[00060] Em uma modalidade da fórmula A, L2 é alquila C3-C9.
[00061] Em uma modalidade da fórmula A, L2 é alquila C5-C9.
[00062] Em uma modalidade da fórmula A, L2 é alquila C7-C9.
[00063] Em uma modalidade da fórmula A, L2 é alquila C9.
[00064] Em uma modalidade da fórmula A, L1 é selecionado de alquila C4-C24 e alquenila C4-C24, a dita alquila e alquenila sendo opcionalmente substituídas por um ou mais substituintes selecionados de R’; e L2 é selecionado de alquila C3-C9 e alquenila C3-C9, a dita alquila e alquenila sendo opcionalmente substituídas por um ou mais substituintes selecionados de R’.
[00065] Em uma modalidade da fórmula A, L1 é selecionado de alquenila C12-C24, a dita alquenila sendo opcionalmente substituída por um ou mais substituintes selecionados de R’; e L2 é selecionado de alquila C5-C9a, a dita alquila sendo opcionalmente substituída por um ou mais substituintes selecionados de R’.
[00066] Em uma modalidade da fórmula A, L1 é selecionado de alquenila C19, a dita alquenila é opcionalmente substituída por um ou mais substituintes selecionados de R’; e L2 é selecionado de alquila C7-C9a, a dita alquila é opcionalmente substituída por um ou mais substituintes selecionados de R’.
[00067] Em uma modalidade da fórmula A, L1 é selecionado de alquenila C19, a dita alquenila sendo opcionalmente substituída por um ou mais substituintes selecionados de R’; e L2 é selecionado de C9 alquila, a dita alquila sendo opcionalmente substituída por um ou mais substituintes selecionados de R’.
[00068] Em uma modalidade da fórmula A, L1 é selecionado de uma alquenila C19 de cadeia reta, a dita alquenila sendo opcionalmente substituída por um ou mais substituintes selecionados de R’; e L2 é selecionado de uma alquila C9 de cadeia reta, a dita alquila sendo opcionalmente substituída por um ou mais substituintes selecionados de R’.
[00069] Em uma modalidade da fórmula A, “heterociclila” é pirrolidina, piperidina, morfolina, imidazol ou piperazina.
[00070] Em uma modalidade da fórmula A, “heterociclila monocíclica” é pirrolidina, piperidina, morfolina, imidazol ou piperazina.
[00071] Em uma modalidade da fórmula A, “poliamina” é putrescina, cadaverina, espermidina ou espermina.
[00072] Em uma modalidade, “alquila” é um hidrocarboneto alifático saturado de cadeia reta com o número específico de átomos de carbono.
[00073] Em uma modalidade, “alquenila” é um hidrocarboneto alifático insaturado de cadeia reta com o número específico de átomos de carbono.
[00074] Está incluída na presente invenção a forma livre de lipídeos catiônicos da fórmula A, bem como os sais farmaceuticamente aceitáveis e estereoisômeros destes. Alguns dos lipídeos catiônicos específicos aqui isolados e exemplificados são os sais protonados de lipídeos catiônicos de amina. O termo “forma livre” refere-se aos lipídeos catiônicos de amina na forma de não sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluídos não incluem apenas os sais isolados exemplificados pelos lipídeos catiônicos específicos aqui descritos, mas também todos os sais farmaceuticamente aceitáveis típicos da forma livre de lipídeos catiônicos da fórmula A. A forma livre dos sais de lipídeos catiônicos específicos descrita pode ser isolada usando técnicas conhecidas na tecnologia. Por exemplo, a forma livre pode ser regenerada tratando o sal com uma solução base aquosa diluída e adequada, tal como NaOH diluído aquoso, carbonato de potássio, amônia e bicarbonato de sódio. As formas livres podem diferir um pouco de suas respectivas formas de sal em certas propriedades físicas, tal como solubilidade em solventes polares, mas os sais de ácido e base são de outra maneira farmaceuticamente equivalentes às suas respectivas formas livres, com propósitos da invenção.
[00075] Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos presentes lipídeos catiônicos podem ser sintetizados a partir dos lipídeos catiônicos desta invenção, os quais contêm uma fração básica ou ácida, por métodos químicos convencionais. Em geral, os sais dos lipídeos catiônicos básicos são preparados tanto por cromatografia de troca iônica quanto reagindo a base livre com quantidades estequiométricas, ou com um excesso do ácido inorgânico ou orgânico formador de sal desejado em um solvente adequado ou várias combinações de solventes. De maneira similar, os sais dos compostos ácidos são formados por reações com a base inorgânica ou orgânica adequada.
[00076] Assim, os sais farmaceuticamente aceitáveis dos lipídeos catiônicos desta invenção incluem os sais não tóxicos convencionais dos lipídeos catiônicos desta invenção, uma vez que são formados reagindo os presentes lipídeos catiônicos básicos com um ácido inorgânico ou orgânico. Por exemplo, os sais não tóxicos convencionais incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos tais como clorídrico, hidrobrômico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e similares, bem como sais preparados a partir de ácidos orgânicos tais como acético, propiônico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamoico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutâmico, benzoico, salicílico, sulfanílico, 2- acetóxi-benzoico, fumárico, toluenossulfônico, metanossulfônico, etano dissulfônico, oxálico, isetiônico, trifluoracético (TFA) e similares.
[00077] Quando os lipídeos catiônicos da presente invenção são ácidos, os “sais farmaceuticamente aceitáveis” adequados referem-se aos sais preparados a partir de bases não tóxicas farmaceuticamente aceitáveis, incluindo bases inorgânicas e bases orgânicas. Os sais derivados de bases inorgânicas incluem sais de alumínio, amônio, cálcio, cobre, férrico, ferroso, lítio, magnésio, mangânico, manganoso, potássio, sódio, zinco e similares. São particularmente preferidos os sais de amônio, cálcio, magnésio, potássio e sódio. Os sais derivados de bases não tóxicas orgânicas farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de aminas substituídas primárias, secundárias e terciárias, incluindo aminas substituídas de ocorrência natural, aminas cíclicas e resinas de troca iônica básicas, tais como arginina, betaína, cafeína, colina, N,N1-dibenziletilenodiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2- dimetilaminoetanol, etanolamina, etilenodiamina, N-etilmorfolina, N- etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina e similares.
[00078] A preparação dos sais farmaceuticamente aceitáveis descrita anteriormente e de outros sais farmaceuticamente aceitáveis típicos é descrita com mais detalhes por Berg et al., “Pharmaceutical Salts,” J. Pharm. Sci., 1977:66:1-19.
[00079] Pode-se notar também que os lipídeos catiônicos da presente invenção são potencialmente sais internos ou zwiteríons, uma vez que em condições fisiológicas uma fração ácida desprotonada no composto, tal como um grupo carboxila, pode ser aniônica, e esta carga elétrica pode ser então equilibrada internamente contra a carga catiônica de uma fração básica protonada ou alquilada, tal como um átomo de nitrogênio quaternário.
EXEMPLOS
[00080] Pretende-se que os exemplos fornecidos auxiliem em um melhor entendimento da invenção. Pretende-se que os materiais, espécies e condições particulares empregados sejam mais ilustrativos da invenção e não sejam limitantes do escopo justificado desta. Os reagentes utilizados na síntese dos lipídeos catiônicos são tanto comercialmente disponíveis quanto são facilmente preparados pelos versados na técnica.
[00081] A síntese dos lipídeos catiônicos inéditos é um processo linear que começa a partir do ácido lipídico (I). O acoplamento a N,O-dimetil hidroxilamina fornece a amida de Weinreb II. A adição de Grignard gera cetona III. A aminação redutora mediada por titânio fornece os produtos finais do tipo IV.ESQUEMA GERAL 1
Figure img0005
[00082] A síntese dos lipídeos catiônicos homólogos com carbono simples V é um processo linear que começa a partir da cetona lipídica (III). A conversão da cetona na nitrila (V) é realizada por meio do tratamento com TOSMIC e terc-butóxido de potássio. A redução da nitrila em amina primária seguida por aminação redutora fornece lipídeos catiônicos finais VI. ESQUEMA GERAL 2
Figure img0006
[00083] A síntese de lipídeos catiônicos homólogos a dois carbonos IX é um processo linear que começa a partir da cetona lipídica (III). A conversão da cetona em amida α,β-insaturada VII é realizada em condições de Peterson. A redução do conjugado da a^-insaturação é realizada usando LS-Selectride para fornecer amida VIII. A redução da amida com hidreto de alumínio e lítio fornece lipídeos catiônicos finais IX. ESQUEMA GERAL 3
Figure img0007
[00084] Ciclopropila contendo lipídeos são preparadas de acordo com o esquema geral 4. As amidas insaturadas de Weinreb II são submetidas às condições de ciclopropanação de Simmons-Smith para fornecer ciclopropila contendo amidas de Weinreb X. Estas são realizadas com os produtos finais da maneira representada nos esquemas gerais 1-3. ESQUEMA GERAL 4
Figure img0008
[00085] A síntese de lipídeos catiônicos de amina alílica XVI é um processo linear que começa com o aldeído XI. A adição de acetato de t-butila gera β-hidr0xi éster XII. A conversão da funcionalidade de hidroxila em um grupo flúor grupo, seguido pelo tratamento com ácido gera ácido e-flúor XIII. A conversão do ácido em amida de Weinreb seguida pela adição de Grignard fornece a e-flúor cetona XV. A aminação redutora resulta na eliminação simultânea para gerar a amina alílica desejada XVI.ESQUEMA GERAL 5
Figure img0009
[00086] O ácido 11,14-eicosadienoico, (11Z,14Z)- (50 g, 162 mmol), cloridrato de N,O-dimetil-hidroxilamina (31,6 g, 324 mmol), HOAt (44,1 g, 324 mmol), Et3N (45,2 mL, 324 mmol) e EDC (62,1 g, 324 mmol) foram misturados em DCM (810 mL) e agitados por toda a noite em temperatura ambiente. A reação foi então lavada 5 x com 700 mL de água, a seguir foi lavada 1 x com 600 mL de NaOH 1 M, seca com sulfato de sódio, filtrada por meio de celite e evaporada para obter 53,06 g (93 %) de 11,14- eicosadienamida, N-metoxi-N-metil-, (11Z,14Z) como um óleo dourado claro. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,35 (m, 4H), 3,68 (s, 3H), 3,18 (s, 3H), 2,77 (m, 2H), 2,41 (t, J = 7 Hz, 2H), 2,05 (m, 4H), 1,63 (m, 2H), 1,40-1,26 (m, 18H), 0,89 (t, J = 7 Hz, 3H).
Figure img0010
[00087] 11,14-eicosadienamida, N-metoxi-N-metil-, (11Z,14Z)- 1 (4 g, 11,38 mmol) foram dissolvidos em THF seco (50,0 mL) em um frasco de 250 mL, a seguir brometo de nonilmagnésio 1 M (22,76 mL, 22,76 mmol) foi adicionado em nitrogênio em temperatura ambiente. após 10 minutos, a reação foi finalizada lentamente com excesso de NH4Cl aquoso saturado. A reação foi lavada em um funil separatório com hexano e água, agitada, a camada menos aquosa foi descartada, a camada superior foi seca com sulfato de sódio, filtrada e evaporada para fornecer cetona bruta como um óleo dourado. À cetona bruta anterior foi adicionada dimetilamina (2 M em THF) (14,22 mL, 28,4 mmol) seguido por Ti(O-i-Pr)4 (6,67 mL, 22,76 mmol) e a agitação continuou por toda a noite. No dia seguinte, foi adicionado EtOH (50 mL) seguido por NaBH4 (0,646 g, 17,07 mmol). Após 5 minutos de agitação, toda a reação foi diretamente injetada em uma coluna de sílica de 40 g, que estava em alinhamento com uma coluna de sílica de 330 g. Após a eluição por 10 minutos com DCM 100 %, e a seguir 30 minutos com MeOH/DCM 0-15 %, foi coletada 20,23-nonacosadien-10-amina, N,N-dimetil-, (20Z,23Z) (1) (2,45 g, 5,47 mmol, 48,1 % de rendimento) como um óleo dourado fraco. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,35 (m, 4H), 2,78 (m, 2H), 2,23 (m, 1H), 2,21 (s, 6H), 2,05 (m, 4H), 1,45-1,16 (m, 38H), 0,89 (m, 6H), HRMS calculado para C31H61N 448,4877, encontrado 448,4872.
[00088] Os compostos 2-30 são os lipídeos catiônicos inéditos e foram preparados de acordo com o esquema geral 1 anterior.
Figure img0011
Figure img0012
Figure img0013
(12 Z ,15 Z) - N, N-dimetil-2-nonil-henicosa-12,15-dien-1-amina (composto 31)
Figure img0014
[00089] Uma solução de cetona III (4,0g, 9,55 mmol), TOSMIC (2,4g, 12,4 mmol) em dimetoxietano (45 mL) foi resfriada a 0 oC e tratada com terc- butóxido de potássio (19,1 mmol, 19,1 mL de uma solução em tBuOH 1M). Após 90 minutos, a reação foi dividida entre hexanos e água. Os constituintes orgânicos foram lavados com água, secos com sulfato de sódio, filtrados e evaporados a vácuo. Este material foi purificado por cromatografia rápida (0- 5 % de EtOAc/hexanos) para fornecer o produto desejado (contendo ~20 % de s.m.). Esta mistura foi realizada na próxima etapa da maneira que está. LC/MS (M+H) = 430,6.
Figure img0015
[00090] O hidreto de alumínio e lítio (23,9 mmol, 23,9 mL de uma solução 1M em THF) foi adicionado diretamente em nitrila V (3,42 g, 8 mmol) em temperatura ambiente e a reação foi agitada por 20 minutos. A reação foi diluída com 100 mL de THF, resfriada a 0 oC e finalizada cuidadosamente com solução de sulfato de sódio decaidratado. Os sólidos foram filtrados e lavados com THF. O filtrado evaporou a vácuo e foi transferido diretamente para a próxima reação bruta. LC/MS (M+H) = 434,6.
Figure img0016
[00091] Uma solução de amina primária (3,45 g, 6,2 mmol) em dicloroetano (100 mL) foi tratada com formaldeído (1,6 mL, 21,7 mmol), seguido por triacetoxiboroidreto de sódio (6.,6 g, 31 mmol). Após 5 minutos, a reação foi dividida entre diclorometano e NaOH 1N. Os constituintes orgânicos foram secos com sulfato de sódio, filtrados e evaporados a vácuo. A mistura bruta foi purificada por cromatografia preparatória de fase reversa (coluna C8) para fornecer (12Z,15Z)-N,N-dimetil-2-nonil-henicosa-12,15- dien-1-amina. HRMS calculado 462,5033, encontrado 462,5026, RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,35 (m, 4H), 2,78 (2H, t, J=5,6Hz), 2,18 (s, 6H), 2,05 (m, 6H), 1,3 (m, 39H), 0,89 (m, 6H). (13 Z ,16 Z) - N, N-dimetil-3-nonildocosa-13,16-dien-1-amina (composto 32)
Figure img0017
[00092] O reagente de Peterson com sililamida (3,1 g, 16,7 mmol) foi dissolvido em THF (35 mL) e resfriado a -63 oC. A esta solução foi adicionado nBuLi (16,7 mmol, 6,7 mL de uma solução 2,5 M). A reação foi aquecida em temperatura ambiente por 30 minutos. A cetona (5,0 g, 11,9 mmol) foi dissolvida em THF (25 mL) em um segundo frasco. A solução de cetona foi transferida para o reagente de Peterson por 30 minutos, mantendo ao mesmo tempo a temperatura entre -60 oC e -40 oC. A reação foi aquecida para -40 oC por 1 hora, a seguir aquecida para 0 oC por 30 minutos. A reação foi finalizada com bicarbonato de sódio, diluída com mais água e dividida entre água/hexanos. Os constituintes orgânicos foram lavados com salmoura, secos com sulfato de sódio, filtrados e evaporados a vácuo. A purificação por cromatografia rápida (0-40 % MTBE/hexanos) forneceu amida α,β-insaturada VII. RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,75 (s, 1H), 5,36 (m, 4H), 3,01 (s, 3H), 2,99 (s, 3H), 2,78 (t, 2H), 2,28 (t, 2H), 2,05 (m, 6H), 1,35 (m, 34H), 0,89 (m, 6H).
Figure img0018
[00093] A amida α,β-insaturada VII (1 g, 2,1 mmol) e LS-Selectride (4,1 mmol, 4,1 mL de uma solução 1M) foram combinadas em um tubo selado e aquecidas a 60 oC por 24 horas. A reação foi resfriada em temperatura ambiente e dividida entre solução de cloreto de amônio e heptano. Os constituintes orgânicos foram secos com sulfato de sódio, filtrados e evaporados a vácuo para fornecer amida VIII. Este intermediário foi transferido diretamente para a próxima reação bruta.
[00094] Uma reação alternativa do conjugado de amida α,β-insaturada VII envolve o use de uma redução de hidreto de cobre:
Figure img0019
[00095]
[00096] Em um 5L RB, o catalisador de cobre (9,77 g, 17,13 mmol) foi dissolvido em tolueno (1.713 mL) com nitrogênio. Adicionou-se a este o PMHS, da Aldrich (304 mL, 1.371 mmol) em uma porção única. A reação foi envelhecida por 5 minutos. Às soluções foi adicionada a amida α,β-insaturada VII (167,16 g, 343 mmol). A esta mistura foi então adicionado o álcool t- amílico (113 mL, 1.028 mmol) por 3 horas por meio de bomba de seringa. Após a adição completa, adicionou-se à solução ~1.700 mL de NH4OH a 20 % em rxn, em pequenas porções. Precaução: existe muita efervescência e espuma no começo da finalização e isto tem que ser bem monitorado, e o hidróxido de amônio deve ser adicionado lentamente em pequenas porções. A reação foi dividida entre água e hexanos. Os constituintes orgânicos foram filtrados por meio de celite e evaporados a vácuo. O material sólido de borracha resultante foi pulverizado usando um agitador mecânico em hexanos para fornecer pequenos particulados, que foram então filtrados e lavados com hexanos. Os constituintes orgânicos foram então evaporados a vácuo e purificados por cromatografia rápida (sílica, 0-15 % de acetato de etila/hexanos) para fornecer a amida viii desejada. LC/MS (M+H) = 490,7.
Figure img0020
[00097]
[00098] A uma solução de amida VIII (2,85 g, 5,8 mmol), foi adicionado hidreto de alumínio e lítio (8,7 mmol, 8,7 mL de uma solução 1M). A reação foi agitada em temperatura ambiente por 10 minutos, e a seguir foi finalizada por adição lenta de solução de sulfato de sódio decaidratado. Os sólidos foram filtrados e lavados com THF e o filtrado evaporou a vácuo. A mistura bruta foi purificada por cromatografia preparatória de fase reversa (coluna C8) para fornecer (13Z,16Z)-N,N-dimetil-3-nonildocosa-13,16-dien- 1-amina (composto 32) como um óleo. HRMS (M+H) calculado 476,5190, encontrado 476,5189. RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,37 (m, 4H), 2,78 (t, 2H), 2,42 (m, 8H), 2,05 (q, 4H), 1,28 (m, 41H), 0,89 (m, 6H).
[00099] N, N-dimetil-1 -(2-octilciclopropil)heptadecan-8-amina (composto 33)
Figure img0021
[000100]
[000101] A uma solução de ácido oleico (1 g, 3,5 mmol) em DCM (500 mL) resfriado a 0 oC foi adicionado CDI (0,63 g, 3,9 mmol). A reação foi aquecida em temperatura ambiente por 30 minutos antes de resfriar a 0 oC, e de ser tratada primeiro com trietilamina (0,39 g, 3,9 mmol) e a seguir com dimetil cloridrato de hidroxilamina (0,38 g, 3,9 mmol). Após 1 hora, a reação foi dividida entre água e heptano. Os constituintes orgânicos foram secos com sulfato de magnésio, filtrados e evaporados a vácuo para fornecer amida de Weinreb bruta II, que foi transferida diretamente para a próxima reação.
Figure img0022
[000102]
[000103] Uma solução de dietilzinco (70,3 mmol, 70,3 mL de uma solução 1M) em diclorometano (130 mL) foi resfriado a -1 oC e tratada gota a gota com TFA (8,0 g, 70,3 mmol). Após 30 minutos, di-iodometano (18,8 g, 70,3 mmol) foi adicionado e esta solução foi envelhecida por 30 minutos no banho de gelo. A esta solução foi adicionada amida de Weinreb II (7,6 g, 23,4 mmol). A reação foi aquecida em temperatura ambiente e agitada por 1 hora. A reação foi finalizada com solução de cloreto de amônio (100 mL) e a camada orgânica foi dividida, lavada com tiossulfato de sódio a 10 %, seca O com sulfato de magnésio, filtrada egevapprada. a pvacuo. A purificação N realizada com cromoatografia rápida (0—30 % de MTBE/heptano) forneceu o produto desejado X. RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ 3,72 (s, 3H), 3,22 (s, 3H), 2,48 (t, 2H), 1,65 (m, 2H), 1,39 (m?22H), 1,18 (m, 211), 0,91 (t, 3H), 0,68 (m, 2H), 0,59 (m, 1H), -0,32 (m, 1H).
Figure img0023
[000104]
[000105] A conversão de amida de Weinreb X no composto 33 foi realizada de uma maneira análoga àquela descrita para o composto 1 anterior (adição de nonil Grignard, seguido por aminação redutora). LC/MS (M+H) = 436,6, RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ 2,25 (s, 6H), 1,30 (m, 45H), 0,91 (m, 6H), 0,68 (m, 2H), 0,59 (m, 1H), -0,31 (m, 1H).
[000106] Os compostos 34-43 são os lipídeos catiônicos inéditos e foram preparados de acordo com os esquemas gerais 1-4 anteriores.
Figure img0024
Figure img0025
[000107] (11E,20Z,23Z)-N,N-dimetilnonacosa-11,20,23-trien-10-amina (composto 44)
Figure img0026
[000108]
[000109] A uma solução de LDA (95 mmol, 47,5 mL de uma solução 2M) em THF (127 mL) resfriado a -78 oC foi adicionado acetato de t-butila. A reação foi agitada por 15 minutos, seguido pela adição de aldeído XI. A reação foi finalizada imediatamente com solução de cloreto de amônio, aquecida em temperatura ambiente e dividida entre água/pentano. Os constituintes orgânicos foram secos com sulfato de sódio, filtrados e evaporados a vácuo. LC/MS (M+H-tBu) = 325,4.
Figure img0027
[000110]
[000111] Hidróxi cetona XII (7 g, 18,4 mmol) foi dissolvida em diclorometano (150 mL), resfriada a 0 oC e tratada com Deoxo-Fluor (7,3 g, 33,1 mmol). A reação foi aquecida em temperatura ambiente com agitação por 16 horas, seguido por finalização com solução de bicarbonato de sódio. A reação foi dividida e os constituintes orgânicos foram secos com sulfato de sódio, filtrados e evaporados a vácuo. A cromatografia em coluna rápida (0-5 % de acetato de etila/hexanos) forneceu o e-flúor éster.
[000112] O intermediário de flúor éster (6 g, 15,6 mmol) em diclorometano foi tratado com cloreto de hidrogênio (157 mmol, 39,2 mL de uma solução 4M em dioxano), e a reação foi agitada em temperatura ambiente por 16 horas. A reação foi evaporada a vácuo para fornecer o ácido de e-flúor XIII desejado. LC/MS (M+H) = 327,3.
Figure img0028
[000113]
[000114] O ácido carboxílico com flúor XIII (5,1 g, 15,7 mmol), EDC (6,0 g, 31,4 mmol), cloridrato de N,O-dimetilidroxilamina (3,1g, 31,4 mmol), trimetilamina (4,0 g, 39,2 mmol) e HOAt (4,3 g, 31,4 mmol) foram combinados em DCM (78 mL) e agitados em temperatura ambiente por 16 horas. A reação foi dividida entre água/DCM e os constituintes orgânicos foram lavados com água (3x) e solução de NaOH (1x), secos com sulfato de sódio, filtrados e evaporados a vácuo. O material bruto foi purificado por cromatografia preparatória de fase reversa para fornecer a amida de Weinreb desejada XIV. LC/MS (M+H) = 370,4.
Figure img0029
[000115]
[000116] Uma solução de amida de Weinreb XIV (4,3 g, 11,7 mmol) em THF (50 mL) foi tratada com brometo de nonil-magnésio (23,4 mmol, 23,4 mL de uma solução 1M) em temperatura ambiente. A reação foi finalizada com solução de cloreto de amônio após 1 hora e dividida entre água e pentano. Os constituintes orgânicos foram secos com sulfato de sódio, filtrados e evaporados a vácuo. Este material foi transferido para o material bruto da próxima etapa.
Figure img0030
[000117]
[000118] A cetona XV (5,1 g, 11,7 mmol) foi tratada com dimetilamina (29,3 mmol, 14,7 mL de uma solução 2M em THF) e isopropóxido de titânio (IV) (6,7 g, 23,5 mmol), e a reação foi agitada em temperatura ambiente por 16 horas. À mistura de reação foi adicionado etanol (50 mL), seguido por boroidreto de sódio (0,67 g, 17,6 mmol). A reação foi carregada diretamente em uma coluna de sílica e purificada por cromatografia rápida (0-15 % de MeOH/DCM). O material exigiu uma segunda purificação por cromatografia de fase reversa preparatória para fornecer (11E,20Z,23Z)-N,N- dimetilnonacosa-11,20,23-trien-10-amina. HRMS calculado 446,4720, encontrado 446,4724. RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,48 (m, 1H), 5,37 (m, 4H), 5,23 (m, 1H), 2,78 (t, 2H), 2,58 (m, 1H), 2,22 (s, 6H), 2,04 (m, 6H), 1,56 (m, 1H), 1,30 (m, 31H), 0,89 (m, 6H).
[000119] O composto 45 é DLinKC2DMA da maneira descrita em Nature Biotechnology, 2010, 28, 172-176, WO 2010/042877 A1, WO 2010/048536 A2, WO 2010/088537 A2, e WO 2009/127060 A1.
Figure img0031
[000120]
[000121] Composto 46 é MC3 da maneira descrita em WO 2010/054401, e WO 2010/144740 A1.
Figure img0032
[000122]
[000123] COMPOSIÇÕES LNP
[000124] As seguintes composições de nanopartícula de lipídeo (LNPs) da presente invenção são usadas para a distribuição de oligonucleotídeos, especificamente RNAsi e RNAmi:
[000125] Lipídeo catiônico / Colesterol / PEG-DMG 56.6/38/5.4;
[000126] Lipídeo catiônico / Colesterol / PEG-DMG 60/38/2;
[000127] Lipídeo catiônico/ Colesterol / PEG-DMG 67.3/29/3.7;
[000128] Lipídeo catiônico / Colesterol / PEG-DMG 49.3/47/3.7;
[000129] Lipídeo catiônico / Colesterol / PEG-DMG 50.3/44.3/5.4;
[000130] Lipídeo catiônico / Colesterol / PEG-C-DMA / DSPC 40/48/2/10;
[000131] Lipídeo catiônico / Colesterol / PEG-DMG / DSPC 40/48/2/10; e
[000132] Lipídeo catiônico / Colesterol / PEG-DMG / DSPC 58/30/2/10.
[000133] Descrição do processo de LNP:
[000134] As nanopartículas de lipídeo (LNP) são preparadas por um processo de jato impingente. As partículas são formadas misturando lipídeos dissolvidos em álcool com RNAsi dissolvido em um tampão citrato. A razão de mistura de lipídeos para RNAsi é apontada como 45-55 % de lipídeo e 6545 % de RNAsi. A solução de lipídeo contém um lipídeo catiônico inédito da presente invenção, um lipídeo auxiliar (colesterol), lipídeo PEG (por exemplo, PEG-C-DMA, PEG-DMG), e DSPC em uma concentração de 5-15 mg/mL com um alvo de 9-12 mg/mL em um álcool (por exemplo, etanol). A razão dos lipídeos apresenta uma faixa de mol percentual de 25-98 para o lipídeo catiônico com um alvo de 35-65, o lipídeo auxiliar apresenta uma faixa de mol percentual de 0-75 com um alvo de 30-50, o PEG lipídeo apresenta uma faixa de mol percentual de 1-15 com um alvo de 1-6, e o DSPC apresenta uma faixa de mol percentual de 0-15 com um alvo de 0-12. A solução de RNAsi contém uma ou mais sequências de RNAsi em uma faixa de concentração de 0,3 a 1,0 mg/mL, com um alvo de 0,3 -0.9 mg/mL em uma solução de sal citrato com tampão sódio com o pH na faixa de 3,5-5. Os dois líquidos são aquecidos em uma temperatura na faixa de 15-40 °C, alvejando 30-40 °C, e a seguir são misturados em um misturador de jato impingente, formando imediatamente a LNP. A ID tee apresenta uma faixa de 0,25 a 1,0 mm e uma vazão total de 10-600 mL/min. A combinação de vazão e ID de tubulação apresenta o efeito de controlar o tamanho da partícula das LNPs entre 30 e 200 nm. A solução é então misturada com uma solução tamponada em um pH mais elevado com uma razão de mistura na faixa de 1:1 a 1:3 vol:vol, mas que alveja 1:2 vol:vol. Esta solução tamponada está em uma temperatura na faixa de 15-40 °C, alvejando 30-40 °C. As LNPs mistas são mantidas de 30 minutos a 2 horas antes em uma etapa de filtração de troca aniônica. A temperatura durante a incubação está na faixa de 15-40 °C, alvejando 30-40 °C. Após a incubação, a solução é filtrada por meio de um filtro 0,8 um contendo uma etapa de separação por troca iônica. Este processo usa as IDs de tubulação, que variam de ID 1 mm ID a ID 5 mm, e uma vazão de 10 a 2.000 mL/min. As LNPs são concentradas e filtradas por diálise por meio de um processo de ultrafiltração, onde o álcool é removido e o tampão citrato é trocado pela solução tampão final, tal como salina tamponada com fosfato. O processo de ultrafiltração usa um formato de filtração de fluxo tangencial (TFF). Este processo usa uma faixa de corte de peso molecular de membrana nominal de 30 -500 KD. O formato da membrana pode ser fibra oca ou cassete em lâmina reta. Os processos de TFF com o corte de peso molecular ideal mantêm a LNP no concentrado, e o filtrado ou permeado contém o álcool, tampão citrato e resíduos de tampão final. O processo TFF é um processo multietapas com uma concentração inicial, em uma concentração de RNAsi, de 1 -3 mg/mL. Após a concentração, a solução de LNPs é diafiltrada contra o tampão final em 10 -20 volumes para remover o álcool e realizar a troca de tampão. O material é então concentrado mais 1-3 vezes. As etapas finais do processo de LNP são esterilizar por filtração a solução concentrada de LNP e colocar o produto no frasco.
[000135] Procedimento analítico:
[000136] 1) Concentração de RNAsi
[000137] As concentrações de RNAsi duplex são determinadas por cromatografia líquida de alto desempenho por troca iônica forte (SAX- HPLC), usando o sistema Waters 2695 Alliance (Water Corporation, Milford MA) com um detector 2996 PDA. As LNPs, de outra forma referidas como veículos de distribuição de RNAi (RDVs), são tratadas com 0,5 % de Triton X-100 em RNAsi total livre e analisadas por separação SAX usando uma coluna Dionex BioLC DNAPac PA 200 (4 x 250 mm) com detecção por UV em 254 nm. A fase móvel é composta de A: NaClO4 25 mM, Tris 10 mM, 20 % de EtOH, pH 7,0 e B: NaClO4 250 mM, Tris 10 mM, 20 % de EtOH, pH 7,0 com gradiente linear de 0-15 minutos e vazão de 1 mL/min. A quantidade de RNAsi é determinada comparando com a curva padrão de RNAsi.
[000138] 2) Taxa de encapsulação
[000139] O reagente de fluorescência SYBR Gold é empregado na quantificação de RNA para monitorar a taxa de encapsulação de RDVs. Os RDVs com ou sem Triton X-100 são usados para determinar o RNAsi livre e a quantidade de RNAsi total. O ensaio é realizado usando um espectrofotômetro de microplacas SpectraMax M5e da Molecular Devices (Sunnyvale, CA). As amostras são excitadas em 485 nm e a emissão de fluorescência foi medida em 530 nm. A quantidade de RNAsi é determinada comparando com a curva padrão de RNAsi.
[000140] Taxa de encapsulação = (1- RNAsi livre/RNAsi total) x100 %
[000141] 3) Tamanho da partícula e polidispersibilidade
[000142] Os RDVs contendo 1 μg de RNAsi são diluídos em um volume final de 3 mL com PBS 1x. O tamanho da partícula e a polidispersibilidade das amostras são medidos por um método de espalhamento de luz dinâmico, usando o instrumento ZetaPALS (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY). A intensidade do espalhamento é medida com laser He-Ne a 25 °C com um ângulo de espalhamento de 90°.
[000143] 4) Análise do potencial zeta
[000144] Os RDVs contendo 1 μg de RNAsi são diluídos em um volume final de 2 mL com tampão Tris 1mM (pH 7,4). A mobilidade eletroforética das amostras é determinada usando o instrumento ZetaPALS (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY) com eletrodo e laser He-Ne como uma fonte de luz. O limite de Smoluchowski é presumido no cálculo dos potenciais zeta.
[000145] 5) Análise lipídica
[000146] As concentrações lipídicas individuais são determinadas por cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC), usando o sistema Waters 2695 Alliance (Water Corporation, Milford MA) com um detector em aerossol carregado com coroa (CAD) (ESA Biosciences, Inc, Chelmsford, MA). Os lipídeos individuais em RDVs são analisados usando uma coluna Agilent Zorbax SB-C18 (50 x 4,6 mm, 1,8 μm de tamanho da partícula) com CAD a 60 °C. A fase móvel é composta de A: 0,1 % de TFA em H2O e B: 0,1 % de TFA em IPA. A gradiente altera de 60 % de fase móvel A e 40 % de fase móvel B, a partir do tempo 0, para 40 % de fase móvel A e 60 % de fase móvel B em 1,00 minuto; 40 % de fase móvel A e 60 % de fase móvel B de 1,00 para 5,00 minutos; 40 % de fase móvel A e 60 % de fase móvel B de 5,00 minutos para 25 % de fase móvel A e 75 % de fase móvel B em 10,00 minutos; 25 % de fase móvel A e 75 % de fase móvel B de 10,00 minutos para 5 % de fase móvel A e 95 % de fase móvel B em 15,00 minutos; e 5 % de fase móvel A e 95 % de fase móvel B de 15,00 para 60 % de fase móvel A e 40 % de fase móvel B em 20,00 minutos com vazão de 1 mL/min. A concentração lipídica individual é determinada comparando a curva padrão com todos os componentes lipídicos nos RDVs com um ajuste de curva quadrática. O percentual molar de cada lipídeo é calculado com base em seu peso molecular.
[000147] Descrição do processo de LPN geral para formulações do composto 32:
[000148] As nanopartículas de lipídeo foram preparadas por um processo de jato impingente. As partículas foram formadas misturando lipídeos dissolvidos em álcool, com RNAsi dissolvido em um tampão citrato. A solução de lipídeo continha um lipídeo catiônico, um lipídeo auxiliar (colesterol), PEG (por exemplo, PEG-C-DMA, PEG-DMG) lipídeo, e DSPC em uma concentração de 5-15 mg/mL, com um alvo de 9-12 mg/mL em um álcool (por exemplo etanol). A razão dos lipídeos apresentou uma faixa de mol percentual de 25-98 para o lipídeo catiônico com um alvo de 35-65, o lipídeo auxiliar apresentou uma faixa de mol percentual de 0-75 com um alvo de 30-50, o lipídeo PEG apresentou uma faixa de mol percentual de 1-15 com um alvo de 1-6, e o DSPC apresentou uma faixa de mol percentual de 0-15 com um alvo de 0-12. A solução de RNAsi continha uma ou mais sequências de RNAsi, em uma faixa de concentração de 0,3 a 0,6 mg/mL com um alvo de 0,3-0,9 mg/mL, em uma solução de sal citrato com tampão sódio com o pH na faixa de 3,5-5. As duas soluções foram aquecidas a uma temperatura na faixa de 15-40 °C, alvejando 30-40 °C, e a seguir misturadas em um misturador de jato impingente que forma instantaneamente a LNP. A teeID apresentou uma variação de 0,25 a 1,0 mm e uma vazão total de 10-600 mL/minuto. A combinação de vazão e ID de tubulação apresentou o efeito de controlar o tamanho da partícula das LNPs entre 30 e 200 nm. A suspensão de LNP foi então misturada com uma solução tamponada em um pH mais elevado, com uma razão de mistura na faixa de 1:1 a 1:3 vol:vol, mas alvejando 1:2 vol:vol. Esta solução tamponada estava em uma temperatura na faixa de 15-40 °C, alvejando 30-40 °C. Esta suspensão de LNP foi misturada adicionalmente com uma solução tamponada, em um pH mais elevado e com uma razão de mistura na faixa de 1:1 a 1:3 vol:vol, mas alvejando 1:2 vol:vol. A solução tamponada estava em uma temperatura na faixa de 15-40 °C, alvejando 30-40 °C. As LNPs mistas ficaram retidas de 30 minutos a 2 horas antes de uma etapa de filtração de troca aniônica. A temperatura durante a incubação estava na faixa de 15-40 °C, alvejando 30-40 °C. Após a incubação, a suspensão de LPN foi filtrada por meio de um filtro de 0,8 um contendo uma etapa de separação por troca iônica. Este processo usou IDs de tubulação que variam de ID de 1 mm a ID de 5 mm, e uma vazão de 10 a 2.000 mL/minuto. As LNPs foram concentradas e diafiltradas por meio de um processo de ultrafiltração, onde o álcool foi removido e o tampão citrato foi trocado pela solução tampão final, tal como salina tamponada com fosfato. O processo de ultrafiltração usou um formato de filtração de fluxo tangencial (TFF). Este processo usou uma faixa de corte de peso molecular de membrana nominal de 30-500 KD. O formato da membrana era de fibra oca ou cassete em lâmina reta. Os processos TFF com o corte de peso molecular ideal mantiveram a LNP no concentrado, e o filtrado ou permeado continha o álcool, tampão citrato e resíduos de tampão final. O processo TFF é um processo multietapas com uma concentração inicial a uma concentração de RNAsi de 1-3 mg/mL. Após a concentração, a suspensão de LPN foi diafiltrada contra o tampão final em 10 -20 volumes para remover o álcool e realizar a troca de tampão. O material foi então concentrado mais 1-3 vezes. As etapas finais do processo de LNP foram filtrar por esterilização a solução de LNP concentrada e colocar o produto em frascos.
[000149] Procedimento analítico:
[000150] Concentração de RNAsi
[000151] As concentrações de RNAsi duplex foram determinadas por cromatografia líquida de alto desempenho por troca iônica forte (SAX-HPLC), usando o sistema Waters 2695 Alliance (Water Corporation, Milford MA) com um detector 2996 PDA. As LNPs, de outra forma referidas como veículos de distribuição de RNAi (RDVs), foram tratadas com 0,5 % de Triton X-100 em RNAsi total livre e analisadas por separação SAX usando uma coluna Dionex BioLC DNAPac PA 200 (4 x 250 mm) com detecção por UV em 254 nm. A fase móvel foi composta de A: NaClO4 25 mM, Tris 10 mM, 20 % de EtOH, pH 7,0 e B: NaClO4 250 mM, Tris 10 mM, 20 % de EtOH, pH 7,0, com um gradiente linear de 0-15 minutos e uma vazão de 1 mL/minuto. A quantidade de RNAsi foi determinada comparando com a curva padrão de RNAsi.
[000152] Taxa de encapsulação
[000153] O reagente de fluorescência SYBR Gold foi empregado na quantificação de RNA para monitorar a taxa de encapsulação de RDVs. Os RDVs com ou sem Triton X-100 foram usados para determinar a quantidade de RNAsi livre e de RNAsi total. O ensaio é realizado usando um espectrômetro de microplacas SpectraMax M5e da Molecular Devices (Sunnyvale, CA). As amostras foram excitadas a 485 nm e a emissão de fluorescência foi medida em 530 nm. A quantidade de RNAsi é determinada comparando com uma curva padrão de NAsi.
[000154] Taxa de encapsulação = (1-NAsi livre/NAsi total) x100 %
[000155] Tamanho da partícula e polidispersibilidade
[000156] Os RDVs contendo 1 μg de RNAsi foram diluídos em um volume final de 3 mL com PBS 1x. O tamanho da partícula e a polidispersibilidade das amostras foram medidos por um método de espalhamento de luz dinâmico usando o instrumento ZetaPALS (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY). A intensidade do espalhamento foi medida com laser He-Ne a 25 °C, com um ângulo de espalhamento de 90°.
[000157] Análise do potencial zeta
[000158] Os RDVs contendo 1 μg de RNAsi foram diluídos em um volume final de 2 mL com tampão Tris 1mM (pH 7,4). A mobilidade eletroforética de amostras foi determinada usando o instrumento ZetaPALS (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY) com eletrodo e laser He-Ne como uma fonte de luz. O limite de Smoluchowski foi presumido no cálculo de potenciais zeta.
[000159] Análise lipídica
[000160] As concentrações lipídicas individuais foram determinadas por cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC), usando o sistema Waters 2695 Alliance (Water Corporation, Milford MA) com um detector em aerossol carregado com coroa (CAD) (ESA Biosciences, Inc, Chelmsford, MA). Os lipídeos individuais em RDVs foram analisados usando uma coluna Agilent Zorbax SB-C18 (50 x 4,6 mm, 1,8 μm de tamanho da partícula) com CAD a 60 °C. A fase móvel foi composta de A: 0,1 % de TFA em H2O e B: 0,1 % de TFA em IPA. O gradiente mudou de 60 % de fase móvel A e 40 % de fase móvel B no tempo 0 para 40 % de fase móvel A e 60 % de fase móvel B em 1,00 minuto; 40 % de fase móvel A e 60 % de fase móvel B de 1,00 para 5,00 minutos; 40 % de fase móvel A e 60 % de fase móvel B em 5,00 minutos para 25 % de fase móvel A e 75 % de fase móvel B em 10,00 minutos; 25 % de fase móvel A e 75 % de fase móvel B em 10,00 minutos para 5 % de fase móvel A e 95 % de fase móvel B em 15,00 minutos; e 5 % de fase móvel A e 95 % de fase móvel B em 15,00 minutos para 60 % de fase móvel A e 40 % de fase móvel B em 20,00 minutos, com uma vazão de 1 mL/minuto. A concentração lipídica individual foi determinada comparando a curva padrão com todos os componentes lipídicos nos RDVs, com um ajuste de curva quadrática. O percentual molar de cada lipídeo foi calculado com base em seu peso molecular.
[000161] Preparação de LNP geral por várias formulações na tabela 1.
[000162] As suspensões de nanopartícula com RNAsi na tabela 1 são preparadas dissolvendo RNAsis e/ou moléculas carreadoras em tampão citrato de sódio 20 mM (pH 5,0), em uma concentração de cerca de 0,40 mg/mL. As soluções de lipídeo são preparadas dissolvendo uma mistura de lipídeo catiônico (por exemplo, 32, ver estrutura na tabela 2), DSPC, colesterol e PEG-DMG (razões mostradas na tabela 1), em etanol absoluto, em uma concentração de cerca de 8 mg/mL. A razão nitrogênio para fosfato é aproximadamente 6:1.
[000163] Os volumes quase iguais de RNAsi/soluções carreadoras e lipídicas são distribuídos com duas bombas FPLC nas mesmas vazões em um conector T de mistura. Uma válvula antirretorno é usada para ajustar ao tamanho da partícula desejado. A mistura leitosa resultante é coletada em uma garrafa de vidro estéril. Esta mistura é então diluída com um volume igual de tampão citrato, seguido pelo volume igual de PBS (pH 7,4), e filtrada por meio de uma membrana de troca iônica para remover qualquer RNAsi/carreador livre na mistura. A ultrafiltração contra PBS (7,4) é empregada para remover o etanol e trocar o tampão. A LNP final é obtida concentrando em um volume desejado e esterilizando por filtração por meio de um filtro de 0,2 μm. As LNPs obtidas são caracterizadas em termo de tamanho da partícula, potencial zeta, teor de álcool, teor total de lipídeo, ácido nucleico encapsulado e concentração total de ácido nucleico.
[000164] Processo de fabricação de LNP
[000165] Em um exemplo não limitante, LNP é preparada em massa da maneira a seguir. O processo consiste em (1) preparar uma solução de lipídeo; (2) preparar uma solução de RNAsi/carreador; (3) mistura/formação de partícula; (4) incubação; (5) diluição; (6) ultrafiltração e concentração.
[000166] Preparação de solução de lipídeo
[000167] As garrafas de vidro de 2L para reagente e os cilindros de medição são despirogenados. Os lipídeos são aquecidos em temperatura ambiente. Na garrafa de vidro para reagente são transferidos 8,0 g do composto 32 com uma pipeta, e 1,2 g de DSPC, 3,5 g de colesterol, 0,9 g de PEG-DMG são adicionados. À mistura é adicionado 1L de etanol. A garrafa de reagente é colocada em banho maria aquecido, em uma temperatura que não excede 50 °C. A suspensão de lipídeo é agitada com uma barra de agitação. Uma sonda termoacopladora é colocada na suspensão por meio de um gargalo do frasco de fundo redondo com um adaptador selado. A suspensão é aquecida a 30-40 °C até se tornar clara. A solução é resfriada naturalmente em temperatura ambiente.
[000168] Preparação de solução de RNAsi/carreadora
[000169] Em um recipiente estéril, tal como a garrafa de armazenamento Corning, é pesado 0,4 g vezes o fator de correção da água (aproximadamente 1.2) de RNAsi-1 em pó. O RNAsi é transferido para uma garrafa de vidro de 2L despirogenada para reagente. O recipiente de pesagem é lavado 3x com tampão citrato (20 mM, pH 5,0) e os materiais de enxague são colocados nas garrafas de vidro de 2 L, QS com tampão citrato para 1 L. A concentração da solução de RNAsi é determinada com um espectrômetro de UV usando o procedimento a seguir. 20 μL são removidos da solução, diluídos 50 vezes em 1.000 μL, e a leitura em UV foi registrada em A260 nm após ler o branco com tampão citrato. Isto é repetido. Se as leituras para as duas amostras forem consistentes, uma média é obtida e a concentração é calculada com base nos coeficientes de extinção dos RNAsis. Se a concentração final estiver fora da faixa de 0,40 ± 0,01 mg/mL, a concentração é ajustada adicionando mais pó de RNAsi/carreador, ou adicionando mais tampão citrato. Este processo é repetido para o segundo RNAsi, se aplicável.
[000170] Alternativamente, se a solução de RNAsi/carreador for compreendida de um RNAsi duplex simples e/ou carreador duplex simples em vez de um coquetel de dois ou mais RNAsis duplex e/ou carreadores, então o RNAsi/carreador é dissolvido em tampão citrato 20 mM (pH 5,0) para fornecer uma concentração final de 0,4 mg/mL.
[000171] As soluções de lipídeo e etanol são então esterilizadas por filtração por meio de um filtro estéril Pall Acropak 20 de 0,8/0,2 μm PN 12203, em um vaso de vidro despirogenado, usando um modelo de bomba Master Flex Peristaltic 7520-40 para fornecer um material de partida estéril no processo de encapsulação. O processo de filtração é corrido em uma escala de 80 mL com uma área de membrana de 20 cm2. A vazão é 280 mL/minuto. Este processo é adaptável aumentando o diâmetro da tubulação e a área de filtração.
[000172] Formação de partícula- etapa de mistura
[000173] Usando uma bomba para puxar seringa dupla (Harvard 33 Twin Syringe), a solução estéril de lipídeo/etanol e as soluções de RNAsi/carreador estéril ou RNAsi/coquetel carreador/tampão citrato (tampão citrato 20 mM, pH 5.0) são misturadas em um misturador T de ID 0,5mm (estágio de mistura I) em vazões iguais oi quase iguais. A suspensão de LNP de escape resultante continha 40-50 % em volume de etanol. Quando uma suspensão de escape de etanol de 45 % em volume é desejada, o lipídeo/etanol estéril e as soluções estéreis de RNAsi/carreador ou RNAsi/coquetel de carreador/tampão citrato são misturados em vazões de 54 mL/min e 66 mL/min, respectivamente, de maneira tal que a vazão total do escape da mistura seja 120 mL/min.
[000174] Diluição
[000175] O fluxo de saída do estágio de mistura I é alimentado diretamente em um misturador T com ID de 4mm (estágio de mistura II), onde é diluído com uma solução tamponada em pH mais elevado (citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 300 mM, pH 6,0) em uma razão de 1:1 volume:volume %. Esta solução tamponada está em uma temperatura na faixa de 30-40 °C, e é distribuída no misturador T de 4mm por meio de uma bomba peristáltica (Cole Parmer MasterFlex L/S 600 RPM) em uma vazão de 120 mL/min.
[000176] O fluxo de saída do estágio de mistura II é alimentado diretamente em um misturador T com ID de 6mm (estágio de mistura III), onde é diluído com uma solução tamponada em pH mais elevado (PBS, pH 7,4) em uma razão de 1:1 volume:volume %. Esta solução tamponada está em uma temperatura na faixa de 15-25 °C, e é distribuída no misturador T de 6mm por meio de bomba peristáltica (Cole Parmer MasterFlex L/S 600 RPM) em uma vazão de 240 mL/min.
[000177] Incubação e remoção de RNAsi livre
[000178] O fluxo de saída do estágio de mistura III é mantido após a mistura para incubação de 30 minutos. A incubação é realizada em temperatura de 35-40 °C e a suspensão em processamento foi protegida da luz. Após a incubação, o RNAsi (não encapsulado) é removido por meio de troca aniônica com filtros de cromatografia Mustang Q (cápsulas). Antes do uso, os filtros de cromatografia são pré-tratados sequencialmente com descargas de NaOH 1N, NaCl 1M, e uma solução final de 12,5 % em volume de etanol em PBS. O pH da descarga final é verificado para garantir pH < 8. O fluxo de LNP incubada é então filtrado por meio de filtros Mustang Q através de bomba peristáltica (Cole Parmer MasterFlex L/S 600 RPM) em vazão de aproximadamente 100 mL/min. O fluxo filtrado é colocado em um recipiente de vidro estéril para ultrafiltração e concentração da maneira a seguir.
[000179] Ultrafiltração, concentração e esterilização por filtração
[000180] O processo de ultrafiltração é um processo longo e as vazões têm que ser monitoradas cuidadosamente. Este é um processo de duas etapas; a primeira é uma etapa de concentração a partir do material diluído e que o concentra em aproximadamente 8 vezes, em uma concentração de aproximadamente 0,3-0,6 mg/mL de RNAsi.
[000181] Na primeira etapa, um ponto de anel com uma membrana de ultrafiltração 100 kDa PES (Spectrum Labs) instalada é anexado a uma bomba peristáltica (Spectrum KrosFloII System). 9,2 L de água destilada estéril é adicionada ao reservatório; 3 L são drenados como resíduo e o restante é drenado por meio do permeado como resíduo. 5,3 L de hidróxido de sódio 0,25 N são adicionados ao reservatório com 1,5 L drenado como resíduo e 3,1 L são drenados por meio do permeado como resíduo. O hidróxido de sódio restante é mantido no sistema para sanitização (pelo menos 10 minutos), e a seguir a bomba é drenada. 9,2 L de 70 (v/v) % de álcool isopropílico são adicionados ao reservatório, com 1,5 L drenado como resíduo e o restante drenado por meio do permeado como resíduo. 6 L de tampão de condicionamento (12,5 % de etanol em salina tamponada com fosfato) são adicionados, com 1,5 L drenados como resíduo e o restante drenado por meio do permeado até o resíduo apresentar o pH neutro (7-8). Um valor de fluxo de membrana é registrado e a bomba é então drenada.
[000182] A solução diluída de LNP é colocada no reservatório na marca de 1,1 L. A bomba é ligada em 2,3 L/min. Após 5 minutos de recirculação, a bomba do permeado é ligada em 62,5 mL/min e o nível do líquido fica constante em aproximadamente 950 mL no reservatório. A solução diluída de LNP é concentrada a partir de 9,8 L para 1,1 L em 140 minutos e a bomba é desligada quando toda a solução diluída de LNP tiver sido transferida para o reservatório.
[000183] A segunda etapa é uma etapa de diafiltração que troca o etanol/tampão aquoso por salina tamponada com fosfato. Durante esta etapa, aproximadamente 10-20 volumes de salina tamponada com fosfato são usados para diafiltração. Após a diafiltração, uma segunda concentração é responsável por concentrar a suspensão de LPN 3 vezes em aproximadamente 1-1,5 mg/mL de RNAsi. A suspensão concentrada é coletada em garrafas plásticas de PETG. A suspensão final é então filtrada sequencialmente por meio de filtros Pall 0,45 um de PES e Pall 0,2 um de PES para esterilização final antes de preencher o frasco.
[000184] Em uma modalidade, uma composição de LNP da presente invenção compreende um lipídeo catiônico da fórmula A, colesterol, DSPC e PEG-DMG.
[000185] Em uma outra modalidade, uma composição de LNP da presente invenção compreende adicionalmente um crioprotetor.
[000186] Em uma outra modalidade, o crioprotetor é sacarose, trealose, rafinose, estaquiose, verbascose, manitol, glicose, lactose, maltose, maltotriose-heptaose, dextrano, hidroxietilamido, insulina, sorbitol, glicerol, arginina, histidina, lisina, prolina, dimetilsulfóxido ou qualquer combinação destes.
[000187] Em uma outra modalidade, o crioprotetor é sacarose.
[000188] Em uma outra modalidade, o crioprotetor é trealose.
[000189] Em uma outra modalidade, o crioprotetor é uma combinação de sacarose e trealose.
[000190] Em uma outra modalidade, a composição de LNP compreende o lipídeo catiônico (13Z,16Z)-N,N-dimetil-3-nonildocosa-13,16-dien-1-amina (composto 32), colesterol, DSPC e PEG-DMG.
[000191] As LNPs obtidas são caracterizadas em termos de tamanho da partícula, potencial zeta, teor de álcool, teor total de lipídeo, ácido nucleico encapsulado e concentração total de ácido nucleico.
[000192] Os versados na técnica podem entender facilmente que a presente invenção é bem adaptada para realizar os objetivos e obter as conclusões e vantagens mencionadas, bem como outros inerentes a esta. Os métodos e composições aqui descritos, da maneira atualmente representativa das modalidades preferidas, são exemplares e não são pretendidos como limitações no escopo da invenção. As mudanças nestes e outros usos serão realizadas pelos versados na técnica, as quais são incluídas no espírito da invenção, e são definidas pelo escopo das reivindicações.
[000193] Tabela 1: Composição de formulações de nanopartícula de lipídeo selecionadas
Figure img0033
[000194] Tabela 2: Estruturas químicas de lipídeos em formulações da tabela 1.
Figure img0034
Figure img0035
[000195] Utilizando o processo de LNP descrito anteriormente, as LNPs específicas com as seguintes razões foram identificadas:
[000196] Composição nominal:
[000197] Lipídeo catiônico / Colesterol / PEG-DMG 60/38/2
[000198] Lipídeo catiônico / Colesterol / PEG-DMG / DSPC 58/30/2/10
[000199] Luc RNAsi
[000200] 5’-iB-AUAAGGCUAUGAAGAGAUATT-iB 3’(SEQ.ID.NO.:1)
[000201] 3’-UUUAUUCCGAUACUUCUCUAU-5’ (SEQ.ID.NO.:2)
[000202] AUGC - Ribose
[000203] iB - Abásico desóxi invertido
[000204] UC - 2’ Flúor
[000205] AGT - 2’ Desóxi
[000206] AGU - 2’ OCH3
[000207] Composição nominal
[000208] Lipídeo catiônico /Colesterol/PEG-DMG 60/38/2
[000209] Lipídeo catiônico / Colesterol / PEG-DMG / DSPC 40/48/2/10
[000210] Lipídeo catiônico / Colesterol / PEG-DMG / DSPC 58/30/2/10
[000211 ] RNAsi de ApoB
[000212] 5’-iB-CUUUAA CAA UUCCU GAAA UTsT-iB-3’ (SEQ ID NO.:3)
[000213] 3’-UsUGAAAUUGUUAAGGACUsUsUsA-5’ (SEQ ID NO.:4)
[000214] AUGC - Ribose
[000215] iB - Abásico desóxi invertido
[000216] UC - 2’ Flúor
[000217] AGT - 2’ Desóxi
[000218] AGU - 2’ OCH3
[000219] UsA - ligação fosforotioato
[000220] RNAsi de beta-catenina
[000221] 5 ’ -iB -CUGUUGGAUUGAUUCGAAAUsU-iB-3 ’ (SEQ ID NO.:5)
[000222] 3’-UsUGA CA A CCUAA C UA AG CUUU-5’ (SEQ ID NO.:6)
[000223] AUGC - Ribose
[000224] iB - Abásico desóxi invertido
[000225] UC - 2’ Flúor
[000226] AGT - 2’ Desóxi
[000227] AGU - 2’ OCH3
[000228] UsA - ligação fosforotioato
[000229] 5’-iB-A C GA CUA GUUCAGUUGCUUUsU-iB-3’ (SEQ ID NO.:7)
[000230] 3’-UsUUGCUGAUCAAGU CAA CGAA-5’ (SEQ ID NO.:8)
[000231] AUGC - Ribose
[000232] iB - Abásico desóxi invertido
[000233] UC - 2’ Flúor
[000234] AGT - 2’ Desóxi
[000235] AGU - 2’ OCH3
[000236] UsA - ligação fosforotioato
[000237] 5’-iB-ACGACUAGUUCAGUUGCUUUU-iB-3’ (SEQ ID NO.:9)
[000238] 3’-UUUGCUGAUCAAGU CAA CGAA-5’ (SEQ ID NO.: 10)
[000239] AUGC - Ribose
[000240] iB - Abásico desóxi invertido
[000241] UC - 2’ Flúor
[000242] AGT - 2’ Desóxi
[000243] AGU - 2’ OCH3
[000244] UsA - ligação fosforotioato
[000245] A síntese de oligonucleotídeos é bem conhecida na técnica. (Ver pedidos de patente U.S.: U.S. 2006/0083780, U.S. 2006/0240554, U.S. 2008/0020058, U.S. 2009/0263407 e U.S. 2009/0285881, e pedidos de patente PCT: WO 2009/086558, WO2009/127060, WO2009/132131, WO2010/042877, WO2010/054384, WO2010/054401, WO2010/054405 e WO2010/054406). Os RNAsis revelados e utilizados nos exemplos foram sintetizados por meio de procedimentos padrões de fase sólida.
[000246] EXEMPLO 1
[000247] Avaliação da eficiência in vivo em camundongo
[000248] Os compostos 1-44 que utilizam LNP, nas composições nominais descritas imediatamente antes, foram avaliados com relação à eficiência in vivo. O RNAsi alveja o transcrito de RNAm do gene da luciferase de vaga-lume (Photinus piralis) (# de acesso M15077). A sequência primária e o padrão de modificação química do RNAsi da luciferase é exibida anteriormente. O modelo da luciferase in vivo emprega um camundongo transgênico, no qual a sequência codificante de luciferase de vaga-lume está presente em todas as células. Os camundongos transgênicos ROSA26- LoxP-Stop-LoxP-Luc (LSL-Luc), fornecidos pelo Dana Farber Cancer Institute, são induzidos a expressar o gene da luciferase reduzindo primeiro a sequência LSL com um vírus recombinante Ad-Cre (Vector Biolabs). Em virtude da natureza organotrópica do vírus, a expressão é limitada ao fígado quando este é distribuído por meio da injeção na veia caudal. Os níveis de expressão da luciferase no fígado são quantificados medindo a emissão de luz, usando um imageador IVIS (Xenogen), após a administração do substrato luciferina (Caliper Life Sciences). Os níveis de luminescência pré-dose são medidos antes da administração dos RDVs. A luciferina em PBS (15mg/mL) é injetada intraperitonealmente (IP) em um volume de 150 μL. Após um período de incubação de quatro minutos, os camundongos são anestesiados com isoflurano e colocados no imageador IVIS. Os RDVs (contendo RNAsi) em veículo de PBS foram injetados pela veia caudal tail em um volume de 0,2 mL. Os níveis finais da dose variaram de 0,1 a 0,5 mg/kg de RNAsi. O veículo PBS sozinho foi dosado como um controle. Os camundongos foram imageados 48 horas após a dose, usando o método descrito anteriormente. As mudanças na emissão de luz luciferina estão diretamente relacionadas com os níveis de RNAm da luciferase e representam uma medição indireta da atividade do RNAsi da luciferase. Os resultados da eficiência in vivo são expressos como % de inibição da luminescência com relação aos níveis de luminescência pré-dose. A administração sistêmica dos RDVs do RNAsi da luciferase diminuiu a expressão da luciferase de uma maneira dose dependente. A melhor eficiência foi observada em camundongos dosados com o composto 1 contendo os RDVs do que com o lipídeo catiônico octil-CLinDMA (OCD) contendo RDV (figura 1). O OCD é conhecido e descrito em WO2010/021865. Uma eficiência similar foi observada em camundongos dosados com os compostos 32 e 33 contendo RDVs, com relação ao lipídeo catiônico MC3 (composto 46) contendo RDV (Figura 11).
[000249] EXEMPLO 2
[000250] Ensaio de ligação de ApoE in vitro
[000251] As LNPs são incubadas a 37 oC em soro de macaco reso a 90 %, em uma concentração final de LPN de 4ug/mL. A incubação é por 20 minutos com rotação orbital. Após incubação, as amostras são diluídas 1:20 em PBS e 100 μL de cada amostra diluída é aliquotada nos poços de uma placa de 96 poços revestida com anticorpo anti-PEG (Life Diagnostics Cat. No. P-0001PL). Após a incubação em temperatura ambiente por 1 hora, a placa é lavada 5X com 300 μL de PBS. Após lavar, 50 μL de Triton X-100 0,2 % são adicionados a cada poço e a placa é incubada a 37 oC por 10 minutos, seguido por agitação em um agitador de placas por 1 minuto a 750 rpm. As amostras são congeladas antes de realizar o ApoE ELISA e a análise de PCR do tipo haste-laço das amostras.
[000252] Um ensaio ApoE ELISA é realizado para quantificar ApoE ligado às LNPs após incubação em soro de macaco reso. O anticorpo anti- ApoE (Milipore, Cat No. AB947) é diluído 1:1.000 em PBS, e 100 μL do anticorpo diluído é adicionado a cada poço de uma placa de poliestireno de alta ligação. A placa com anticorpo é incubada por toda a noite a 4oC, após o que a placa é lavada 2X com 200 μL de PBS. A seguir, 200 μL de tampão contendo BSA 1 % e Tween-20 0,05 % em PBS (tampão de incubação) são adicionados a cada poço, seguido por incubação em temperatura ambiente por 1 hora. As placas são lavadas 5X com PBS contendo Tween-20 0,05 %. As amostras de teste Triton para lise congeladas são descongeladas e diluídas 1:6 com tampão de incubação, e 100 μL de amostra de teste são aliquotados nos poços da placa com anticorpo ApoE. A incubação é por 1 hora em temperatura ambiente, seguido por uma lavagem de 5X com PBS contendo Tween-20 0,05 %. Após a lavagem, 100 μL de anticorpo anti-ApoE biotinilado (Mabtech, Cat. ANo. E887-biotina), diluído 1:500 em tampão de incubação, são adicionados em cada poço e incubados por 1 hora em temperatura ambiente, seguido por uma lavagem de 5X com Tween-20 0,05 % em PBS. 100 μL por poço de estreptavidina-HPR (Thermo, Cat. No. TS- 125-HR) são então adicionados e incubados por 1 hora em temperatura ambiente. Após lavar 5X com Tween-20 0,05 % em PBS, 100 μL do substrato TMB (Thermo, Cat. No. 34028) são adicionados em cada poço, seguido por incubação em temperatura ambiente por 20 minutos no escuro. A reação colorimétrica é finalizada com 100 μL de solução de parada TMB (KPL, Cat. No. 50-85-04) e a absorbância em 450nm é determinada. Uma curva padrão de ApoE é preparada diluindo ApoE recombinante de macaco reso em tampão de incubação com Triton X-100 0,03 %, com concentrações que variam de 100 ng/mL a 0,78 ng/mL. Os padrões de ApoE são avaliados no ELISA em paralelo às amostra de teste. Um soro de macaco reso apenas controle (sem LNP) é utilizado para obter uma subtração de fundo com relação ao sinal ApoE não dependente de LNP no ELISA.
Protocolo de RT-PCR do tipo haste-laço
[000253] Para normalizar o ApoE ligado à quantidade de LNP ligada à placa de anticorpo anti-PEG, a quantidade de RNAsi mantido no poço com anticorpo anti-PEG é verificada por PCR do tipo haste-laço, e está relacionada ao número de RNAsis encapsulados por LNP para fornecer uma medição aproximada de partículas de LNP total ligadas por poço.
Preparação das amostras de curva padrão:
[000254] A curva padrão é preparada de reforço usando o peso molecular do RNAsi (13.693 g/mol para ApoB 17063) para calcular o número de cópias. O padrão elevado pode conter 1011 cópias por 3 μL. Uma diluição seriada de 10 vezes é realizada através de uma ordem de uma placa de ensaio, até que o menor padrão contenha 102 cópias por 3μL. O Triton X-100 0,2 % é diluído 1:80 em água e 20 μL do Triton X-100 diluído são pipetados em 10 poços de uma placa de 96 poços. 30 μL da curva padrão diluída e misturada em série são adicionados em cada poço da placa. 10 μL da curva padrão de reforço são usados na reação de transcrição reversa.
[000255] RT-PCR do tipo haste-laço - amostra de testes e curva padrão:
[000256] Os lisados obtidos com Triton a partir da captura na placa com anticorpo PEG são diluídos 1 para 2.000 em água sem nuclease. 10 μL de “mistura de oligonucleotídeo iniciador para RT” (Estojo de transcrição reversa TaqMan MicroRNA da Applied Biosystem, Cat. No. 4366596) são adicionados em cada poço de uma placa de 96 poços Micro-Amp QPCR (ABI Cat# N801-0560).
Figure img0036
Figure img0037
Sequência de oligonucleotídeo iniciador ApoB RT: 5’ GTCGTATCCAGTGC AGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTTTAACA3’(SEQ.ID. NO.:11)
[000257] 10 μL de cada amostra de teste (diluída 1 para 2.000) ou curva padrão de reforço (anterior) são aliquotados na placa de 96 poços. A placa é coberta com uma tampa (ABI Cat. No. N801-0550) para minimizar a evaporação. A placa é centrifugada rapidamente a 800 rpm por 1 minuto. A seguir, a placa é corrida em um termociclador usando os seguintes parâmetros de ciclos:
Figure img0038
[000258] A seguir, 10 μL de “mistura para RT” são adicionados em cada poço (Estojo de transcrição reversa TaqMan MicroRNA da Applied Biosystem, Cat. No. 4366596)
Figure img0039
[000259] A reação dos ciclos de RT é composta de 10 μL de amostra de teste, 10 μL de mistura de oligonucleotídeo iniciador para RT e 10 μL de componentes de mistura para RT, em um volume total de 30 μL. A concentração final do oligonucleotídeo iniciador RT no total de 30 μL de mistura para RT total é de 200 nM. A placa é então selada com a mesma tampa de placa, centrifugada rapidamente em 800 rpm por 1 minuto, e a seguir corrida no termociclador usando os seguintes parâmetros de ciclos:
Figure img0040
[000260] A seguir, 15 μL de mistura de enzima Fast/oligonucleotídeo iniciador-sonda são adicionados em cada poço de uma nova placa de 96 poços Fast (mistura principal para PCR universal TaqMan Fast da Applied Biosystem, Cat. No. 4352042)
Figure img0041
Oligonucleotídeos iniciadores ApoB e sequência da sonda: 17063DC F3 GGCGCGAAATTTCAGGAATTGT (SEQ.ID.NO.:12) 17063DC PR2 CACTGGATACGACCTTTAACA (SEQ.ID.NO.:13) Universal R2 AGTGCAGGGTCCGAG (SEQ.ID.NO.:14)
[000261] 5 μL de cada reação RT são adicionados à placa de mistura de enzima Fast. A placa é centrifugada por 1 minuto a 1.000 rpm e a análise QPCR é realizada em um ABI7900 com bloco rápido. Os parâmetros dos ciclos são: 1 ciclo - 95 °C por 20 segundos, seguido por 40 ciclos- 95 °C por 1 segundo, 60 °C por 20 segundos.
[000262] O resultado da QPCR é utilizado para calcular a concentração de RNAsi nos lisados obtidos com Triton a partir da placa de captura com anticorpo PEG. Com base em uma estimativa de 500 RNAsi por partícula LNP, o número de LNPs mantida em cada poço da placa com anticorpo anti-PEG pode ser calculado. Usando a concentração de ApoE por poço, da maneira determinada pelo ApoE ELISA, e o número de partículas LNP por poço, um número aproximado de moléculas ApoE ligadas por partícula LNP pode ser calculado. # de moléculas ApoE ligadas por LNP
Figure img0042
EXEMPLO 3 Ensaio de ligação com heparina sepharose HI-TRAP™
[000263] As nanopartículas de lipídeo (LNP) com carga superficial neutra não são mantidas após a injeção com heparina-Sepharose em salina tamponada com fosfato de Dulbecco 1X (DPBS) como o tampão de corrida, mas podem eluir no volume vazio da coluna. A apolipoproteína E sérica (ApoE) exibe ligação de alta afinidade com sulfato de heparina, e isto mostra que as LNPs se ligam à heparina-Sepharose em um grau dependente de sua capacidade intrínseca de se ligar à ApoE (dependendo tanto da composição de nanopartícula de lipídeo quanto da concentração de ApoE) após a incubação com amostras humanas de ApoE ou séricas purificadas e/ou recombinantes. As nanopartículas de lipídeo com superfície ligada à ApoE se ligam à heparina-Sepharose com afinidade elevada e são eluídas apenas em alta concentração de sal (NaCl 1M).
[000264] Um ensaio de ligação de heparina-Sepharose foi desenvolvido para avaliar a ligação de ApoE sérica nas nanopartículas de lipídeo, com base na interação de alta afinidade que o complexo ApoE-LNP exibe para heparina-Sepharose.
Incubações
[000265] As nanopartículas de lipídeo foram incubadas a 37 °C por 20 min, em uma concentração final de RNAsi de 50 μg/mL, com várias concentrações de apolipoproteína E humana tanto purificada quanto recombinante, ou 0,1-50 % de soro de rato/camundongo/macaco reso/humano em salina tamponada com fosfato de Dulbecco 1X (DPBS). Após a incubação com ApoE ou soro, as amostras de LNP foram diluídas 10 vezes usando DPBS 1X e foram analisadas por cromatografia de afinidade em heparina- Sepharose. A área mais elevada de LNP mantida (após subtração dos sinais brancos apropriados) é comparada à área do pico total da incubação de LNP controle sem ApoE e/ou soro, para determinar o percentual da LNP que se submete ao deslocamento para interação com heparina de alta afinidade após incubação com ApoE/soro.
Condições cromatográficas de heparina Sepharose HI-TRAP™
[000266] Uma coluna de cromatografia de heparina-Sepharose HITRAP™ (GE Healthcare; 1 mL de volume do leito) é equilibrada tanto com PBS de Dulbecco 1X quanto com 2X; a concentração de sal 2X maior é usada para as LNPs com maior retenção intrínseca em heparina-Sepharose (provavelmente em virtude da maior carga superficial positiva).A fase móvel A: DPBS 1X ou 2X.A fase móvel B: NaCl 1M em tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,0.
[000267] 100 % de é A distribuído isocraticamente por 10 minutos,seguido pelo gradiente da etapa em 100 % de B; mantido por mais 10 minutos; o gradiente da etapa volta para 100 % de A e reequilibra por mais 10 minutos antes da injeção da próxima amostra.Vazão: 1 mL/min.Volume da injeção da amostra: 50 μL.Detecção: UV @260 nm.Resultados da ligação de HI-TRAP™ mediante incubação de soro de macaco reso (condições de DPBS 2X)
Figure img0043
EXEMPLO 4 Avaliação da eficiência e toxicidade in vivo em rato
[000268] Os compostos que utilizam LNPs nas composições nominais descritas anteriormente foram avaliadas com relação à eficiência in vivo e aos aumentos em alanina amino transferase e aspartato amino transferase em ratos fêmeas Sprague-Dawley (Crl:CD(SD) (Charles River Labs). O RNAsi alveja o transcrito de RNAm com relação ao gene ApoB (# de acesso NM 019287). A sequência primária e o padrão de modificação química do RNAsi de ApoB são exibidos anteriormente. Os RDVs (contendo RNAsi) em veículo PBS foram injetados na veia caudal em um volume de 1 a 1,5 mL. A taxa de é de aproximadamente 3 mL/min. Cinco ratos foram usados em cada grupo de dosagem. Após a administração de LNP, os ratos são colocados em gaiolas com dieta normal e água presentes. Seis horas após a dose, o alimento é removido das gaiolas. A necropsia do animal é realizada 24 horas após a dosagem de LNP. Os ratos são anestesiados com isoflurano por 5 minutos, a seguir são mantidos em anestesia colocando-os em cones nasais que continuam a distribuição de isoflurano até que a retirada de sangue seja completa. O sangue é coletado a partir da veia cava usando um conjunto de venopunção de escalpe com calibre 23, e aliquotado em tubos a vácuo com separador de soro para a análise química sérica. As punções do lobo hepático caudado excisado são obtidas e colocadas em RNALater (Ambion) para análise do RNAm. O tecido hepático conservado foi homogeneizado, e o RNA total foi isolado usando um moinho de microesferas da Qiagen e o estojo de isolamento de RNA RNAmi-Easy da Qiagen, seguindo as instruções do fabricante. Os níveis hepáticos de RNAm de ApoB foram determinados por RT-PCR quantitativa. O resultado foi amplificado a partir do RNA purificado, utilizando um conjunto de sondas comercial ApoB de rato (Applied Biosystems Cat # RN01499054_m1). A reação de PCR foi realizada em um instrumento ABI 7500 com um bloco rápido de 96 poços. O nível de RNAm em ApoB é normalizado com o RNAm interno PPIB (NM 011149). Os níveis de RNAm de PPIB foram determinados por RT-PCR usando um conjunto de sondas comercial (Applied Biosytems Cat. No. Mm00478295_m1). Os resultados são expressos como uma razão de RNAm de ApoB/RNAm de PPIB. Todos os dados de RNAm são expressos com relação à dose controle de PBS. A análise sérica de ALT e AST foi realizada no analisador químico Siemens Advia 1800 Clinical, que utiliza os reagentes alanina aminotransferase (Cat# 03039631) e aspartato aminotransferase (Cat# 03039631) da Siemens. A eficiência similar e melhor tolerabilidade foram observadas em ratos dosados com o composto 32 ou 33 contendo RDV, do que com o lipídeo catiônico DLinKC2DMA (composto 45) ou MC3 (composto 46, Figura 2) contendo RDV.
EXEMPLO 5 Determinação dos níveis lipídicos catiônicos no fígado de rato/macaco
[000269] O tecido hepático foi pesado em frascos de 20 mL e homogeneizado em 9 v/p de água usando um GenoGrinder 2000 (OPS Diagnostics, 1.600 batidas/minuto, 5min). Uma alíquota de 50 μL de cada homogenado tecidual foi misturada com 300 μL de solvente de extração/precipitação proteica (50/50 acetonitrila/metanol contendo padrão interno 500 nM), e a placa foi centrifugada para sedimentar a proteína precipitada. Um volume de 200 μL de cada sobrenadante foi então transferido para os poços separados de uma placa de 96 poços, e 10 μL das amostras foram analisados diretamente por LC/MS-MS.
[000270] Os padrões foram preparados aumentando as quantidades conhecidas de uma solução estoque de metanol, a partir do composto do fígado não tratado do homogenado de rato (9 volumes de água/peso de fígado). As alíquotas (50 μL) de cada homogenado padrão/hepático foram misturadas com 300 μL de solvente de extração/precipitação proteica (50/50 acetonitrila/metanol contendo padrão interno 500 nM), e a placa foi centrifugada para sedimentar a proteína precipitada. Um volume de 200 μL de cada sobrenadante foi transferido para poços separados de uma placa de 96 poços, e 10 μL de cada padrão foram analisados diretamente por LC/MS-MS.
[000271] A quantificação absoluta versus os padrões preparados e extraídos do homogenado hepático foi realizada usando um sistema de HPLC Aria LX-2 (Thermo Scientific) acoplado a um espectrômetro de massa triplo quadrupolo API 4000 (Applied Biosystems). Para cada corrida, um total de 10 μL de amostra foi injetado em uma coluna BDS Hypersil C8 HPLC (Thermo, 50 x 2mm, 3 μm) em temperatura ambiente.
[000272] Fase móvel A: 95 % de H2O/5 % de metanol/formato de amônio 10 mM/0,1 %de ácido fórmico. Fase móvel B: 40 % de metanol/60 % de n-propanol/formato de amônio 10 mM/0,1 % de ácido fórmico. A vazão foi de 0,5 mL/min e o perfil de eluição do gradiente foi da maneira a seguir: manter 80 % de A por 0,25 minuto, aumento linear para 100 % de B por 1,6 minuto, manter a 100 % de B por 2,5 minutos, a seguir retornar e manter em 80 % de A por 1,75 minuto. O tempo total de corrida foi 5,8 minutos. Os parâmetros da fonte API 4000 foram CAD: 4, CUR: 15, GS1: 65, GS2: 35, IS: 4000, TEM: 550, CXP: 15, DP: 60, EP: 10.
[000273] Nos ratos dosados com o composto 32 ou 33 contendo RDV, os níveis hepáticos foram tanto similares quanto menores que o lipídeo catiônico DLinKC2DMA (composto 45) ou MC3 (composto 46, Figura 3) contendo RDV contendo. Em macacos dosados com o composto 32 ou 33 contendo RDV, os níveis hepáticos foram menores que o lipídeo catiônico DLinKC2DMA (composto 45) ou MC3 (composto 46, Figura 7) contendo o RDV.
EXEMPLO 6 Avaliação da eficiência de ApoB in vivo em macaco reso
[000274] Os compostos que utilizam LNPs nas composições nominais descritas anteriormente foram avaliados com relação à eficiência in vivo em macacos Macaca mulatta (reso) machos ou fêmeas. O RNAsi alveja o transcrito de RNAm com relação ao gene ApoB (# de acesso XM 001097404). A sequência primária e o padrão de modificação química do RNAsi de ApoB são exibidos anteriormente. Os RDVs (contendo RNAsi) em veículo PBS foram administrados por injeção intravenosa na veia safena, em uma taxa de injeção de 20 mL/minuto com um nível de dose de 0,25 mg/quilograma de RNAsi. Os volumes de injeção foram de 1,9 a 2,1 mL/quilograma e os macacos variaram em peso de 2,5 a 4,5 quilogramas. O RDV ou PBS controle foram administrados à três macacos. Vários dias após a dose, amostras de 1 mL de sangue foram retiradas a partir da artéria femoral para análise química sérica. Os macacos foram jejuados por toda a noite antes da coleta do sangue. Como uma medição de eficiência, LDL-C foi monitorado como um marcador substituto à jusante de redução de RNAm de ApoB. Em 4 dias após a administração sistêmica de compostos 32 e 33 (0.25 mg/kg) contendo os RDVs, os níveis séricos de LDL-C foram reduzidos para menos de 30 % dos níveis pré-dose (figura 4).
EXEMPLO 7 Avaliação da eficiência de β-catenina in vivo em macaco reso
[000275] No estudo, as amostras de biópsia de fígado pré-dose de 7 dias (~0,5-1 grama/amostra) foram coletadas a partir de macacos reso machos por ressecção cirúrgica laparoscópica (ressecção de uma amostra de biópsia a partir da extremidade externa de um lobo hepático selecionado aleatoriamente por macaco). Um fragmento tecidual de 5 mm foi usado para amostrar três amostras de ~50 mg não adjacentes, a partir de cada biópsia pré-dose. As amostras foram conservadas em RNAlater™ (Ambion) para analise posterior de RNAm de CTNNB1.
[000276] No dia 0 do estudo, foram administradas aos macacos as suspensões dos artigos de teste de nanopartícula de lipídeo (LNP) em salina tamponada com fosfato (0,05-0,1 mg de RNAsi/mL), por meio de injeção em bolo intravenosa de dose única em doses alvo de 0,67, 1,34 ou 3,34 mg de RNAsi/m2. Com propósitos de dosagem, a área de superfície corporal (m2) foi estimada a partir do peso corporal, de acordo com a relação de escala alométrica estabelecida fornecida a seguir (1):BSA (m2)= 0,11 * BW(em kg) 0.65
[000277] Nos dias 2 e 7 do estudo, em 48 horas e 168 horas após a administração de LNP, as amostras da biópsia de fígado (~0,5-1 grama/amostra) foram coletadas dos macacos por ressecção cirúrgica laparoscópica (2 lobos hepáticos separados e selecionados aleatoriamente foram resseccionados por macaco). Um fragmento tecidual de 5 mm foi usado para amostrar três amostras de ~50 mg não adjacente para cada amostra de biópsia cirúrgica de 48 horas e 168 horas. As amostras foram conservadas em RNAlater™ (Ambion) para análise posterior do RNAm de CTNNB1.
[000278] Os níveis de RNAm de CTNNB1 foram medidos por RT-PCR quantitativa relativa, usando um conjunto de oligonucleotídeo iniciador/sonda validado com relação a CTNNB1 e normalizado contra os níveis de RNAm de peptidilprolil isomerase B (também denominado PPIB ou ciclofilina B) e contra os níveis de RNA do RNA 18S ribossomal (RNAr 18S) . A alteração na expressão hepática de RNAm de CTNNB1 RNAm foi medida como a diferença no número de ciclos limites de PCR (ΔΔCt) entre as amostras pós- dose, e em cada uma das amostras de fígado pré-dose de macaco correspondente.
[000279] O cálculo do silenciamento do RNAm de CTNNB1 (com relação aos níveis de pré-tratamento) foi realizado a partir de ΔΔCt, usando a seguinte relação: RNAm (% de silenciamento)= 100- (100/2-ΔΔCt)
[000280] Os macacos dosados com os compostos 32 e 33 e o RNAsi de beta-catenina contendo RDVs demonstraram KD de maneira acentuada, em doses que variam de 0,67 - 3,34 mg/m2 (Figura 5). (1) DOCUMENTO DE ORIENTAÇÃO DO FDA: “Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers” Julho de 2005, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug AdministrationCenter for Drug Evaluation and Research (CDER)
EXEMPLO 8 Avaliação do aumento de ALT in vivo em macaco reso
[000281] A alanina aminotransferase (ALT) é medida no soro que é coletado do sangue total coagulado de macaco após centrifugação. Um analisador químico automatizado de sistema modular da Roche mede a atividade enzimática de ALT no soro usando procedimentos e reagentes da International Federation of Clinical Chemistry. O computador do analisador usa medições de absorbância para calcular a atividade de ALT na amostra, de maneira comparada a uma curva padrão. A atividade de ALT é registrada em unidades internacionais por litro (IU/L).
[000282] Os macacos dosados com compostos 32 e 33 contendo RDVs apresentaram elevações de ALT com picos mais baixos do que aqueles dosados com o lipídeo catiônico DLinKC2DMA (composto 45) ou MC3 (composto 46, Figura 6) contendo o RDV.
EXEMPLO 9 Avaliação do modelo de carcinoma hepatocelular em camundongo
[000283] A atividade de LNPs na distribuição de um RNAsi de β- catenina (RNAsiβ-cat) no carcinoma hepatocelular foi avaliada em um modelo de carcinoma hepatocelular (HCC) em camundongo, denominado TRE-MET. Os camundongos TRE-MET são camundongos transgênicos em uma base genética FVB/N, onde o transgene MET humano é expresso em um promotor hCMV com operadores tet heptamerizados à montante. Quando os camundongos TRE-MET são cruzados com a linhagem LAP-tTA, os camundongos transgênicos duplos (TRE-MET/LAP-tTA) expressam MET de uma maneira específica do fígado, o que pode ser suprimido por administração de doxiciclina. Estes camundongos desenvolvem HCC em ~ 3 meses de idade, com nódulos tumorais visualmente identificáveis na superfície do fígado, e os tumores desempenham um padrão de crescimento trabecular difuso típico de HCC e expressam a alfa-fetoproteína marcadora de tumor HCC (AFP). Além do mais, a análise da mutação no tumor de camundongos TRE-MET também foi identificada ativando mutações no gene beta-catenina em aproximadamente 95 % dos tumores. Estas características tornam o modelo de camundongo TRE-MET HCC adequado para avaliar a distribuição de RNAsi de β-catenina mediada por LNP e a eficiência resultante no crescimento do tumor.
[000284] O efeito de LNPs contendo β-catenina no silenciamento de RNAm de β-catenina, tanto nos tecidos do fígado quanto nos tecidos tumorais, foi avaliado primeiro em um estudo farmacodinâmico (PD) em camundongos TRE-MET que carregam tumores. Diferentes doses de LNPs ou uma dose elevada de RNAsi de LNP controle foram administradas intravenosamente, e após 72 horas a necropsia foi realizada para coletar os tecidos do fígado e de tumor para a determinação dos níveis de RNAm de β- catenina por Taqman. Da maneira mostrada nas figuras 8 e 9, o composto 33 induziu o silenciamento acentuado e dose-dependente de RNAm de β- catenina, tanto nos tecidos do fígado quanto do tumor, ao passo que nenhum silenciamento de β-catenina foi observado em animais que receberam o RNAsi controle ou PBS. 0,1 mpk e 0,05 mpk de LNP induziram 88 % e 69 % KD em fígado normal, respectivamente. KD em tumores variou de 70 % (2 mpk) a cerca de 40 % (0,1 ou 0,05 mpk). Da maneira mostrada nas figuras 12 e 13, o composto 32 induziu silenciamento acentuado e dose-dependente de RNAm de β-catenina tanto nos tecidos do fígado quanto de tumor, ao passo que nenhum silenciamento de β-catenina foi observado em animais que receberam RNAsi controle ou PBS. 0,1 mpk e 0,05 mpk de LNP induziram 76 % e 78 % KD no fígado normal, respectivamente. KD em tumores variou de 47 % (0,25 mpk) a cerca de 20-30 % (0,1 ou 0,05 mpk).
[000285] O efeito de LNP no crescimento do tumor foi avaliado em um estudo de eficiência de dose múltipla. Os camundongos TRE-MET HCC foram dosados com o composto 33/RNAsiβ-cat, composto 32/RNAsib-cat, RNAsi controle ou PBS semanalmente, durante 3 semanas (3 doses), e o volume do tumor em cada animal foi determinado 7 dias antes da 1a dose e 3 dias após a dose final por varredura microCT (figuras 10 e 14). Além do mais, 7 dias após a dose final, os tecidos do fígado e de tumor foram coletados para a avaliação dos níveis de RNAm de β-catenina. Enquanto os camundongos que receberam PBS ou RNAsi controle mostraram 360-470 % de crescimento na carga tumoral, os camundongos tratados com o composto 33/RNAsiβ-cat exibiram intensa inibição ou regressão do crescimento do tumor, de uma maneira dose-dependente (figura 10). 2 mpk e 0,5 mpk do composto 33/RNAsiβ-cat induziram 60 % e 40 % de regressão do tumor, respectivamente, e 0,05 mpk causou a estagnação tumoral. Enquanto os camundongos que receberam PBS ou RNAsi controle mostraram ~350 % de crescimento na carga tumoral, os camundongos tratados com o composto 32/RNAsiβ-cat exibiram inibição ou regressão acentuada no crescimento do tumor, de uma maneira dose-dependente (figura 14). 0,5, 0,25 e 0,1 mg/kg de composto 32/RNAsiβ-cat induziram 37, 58, e 37 % da regressão tumoral, respectivamente, e 0,05 mpk causou a estagnação tumoral.

Claims (8)

1. Lipídeo catiônico, caracterizado pelo fato de ser da formula A:
Figure img0044
em que:R1 e R2 são independentemente selecionados de alquila (C1-C6),ou R1 e R2 podem ser ligados ao nitrogênio no qual são anexados para formar um anel pirrolidina;R3 é H;n é 0, 1 ou 2;L1 é selecionado de C12-C24 alcadienila ou alquila de cadeialinear e alquenila C12-C24 de cadeia linear selecionadas de:
Figure img0045
em que a dita alcadienila, alquila e alquenila são opcionalmente substituídas por um ou mais substituintes selecionados de R’;R’ é independentemente selecionado de Halogênio, R”, OR”, SR”, CN, CO2R” ou CON(R”)2; R” é independentemente selecionado de H e alquila (C1-C6), em que a referida alquila é opcionalmente substituída com halogênio e OH; eL2 é selecionado de alquila C3-C9 e alquenila C3-C9,ou qualquer sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero destes.
2. Lipídeo catiônico da fórmula A de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que:R1 e R2 são cada qual metila; en é 0;ou qualquer sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero destes.
3. Lipídeo catiônico da fórmula A de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que:R1 e R2 são cada qual metila; en é 2;ou qualquer sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero destes.
4. Lipídeo catiônico, caracterizado pelo fato de que é selecionado de:(20Z,23Z)-N,N-dimetil-nonacosa-20,23-dien-10-amina(composto 1);(17Z,20Z)-N,N-dimetil-hexacosa-17,20-dien-9-amina(composto 2);(16Z,19Z)-N,N-dimetil-pentacosa-16,19-dien-8-amina (composto 3);(13Z,16Z)-N,N-dimetil-docosa-13,16-dien-5-amina (composto 4);(12Z,15Z)-N,N-dimetil-henicosa-12,15-dien-4-amina(composto 5); (14Z,17Z)-N,N-dimetil-tricosa-14,17-dien-6-amina (composto 6);(15Z,18Z)-N,N-dimetil-tetracosa-15,18-dien-7-amina(composto 7);(18Z,21Z)-N,N-dimetil-heptacosa-18,21-dien-10-amina(composto 8);(15Z,18Z)-N,N-dimetil-tetracosa-15,18-dien-5-amina(composto 9);(14Z,17Z)-N,N-dimetil-tricosa-14,17-dien-4-amina (composto 10);(19Z,22Z)-N,N-dimetil-octacosa-19,22-dien-9-amina(composto 11);(18Z,21Z)-N,N-dimetil-heptacosa-18,21-dien-8-amina(composto 12);(17Z,20Z)-N,N-dimetil-hexacosa-17,20-dien-7-amina(composto 13);(16Z,19Z)-N,N-dimetil-pentacosa-16,19-dien-6-amina(composto 14);(22Z,25Z)-N,N-dimetil-hentriaconta-22,25-dien-10-amina(composto 15);(21Z,24Z)-N,N-dimetil-triaconta-21,24-dien-9-amina(composto 16);(19Z,22Z)-N,N-dimetil-octacosa-19,22-dien-7-amina(composto 19);(20Z,23Z)-N-etil-N-metil-nonacosa-20,23-dien-10-amina(composto 21);1-[(11Z,14Z)-1-nonilicosa-11,14-dien-1-il]pirrolidina(composto 22);(12Z,15Z)-N,N-dimetil-2-nonilhenicosa-12,15-dien-1-amina (composto 31);(13Z,16Z)-N,N-dimetil-3-nonildocosa-13,16-dien-1-amina (composto 32);N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]heptadecan-8-amina (composto 33);1-[(1S,2R)-2-hexilciclopropil]-N,N-dimetilnonadecan-10- amina (composto 34);N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]nonadecan-10- amina (composto 35);N,N-dimetil-21-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]henicosan-10- amina (composto 36);N,N-dimetil-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-pentilciclopropil]metil}ciclopropil]nonadecan-10-amina (composto 37);N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]hexadecan-8-amina (composto 38);N,N-dimetil-1-[(1R,2S)-2-undecilciclopropil]tetradecan-5- amina (composto 39);1-[(1R,2S)-2-heptilciclopropil]-N,N-dimetiloctadecan-9-amina (composto 41);1-[(1S,2R)-2-decilciclopropil]-N,N-dimetilpentadecan-6- amina (composto 42); eN,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]pentadecan-8-amina (composto 43);ou qualquer sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero destes.
5. Composição de LNP, caracterizada pelo fato de que compreende um lipídeo catiônico da fórmula A como definido na reivindicação 1 ou 4, colesterol, DSPC e PEG-DMG.
6. Uso de um lipídeo catiônico como definido na reivindicação 1 ou 4, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de nanopartículas de lipídeo.
7. Uso de um lipídeo catiônico como definido na reivindicação 1 ou 4, caracterizado pelo fato de que é como um componente em uma nanopartícula de lipídeo para a distribuição de oligonucleotídeos.
8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os oligonucleotídeos são RNAsi.
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