CN103167866B - 用于寡核苷酸递送的新型低分子量阳离子脂质 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可以与其它脂质组分如胆固醇和PEG-脂质联合使用以与寡核苷酸形成脂质纳米粒的新型阳离子脂质。本发明的一个目的是提供表现出增强的效力以及由于肝中较低的脂质水平而导致的较低的肝毒性的阳离子脂质支架。本发明使用具有一个短脂质链的低分子量阳离子脂质以增强siRNA的体内递送的效率和耐受性。

Description

用于寡核苷酸递送的新型低分子量阳离子脂质
发明背景
本发明涉及可以与其它脂质组分如胆固醇和PEG-脂质联合使用以与寡核苷酸形成脂质纳米粒、促进细胞摄取和内体逃逸以及在体外和体内敲低靶mRNA的新型阳离子脂质。
之前已经公开了阳离子脂质和阳离子脂质在用于递送寡核苷酸，特别是siRNA和miRNA的脂质纳米粒中的用途。之前已经公开了脂质纳米粒和脂质纳米粒用于递送寡核苷酸，特别是siRNA和miRNA的用途。之前已经公开了寡核苷酸（包括siRNA和miRNA）和寡核苷酸的合成。（参见美国专利申请：US 2006/0083780、US 2006/0240554、US 2008/0020058、US 2009/0263407和US 2009/0285881和PCT专利申请：WO 2009/086558、WO2009/127060、WO2009/132131、WO2010/042877、WO2010/054384、WO2010/054401、WO2010/054405和WO2010/054406）。还参见Semple S. C.等人，Rational design of cationic lipids for siRNA delivery, Nature Biotechnology, 2010, 28, 172-176。
在美国专利申请：US 2009/0263407、US 2009/0285881、US 2010/0055168、US 2010/0055169、US 2010/0063135、US 2010/0076055、US 2010/0099738和US 2010/0104629中公开了其它阳离子脂质。
传统阳离子脂质，如CLinDMA和DLinDMA已用于向肝递送siRNA，但受困于非最佳的递送效率以及在较高剂量下的肝毒性。本发明的一个目的是提供表现出增强的效力以及由于肝中较低的脂质水平而导致的较低的肝毒性的阳离子脂质支架（scaffold）。本发明使用具有一个短脂质链的低分子量阳离子脂质以增强siRNA的体内递送的效率和耐受性。
发明概述
本发明提供可以与其它脂质组分如胆固醇和PEG-脂质联合使用以与寡核苷酸形成脂质纳米粒的新型阳离子脂质。本发明的一个目的是提供表现出增强的效力以及由于肝中较低的脂质水平而导致的较低的肝毒性的阳离子脂质支架。本发明使用具有一个短脂质链的低分子量阳离子脂质以增强siRNA的体内递送的效率和耐受性。
附图简述
图1:  LNP（化合物1）在小鼠中的效力。
图2.  LNP（化合物32和33）在大鼠中的效力（ApoB siRNA）。
图3.  大鼠肝中的阳离子脂质（化合物32和33）水平。
图4.  LNP（化合物32和33，ApoB siRNA）在NHP中的效力。
图5.  LNP（化合物32和33，β-连环蛋白siRNA）在NHP中的效力。
图6.  LNP给药后NHP中的峰ALT水平(化合物32和33）。
图7.  NHP肝中的阳离子脂质（化合物32和33）水平。
图8.  TRE-Met小鼠中的肝β-连环蛋白mRNA KD（化合物33）。
图9.  TRE-Met小鼠中的肿瘤β-连环蛋白mRNA KD（化合物33）。
图10.  TRE-met小鼠中的肿瘤生长抑制（化合物33）。
图11.  LNP（化合物32和33）在小鼠中的效力。
图12.  TRE-Met小鼠中的肝β-连环蛋白mRNA KD（化合物32）。
图13.  TRE-Met小鼠中的肿瘤β-连环蛋白mRNA KD（化合物32）。
图14.  TRE-met小鼠中的肿瘤生长抑制（化合物32）。
发明详述
本发明的各种方面和实施方案涉及可用在脂质纳米粒中的新型阳离子脂质用于向任何靶基因递送寡核苷酸，特别是siRNA和miRNA的用途。（参见美国专利申请：US 2006/0083780、US 2006/0240554、US 2008/0020058、US 2009/0263407和US 2009/0285881和PCT专利申请：WO 2009/086558、WO2009/127060、WO2009/132131、WO2010/042877、WO2010/054384、WO2010/054401、WO2010/054405和WO2010/054406）。还参见Semple S. C.等人，Rational design of cationic lipids for siRNA delivery, Nature Biotechnology, 2010, 28, 172-176。
本发明的阳离子脂质是用于递送寡核苷酸，尤其是siRNA和miRNA的脂质纳米粒中的有用组分。
在本发明的第一实施方案中，该阳离子脂质由式A或其任何药学上可接受的盐或立体异构体表示：
其中：
R1和R2独立地选自H、(C1-C6)烷基、杂环基和多胺，其中所述烷基、杂环基和多胺任选被1至3个选自R'的取代基取代，或R1和R2可以与它们相连的氮一起形成除氮外还任选含有一个或两个选自N、O和S的额外杂原子的4-7元单环杂环，所述单环杂环任选被1至3个选自R'的取代基取代；
R3独立地选自H和(C1-C6)烷基，所述烷基任选被1至3个选自R'的取代基取代；
R'独立地选自卤素、R''、OR''、SR''、CN、CO2R''或CON(R'')2；
R''独立地选自H和(C1-C6)烷基，其中所述烷基任选被卤素和OH取代；
n是0、1、2、3、4或5；
L1选自C4-C24烷基和C4-C24烯基，所述烷基和烯基任选被一个或多个选自R'的取代基取代；且
L2选自C3-C9烷基和C3-C9烯基，所述烷基和烯基任选被一个或多个选自R'的取代基取代。
在第二实施方案中，本发明涉及具有式A的化合物或其任何药学上可接受的盐或立体异构体，
其中：
R1和R2各自是甲基；
R3是H；
n是0；
L1选自C4-C24烷基和C4-C24烯基；且
L2选自C3-C9烷基和C3-C9烯基。
在第三实施方案中，本发明涉及具有式A的化合物或其任何药学上可接受的盐或立体异构体，
其中：
R1和R2各自是甲基；
R3是H；
n是2；
L1选自C4-C24烷基和C4-C24烯基；且
L2选自C3-C9烷基和C3-C9烯基。
具体的阳离子脂质是：
(20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺(化合物1)；
(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-9-胺(化合物2)；
(16Z,19Z)-N,N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-8-胺(化合物3)；
(13Z,16Z)-N,N-二甲基二十二碳-13,16-二烯-5-胺(化合物4)；
(12Z,15Z)-N,N-二甲基二十一碳-12,15-二烯-4-胺(化合物5)；
(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-6-胺(化合物6)；
(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四碳-15,18-二烯-7-胺(化合物7)；
(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-10-胺(化合物8)；
(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四碳-15,18-二烯-5-胺(化合物9)；
(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-4-胺(化合物10)；
(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-9-胺(化合物11)；
(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-8-胺(化合物12)；
(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-7-胺(化合物13)；
(16Z,19Z)-N,N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-6-胺(化合物14)；
(22Z,25Z)-N,N-二甲基三十一碳-22,25-二烯-10-胺(化合物15)；
(21Z,24Z)-N,N-二甲基三十碳-21,24-二烯-9-胺(化合物16)；
(18Z)-N,N-二甲基二十七碳-18-烯-10-胺(化合物17)；
(17Z)-N,N-二甲基二十六碳-17-烯-9-胺(化合物18)；
(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-7-胺(化合物19)；和
N,N-二甲基二十七烷-10-胺(化合物20)；
(20Z,23Z)-N-乙基-N-甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺(化合物21)；
1-[(11Z,14Z)-1-壬基二十碳-11,14-二烯-1-基]吡咯烷(化合物22)；
(20Z)-N,N-二甲基二十七碳-20-烯-10-胺(化合物23)；
(15Z)-N,N-二甲基二十七碳-15-烯-10-胺(化合物24)；
(14Z)-N,N-二甲基二十九碳-14-烯-10-胺(化合物25)；
(17Z)-N,N-二甲基二十九碳-17-烯-10-胺(化合物26)；
(24Z)-N,N-二甲基三十三碳-24-烯-10-胺(化合物27)；
(20Z)-N,N-二甲基二十九碳-20-烯-10-胺(化合物28)；
(22Z)-N,N-二甲基三十一碳-22-烯-10-胺(化合物29)；
(16Z)-N,N-二甲基二十五碳-16-烯-8-胺(化合物30)；
(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一碳-12,15-二烯-1-胺(化合物31)；
(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(化合物32)；
N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺(化合物33)；
1-[(1S,2R)-2-己基环丙基]-N,N-二甲基十九烷-10-胺(化合物34)；
N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十九烷-10-胺(化合物35)；
N,N-二甲基-21-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]二十一烷-10-胺(化合物36)；
N,N-二甲基-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基]十九烷-10-胺(化合物37)；
N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十六烷-8-胺(化合物38)；
N,N-二甲基-1-[(1R,2S)-2-十一烷基环丙基]十四烷-5-胺(化合物39)；
N,N-二甲基-3-{7-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]庚基}十二烷-1-胺(化合物40)
1-[(1R,2S)-2-庚基环丙基]-N,N-二甲基十八烷-9-胺(化合物41)；
1-[(1S,2R)-2-癸基环丙基]-N,N-二甲基十五烷-6-胺(化合物42)；
N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十五烷-8-胺(化合物43)；和
(11E,20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-11,20,23-三烯-10-胺(化合物44)；
或其任何药学上可接受的盐或立体异构体。
在另一实施方案中，所公开的阳离子脂质可用于制备脂质纳米粒。
在另一实施方案中，所公开的阳离子脂质是用于递送寡核苷酸的脂质纳米粒中的有用组分。
在另一实施方案中，所公开的阳离子脂质是用于递送siRNA和miRNA的脂质纳米粒中的有用组分。
在另一实施方案中，所公开的阳离子脂质是用于递送siRNA的脂质纳米粒中的有用组分。
本发明的阳离子脂质可具有不对称中心、手性轴和手性面（如E.L. Eliel和S.H. Wilen, Stereochemistry of Carbon Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1994, 第1119-1190页中所述）并作为外消旋物、外消旋混合物和独立的非对映体存在，所有可能的异构体及其混合物，包括旋光异构体都包括在本发明中。此外，本文中所公开的阳离子脂质可作为互变异构体存在，本发明的范围旨在包括这两种互变异构形式，尽管仅描绘了一种互变异构结构。
要理解的是，本领域普通技术人员可以选择本发明的阳离子脂质上的取代基和取代型式以提供化学稳定并容易由易得的原材料通过本领域中已知的技术以及下文阐述的那些方法合成的阳离子脂质。如果取代基本身被多于一个基团取代，要理解的是，这多个基团可以在相同碳上或在不同碳上，只要产生稳定结构。
要理解的是，本领域普通技术人员可以将一个或多个Si原子并入本发明的阳离子脂质中以提供化学稳定并容易由易得的原材料通过本领域中已知的技术合成的阳离子脂质。
在式A的化合物中，原子可能表现出它们的天然同位素丰度，或一个或多个原子可以人为地富集具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于自然界中主要发现的原子质量或质量数的特定同位素。本发明意在包括式A的化合物的所有合适的同位素变体。例如，氢(H)的不同同位素形式包括氕(1H)和氘(2H)。氕是自然界中发现的主要氢同位素。富集氘可提供某些治疗优点，如提高体内半衰期或降低剂量要求，或可提供可用作生物样品的表征的标准的化合物。无需过度实验，可通过本领域技术人员公知的常规技术或通过与本文中的方案和实施例中描述的那些类似的方法使用适当的同位素富集试剂和/或中间体制备式A内的同位素富集化合物。
如本文所用，“烷基”是指具有规定的碳原子数的直链、环状或支链饱和脂族烃。
如本文所用，“烯基”是指具有规定的碳原子数的直链、环状或支链不饱和脂族烃，包括但不限于二烯、三烯和四烯不饱和脂族烃。
环状“烷基”或“烯基”的实例包括：
。
如本文所用，“杂环基”或“杂环”是指含有1至4个选自O、N和S的杂原子的4-至10-元芳族或非芳族杂环，并包括双环基团。“杂环基”因此包括下列：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并吡唑基、苯并***基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、indolazinyl、吲唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、萘吡啶基、噁二唑基、噁唑基、噁唑啉、异噁唑啉、氧杂环丁烷基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氢吡喃基、四唑基、四唑并吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、***基、氮杂环丁烷基、1,4-二氧杂环己烷基、六氢氮杂?基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并噁唑基、二氢呋喃基、二氢咪唑基、二氢吲哚基、二氢异噁唑基、二氢异噻唑基、二氢噁二唑基、二氢噁唑基、二氢吡嗪基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑基、二氢噻唑基、二氢噻吩基、二氢***基、二氢氮杂环丁烷基、亚甲二氧基苯甲酰基、四氢呋喃基和四氢噻吩基和它们的N-氧化物，所有这些都任选被1至3个选自R''的取代基取代。
如本文所用，“多胺”是指具有两个或更多个氨基的化合物。实例包括腐胺、尸胺、亚精胺和精胺。
如本文所用，“卤素”是指Br、Cl、F和I。
在式A的一个实施方案中，R1和R2独立地选自H和(C1-C6)烷基，其中所述烷基任选被1至3个选自R'的取代基取代，或R1和R2可以与它们相连的氮一起形成除氮外还任选含有一个或两个选自N、O和S的额外杂原子的4-7元单环杂环，所述单环杂环任选被1至3个选自R'的取代基取代。
在式A的一个实施方案中，R1和R2独立地选自H、甲基、乙基和丙基，其中所述甲基、乙基和丙基任选被1至3个选自R'的取代基取代，或R1和R2可以与它们相连的氮一起形成除氮外还任选含有一个或两个选自N、O和S的额外杂原子的4-7元单环杂环，所述单环杂环任选被1至3个选自R'的取代基取代。
在式A的一个实施方案中，R1和R2独立地选自H、甲基、乙基和丙基。
在式A的一个实施方案中，R1和R2各自是甲基。
在式A的一个实施方案中，R3独立地选自：H和甲基。
在式A的一个实施方案中，R3是H。
在式A的一个实施方案中，R'是R''。
在式A的一个实施方案中，R''独立地选自H、甲基、乙基和丙基，其中所述甲基、乙基和丙基任选被一个或多个卤素和OH取代。
在式A的一个实施方案中，R''独立地选自H、甲基、乙基和丙基。
在式A的一个实施方案中，n是0、1、2或3。
在式A的一个实施方案中，n是0、1或2。
在式A的一个实施方案中，n是0、1或2。
在式A的一个实施方案中，n是0。
在式A的一个实施方案中，n是2。
在式A的一个实施方案中，L1选自C4-C24烷基和C4-C24烯基，其任选被卤素和OH取代。
在式A的一个实施方案中，L1选自C4-C24烷基和C4-C24烯基。
在式A的一个实施方案中，L1选自C4-C24烯基。
在式A的一个实施方案中，L1选自C12-C24烯基。
在式A的一个实施方案中，L1是C19烯基。
在式A的一个实施方案中，L1是：
。
在式A的一个实施方案中，L1是：
。
在式A的一个实施方案中，L2选自C3-C9烷基和C3-C9烯基，其任选被卤素和OH取代。
在式A的一个实施方案中，L2选自C5-C9烷基和C5-C9烯基，其任选被卤素和OH取代。
在式A的一个实施方案中，L2选自C7-C9烷基和C7-C9烯基，其任选被卤素和OH取代。
在式A的一个实施方案中，L2选自C3-C9烷基和C3-C9烯基。
在式A的一个实施方案中，L2选自C5-C9烷基和C5-C9烯基。
在式A的一个实施方案中，L2选自C7-C9烷基和C7-C9烯基。
在式A的一个实施方案中，L2是C3-C9烷基。
在式A的一个实施方案中，L2是C5-C9烷基。
在式A的一个实施方案中，L2是C7-C9烷基。
在式A的一个实施方案中，L2是C9烷基。
在式A的一个实施方案中，L1选自C4-C24烷基和C4-C24烯基，所述烷基和烯基任选被一个或多个选自R'的取代基取代；且L2选自C3-C9烷基和C3-C9烯基，所述烷基和烯基任选被一个或多个选自R'的取代基取代。
在式A的一个实施方案中，L1选自C12-C24烯基，所述烯基任选被一个或多个选自R'的取代基取代；且L2选自C5-C9烷基，所述烷基任选被一个或多个选自R'的取代基取代。
在式A的一个实施方案中，L1选自C19烯基，所述烯基任选被一个或多个选自R'的取代基取代；且L2选自C7-C9烷基，所述烷基任选被一个或多个选自R'的取代基取代。
在式A的一个实施方案中，L1选自C19烯基，所述烯基任选被一个或多个选自R'的取代基取代；且L2选自C9烷基，所述烷基任选被一个或多个选自R'的取代基取代。
在式A的一个实施方案中，L1选自直链C19烯基，所述烯基任选被一个或多个选自R'的取代基取代；且L2选自直链C9烷基，所述烷基任选被一个或多个选自R'的取代基取代。
在式A的一个实施方案中，“杂环基”是吡咯烷、哌啶、吗啉、咪唑或哌嗪。
在式A的一个实施方案中，“单环杂环基”是吡咯烷、哌啶、吗啉、咪唑或哌嗪。
在式A的一个实施方案中，“多胺”是腐胺、尸胺、亚精胺或精胺。
在一个实施方案中，“烷基”是具有规定的碳原子数的直链饱和脂族烃。
在一个实施方案中，“烯基”是指具有规定的碳原子数的直链不饱和脂族烃。
在本发明中包括式A的阳离子脂质的游离形式，及其药学上可接受的盐和立体异构体。本文中例举的一些分离的特定阳离子脂质是胺阳离子脂质的质子化盐。术语“游离形式”是指非盐形式的胺阳离子脂质。包含的药学上可接受的盐不仅包括为本文所述的特定阳离子脂质例举的分离的盐，还包括式A的阳离子脂质的游离形式的所有典型的药学上可接受的盐。可以使用本领域中已知的技术分离所述特定的盐阳离子脂质的游离形式。例如，可以通过用合适的稀碱水溶液，如稀NaOH、碳酸钾、氨和碳酸氢钠水溶液处理该盐来再生游离形式。游离形式在某些物理性质，如在极性溶剂中的溶解度方面可能略微不同于它们各自的盐形式，但对本发明的目的而言，酸盐和碱盐在其它方面在制药学上等同于它们各自的游离形式。
可以由含有碱性或酸性部分的本发明的阳离子脂质通过常规化学方法合成本发明的阳离子脂质的药学上可接受的盐。通常，通过离子交换色谱法或通过使游离碱与化学计算量或与过量的所需成盐无机酸或有机酸在合适的溶剂或各种溶剂组合中反应制备碱性阳离子脂质的盐。类似地，通过与适当的无机碱或有机碱的反应形成酸性化合物的盐。
因此，本发明的阳离子脂质的药学上可接受的盐包括通过使本发明碱性阳离子脂质与无机酸或有机酸反应形成的本发明的阳离子脂质的常规无毒盐。例如，常规无毒盐包括衍生自无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的那些，以及由有机酸，如乙酸、丙酸、丁二酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、双羟萘酸、马来酸、羟基马来酸、苯基乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基-苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、草酸、羟乙磺酸、三氟乙酸（TFA）等制成的盐。
当本发明的阳离子脂质是酸性时，合适的“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒碱，包括无机碱和有机碱制成的盐。衍生自无机碱的盐包括铝、铵、钙、铜、三价铁、亚铁、锂、镁、三价锰盐、亚锰、钾、钠、锌等。特别优选的是铵、钙、镁、钾和钠盐。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺，包括天然存在的取代的胺、环状胺和碱性离子交换树脂，如精氨酸、甜菜碱咖啡因、胆碱、N,N1-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡萄糖胺、葡糖胺、组氨酸、哈胺、异丙胺、赖氨酸、甲基葡萄糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等的盐。
Berg等人, “Pharmaceutical Salts,” J. Pharm. Sci., 1977:66:1-19更充分描述了上述药学上可接受的盐和其它典型的药学上可接受的盐的制备。
还要指出，本发明的阳离子脂质可能是内盐或两性离子，因为在生理条件下，该化合物中的脱质子酸性部分，如羧基可能是阴离子型的，并且这种电子电荷可能随后被质子化或烷基化的碱性部分，如季氮原子的阳离子电荷内部平衡掉。
实施例
提供的实施例意在助于进一步理解本发明。所用的特定材料、种类和条件意在进一步例示本发明而非限制其合理范围。用于合成阳离子脂质的试剂可商购得到或容易由本领域普通技术人员制备。
新型阳离子脂质的合成是从脂质酸(I)开始的线性过程。偶联至N,O-二甲基羟基胺产生Weinreb酰胺II。Grignard加成产生酮III。钛介导的还原胺化产生IV类型的最终产物。
一般方案1
单碳同系化的（homologated）阳离子脂质V的合成是从脂质酮(III)开始的线性过程。通过用TOSMIC和叔丁醇钾处理，使酮转化成腈(V)。腈还原成伯胺，接着还原胺化，提供最终阳离子脂质VI。
一般方案2
双碳同系化的阳离子脂质IX的合成是从脂质酮(III)开始的线性过程。在Peterson条件下使酮转化成α,β-不饱和酰胺VII。使用LS-Selectride进行α,β-不饱和的共轭还原以产生酰胺VIII。用氢化锂铝还原酰胺以提供最终阳离子脂质IX。
一般方案3
根据一般方案4制备含环丙基的脂质。对不饱和Weinreb酰胺II施以Simmons-Smith环丙烷化（cyclopropanation）条件以产生含环丙基的Weinreb酰胺X。这些如一般方案1-3中概述进行至最终产物。
一般方案4
烯丙型胺阳离子脂质XVI的合成是以醛XI开始的线性过程。乙酸叔丁酯的添加生成β-羟基酯XII。将羟基官能转化成氟基，接着进行酸处理，生成β-氟代酸XIII。该酸转化成Weinreb酰胺，接着进行Grignard加成，产生β-氟代酮XV。还原胺化导致同时消除，从而生成所需烯丙型胺XVI。
一般方案5
。
20,23-二十九碳二烯-10-胺, N,N-二甲基-, (20Z,23Z)(化合物1)
在DCM（810毫升）中混合11,14-二十碳二烯酸、(11Z,14Z)-（50克，162毫摩尔）、N,O-二甲基羟胺盐酸盐（31.6克，324毫摩尔）、HOAt（44.1克，324毫摩尔）、Et3N（45.2毫升，324毫摩尔）和EDC（62.1克，324毫摩尔）并在环境温度下搅拌过夜。反应随后用5 x 700 mL水洗涤，然后用1 x 600 mL 1 M NaOH洗涤，用硫酸钠干燥，经Celite过滤并蒸发获得53.06 g (93%)透明金色油状的11,14-二十碳二烯酰胺, N-甲氧基-N-甲基-, (11Z,14Z)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.35 (m, 4H), 3.68 (s, 3H), 3.18 (s, 3H), 2.77 (m, 2H), 2.41 (t, J = 7 Hz, 2H), 2.05 (m, 4H), 1.63 (m, 2H), 1.40-1.26 (m, 18H), 0.89 (t, J = 7 Hz, 3H)。
在250毫升烧瓶中将11,14-二十碳二烯酰胺, N-甲氧基-N-甲基-, (11Z,14Z)- 1（4克，11.38毫摩尔）溶解在无水THF（50.0毫升）中，然后在环境温度下在氮气下加入1 M壬基溴化镁（22.76毫升，22.76毫摩尔）。在10分钟后，用过量饱和NH4Cl水溶液缓慢淬灭该反应。该反应用己烷和水洗涤到分液漏斗中，摇振，弃置下方水层，上层用硫酸钠干燥，过滤并蒸发产生金色油形式的粗制酮。向上述粗制酮中加入二甲基胺（在THF中2 M）（14.22毫升，28.4毫摩尔），接着加入Ti(O-i-Pr)4（6.67毫升，22.76毫摩尔）并搅拌过夜。第二天，加入EtOH（50毫升），接着加入NaBH4（0.646克，17.07毫摩尔）。在搅拌5分钟后，将整个反应直接注射到与330克二氧化硅柱串联的40克二氧化硅柱上。用100% DCM洗脱10 min，然后用0-15% MeOH/DCM洗脱30 min，收集浅金色油状的20,23-二十九碳二烯-10-胺, N,N-二甲基-, (20Z,23Z) (1)（2.45克，5.47毫摩尔，48.1%收率）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.35 (m, 4H), 2.78 (m, 2H), 2.23 (m, 1H), 2.21 (s, 6H), 2.05 (m, 4H), 1.45-1.16 (m, 38H), 0.89 (m, 6H). C31H61N的HRMS计算值448.4877, 实测值448.4872。
化合物2-30是新型阳离子脂质并根据上述一般方案1制备。
化合物 结构 HRMS
2 C28H56N计算值 406.4407，实测值406.4405.
3 C27H54N计算值 392.4251，实测值392.4250.
4 C24H48N计算值350.3781，实测值350.3770.
5 C23H46N计算值 336.3625，实测值336.3613.
6 C25H50N计算值 364.3938，实测值364.3941.
7 C26H52N计算值 378.4094，实测值378.4081.
8 C29H58N 计算值420.4564，实测值420.4562.
9 C26H52N计算值 378.4094，实测值378.4089.
10 C25H50N计算值364.3938，实测值364.3931.
11 C30H60N计算值 434.4720，实测值434.4717.
12 C29H58N计算值 420.4564，实测值420.4561.
13 C28H56N计算值 406.4407，实测值406.4404.
14 C27H54N计算值392.4251，实测值392.4245.
15 C33H66N计算值 476.5190，实测值476.5196.
16 C32H64N计算值 462.5033，实测值462.5045.
17 C29H59N计算值422.4720，实测值422.4726.
18 C28H57N计算值 408.4564，实测值408.4570.
19 C30H59N计算值 434.4720，实测值434.4729.
20 C29H61N计算值 424.4877，实测值424.4875.
21 C32H64N计算值 462.5033，实测值462.5023.
22 C33H64N计算值 474.5033，实测值474.5033.
23 C29H60N计算值 422.4720，实测值422.4716.
24 C29H60N计算值 422.4720，实测值422.4718.
25 C31H64N计算值 450.5033，实测值450.5031.
26 C31H64N计算值 450.5033，实测值450.5034.
27 C35H72N计算值 506.5659，实测值506.5635.
28 C31H64N计算值 450.5033，实测值450.5037.
29 C33H68N计算值 478.5346，实测值478.5358.
30 C27H56N计算值 394.4407，实测值394.4407.
(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一碳-12,15-二烯-1-胺(化合物31)
将酮iii（4.0克，9.55毫摩尔）、TOSMIC（2.4克，12.4毫摩尔）在二甲氧基乙烷（45毫升）中的溶液冷却至0℃并用叔丁醇钾（19.1毫摩尔，19.1毫升在tBuOH中的1M溶液）处理。在90分钟后，使反应在己烷和水之间分相。有机相用水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发。这种材料通过快速色谱法（0-5% EtOAc/己烷）提纯以产生所需产物（含有~20%的s.m.）。将这种混合物原样送往下一步骤。LC/MS (M+H) = 430.6。
将氢化锂铝（23.9毫摩尔，23.9毫升在THF中的1M溶液）在环境温度下直接添加到腈v（3.42克，8毫摩尔）中并将该反应搅拌20分钟。该反应用100毫升THF稀释，冷却至0℃并用十水合硫酸钠溶液小心淬灭。滤出固体并用THF洗涤。将滤液真空蒸发并以粗制形式直接送往下一反应。LC/MS (M+H) = 434.6。
先后用甲醛（1.6毫升，21.7毫摩尔）和三乙酰氧基硼氢化钠（6.6，31毫摩尔）处理伯胺（3.45克，6.2毫摩尔）在二氯乙烷（100毫升）中的溶液。在5分钟后，该反应在二氯甲烷和1N NaOH之间分相。有机相经硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发。粗制混合物通过反相制备色谱法（C8柱）提纯以提供(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一碳-12,15-二烯-1-胺。HRMS计算值462.5033，实测值462.5026。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.35 (m, 4H), 2.78 (2H, t, J=5.6Hz), 2.18 (s, 6H), 2.05 (m, 6H), 1.3 (m, 39H), 0.89 (m, 6H)。
(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(化合物32)
将甲硅烷基酰胺Peterson试剂（3.1克，16.7毫摩尔）溶解在THF（35毫升）中并冷却至-63℃。向这种溶液中加入nBuLi（16.7毫摩尔，6.7毫升2.5M溶液）。将该反应升温至环境温度保持30分钟。在第二烧瓶中将酮（5.0克，11.9毫摩尔）溶解在THF（25毫升）中。在使温度保持在-60℃和-40℃之间的同时，将该酮溶液经30分钟转移到Peterson试剂中。将该反应升温至-40℃保持1小时，然后升温至0℃保持30分钟。该反应用碳酸氢钠淬灭，用追加的水稀释并在水/己烷之间分相。有机相用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发。通过快速色谱法（0-40% MTBE/己烷）提纯产生α,β-不饱和酰胺vii。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.75 (s, 1H), 5.36 (m, 4H), 3.01 (s, 3H), 2.99 (s, 3H), 2.78 (t, 2H), 2.28 (t, 2H), 2.05 (m, 6H), 1.35 (m, 34H), 0.89 (m, 6H)。
在密封管中合并α,β-不饱和酰胺vii（1克，2.1毫摩尔）和LS-Selectride（4.1毫摩尔，4.1毫升1M溶液）并加热至60℃保持24小时。将该反应冷却至环境温度并在氯化铵溶液和庚烷之间分相。有机相经硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发以产生酰胺viii。这种中间体以粗制形式直接送往下一反应。
α,β-不饱和酰胺vii的另一共轭还原涉及使用氢化铜还原：
在5L RB中，在氮气下将铜催化剂（9.77克，17.13毫摩尔）溶解在甲苯（1713毫升）中。向其中一次性加入来自Aldrich的PMHS（304毫升，1371毫摩尔）。使该反应老化5分钟。向该溶液中加入α,β-不饱和酰胺vii（167.16克，343毫摩尔）。然后通过注射泵经3小时向这种混合物中加入叔戊醇（113毫升，1028毫摩尔）。在添加完成后，向该溶液中分小份加入~1700毫升20% NH4OH。注意：在淬灭开始时剧烈冒泡和发泡，并且必须严密监测和分小份缓慢加入氢氧化铵。该反应在水和己烷之间分相。有机相经Celite过滤并真空蒸发。所得橡胶固体材料使用机械搅拌器在己烷中粉化以产生小微粒，其随后过滤和用己烷洗涤。有机相随后真空蒸发和通过快速色谱法提纯（硅胶，0-15%乙酸乙酯/己烷）以产生所需酰胺viii。LC/MS (M+H) = 490.7。
向酰胺viii（2.85克，5.8毫摩尔）的溶液中加入氢化锂铝（8.7毫摩尔，8.7毫升1M溶液）。该反应在环境温度下搅拌10分钟，然后通过缓慢添加十水合硫酸钠溶液淬灭。过滤固体并用THF洗涤，将滤液真空蒸发。粗制混合物通过反相制备色谱法（C8柱）提纯以提供油状的(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺（化合物32）。HRMS (M+H)计算值476.5190，实测值476.5189。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.37 (m, 4H), 2.78 (t, 2H), 2.42 (m, 8H), 2.05 (q, 4H), 1.28 (m, 41H), 0.89 (m, 6H)。
N ,N-二甲基-1-(2-辛基环丙基)十七烷-8-胺(化合物33)
向冷却至0℃的油酸（1克3.5毫摩尔）在DCM（500毫升）中的溶液中加入CDI（0.63克，3.9毫摩尔）。将该反应升温至环境温度保持30分钟，然后冷却至0℃并先用三乙胺（0.39克，3.9毫摩尔）处理，然后用二甲基羟胺盐酸盐（0.38克，3.9毫摩尔）处理。在1小时后，该反应在水和庚烷之间分相。有机相经硫酸镁干燥，过滤并真空蒸发以产生粗制Weinreb酰胺ii，其直接送往下一反应。
将二乙基锌（70.3毫摩尔，70.3毫升1M溶液）在二氯甲烷（130毫升）中的溶液冷却至-1℃并用TFA（8.0克，70.3毫摩尔）逐滴处理。在30分钟后，加入二碘甲烷（18.8克，70.3毫摩尔）并将其在冰浴中老化30分钟。向这种溶液中加入Weinreb酰胺ii（7.6克，23.4毫摩尔）。将该反应升温至环境温度并搅拌1小时。该反应用氯化铵溶液（100毫升）淬灭并分离出有机层，用10%硫代硫酸钠洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并真空蒸发。快速色谱法提纯（0-30% MTBE/庚烷）产生所需产物x。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.72 (s, 3H), 3.22 (s, 3H), 2.48 (t, 2H), 1.65 (m, 2H), 1.39 (m, 22H), 1.18 (m, 2H), 0.91 (t, 3H), 0.68 (m, 2H), 0.59 (m, 1H), -0.32 (m, 1H)。
以与对上述化合物1描述的类似的方式使Weinreb酰胺x转化成化合物33（壬基Grignard加成，接着还原胺化）。LC/MS (M+H) = 436.6。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.25 (s, 6H), 1.30 (m, 45H), 0.91 (m, 6H), 0.68 (m, 2H), 0.59 (m, 1H), -0.31 (m, 1H)。
化合物34-43是新型阳离子脂质并根据上述一般方案1-4制备。
化合物 结构 HRMS
34 C30H62N计算值436.4877，实测值436.4872.
35 C32H66N计算值464.5190，实测值464.5186.
36 C34H70N计算值492.5503，实测值492.5496.
37 C33H66N计算值476.5190，实测值476.5174.
38 C29H60N计算值422.4720，实测值422.4701.
39 C30H62N计算值436.4877，实测值436.4880.
40 C32H66N计算值464.5190，实测值464.5199.
41 C30H62N计算值436.4877，实测值436.4877.
42 C30H62N计算值436.4877，实测值436.4875.
43 LC/MS (M+H) 408.6.
(11E,20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-11,20,23-三烯-10-胺(化合物44)
向冷却至-78℃的LDA（95毫摩尔，47.5毫升2M溶液）在THF（127毫升）中的溶液中加入乙酸叔丁酯。将该反应搅拌15分钟，接着加入醛xi。该反应立即用氯化铵溶液淬灭，升温至环境温度并在水/戊烷之间分相。有机相经硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发。LC/MS (M+H-tBu) = 325.4。
将羟基酮xii（7克，18.4毫摩尔）溶解在二氯甲烷（150毫升）中并冷却至0℃和用deoxofluor（7.3克，33.1毫摩尔）处理。在搅拌下将该反应升温至环境温度保持16小时，接着用碳酸氢钠溶液淬灭。使反应分相，有机相经硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发。快速柱色谱法（0-5%乙酸乙酯/己烷）产生β-氟代酯。
用氯化氢（157毫摩尔，39.2毫升在二氧杂环己烷中的4M溶液）处理在二氯甲烷中的氟代酯中间体（6克，15.6毫摩尔），并将该反应在环境温度下搅拌16小时。将该反应真空蒸发以产生所需β-氟代酸xiii。LC/MS (M+H) = 327.3。
在DCM（78毫升）中合并氟代羧酸xiii（5.1克，15.7毫摩尔）、EDC（6.0克，31.4毫摩尔）、N,O-二甲基羟胺盐酸盐（3.1克，31.4毫摩尔）、三甲胺（4.0克，39.2毫摩尔）和HOAt（4.3克，31.4毫摩尔）并在环境温度下搅拌16小时。使该反应在水/DCM之间分相，有机相用水（3x）和NaOH溶液（1x）洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发。粗材料通过反相制备色谱法提纯以产生所需Weinreb酰胺xiv。LC/MS (M+H) = 370.4。
在环境温度下用壬基溴化镁（23.4毫摩尔，23.4毫升1M溶液）处理Weinreb酰胺xiv（4.3克，11.7毫摩尔）在THF（50毫升）中的溶液。在1小时后用氯化铵溶液淬灭该反应并在水和戊烷之间分相。有机相经硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发。这种材料以粗制形式送往下一步骤。
用二甲基胺(29.3毫摩尔，14.7毫升在THF中的2M溶液）和异丙醇钛(IV)（6.7克，23.5毫摩尔）处理酮 xv（5.1克，11.7毫摩尔），该反应在环境温度下搅拌16小时。向反应混合物中加入乙醇（50毫升），接着加入硼氢化钠（0.67克，17.6毫摩尔）。将该反应直接加载到硅胶柱上并通过快速色谱法（0-15% MeOH/DCM）提纯。该材料需要通过制备反相色谱法二次提纯以产生(11E,20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-11,20,23-三烯-10-胺。HRMS计算值446.4720，实测值446.4724。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.48 (m, 1H), 5.37 (m, 4H), 5.23 (m, 1H), 2.78 (t, 2H), 2.58 (m, 1H), 2.22 (s, 6H), 2.04 (m, 6H), 1.56 (m, 1H), 1.30 (m, 31H), 0.89 (m, 6H)。
化合物45是如Nature Biotechnology, 2010, 28, 172-176、WO 2010/042877 A1、WO 2010/048536 A2、WO 2010/088537 A2和WO 2009/127060 A1中所述的DLinKC2DMA。
化合物46是如WO 2010/054401和WO 2010/144740 A1中所述的MC3。
LNP组合物
本发明的下列脂质纳米粒组合物（LNPs）可用于递送寡核苷酸，尤其是siRNA和miRNA：
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG 56.6/38/5.4；
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG 60/38/2；
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG 67.3/29/3.7；
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG 49.3/47/3.7；
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG 50.3/44.3/5.4；
阳离子脂质/胆固醇/PEG-C-DMA/DSPC 40/48/2/10；
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG/DSPC 40/48/2/10；和
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG/DSPC 58/30/2/10。
LNP工艺描述:
通过撞击射流法制备脂质纳米粒(LNP)。通过将溶解在醇中的脂质与溶解在柠檬酸盐缓冲液中的siRNA混合，形成粒子。脂质与siRNA的混合比目标为45-55%脂质和65-45% siRNA。该脂质溶液含有本发明的新型阳离子脂质、辅助脂质（胆固醇）、PEG（例如PEG-C-DMA、PEG-DMG）脂质和DSPC（浓度为5-15 mg/mL，目标为9-12 mg/mL，在醇（例如乙醇）中）。脂质的比率具有25-98（目标为35-65）的阳离子脂质的摩尔%范围，0-75（目标为30-50）的辅助脂质的摩尔%范围，1-15（目标为1-6）的PEG脂质的摩尔%范围，0-15（目标为0-12）的DSPC的摩尔%范围。该siRNA溶液在pH为3.5-5的柠檬酸钠缓冲的盐溶液中以0.3至1.0 mg/mL的浓度范围（目标是0.3-0.9 mg/mL）含有一种或多种siRNA序列。将这两种液体加热至15-40℃（目标是30-40℃）的温度，然后在撞击射流混合器中混合，立即形成LNP。该teeID具有0.25至1.0 mm的范围且总流速为10-600 mL/min。流速和管ID的组合具有将LNPs的粒度控制在30至200纳米之间的作用。然后将该溶液与更高pH的缓冲溶液以1:1至1:3体积:体积，但目标是1:2体积:体积的混合比混合。这种缓冲溶液处于15-40℃（目标是30-40℃）的温度。该混合LNPs在阴离子交换过滤步骤之前保持30分钟至2小时。培养过程中的温度为15-40℃，目标是30-40℃。在培养后，该溶液经含有阴离子交换分离步骤的0.8微米过滤器过滤。这种方法使用1 mm ID至5 mm ID的管ID和10至2000 mL/min的流速。该LNPs通过超滤法浓缩和渗滤，在所述超滤法中除去醇并将柠檬酸盐缓冲液交换成最终缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水。该超滤法使用切向流过滤模式（TFF）。这种方法使用30-500 KD的膜标称分子量筛截。膜形式可以是中空纤维或平板盒（flat sheet cassette）。具有适当的分子量筛截的TFF法使LNP保留在渗余物中，且滤液或渗透液含有醇；柠檬酸盐缓冲剂；最终缓冲废物。该TFF法是最初浓缩至1-3 mg/mL的siRNA浓度的多步骤法。在浓缩后，该LNPs溶液针对最终缓冲液渗滤10-20体积以除去醇和进行缓冲液交换。然后将该材料浓缩另外的1-3倍。该LNP法的最终步骤是无菌过滤该浓缩的LNP溶液并将产物装入小瓶。
分析程序:
1) siRNA浓度
通过强阴离子交换高效液相色谱法(SAX-HPLC)使用带有2996 PDA检测器的Waters 2695 Alliance***(Water Corporation, Milford MA)测定siRNA双链体浓度。LNPs，也称作RNAi递送载体（Delivery Vehicles）（RDVs）用0.5% Triton X-100处理以释放总siRNA并通过使用具有在254 nm的UV检测的Dionex BioLC DNAPac PA 200 (4 × 250 mm)柱的SAX分离分析。流动相由A: 25 mM NaClO4, 10 mM Tris, 20% EtOH, pH 7.0和B: 250 mM NaClO4, 10 mM Tris, 20% EtOH, pH 7.0构成，线性梯度为0-15 min，流速为1 ml/min。通过与siRNA标准曲线比较，测定siRNA量。
2) 包封率
荧光试剂SYBR Gold用于RNA量化以监测RDVs的包封率。使用具有或不具有Triton X-100的RDVs测定游离siRNA和总siRNA量。使用来自Molecular Devices (Sunnyvale, CA)的SpectraMax M5e微量培养板分光光度计进行检测。样品在485纳米下激发并在530纳米下测量荧光发射。通过与siRNA标准曲线比较，测定siRNA量。
包封率 = (1- 游离siRNA/总siRNA) ×100% 。
3) 粒度和多分散性
将含有1微克siRNA的RDVs用1 × PBS稀释至3毫升的最终体积。通过使用ZetaPALS仪器(Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY)的动态光散射法测量样品的粒度和多分散性。用He–Ne激光器在25℃下以90°的散射角测量散射强度。
4) ζ电位分析
将含有1微克siRNA的RDVs用1 mM Tris缓冲液(pH 7.4)稀释至2毫升的最终体积。使用带有电极和作为光源的He–Ne激光器的ZetaPALS仪器(Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY)测定样品的电泳迁移率。在ζ电位的计算中假设Smoluchowski极限。
5) 脂质分析
通过反相高效液相色谱法（RP-HPLC）使用带有电晕带电气溶胶检测器（CAD）（ESA Biosciences, Inc, Chelmsford, MA）的Waters 2695 Alliance***(Water Corporation, Milford MA)测定各脂质浓度。使用带有CAD的Agilent Zorbax SB-C18 (50 × 4.6 mm, 1.8 μm粒度)柱在60℃下分析RDVs中的各脂质。流动相由A: 在H2O中的0.1% TFA和B: 在IPA中的0.1% TFA构成。梯度从时间0的60%流动相A和40%流动相B变成1.00分钟的40%流动相A和60%流动相B；1.00至5.00分钟为40%流动相A和60%流动相B；从5.00分钟的40%流动相A和60%流动相B变成10.00分钟的25%流动相A和75%流动相B；从10.00分钟的25%流动相A和75%流动相B变成15.00分钟的5%流动相A和95%流动相B；和从15.00分钟的5%流动相A和95%流动相B变成20.00分钟的60%流动相A和40%流动相B，流速为1 ml/min。通过与RDVs中的所有脂质组分采用二次曲线拟合的标准曲线比较，测定各脂质浓度。基于其分子量计算各脂质的摩尔百分比。
化合物32制剂的一般LNP工艺描述：
通过撞击射流法制备脂质纳米粒。通过将溶解在醇中的脂质与溶解在柠檬酸盐缓冲液中的siRNA混合，形成粒子。该脂质溶液含有阳离子脂质、辅助脂质（胆固醇）、PEG（例如PEG-C-DMA、PEG-DMG）脂质和DSPC（浓度为5-15 mg/mL，目标为9-12 mg/mL，在醇（例如乙醇）中）。脂质的比率具有25-98（目标为35-65）的阳离子脂质的摩尔%范围，0-75（目标为30-50）的辅助脂质的摩尔%范围，1-15（目标为1-6）的PEG脂质的摩尔%范围，0-15（目标为0-12）的DSPC的摩尔%范围。该siRNA溶液在pH为3.5-5的柠檬酸钠缓冲的盐溶液中以0.3至0.6 mg/mL的浓度范围（目标是0.3-0.9 mg/mL）含有一种或多种siRNA序列。将这两种溶液加热至15-40℃(目标是30-40℃)的温度，然后在撞击射流混合器中混合，立即形成LNP。该teeID具有0.25至1.0 mm的范围且总流速为10-600毫升/分钟。流速和管ID的组合具有将LNPs的粒度控制在30至200纳米之间的作用。然后将该LNP混悬液与更高pH的缓冲溶液以1:1至1:3 体积:体积，但目标是1:2 体积:体积的混合比混合。这种缓冲溶液处于15-40℃（目标是30-40℃）的温度。这种LNP混悬液与更高pH的缓冲溶液以1:1至1:3 体积:体积，但目标是1:2 体积:体积的混合比进一步混合。该缓冲溶液处于15-40℃（目标是30-40℃）的温度。该混合LNPs在阴离子交换过滤步骤之前保持30分钟至2小时。培养过程中的温度为15-40℃，目标是30-40℃。在培养后，该LNP混悬液经含有阴离子交换分离步骤的0.8微米过滤器过滤。这种方法使用1 mm ID至5 mm ID的管ID和10至2000毫升/分钟的流速。该LNPs通过超滤法浓缩和渗滤，在所述超滤法中除去醇并将柠檬酸盐缓冲液换成最终缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水。该超滤法使用切向流过滤模式（TFF）。这种方法使用30-500 KD的膜标称分子量筛截。膜形式是中空纤维或平板盒。具有适当的分子量筛截的TFF法使LNP保留在渗余物中，且滤液或渗透液含有醇；柠檬酸盐缓冲剂；最终缓冲废物。该TFF法是最初浓缩至1-3 mg/mL的siRNA浓度的多步骤法。在浓缩后，该LNP混悬液针对最终缓冲液渗滤10-20体积以除去醇和进行缓冲液交换。然后将该材料浓缩另外的1-3倍。该LNP法的最终步骤是无菌过滤该浓缩的LNP溶液并将产物装入小瓶。
分析程序:
siRNA浓度
通过强阴离子交换高效液相色谱法(SAX-HPLC)使用带有2996 PDA检测器的Waters 2695 Alliance***(Water Corporation, Milford MA)测定siRNA双链体浓度。LNPs，也称作RNAi递送载体（Delivery Vehicles）（RDVs）用0.5% Triton X-100处理以释放总siRNA并通过使用具有在254 nm的UV检测的Dionex BioLC DNAPac PA 200 (4 × 250 mm)柱的SAX分离分析。流动相由A: 25 mM NaClO4, 10 mM Tris, 20% EtOH, pH 7.0和B: 250 mM NaClO4, 10 mM Tris, 20% EtOH, pH 7.0构成，线性梯度为0-15 min，流速为1 ml/min。通过与siRNA标准曲线比较，测定siRNA量。
包封率
荧光试剂SYBR Gold用于RNA量化以监测RDVs的包封率。使用具有或不具有Triton X-100的RDVs测定游离siRNA和总siRNA量。使用来自Molecular Devices (Sunnyvale, CA)的SpectraMax M5e微量培养板分光光度计进行检测。样品在485纳米下激发并在530纳米下测量荧光发射。通过与siRNA标准曲线比较，测定siRNA量。
包封率 = (1- 游离siRNA/总siRNA) ×100% 。
粒度和多分散性
将含有1微克siRNA的RDVs用1 × PBS稀释至3毫升的最终体积。通过使用ZetaPALS仪器(Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY)的动态光散射法测量样品的粒度和多分散性。用He–Ne激光器在25℃下以90°的散射角测量散射强度。
ζ电位分析
将含有1微克siRNA的RDVs用1 mM Tris缓冲液(pH 7.4)稀释至2毫升的最终体积。使用带有电极和作为光源的He–Ne激光器的ZetaPALS仪器(Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY)测定样品的电泳迁移率。在ζ电位的计算中假设Smoluchowski极限。
脂质分析
通过反相高效液相色谱法（RP-HPLC）使用带有电晕带电气溶胶检测器（CAD）（ESA Biosciences, Inc, Chelmsford, MA）的Waters 2695 Alliance***(Water Corporation, Milford MA)测定各脂质浓度。使用带有CAD的Agilent Zorbax SB-C18 (50 × 4.6 mm, 1.8 μm粒度)柱在60℃下分析RDVs中的各脂质。流动相由A: 在H2O中的0.1% TFA和B: 在IPA中的0.1% TFA构成。梯度从时间0的60%流动相A和40%流动相B变成1.00分钟的40%流动相A和60%流动相B；1.00至5.00分钟为40%流动相A和60%流动相B；从5.00分钟的40%流动相A和60%流动相B变成10.00分钟的25%流动相A和75%流动相B；从10.00分钟的25%流动相A和75%流动相B变成15.00分钟的5%流动相A和95%流动相B；和从15.00分钟的5%流动相A和95%流动相B变成20.00分钟的60%流动相A和40%流动相B，流速为1 ml/min。通过与RDVs中的所有脂质组分采用二次曲线拟合的标准曲线比较，测定各脂质浓度。基于其分子量计算各脂质的摩尔百分比。
表1中的各种制剂的通用LNP制备
通过将siRNAs和/或载体分子以大约0.40 mg/mL的浓度溶解在20 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 5.0）中，制备表1中的siRNA纳米粒混悬液。通过将阳离子脂质（例如32，见表2中的结构）、DSPC、胆固醇和PEG-DMG（比率显示在表1中）的混合物以大约8 mg/mL的浓度溶解在无水乙醇中，制备脂质溶液。氮/磷酸盐比接近6:1。
用两个FPLC泵将几乎等体积的siRNA/载体和脂质溶液以相同流速输送至混合T形连接器。使用背压阀调节至所需粒度。将所得乳状混合物收集在无菌玻璃瓶中。这种混合物随后用等体积的柠檬酸盐缓冲液稀释，接着用等体积的PBS（pH 7.4）稀释，经离子交换膜过滤以除去该混合物中的任何游离siRNA/载体。针对PBS(7.4)超滤以除去乙醇和交换缓冲液。通过浓缩至所需体积获得最终LNP并经0.2微米过滤器无菌过滤。以粒度、ζ电位、醇含量、总脂质含量、包封的核酸和总核酸浓度表征所得LNPs。
LNP制造法
在非限制性实例中，如下大批量制备LNP。该方法由(1) 制备脂质溶液；(2) 制备siRNA/载体溶液；(3) 混合/粒子形成；(4) 培养；(5) 稀释；(6) 超滤和浓缩组成。
脂质溶液的制备
将2升玻璃试剂瓶和量筒去热原。将脂质升温至室温。用吸移管向玻璃试剂瓶中移入8.0克化合物32并加入1.2克DSPC、3.5克胆固醇、0.9克PEG-DMG。向该混合物中加入1升乙醇。将试剂瓶置于温度不超过50℃的加热水浴中。用搅拌棒搅拌该脂质混悬液。通过带有密封适配器（adapter）的圆底***一颈将热电偶探针放入该混悬液中。在30-40℃下加热该混悬液直至其变透明。使该溶液冷却至室温。
siRNA/载体溶液的制备
向无菌容器，如Corning储存瓶中称入0.4克 x 水校正系数（大约1.2）的siRNA-1粉末。将siRNA转移到去热原的2升玻璃试剂瓶中。该称量容器用柠檬酸盐缓冲液（20mM, pH 5.0）漂洗3次，并将洗液置于2升玻璃瓶中，用柠檬酸盐缓冲液QS至1升。用UV光谱仪使用下列程序测定siRNA溶液的浓度。从溶液中取出20微升，稀释50倍至1000微升，并在用柠檬酸盐缓冲液清屏（blanking）后在A260 nm下记录UV读数。重复这一步。如果两个样品的读数一致，取平均值并基于siRNAs的消光系数计算浓度。如果最终浓度不在0.40 ± 0.01 mg/mL的范围内，通过添加更多的siRNA/载体粉末或添加更多的柠檬酸盐缓冲液调节浓度。如果适用，为第二siRNA重复这一过程。
或者，如果该siRNA/载体溶液包含单一siRNA双链体和/或载体而不是两种或更多种siRNA双链体和/或载体的混合物（cocktail），则将siRNA/载体溶解在20 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 5.0）中以产生0.4 mg/mL的最终浓度。
该脂质和乙醇溶液随后使用Master Flex蠕动泵(型号7520-40)经Pall Acropak 20 0.8/0.2 μm无菌过滤器PN 12203无菌过滤到去热原的玻璃容器中以提供用于包封工艺的无菌原材料。过滤法在80毫升规模下用20平方厘米的膜面积进行。流速为280毫升/分钟。该方法可通过提高管直径和过滤面积来规模化。
粒子形成–混合步骤
使用双筒注射器驱动泵（Harvard 33 Twin Syringe），以相等或几乎相等的流速在0.5mm ID T-混合器（混合阶段I）中混合无菌脂质/乙醇溶液和无菌siRNA/载体或siRNA/载体混合物/柠檬酸盐缓冲液（20 mM柠檬酸盐缓冲液，pH 5.0）溶液。所得出口LNP混悬液含有40-50体积%乙醇。当需要45体积%乙醇出口混悬液时，将无菌脂质/乙醇和无菌siRNA/载体或siRNA/载体混合物/柠檬酸盐缓冲液溶液分别以54 mL/min和66 mL/min的流速混合，以使混合出口的总流速为120 mL/min。
稀释
将混合阶段I的出口流直接送入4mm ID T-混合器（混合阶段II），在此其用更高pH的缓冲溶液（20 mM柠檬酸钠、300 mM氯化钠，pH 6.0）以1:1 体积:体积 %的比率稀释。这种缓冲溶液处于30-40℃的温度，并经由蠕动泵(Cole Parmer MasterFlex L/S 600 RPM)以120 mL/min的流速输送至4mm T-混合器。
将混合阶段II的出口流直接送入6mm ID T-混合器（混合阶段III），在此其用更高pH的缓冲溶液（PBS，pH 7.4）以1:1 体积:体积 %的比率稀释。这种缓冲溶液处于15-25℃的温度，并经由蠕动泵(Cole Parmer MasterFlex L/S 600 RPM)以240 mL/min的流速输送至6mm T-混合器。
培养和除去游离siRNA
混合阶段III的出口流在混合后保持30分钟以培养。在35-40℃的温度下进行培养，且进程中的混悬液避光。在培养后，用Mustang Q色谱过滤器（胶囊）通过阴离子交换除去游离（未包封的）siRNA。在使用前，色谱过滤器用1N NaOH、1M NaCl和在PBS中的12.5体积%乙醇的最终溶液的冲洗液相继预处理。检查最终冲洗液的pH以确保pH <8。培养过的LNP流随后通过蠕动泵（Cole Parmer MasterFlex L/S 600 RPM）以大约100毫升/分钟的流速经Mustang Q过滤器过滤。将过滤流接收到无菌玻璃容器中以如下进行超滤和浓缩。
超滤、浓缩和无菌过滤
超滤法是定时方法并且必须仔细监控流速。这是两步法；第一步是浓缩步骤，取稀释材料并浓缩大约8倍至大约0.3-0.6 mg/mL siRNA的浓度。
在第一步骤中，将装有超滤膜100 kDa PES (Spectrum Labs)的环架连接到蠕动泵(Spectrum KrosFloII System)上。将9.2升无菌蒸馏水添加到储器中；其中3升排向废料，其余经渗透液排向废料。将5.3升0.25 N氢氧化钠添加到储器中，其中1.5升排向废料，且3.1升经渗透液排向废料。剩余氢氧化钠保留在该***中以消毒（至少10分钟），然后排空泵。将9.2升70 (v/v)%异丙醇添加到储器中，其中1.5升排向废料，其余经渗透液排向废料。加入6升调节缓冲液（在磷酸盐缓冲盐水中的12.5%乙醇），其中1.5升排向废料，其余经渗透液排向废料，直至废料为中性pH (7-8)。记录膜通量值，然后排空泵。
将稀释的LNP溶液置于储器中至1.1升刻度。以2.3 L/min启动泵。再循环5分钟后，以62.5 mL/min启动渗透泵（permeate pump）且储器中的液位恒定在大约950毫升。该稀释的LNP溶液在140分钟内从9.8升浓缩至1.1升，并在将所有稀释的LNP溶液转移到储器中时暂停泵。
第二步骤是将乙醇/水缓冲液交换成磷酸盐缓冲盐水的渗滤步骤。在此步骤的过程中，使用大约10-20渗滤体积的磷酸盐缓冲盐水。在渗滤后，进行二次浓缩以将LNP混悬液浓缩3倍至大约1-1.5 mg/mL siRNA。将浓缩混悬液收集到无菌塑料PETG瓶中。最终混悬液随后相继经Pall 0.45 um PES和Pall 0.2 um PES过滤器过滤以在装瓶前最终消毒。
在一个实施方案中，本发明的LNP组合物包含式A的阳离子脂质、胆固醇、DSPC和PEG-DMG。
在另一实施方案中，本发明的LNP组合物进一步包含冷冻保护剂。
在另一实施方案中，该冷冻保护剂是蔗糖、海藻糖、棉籽糖、水苏糖、毛蕊花糖、甘露醇、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、麦芽三糖-庚糖、葡聚糖、羟乙基淀粉、胰岛素、山梨糖醇、甘油、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、二甲亚砜或它们的任何组合。
在另一实施方案中，该冷冻保护剂是蔗糖。
在另一实施方案中，该冷冻保护剂是海藻糖。
在另一实施方案中，该冷冻保护剂是蔗糖和海藻糖的组合。
在另一实施方案中，该LNP组合物包含阳离子脂质(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺（化合物32）、胆固醇、DSPC和PEG-DMG。
以粒度、ζ电位、醇含量、总脂质含量、包封的核酸和总核酸浓度表征所得LNPs。
本领域技术人员将容易认识到，本发明非常适合实施所述目的，并实现所述目标和优点以及其中固有的那些。目前代表优选实施方案的本文所述的方法和组合物是示例性的并且无意限制本发明的范围。本领域技术人员会想到其中的变化和其它应用，这些包含在由权利要求书的范围限定的本发明的精神内。
表1: 所选脂质纳米粒制剂的组成
。
表2: 表1的制剂中的脂质的化学结构
。
利用上述LNP法，鉴别具有下列比率的特定LNPs：
标称组成：
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG 60/38/2
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG/DSPC 58/30/2/10
Luc siRNA
5'-iB-A U AAGG CU A U GAAGAGA U ATT-iB 3' (SEQ.ID.NO.:1)
3'-UUUAUUCCGAUACUUCUC UAU-5' (SEQ.ID.NO.:2)
AUGC – 核糖
iB – 反向脱氧脱碱基
UC – 2'氟
AGT – 2'脱氧
AGU – 2' OCH3
标称组成
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG 60/38/2
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG/DSPC 40/48/2/10
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG/DSPC 58/30/2/10
ApoB siRNA
5'-iB-CUUUAACAAUUCCUGAAAUTsT-iB-3' (SEQ ID NO.:3)
3'-UsUGAAAUUGUUAAGGACUsUsUsA-5' (SEQ ID NO.:4)
AUGC – 核糖
iB – 反向脱氧脱碱基
UC – 2'氟
AGT – 2'脱氧
AGU – 2' OCH3
UsA – 硫代磷酸酯连接键
β-连环蛋白siRNA
5'-iB-CUGUUGGAUUGAUUCGAAAUsU-iB-3' (SEQ ID NO.:5)
3'-UsUG ACA A CCUAA C UAAGCUUU-5' (SEQ ID NO.:6)
AUGC – 核糖
iB – 反向脱氧脱碱基
UC – 2'氟
AGT – 2'脱氧
AGU – 2' OCH3
UsA – 硫代磷酸酯连接键
5'-iB-A C GACUA GUUC AGU U G CUUUsU-iB-3' (SEQ ID NO.:7)
3'-UsUUGCUGAUCAAGUC A ACGAA-5' (SEQ ID NO.:8)
AUGC – 核糖
iB – 反向脱氧脱碱基
UC – 2'氟
AGT – 2'脱氧
AGU – 2' OCH3
UsA – 硫代磷酸酯连接键
5'-iB-A C GACUA GUUC AGU U G CUUUU-iB-3' (SEQ ID NO.:9)
3'-UUUGCUGAUCAAGUC A ACGAA-5' (SEQ ID NO.:10)
AUGC – 核糖
iB – 反向脱氧脱碱基
UC – 2'氟
AGT – 2'脱氧
AGU – 2' OCH3
UsA – 硫代磷酸酯连接键。
寡核苷酸合成是本领域中公知的（参见美国专利申请：US 2006/0083780、US 2006/0240554、US 2008/0020058、US 2009/0263407和US 2009/0285881和PCT专利申请：WO 2009/086558、WO2009/127060、WO2009/132131、WO2010/042877、WO2010/054384、WO2010/054401、WO2010/054405和WO2010/054406）。通过标准固相程序合成实施例中公开和使用的siRNAs。
实施例1
小鼠体内效力评估
评估使用上文刚描述的标称组成中的化合物1-44的LNPs的体内效力。所述siRNA靶向萤火虫（北美萤火虫（Photinus pyralis））荧光素酶基因（Accession # M15077）的mRNA转录物。上面显示了荧光素酶siRNA的基本序列和化学修饰模式。体内荧光素酶模型使用转基因小鼠，其中在所有细胞中都存在萤火虫荧光素酶编码序列。通过首先用重组Ad-Cre病毒（Vector Biolabs）除去LSL序列，诱发Dana Farber Cancer Institute许可的ROSA26-LoxP-Stop-LoxP-Luc (LSL-Luc)转基因小鼠表达荧光素酶基因。由于该病毒的亲器官性质，在通过尾静脉注射递送时，表达仅限于肝。通过在给药虫荧光素底物（Caliper Life Sciences）后使用IVIS图像仪(Xenogen)测量光输出，量化肝中的荧光素酶表达水平。在给药RDVs之前测量给药前的发光水平。以150微升的体积腹膜内（IP）注射在PBS中的虫荧光素（15毫克/毫升）。在4分钟培养期后，小鼠用异氟烷麻醉并置于IVIS图像仪中。以0.2毫升体积尾静脉注射在PBS赋形剂中的RDVs（含有siRNA）。最终剂量水平为0.1至0.5 mg/kg siRNA。PBS赋形剂作为对照物单独给药。小鼠在给药后48小时使用上述方法成像。虫荧光素光输出的变化与荧光素酶 mRNA水平直接相关并代表荧光素酶siRNA活性的间接量度。体内效力结果以与给药前发光水平相比发光的抑制%表示。荧光素酶siRNA RDVs的全身给药以剂量依赖性方式降低荧光素酶表达。在被给予含有化合物1的RDVs的小鼠中观察到比被给予含有辛基-CLinDMA (OCD)阳离子脂质的RDV的小鼠中更高的效力（图1）。OCD是WO2010/021865中已知和描述的。与含有MC3（化合物46）阳离子脂质的RDV相比，在被给予含有化合物32和33的RDVs的小鼠中观察到类似的效力（图11）。
实施例2
体外ApoE结合检测
LNPs在37℃下在90%恒河猴血清中以4ug/mL的最终LNP浓度培养。培养在轨道旋转下持续20分钟。在培养后，将样品以1:20在PBS中稀释并将100微升各稀释样品等分到抗-PEG抗体涂布的96-孔板（Life Diagnostics Cat. No. P-0001PL）的孔中。在室温下培养1小时后，该板用300uL PBS洗涤5X。在洗涤后，向各孔中加入50微升0.2% Triton X-100并将该板在37℃下培养10分钟，接着在板摇振器上以750 rpm摇振1分钟。样品在进行样品的ApoE ELISA和茎环PCR分析之前冷冻。
进行ApoE ELISA检测以量化在恒河猴血清中培养后结合到LNPs上的ApoE。将抗-ApoE抗体（Milipore, Cat No. AB947）以1:1000在PBS中稀释并将100微升稀释抗体添加到聚苯乙烯高结合板的各孔中。带有抗体的板在4℃下培养过夜，此后将板用200uL PBS洗涤2X。接着，将200微升在PBS中含有1% BSA和0.05% Tween-20的缓冲液（培养缓冲液）添加到各孔中，接着在室温下培养1小时。板用含有0.05% Tween-20的PBS洗涤5X。将冷冻的Triton溶胞试验样品解冻并用培养缓冲液以1:6稀释，并将100微升试验样品等分到ApoE抗体板的孔中。在室温下培养1小时，接着用含有0.05% Tween-20的PBS洗涤5X。在洗涤后，将在培养缓冲液中以1:500稀释的100微升生物素化的抗-ApoE抗体(Mabtech, Cat. ANo. E887-生物素)添加到各孔中并在室温下培养1小时，接着用PBS中的0.05% Tween-20洗涤5X。然后加入100微升/孔的链霉亲和素-HPR (Thermo, Cat. No. TS-125-HR)并在室温下培养1小时。在用PBS中的0.05% Tween-20洗涤5X后，将100微升TMB底物（Thermo, Cat. No. 34028）添加到各孔中，接着在暗处在室温下培养20分钟。用100微升TMB终止溶液（KPL, Cat. No. 50-85-04）终止比色反应并测定在450纳米的吸光度。通过在含有0.03% Triton X-100的培养缓冲液中以100 ng/mL至0.78 ng/mL的浓度稀释恒河猴重组ApoE，制备ApoE标准曲线。在ELISA中与试样平行地评估ApoE标样。使用单独的恒河猴血清（无LNP）对照物获得ELISA中的非LNP依赖性ApoE信号的本底扣除。
茎环RT-PCR程序
为了标准化至结合到抗-PEG抗体板上的LNP的量上结合的ApoE，通过茎环PCR量化留在抗-PEG抗体孔中的siRNA的量并与每LNP包封的siRNAs数相关联，以得出每孔结合的总LNP粒子的近似测量值。
Spiked标准曲线样品的制备：
使用siRNA的分子量（对ApoB 17063而言，为13693 g/mol）计算拷贝数以制备标准曲线。高标准应含有1011个拷贝/3微升。在一行检测板上进行10倍连续稀释直至最低标准含有102个拷贝/3微升。以1:80在水中稀释0.2% Triton X-100 并将20微升稀释的Triton X-100吸移到96孔板的10个孔中。将30微升连续稀释的标准曲线和混合物添加到该板的各孔中。在逆转录反应中使用10微升spiked标准曲线。
茎环RT-PCR –试样和标准曲线:
将来自PEG抗体板捕获的Triton溶胞产物在无核酸酶的水中以1:2000稀释。将10微升'RT-引物混合物' (Applied Biosystem’s TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Cat. No. 4366596)添加到96孔Micro-Amp QPCR板(ABI Cat# N801-0560)的各孔中：
RT引物混合物组分 uL/rxn 最终浓度
ApoB RT-引物 (10uM) 0.6 200 nM
10x缓冲液 2  
水 7.4  
ApoB RT引物序列: 5’ GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTA
TTCGCACTGGATACGACCTTTAACA3'(SEQ.ID.NO.:11)。
将10微升各试样（以1:2000稀释）或spiked标准曲线（上述）等分到96孔板中。该板用垫子（ABI Cat. No. N801-0550）覆盖以将蒸发减至最少。该板以800 rpm简短离心1分钟。接着，该板在温度循环器上使用下列循环参数运行：
循环: 94℃ 10分钟
  75℃ 2分钟
  60℃ 3分钟
  50℃ 3分钟
  40℃ 3分钟
  30℃ 3分钟
  4℃ 保持
接着，将10微升'RT混合物'添加到各孔（Applied Biosystem’s TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Cat. No. 4366596）中。
RT混合物组分 uL/rxn
100 mM dNTP 0.3
10x RT缓冲液 1
核糖核酸酶抑制剂 0.38
Multiscribe RT酶 1
水 7.32
该RT循环反应由10微升试样、10微升RT引物混合物和10微升RT混合物组分构成，总体积为30微升。在总共30微升的总RT混合物中RT-引物的最终浓度为200nM。该板随后用相同的板垫密封，以800 rpm简短离心1分钟，然后在温度循环器上使用下列循环参数运行：
循环: 16℃ 30分钟
  42℃ 30分钟
  85℃ 5分钟
  4℃ 保持
接着，将15微升Fast Enzyme/引物-探针混合物添加到新的Fast 96-孔板（Applied Biosystem’s TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, Cat. No. 4352042）的各孔中。
ApoB    
PCR Master Mix组分 uL/rxn 最终浓度
Fast Enyzme Mix (2x stock) 10  
正向引物 (100uM) 0.18 900 nM
反向引物 (100uM) 0.18 900 nM
探针 (10uM) 0.05 250 nM
水 4.59  
     
ApoB引物和探针序列：
17063DC F3   GGCGCGAAATTTCAGGAATTGT (SEQ.ID.NO.:12)
17063DC Pr2  CACTGGATACGACCTTTAACA (SEQ.ID.NO.:13)
Universal R2    AGTGCAGGGTCCGAG (SEQ.ID.NO.:14)。
将5微升各RT反应添加到Fast Enzyme Mix板上。该板以1000 rpm离心1分钟，并在带有Fast Block的ABI7900上进行QPCR分析。循环参数为：1个循环 - 95℃保持20秒，接着40个循环 - 95℃保持1秒，60℃保持20秒。
利用QPCR结果计算PEG抗体捕获板Triton溶胞产物中的siRNA浓度。基于每LNP粒子500 siRNA的估计值，可以计算留在抗-PEG抗体板的各孔中的LNPs数。使用如通过ApoE ELISA测得的每孔的ApoE浓度和每孔的LNP粒子数，可以计算每LNP粒子结合的大概的ApoE分子数。
每LNP结合的ApoE分子数
化合物 ApoE分子/LNP
8 4.9
16 3.3
24 1.2
25 13.7
28 4.7
29 38
32 12.8
33 18.1
34 2.3
45 (KC2) 32.5
46 (MC3) 14.5
实施例3
肝素琼脂糖HI-TRAP?结合检测
用1X Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)作为运行缓冲液，在注射到肝素琼脂糖上后，具有中性表面电荷的脂质纳米粒(LNP)不留存，而是在柱空体积中洗脱。血清载脂蛋白E (ApoE)表现出与硫酸肝素的高亲和结合，并且据显示，在用纯化和/或重组人ApoE或血清样品培养后，LNPs以取决于它们固有的ApoE结合能力（取决于脂质纳米粒组成和ApoE浓度）的程度结合到肝素琼脂糖上。带有表面结合的ApoE的脂质纳米粒以高亲和力结合到肝素琼脂糖上并仅在高盐（1M NaCl）下洗脱。
开发肝素琼脂糖结合检测以基于ApoE-LNP复合物对肝素琼脂糖表现出的高亲和相互作用评估血清ApoE与脂质纳米粒的结合。
培养
脂质纳米粒在37℃下以50 μg/mL的最终siRNA浓度在1X Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水 (DPBS)中与各种浓度的纯化或重组人载脂蛋白E或0.1-50%大鼠/小鼠/恒河猴/人血清培养20分钟。在与ApoE或血清LNP培养后，样品用1X DPBS稀释10倍并通过肝素琼脂糖色谱法分析。将保留的LNP的峰面积（减除适当的空白信号后）与未经ApoE和/或血清培养的LNP对照物的总峰面积进行比较以测定在与ApoE/血清培养后移向高亲和力肝素相互作用的LNP的百分比。
肝素琼脂糖HI-TRAP?色谱条件
肝素琼脂糖HI-TRAP?色谱柱（GE Healthcare；1毫升床体积）用1X或2X Dulbecco氏PBS平衡；较高的2X盐浓度用于在肝素琼脂糖上具有较高的固有留着（可能由于较高的正表面电荷）的LNPs。
流动相A: 1X或2X DPBS
流动相B: 在10 mM磷酸钠缓冲液中的1M NaCl, pH 7.0
100% A等度输送10分钟，接着步进梯度至100% B；保持另外10分钟；步进梯度回100% A，再平衡另外10分钟，接着注射下一样品
流速: 1 mL/min
样品注射体积: 50 μL
检测: UV，在260 nm。
恒河猴血清培养(2X DPBS条件)时的HI-TRAP?结合结果
化合物 结合%
32 100
33 <5
45 (KC2) 58
46 (MC3) 7
实施例4
效力和毒性的大鼠体内评估
在Sprague-Dawley (Crl:CD(SD)雌性大鼠(Charles River Labs))中评估使用上述标称组成中的化合物的LNPs的体内效力和丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶的升高。siRNA靶向ApoB基因（Accession # NM 019287）的mRNA转录物。上面显示了ApoB siRNA的基本序列和化学修饰模式。将在PBS赋形剂中的RDVs（含有siRNA）以1至1.5毫升的体积尾静脉注射。输注速率为大约3毫升/分钟。在各给药组中使用五只大鼠。在LNP给药后，将大鼠置于存在正常饮食和水的笼子中。在给药后6小时，从笼中取出食物。在LNP给药后24小时进行动物尸体剖检。大鼠在异氟烷下麻醉5分钟，然后将它们放置在继续输送异氟烷的头锥体（nose cone）中以保持麻醉，直至完成放血。使用23计量蝴蝶静脉穿刺套件（gauge butterfly venipuncture set）从腔静脉收集血液并等分到血清分离器真空采血管（vacutainers）中以进行血清化学分析。取离体尾状肝叶的打孔切片（Punches）并置于RNALater (Ambion)中以用于mRNA分析。将保存的肝组织匀浆并使用Qiagen砂磨机和Qiagen miRNA-Easy RNA提取试剂盒依据制造商的说明书提取总RNA。通过定量RT-PCR测定肝ApoB mRNA水平。利用大鼠ApoB商业探针套件（Applied Biosystems Cat # RN01499054_m1）从纯化RNA中放大信息(Message)。在带有96-孔Fast Block的ABI 7500仪器上进行PCR反应。将ApoB mRNA水平标准化至管家PPIB (NM  011149) mRNA。使用商业探针套件（Applied Biosytems Cat. No. Mm00478295_m1）通过RT-PCR测定PPIB mRNA水平。结果以ApoB mRNA/PPIB mRNA的比率表示。所有mRNA数据相对于PBS对照剂量表示。在Siemens Advia 1800 Clinical Chemistry Analyzer上使用Siemens 丙氨酸转氨酶(Cat# 03039631)和天冬氨酸转氨酶(Cat# 03039631)试剂进行血清ALT和AST分析。与含有阳离子脂质DLinKC2DMA（化合物45）或MC3（化合物46，图2）的RDV相比，在被给予含有化合物32或33的RDV的大鼠中观察到类似的效力和改善的耐受性。
实施例5
大鼠/猴子肝中的阳离子脂质水平的测定
将肝组织称到20毫升小瓶中并在9 v/w水中使用GenoGrinder 2000 (OPS Diagnostics, 1600下/分钟, 5min)匀浆。将50微升各组织匀浆的等分试样与300微升提取/蛋白质沉淀溶剂（含有500 nM内标的50/50乙腈/甲醇）混合并将该板离心以使沉淀的蛋白质沉降。然后将200微升体积的各上清液转移到96孔板的单独的孔中并通过LC/MS-MS直接分析10微升样品。
通过将已知量的化合物的甲醇储备溶液掺入未处理的大鼠肝匀浆（9体积水/重量肝）中，制备标样。将各标样/肝匀浆的等分试样（50微升）与300微升提取/蛋白质沉淀溶剂（含有500 nM内标的50/50乙腈/甲醇）混合并将该板离心以使沉淀的蛋白质沉降。将200微升体积的各上清液转移到96孔板的单独的孔中并通过LC/MS-MS直接分析10微升各标样。
使用偶联到API 4000三重四极质谱仪（Applied Biosystems）上的Aria LX-2 HPLC***（Thermo Scientific）进行对照由肝匀浆制备和提取的标样的绝对量化。对各运行而言，在环境温度下将总共10微升样品注射到BDS Hypersil C8 HPLC柱 (Thermo, 50 x 2mm, 3 μm)上。
流动相 A: 95% H2O/5% 甲醇/10 mM甲酸铵/0.1%甲酸。流动相B: 40%甲醇/60%正丙醇/10 mM甲酸铵/0.1%甲酸。流速为0.5 mL/min且梯度洗脱分布如下：保持80% A 0.25分钟，经1.6分钟线性升至100% B，在100% B保持2.5分钟，然后恢复并保持在80% A 1.75分钟。总运行时间为5.8分钟。API 4000源参数为CAD: 4、CUR: 15、GS1: 65、GS2: 35、IS: 4000、TEM: 550、CXP: 15、DP: 60、EP: 10。
在被给予含有化合物32或33的RDV的大鼠中，肝水平与被给予含有阳离子脂质DLinKC2DMA（化合物45）或MC3（化合物46，图3）的RDV的大鼠的肝水平类似或更低。在被给予含有化合物32或33的RDV的猴子中，肝水平低于被给予含有阳离子脂质DLinKC2DMA（化合物45）或MC3（化合物46，图7）的RDV的猴子的肝水平。
实施例6
ApoB效力的恒河猴体内评估
在雄性或雌性猕猴（恒河猴）中评估利用上述标称组成中的化合物的LNPs的体内效力。siRNA靶向ApoB基因（Accession # XM 001097404）的mRNA转录物。上面显示了ApoB siRNA的基本序列和化学修饰模式。将在PBS赋形剂中的RDVs（含有siRNA）以20毫升/分钟的注射速率通过在隐静脉中静脉注射给药至0.25毫克/千克siRNA的剂量水平。注射体积为1.9至2.1毫升/千克，并且猴子体重为2.5至4.5千克。给予三个猴子RDV或PBS对照物。在给药后数天，从股动脉抽取1毫升血样用于血清化学分析。猴子在抽血前禁食过夜。监测作为ApoB mRNA降低的下游替代标记物的LDL-C（作为效力的量度）。在含有化合物32和33的RDVs的全身给药（0.25 mg/kg）后4天，LDL-C的血清水平降至小于给药前的水平的30%（图4）。
实施例7
β-连环蛋白效力的恒河猴体内评估
在研究当天 - 通过腹腔镜手术切除（从每只猴子的一个随机选择的肝叶的外缘切除一个活组织检查样品）从雄性恒河猴中收集7个给药前肝活组织检查样品（~0.5-1克/样品）。使用5毫米组织环切刀从各给药前活组织检查样品上取下3个不相邻的~50毫克样品。将样品保存在RNAlater? (Ambion)中以用于随后的CTNNB1 mRNA分析。
在研究日0，通过单剂量静脉快速浓注以0.67、1.34或3.34 mg siRNA/m2的目标剂量给予猴子脂质纳米粒（LNP）受试制品在磷酸盐缓冲盐水（0.05-0.1毫克siRNA/毫升）中的混悬液。为了给药的目的，根据下面给出的确立的异速生长的尺度关系（1），由体重评估体表面积（平方米）：
BSA (平方米)= 0.11 * BW(以kg计)  0.65 。
在研究日2和7，在LNP给药后48小时和168小时，通过腹腔镜手术切除（每个猴子切除2个分离的随机选择的肝叶）从猴子中收集肝活组织检查样品（~0.5-1克/样品）。使用5毫米组织环切刀从各48小时和168小时手术活组织检查样品上取下3个不相邻的~50毫克样品。将样品保存在RNAlater? (Ambion)中以用于随后的CTNNB1 mRNA分析。
使用经CTNNB1验证并对照肽基脯氨酰异构酶B（也称作PPIB或亲环蛋白B）的mRNA水平和18S核糖体RNA（18S rRNA）的RNA水平标准化的引物/探针套件通过相对定量的RT-PCR测量CTNNB1 mRNA水平。将CTNNB1 mRNA肝表达的变化测量为给药后样品与各相应的猴子给药前肝样品之间的PCR阈值循环数的差异（ΔΔCt）。
使用下列关系式由ΔΔCt计算CTNNB1 mRNA敲低（相对于处理前的水平）：
mRNA (敲低%)= 100 - (100/2-ΔΔCt)。
被给予含有化合物32和33和β-连环蛋白siRNA的RDVs的猴子在0.67 – 3.34 mg/m2剂量下表现出强的KD（图5）。
(1) FDA指导文献: "Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers" July 2005, US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration- Center for Drug Evaluation and Research (CDER)。
实施例8
ALT提高的恒河猴体内评估
在从离心后的凝结猴全血中收获的血清中测量丙氨酸转氨酶（ALT）。Roche Modular System自动化化学分析仪通过使用International Federation of Clinical Chemistry标准化程序和试剂测量血清中ALT的酶活性。分析仪的电脑与标准曲线比较地使用吸光度测量值计算样品中的ALT活性。ALT活性以每升国际单位（IU/L）报道。
被给予含有化合物32和33的RDVs的猴子具有比被给予含有阳离子脂质DLinKC2DMA（化合物45）或MC3（化合物46，图6）的RDV的猴子更低的峰值ALT升高。
实施例9
肝细胞癌小鼠模型中的评估
在被称作TRE-MET的小鼠肝细胞癌（HCC)模型中评估LNPs向肝细胞癌输送β-连环蛋白siRNA（siRNAβ-连环蛋白）的活性。TRE-MET小鼠是在FVB/N遗传背景中的转基因小鼠，在所述遗传背景中在具有七聚化的(heptamerized)上游tet-操纵基因的hCMV启动子下表达人MET转基因。当TRE-MET小鼠与LAP-tTA系杂交时，双转基因（TRE-MET/ LAP-tTA）小鼠以肝特异性方式表达MET，这可通过给予强力霉素来抑制。这些小鼠在~ 3月龄时产生在肝表面上具有视觉可识别的肿瘤结节的HCC，且肿瘤表现出HCC典型的弥漫小梁生长模式并表达HCC肿瘤标记物α-胎蛋白（AFP）。此外，TRE-MET小鼠肿瘤中的突变分析还鉴别了大约95%的肿瘤中的β-连环蛋白基因中的活化突变。这些特征使得TRE-MET HCC小鼠模型适合于评估LNP-介导的β-连环蛋白siRNA的递送和所带来的对肿瘤生长的效力。
首先在荷瘤的TRE-MET小鼠中的药效学（PD）研究中评估含有β-连环蛋白的LNPs在使肝和肿瘤组织中的β-连环蛋白mRNA沉默中的作用。静脉给予不同剂量的LNPs或高剂量的LNP对照siRNA，并在72小时后，进行尸体剖检以收集肝和肿瘤组织以通过Taqman测定β-连环蛋白mRNA水平。如图8和9中所示，化合物33在肝和肿瘤组织中都诱发β-连环蛋白mRNA的强的和剂量依赖性的敲低，而在接受对照siRNA或PBS的动物中没有观察到β-连环蛋白敲低。0.1 mpk和0.05 mpk的LNP在正常肝中分别诱发88%和69% KD。肿瘤中的KD为70% (2 mpk)至大约40% (0.1或0.05 mpk)。如图12和13中所示，化合物32在肝和肿瘤组织中都诱发β-连环蛋白mRNA的强的和剂量依赖性的敲低，而在接受对照siRNA或PBS的动物中没有观察到β-连环蛋白敲低。0.1 mpk和0.05 mpk的LNP在正常肝中分别诱发76%和78% KD。肿瘤中的KD为47% (0.25 mpk)至大约20-30% (0.1或0.05 mpk)。
在多剂量效力研究中评估LNP对肿瘤生长的作用。每周给予TRE-MET HCC小鼠化合物33/siRNAβ-连环蛋白、化合物32/siRNAb-连环蛋白、对照siRNA或PBS，持续3周（3个剂量），并在第一次给药前7天和最后一次给药后3天通过microCT扫描测定各动物的肿瘤体积（图10和14）。此外，在最后一次给药后7天，收集肝和肿瘤组织以评估β-连环蛋白mRNA水平。尽管接受PBS或对照siRNA的小鼠表现出360-470%的肿瘤负荷生长，用化合物33/siRNAβ-连环蛋白治疗的小鼠以剂量依赖性的方式表现出显著的肿瘤生长抑制或消退（图10）。2 mpk和0.5 mpk的化合物33/siRNAβ-连环蛋白分别诱发60%和40%的肿瘤消退，且0.05 mpk造成肿瘤停滞。尽管接受PBS或对照siRNA的小鼠表现出~350%的肿瘤负荷生长，用化合物32/siRNAβ-连环蛋白治疗的小鼠以剂量依赖性的方式表现出显著的肿瘤生长抑制或消退（图14）。0.5、0.25和0.1 mg/kg的化合物32/siRNAβ-连环蛋白分别诱发37、58和37%的肿瘤消退，并且0.05 mpk造成肿瘤停滞。
序列表
 
 
 
<110>  Merck Sharp & Dohme Corp.
 
       Stanton, Matthew G.
 
       Budzik, Brian W.
 
       Beutner, Gregory L.
 
       Liao, Hongbiao
 
 
 
<120>  用于寡核苷酸递送的新型低分子量阳离子脂质
 
 
 
<130>  MRL-MIS-00044
 
 
 
<150>  61/384,486
 
<151>  2010-09-20
 
 
 
<150>  61/514,270
 
<151>  2011-08-02
 
 
 
<160>  14   
 
 
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
 
 
<210>  1
 
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<220>
 
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<222>  (12)..(14)
 
<223>  2'氟
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (15)..(15)
 
<223>  2' O-甲基
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (16)..(17)
 
<223>  核糖
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (18)..(21)
 
<223>  2' O-甲基
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (20)..(21)
 
<223>  硫代磷酸酯连接键
 
 
 
<400>  8
 
aagcaacuga acuagucguu u                                                 21
 
 
 
 
 
<210>  9
 
<211>  21
 
<212>  RNA
 
<213>  人工序列
 
 
 
<220>
 
<223>  合成
 
 
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (1)..(1)
 
<223>  反向脱氧脱碱基
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (1)..(1)
 
<223>  2'氟
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (2)..(2)
 
<223>  2'脱氧
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (3)..(4)
 
<223>  2'氟
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (6)..(7)
 
<223>  2'脱氧
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (8)..(9)
 
<223>  2'氟
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (10)..(10)
 
<223>  2' O-甲基
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (11)..(11)
 
<223>  核糖
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (12)..(14)
 
<223>  2'脱氧
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (15)..(15)
 
<223>  核糖
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (16)..(16)
 
<223>  核糖
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (17)..(17)
 
<223>  核糖
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (18)..(18)
 
<223>  2' O-甲基
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (19)..(19)
 
<223>  2'脱氧
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (20)..(21)
 
<223>  2' O-甲基
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (21)..(21)
 
<223>  反向脱氧脱碱基
 
 
 
<400>  9
 
acgacuaguu caguugcuuu u                                                 21
 
 
 
 
 
<210>  10
 
<211>  21
 
<212>  RNA
 
<213>  人工序列
 
 
 
<220>
 
<223>  合成
 
 
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (1)..(2)
 
<223>  2'氟
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (3)..(4)
 
<223>  2' O-甲基
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (5)..(5)
 
<223>  2'氟
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (6)..(6)
 
<223>  核糖
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (7)..(7)
 
<223>  2'氟
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (8)..(11)
 
<223>  2' O-甲基
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (12)..(14)
 
<223>  2'氟
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (15)..(15)
 
<223>  2' O-甲基
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (16)..(17)
 
<223>  核糖
 
 
 
<220>
 
<221>  misc_feature
 
<222>  (18)..(21)
 
<223>  2' O-甲基
 
 
 
<400>  10
 
aagcaacuga acuagucguu u                                                 21
 
 
 
 
 
<210>  11
 
<211>  52
 
<212>  DNA
 
<213>  人工序列
 
 
 
<220>
 
<223>  合成
 
 
 
<400>  11
 
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacctttaa ca               52
 
 
 
 
 
<210>  12
 
<211>  22
 
<212>  DNA
 
<213>  人工序列
 
 
 
<220>
 
<223>  合成
 
 
 
<400>  12
 
ggcgcgaaat ttcaggaatt gt                                                22
 
 
 
 
 
<210>  13
 
<211>  21
 
<212>  DNA
 
<213>  人工序列
 
 
 
<220>
 
<223>  合成
 
 
 
<400>  13
 
cactggatac gacctttaac a                                                 21
 
 
 
 
 
<210>  14
 
<211>  15
 
<212>  DNA
 
<213>  人工序列
 
 
 
<220>
 
<223>  合成
 
 
 
<400>  14
 
agtgcagggt ccgag                                                        15

Claims (10)

1.式A的阳离子脂质或其任何药学上可接受的盐或立体异构体：
其中：
R1和R2独立地选自H、(C1-C6)烷基、杂环基和多胺，其中所述烷基、杂环基和多胺任选被1至3个选自R'的取代基取代，或R1和R2可以与它们相连的氮一起形成除氮外还任选含有一个或两个选自N、O和S的额外杂原子的4-7元单环杂环，所述单环杂环任选被1至3个选自R'的取代基取代；
R3独立地选自H和(C1-C6)烷基，所述烷基任选被1至3个选自R'的取代基取代；
R'独立地选自卤素、R''、OR''、SR''、CN、CO2R''或CON(R'')2；
R''独立地选自H和(C1-C6)烷基，其中所述烷基任选被卤素和OH取代；
n是0、1、2、3、4或5；
L1是C12-C24烯基，所述烯基任选被一个或多个选自R'的取代基取代；和
L2选自C3-C9烷基和C3-C9烯基，所述烷基和烯基任选被一个或多个选自R'的取代基取代。
2.根据权利要求1的式A的阳离子脂质或其任何药学上可接受的盐或立体异构体，
其中：
R1和R2各自是甲基；
R3是H；
n是0；
L1是C12-C24烯基；和
L2选自C3-C9烷基和C3-C9烯基。
3.根据权利要求1的式A的阳离子脂质或其任何药学上可接受的盐或立体异构体，
其中：
R1和R2各自是甲基；
R3是H；
n是2；
L1是C12-C24烯基；和
L2选自C3-C9烷基和C3-C9烯基。
4.阳离子脂质，其选自：
(20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺(化合物1)；
(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-9-胺(化合物2)；
(16Z,19Z)-N,N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-8-胺(化合物3)；
(13Z,16Z)-N,N-二甲基二十二碳-13,16-二烯-5-胺(化合物4)；
(12Z,15Z)-N,N-二甲基二十一碳-12,15-二烯-4-胺(化合物5)；
(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-6-胺(化合物6)；
(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四碳-15,18-二烯-7-胺(化合物7)；
(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-10-胺(化合物8)；
(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四碳-15,18-二烯-5-胺(化合物9)；
(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-4-胺(化合物10)；
(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-9-胺(化合物11)；
(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-8-胺(化合物12)；
(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-7-胺(化合物13)；
(16Z,19Z)-N,N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-6-胺(化合物14)；
(22Z,25Z)-N,N-二甲基三十一碳-22,25-二烯-10-胺(化合物15)；
(21Z,24Z)-N,N-二甲基三十碳-21,24-二烯-9-胺(化合物16)；
(18Z)-N,N-二甲基二十七碳-18-烯-10-胺(化合物17)；
(17Z)-N,N-二甲基二十六碳-17-烯-9-胺(化合物18)；
(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-7-胺(化合物19)；和
N,N-二甲基二十七烷-10-胺(化合物20)；
(20Z,23Z)-N-乙基-N-甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺(化合物21)；
1-[(11Z,14Z)-1-壬基二十碳-11,14-二烯-1-基]吡咯烷(化合物22)；
(20Z)-N,N-二甲基二十七碳-20-烯-10-胺(化合物23)；
(15Z)-N,N-二甲基二十七碳-15-烯-10-胺(化合物24)；
(14Z)-N,N-二甲基二十九碳-14-烯-10-胺(化合物25)；
(17Z)-N,N-二甲基二十九碳-17-烯-10-胺(化合物26)；
(24Z)-N,N-二甲基三十三碳-24-烯-10-胺(化合物27)；
(20Z)-N,N-二甲基二十九碳-20-烯-10-胺(化合物28)；
(22Z)-N,N-二甲基三十一碳-22-烯-10-胺(化合物29)；
(16Z)-N,N-二甲基二十五碳-16-烯-8-胺(化合物30)；
(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一碳-12,15-二烯-1-胺(化合物31)；
(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(化合物32)；
N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺(化合物33)；
1-[(1S,2R)-2-己基环丙基]-N,N-二甲基十九烷-10-胺(化合物34)；
N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十九烷-10-胺(化合物35)；
N,N-二甲基-21-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]二十一烷-10-胺(化合物36)；
N,N-二甲基-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基]十九烷-10-胺(化合物37)；
N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十六烷-8-胺(化合物38)；
N,N-二甲基-1-[(1R,2S)-2-十一烷基环丙基]十四烷-5-胺(化合物39)；
N,N-二甲基-3-{7-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]庚基}十二烷-1-胺(化合物40)
1-[(1R,2S)-2-庚基环丙基]-N,N-二甲基十八烷-9-胺(化合物41)；
1-[(1S,2R)-2-癸基环丙基]-N,N-二甲基十五烷-6-胺(化合物42)；
N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十五烷-8-胺(化合物43)；和
(11E,20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-11,20,23-三烯-10-胺(化合物44)；
或其任何药学上可接受的盐或立体异构体。
5.阳离子脂质，其是：
(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(化合物32)；
或其任何药学上可接受的盐或立体异构体。
6.包含根据权利要求1的式A的阳离子脂质、胆固醇、DSPC和PEG-DMG的LNP组合物。
7.包含阳离子脂质(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(化合物32)、胆固醇、DSPC和PEG-DMG的LNP组合物。
8.根据权利要求1的阳离子脂质用于制备脂质纳米粒的用途。
9.根据权利要求1的阳离子脂质作为用于递送寡核苷酸的脂质纳米粒中的组分的用途。
10.根据权利要求9的用途，其中所述寡核苷酸是siRNA。
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