BR112017005071B1

BR112017005071B1 - Método de produção de líquido de açúcar

Info

Publication number: BR112017005071B1
Application number: BR112017005071-4A
Authority: BR
Inventors: Shigeyuki Funada; Hiroyuki Kurihara; Katsushige Yamada
Original assignee: Toray Industries, Inc
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2015-09-18
Publication date: 2023-01-10
Also published as: JP6565684B2; JPWO2016047589A1; CN106715704B; PH12017500524A1; BR112017005071A2; AU2015322688A1; US9920346B2; PH12017500524B1; CA2962035A1; CN106715704A; CA2962035C; WO2016047589A1; MY179402A; AU2015322688B2; US20170306372A1

Abstract

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE AÇÚCAR LÍQUIDO. O método de preparação de solução de açúcar de acordo com a presente invenção é um método de preparação de solução de açúcar a partir de biomassa que contém celulose, em que o método inclui a etapa 1: etapa de obtenção de hidrolisato de endoxilanase por meio de hidrólise da biomassa que contém celulose utilizando endoxilanase derivada de micro-organismos do gênero Acremonium ou do gênero Aspergillus; etapa 2: etapa de separação do hidrolisato de endoxilanase em um hidrolisato de endoxilanase sólido e um hidrolisato de endoxilanase líquido por meio de separação de sólidos e líquidos; etapa 3: etapa de obtenção de hidrolisato de celulase por meio de hidrólise do hidrolisato de endoxilanase sólido utilizando celulase derivada de fungo filamentoso; e etapa 4: etapa de filtragem do hidrolisato de celulase através de uma membrana de ultrafiltragem para recuperar uma solução de açúcar do lado filtrado e coletar um componente de enzima do lado não filtrado.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um método de produção, a partir de biomassa, de líquidos de açúcar úteis como materiais de partida de fermentação e similares.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O processo de produção por fermentação de produtos químicos utilizando açúcares como materiais de partida vem sendo utilizado para a produção de diversos materiais industriais. Atualmente, como os açúcares a serem utilizados como materiais de partida de fermentação, são utilizados industrialmente os derivados de materiais alimentícios, como cana de açúcar, amido e beterraba. Em vista do fato de que é esperado aumento dos preços de materiais alimentícios devido ao futuro aumento da população mundial ou em visão ética do fato de que esses açúcares concorrem com açúcares para alimento, entretanto, é necessário elaborar no futuro um processo de produção eficiente de líquidos de açúcar a partir de recursos não alimentícios renováveis, ou seja, biomassa que contém celulose, ou um processo de uso de um líquido de açúcar obtido como material de partida de fermentação para convertê-lo eficientemente em um material industrial.

[003] Como método de produção de líquido de açúcar a partir de biomassa que contém celulose, é conhecido um método de produção de líquido de açúcar por meio de hidrólise de biomassa que contém celulose utilizando ácido sulfúrico diluído, seguido adicionalmente por sacarificação empregando uma enzima como celulase, bem como um método de produção de líquido de açúcar por meio de hidrólise de celulose e hemicelulose com ácido, utilizando ácido sulfúrico concentrado (Documento Não de Patente 1). Também foi descrito um método de produção de líquido de açúcar por meio de hidrólise de biomassa que contém celulose com água comprimida quente a 240 até 280 °C, seguida adicionalmente por sacarificação, utilizando uma enzima de sacarificação (Documento de Patente 1). Dentre estes, nos últimos anos, vêm sendo extensamente estudados métodos de hidrólise de biomassa utilizando uma enzima de sacarificação, em que esses métodos utilizam menos energia e causam menos encargos ambientais, mas produzem açúcar em alto rendimento. Os métodos de produção de líquido de açúcar utilizando uma enzima sacarificante resultam, entretanto, em alto custo de produção de líquido de açúcar, pois o custo da enzima é alto.

[004] Como meio de solução do problema técnico mencionado acima em métodos de produção de líquido de açúcar utilizando uma enzima sacarificante, foi proposto um método de recuperação e reutilização de enzimas sacarificantes que foram utilizadas para hidrólise. Foram descritos, por exemplo, um método no qual a enzima é recuperada por meio de filtragem, por meio de uma membrana de ultrafiltragem, do líquido de açúcar obtido por meio de separação contínua de sólido e líquido por meio de um filtro de rotação (Documento de Patente 2), um método no qual a adição de tensoativo na etapa de sacarificação da enzima suprime a adsorção da enzima e aumenta a eficiência de recuperação da enzima (Documento de Patente 3) e similares. Também foram descritos um método no qual a hidrólise de biomassa utilizando a enzima recuperada antes das reações de sacarificação seguintes e posteriores pode aumentar a eficiência de recuperação da enzima nas reações de sacarificação e reduzir a quantidade de enzima utilizada (Documento de Patente 4) e outros métodos. No Documento de Patente 4, a enzima recuperada nos Exemplos é a mesma enzima derivada de fungo filamentoso utilizada para a reação de sacarificação e utiliza-se Trichoderma nos Exemplos.

[005] Documentos do Estado da Técnica:

[006] Documentos de Patente: - Documento de Patente 1: JP 3041380 B2; - Documento de Patente 2: JP 2006-87319 A; - Documento de Patente 3: JP 63-87994 A; - Documento de Patente 4: WO 2011/115040.

[007] Documentos Não de Patente: - Documento Não de Patente 1: A. Aden et al, Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Pre-Hydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover, NREL Technical Report (2002).

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[008] Conforme mencionado acima, foi desenvolvido um método de recuperação da enzima utilizada para hidrólise de biomassa que contém celulose, mas o seu efeito ainda é insuficiente em vista da redução da quantidade da enzima sacarificante utilizada e é necessário um método de produção de líquido de açúcar com uso mais eficiente da enzima de sacarificação na produção de líquido de açúcar a partir de biomassa que contém celulose.

[009] Consequentemente, um problema a ser solucionado pela presente invenção é o fornecimento de um método de produção de líquido de açúcar que possa ampliar adicionalmente o efeito de redução da quantidade de enzima sacarificante utilizada.

[010] A presente invenção engloba as realizações 1 a 8 descritas abaixo: 1. Método de produção de líquido de açúcar a partir de biomassa que contém celulose, que compreende: - Etapa 1: etapa de obtenção de hidrolisado de endoxilanase por meio de hidrólise da biomassa que contém celulose utilizando endoxilanase derivada de micro-organismos do gênero Acremonium ou do gênero Aspergillus; - Etapa 2: etapa de separação do hidrolisado de endoxilanase em um hidrolisado de endoxilanase sólido e um hidrolisado de endoxilanase líquido por meio de separação de sólidos e líquidos; - Etapa 3: etapa de obtenção de hidrolisado de celulase por meio de hidrólise do hidrolisado de endoxilanase sólido utilizando celulase derivada de fungo filamentoso; e - Etapa 4: etapa de filtragem do hidrolisado de celulase por meio de uma membrana de ultrafiltragem para recuperar um líquido de açúcar do lado do permeado e recuperar um componente de enzima do lado do não permeado. 2. Método de produção de líquido de açúcar de acordo com 1, em que a biomassa que contém celulose é previamente tratada por meio de um ou mais métodos selecionados a partir do grupo que consiste em tratamento alcalino, tratamento hidrotérmico e tratamento com ácido sulfúrico diluído. 3. Método de produção de líquido de açúcar de acordo com 1 ou 2, em que a atividade enzimática da endoxilanase é de 80 U/mg de proteína ou mais. 4. Método de produção de líquido de açúcar de acordo com qualquer um dentre um 1 a 3, em que a separação de sólidos e líquidos do hidrolisado de endoxilanase satisfaz a expressão relacional a seguir: peso de hidrolisado de endoxilanase sólido < peso de hidrolisado de endoxilanase líquido. 5. Método de produção de líquido de açúcar de acordo com qualquer dentre 1 a 4, que compreende adicionalmente uma etapa de filtragem do hidrolisado de endoxilanase líquido por meio de uma membrana de ultrafiltragem para recuperar um xilo-oligossacarídeo líquido do lado do permeado e recuperar uma endoxilanase do lado do não permeado. 6. Método de produção de líquido de açúcar de acordo com qualquer um dentre 1 a 5, em que a celulase derivada de fungo filamentoso é derivada de um ou mais micro-organismos pertencentes ao gênero Trichoderma. 7. Método de produção de líquido de açúcar de acordo com qualquer um dentre 1 a 6, em que a etapa 4 é uma etapa de filtragem, por meio de uma membrana de ultrafiltragem, do hidrolisado de celulase líquido obtido por meio de separação de líquidos e sólidos do hidrolisado de celulase, recuperação de um líquido de açúcar do lado do permeado e recuperação de um componente de enzima do lado do não permeado. 8. Método de produção de líquido de açúcar de acordo com qualquer um dentre 1 a 7, em que o componente de enzima é utilizado como celulase derivada de fungo filamentoso na Etapa 3.

[011] Segundo a presente invenção, é obtido um hidrolisado de endoxilanase sólido por meio de separação de sólidos e líquidos do hidrolisado de endoxilanase obtido por meio de hidrólise de biomassa que contém celulose com endoxilanase antes da reação de sacarificação da biomassa que contém celulose. A recuperação e a reutilização do não permeado obtido por meio de hidrólise desse hidrolisado de endoxilanase sólido com celulase derivada de fungo filamentoso pode ampliar adicionalmente o efeito de redução da quantidade de enzima de sacarificação utilizada em processos de produção de líquido de açúcar. Isso pode reduzir os custos de produção do líquido de açúcar.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[012] A Fig. 1 é uma vista que exibe um método de produção de líquido de açúcar de acordo com a presente invenção.

[013] A Fig. 2 é uma vista que exibe outro exemplo de método de produção de líquido de açúcar de acordo com a presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[014] É exibido um método de produção de líquido de açúcar de acordo com a presente invenção na Fig. 1. A presente invenção será descrita detalhadamente em etapas. A presente invenção não se limita ao abaixo.

[015] Etapa 1:

[016] A Etapa 1 é uma etapa de obtenção de hidrolisado de endoxilanase por meio da hidrólise de biomassa que contém celulose utilizando endoxilanase derivada de micro-organismos do gênero Acremonium ou do gênero Aspergillus.

[017] A biomassa que contém celulose utilizada na Etapa 1 refere- se a um recurso biológico que contém pelo menos celulose. Exemplos específicos de biomassa que contém celulose incluem: biomassas herbáceas tais como bagaço, sabugo de milho, switchgrass, capim Napier, Erianthus, palha de milho, palha de arroz e palha de trigo; biomassas lenhosas como árvores e resíduos de materiais de construção; polpa obtida de biomassa lenhosa; mesmo biomassas derivadas de ambientes aquáticos, como algas e gramas marinhas; ou biomassa de casca de grãos como cascas de milho, cascas de trigo, cascas de soja e cascas de arroz; em que biomassa de cascas de grãos e palha de arroz são as mais eficazes e preferencialmente utilizadas.

[018] A hidrólise de biomassa que contém celulose destina-se à redução do peso molecular de celulose ou hemicelulose, de forma a produzir monossacarídeos ou oligossacarídeos. Na hidrólise de biomassa que contém celulose com endoxilanase nesta etapa, xilano, que é um componente de hemicelulose, é hidrolisado. Na presente invenção, “endoxilanase” é uma enzima que hidrolisa hemicelulose por meio de ação sobre uma cadeia principal de xilose ligada por β-1,4 e é uma enzima classificada com o número EC: EC 3.3.1.8.

[019] Preferencialmente, biomassa que contém celulose é previamente tratada antes da hidrólise da biomassa que contém celulose com endoxilanase, a fim de aumentar a eficiência da hidrólise. Isso pode aumentar a eficiência da hidrólise de biomassa que contém celulose com celulase derivada de fungo filamentoso. Para a preparação para a Etapa 1, um material de biomassa previamente tratado que sofreu tratamento prévio antecipado pode ser adquirido e a presente invenção engloba esse aspecto.

[020] Exemplos de métodos de tratamento prévio de biomassa que contém celulose não são particularmente limitados e incluem especificamente tratamento ácido, tratamento com ácido sulfúrico, tratamento com ácido sulfúrico diluído, tratamento alcalino, tratamento com soda cáustica, tratamento com amônia, tratamento hidrotérmico, tratamento com água subcrítica, tratamento por pulverização e tratamento com vapor e, em vista da recuperação eficiente de diversas enzimas na Etapa 4 descrita abaixo, tratamento hidrotérmico, tratamento com ácido sulfúrico diluído e tratamento alcalino são preferidos na presente invenção. Em tratamento hidrotérmico, adiciona-se água a um sólido de biomassa, de tal forma que o sólido possua concentração de 0,1 a 50% em peso, seguido por tratamento sob temperatura de 100 a 400 °C por 1 a 60 minutos. Tratamento sob essas condições de temperatura causa hidrólise de celulose ou hemicelulose. Particularmente, a temperatura encontra-se preferencialmente na faixa de 100 °C a 250 °C e o tempo de tratamento é preferencialmente de 5 a 30 minutos. O número de vezes do tratamento não é particularmente limitado e esse tratamento pode ser realizado uma ou mais vezes. Particularmente, quando esse tratamento é realizado duas ou mais vezes, o primeiro tratamento e o(s) tratamento(s) subsequente(s) podem ser realizados sob diferentes condições. Tratamento com ácido sulfúrico diluído designa tratamento no qual ácido sulfúrico é adicionado em tratamento hidrotérmico. A quantidade de ácido sulfúrico a ser adicionada é preferencialmente de 0,1 a 150 mg por g em peso de biomassa que contém celulose. Tratamento alcalino designa tratamento no qual 0,1 a 150 mg de álcali por grama em peso de biomassa que contém celulose são adicionados à temperatura ambiente ou em tratamento hidrotérmico. Como álcali para uso, pode-se utilizar hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio, amônia ou similares. Após o tratamento prévio, o ácido e o álcali podem também ser removidos por meio de separação de sólidos e líquidos.

[021] Nesta etapa, endoxilanase derivada de micro-organismos do gênero Acremonium ou do gênero Aspergillus é utilizada para hidrólise. A endoxilanase pode ser uma enzima que tenha sido purificada por meio de uma coluna ou similar a partir de um líquido de cultivo que tenha sido cultivado por um certo período de tempo, de forma a produzir endoxilanase, ou pode ser obtida por meio da preparação de DNA que codifica a sequência de aminoácidos de endoxilanase, relacionando-o a um vetor de expressão, introdução do vetor de expressão em um hospedeiro, produção de proteína a partir de uma espécie diferente ou da mesma espécie e condução de isolamento e purificação. O uso de códons para codificar a sequência de aminoácidos pode ser o mesmo para Acremonium ou Aspergillus, ou pode variar de acordo com o uso de códons do hospedeiro.

[022] O gênero Acremonium inclui, mas sem limitações, Acremonium alternatum, Acremonium curvulum, Acremonium persicinum, Acremonium recifei, Acremonium strictum, Acremonium cellulolyticus e similares.

[023] O gênero Aspergillus inclui, mas sem limitações, Aspergillus aculeatus, Aspergillus clavatus, Aspergillus niger e Aspergillus oryzae.

[024] Endoxilanase do gênero Acremonium não é particularmente limitada, desde que contenha endoxilanase, e inclui uma enzima purificada na qual endoxilanase é purificada a partir de Acremonium cellulase disponível comercialmente por meio da Meiji Seika Pharma Co., Ltd. Endoxilanase do gênero Aspergillus não é particularmente limitada, desde que contenha endoxilanase, e inclui Cellulosin HC100, disponível comercialmente por meio da HBI Enzymes Inc. e similares.

[025] Para a atividade de endoxilanase, a quantidade de enzima que produz 1 μmol de xilose por minuto é definida como 1 U, utilizando xilano Birchwood como substrato. Durante a medição da atividade, utiliza-se o método de ácido dinitrossalicílico (método DNS) para medir a absorção a 540 nm, de forma a medir a quantidade de açúcar redutor contida em um líquido de reação após a reação e permitir a determinação da quantidade do açúcar redutor com relação a uma curva de calibragem que é determinada anteriormente utilizando uma xilose conhecida. As condições de medição da atividade são determinadas a partir de reação sob xilano Birchwood a 1% a 50 °C e pH 5 por dez minutos.

[026] As condições de reação para hidrólise por endoxilanase não são limitadas, desde que ela seja realizada de acordo com as condições de reação preferíveis de endoxilanase, enquanto, como atividade de endoxilanase, utiliza-se atividade mais alta de xilanase porque atividade mais baixa aumenta a quantidade de endoxilanase adicionada e prejudica a economia. Especificamente, endoxilanase de 80 U ou mais por mg em peso de enzima é preferível e endoxilanase de 80 a 100.000 U ou mais por mg em peso de enzima é de maior preferência.

[027] A quantidade de endoxilanase adicionada não é particularmente limitada e adiciona-se preferencialmente 0,05 mg ou mais de endoxilanase por mg em peso de biomassa, de maior preferência 0,1 mg ou mais. O tempo de reação de hidrólise com adição de endoxilanase não é particularmente limitado e é preferencialmente de 1 a 48 horas, de maior preferência de 4 a 24 horas. A temperatura geral de reação durante o uso de endoxilanase derivada de micro-organismos do gênero Acremonium ou do gênero Aspergillus encontra-se preferencialmente na faixa de 15 a 100 °C, de maior preferência de 40 a 60 °C e, de preferência ainda maior, de 50 °C. O valor de pH para a hidrólise encontra-se preferencialmente na faixa de pH 3 a 9, de maior preferência 4 a 5,5 e, de preferência ainda maior, pH 5. Para ajuste do pH, pode-se utilizar ácido ou álcali para ajuste a um pH desejado e pode-se utilizar tampão conforme o desejado. Além disso, para facilitar o contato entre biomassa que contém celulose e enzima de sacarificação e, para uniformizar a concentração de açúcar em hidrolisado, o hidrolisado é preferencialmente misturado com agitação e adiciona-se água, de forma que a concentração de sólidos na celulose esteja preferencialmente na faixa de 1 a 25% em peso, de maior preferência de 5 a 20% em peso.

[028] Etapa 2:

[029] A Etapa 2 é uma etapa de separação do hidrolisado de endoxilanase em um hidrolisado de endoxilanase sólido e um hidrolisado de endoxilanase líquido por meio de separação de sólidos e líquidos.

[030] O método de separação de sólidos e líquidos não é particularmente limitado e a separação de sólidos e líquidos pode ser realizada por meio de centrifugação, por exemplo, por um decantador de rosca; separação de membrana, por exemplo, por uma prensa de filtro; prensa de esteira; filtro de esteira; separação por meio de precipitação espontânea; ou filtragem, por exemplo, por meio de tela, tecido não tecido e papel-filtro.

[031] A quantidade de líquido e sólido separada por meio de separação de sólidos e líquidos não é particularmente limitada e as suas condições são preferencialmente definidas de forma a obter-se o efeito de ampliar a quantidade de um componente de enzima recuperado do lado do não permeado na Etapa 4 descrita abaixo e de tal forma que, ao realizar-se a recuperação de endoxilanase e a recuperação de xilo-oligossacarídeo mencionada abaixo, as condições operacionais de separação de sólidos e líquidos de hidrolisado de endoxilanase satisfaçam a expressão relacional a seguir: peso de hidrolisado de endoxilanase sólido < peso de hidrolisado de endoxilanase líquido.

[032] A hidrólise de xilano em biomassa que contém celulose por meio da ação de endoxilanase resulta na produção de xilo-oligossacarídeo no hidrolisado de endoxilanase líquido. Enquanto isso, a celulose não é submetida a hidrólise por endoxilanase e está principalmente presente sem degradação no hidrolisado de endoxilanase sólido.

[033] O hidrolisado de endoxilanase líquido pode ser filtrado por meio de uma membrana de ultrafiltragem. O hidrolisado de endoxilanase líquido é filtrado por meio de uma membrana de ultrafiltragem, de forma que a endoxilanase possa ser recuperada sobre o lado do não permeado da membrana de ultrafiltragem e o xilo-oligossacarídeo possa ser recuperado sobre o lado do permeado da membrana de ultrafiltragem. Neste caso, o hidrolisado de endoxilanase sólido pode ser lavado com água ou salmoura para recuperar enzimas na lavagem obtida e a lavagem pode ser misturada no hidrolisado de endoxilanase líquido. A endoxilanase recuperada sobre o lado do não permeado da membrana de ultrafiltragem pode também ser reutilizada para hidrólise de biomassa que contém celulose na Etapa 1. Como xilo-oligossacarídeo possui o efeito de acalmar distúrbios intestinais, ele é aprovado como alimento para uso específico em saúde e é um oligossacarídeo valioso.

[034] A membrana de ultrafiltragem e o método de filtragem utilizados nesta Etapa são idênticos à membrana de ultrafiltragem e ao método de filtragem da etapa de filtragem da Etapa 4 descrita abaixo.

[035] Etapa 3:

[036] A Etapa 3 é uma etapa de obtenção de hidrolisado de celulase por meio de hidrólise do hidrolisado de endoxilanase sólido utilizando celulase derivada de um fungo filamentoso.

[037] A hidrólise do hidrolisado de endoxilanase sólido com celulase derivada de fungo filamentoso destina-se à redução do peso molecular de celulose no hidrolisado de endoxilanase sólido, de forma a produzir monossacarídeo ou oligossacarídeo. Na hidrólise do hidrolisado de endoxilanase sólido, manan, arabinan e um componente de hemicelulose como xilano que não se decompôs completamente na hidrólise com endoxilanase também são hidrolisados ao mesmo tempo. Nesta Etapa, utiliza-se celulase derivada de fungo filamentoso como enzima sacarificante para hidrolisar um hidrolisado de endoxilanase sólido.

[038] Celulase derivada de fungo filamentoso é uma composição de enzima que compreende uma série de componentes de enzima como celobio- hidrolase, endoglucanase, exoglucanase, β-glicosidase, endoxilanase e xilosidase e possui atividade de sacarificação de celulose por meio de hidrólise. Como esses diversos componentes de enzima estão contidos em celulase derivada de fungo filamentoso, pode-se conduzir hidrólise eficiente de celulose por meio do seu efeito sinérgico ou complementar dos diversos componentes de enzima na hidrólise de celulose.

[039] Exemplos de celulase derivada de fungo filamentoso incluem celulase derivada de micro-organismos tais como Trichoderma, Aspergillus, Cellulomonas, Clostridium, Streptomyces, Humicola, Acremonium, Irpex, Mucor, Talaromyces, Phanerochaete, fungo lignolítico branco e fungo lignolítico marrom. A celulase pode também ser derivada de uma linhagem mutante desse micro-organismo preparado por meio de mutagênese utilizando um mutagênenico, irradiação de UV ou similar para aumentar a produtividade de celulase. Dentre os fungos filamentosos, utiliza-se preferencialmente celulase derivada da celulase derivada de Trichoderma que produz, em líquido de cultivo, grandes quantidades de componentes de enzima que possuem alta atividade específica na hidrólise de celulose.

[040] Celulase derivada de Trichoderma é uma composição enzimática cujo principal componente é celulase derivada de um ou mais microorganismos pertencentes ao gênero Trichoderma. Os micro-organismos de Trichoderma não são particularmente limitados e são preferencialmente Trichoderma reesei, incluindo especificamente Trichoderma reesei QM9414, Trichoderma reesei QM9123, Trichoderma reesei RutC-30, Trichoderma reesei PC3-7, Trichoderma reesei CL-847, Trichoderma reesei MCG77, Trichoderma reesei MCG80 e Trichoderma viride QM9123.

[041] Celobio-hidrolase é um termo geral para celulase que inicia a hidrólise a partir do final de celulose para liberar celobiose. O grupo de enzimas pertencentes a celobio-hidrolase é descrito como número EC: EC 3.2.1.91.

[042] Endoglucanase é um termo geral para celulase que hidrolisa cadeias moleculares de celulose das suas partes centrais. O grupo de enzimas pertencentes a endoglucanase é descrito como números EC: EC 3.2.1.4, EC 3.2.1.6, EC 3.2.1.39 e EC 3.2.1.73.

[043] Exoglucanase é um termo geral para celulase que hidrolisa cadeias moleculares de celulose dos seus terminais. O grupo de enzimas pertencentes a exoglucanase é descrito como números EC: EC 3.2.1.74 e EC 3.2.1.58.

[044] β-Glicosidase é um termo geral para celulase que hidrolisa celo-oligossacarídeos ou celobiose. O grupo de enzimas pertencentes a β- glicosidase é descrito como número EC: EC 3.2.1.21.

[045] Xilosidase é um termo geral para celulases que agem sobre xilo-oligossacarídeos. O grupo de enzimas pertencentes a xilosidase é descrito como número EC: EC 3.2.1.37.

[046] Enzimas contidas nessa celulase derivada de fungo filamentoso podem ser separadas por meio de método conhecido tal como filtragem de gel, troca de íons ou eletroforese bidimensional e os componentes separados podem ser submetidos à determinação das suas sequências de aminoácidos (por meio de análise N-terminal, análise C-terminal ou espectrometria de massa) e identificação por meio de comparação com bancos de dados.

[047] A atividade enzimática de uma celulase derivada de fungo filamentoso pode ser avaliada com base nas suas atividades hidrolíticas sobre polissacarídeos, tais como a atividade de degradação de Avicel, atividade de degradação de xilano, atividade de degradação de carboximetil celulose (CMC), atividade de degradação de celobiose e atividade de degradação de manano. As principais enzimas que exibem a atividade de degradação de Avicel são celobio- hidrolase ou exoglucanase, que degradam celulose a partir das suas partes terminais. As principais enzimas que exibem atividade de degradação de xilano são xilanase e β-xilosidase. As principais enzimas envolvidas na atividade de degradação de CMC são celobio-hidrolase, exoglucanase e endoglucanase. A principal enzima que exibe a atividade de degradação de celobiose é β- glicosidase. O termo “principal” no presente é utilizado para indicar que o(s) componente(s) está(ão) envolvido(s) na degradação até o máximo possível, enquanto outros componentes da enzima também estão envolvidos na degradação.

[048] Como fungos filamentosos produzem celulase no líquido de cultivo, o líquido de cultivo pode ser utilizado como se encontra na forma de agente de enzima bruto ou as enzimas podem ser purificadas e formuladas por meio de método conhecido para fornecer uma mistura de celulase derivada de fungo filamentoso. Em casos em que a celulase derivada de fungo filamentoso é purificada e formulada, a formulação de celulase pode também conter substâncias diferentes de enzimas, tais como inibidores de protease, dispersantes, solubilizantes e/ou estabilizantes.

[049] Na presente invenção, produtos de enzima brutos são preferencialmente utilizados como celulase derivada de fungo filamentoso. O produto de enzima bruto é derivado de um sobrenadante de cultivo obtido após o cultivo de fungo filamentoso por um período arbitrário em meio preparado de tal forma que o micro-organismo produza celulase. Os componentes de meio a serem utilizados para isso não são limitados e pode-se geralmente utilizar um meio suplementado com celulose, a fim de promover a produção de celulase. Como produto de enzima bruto, o líquido de cultivo pode ser utilizado como se encontra ou pode ser preferencialmente utilizado um sobrenadante de cultivo processado apenas por meio de remoção do corpo de fungo.

[050] As razões em peso de componentes de enzima no produto de enzima bruto não são limitadas e, por exemplo, um líquido de cultivo derivado de Trichoderma reesei contém de 50 a 95% em peso de celobio-hidrolase e também contém, como outros componentes, endoglucanase, β-glicosidase e similares. Micro-organismos pertencentes a Trichoderma produzem fortes componentes de celulase no líquido de cultivo, enquanto a atividade de β- glicosidase no líquido de cultivo é baixa, pois β-glicosidase é retida nas células ou sobre as superfícies celulares. β-glicosidase de uma espécie diferente ou da mesma espécie pode, portanto, ser adicionada ao produto de enzima bruta. Como β-glicosidase de uma espécie diferente, pode-se utilizar preferencialmente β-glicosidase derivada de Aspergillus. Exemplos da β-glicosidase derivada de Aspergillus incluem Novozyme 188, que é disponível comercialmente por meio da Novozyme. Um método de adição ao produto de enzima bruto de β- glicosidase de uma espécie diferente ou da mesma espécie pode ser um método no qual um gene pode ser introduzido em um micro-organismo de Trichoderma, em que o micro-organismo de Trichoderma sofreu recombinação genética para que fosse produzida β-glicosidase no líquido de cultivo e o líquido de cultivo é isolado.

[051] As condições de reação para hidrólise com celulase derivada de fungo filamentoso não são limitadas, desde que ela seja realizada de acordo com as condições de reação preferíveis de celulase derivada de fungo filamentoso, enquanto, na presente invenção, a temperatura de reação geral para uso de celulase derivada de fungo filamentoso encontra-se preferencialmente na faixa de 15 a 100 °C, de maior preferência de 40 a 60 °C e, de preferência ainda maior, cerca de 50 °C.

[052] Na presente invenção, como valor de pH do hidrolisado de endoxilanase sólido durante reação de hidrólise, valor de pH durante o tratamento de celulase encontra-se preferencialmente na faixa de 3 a 9, de maior preferência de 4 a 5,5 e, de preferência ainda maior, cerca de 5, pois o efeito da hidrólise com celulase derivada de fungo filamentoso é mais alto sob pH ideal da celulase derivada de fungo filamentoso.

[053] Como o valor de pH varia em um processo de hidrólise, realiza-se preferencialmente ajuste de pH utilizando ácido ou álcali para ajuste a um pH desejado. No ajuste de pH, pode-se também utilizar um tampão com o hidrolisado, conforme desejado. Exemplos de ácido incluem, por exemplo, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico e ácido fosfórico, sendo preferencialmente utilizados ácido sulfúrico, ácido nítrico e ácido fosfórico devido à tendência de não causar inibição durante a fermentação do líquido de açúcar obtido na presente invenção e, de maior preferência, ácido sulfúrico é utilizado por questão de economia. Como álcali, são preferencialmente utilizados amônia, hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio e soluções que os incluem por motivo de economia, sendo utilizados de maior preferência amônia e hidróxido de sódio, que são íons monovalentes, devido à supressão da ocorrência de falha de membrana durante a separação da membrana na Etapa 4 descrita abaixo e, de preferência ainda maior, utiliza-se amônia devido à tendência de não causar inibição durante a fermentação.

[054] Além disso, para facilitar o contato entre o hidrolisado de endoxilanase sólido e a enzima de sacarificação e para uniformizar a concentração de açúcar no hidrolisado, o hidrolisado de endoxilanase sólido e a enzima de sacarificação são preferencialmente misturadas com agitação.

[055] Adiciona-se água, de tal forma que a concentração de sólido em celulose fique preferencialmente na faixa de 1 a 25% em peso, de maior preferência de 5 a 20% em peso.

[056] Etapa 4:

[057] A Etapa 4 é uma etapa de filtragem do hidrolisado de celulase por meio de uma membrana de ultrafiltragem para recuperar um líquido de açúcar do lado do permeado e recuperar um componente de enzima do lado do não permeado. Os componentes de enzima recuperados como não permeados podem ser reutilizados na Etapa 3, de tal forma que a quantidade dos componentes de enzima utilizados na Etapa 3 possa ser reduzida.

[058] Uma membrana de ultrafiltragem utilizada na presente invenção permite a permeação de glicose (peso molecular, 180) e xilose (peso molecular, 150), que são monossacarídeos, e aquele que possui corte de peso molecular que pode bloquear celulase derivada de fungo filamentoso pode ser utilizado. Na presente invenção, o corte de peso molecular da membrana de ultrafiltragem pode encontrar-se na faixa de 500 a 50.000 e, do ponto de vista de separação de impurezas que exibem ações inibidoras contra a reação enzimática da enzima, o corte de peso molecular encontra-se, de maior preferência, na faixa de 5000 a 50.000 e, de preferência ainda maior, na faixa de 10.000 a 30.000.

[059] Neste ponto, como o tamanho dos poros de uma membrana de ultrafiltragem é pequeno demais, a medição do tamanho dos poros sobre a sua superfície de membrana é difícil, mesmo sob microscópio eletrônico ou similar e, portanto, utiliza-se um valor denominado corte de peso molecular como índice do tamanho de poros e não o tamanho médio dos poros. Corte de peso molecular designa peso molecular com relação ao qual a taxa de bloqueio é de 90% ao plotar-se os dados de peso molecular do soluto ao longo da abscissa e os dados de taxa de bloqueio ao longo das ordenadas.

[060] Exemplos do material da membrana de ultrafiltragem incluem poliéter sulfona (PES), polissulfona (PS), poliacrilonitrila (PAN), fluoreto de polivinilideno (PVDF), celulose regenerada, celulose, éster de celulose, polissulfona sulfonatada, poliéter sulfona sulfonatada, poliolefina, álcool polivinílico, metacrilato de polimetila e politetrafluoroetileno. Na presente invenção, como material de membrana de ultrafiltragem utilizado, é preferencialmente utilizada uma membrana de ultrafiltragem que emprega um material de polímero sintético tal como PES ou PVDF, pois celulose regenerada, celulose e éster de celulose sofrem degradação por celulase.

[061] Exemplos do método de filtragem por meio da membrana de ultrafiltragem incluem filtragem convencional e filtragem tangencial e o método é preferencialmente filtragem tangencial, com vistas à supressão de falhas da membrana.

[062] Exemplos da forma da membrana de ultrafiltragem que pode ser utilizada como apropriada incluem a membrana plana, membrana enrolada em espiral, membrana tubular e membrana de fibras ocas. Exemplos específicos da membrana de ultrafiltragem incluem Tipo G-5, Tipo G-10, Tipo G-20, Tipo G- 50, Tipo PW e Tipo HWSUF, fabricados pela DESAL; HFM-180, HFM-183, HFM- 251, HFM-300, HFK-131, HFK-328, MPT-U20, MPS-U20P e MPS-U20S, fabricados pela KOCH; SPE1, SPE3, SPE5, SPE10, SPE30, SPV5, SPV50 e SOW30, fabricados pela Synder; produtos da Microza (marca registrada) série UF, fabricados pela Asahi Kasei Corporation, que possuem cortes de peso molecular de 3000 a 10.000; e NTR7410 e NTR7450, fabricados pela Nitto Denko Corporation.

[063] Como método de filtragem, utiliza-se preferencialmente filtro de pressão, filtragem a vácuo, filtragem centrífuga e similares. Exemplos de operação de filtragem incluem filtragem sob pressão constante, filtragem sob fluxo constante, filtragem sob fluxo não constante e pressão não constante e similares. A operação de filtragem pode ser filtragem em múltiplas etapas utilizando a membrana de ultrafiltragem mencionada acima duas ou mais vezes.

[064] Como o não permeado recuperado na Etapa 4 contém celulase derivada de fungo filamentoso como componente de enzima, ele pode ser utilizado como celulase derivada de fungo filamentoso da Etapa 3 por meio de mistura do não permeado recuperado que contém celulase derivada de fungo filamentoso na celulase derivada de fungo filamentoso utilizada na Etapa 3. Isso permite redução da quantidade de celulase derivada de fungo filamentoso recém utilizada na Etapa 3 e permite uma tentativa de reduzir o custo da celulase derivada de fungo filamentoso.

[065] Segundo o método de produção de líquido de açúcar de acordo com a presente invenção, portanto, é produzido um sólido de hidrolisado de endoxilanase por meio de separação de sólidos e líquidos do hidrolisado de endoxilanase obtido por meio de hidrólise de biomassa que contém celulose com endoxilanase antes de uma reação de sacarificação da biomassa que contém celulose. A recuperação e a reutilização do não permeado obtido por meio de hidrólise desse hidrolisado de endoxilanase sólido com uma celulase derivada de fungo filamentoso podem aumentar adicionalmente o efeito de redução da quantidade de celulase derivada de fungo filamentoso, que é uma enzima de sacarificação, utilizada nos processos de produção de líquido de açúcar. Além disso, por meio de filtragem do líquido de hidrolisado de endoxilanase obtido por separação de sólidos e líquidos do hidrolisado de endoxilanase, pode-se recuperar xilo-oligossacarídeo e também endoxilanase. A endoxilanase obtida pode ser reutilizada para hidrólise de biomassa que contém celulose e, portanto, pode-se produzir um líquido de açúcar reduzindo ao mesmo tempo a quantidade de endoxilanase utilizada para hidrólise de biomassa que contém celulose, especialmente um componente de hemicelulose. O método de produção de líquido de açúcar de acordo com a presente invenção permite, portanto, a produção de um líquido de açúcar mediante recuperação e reutilização de uma enzima de sacarificação e permite manter baixos os custos de produção de líquido de açúcar.

[066] Outras realizações:

[067] A presente invenção foi descrita com referência, mas sem limitações, a um caso no qual o não permeado obtido por meio de filtragem de hidrolisado de celulase na Etapa 4 é misturado com a celulase derivada de fungo filamentoso da Etapa 3. Outro exemplo do método de produção de líquido de açúcar de acordo com a presente invenção é exibido na Fig. 2. Conforme exibido na Fig. 2, por exemplo, o hidrolisado de celulase obtido na Etapa 3 é submetido a separação de sólidos e líquidos e separado em uma solução que contém açúcar (hidrolisado de celulase líquido) e um resíduo sacarificado que é sólido. O hidrolisado de celulase líquido obtido é filtrado por meio de uma membrana de ultrafiltragem na Etapa 4 e separado em um não permeado que contém celulase derivada de fungo filamentoso e um açúcar líquido que é permeado. Isso resulta na recuperação de não permeado que contém celulase derivada de fungo filamentoso e na recuperação de açúcar líquido na forma de permeado. O não permeado recuperado pode ser reutilizado e misturado na celulase derivada de fungo filamentoso utilizada na Etapa 3. Desta forma, removendo-se os sólidos do hidrolisado de celulase por meio da separação anterior de sólidos e líquidos do hidrolisado de celulase, a celulase derivada de fungo filamentoso contida no hidrolisado de celulase pode ser eficientemente recuperada na Etapa 4. Isso permite a produção de um líquido de açúcar mediante aumento da taxa de recuperação da celulase derivada de fungo filamentoso.

[068] Em um método de separação de sólidos e líquidos, como na Etapa 2, a separação de sólidos e líquidos pode ser realizada por meio de centrifugação, por exemplo, por um decantador de rosca; separação de membrana, por exemplo, por filtro de pressão; prensa de esteira; filtro de esteira; separação por meio de precipitação espontânea; ou filtragem, por exemplo, por meio de tela, tecido não tecido e papel-filtro. Dentre estes, é preferencialmente utilizado um método de filtragem tal como decantador de rosca, filtro de pressão e prensa de esteira. Utilizando estes métodos de filtragem, pode-se obter um componente de solução que possui menos sólidos insolúveis e menos material suspenso. É preferível uma quantidade menor de material suspenso, pois ele suprime as falhas da membrana de ultrafiltragem na Etapa 4.

[069] Também é preferível filtrar, adicionalmente por meio de uma membrana de microfiltragem, o hidrolisado de celulase líquido obtido por meio de separação de sólidos e líquidos. Filtrando-se o hidrolisado de celulase líquido por meio de uma membrana de microfiltragem, sólidos que não foram completamente separados por meio de separação de sólidos e líquidos podem ser removidos e, portanto, a celulase derivada de fungo filamentoso contido no hidrolisado de celulase pode ser adicionalmente recuperado de forma eficiente na Etapa 4.

[070] Membrana de microfiltragem designa uma membrana que possui tamanho de poros médio de 0,01 μm a 5 mm. Exemplos do material da membrana de ultrafiltragem não são particularmente limitados, desde que ele remova os sólidos que não tenham sido completamente separados por meio da separação de sólidos e líquidos mencionada acima e inclua materiais orgânicos tais como celulose, éster de celulose, polissulfona, poliéter sulfona, polietileno clorado, polipropileno, poliolefina, álcool polivinílico, metacrilato de polimetila, fluoreto de polivinilideno e politetrafluoroetileno; metais, tais como aço inoxidável; e materiais inorgânicos, tais como cerâmica.

[071] Conforme descrito acima, o líquido de açúcar obtido por meio da presente invenção pode ser utilizado para diversas aplicações de materiais de partida de fermentação e similares, tais como materiais de produtos alimentícios, materiais farmacêuticos e produtos químicos. O líquido de açúcar obtido por meio da presente invenção pode ser utilizado como material de partida de fermentação para o crescimento de micro-organismos que detêm a capacidade de fabricar produtos químicos, de forma a permitir a elaboração de diversos produtos químicos. O crescimento de micro-organismos indica que componentes de açúcar ou fontes de amino contidas em um líquido de açúcar são utilizados como nutrientes para micro-organismos, a fim de causar a proliferação e o crescimento contínuo dos micro-organismos. Exemplos específicos dos produtos químicos incluem álcoois, ácidos orgânicos, aminoácidos e ácidos nucleicos, que são substâncias produzidas em massa na indústria de fermentação. Esses produtos químicos são elaborados e acumulam- se dentro e fora do corpo vivo, como resultado do metabolismo, utilizando componentes de açúcar no líquido de açúcar como fontes de carbono. Exemplos dos produtos químicos que podem ser fabricados por micro-organismos incluem álcoois tais como etanol, propanol, butanol, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol e glicerol; ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido succínico, ácido málico, ácido itacônico e ácido cítrico; nucleosídeos, tais como inosina e guanosina; e compostos de amina, tais como cadaverina. Além disso, o líquido de açúcar obtido por meio do método de produção de líquido de açúcar de acordo com a presente invenção pode ser aplicado à produção de enzimas, antibióticos, proteínas recombinantes e similares. Os micro-organismos utilizados para a elaboração desses produtos químicos não são limitados, desde que os micro-organismos sejam capazes de produzir com eficiência os produtos químicos de interesse e exemplos dos micro-organismos que podem ser utilizados incluem micro-organismos tais como E. coli, leveduras, fungos filamentosos e Basidiomycetes.

EXEMPLOS

[072] Como forma de exemplos, a presente invenção é descrita concretamente abaixo. A presente invenção não é, entretanto, limitada a eles.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1

[073] Preparação de celulase derivada de fungo filamentoso (líquido de cultivo):

[074] Celulase derivada de fungo filamentoso (líquido de cultivo) foi preparada por meio do método a seguir.

[075] Cultivo prévio:

[076] Preparou-se a mistura de 5% (peso/volume) de milhocina, 2% (peso/volume) de glicose, 0,37% (peso/volume) de tartarato de amônio, 0,14% (peso/volume) de sulfato de amônio, 0,2% (peso/volume) de di-hidrogênio fosfato de potássio, 0,03% (peso/volume) de di-hidrato cloreto de cálcio, 0,03% (peso/volume) de hepta-hidrato sulfato de magnésio, 0,02% (peso/volume) de cloreto de zinco, 0,01% (peso/volume) de hexa-hidrato cloreto de ferro (III), 0,004% (peso/volume) de penta-hidrato sulfato de cobre (II), 0,0008% (peso/volume) de tetra-hidrato cloreto de manganês, 0,0006% (peso/volume) de ácido bórico e 0,0026% (peso/volume) de tetra-hidrato heptamolibdato de hexa- amônio adicionada a água destilada e 100 ml dessa água destilada que inclui os componentes mencionados acima foram colocados em um frasco Erlenmeyer de 500 ml com membrana, seguido por esterilização por meio de autoclave sob temperatura de 121 °C por quinze minutos. Após permitir-se o resfriamento da mistura, PE-M e Tween 80, cada qual esterilizado por meio de autoclave sob temperatura de 121 °C por quinze minutos separadamente da mistura, foram adicionados ao frasco Erlenmeyer de 500 ml com membrana mencionado acima a 0,01% (peso/volume) cada um. A esse meio de cultivo prévio, Trichoderma reesei ATCC 66589 foi inoculado a 1x105 células/ml e as células foram cultivadas sob temperatura de 28 °C por 72 horas com agitação a 180 rpm, utilizando um agitador (BIO-SHAKER BR-40LF, fabricado pela TAITEC CORPORATION) para fornecer um líquido de cultivo prévio.

[077] Cultivo principal:

[078] Foi preparada a mistura de 5% (peso/volume) de milhocina, 2% (peso/volume) de glicose, 10% (peso/volume) de celulose (Avicel), 0,37% (peso/volume) de tartarato de amônio, 0,14% (peso/volume) de sulfato de amônio, 0,2% (peso/volume) de di-hidrogênio fosfato de potássio, 0,03% (peso/volume) de di-hidrato cloreto de cálcio, 0,03% (peso/volume) de hepta- hidrato sulfato de magnésio, 0,02% (peso/volume) de cloreto de zinco, 0,01% (peso/volume) de hexa-hidrato cloreto de ferro (III), 0,004% (peso/volume) de penta-hidrato sulfato de cobre (II), 0,0008% (peso/volume) de tetra-hidrato cloreto de manganês, 0,0006% (peso/volume) de ácido bórico e 0,0026% (peso/volume) de tetra-hidrato heptamolibdato de hexa-amônio adicionado a água destilada e 2,5 l dessa água destilada que inclui os componentes mencionados acima foram colocados em uma jarra de agitação com 5 l de capacidade (DPC-2A, ABLE Corporation), seguidos por esterilização por meio de autoclave sob temperatura de 121 °C por quinze minutos. Após manutenção da mistura em resfriamento, PE-M e Tween 80, cada um dos quais esterilizado por meio de autoclave sob temperatura de 121 °C por quinze minutos separadamente da mistura, foram adicionados à mistura a 0,1% (p/v) cada um. À mistura resultante, foram inoculados 250 ml do Trichoderma reesei ATCC 66589 previamente cultivado no meio de cultivo líquido por meio do método acima. As células foram cultivadas em seguida com agitação sob as condições de temperatura de 28 °C a 300 rpm sob velocidade de aeração de 1 vvm por 87 horas e centrifugadas. Em seguida, o sobrenadante foi filtrado por meio de uma membrana (Stericup-GV, material PVDF, da Millipore). Este líquido de cultivo ajustado sob as condições mencionadas acima foi utilizado como celulase derivada de fungo filamentoso nos Exemplos abaixo.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2

[079] Método de medição da atividade de celulase derivada de fungos filamentosos:

[080] Para atividade enzimática de celulase derivada de fungo filamentoso como atividade do grupo de enzimas envolvidas na degradação de celulose, (1) a atividade de degradação de 4-nitrofenil-β-D-lactopiranosida (pNP- Lac) como a atividade de celobio-hidrolase e endoglucanase, (2) a atividade de degradação de 4-nitrofneil-β-D-glicopiranosida (pNP-Glc) como atividade de β- glicosidase e (3) a atividade de degradação de 4-nitrofenil-β-D-xilopiranosida (pNP-Xyl) como atividade de endoxilanase e xilosidase envolvida na degradação de xilano, que é o principal componente de hemicelulose foram todas medidas e avaliadas por meio dos procedimentos a seguir. Os substratos de (1) a (3) descritos acima são denominados coletivamente pNP-açúcar.

[081] A 0,9 ml de 100 mM tampão de ácido acético (pH 5,0) contendo cada substrato sob concentração de 1 mM cada, 0,1 ml do líquido enzimático foram adicionados e reagiram a 30 °C. O tempo de reação foi de 60 minutos para o substrato de pNP-Lac, dez minutos para pNP-Glc e trinta minutos para pNP-Xyl e, após essa reação, adicionou-se 0,1 ml de 2 M solução aquosa de carbonato de sódio para interromper a reação e foi medida a absorção a 405 nm (ODteste). Como teste padrão, a solução de substrato à qual foram adicionados 2 M solução aquosa de carbonato de sódio e uma solução de enzimas, nesta ordem, foi medida para determinar a absorção a 405 nm da mesma forma (ODpadrão). A quantidade de enzima que produz 1 μmol de 4- nitrofenol por minuto no sistema de reação acima foi definida como 1 U e o valor de atividade (U/ml) foi calculado de acordo com a equação a seguir. O coeficiente de extinção molecular milimolar de 4-nitrofenol no sistema de reação acima foi de 17,2 l/mmol/cm: atividade de degradação de pNP-Lac (U/ml) = {(ODteste - ODpadrão) x 1,1 (ml) x razão de diluição da enzima} / {17,2 x 60 (minutos) x 0,1 (ml)} atividade de degradação de pNP-Glc (U/ml) = {(ODteste - ODpadrão) x 1,1 (ml) x razão de diluição da enzima} / {17,2 x 10 (minutos) x 0,1 (ml)} atividade de degradação de pNP-Xyl (U/ml) = {(ODteste - ODpadrão) x 1,1 (ml) x razão de diluição da enzima} / {17,2 x 60 (minutos) x 0,1 (ml)}

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3

[082] Preparação de biomassa que contém celulose:

[083] Com 100 g em peso seco de bagaço, 9,3 g de soda cáustica foram misturados e reagiram a 121 °C por trinta minutos para preparar um bagaço tratado com álcali.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 4

[084] Preparação de endoxilanase derivada de Acremonium purificada: - “Celulase de Acremonium”, disponível comercialmente por meio da Meiji Seika Pharma Co., Ltd., foi purificada por meio dos procedimentos mencionados abaixo para obter uma enzima, que foi a endoxilanase derivada de Acremonium purificada.

[085] Preparação da Fração 1, 2: 1. Cromatografia de troca de ânions fortemente básicos: utilizou-se QAE-Toyopearl 550C (Tosoh Corporation) para adsorver a enzima bruta e fracionar uma fração ativa em xilanase eluída com um tampão de ácido acético (0,02 M, pH 5,5). 2. Cromatografia de troca de ânions fracamente básicos: utilizou-se DEAE-Toyopearl 650S (Tosoh Corporation) para adsorver a fração fracionada de 1 acima com 0,02 M tampão de ácido acético (pH 6,0) e fracionar uma fração ativa em xilanase eluída com tampão de ácido acético (0,02 M, pH 5,5). 3. Cromatografia de troca de ânions fortemente básicos: utilizou-se Mono S (Pharmacia Corporation) para adsorver a fração fracionada de 2 acima com um tampão de ácido acético (0,1 M, pH 3,5), seguido por eluição de gradiente linear com tampão de ácido acético (0,1 M, pH 3,5), incluindo 0 a 0,05 M NaCl, para fracionar uma fração que exibe atividade de xilanase. Foram recuperadas duas frações (Fração 1, Fração 2) que exibem apenas atividade de xilanase.

[086] Preparação das Frações 3, 4 e 5: 4. Cromatografia de filtragem de gel: permitiu-se que Superdex 75 (Pharmacia Corporation) passasse pela Fração 1 fracionada de 3 acima utilizando um tampão de ácido acético (0,05 M, pH 3,5) contendo 0,1 M de NaCl, para fracionar uma fração ativa em xilanase (Fração 3). 5. Cromatografia de filtragem de gel: permitiu-se que Superdex 75 (Pharmacia Corporation) passasse pela Fração 2 de 3 acima utilizando um tampão de ácido acético (0,05 M, pH 3,5) contendo 0,1 M NaCl, para fracionar duas frações ativas em xilanase (Fração 4 e Fração 5).

[087] Por meio dos procedimentos acima, a Fração 3, a Fração 4 e a Fração 5 foram altamente purificadas até exibirem uma única faixa manchada com proteína sobre eletroforese de gel de poliacrilamida-SDS. Uma mistura de Fração 3, Fração 4 e Fração 5 foi transformada na endoxilanase purificada. Após reação sob substrato de xilano Birchwood a 50 °C sob pH 5 por dez minutos, utilizou-se o método de ácido dinitrossalicílico (método DNS) para medir a absorção a 540 nm, de forma a medir a quantidade de açúcar redutor contida em um líquido de reação resultante da reação e a atividade da endoxilanase foi de 100 U/mg.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 5

[088] Medição da concentração de açúcar:

[089] A concentração de cada uma dentre glicose e xilose contidas no líquido de açúcar foi quantificada com relação a uma preparação autêntica por meio de cromatografia de líquidos de alto desempenho (condições de HPLC) descrita abaixo.

[090] Condições de HPLC: - Coluna: Shodex SH1011 (Showa Denko K. K.); - Fase móvel: 5 mM ácido sulfúrico (fluxo: 0,6 ml/min); - Líquido de reação: nenhum; - Método de detecção: RI (índice de refração); - Temperatura: 65 °C.

EXEMPLO 1

[091] Uso de endoxilanase derivada de micro-organismos do gênero Acremonium.

[092] Etapa 1: - A 1 g do bagaço tratado com álcali ajustado no Exemplo de Referência 3, foram adicionados 19 g de água para elaborar um ajuste, de tal forma que a concentração dos sólidos fosse de 5%. À biomassa que contém celulose preparada, endoxilanase derivada de micro-organismos do gênero Acremonium preparada no Exemplo de Referência 4 foi adicionada para realizar hidrólise. A endoxilanase previamente tratada derivada de micro-organismos do gênero Acremonium foi agregada em quantidade de adição de 0,1 mg/g e ajustada para que fosse de pH 5 com ácido clorídrico, seguido por hidrólise da endoxilanase. A reação de hidrólise de endoxilanase foi realizada a 50 °C por 24 horas.

[093] Etapa 2: - Após a reação de endoxilanase, 10 g de hidrolisado de endoxilanase líquido e 10 g de hidrolisado de endoxilanase sólido foram recuperados por meio de separação de sólidos e líquidos com uma peneira de aço inoxidável de 12 mesh.

[094] Etapa 3: - A 10 g do sólido (concentração de 10% de sólido) da separação de sólidos e líquidos, a celulase derivada de fungo filamentoso preparada no Exemplo de Referência 1 foi adicionada para realizar hidrólise. A celulase derivada de fungo filamentoso previamente tratada foi adicionada em quantidade de adição de 8 mg/g e ajustada de forma a ser de pH 5 com um ácido clorídrico, seguido pelo início da hidrólise. A hidrólise foi realizada a 50 °C por 24 horas.

[095] Etapa 4: - Após a sacarificação de celulase, hidrolisado de celulase sólido e hidrolisado de celulase líquido foram separados por meio de separação de sólidos e líquidos por centrifugação (4500 g, dez minutos). Além disso, o hidrolisado de celulase líquido foi filtrado por meio de uma membrana (Stericup- GP, material PES, fabricado pela Millipore) e o sobrenadante resultante foi centrifugado a 4500 g utilizando uma membrana de ultrafiltragem com corte de peso molecular de 10.000 (VIVASPIN 20, material PES, fabricado pela Sartorius Stedim Biotech) até que o lado do não permeado da membrana de ultrafiltragem se tornasse 1 ml. À fração de membrana, foram adicionados 10 ml de água destilada; a mistura foi novamente centrifugada a 4500 g até que a fração sobre o lado do não permeado se tornasse 1 ml, para gerar a enzima recuperada; a atividade enzimática foi medida por meio do método do Exemplo de Referência 2; e determinou-se valor relativo com a atividade de 100 para a enzima adicionada.

EXEMPLO 2

[096] Uso de endoxilanase derivada de micro-organismos do gênero Aspergillus.

[097] Etapa 1: - A 1 g do bagaço tratado com álcali ajustado no Exemplo de Referência 3, foram adicionados 19 g de água para realizar o ajuste para que a concentração dos sólidos fosse de 5%. À biomassa que contém celulose preparada, endoxilanase derivada de micro-organismos do gênero Aspergillus (atividade de 80 U/mg, fabricada pela Megazyme) foi adicionada para realizar hidrólise. A endoxilanase previamente tratada derivada de micro-organismos do gênero Aspergillus foi agregada em quantidade de adição de 0,13 mg/g e ajustada de forma a ter pH 5 com ácido clorídrico, seguido por hidrólise de endoxilanase. A reação de hidrólise de endoxilanase foi realizada a 50 °C por 24 horas.

[098] Etapa 2: - Após a reação de endoxilanase, 10 g de hidrolisado de endoxilanase líquido e 10 g de hidrolisado de endoxilanase sólido foram recuperados por meio de separação de sólidos e líquidos com peneira de aço inoxidável de 12 mesh.

[099] Etapa 3: - A 10 g do sólido da separação de sólidos e líquidos, a celulase derivada de fungo filamentoso preparada no Exemplo de Referência 1 foi adicionada para realizar hidrólise. A hidrólise por celulase foi realizada da mesma forma do Exemplo Comparativo 1.

[100] Etapa 4: - Esta etapa foi realizada da mesma forma do Exemplo 1.

EXEMPLO 3

[101] Recuperação de endoxilanase da Etapa 2 no Exemplo 1 e recuperação de xilo-oligossacarídeo:

[102] A Etapa 1, a Etapa 2, a Etapa 3 e a Etapa 4 foram realizadas da mesma forma do Exemplo 1. Enquanto isso, o hidrolisado de endoxilanase líquido obtido na Etapa 2 foi filtrado por meio de uma membrana (Stericup-GP, material PES, fabricado pela Millipore) e o sobrenadante resultante foi centrifugado a 4500 g utilizando uma membrana de ultrafiltragem com corte de peso molecular de 10.000 (VIVASPIN 20, material PES, fabricado pela Sartorius Stedim Biotech) até que o lado do não permeado da membrana de ultrafiltragem se tornasse 1 ml. À fração de membrana, foram adicionados 10 ml de água destilada; a mistura foi novamente centrifugada a 4500 g até que a fração sobre o lado do não permeado se tornasse 1 ml, para gerar a enzima de endoxilanase recuperada; após reação sob substrato de xilano Birchwood a 50 °C sob pH 5 por dez minutos, utilizou-se o método de ácido dinitrossalicílico (método DNS) para medir a absorção a 540 nm e, com base nela, determinou-se um valor relativo da endoxilanase recuperada com atividade de 100 para a endoxilanase adicionada como razão de recuperação da endoxilanase. A razão de recuperação da endoxilanase foi de 73%. A concentração de xilo- oligossacarídeo no permeado do hidrolisado de endoxilanase líquido foi medida de acordo com o Exemplo de Referência 5 para concluir que foram recuperados 80 mg do xilo-oligossacarídeo por grama em peso de bagaço tratado com álcali.

EXEMPLO COMPARATIVO 1

[103] Omissão da Etapa 1 e da Etapa 2 no Exemplo 1:

[104] A 1 g da biomassa que contém celulose ajustada no Exemplo de Referência 3, 9 g de água foram adicionados e preparados de tal forma que a concentração dos sólidos fosse de 10%. À biomassa que contém celulose preparada, a celulase derivada de fungo filamentoso preparada no Exemplo de Referência 1 foi adicionada para realizar hidrólise. As condições de hidrólise foram as mesmas do Exemplo 1. A partir do hidrolisado obtido, a enzima foi recuperada de acordo com a Etapa 4 no Exemplo 1 e a atividade enzimática foi medida por meio do método do Exemplo de Referência 2.

EXEMPLO COMPARATIVO 2

[105] Omissão da Etapa 1 no Exemplo 1:

[106] A 1 g da biomassa que contém celulose ajustada no Exemplo de Referência 3, 19 g de água foram adicionados e ajustados de tal forma que a concentração dos sólidos fosse de 5%. Por meio da sua separação de sólidos e líquidos com uma peneira de aço inoxidável de 12 mesh, foram recuperados 10 g do lado líquido e 10 g do lado sólido. A 10 g do sólido da separação de sólidos e líquidos, a celulase derivada de fungo filamentoso preparada no Exemplo de Referência 1 foi adicionada para realizar hidrólise de acordo com a Etapa 3 do Exemplo 1. A partir do hidrolisado obtido, a enzima foi recuperada de acordo com a Etapa 4 do Exemplo 1 e a atividade enzimática foi medida por meio do método do Exemplo de Referência 2.

EXEMPLO COMPARATIVO 3

[107] Omissão da Etapa 2 do Exemplo 1:

[108] A 1 g da biomassa que contém celulose ajustada no Exemplo de Referência 3, 9 g de água foram adicionados e ajustados de tal forma que a concentração dos sólidos fosse de 10%. À biomassa que contém celulose preparada, a endoxilanase derivada de micro-organismos do gênero Acremonium preparada no Exemplo de Referência 4 foi adicionada para realizar hidrólise. A endoxilanase previamente tratada derivada de micro-organismos do gênero Acremonium foi adicionada em quantidade de adição de 0,1 mg/g e ajustada de forma a ter pH 5 com ácido clorídrico, seguido por hidrólise de endoxilanase. A reação de hidrólise de endoxilanase foi realizada a 50 ° por 24 horas. Após a reação de endoxilanase, não se realizou separação de sólidos e líquidos e adicionou-se a celulase derivada de fungo filamentoso preparada no Exemplo de Referência 1, seguida por hidrólise de acordo com a Etapa 3 do Exemplo 1. A partir do hidrolisado obtido, a enzima foi recuperada de acordo com a Etapa 4 do Exemplo 1 e a atividade enzimática foi medida por meio do método do Exemplo de Referência 2.

EXEMPLO COMPARATIVO 4

[109] Uso de endoxilanase derivada de micro-organismos do gênero Trichoderma:

[110] A 1 g da biomassa que contém celulose ajustada no Exemplo de Referência 3, 19 g de água foram adicionados e ajustados de tal forma que a concentração dos sólidos fosse de 5%. À biomassa que contém celulose preparada, 0,04 mg/g da endoxilanase previamente tratada derivada de Trichoderma viride (atividade de 250 U/mg, fabricada pela Megazyme) foram adicionados e ajustados até pH 5 com ácido clorídrico, seguido por hidrólise de endoxilanase. A reação de hidrólise de endoxilanase foi realizada a 50 °C por 24 horas. Após a reação de endoxilanase, 10 g de hidrolisado de endoxilanase líquido e 10 g de hidrolisado de endoxilanase sólido foram recuperados por meio de separação de sólidos e líquidos com uma peneira de aço inoxidável de 12 mesh. A 10 g do sólido da separação de sólidos e líquidos, adicionou-se a celulase derivada de fungo filamentoso preparada no Exemplo de Referência 1, seguida por hidrólise de acordo com a Etapa 3 do Exemplo 1. A partir do hidrolisado obtido, a enzima foi recuperada de acordo com a Etapa 4 do Exemplo 1 e a atividade enzimática foi medida por meio do método do Exemplo de Referência 2.

[111] A Tabela 1 resume os resultados das razões de recuperação das enzimas dos Exemplos Comparativos 1 a 4 e dos Exemplos 1 e 2. Como se pode observar na Tabela 1, as atividades de degradação de pNP-Lac, pNP-Glc e pNP-Xyl das enzimas recuperadas são altas nos Exemplos 1 e 2 com as razões de recuperação de enzimas aprimoradas, em comparação com os Exemplos Comparativos 1 a 4.

[112] No Exemplo Comparativo 3, a endoxilanase derivada de micro-organismos do gênero Acremonium foi utilizada na Etapa 1, mas a atividade da celulase recuperada não foi aprimorada sem a realização da Etapa 2, o que deixou claro que a separação de sólidos e líquidos da Etapa 2 é necessária para obter o efeito da presente invenção.

[113] O Exemplo Comparativo 4 é um exemplo no qual a xilanase derivada de micro-organismos do gênero Trichoderma foi utilizada na Etapa 1. O Documento de Patente 4 indica que hidrólise com apenas a enzima recuperada é realizada antes da hidrólise com celulase derivada de fungo filamentoso, que xilosidase que converte endoxilanase e xilobiose em xilose é acumulada na celulase recuperada e que a atividade de celulase da enzima recuperada e a razão de sacarificação na hidrólise de celulase são aumentadas. O mesmo efeito descrito no Documento de Patente 4 foi esperado, mas, em comparação com os Exemplos 1 e 2, a razão de recuperação de celulase foi mais baixa e, em comparação com o Exemplo Comparativo 1, a razão de recuperação de celulase foi aprimorada apenas levemente. TABELA 1

[114] Atividade enzimática de componentes de enzima recuperados de hidrolisado de celulase utilizando membrana de ultrafiltragem:

Claims

1. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM LÍQUIDO DE AÇÚCAR, a partir de biomassa que contém celulose, caracterizado por compreender: - Etapa 1: etapa de obtenção de hidrolisado de endoxilanase por meio de hidrólise da biomassa que contém celulose, utilizando uma endoxilanase derivada de micro-organismos do gênero Acremonium ou do gênero Aspergillus; - Etapa 2: etapa de separação do hidrolisado de endoxilanase em um hidrolisado de endoxilanase sólido e um hidrolisado de endoxilanase líquido por meio de separação de sólidos e líquidos; - Etapa 3: etapa de obtenção de hidrolisado de celulase por meio de hidrólise do hidrolisado de endoxilanase sólido utilizando celulase derivada de fungo filamentoso; e - Etapa 4: etapa de filtragem do hidrolisado de celulase por meio de uma membrana de ultrafiltragem para recuperar um líquido de açúcar do lado do permeado e recuperar um componente de enzima do lado do não permeado.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela biomassa que contém celulose ser previamente tratada por um ou mais métodos selecionados a partir do grupo que consiste em tratamento com álcali, tratamento hidrotérmico e tratamento com ácido sulfúrico diluído.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela atividade enzimática da endoxilanase ser de 80 U/mg de proteína ou mais.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela separação de sólidos e líquidos do hidrolisado de endoxilanase satisfazer a expressão relacional a seguir: peso do hidrolisado de endoxilanase sólido < peso do hidrolisado de endoxilanase líquido.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender adicionalmente uma etapa de filtragem do hidrolisado de endoxilanase líquido por meio de uma membrana de ultrafiltragem para recuperar um xilo-oligossacarídeo líquido do lado do permeado e recuperar endoxilanase do lado do não permeado.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela celulase derivada de fungo filamentoso ser derivada de um ou mais micro-organismos pertencentes ao gênero Trichoderma.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela etapa 4 ser uma etapa de filtragem, por meio de uma membrana de ultrafiltragem, do hidrolisado de celulase líquido obtido por meio de separação de sólidos e líquidos do hidrolisado de celulase, para recuperar um líquido de açúcar do lado do permeado e recuperar um componente de enzima do lado do não permeado.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo componente de enzima ser utilizado como celulase derivada de fungo filamentoso na Etapa 3.