BR112012022881B1

BR112012022881B1 - Método para produzir um líquido de açúcar

Info

Publication number: BR112012022881B1
Application number: BR112012022881-1A
Authority: BR
Inventors: Hiroyuki Kurihara; Atsushi Minamino; Yuki Yamamoto; Katsushige Yamada
Original assignee: Toray Industries,Inc
Priority date: 2010-03-15
Filing date: 2011-03-14
Publication date: 2019-05-07
Also published as: CN102791874B; EP2548966B1; DK2548966T3; US10266860B2; US20130203117A1; EP2548966A4; EP2548966A1; CA2792095C; AU2011228213A1; RU2012143737A; MY160038A; US20170175065A1; US9624516B2; AU2011228213B2; CA2792095A1; JPWO2011115040A1; CN102791874A; KR20130038818A; ES2689865T3; BR112012022881B8

Abstract

método para produzir um líquido de açúcar a presente invenção é destinada a proporcionar um método para produzir um líquido de açúcar que repete um processo para produzir líquido de açúcar que compreende as etapas (1) a (3) abaixo: (1) a etapa de adicionar uma celulase derivada de fungo filamentoso a celulose para realizar hidrólise primária; (2) a etapa de adicionar uma celulase derivada de fungo filamentoso fresca ao hidrolisado em etapa (1) para realizar hidrólise secundária; e (3) a etapa de submeter o hidrolisado em etapa (2) a separação sólido-líquido para obter um líquido de açúcar, a partir do qual uma enzima recuperada é obtida; em que a enzima recuperada obtida em etapa (3) é usada para etapa (1) dos próximos e seguintes processos para produzir líquido de açúcar. por meio deste, a presente invenção proporciona um método para reduzir a quantidade de enzima usada, como celulase, em um método para produzir um líquido de açúcar a partir de celulose pré-tratada.

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR UM LÍQUIDO DE AÇÚCAR”

Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a um método para produzir um líquido de açúcar a partir de celulose, e um aparelho para o método.

Antecedentes da Invenção [002] Os processos de fermentação para produzir produtos químicos como o uso de açúcares como material bruto foram usados para produzir vários materiais industriais. No presente, como os açúcares a serem usados como insumos de fermentação, aqueles derivados a partir de materiais alimentícios como cana de açúcar, amido e beterraba sacarina são usados industrialmente. Entretanto, em vista do fato da alta nos preços dos materiais alimentícios devido ao aumento future esperado da população mundial, ou com uma visão ética do fato de que os açúcares para materiais industriais podem competir com açúcares para comida, um processo para produzir de forma eficiente um líquido de açúcar a partir de uma fonte não alimentícia renovável, isto é, uma biomassa que contém celulose, ou um processo para uso de um líquido de açúcar obtido por matéria prima de fermentação a fim de converter de forma eficaz o líquido de açúcar em um material industrial que precisa ser construído no futuro.

[003] Os exemplos dos métodos apresentados para produzir um líquido de açúcar a partir de uma biomassa que contém celulose inclui os métodos para produzir líquidos de açúcar por meio da hidrólise ácida de celulose e hemicelulose usando ácido sulfúrico concentrado (Documento de Patente 1 e 2) e um método em que uma biomassa que contém celulose é submetida a tratamento por hidrólise usando ácido sulfúrico diluído e, então, a mesma é enzimaticamente tratada por celulase ou similares a fim de produzir um líquido de açúcar (Documento Não Patente 1). Ademais, os exemplos dos métodos apresentados sem o uso de ácido inclui um método em que uma

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2/48 biomassa que contém celulose é hidrolisada usando água subcrítica em torno de 250°C a 500°C a fim de produzir um líquido de açúcar (Documento de patente 3), um método em que uma biomassa que contém celulose é submetida a tratamento por água subcrítica e, então, a mesma é tratada de forma enzimática para produzir um líquido de açúcar (Documento de patente 4), e um método em que uma biomassa que contém celulose é submetida a tratamento por hidrólise com água quente pressurizada a 240°C até 280°C e, então, a mesma é tratada de forma enzimática a fim de produzir um líquido de açúcar (Documento de patente 5).

[004] Nos últimos anos, os métodos de hidrólise de uma biomassa que usa menos energia e causa menos carga ambiental, porém produz açúcar com alto rendimento foram estudados amplamente. Entretanto, tais métodos usando enzimas têm uma desvantagem pelo alto custo das enzimas.

[005] Para a solução destes problemas técnicos, os métodos pela recuperação e reutilização das enzimas usadas na hidrólise foram propostos. Os exemplos de tais métodos apresentados incluem um método em que a separação sólido-líquido contínua é executada com um filtro spin e o líquido de açúcar obtido é filtrado através de uma membrana de ultrafiltração a fim de recuperar as enzimas (Documento de patente 6), um método em que um tensoativo é alimentado na etapa de sacarificação enzimática, para suprimir a absorção de enzima e, por meio disto, fortalecer a eficácia da recuperação (Documento de patente 7), um método em que o resíduo produzido pela sacarificação enzimática é submetido a tratamento elétrico para recuperar o componente de enzima (Documento de patente 8) e um método em que o resíduo produzido pela sacarificação enzimática é alimentado novamente para outro grupo de biomassa e as enzimas são, assim reutilizadas (Documento de patente 9).

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Documentos Da Técnica Anterior [Documentos de patente] [006] Documento de patente 1:

Pedido de Patente Traduzido do Japonês Com Número 11-506934

Documento de patente 2: JP 2005-229821 A

Documento de patente 3: JP 2003-212888 A

Documento de patente 4: JP 2001-95597 A

Documento de patente 5: JP 3041380 B

Documento de patente 6: JP 2006-87319 A

Documento de patente 7: JP 63-87994 A

Documento de patente 8: JP 2008-206484 A

Documento de patente 9: JP 55-144885 A

Documento que não patentes [007] Documento que não patente 1:

A. Aden et al. “Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis e Enzymatic Hydrolisys for Corn Stover” NREL Relatório Técnico (2002)

Descrição Resumida Da Invenção

Problemas a Serem Resolvidos Pela Invenção [008] Os métodos de hidrólise enzimática de celulose foram desenvolvidos conforme descrito acima, mas os efeitos destes métodos foram insuficientes em vista da redução da quantidade de enzima usada. Portanto, a presente invenção procura o desenvolvimento de um processo em que o efeito de redução de quantidade da enzima usada seja maior do que aqueles em métodos convencionais.

Meios Para a Resolução De Problemas [009] A presente invenção tem a constituição composta por [1] a [11] abaixo.

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4/48 [1] Um método para produzir um líquido de açúcar que repete um processo para produzir líquido de açúcar que compreende as Etapas (1) a (3) abaixo:

(1) a etapa de adicionar uma celulase derivada de fungo filamentoso a celulose para realizar hidrólise primária;

(2) a etapa de adicionar uma celulase derivada de fungo filamentoso fresca ao hidrolisado em Etapa (1) para realizar hidrólise secundária; e (3) a etapa de submeter o hidrolisado em Etapa (2) a separação sólido-líquido para obter um líquido de açúcar, a partir do qual uma enzima recuperada é obtida; em que a enzima recuperada obtida em Etapa (3) é usada para Etapa (1) dos próximos e seguintes processos para produzir líquido de açúcar.

[2] O método para produzir um líquido de açúcar de acordo com [1], em que, como a celulase derivada de fungo filamentoso na Etapa (1) do processo para produzir líquido de açúcar, um componente de enzima recuperada a partir de um hidrolisado de celulose produzido por uma celulase derivada de fungo filamentoso é usado.

[3] O método para produzir um líquido de açúcar de acordo com [1] ou [2], em que a celulase derivada de fungo filamentoso na Etapa (1) ou (2) compreende um componente derivado a partir de um líquido de cultura de um microorganismo que pertence ao gênero Trichoderma.

[4] Método para produzir um líquido de açúcar de acordo com qualquer uma dentre [1] a [3], em que a enzima recuperada compreende xilanase e/ou xilosidase.

[5] O método para produzir um líquido de açúcar de acordo com qualquer uma dentre [1] a [4], em que a enzima recuperada compreende uma celulase derivada de fungo filamentoso insolúvel em água.

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5/48 [6] O método para produzir um líquido de açúcar de acordo com qualquer uma dentre [1] a [5], em que a celulose é um produto processado obtido por submeter uma biomassa que contém celulose a tratamento alcalino, tratamento hidrotérmico ou tratamento por ácido sulfúrico diluído.

[7] O método para produzir um líquido de açúcar de acordo com qualquer uma dentre [1] a [6], em que as quantidades de enzima adicionadas em hidrólise primária e hidrólise secundária satisfazem a relação a seguir: a quantidade da enzima recuperada adicionada em Etapa (1) é maior que a quantidade da enzima fresca adicionada em Etapa (2).

[8] O método para produzir um líquido de açúcar de acordo com qualquer uma dentre [1] a [7], em que a recuperação da celulase derivada de fungo filamentoso na Etapa (3) é executada por filtrar o líquido de açúcar através de uma membrana de ultrafiltração e recuperar a celulase a partir do lado de alimentação.

[9] Um aparelho para um método para produzir um líquido de açúcar, o método compreendendo a etapa de hidrolisar celulose, e o aparelho compreendendo, como constituintes: um tanque de hidrólise ao qual uma tubulação de alimentação de enzima recuperada e uma tubulação de alimentação de enzima fresca são conectadas; dispositivo de separação sólidolíquido de um hidrolisado; tanque de retenção de líquido de açúcar tendo uma tubulação de fornecimento de água para lavar uma membrana de ultrafiltração e/ou para a remover enzima recuperada retida em uma tubulação de circulação; e dispositivo de membrana de ultrafiltração para separar enzima e e um líquido de açúcar.

[10] Um aparelho para um método para produzir um líquido de açúcar, o método compreendendo a etapa de hidrolisar celulose, o aparelho compreendendo, como constituintes: um dispositivo de mistura de celulose/enzima recuperada para misturar enzima recuperada e celulose para

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6/48 realizar hidrólise primária; tanque de hidrólise ao qual uma tubulação de fornecimento de mistura de celulose/enzima recuperada e uma tubulação de alimentação de enzima fresca são conectadas; dispositivo de separação sólidolíquido de um hidrolisado; tanque de retenção de líquido de açúcar tendo uma tubulação de fornecimento de água para lavar uma membrana de ultrafiltração e/ou para remover enzima recuperada retida em uma tubulação de circulação; e dispositivo de membrana de ultrafiltração para separar enzima e um líquido de açúcar.

[11] Um aparelho que compreende, como constituinte(s), em adição aos constituintes do aparelho recitados na [9] ou [10], um dispositivo de membrana de osmose reversa e/ou nanofiltração para concentrar o líquido de açúcar.

Efeito Da Invenção [010] Em um método de hidrólise em que a celulase é recuperada e reutilizada, a quantidade de enzima usada para a hidrólise pode ser amplamente reduzida e a eficácia da produção de açúcar a partir de uma biomassa que contém celulose pode ser amplamente aumentada por adicionar, antes de adicionar enzima fresca, enzima recuperada para realizar hidrólise primária e, então, adicionar enzima fresca para realizar hidrólise secundária.

Descrição Resumida Dos Desenhos [011] A Figura 1 é um diagrama esquemático que mostra o procedimento do método de hidrólise da presente invenção.

[012] A Figura 2 é um diagrama esquemático que mostra um aparelho usado na presente invenção.

[013] A Figura 3 é um diagrama esquemático que mostra um aparelho usado na presente invenção.

[014] A Figura 4 é um diagrama esquemático que mostra um aparelho usado na presente invenção.

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7/48 [015] A Figura 5 é um diagrama esquemático que mostra um aparelho usado na presente invenção.

[016] A Figura 6 é um diagrama esquemático que mostra um aparelho usado na presente invenção.

[017] A Figura 7 é um diagrama esquemático que mostra um aparelho usado na presente invenção.

[018] A Figura 8 é um diagrama esquemático que mostra um aparelho usado na presente invenção.

[019] A Figura 9 é um diagrama esquemático que mostra um aparelho usado na presente invenção.

[020] A Figura 10 é um diagrama esquemático que mostra um aparelho usado na presente invenção.

[021] A Figura 11 é um diagrama que mostra o resultado de SDS-PAGE do componente de celulase derivado de trichoderma insolúvel em água.

Melhor Modo De Realizar a Invenção [022] Grandes quantidades de celuloses são contidas em biomassas herbáceas como bagaço, céspede, Capim napier, Erianthus, milho, palha de arroz e palha de trigo; e biomassas de madeira como árvores e materiais de restos de construções. Estas biomassas que contém celulose podem ser usadas de preferência, como material bruto na presente invenção.

[023] A biomassa que contém celulose contém, em adição à celulose e hemicelulose (chamada no presente documento de “celulose” como um termo geral para celulose e hemicelulose), lignina e similares que são macromoléculas aromáticas. Portanto, em casos onde a celulose derivada a partir de uma biomassa é usada como matéria prima para um líquido de açúcar no método da presente invenção para produzir um líquido de açúcar, a eficácia da hidrólise enzimática pode ser aumentada por meio do pré-tratamento. Os

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8/48 exemplos do método de pré-tratamento de uma biomassa que contém celulose inclui tratamento por ácido, tratamento por ácido sulfúrico, tratamento por ácido sulfúrico diluído, tratamento alcalino, tratamento por soda cáustica, tratamento hidrotérmico, tratamento por água subcrítica, tratamento por pulverização e tratamento por vaporização. Na presente invenção, o método de pré-tratamento é, de preferência, tratamento alcalino, tratamento hidrotérmico ou tratamento por ácido sulfúrico diluído.

[024] Os exemplos do tratamento alcalino incluem os métodos usando base alcalina como hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio ou amônia, e a amônia pode ser usada de forma especialmente preferencial. Tal tratamento por amônia pode ser executado pelos métodos descritos em JP 2008-161125 A e JP 2008-535664 A. Por exemplo, a amônia é adicionada à biomassa em uma concentração dentro da faixa de 0,1 a 15% em peso, e o tratamento é executado de 4 a 200°C, de preferência 90 a 150°C. A amônia a ser adicionada pode estar tanto em estado líquido quanto gasoso. Ademais, a forma da amônia a ser adicionada pode ser tanto amônia pura quanto amônia aquosa. O número de vezes do tratamento não é restrito, e 1 ou mais vezes o tratamento pode ser executado. Em particular, em casos onde o tratamento é executado 2 ou mais vezes, as condições para o primeiro tratamento podem ser diferentes das do segundo e seguintes tratamentos. O produto tratado obtido pelo tratamento por amônia precisa ser submetido à neutralização da amônia ou remoção da amônia a fim de realizar adicionalmente a reação de hidrólise enzimática. A neutralização da amônia pode ser executada tanto após a redução dos sólidos a partir do hidrolisado pela separação sólido-líquido quanto no estado no qual os sólidos são contidos. O reagente ácido a ser utilizado para a neutralização não é restrito. A amônia pode ser removida ao manter o produto de tratado por amônia sob pressão reduzida a fim de permitir a

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9/48 evaporação da amônia para o estado gasoso. A amônia removida pode ser recuperada e reutilizada.

[025] No caso de tratamento hidrotérmico, a água é adicionada de forma que a concentração da biomassa que contém celulose é de 0,1 a 50 % em peso, e a mistura resultante é tratada em uma temperatura de 100 a 400°C por 1 segundo a 60 minutos. Por tratar sob tais condições de temperatura, a hidrólise de celulose ocorre. O número de vezes do tratamento não é restrito, e 1 ou mais vezes do tratamento podem ser executadas. Em particular, em casos onde o tratamento é executado 2 ou mais vezes, as condições para o primeiro tratamento pode ser diferente das do segundo e próximos tratamentos.

[026] No caso do tratamento por ácido sulfúrico diluído, a concentração de ácido sulfúrico é, de preferência, de 0,1 a 15% em peso, com mais preferência de 0,5 a 5% em peso. A temperatura de reação pode estar estabelecida dentro da faixa de 100 a 300°C, e é, de preferência, estabelecida dentro da faixa de 120 a 250°C. O tempo de reação pode ser estabelecido dentro da faixa de 1 segundo a 60 minutos. O número de vezes do tratamento não é restrito, e 1 ou mais vezes do tratamento podem ser executadas. Em particular, em casos onde o tratamento é executado 2 ou mais vezes, as condições do primeiro tratamento podem ser diferentes das do segundo e seguintes tratamentos. Já que o hidrolisado obtido pelo tratamento por ácido sulfúrico diluído contém ácido, a neutralização é necessária a fim de realizar adicionalmente a reação por hidrólise com celulase ou a fim de utilizar o hidrolisado como uma matéria prima de fermentação.

[027] A presente invenção é caracterizada por ter a celulose hidrolisada com uma celulase derivada de fungo filamentoso. A hidrólise de celulose significa que a celulose é transformada em fragmentos com baixo peso molecular por meio da ação da celulase a fim de produzir

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10/48 monossacarídeos e/ou oligossacarídeos. As condições de reação para a hidrólise não são restritas enquanto a reação é executada sob condições preferenciais pela celulase, e, em geral, a temperatura de reação está, de preferência, dentro da faixa de 15°C a 100°C, com mais preferência de 40°C a 60°C, ainda com mais preferência 50°C. O pH para a hidrólise está, de preferência, dentro da faixa de 3 a 9, com mais preferência 4 a 5,5, ainda com mais preferência 5. O pH pode ser ajustado por adicionar um ácido ou base alcalina de forma que o pH desejado seja alcançado. Ademais, um tampão pode ser adicionado conforme apropriado. Na hidrólise, é preferencial mexer a mistura a fim de promover o contato da celulose com a enzima e para tornar a concentração de açúcar no hidrolisado uniforme. É preferencial adicionar água de forma que a concentração sólida da celulose esteja dentro da faixa de 1 a 25% em peso, e a concentração de sólidos esteja com mais preferência dentro da faixa de 8 a 20% em peso.

[028] Os exemplos da celulase derivada de fungo filamentoso incluem aqueles derivados a partir de Trichoderma, Aspergillus, Cellulomonas, Clostridium, Streptomyces, Humicola, Acremonium, Irpex, Mucor, Talaromyces, Phanerochaete, fungos causadores de podridão branca e fungos causadores de podridão marrom. Dentre tais celulases derivadas de fungo filamentoso, a celulase derivada de Trichoderma, que tem alta atividade de degradação de celulose, é usada de preferência.

[029] A Celulase derivada de Trichoderma é uma composição de enzima que compreende celulase derivada a partir de um microorganismo que pertence ao gênero Trichoderma como um componente maior. O microorganismo que pertence ao gênero Trichoderma não é restrito, e a Trichoderma reesei é preferencial. Os exemplos específicos de Trichoderma reesei incluem Trichoderma reesei QM9414, Trichoderma reesei QM9123, Trichoderma reesei Rut C-30, Trichoderma reesei ATCC68589, Trichoderma

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11/48 reesei PC3-7, Trichoderma reesei CL-847, Trichoderma reesei MCG77, Trichoderma reesei MCG80 e Trichoderma viride QM9123 (Trichoderma viride QM9123). A celulase pode ainda ser derivada de uma estirpe mutante originada a partir de microorganismo que pertence ao gênero Trichoderma, cuja estirpe mutante foi preparada pela mutagênese usando um agente mutagênico, irradiação UV ou similares para fortalecer a produtividade da celulase.

[030] A celulase derivada de fungo filamentoso usada na presente invenção é uma composição de enzima que compreende uma pluralidade de componentes de enzima como celobiohidrolase, endoglicanase, exoglicanase, β-glicosidase, xilanase e xilosidase, cuja composição de enzima tem uma atividade de hidrolisar e sacarizar celulose. Em casos onde a celulase derivada de fungo filamentoso é usada para a degradação de celulose, um efeito concertado ou efeito complementar pela pluralidade de componentes de enzima permite a hidrólise eficiente da celulose.

[031] Celobiohidrolase é um termo geral para celulases que hidrolisam celulose a partir de porções de terminação. O grupo de enzimas que pertence a celobiohidrolase é descrito como EC número: EC 3.2.1.91.

[032] A endoglicanase é um termo geral para celulases que hidrolisam cadeias de celulose molecular a partir de porções centrais. O grupo de enzimas que pertence a endoglicanase é descrito como EC números: EC

3.2.1.4, EC 3.2.1.6, EC 3.2.1.39 e EC 3.2.1.73 [033] A exoglicanase é um termo geral para celulases que hidrolisam cadeias de celulose molecular a partir de sua terminação. O grupo de enzimas que pertence a exoglicanase é descrito como números EC: EC 3.2.1.74 e EC 3.2.1.58.

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12/48 [034] A β-gicosidase é um termo geral para celulases que agem sobre celo oligossacarídeos ou celobiose. O grupo de enzimas que pertence a β-gicosidase é descrito como EC número: EC 3.2.1.21.

[035] A Xilanase é um termo geral para celulases que agem sobre hemicelulose ou especialmente xilano. O grupo de enzimas que pertence a xilanase é descrito como EC número: EC 3.2.1.8.

[036] A Xilosidase é um termo geral para celulases que agem sobre xilo oligossacarídeos. O grupo de enzimas que pertence a xilosidase é descrito como EC número: EC 3.2.1.37.

[037] Como a Celulase derivada de Trichoderma, um que compreende componente(s) derivados a partir de um líquido de cultura de um microorganismo que pertence ao gênero Trichoderma é, de preferência, usado. Os exemplos do(s) componente(s) derivados a partir de Trichoderma derivado de líquido de cultura incluem todos os componentes que não celulase contida em um líquido de cultura obtido por meio da ação de cultivo de um microorganismo que pertence ao gênero Trichoderma em um meio preparado de forma que o microorganismo produz celulase. Isto é, os exemplos do(s) componente(s) incluem os componentes de enzima que não celulase, células do microorganismo que pertence ao gênero Trichoderma, e componentes de meio usados para o cultivo. Os exemplos específicos dos componentes de meio usados para o cultivo incluem monossacarídeos como glicose e xilose; indutores de produção de celulase como água de maceração do milho, extrato de levedura, e celulose; minerais; e componentes de vitamina. As células de um microorganismo que pertence ao gênero Trichoderma podem ser contidas como um componente derivado a partir de um líquido de cultura de um microorganismo que pertence ao gênero Trichoderma. Isto acontece em razão da inclusão das células de um microorganismo que pertence ao gênero

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Trichoderma como um componente da Celulase derivada de Trichoderma da presente invenção poder fortalecer a atividade da enzima recuperada.

[038] As razões de peso dos componentes de enzima na Celulase derivada de Trichoderma não são restritas, e, por exemplo, um líquido de cultura derivado de Trichoderma reesei contém 50 a 95% em peso de celobiohidrolase, e contém ainda como outros componentes endoglicanase, βgicosidase, exo-1,4-e-D-glicosamidase, xilanase, xilosidase, endo-1,4manosidase, 1,2-a-manosidase, α-glicuronidase, quitosanase, quitinase, 1,4-agicosidase, a-galactosidase, β-galactosidase, arabinofuranosidase, xilano esterase, “swollenin”, hidrofobina e/ou similares. Os microorganismos que pertencem ao Trichoderma produzem componentes fortes de celulase no interior do líquido de cultura, enquanto a atividade de β-gicosidase dentro do líquido de cultura é baixa já que a β-gicosidase é retida dentro das células ou sobre as superfícies da célula. Portanto, em adição aos componentes inerentes de Celulase derivada de Trichoderma, a β-gicosidase proveniente de uma espécie diferente ou a partir da mesma espécie pode ser adicionada. Como a β-gicosidase proveniente de uma espécie diferente, a β-gicosidase derivada de Aspergillus pode ser de preferência usada. Os exemplos da β-gicosidase derivada de Aspergillus incluem Novozyme 188, que está comercialmente disponível por Novozyme. O método de adicionar β-glicosidase a partir de uma espécie diferente ou a partir da mesma espécie pode ser um método em que um gene é introduzido em um microorganismo que pertence ao Trichoderma para realizar recombinação genética do microorganismo de forma que a βgicosidase é produzida no interior do líquido de cultura, e o microorganismo que pertence ao Trichoderma é então cultivado, seguido de isolamento do líquido de cultura.

[039] Na presente invenção, a hidrólise de celulose com a celulase derivada de fungo filamentoso é executada em duas etapas

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14/48 separadas, isto é, a hidrólise primária e hidrólise secundária. As etapas são descritas em ordem abaixo.

[040] A hidrólise primária na presente invenção significa que uma celulase derivada de fungo filamentoso é adicionada a celulose que não foi submetida a tratamento por enzima, para realizar hidrólise. A enzima usada para a hidrólise primária pode ser tanto a enzima fresca mencionada por último ou a enzima recuperada, e a enzima recuperada é, de preferência, usada já que o uso da enzima recuperada pode aumentar a eficácia da produção de açúcar. Os mecanismos pelos quais a eficácia da produção de açúcar é aumentada por meio do uso de enzima recuperada na hidrólise primária acontecem conforme a seguir. Na enzima recuperada, os componentes de enzima cujas estruturas foram parcialmente desnaturadas devido ao aquecimento durante a hidrólise são contidos, e tais componentes de enzima mostram especificamente forte absorção para absorver os locais que existem sobre as superfícies da celulose. Como resultado, os componentes de enzima não são especificamente absorvidos das porções de superfície absorvíveis dentro da celulose, como lignina. Portanto, a absorção não específica do componente de enzima fresca que é alimentado mais tarde pode ser contida. Em geral, a atividade específica (atividade enzimática por peso de proteína) de degradação por celulase é mais alta na enzima recuperada do que na enzima fresca. Isto é, como resultado da contenção da absorção não específica do componente de enzima fresca, que tem uma atividade específica mais alta, a produtividade de açúcar e a eficácia da recuperação da enzima podem ser aumentadas. Outra razão é, conforme o número de vezes de recuperação da enzima recuperada da presente invenção aumenta, é possível obter maior atividade de degradação de xilano. A atividade de degradação de xilano contida dentro da enzima recuperada pode ser medida usando como um substrato a ser degradado um reagente xilano como xilano de bétula. Os

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15/48 exemplos de componentes de celulase derivada de fungo filamentoso envolvidos na atividade de degradação de xilano incluem xilanase e xilosidase. Os exemplos dos genes para xilanase incluem xyn1(GH11), xyn2(GH11), xyn3(GH10), xyn4(GH5), xyn5b(GH5) e xyn11(GH11). Os exemplos dos genes para xilosidase incluem bxl1/bxl3a(GH3), bxl3b(GH3) e bxl3c(GH3). Cada um dos genes acima codifica xilanase ou xilosidase, e é contido como um componente de celulase derivada de fungo filamentoso. Os exemplos de enzimas que degradam xilano cujas atividades na enzima recuperada podem ser aumentadas incluem xilanase 3 (peso molecular, 38 kDa; xyn3), endo-β-

1,4-xilanase (peso molecular, 25 kDa; xynl) e β-xilosidase (peso molecular, 88 kDa; bxl1/bxl3a). Por adicionar enzima recuperada, cuja atividade de degradação de xilano foi aumentada conforme descrito acima, para a hidrólise primária, os componentes de xilano que cercam a celulose são hidrolisados de forma preferencial, e a produtividade de açúcar na hidrólise primária e secundária pode, portanto, ser aumentada.

[041] O tempo de reação na hidrólise primária está, de preferência, dentro da faixa de 15 minutos a 6 horas. Em casos onde o tempo de reação é menor que 15 minutos, o grau de fortalecimento da eficácia da produção de açúcar pode ser baixo, enquanto em casos onde o tempo de reação não é menor que 6 horas, a eficácia da produção de açúcar por tempo de unidade pode ser baixa. A concentração de celulose, temperatura de reação e pH não são restritos, e podem ser aqueles nas condições descritas acima para hidrólise.

[042] A enzima para a hidrólise primária é, de preferência, adicionada à razão de peso de 1/1000 a 1/50 em relação ao peso da celulose pré-tratada. O peso da celulose pré-tratada pode ser calculado por meio da medição de peso do conteúdo sólido na celulose pré-tratada. O peso dos sólidos pode ser calculado por meio da submissão do produto pré-tratado a

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16/48 separação sólido-líquido por meio da centrifugação, separação da membrana ou similares e lavando o conteúdo resultante com água para separar e remover os compostos solúveis em água, seguido da secagem dos sólidos contendo água até que o peso alcance um valor constante e meça o peso dos sólidos. A quantidade de enzima adicionada pode ser calculada por meio da medição de concentração de proteína na solução que contém a enzima fresca e multiplicação da concentração de proteína pela quantidade da solução da enzima fresca adicionada.

[043] No hidrolisado primário obtido pela hidrólise primária, os componentes de monossacarídeo produzidos pela hidrólise são acumulados. A atividade de degradação de xilano tende a ser alta especialmente em casos onde a enzima recuperada é usada para a hidrólise primária. Isto é, no hidrolisado primário obtido usando enzima recuperada na hidrólise primária, uma quantidade grande de xilose é produzida. O hidrolisado primário obtido pela hidrólise primária da presente invenção pode ser submetido à hidrólise secundária mencionada por último como for ou após realizar operação, como separação sólido-líquido para o fortalecimento da concentração de sólidos não degradados. Ademais, em casos onde a separação sólido-líquido é executada após a hidrólise primária, o componente de solução obtido pela separação pode ser usado como um líquido de açúcar.

[044] A hidrólise secundária na presente invenção significa que a enzima fresca é adicionada adicionalmente ao hidrolisado obtido pela hidrólise primária descrita acima, para realizar hidrólise. A operação de separação sólido-líquido não precisa ser executada para o hidrolisado primário. Ademais, conforme requerido, a água pode ser adicionada, mas adicionar água não é indispensável.

[045] Na presente invenção, a enzima fresca é alimentada e usada para a hidrólise secundária. Isto é executado em razão de 1) já que uma

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17/48 eficácia suficiente de degradação de celulose não pode ser obtida com a quantidade de enzima alimentada na hidrólise primária (a enzima fresca ou enzima recuperada), a enzima fresca precisa ser adicionalmente alimentada para obter uma eficácia suficiente de degradação de celulose; e 2) a eficácia da produção de açúcar e a eficácia de recuperação da enzima podem ser aumentadas pela alimentação da enzima fresca em duas etapas separadas, isto é, na hidrólise primária e na hidrólise secundária. Ademais, especialmente em casos onde apenas a hidrólise primária usando enzima recuperada é executada, o rendimento de açúcar no segundo e próximos processos diminui, o que não é preferencial. Portanto, por meio da alimentação da enzima fresca, em adição à enzima recuperada, para a hidrólise secundária, o rendimento de açúcar pode ser equivalente ao do primeiro processo ou do processo anterior. Isto é, no presente método para produzir um líquido de açúcar, é possível repetir a produção de açúcar em uma concentração de não menos que um valor predeterminado.

[046] A adição de enzima fresca para a hidrólise secundária pode ser executada de forma dividida uma pluralidade de vezes (alimentação dividida). Por exemplo, após a hidrólise primária, uma metade da enzima fresca a ser adicionada em hidrólise secundária pode ser alimentada para realizar hidrólise por diversas horas, seguido da alimentação da metade restante da enzima fresca. Na presente invenção, mesmo os casos onde a enzima fresca é alimentada de forma dividida diversas vezes na hidrólise secundária, estas operações ainda são incluídas na hidrólise secundária.

[047] O tempo de reação da hidrólise secundária é, de preferência, não mais que o da hidrólise primária. Mais especificamente, o tempo de reação da hidrólise secundária está, de preferência, dentro da faixa de 1 a 200 horas, com mais preferência dentro da faixa de 6 a 72 horas, ainda com mais preferência dentro da faixa de 12 a 24 horas. Embora o tempo de

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18/48 reação deva ser controlado dependendo da quantidade de enzima usada, a temperatura de reação, a concentração de açúcar de interesse e similares, um tempo de reação maior que 200 horas pode causar a inativação do calor da celulase, o que não é preferencial em vista da recuperação e reutilização da celulase. Por outro lado, em casos onde o tempo de reação é menor que 1 hora, a concentração de açúcar do hidrolisado obtido pode ser insuficiente.

[048] A enzima para a hidrólise secundária é, de preferência, adicionada em uma proporção de peso de 1/1000 a 1/50 em relação ao peso da celulose pré-tratada. O peso da celulose pré-tratada pode ser calculado a partir do peso do conteúdo sólido da celulose pré-tratada antes da hidrólise primária.

[049] As quantidades de enzima adicionadas em hidrólise primária e hidrólise secundária de preferência satisfazem a relação a seguir: a quantidade de enzima adicionada para a hidrólise primária é maior que a quantidade de enzima adicionada para a hidrólise secundária. A quantidade de adição aqui pode ser calculada pela multiplicação de concentração de proteína da enzima fresca ou enzima recuperada pela quantidade da solução de enzima a ser alimentada. Em termos de medição da concentração de proteína, a concentração de proteína da enzima recuperada e enzima fresca pode ser calculada pelo método conhecido descrito acima. A concentração de proteína aqui significa simplesmente a concentração de proteína, sem relação se a proteína é um componente derivado de celulase ou outro componente. Na presente invenção, quando a quantidade de adição satisfaz essa relação, uma produção de açúcar mais alta pode ser alcançada, e a eficácia da recuperação de enzima pode ainda ser aumentada.

[050] A presente invenção tem a etapa de submeter o hidrolisado secundário a separação sólido-líquido para obter um líquido de açúcar, a partir do qual uma celulase derivada de fungo filamentoso é, então,

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19/48 recuperada; e a etapa de reutilizar a celulase derivada de fungo filamentoso recuperada na hidrólise primária. As etapas são descritas em ordem abaixo.

[051] A separação sólido-líquido do hidrolisado secundário é executada com o propósito de separar o líquido de açúcar e o resíduo de hidrólise obtido pela hidrólise secundária. O líquido de açúcar significa a solução de açúcar obtida pela hidrólise de celulose obtida acima. Os açúcares são, em geral, classificados com base no grau de polimerização dos monossacarídeos, em monossacarídeos como glicose e xilose; oligossacarídeos produzidos pela condensação de desidratação de 2 a 9 monossacarídeos; e polissacarídeos produzidos pela condensação de desidratação de não menos que 10 monossacarídeos. O líquido de açúcar obtido pela presente invenção compreende glicose e xilose como maiores componentes, e, embora em pequenas quantidades, oligossacarídeos como celobiose; e monossacarídeos como arabinose e manose. Mais especificamente, o método de análise de monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos dissolvidos em água pode ser HPLC, pelo qual a quantificação pode ser executada com base na comparação com uma amostra padrão. O método de separação sólido-líquido não é restrito, e exemplos do método de separação sólido-líquido incluem centrifugação usando um decantador ou similares, filtração usando filtro-prensa ou similares, e separação de membrana usando uma membrana de microfiltração ou similares.

[052] No hidrolisado secundário, a celulase derivada de fungo filamentoso existe no estado onde a mesma é dissolvida em um líquido de açúcar ou absorvida pelo resíduo sólido como um material não degradado. Tal celulase derivada de fungo filamentoso pode ser recuperada pela separação sólido-líquido a partir da lateral do líquido de açúcar. Os exemplos preferenciais do método para a recuperar celulase derivada de fungo filamentoso a partir do líquido de açúcar inclui um método em que o líquido de açúcar é filtrado

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20/48 através de uma membrana de ultrafiltração e a celulase é recuperada a partir do lado de alimentação. Os exemplos da membrana de ultrafiltração que podem ser usados incluem membranas feitas de materiais como poliéter sulfona (PES), fluoreto de polivinilidina (PVDF) e celulose regenerada, mas, já que a celulose regenerada é degradada pela celulase, uma membrana de ultrafiltração feita de um material polimérico sintético como PES ou PVDF é, de preferência, usada. O peso molecular retirado da membrana de ultrafiltração não é restrito contanto que a celulase a ser usada possa ser recuperada de forma eficaz, e a membrana de ultrafiltração de preferência tenha um corte de peso molecular dentro da faixa de 1000 a 50000. A quantidade de enzima recuperada varia dependendo da quantidade de enzima fresca adicionada em hidrólise secundária, e não é, portanto, restrita.

[053] Na operação de repetir a recuperação e reutilizar na presente invenção, e especificamente no processo de separar a enzima recuperada usando uma membrana de ultrafiltração, um componente de celulase derivada de fungo filamentoso insolúvel em água pode ser obtido como um componente de enzima recuperada em alguns casos. Tal componente de celulase derivada de fungo filamentoso insolúvel em água é um componente de enzima produzido durante o processo de hidrólise ou durante a recuperação da enzima usando uma membrana de ultrafiltração ou similares. Tal componente de celulase derivada de fungo filamentoso insolúvel em água é, de preferência, usado de forma natural, sem ser removido pela separação sólido-líquido, filtração ou similares, como um componente de enzima recuperada. O componente de celulase derivada de fungo filamentoso insolúvel em água é constituído principalmente pela celobiohidrolase. A insolubilidade em água significa que o componente existe no líquido de enzima recuperada como precipitado, flocos ou micropartículas, que podem ser separadas por meio da disposição da enzima recuperada em um tubo e centrifugação do tubo

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21/48 para obter componente de celulase derivada de fungo filamentoso insolúvel em água como precipitado. O componente de celulase derivada de fungo filamentoso insolúvel em água recuperado como precipitado pode ser identificado com base em sua cor, que pode ser branco, amarelo claro, marrom ou similares. Por meio da separação do componente de celulase derivada de fungo filamentoso insolúvel em água e resuspensão do mesmo em água, uma parte do componente pode ser dissolvido. Entretanto, para dissolução completa do componente, adicionar ureia ou um tensoativo (sulfato dodecil sódico, Tween 80, Triton X ou similares) é necessário. Por meio da reutilização da enzima recuperada que contém tal componente de celulase derivada de fungo filamentoso insolúvel em água para a hidrólise primária, ainda é possível alcançar alta produtividade de açúcar.

[054] A celulase derivada de fungo filamentoso recuperada a partir do hidrolisado secundário (chamado no presente documento de enzima recuperada) é reutilizada para a hidrólise primária. As vantagens de uso da enzima recuperada na hidrólise primária são conforme descritas acima. O número de vezes de reutilização da enzima recuperada não é restrito.

[055] Na presente invenção, a quantidade de enzima adicionada na reutilização da enzima recuperada a partir do hidrolisado para a hidrólise primária é, de preferência, maior que a quantidade de enzima fresca adicionada na hidrólise secundária. A quantidade de adição de enzima é medida em termos de quantidade de proteína conforme descrito acima. Em geral, a atividade de celulase da enzima recuperada (atividade de enzima por quantidade de proteína) é mais baixa que a atividade de celulase da enzima fresca, mas, na presente invenção, em casos onde a relação: a quantidade de adição de enzima recuperada a ser reutilizada para a hidrólise primária é maior que a quantidade de adição de enzima fresca na hidrólise secundária; é

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22/48 satisfeita, a eficácia da produção de açúcar em relação à quantidade de enzima fresca aumenta.

[056] O líquido de açúcar obtido pela presente invenção contém monossacarídeos como glicose, xilose, arabinose e manose derivada de celulose e hemicelulose (xilano e arabinano). A razão de constituição dos monossacarídeos não é restrita, e os componentes de monossacarídeo principais são glicose e xilose. O líquido de açúcar da presente invenção pode conter ainda oligossacarídeos como celobiose, e similares, embota as suas quantidades passam ser muito pequenas comparadas às quantidades de monossacarídeos. A concentração de monossacarídeos contida no líquido de açúcar não é restrita, e é, de preferência, 0,1 a 20% em peso, com mais preferência 5 a 20% em peso. Em casos onde a concentração no líquido de açúcar está dentro da faixa de 5 a 20% em peso, o líquido de açúcar pode ser usado como uma matéria prima de fermentação para microorganismos, sem ser concentrada.

[057] O líquido de açúcar da presente invenção pode ser concentrado usando uma membrana de nanofiltração e/ou membrana de osmose reversa. Exemplos do material da membrana de nanofiltração ou membrana de osmose reversa que podem ser usados na presente invenção incluindo materiais poliméricos, como polímeros acetato de celulose, poliamidas, poliésteres, polimidas, polímeros vinílicos e polisulfonas. A membrana não é restrita a uma membrana constituída por apenas um dos materiais, e pode ser uma membrana que compreende uma pluralidade de materiais de membrana.

[058] Como a membrana de nanofiltração a ser usada na presente invenção, um elemento de membrana ferido em espiral é preferencial. Os exemplos específicos do elemento de membrana de nanofiltração preferencial incluem elemento de membrana de nanofiltração acetato de

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23/48 celulose GE Sepa, produzida pela GE Osmonics; elementos de membrana de nanofiltração NF99 e NF99HF, produzida por Alfa-Laval, que tem camadas funcionais de poliamida; elementos de membrana de nanofiltração NF-45, NF90, NF-200, NF-270 e NF-400, produzidos por FilmTec Corporation, que tem camadas funcionais de poliamida tuborazina de ligação cruzada; e elementos de membrana de nanofiltração SU-210, SU-220, SU-600 e SU-610, produzidos por Toray Industries, Inc., que compreende a membrana de nanofiltração UTC60, produzida pelo mesmo fabricante, que compreende um poliamida tuborazina de ligação cruzada como um componente principal. O elemento de membrana de nanofiltração é, com mais preferência, NF99 ou NF99HF; NF-45, NF-90, NF-200 ou NF-400; ou SU-210, SU-220, SU-600 ou SU-610. O elemento de membrana de nanofiltração é ainda com mais preferência SU-210, SU-220, SU-600 ou SU-610.

[059] Como a membrana de osmose reversa a ser usada na presente invenção, um elemento de membrana ferido em espiral é preferencial como no caso da membrana de nanofiltração. Os exemplos específicos do elemento membrana de osmose reversa incluem módulos de membrana de osmose reversa poliamida produzida por TORAY INDUSTRIES, INC. SU-710, SU-720, SU-720F, SU-710L, SU-720L, SU-720LF, SU-720R, SU-710P e SU720P, que são módulos do tipo de baixa pressão, assim como SU-810, SU820, SU-820L e SU-820FA que contém UTC70 como uma membrana de osmose reversa, que são módulos do tipo alta pressão; membranas de osmose reversas acetato de celulose produzidas pelo mesmo fabricante SC-L100R, SC-L200R, SC-1100, SC-1200, SC-2100, SC-2200, SC-3100, SC-3200, SC8100 e SC-8200; NTR-759HR, NTR-729HF, NTR-70SWC, ES10-D, ES20-D, ES20-U, ES15-D, ES15-U e LF10-D, produzida por Nitto Denko Corporation; RO98pHt, RO99, HR98PP e CE4040C-30D, produzida por Alfa-Laval; GE

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Sepa, produzida por GE; e BW30-4040, TW30-4040, XLE-4040, LP-4040, LE4040, SW30-4040 e SW30HRLE-4040, produzida por FilmTec Corporation.

[060] O aparelho para realizar o método da presente invenção para produzir um líquido de açúcar por hidrólise enzimática de celulose é descrito abaixo mais especificamente com referência aos desenhos anexados.

[061] Como um mecanismo de aparelho para realizar o método para produzir um líquido de açúcar, o aparelho da presente invenção tem uma constituição de aparelho que compreende: 1. um tanque de hidrólise ao qual uma tubulação de alimentação de enzima recuperada e uma tubulação de alimentação de enzima fresca são conectadas; 2. um dispositivo de separação sólido-líquido de um hidrolisado; 3. um tanque de retenção de líquido de açúcar tendo uma tubulação de fornecimento de água para lavar uma membrana de ultrafiltração e/ou para a remover enzima recuperada retida em uma tubulação de circulação; e 4. um dispositivo de membrana de ultrafiltração para separar enzima e um líquido de açúcar; que são conectados de forma funcional um ao outro. Isto é, no método da presente invenção para produzir um líquido de açúcar, a hidrólise primária é executada usando enzima recuperada. Para realizar isso, 1. o tanque de hidrólise ao qual uma tubulação de alimentação de enzima recuperada e uma tubulação de alimentação de carbohidrase fresco são conectadas; foi fornecido. Ademais, para separar a enzima recuperada contida no hidrolisado, 2. o dispositivo de separação sólido-líquido de um hidrolisado; e 4. o dispositivo de membrana de ultrafiltração para separar enzima e um líquido de açúcar; foram fornecidos. Ademais, para remover o líquido de enzima recuperada e lavar a membrana de ultrafiltração ao mesmo tempo, 3. o tanque de retenção de líquido de açúcar tendo uma tubulação de fornecimento de água para lavar a membrana de ultrafiltração e/ou para remover a enzima recuperada retida em uma tubulação de circulação; foi

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25/48 fornecido. Os exemplos específicos do aparelho são descritos abaixo com referência à Figura 2 à Figura 10.

[062] A Figura 2 mostra um exemplo do aparelho para realizar o método da presente invenção. Isto é, o aparelho na Figura 2 compreende, como constituintes:

um tanque de hidrólise (1) que tem: uma tubulação de alimentação de enzima recuperada (4) que pode alimentar de forma independente a enzima recuperada ao tanque de hidrólise e pode, adicionalmente, controlar a alimentação conforme requerido; e uma tubulação de alimentação de enzima fresca (6) que pode alimentar de forma independente a enzima fresca para o tanque de hidrólise e pode, adicionalmente, controlar a alimentação conforme requerido; que são conectadas de forma independente ao tanque de hidrólise 1;

um dispositivo de filtração por prensa (9) para a separação sólidolíquido do hidrolisado;

um tanque de retenção de líquido de açúcar (12) tendo uma tubulação de fornecimento de água (11) para lavar uma membrana de ultrafiltração e/ou para a remover enzima recuperada retida dentro de uma tubulação de circulação (15); e um dispositivo de membrana de ultrafiltração (14) para separar enzima e o líquido de açúcar.

[063] Ademais, para o tanque de hidrólise (1), um termostato (2) para manter a temperatura durante a hidrólise; uma pá misturadora (3) para a mistura de lignocelulose por agitação; e uma entrada de celulose (7) foi fornecida. A tubulação de alimentação de enzima recuperada (4) e a tubulação de alimentação de enzima fresca (6) são conectadas a um tanque de retenção de enzima recuperada (5) e um tanque de retenção de enzima fresca (8),

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26/48 respectivamente, através de válvulas. De preferência, as válvulas são controladas eletronicamente de forma separada por válvulas de precisão.

[064] O tanque de hidrólise (1) é conectado ao dispositivo de filtração por prensa (9), no qual o hidrolisado é separado, através de uma válvula e uma bomba de ar ou similares, a fim de permitir a transferência do hidrolisado para o interior do dispositivo de filtração por prensa (9). Para o dispositivo de filtração por prensa (9), um compressor (10) para o fornecimento de pressão de filtração é conectado.

[065] O líquido de açúcar obtido pela filtração por pressão é retido dentro do tanque de retenção de líquido de açúcar (12). O tanque de retenção de líquido de açúcar (12) é conectado a um dispositivo de membrana de ultrafiltração (14) através de uma bomba de circulação (13). A enzima recuperada que passou através do lado da membrana (lado de alimentação) da membrana de ultrafiltração é retornada para o tanque de retenção de líquido de açúcar (12) através de uma tubulação de circulação (15). A solução de açúcar após a remoção da enzima é coletada na lateral secundária (lateral permeável) como um filtrado. A enzima recuperada coletada dentro do tanque de retenção de líquido de açúcar (12) é enviada para o tanque de retenção de enzima recuperada (5) através de uma tubulação de enzima recuperada (16) e uma bomba. A água é fornecida ao tanque de retenção de líquido de açúcar (12) através da tubulação de fornecimento de água (11), e a água é circulada através do dispositivo de membrana de ultrafiltração (14) e da tubulação de circulação (15) com a bomba de circulação (13). Por meio disto, o componente de enzima recuperada retido sobre a superfície da membrana de ultrafiltração e dentro da tubulação de circulação (15) pode ser recuperado adicionalmente como uma solução, o que torna o processo eficaz. Ademais, o componente de celulase derivada de fungo filamentoso insolúvel em água grudado à superfície da membrana de ultrafiltração e similares pode ainda ser recuperado. Ademais,

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27/48 esta circulação de água permite lavar a superfície da membrana de ultrafiltração fornecida no dispositivo de membrana de ultrafiltração (14), e é útil para reprimir a sujeira na membrana. Por meio desta operação, a água retida dentro do tanque de retenção de líquido de açúcar (12) é enviada para o tanque de retenção de enzima recuperada (5) através da tubulação de enzima recuperada (16). Portanto, a água fornecida através da tubulação de fornecimento de água (11) é usada para hidrólise da lignocelulose dentro do tanque de hidrólise (1).

[066] A Figura 3 mostra outro exemplo do aparelho para realizar o método da presente invenção. Isto é, o aparelho mostrado na Figura 3 compreende, como constituintes:

um dispositivo de mistura de celulose/enzima recuperada (18) para misturar enzima recuperada com a celulose para realizar hidrólise primária;

um tanque de hidrólise (1) que tem uma tubulação de alimentação de mistura de celulose/enzima recuperada (17) e uma tubulação de alimentação de enzima fresca (6), que são conectadas de forma independente ao tanque de hidrólise (1);

um tanque de retenção de líquido de açúcar (12) tendo uma tubulação de fornecimento de água (11) para lavar uma membrana de ultrafiltração e/ou para remover enzima recuperada retida em uma tubulação de circulação (15); e um dispositivo de membrana de ultrafiltração (14) para separar enzima e o líquido de açúcar.

[067] Este aparelho é diferente do aparelho mostrado na Figura em termos do dispositivo de mistura de celulose/enzima recuperada (18) e da

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28/48 entrada (17) fornecida para o dispositivo. O dispositivo de mistura de celulose/enzima recuperada (18) é um dispositivo para misturar celulose com enzima recuperada, e a enzima recuperada é misturada à celulose usando um parafuso interno. No dispositivo de mistura de celulose/enzima recuperada (18), a hidrólise primária de Etapa (1) é executada. O dispositivo de mistura de celulose/enzima recuperada (18) pode ser mantido a uma temperatura adequada para a hidrólise primária. Ademais, a enzima recuperada pode ser incubada de forma preliminar, seguida da mistura com a celulose dentro do dispositivo de mistura de celulose/enzima recuperada (18) para realizar hidrólise primária. Por meio da mistura preliminar da enzima recuperada com a celulose dentro do dispositivo de mistura de celulose/enzima recuperada (18), o custo de energia requerido para misturar a mistura dentro do tanque de hidrólise (1) pode ser reduzido. Ademais, por meio da mistura preliminar, a enzima recuperada com celulose dentro do dispositivo de mistura de celulose/enzima recuperada (18), o tempo exigido para dispersar de forma igual a celulose dentro do tanque de hidrólise (1) pode ser diminuído, o que resulta na diminuição da quantidade de tempo exigido para a hidrólise. O hidrolisado primário obtido dentro do dispositivo de mistura de celulose/enzima recuperada (18) é alimentado ao dispositivo de hidrólise (1) através da tubulação de fornecimento de mistura de celulose/enzima recuperada (17). Desde então, a enzima fresca que contém a celulase derivada de fungo filamentoso de Etapa (2) é adicionada a partir da tubulação de alimentação de enzima fresca (6) para realizar hidrólise secundária. A separação sólido-líquido subsequente e a operação de recuperar a enzima são as mesmas do aparelho mostrado na Figura 2.

[068] A Figura 4 mostra outro exemplo do aparelho para realizar o método da presente invenção. O aparelho mostrado na Figura 4 corresponde ao caso em que um dispositivo de separação sólido-líquido (19) compreende

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29/48 uma prensa de filtro empregada ao aparelho mostrado na Figura 2 descrito acima. O tanque de retenção de enzima recuperada (5), o tanque de retenção de enzima fresca (8) e a pá misturadora (3) descritos na Figura 2 não são mostrados na Figura 4 já que os mesmos podem ser fornecidos conforme a necessidade. Os sólidos separados pelo dispositivo de separação sólido-líquido (19) são removidos através de uma tubulação de descarga de sólido (20). O dispositivo de separação sólido-líquido (19) pode ser um filtro por prensa mostrado na Figura 2 e Figura 3 acima, e os exemplos de outros dispositivos de separação sólido-líquido incluem uma centrífuga contínua, decantador, centrífuga DeLaval, balancim, filtro de correia e filtro de tambor. Em termos de características básicas do aparelho, o tanque de hidrólise tem uma tubulação de alimentação de enzima recuperada (4) e uma tubulação de alimentação de enzima fresca (6) que são conectadas de forma independente a esse e portanto permitem o controle independente de adição de enzima recuperada e adição de enzima fresca, e o tanque de retenção de líquido de açúcar (12) tem uma tubulação de fornecimento de água (11) conectada ao mesmo de forma que a água fornecida a partir da tubulação de fornecimento de água (11) pode ser circulada no interior do dispositivo de membrana de ultrafiltração (14) e pode ainda ser fornecida através de uma tubulação de enzima recuperada (16) no interior do tanque de hidrólise (1). Estas características são as mesmas dos aparelhos mostrados na Figura 2 e Figura 3.

[069] A Figura 5 mostra outro exemplo do aparelho para realizar o método da presente invenção. O aparelho mostrado na Figura 5 é basicamente o mesmo do aparelho descrito acima na Figura 4, mas a lateral não permeável por líquido da membrana de ultrafiltração (14) é conectada ao tanque de retenção de enzima recuperada (5). Este aparelho usa particularmente, como a membrana de ultrafiltração, elementos espirais que são conectados de forma linear ou em um formato de árvore. Neste aparelho,

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30/48 similarmente aos aparelhos mostrados nas Figuras 2 a 4, uma tubulação de fornecimento de água (11) é conectada a um tanque de retenção de líquido de açúcar (12). A água fornecida através da tubulação de fornecimento de água (11) pode ser circulada no interior do dispositivo de membrana de ultrafiltração (14) por meio de mudança da tubulação usando uma válvula de três vias (21), e que adicionalmente mudando usando válvula de três vias (21) permite que a água seja fornecida para o interior do tanque de retenção de enzima recuperada (5). Ademais, uma tubulação de enzima recuperada (16) é conectada ao tanque de retenção de enzima recuperada (5), e, através desta tubulação, a água pode ser fornecida para o interior do tanque de hidrólise (1). Similarmente aos aparelhos mostrados nas Figuras 2 a 4, uma tubulação de alimentação de enzima recuperada (4) e uma tubulação de alimentação de enzima fresca 6 são conectadas de forma independente ao tanque de hidrólise, permitindo o controle independente de adição da enzima recuperada e adição da enzima fresca.

[070] A Figura 6 mostra outro exemplo do aparelho para realizar o método da presente invenção. No aparelho mostrado na Figura 6, um dispositivo de membrana de microfiltração (22) é disposto à jusante (downstream) de um dispositivo de separação sólido-líquido (19). No caso em que os sólidos não podem ser removidos de forma suficiente no dispositivo de separação sólido-líquido (19), o processamento adicional com o dispositivo de membrana de microfiltração (22) permite produzir um líquido que é quase completamente livre de sólidos. Por meio disto, a sujeira da membrana do dispositivo de membrana de ultrafiltração 14 pode ser reduzida em uma etapa seguinte.

[071] A Figura 7 é um desenho detalhado do dispositivo de membrana de microfiltração (22) mostrado na Figura 6, e mostra uma constituição do dispositivo para realizar filtração de fluxo cruzado. Neste

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31/48 dispositivo, o filtrado separado pelo dispositivo de separação sólido-líquido (19) é retido em um tanque de retenção de filtrado de separação sólido-líquido (23), e a filtração de fluxo cruzado é executada em uma membrana de microfiltração (25) conectada através de uma bomba (24). A membrana de microfiltração (25) pode estar tanto sob a forma de uma membrana plana ou membrana de fibra oca. A membrana de fibra oca pode ser tanto do uma membrana do tipo pressão interna quanto uma membrana do tipo pressão externa.

[072] A Figura 8 é um desenho detalhado do dispositivo de membrana de microfiltração (22) mostrado na Figura 6, e mostra uma constituição do dispositivo para realizar uma filtração final dentro do dispositivo de membrana de microfiltração (22). O filtrado separado pelo dispositivo de separação sólido-líquido (19) é retido em um tanque de retenção de filtrado de separação sólido-líquido (23), e filtrado através de uma membrana de microfiltração (25). Em casos de filtração final, um dispositivo de fornecimento de ar comprimido 26 para realizar lavagem com bolhas de ar da superfície de membrana pode ser fornecido, e uma bomba de lavagem reversa (27) para a lavagem reversa pode ser disposta. A lavagem reversa pode ser executada tanto com o filtrado recuperado dentro do tanque de retenção de líquido de açúcar (12) quanto com líquido de lavagem de membrana comum ou agente líquido. A membrana de microfiltração (25) pode estar tanto sob a forma de uma membrana plana quanto de uma membrana de fibra oca. A membrana de fibra oca pode ser tanto uma membrana do tipo pressão interna quanto uma membrana do tipo pressão externa.

[073] A Figura 9 mostra outro exemplo do aparelho para realizar o método da presente invenção. O aparelho da presente invenção para produzir um líquido de açúcar pode ter adicionalmente uma membrana de osmose reversa e/ou membrana de nanofiltração para concentrar o líquido de açúcar. A Figura 9 mostra um aparelho que corresponde ao aparelho mostrado

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32/48 na Figura 4 ao qual um dispositivo de membrana de nanofiltração ou membrana de osmose reversa (30) é adicionalmente conectado. À lateral do filtrado do dispositivo de membrana de ultrafiltração (14), um tanque de concentração de líquido de açúcar (28) é conectado adicionalmente, e a filtração é executada com uma membrana de osmose reversa e/ou membrana de nanofiltração (30) através de uma bomba de alta pressão (29). O líquido de açúcar é bloqueado pela membrana de osmose reversa e/ou membrana de nanofiltração e portanto concentrado no tanque de concentração de líquido de açúcar (28). Por outro lado, a água em excesso pode ser removida como filtrado. O dispositivo de membrana de osmose reversa e/ou membrana de nanofiltração (30) pode ser disposto por ser conectado à lateral do filtrado do dispositivo de membrana de ultrafiltração (14) em qualquer um dos aparelhos mostrados nas Figuras 2 a 6.

[074] A Figura 10 mostra outro exemplo do aparelho para realizar o método da presente invenção. A tubulação de alimentação de enzima recuperada (4) e a tubulação de alimentação de enzima fresca (6) são, de preferência, conectadas de forma independente ao tanque de hidrólise (1), mas a tubulação (4) e a tubulação (6) podem ser unidas uma à outra em uma válvula de três vias (31) ou similares para formar uma tubulação única (tubulação de alimentação de enzima fresca ou tubulação de alimentação de enzima recuperada) conectada ao tanque de hidrólise (1), contanto que a alimentação de cada um dos componentes de enzima possa ser controlada pelo mesmo.

[075] A água fornecida a partir da tubulação de fornecimento de água (11) pode ser água aquecida. A temperatura da água aquecida é, de preferência, menor que 60°C a fim de evitar a inatividade da enzima. Por meio do fornecimento de água aquecida a partir da tubulação de fornecimento de água, e permitindo que a água aquecida circule no interior do dispositivo de

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33/48 membrana de ultrafiltração (14), a efeito de lavagem alta podem ser obtidos para a membrana de ultrafiltração. Para um efeito de lavagem mais alto, a temperatura da água aquecida é, de preferência, 30°C a 60°C.

Exemplos [076] A presente invenção é descrita abaixo mais especificamente a título de Exemplos. Entretanto, a presente invenção não é restrita a estes Exemplos.

(Exemplo de referência 1) Preparação de Celulase (Composição de enzima de Celulase derivada de Trichoderma) [077] Uma composição de enzima derivada de um líquido de cultura de Trichoderma foi preparada pelo método a seguir.

Pré-cultivo [078] A mistura de 5% de água de maceração do milho (peso/volume), 2% de glicose (peso/volume), 0,37% de tartarato de amônia (peso/volume), 0,14% (peso/volume) de sulfato de amônia, 0,2% (peso/volume) de fosfato dihidrogênio de potássio, 0,03% (peso/volume) de dihidrato cloreto de cálcio, 0,03% (peso/volume) de heptahidrato de sulfato de magnésio, 0,02% (peso/volume) de cloreto de zinco, 0,01% (peso/volume) de hexahidrato de cloreto de (III) ferro, 0,004% (peso/volume) de pentahidrato de sulfato de (II) cobre, 0,0008% (peso/volume) de tetrahidrato de cloreto manganês, 0,0006% (peso/volume) de ácido bórico e 0,0026% (peso/volume) de tetrahidrato heptamolibdato hexaamônia em água destilado foi preparada, e 100 ml desta mistura foi disposta em um frasco de Erlenmeyer de 500ml defletor, seguido de esterilização POR Autoclave a 121°C por 15 minutos. Após permitir que a mistura resfrie, PE-M e Tween 80, cada um esterilizado por Autoclave a 121°C por 15 minutos de forma separada a partir da mistura, foram adicionados ao mesmo 0,01% (peso/volume) cada. A este meio de pré-cultivo, Trichoderma reesei ATCC68589 foi inoculado a 1*10⁵ células/mL, e as células foram

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34/48 cultivadas a 28°C por 72 horas com agitação a 180 rpm, a fim de realizar o précultivo (agitador: BIO-SHAKER BR-40LF, produzido por TAITEC CORPORATION).

Cultivo principal [079] A mistura de 5% de água de maceração do milho (peso/volume), 2% de glicose (peso/volume), 10% de (peso/volume) celulose (Avicel), 0,37% de tartarato de amônia (peso/volume), 0,14% (peso/volume) de sulfato de amônia, 0,2% (peso/volume) de fosfato dihidrogênio de potássio, 0,03% (peso/volume) de dihidrato cloreto de cálcio, 0,03% (peso/volume) de heptahidrato de sulfato de magnésio, 0,02% (peso/volume) de cloreto de zinco, 0,01% (peso/volume) de hexahidrato de cloreto de (III) de ferro, 0,004% (peso/volume) de pentahidrato de sulfato de (II) de cobre, 0,0008% (peso/volume) de tetrahidrato de cloreto manganês, 0,0006% (peso/volume) de ácido bórico e 0,0026% (peso/volume) de tetrahidrato heptamolibdato hexaamônia em água destilada foi preparada, e 2,5l desta mistura foi disposto em uma jarra de agitação de 5L (produzida por ABLE, DPC-2A), seguido de esterilização por Autclave a 121°C por 15 minutos. Após permitir que a mistura resfrie, PE-M e Tween 80, cada um foi esterilizado por autoclave a 121°C por 15 minutos de forma separada a partir da mistura, e os mesmos foram adicionadas a 0,1% cada. À mistura resultante, 250 mL de pré-cultivo de Trichoderma reesei ATCC68589 preparada de forma preliminar com um meio líquido pelo método descrito acima foi inoculado. As células foram cultivadas a 28°C por 87 horas a 300 rpm em uma taxa de aeração de 1 vvm. Após a centrifugação, os sobrenadantes foram submetidos à filtração por membrana (Stericup-GV, produzida por Millipore, material: PVDF). Ao líquido de cultura preparado sob as condições acima, β-gicosidase (Novozyme 188) foi adicionado a uma razão de peso de proteína de 1/100, e a mistura resultante foi usada como Celulase derivada de Trichoderma nos Exemplos abaixo.

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Exemplo de referência 2) Preparação de Celulase pré-tratada Preparação de Celulose pré-tratada 1 [080] Avicell (produzida por Merck), que está comercialmente disponível, foi usada como celulose pré-tratada 1 nos Exemplos abaixo, sem realizar qualquer tratamento.

Preparação de Celulose pré-tratada 2 [081] Como uma biomassa que contém celulose, foi usada palha de arroz. A biomassa que contém celulose foi ensopara em 1% de solução aquosa de ácido sulfúrico, e submetida a tratamento usando uma autoclave (produzida por Nitto Koatsu Co., Ltd.) a 150°C por 30 minutos. Depois disto, a separação sólido-líquido foi executada para separar celulose tratada por ácido sulfúrico a partir da solução aquosa de ácido sulfúrico (chamada no presente documento de “tratamento por ácido sulfúrico diluído líquido”). Subsequentemente, a celulose tratada por ácido sulfúrico foi misturada ao tratamento por ácido sulfúrico diluído líquido com agitação de forma que a concentração do teor sólido é de 10% em peso, e o pH foi ajustado a cerca de 5 com hidróxido de sódio. A mistura resultante foi usada nos Exemplos abaixo como a celulose pré-tratada 2.

Preparação de Celulose pré-tratada 3 [082] Como a celulose, palha de arroz foi usada. A biomassa que contém celulose foi alimentada no interior de um reator compacto (produzido por Taiatsu Techno Corporation, TVS-N2 30 ml), e resfriado com um líquido de nitrogênio. No interior deste reator, o gás de amônia foi adicionado, e a amostra foi completamente ensopada em amônia líquida. A tampa do reator foi fechada, e o reator foi deixado em temperatura ambiente por cerca de 15 minutos. Subsequentemente, o reator foi processado em um banho de óleo a 150°C por 1 hora. Após isto, o reator foi removido do banho de óleo, e o gás de amônia foi vazado em um coifa, seguido de aspiração do interior do reator a 10

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Pa com uma bomba de aspiração, secando, dessa forma, a celulose. O componente resultante foi usado nos Exemplos abaixo como a celulose prétratada 3.

[Preparação de Celulose pré-tratada 4] [083] Como uma biomassa que contém celulose, foi usada palha de arroz. A biomassa que contém celulose foi encharcada em água, submetida a tratamento usando uma autoclave (produzida por Nitto Koatsu Co., Ltd.) a 180°C por 20 minutos com agitação. O tratamento foi executado em uma pressão de 10 MPa. Após o tratamento, a separação sólido-líquido foi executada por centrifugação (3000 G) para separar o componente de biomassa processado a partir do componente de solução (chamado no presente documento de “líquido tratado de forma hidrotérmica”). Este foi usado nos Exemplos abaixo como a celulose pré-tratada 4.

Exemplo de referência 3 - Medição de Concentração de Açúcar [084] As concentrações de glicose e xilose contidas na solução aquosa de açúcar foram medidas sob condições HPLC descritas abaixo com base em comparação com amostras padrões.

Coluna: Luna NH2 (produzida por Phenomenex, Inc.)

Fase móvel: MilliQ:acetonitrila = 25:75 (taxa de fluxo, 0,6 ml/minuto)

Solução de Reação: nenhuma

Método de Detecção: RI (índice refrativo diferencial)

Temperatura: 30°C

Exemplo de referência 4 - Medição de Atividade de Enzima de Celulase derivada de Trichoderma [085] A atividade de enzima da Celulase derivada de Trichoderma foi medida pelo procedimento a seguir.

1) Atividade de degradação de celulose cristalina

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37/48 [086] A um líquido de enzima (preparado sob condições predeterminadas), o Avicel (produzida por Merck) foi adicionado a 1g/l e tampão acetato de sódio (pH 5,0) foi adicionado a 100 mM, seguido da permissão de a mistura resultante reagir a 50°C por 24 horas. Este líquido de reação foi preparado em um tubo de 1ml, e a reação foi permitida prosseguir com a mistura por rotação sob as condições descritas acima. Portanto, o tubo foi submetido a centrifugação, e a concentração de glicose dentro do componente sobrenadante foi medida. A medição de concentração de glicose foi executada de acordo com o método descrito no Exemplo de referência 3. A concentração da glicose produzida (g/l) foi usada tal qual como o valor de atividade de atividade de degradação de Avicel.

2) Atividade de degradação de Celobiose [087] Em um líquido de enzima, a celobiose (Wako Pure

Chemical Industries, Ltd.) foi adicionada a 500 mg/l e o tampão acetato de sódio (pH 5.0) foi adicionado a 100 mm, seguido da permissão de a mistura resultante reagir a 50°C por 0,5 hora. Este líquido de reação foi preparado em um tubo de 1ml, e permitiu-se que a reação prosseguisse com a mistura por rotação sob as condições descritas acima. A partir disto, o tubo foi submetido a centrifugação, e a concentração de glicose dentro do componente sobrenadante foi medida. A medição da concentração de glicose foi executada de acordo com o método descrito no Exemplo de referência 3. A concentração da glicose produzida (g/l) foi usada tal qual como o valor de atividade de atividade de degradação de Celobiose.

3) Atividade de degradação de xilano [088] Em um líquido de enzima, o xilano (xilano de Bétula, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foi adicionado a 10 g/l e o tampão acetato de sódio (pH 5,0) foi adicionado a 100mm, seguido da permissão de a mistura resultante reagir a 50°C por 4 horas. Este líquido de reação foi preparado em

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38/48 um tubo de 1ml, e a reação foi permitida prosseguir com a mistura por rotação sob as condições descritas acima.

[089] A partir disto, o tubo foi submetido a centrifugação, e a concentração de xilose no componente sobrenadante foi medida. A medição da concentração de xilose foi executada de acordo com o método descrito no Exemplo de referência 3. A concentração da xilose produzida (g/l) foi usada tal qual como o valor de atividade de atividade de degradação de xilose.

Exemplo comparativo 1 [090] Como um Exemplo comparativo, um líquido de açúcar foi produzido a partir de celulose conforme descrito abaixo sem realizar hidrólise primária ou hidrólise secundária.

Etapa 1: Hidrólise [091] Para cada uma das celuloses pré-tratadas 1 a 4 (1 g cada), 0,2 ml (quantidade de proteína, 10mg) de enzima fresca descrita no Exemplo de referência 1 (concentração de proteína, 50 mg/ml) foi adicionada, e a solução de enzima recuperada pelo procedimento que é descrito por último na Etapa2 foi adicionada adicionalmente. A água destilada foi adicionalmente adicionada de forma que o peso da solução resultante se tornou 10 g. a composição foi transferida para um reator de braço lateral (φ30 NS14/23, produzido por Tokyo Rikakikai Co., Ltd.), seguido por realizar hidrólise a 50°C por 19 horas com incubação e agitação (agitador mecânico compacto CPS1000, produzido por Tokyo Rikakikai Co., Ltd., adaptador de conversão, entrada de alimentação com um torneira de três vias, incubador MG-2200).

Etapa 2: Separação Sólido-líquido e Recuperação de Enzima (Enzima recuperada) a partir do líquido de açúcar [092] O hidrolisado em Etapa 1 foi submetido a separação sólido-líquido por centrifugação (4500 G, 10 minutos), e separado em um líquido de açúcar e resíduo. As concentrações de glicose e xilose dentro do

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39/48 líquido de açúcar foi medida pelo método descrito no Exemplo de referência 3, e calculada como açúcares produzidos.

[093] O líquido de açúcar foi submetido adicionalmente à filtração por membrana (Steriflip-GP, produzida por Millipore, material: PES). O sobrenadante obtido foi aplicado a uma membrana de ultrafiltração que tem um corte de peso molecular de 10000 (VIVASPIN 20, produzida por Sartorius stedim biotech, material: PES) e centrifugado a 4500 G até que a fração da membrana fosse reduzida a 1ml. À fração de membrana, 10ml de água destilada foram adicionados, e a mistura resultante foi novamente centrifugada a 4500 G até que a fração de membrana fosse reduzida a 1ml. A partir disto, a enzima foi recuperada a partir da fração de membrana para o fornecimento de uma enzima recuperada. A enzima recuperada foi reutilizada para a hidrólise na Etapa 1 conforme descrito acima.

[094] No Exemplo comparativo presente, Etapa 1 e Etapa 2 foram executadas na rotação para recuperar e reutilizar celulase. O ciclo constituído pela Etapa 1 e Etapa 2 foi preparado um total de 6 vezes, a fim de realizar a recuperação e reutilização. A reação de número 0, em que a recuperação e reutilização não foram executadas, foi executada pelo procedimento a seguir.

Etapa 0: Hidrólise de número 0 [095] A cada uma das celuloses pré-tratadas 1 a 4 (1 g cada), 0,3 ml (quantidade de proteína, 15 mg) de enzima fresca (concentração de proteína, 50 mg/ml) foi adicionada (a enzima recuperada não foi adicionada já que esta foi a hidrólise de número 0). A água destilada foi adicionalmente adicionada de forma que o peso da solução resultante se tornou 10 g. a composição foi transferida para um reator de braço lateral (φ30 NS14/23, produzido por Tokyo Rikakikai Co., Ltd.), seguido por realizar hidrólise a 50°C por 19 horas com incubação e agitação (agitador mecânico compacto CPS

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1000, produzido por Tokyo Rikakikai Co., Ltd., adaptador de conversão, entrada de alimentação com uma torneira de três vias, incubador MG-2200). Por meio da separação do hidrolisado obtido pelo método descrito na Etapa 2 acima, uma enzima recuperada foi obtida. As concentrações de glicose e xilose no líquido de açúcar foram medidas desta vez.

[096] A Tabela 1 resume as concentrações (Glc, g/l) de glicose e concentrações (Xil, g/l) de xilose dentro dos líquidos de açúcar obtidos por meio da reação em que a Etapa 0 e 2 foram executadas uma vez e as Etapas 1 e 2 foram executadas em ordem um total de 6 vezes. Conforme o número de vezes de recuperação e reutilização aumenta, a glicose (Glc) e xilose (Xil) diminuíram. Ademais, revelou-se que a eficácia de produção de açúcar diminui gradualmente conforme o número de vezes de reutilização (N) aumenta.

ÍTabela 11

	hidrólise número 0	primeira hidrólise	segunda hidrólise	terceira hidrólise	quarta hidrólise	quinta hidrólise	sexta hidrólise
Celulose prétratada 1	Glc	42	39	37	35	31	30	27
Xil	1	0,8	0,7	0,6	0,4	0,4	0,3
Celulose prétratada 2	Glc	32	30	28	27	25	23	20
Xil	7	4	3	2	0,9	0,6	0,3
Celulose prétratada 3	Glc	40	35	31	28	25	24	22
Xil	12	10	9	7	6	4	4
Celulose prétratada 4	Glc	25	23	22	20	18	18	15
Xil	4	2	2	1	0,4	0,2	0,1

(Exemplo 1) [097] Conforme um Exemplo, a celulose foi submetida à hidrólise primária e à hidrólise secundária conforme descrito abaixo, a fim de produzir um líquido de açúcar.

IEtapa 1: Hidrólise primária'!

[098] A cada uma das celuloses pré-tratadas 1 a 4 (1g cada), a água destilada foi adicionada, e uma enzima recuperada que foi recuperada pelo procedimento da Etapa 3 mencionado por último foi adicionada, seguido de adição adicional de água destilada de forma que o peso total se tornou 10 g.

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41/48 a composição foi transferida para um reator de braço lateral (φ30 NS14/23, produzido por Tokyo Rikakikai Co., Ltd.), seguido por realizar hidrólise a 50°C por 1 hora se incubação e agitação (agitador mecânico compacto CPS-1000, produzido por Tokyo Rikakikai Co., Ltd., adaptador de conversão, entrada de alimentação com uma torneira de três vias, incubador MG-2200).

Etapa 2: Hidrólise secundária [099] Ao hidrolisado primário em Etapa 1, 0,2ml (quantidade de proteína, 10 mg) da enzima fresca descrita no Exemplo de referência 1 (concentração de proteína, 50mg/ml) foi adicionada, e permitiu-se que a reação prosseguisse a 50°C por 18 horas.

Etapa 3: Separação Sólido-líquido e Recuperação de Enzima (Enzima recuperada) a partir do líquido de açúcar [0100] O hidrolisado secundário em Etapa 3 foi submetido a separação sólido-líquido por centrifugação (4500 G, 10 minutos), e separado em um líquido de açúcar e resíduo. As concentrações de glicose e xilose dentro do líquido de açúcar foram medidas pelo método descrito no Exemplo de referência 3, e calculados como os açúcares produzidos de número N. o líquido de açúcar foi adicionalmente submetido à filtração por membrana (Steriflip-GP, produzido por Millipore, material: PES), e o sobrenadante obtido foi aplicado a uma membrana de ultrafiltração que tem um corte de peso molecular de 10000 (VIVASPIN 20, produzida por Sartorius stedim biotech, material: PES) e centrifugado a 4500 G até que a fração de membrana foi reduzida a 1ml. À fração de membrana, 10 ml de água destilada foram adicionados, e a mistura resultante foi novamente centrifugada a 4500 G até que a fração de membrana foi reduzida a 1ml. A partir disto, a enzima foi recuperada a partir da fração de membrana para o fornecimento de uma enzima recuperada. A enzima recuperada foi reutilizada para a hidrólise na Etapa 1 conforme descrito acima.

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42/48 [0101] No Exemplo presente, Etapa 1 à Etapa 3 foram executadas em rotação para recuperar e reutilizar celulase. O ciclo constituído pelas Etapas 1 a 3 foram repetidos um total de 6 vezes, a fim de realizar a recuperação e reutilização. A reação de número 0, em que a recuperação e reutilização não foram executadas, foi executada pelo procedimento a seguir.

Etapa 0: Hidrólise Número 0 [0102] À cada uma das celuloses pré-tratadas 1 a 4 (1g cada), 0,3 ml (quantidade de proteína, 15 mg) de enzima fresca (concentração de proteína, 50 mg/ml) foi adicionada (a enzima recuperada não foi adicionada já que está é a hidrólise número 0). A água destilada foi adicionalmente adicionada de forma que o peso da solução resultante se tornou 10g. a composição foi transferida para um reator de braço lateral (φ30 NS14/23, produzido por Tokyo Rikakikai Co., Ltd.), seguido por realizar hidrólise a 50°C por 19 horas com incubação e agitação (agitador mecânico compacto CPS-1000, produzido por Tokyo Rikakikai Co., Ltd., adaptador de conversão, entrada de alimentação com uma torneira de três vias, incubador MG-2200). Pela separação do hidrolisado obtido pelo método descrito na Etapa 3 acima, uma enzima recuperada foi obtida. As concentrações de glicose e xilose no líquido de açúcar foram medidas desta vez.

[0103] A Tabela 2 resume as concentrações de glicose (Glc) (g/l) e concentrações de xilose (Xil) (g/l) nos líquidos de açúcar obtidos pelas reações em que a Etapa 0 e 3 foram executadas uma vez e as Etapas 1 a 3 foram executadas em ordem um total de 6 vezes. Conforme o número de vezes da recuperação e reutilização aumentou, a glicose (Glc) e xilose (Xil) diminuíram. Entretanto, pode-se confirmar que a quantidade de produção de açúcar aumentou de forma gradual pelo contraste aos casos no Exemplo de referência 1 (Tabela 1).

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Tabela 2

	hidrólise número 0	primeira hidrólise	segunda hidrólise	terceira hidrólise	quarta hidrólise	quinta hidrólise	sexta hidrólise
Concentração de açúcar (g/l) na celulose pré-tratada 1	Glc	42	42	43	45	47	48	49
Xil	1	1	1	1	1,1	1,1	1,2
Concentração de açúcar (g/l) na celulose pré-tratada 2	Glc	32	32	33	33	34	36	39
Xil	7	6	6	7	8	9	10
Concentração de açúcar (g/l) na celulose pré-tratada 3	Glc	32	30	33	34	35	38	40
Xil	7	6	6	7	8	10	11
Concentração de açúcar (g/l) na celulose pré-tratada 4	Glc	25	24	24	25	25	26	26
Xil	4	3	3	3	3	5	5

[0104] No Exemplo presente, a hidrólise primária com a enzima recuperada foi executada por 1 hora, e a hidrólise secundária após a adição de enzima fresca ter sido executada por 18 horas, por meio da qual a reação de hidrólise foi executada por 19 horas como um Exemplo comparativo 1. Ademais, a quantidade de adição de enzima fresca foi a mesma no Exemplo comparativo 1. Portanto, no presente Exemplo, mostrou-se que, por realizar em rotação as etapas de: 1. Adicionar enzima recuperada a celulose pré-tratada para realizar hidrólise primária; 2. Adicionar enzima fresca ao hidrolisado para realizar hidrólise secundária; e 3. Submeter o hidrolisado a separação sólido-líquido para obter enzima recuperada a partir do líquido de açúcar obtido; a concentração de açúcar obtido pela recuperação e reutilização, isto é, a eficácia da produção de açúcar, pode ser maior que a do Exemplo comparativo.

(Exemplo 2) Medição de Quantidade de Adição de Enzima Recuperada na Hidrólise Primária [0105] A concentração de proteína da enzima recuperada a ser adicionada para a hidrólise primária no Exemplo 1 foi analisada com o kit de medição BCA (Kit de reagente de análise de proteína BCA, produzido por PIERCE), usando albumina bovina (2 mg/mL) como uma amostra padrão, por medição da absorção a 562 nm para realizar colorimetria. A Tabela 3 resume, em termos de

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44/48 recuperação/reutilização da enzima para a celulose pré-tratada 2, a relação entre a quantidade de enzima recuperada obtida pela recuperação de número N e a quantidade de adição de enzima fresca. Levando em consideração a quantidade de produção de glicose resumida na Tabela 2 no Exemplo 1, pode-se confirmar pelo Exemplo presente que a quantidade de produção de glicose pode ser aumentada adicionalmente se a relação: a quantidade de adição de enzima na hidrólise primária é maior que a quantidade de adição de enzima na hidrólise secundária; e ademais, a relação: a quantidade de enzima recuperada reutilizada para a hidrólise primária é maior que a quantidade de enzima fresca adicionada à hidrólise secundária; são satisfeitas, nos casos de recuperação/reutilização de número 4 e última.

Tabela 3

	hidrólise número 0	primeira hidrólise	segunda hidrólise	terceira hidrólise	quarta hidrólise	quinta hidrólise	sexta hidrólise
Quantidade de proteína na enzima recuperada (mg⁾	-	7	8,4	9,3	11	12	14
Quantidade de proteína na enzima fresca (mg)	15	10	10	10	10	10	10
Concentração de glicose na celulose prétratada 2 (g/l)	32	32	33	33	34	36	39

(Exemplo 3) Atividade de enzima da Enzima recuperada [0106] A atividade da enzima recuperada foi medida para casos de celulose pré-tratada 3 (Exemplo comparativo 1: o caso em que a enzima recuperada foi alimentada ao mesmo tempo que a enzima fresca; Exemplo 1: o caso em que a enzima recuperada foi adicionada para realizar hidrólise primária, após a qual enzima fresca foi alimentada). A atividade de enzima foi medida de acordo com o Exemplo de referência 3 para 3 tipos de atividade de degradação, isto é, 1) atividade de degradação de celulose cristalina, 2) atividade de degradação de celobiose, e 3) atividade de degradação de xilano. Cada atividade de degradação

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45/48 foi expressa como um valor relativo (%) da atividade de enzima na enzima recuperada, levando em consideração a atividade de enzima da enzima fresca (10 mg) como 100(%). As atividades da enzima recuperadas após a segunda recuperação e a quarta recuperação são mostradas na Tabela 4 (Exemplo 1) e Tabela 5 (Exemplo comparativo 1).

Tabela 4

	Enzima fresca (10 mg)	Enzima recuperada
segunda hidrólise	quarta hidrólise
Atividade de degradação de celulose cristalina	100	84	110
Atividade de degradação de Celobiose	100	94	114
Atividade de degradação de xilano	100	154	250

Tabela 5

	Enzima fresca (10 mg)	Enzima recuperada
segunda hidrólise	quarta hidrólise
Atividade de degradação de celulose cristalina	100	74	80
Atividade de degradação de Celobiose	100	80	84
Atividade de degradação de xilano	100	114	106

[0107] Revelou-se que, conforme o número de vezes de hidrólise primária aumenta, toda a atividade de degradação por celulose cristalina, atividade de degradação de Celobiose e atividade de degradação de xilano tendem a aumentar, e tal tendência é especificamente excelente na atividade de degradação de xilano. Desde que a xilanase e xilosidase derivadas de Trichoderma estão envolvidas na atividade de degradação de xilano, é pensado que a eficácia da recuperação destas enzimas tem aumentado conforme o número de vezes da hidrólise primária aumenta.

(Exemplo 4) Componente de Celulase derivada de Trichoderma Agregado Contido na Enzima Recuperada [0108] Revelou-se que, na quarta e última recuperação, um componente insolúvel em água é produzido no componente de enzima

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46/48 recuperada que é recuperado como um líquido não permeável da membrana de ultrafiltração. Este componente de celulase derivado de trichoderma insolúvel em água foi analisado pelo procedimento a seguir.

[0109] Com o uso da celulose pré-tratada 3, a hidrólise primária e a hidrólise secundária foram executadas pelo procedimento no Exemplo 1, e o componente de enzima recuperada obtido pela quarta recuperação foi analisado. A enzima recuperada (100 pL) foi disposta em um tubo centrífugo de 1,5ml, e o mesmo foi centrifugado a 15000 rpm por 5 minutos. A partir disto, o sobrenadante foi removido para obter um comprimido no fundo do tubo. O comprimido foi lavado por adição de 100 pL de água pura, e uma preparação de tampão de amostra (EZ Apply, ATTO Corporation) foi alimentada para o tubo, seguido por execução SDS-PAGE (e-PAGEL; gel concentração, 15%; ATTO Corporation). A coloração foi executada com azul brilhante Coomassie (tinta coomassie biologicamente seguro, Bio-Rad Laboratories). Para a medição do peso molecular, um marcador de peso molecular (PrecisionPlus Protein Standard, Kaleidoscope, Bio-Rad Laboratories) foi usado.

[0110] O resultado obtido da análise por SDS-PAGE é mostrado na Figura 11. Já que o componente tem um peso molecular de cerca de 50 a 60 kDa, revelou-se que a celobiohidrolase derivada de Trichoderma estava contida em um componente principal (Figura 11).

(Exemplo 5) Efeito do Componente de Celulase Derivado de trichoderma INSOLÚVEL EM ÁGUA COMO COMPONENTE DE ENZIMA RECUPERADA [0111] A enzima foi recuperada a partir da fração de membrana na Etapa 3 do Exemplo 1 (celulose pré-tratada 3) para obter uma enzima recuperada, que foi então centrifugada a 15000 rpm por 5 minutos. Apenas os sobrenadantes obtidos foram reutilizados como a enzima recuperada, e o rendimento de açúcar observado como resultado foi comparado aos resultados no Exemplo 1. Isto é, o Exemplo 5 descreve a

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47/48 reutilização da enzima recuperada a partir da qual o componente de celulase derivado de trichoderma insolúvel em água foi removido.

Tabela 6

	hidrólise número 0	primeira hidrólise	segunda hidrólise	terceira hidrólise	quarta hidrólise	quinta hidrólise	sexta hidrólise
Celulose prétratada 3 (Exemplo 1)	Glc	32	30	33	34	35	38	40
Xil	7	6	6	7	8	10	11
Celulose prétratada 3	Glc	32	32	32	31	31	30	30
Xil	7	6	6	7	6	6	6

[0112] Isto é, revelou-se que, em casos onde o componente de celulase derivado de trichoderma insolúvel em água contido como uma enzima recuperada não é removido, uma taxa de produção de açúcar mais alta pode ser obtida na próxima reutilização da enzima.

Aplicabilidade Industrial [0113] Por meio da presente invenção, um líquido de açúcar pode ser produzido de forma eficaz a partir da celulose, e a celulose obtida pode ser usada como um material de açúcar para vários produtos de fermentação.

Descrição DOS SÍMBOLOS

Tanque de hidrólise

Termostato

Pá misturadora

Tubulação de alimentação de enzima recuperada

Tanque de retenção de enzima recuperada

Tubulação de alimentação de enzima fresca

Entrada de celulose

Tanque de retenção de enzima fresca

Dispositivo de filtração por prensa

Compressor

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48/48

Tubulação de fornecimento de água

Tanque de retenção de líquido de açúcar

Bomba de circulação

Dispositivo de membrana de ultrafiltração

T ubulação de circulação

Tubulação de enzima recuperada

Tubulação de fornecimento de mistura de celulose/enzima recuperada

Dispositivo de mistura de celulose/enzima recuperada

Dispositivo de separação sólido-líquido

Tubulação de descarga de sólido

Válvula de três vias

Dispositivo de membrana de microfiltração

Tanque de filtrado de separação sólido-líquido

Bomba

Membrana de microfiltração

Dispositivo de fornecimento de ar comprimido

Bomba de lavagem reversa

Tanque de concentração de líquido de açúcar

Bomba de alta pressão

Dispositivo de membrana de osmose reversa e/ou membrana de nanofiltração

Válvula de três vias

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Claims

Reivindicações

1. MÉTODO PARA PRODUZIR UM LÍQUIDO DE AÇÚCAR, caracterizado por ser por meio da repetição de um processo para produzir líquido de açúcar que consiste das etapas (1) a (3) abaixo:

(1) adicionar celulose a uma celulase de fungo filamentoso para realizar hidrólise primária;
(2) adicionar uma celulase de fungo filamentoso fresca ao hidrolisado formado na etapa (1) para realizar hidrólise secundária; e (3) submeter o hidrolisado formado na etapa (2) a separação sólido-líquido para obter um líquido de açúcar, e recuperar enzima a partir do líquido de açúcar;

em que as hidrólises primária e secundária são realizadas em duas etapas separadas, e em que dita enzima recuperada obtida na etapa (3) é usada para etapa (1) dos próximos e seguintes processos para produzir líquido de açúcar;

em que dita celulose é pré-tratada por tratamento alcalino, tratamento hidrotérmico ou tratamento por ácido sulfúrico diluído.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de concentrar o líquido de açúcar utilizando uma membrana de osmose reversa e/ou nanofiltração.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 2, caracterizado por, como dita celulase de fungo filamentoso na etapa (1) do processo para produzir líquido de açúcar, ser usado um componente de enzima recuperada a partir de um hidrolisado de celulose produzido por uma celulase de fungo filamentoso.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 3, caracterizado pela dita celulase de fungo filamentoso na etapa (1) ou (2) compreender um componente derivado de um líquido de cultura de um

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2/2 microorganismo que pertence ao gênero Trichoderma.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 4, caracterizado pela dita enzima recuperada compreender xilanase e/ou xilosidase.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 5, caracterizado pela dita enzima recuperada compreender uma celulase de fungo filamentoso insolúvel em água.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 6, caracterizado pelas quantidades de enzima adicionadas em dita hidrólise primária e dita hidrólise secundária satisfazerem a relação a seguir: a quantidade de dita enzima recuperada adicionada na Etapa (1) é maior que a quantidade de dita enzima fresca adicionada na Etapa (2).

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 7, caracterizado pela recuperação de dita celulase de fungo filamentoso na Etapa (3) ser executada por meio da filtração do dito líquido de açúcar através de uma membrana de ultrafiltração e recuperação da dita celulase a partir do lado de alimentação.