JP2010098951A - セルロース糖化酵素の簡易的回収・再利用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】簡易的な方法による酵素の回収・再利用を提供する。
【解決手段】酵素が作用するように前処理が施されたリグノセルロース原料に、セルロース加水分解酵素を添加してC6糖であるグルコースやC5糖を得るリグノセルロースのバッチ式またはセミバッチ式の糖化方法であり、加水分解されず、かつ添加した酵素が付着しているリグノセルロース残渣を次回分の酵素糖化に再利用する。
【選択図】なし
【解決手段】酵素が作用するように前処理が施されたリグノセルロース原料に、セルロース加水分解酵素を添加してC6糖であるグルコースやC5糖を得るリグノセルロースのバッチ式またはセミバッチ式の糖化方法であり、加水分解されず、かつ添加した酵素が付着しているリグノセルロース残渣を次回分の酵素糖化に再利用する。
【選択図】なし
Description
本発明は、リグノセルロース系バイオマスを酵素で糖化し、エタノールや生分解性プラスチックの原料となる乳酸の発酵原料となるグルコース等を製造する技術に関する。特に、本発明は、リグノセルロース材料を基質とし、簡易的な方法で一度利用した糖化酵素を回収・再利用できる工業的方法に関する。
セルロースを構成糖であるグルコースに加水分解する方法は大きく分けて2つの方法がある。一つは硫酸等の鉱酸を用いる酸糖化法であり、もう一つは酵素やその酵素を生産する微生物を用いる酵素糖化法である。前者は技術的に完成されてはいるが、過分解物等が生成する問題のほかに、硫酸の中和や回収にも課題が残る。後者については、近年、米国を主導とした開発が加速して酵素価格が下がる動向ではあるが、実用化には更なる酵素価格の低減が不可欠である。
その対策として、酵素添加量を低減させる方法、あるいは一度使用した酵素を回収して再利用する方法が提唱されている。
例えば、Woodらはmixed waste office paperに酵素製剤を添加して併行糖化発酵を行う際に、240分に15分の割合で超音波を照射することで酵素の使用量を半減することが出来たと報告している。また、超音波によって繊維が弛緩されるのみならず、酵素がセルロース繊維に吸着されたのを剥離させ、再び新しいドメインに転移、作用させる効果があるためであると考察している(非特許文献1、2)。
また、非特許文献3には、蒸煮・爆砕処理したシラカンバ材を5%の濃度で糖化槽に加え、2万単位のセルラーゼを添加して、限外ろ過により糖液と酵素液とを分離し、酵素を回収再利用しながら、8日間で2kgのシラカンバ材から単糖類を630g得ている。この方法で酵素の使用量を20%節約できたと報告している。ただし、20%の節約では実用化には至らず。
さらに、非特許文献4には、アルカリ前処理したバガスをセルラーゼで糖化した低濃度糖液から、分画分子量10,000から20,000の限外ろ過膜を用いて酵素90%を回収。酵素の添加率は反応液1mL当たり30〜200単位で、基質1gに対する添加率はCMCaseで1,000〜2,800単位。ろ紙分解活性では45〜128単位(CMCaseが720単位のとき、ろ紙分解活性が33単位として計算)と考えられるが、この条件で糖化率は80%であった。一方、高濃度糖液の場合は糖化残渣が多くなり、この残渣にセルラーゼが吸着されて酵素回収量は75〜80%となったと報告されている。以上のような観点から、糖化装置の設計においても酵素を限外ろ過膜で回収・再利用する方法が検討されている(特許文献1〜3)。
特許文献4では、7L 容量のスラリー中、コピー用紙が1.25%(w/w,絶乾)となるように懸濁し、攪拌速度180rpmで攪拌し、この基質を糖化反応槽へ連続的に送り出す。
糖化反応槽の液量は3kg、コピー用紙濃度は0.25%(w/w,絶乾)とし、酵素添加量はコピー用紙1gあたり260単位で滞留時間は12時間、50℃、250−300rpmの条件で運転。反応液は反応液貯留槽に送られ、限外ろ過装置で回収された酵素は糖化反応槽に戻される。1,000時間に及ぶ連続運転に際し、糖化率は98%以上を保っていた。投入する基質に対する残渣の蓄積量を5%以下に保つことで新たな酵素を追加せずに繰り返し、回収・再利用することが可能と報告されている。
ウッド・ビー・イー(Wood,B.E.)、アルドリッチ・エイチ・シー(Aldrich,H.C.)、イングラム・エル・オー(Ingram,L.O.)著、「Biotechnol.Prog.」,1997年、第13巻、p.232−237 トム・ピー(Tomme,P.)、ウォーレン・エイ・ジェイ(Warren,A.J.)、ミラー・ティー・シー・ジェイ(Miller,T.C.J.)、キルバーン・ディー・ジー(Kilburn,D.G.)、ギルケス・エム・アール(Gilkes,M.R.)著、「Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates」J.N.Saddler版)、ACS Symposium Ser、ACS,サン・ディエゴ、CA、1995年、第618巻,p.145−163, イシハラ・エム(Ishihara,M.)ら著、「Biotechnol.Bioeng.」,1991年、第37巻,p.948−954 安戸 饒著、木材学会誌,1989年、第35巻、第12号,p.1067−1072 特開昭61−260875号公報
特開昭61−234790号公報
特開昭63−87994号公報
特開2006−87319号公報
ウッド・ビー・イー(Wood,B.E.)、アルドリッチ・エイチ・シー(Aldrich,H.C.)、イングラム・エル・オー(Ingram,L.O.)著、「Biotechnol.Prog.」,1997年、第13巻、p.232−237 トム・ピー(Tomme,P.)、ウォーレン・エイ・ジェイ(Warren,A.J.)、ミラー・ティー・シー・ジェイ(Miller,T.C.J.)、キルバーン・ディー・ジー(Kilburn,D.G.)、ギルケス・エム・アール(Gilkes,M.R.)著、「Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates」J.N.Saddler版)、ACS Symposium Ser、ACS,サン・ディエゴ、CA、1995年、第618巻,p.145−163, イシハラ・エム(Ishihara,M.)ら著、「Biotechnol.Bioeng.」,1991年、第37巻,p.948−954 安戸 饒著、木材学会誌,1989年、第35巻、第12号,p.1067−1072
超音波を照射して基質から酵素を剥離させ、再び新しい反応ドメインに転移、作用させる、あるいは限外ろ過膜による酵素の回収・再利用を工業規模で実施するには、前者には多大なイニシャルコスト、後者には膜再生等のメンテナンス作業の発生が予想される。事業化を進めるうえでは、更に簡易的な方法による酵素の回収・再利用が望ましい。
上記課題を解決するため、本発明のリグノセルロースのバッチ式またはセミバッチ式の糖化方法は、酵素が作用するように前処理が施されたリグノセルロース原料に、セルロース加水分解酵素を添加してC6糖であるグルコースやC5糖を得るリグノセルロースのバッチ式またはセミバッチ式の糖化方法であり、加水分解されず、かつ添加した酵素が付着しているリグノセルロース残渣を次回分の酵素糖化に再利用することを特徴とするものである。
本発明において用いられるリグノセルロース原料とは、例えば針葉樹、広葉樹等の木材(間伐材、製材時の端材・おが屑、あるいはコンクリート型枠や解体家屋由来の建築廃材)、ヤシ類を中心とした南洋材(幹および実の外殻)、稲藁、麦藁、バガス、コーンストーバーなどの農業残渣、そして大型藻類や微細藻類等の植物組織を指す。
そして、「酵素が作用するように前処理が施された」とは、植物組織の強度を司り、セルロースおよびヘミセルロースを包埋するように存在するリグニン(リグノセルロースの20〜30%を占める)をアルカリや酸を加えた条件下で蒸煮、或いはそれらを加えない蒸煮や水蒸気爆砕等によって除去するとともに、強固なセルロースの結晶構造の弛緩も図ることを指す。また、このような前処理が既に施された原料として、前述した針葉樹や広葉樹由来の紙が挙げられる。
紙は、木材から、機械的あるいは化学的に繊維を取り出し、これを剥いて薄いシートにしたものである。特に化学パルプは、セルロース繊維を包埋するリグニンがほぼ取り除かれており、酵素糖化に好適なリグノセルロース原料と見なすことができる。また、紙(繊維)は容易に細断でき、これを絶乾重量で10%の懸濁液(スラリー)に調製したものが流動限界であり、これは他のリグノセルロース原料のそれよりも高濃度である。例えば硬い木材は微粉化に多大なコストを要するだけでなく、微粉化しても紙ほど高濃度スラリー化はできない。このため、連続、バッチ式酵素糖化法に関係なく、濃い糖化液が得られないという欠点があるが、この欠点をある程度補える紙は、好適な原料である。
なお、機械パルプは古紙としての回収ルートが確立され、高い回収率で有効に再利用されているが、化学パルプは印刷用紙、コピー用紙などの事務用紙、包装用紙などに使用され、オフィス系紙ごみとして廃棄されることが多い。古紙リサイクルに含まれない紙資源として、都市ごみ焼却施設に持ち込まれ焼却処分される紙ごみ(主にオフィス系)の割合は都市部において約40%を占める。また、収集システムを新たに構築・整備する必要がないうえ、安定供給も期待できる。なお、コピー用紙などの上中質紙には白さと表面の滑らかさを出すため、化学パルプ以外に填料として炭酸カルシウムが数%含有されているが(ぷりんとぴあ、http://www.jfpi.or.jp/printpia/kami/story08.htm)、強酸性(pH4.8)付近では溶解性が増す。酵素糖化時のpHは更に低いため、ほぼ溶解して糖化液中に遊離していると思われる。
好ましくは、酵素が作用するよう前処理を施したリグノセルロースを2〜10%[dry wt/wt]のスラリーに調整し、該スラリーにリグノセルロース1%絶乾重量当たり200〜1000単位の糖化酵素を添加し、24〜72時間糖化処理する。
好ましくは、リグノセルロース糖化液に対して、減圧留去または炭素数2〜4個のアルコール(例えば、エタノール、ブタノール等)を添加した共沸を行うことによって、リグノセルロース糖化液をエタノール発酵に適した10〜15%の濃度に濃縮する。
好ましくは、前記リグノセルロース糖化液に対して、限外ろ過膜を用いて濃縮する。
好ましくは、リグノセルロース糖化液を静置することで沈殿するリグノセルロース残渣を回収し、回収した全量または一部を次回分のリグノセルロースの酵素糖化に再利用酵素として添加する。
好ましくは、前記リグノセルロース残渣の次回の処理への再利用を複数回にわたって繰り返して行う。
一回分の糖化処理では可溶化されずに酵素が付着したまま残渣となったリグノセルロースが次回分の糖化処理において可溶化、構成糖まで変換され、未反応残渣量を低減できる。
好ましくは、前記リグノセルロース原料は、従来の古紙回収システムには含まれず、都市ごみ焼却場で焼却処分されていた紙ごみに由来するもの、より好ましくは、オフィス系紙ごみに由来するものである。
本発明によると、残渣に付着した酵素をpH調整や超音波等を駆使して剥離させることなく、残渣ごと再利用することができ、簡易に糖化処理を行うことができる。
一方、酵素の回収・再利用を前提とした連続式酵素糖化法に関する前述の特許文献4を例に挙げると、以下の問題点がある。例えば、化学パルプ由来のコピー用紙中のセルロース含量は原料(樹種)、製法、ロット等の違いによって一定ではないが、概ね50〜60%の範囲と考えられる。セルロース比を50%と仮定すると、特許文献4に記載の0.25%濃度の紙スラリーから得られるグルコース溶液濃度は、糖化率100%とした理論値でも0.25×0.5×1.111=0.138(%)程度であり、この極めて希薄な糖液をそのままエタノール発酵に適用するのは効率的ではない。少なくとも10〜15%グルコース溶液まで限外ろ過膜等で濃縮してからの適用が望ましい。実用化を考慮すると、リグノセルロースを酵素処理して得られる糖化液中のグルコース濃度はできる限り高い方が望ましく、仮に10〜15%濃度に至らずとも、0.138%ではなく5%グルコース溶液を濃縮する方が低コストなのは明らかである。また、同特許では、12時間程度で98%以上の糖化率を示すよう、コピー用紙重量あたり大量の酵素が反応系内に添加されているが、工業規模での連続処理においてトラブル(制御系故障による酵素の失活、破損による反応液流失など)が発生した場合の酵素費用損失リスクは極めて大きいと考えられる。
これに対して、本願発明では、リグノセルロース糖化液に対して、減圧留去または炭素数2〜4個のアルコールを添加した共沸を行うことによって、リグノセルロース糖化液をエタノール発酵に適した10〜15%の濃度に濃縮するか、または、限外ろ過膜を用いて濃縮することにより、上記のような問題点は解消される。
(濃い糖化液を得る方法)
リグノセルロースを酵素糖化して濃い糖液を得るためには、少なくとも処理懸濁液中のリグノセルロースは、それを達成できる濃度にしておくことが大前提である。前項で述べた通り、紙は10%懸濁液程度が流動限界である。ただし、紙は酵素により可溶化して粘度が低下するため、紙を段階的に投入して10%よりも濃い懸濁液とすることも可能ではある。しかし、その場合、糖化液中に最終産物であるグルコース、あるいはその2量体のセロビオースの絶対量が多くなり、これらによって酵素活性は阻害され、糖化率が低下することが知られている。以上の点を踏まえた検証実験により、現時点では紙10%懸濁液が最も効率的であると判断した。これを上限濃度としたバッチ式酵素糖化処理の具体例を以下に述べる。
リグノセルロースを酵素糖化して濃い糖液を得るためには、少なくとも処理懸濁液中のリグノセルロースは、それを達成できる濃度にしておくことが大前提である。前項で述べた通り、紙は10%懸濁液程度が流動限界である。ただし、紙は酵素により可溶化して粘度が低下するため、紙を段階的に投入して10%よりも濃い懸濁液とすることも可能ではある。しかし、その場合、糖化液中に最終産物であるグルコース、あるいはその2量体のセロビオースの絶対量が多くなり、これらによって酵素活性は阻害され、糖化率が低下することが知られている。以上の点を踏まえた検証実験により、現時点では紙10%懸濁液が最も効率的であると判断した。これを上限濃度としたバッチ式酵素糖化処理の具体例を以下に述べる。
まず、5〜10%懸濁液として調製した紙スラリーに糖化酵素(GC220 Genencor製)を添加し、至適温度(50〜65℃)、pH(4.0〜5.5)下で攪拌しながら24〜72時間、糖化処理する。糖化率は紙重量あたりの酵素添加量によって変動するが、充分な酵素添加量の場合、糖化率は90%以上が見込まれる。供試する上質紙のセルロース含有量は55%、糖化率は90%とすると、5および10%紙スラリーから酵素糖化処理で得られるグルコース溶液濃度は以下の通りである。
(1)5%紙スラリー:5×0.55×0.9=2.47(%のグルコース溶液)
(2)10%紙スラリー:10×0.55×0.9=4.95(%のグルコース溶液)
以上の方法により、最高で5%弱のグルコース溶液が得られる。これをエタノール発酵に適した10〜15%まで濃縮する場合、2〜3倍程度の濃縮で良いため、限外ろ過膜を使用せず、減圧留去により水分を除去することも可能であり、再利用可能なエタノールやブタノールを糖化液に混入して共沸させれば、より効率的に濃縮できる。或いは5%濃度のままエタノール発酵に適用することも可能である。特許文献4のように糖化液中のグルコース濃度が0.14%程度では、これらの方法は成立しない。
(2)10%紙スラリー:10×0.55×0.9=4.95(%のグルコース溶液)
以上の方法により、最高で5%弱のグルコース溶液が得られる。これをエタノール発酵に適した10〜15%まで濃縮する場合、2〜3倍程度の濃縮で良いため、限外ろ過膜を使用せず、減圧留去により水分を除去することも可能であり、再利用可能なエタノールやブタノールを糖化液に混入して共沸させれば、より効率的に濃縮できる。或いは5%濃度のままエタノール発酵に適用することも可能である。特許文献4のように糖化液中のグルコース濃度が0.14%程度では、これらの方法は成立しない。
(酵素の回収・再利用方法)
上記の方法で得られた紙の糖化液(グルコース溶液)中には未反応残渣も懸濁しており、これは反応槽の攪拌を止めて静置しておくと、2時間程度で沈殿するため、固液分離も容易である。なお、糖化酵素であるセルラーゼは、セロビオハイドラーゼ(CBH)、エンドグルカナーゼ(EG)およびβ−グリコシダーゼ(BGL)の3種類に大きく分類され、その中でもCBHの反応機構に関しては、これまでの酵素にはないprocessivity(反応終了後に残った生成物の一方が遊離しないで次の基質となる)という新しい概念が出されている(森川康著、「セルロース系バイオマスの酵素糖化」、化学工学、71(12)、p.27−30(2007)参照)。また、ほとんどのセルラーゼはセルロース結合領域(Cellulose binding domain:CBD)など、糖質結合モジュール(carbohydrate binding module:CBM)を有したモジュラー酵素である(Cazy(Carbohydrate-active Enzymes),http://www.cazy.org/)。つまり、セルラーゼは基質であるセルロースと結合した状態で機能することから、沈殿した未反応残渣には多くの酵素が結合し残存している。沈殿という簡易的方法で回収した残渣を酵素として次回分糖化処理に再利用することで、酵素の節減が可能となる。
上記の方法で得られた紙の糖化液(グルコース溶液)中には未反応残渣も懸濁しており、これは反応槽の攪拌を止めて静置しておくと、2時間程度で沈殿するため、固液分離も容易である。なお、糖化酵素であるセルラーゼは、セロビオハイドラーゼ(CBH)、エンドグルカナーゼ(EG)およびβ−グリコシダーゼ(BGL)の3種類に大きく分類され、その中でもCBHの反応機構に関しては、これまでの酵素にはないprocessivity(反応終了後に残った生成物の一方が遊離しないで次の基質となる)という新しい概念が出されている(森川康著、「セルロース系バイオマスの酵素糖化」、化学工学、71(12)、p.27−30(2007)参照)。また、ほとんどのセルラーゼはセルロース結合領域(Cellulose binding domain:CBD)など、糖質結合モジュール(carbohydrate binding module:CBM)を有したモジュラー酵素である(Cazy(Carbohydrate-active Enzymes),http://www.cazy.org/)。つまり、セルラーゼは基質であるセルロースと結合した状態で機能することから、沈殿した未反応残渣には多くの酵素が結合し残存している。沈殿という簡易的方法で回収した残渣を酵素として次回分糖化処理に再利用することで、酵素の節減が可能となる。
これに対し、pH調整や超音波処理によって残渣から酵素を剥離させ、更には限外ろ過膜を使って回収する工程の付帯には更なるコストおよびメンテナンスの付帯が見込まれる。特許文献4においては、少ない基質に対して充分な酵素を添加することによって、短時間に全基質を可溶化、糖化させることで、反応系内に酵素が付着する残渣が発生しないように留意。そして、糖化反応槽から薄い糖化液を排出し、この中に遊離している酵素を限外ろ過膜で回収・再利用することに主眼が置かれてはいるが、限外ろ過膜に依存したシステムであることに変わりはない。
本発明は、残渣に付着した酵素をpH調整や超音波等を駆使して剥離させることなく、残渣ごと簡易的に再利用するスタンスである。紙は、10%スラリーが流動限界と前述したが、セルラーゼを添加した直後から可溶化が進み、流動性が向上してさらさらとなる。粘度が低くなった前回分の糖化残渣の全量は、同等の糖化力を有す酵素製剤よりも多いが、これを次回分の新しい紙スラリーに添加しても、流動性に大きな問題はない。仮に流動性に若干の問題がある場合も、新しい紙の投入を段階的に実施すれば解決できる。
ただし、残渣を除いた糖化液の濃縮に際し、減圧留去法ではなく、限外ろ過膜法を採用する場合は、特許文献1〜4と同じように糖化液中に遊離した酵素の回収・再利用も併せることが望ましく、より酵素の節約が図れる。また、再利用酵素の糖化力が不十分な場合は、新しい酵素を補充する必要があるのは言うまでもない。
(実施例1:濃い糖化液の製造)
標準紙サンプルとして、市販の化学パルプ由来の上質OA紙(コピー用紙)の同ロットをまとめて購入し、シュレッダーで細断した後、乾燥機中で絶乾させたものを全試験に供試した。これを蒸留水中、2.5〜10%濃度になるよう計量して懸濁させ、100mL容量のスラリーとして酵素糖化試験に適用した。なお、使用した酵素製剤はGenencor社製、Trichoderma reesei由来のGC220(液状)であり、力価はCMC(カルボキシメチルセルロース)糖化活性として6,200単位/g、比重は1.1〜1.2の表示であった。この酵素を紙の総重量あたり、1〜20%(wt/wt)になるように添加し、図1に示す実験系で50℃、pH4.0、200rpmの条件下で32〜72時間処理した。酵素糖化実験時のリグノセルローススラリーは、50mM酢酸緩衝液化することが報告されているが、実用を考慮してより単価の低い硫酸のみでpH調整した(酢酸と硫酸の違いによる糖化率の差は認められなかった)。
標準紙サンプルとして、市販の化学パルプ由来の上質OA紙(コピー用紙)の同ロットをまとめて購入し、シュレッダーで細断した後、乾燥機中で絶乾させたものを全試験に供試した。これを蒸留水中、2.5〜10%濃度になるよう計量して懸濁させ、100mL容量のスラリーとして酵素糖化試験に適用した。なお、使用した酵素製剤はGenencor社製、Trichoderma reesei由来のGC220(液状)であり、力価はCMC(カルボキシメチルセルロース)糖化活性として6,200単位/g、比重は1.1〜1.2の表示であった。この酵素を紙の総重量あたり、1〜20%(wt/wt)になるように添加し、図1に示す実験系で50℃、pH4.0、200rpmの条件下で32〜72時間処理した。酵素糖化実験時のリグノセルローススラリーは、50mM酢酸緩衝液化することが報告されているが、実用を考慮してより単価の低い硫酸のみでpH調整した(酢酸と硫酸の違いによる糖化率の差は認められなかった)。
図2の通り、5%紙スラリーによる酵素糖化基礎実験では、希硫酸を加えた上での熱処理には特に前処理としての効果はなく、無処理と同等の糖化率だった。紙の場合、あくまでも糖化率は酵素添加量のみに依存し、前処理効果はないという結果が得られた。そして、酵素GC220の場合は、紙絶乾重量あたり、少なくとも5%[wt/wt]を添加しなければ満足な糖収率は得られないことがわかった。酵素単価の見通し、および採算性の面から、紙絶乾重量あたりの添加量は5%[wt/wt]が上限と概算し、この添加量を大前提として、以降の実験を遂行した。なお、GC220の比重を1.1として上記の添加量5%[wt/wt]を力価に換算すると、紙1gあたりCMC糖化活性として340単位となる。
図3に紙スラリー濃度を、2.5、5、10%とし、紙絶乾重量あたり酵素をそれぞれ5%[wt/wt]添加した場合のグルコース収量の推移を示す。紙の絶対量に比例してグルコース収量は上がるものの、紙濃度を分母としたグルコースへの転換率で示すと順位は逆転し、10%紙スラリーのそれが最も低くなった(図4)。この原因は、10%スラリーは紙の絶対量が多いため、糖化液中にグルコースおよびセロビオースがより多く生成され、酵素活性が阻害されたことによると考えられた。特に図5に示す通り、セロビオースの生成は2.5や5%スラリーのそれらよりも著しく多かった。そこで、GC220を5%[wt/wt]添加した8時間および24時間後に、Aspergillus niger由来のセルラーゼ(ヤクルト薬品工業製:Y−2NC、セルラーゼ65%、デキストリン35%の凍結乾燥粉末でCMC力価表示60,000単位/g)をそれぞれ0.5%[wt/wt]添加する追加試験を実施した。
図6に示すように、GC220だけでは32時間時点で2.5%程度だったグルコース濃度は4%まで向上し、72時間目には5%弱に達した。以上の結果より、10%紙スラリーからは、少なくとも72時間処理で5%弱のグルコース溶液が得られることが解かったが、グルコース濃度4%に達する32時間程度で処理を終了することが反応効率上は望ましいと考える。なお、共試した標準紙のセルロース含量は53.6%であり(表1)、これをもとに計算すると以下の通り、糖化率は約90%となる。
8時間後にY−2NCを0.5%[wt/wt]添加:4.8÷(10×0.536)×100=89.5(%)
なお、セロビオースが反応液中に蓄積されると、酵素活性は阻害される。その対策として、セロビオースをグルコースに加水分解するβ−グリコシダーゼが豊富とされるA.niger由来のセルラーゼを併用すると、それが解消され、糖化率が向上するというのは周知の酵素反応である。
なお、セロビオースが反応液中に蓄積されると、酵素活性は阻害される。その対策として、セロビオースをグルコースに加水分解するβ−グリコシダーゼが豊富とされるA.niger由来のセルラーゼを併用すると、それが解消され、糖化率が向上するというのは周知の酵素反応である。
(実施例2:残渣の回収・再利用1)
前項で述べた通り、酵素GC220の場合は、紙絶乾重量あたり、少なくとも5%[wt/wt]を添加しなければ満足な糖収率は得られない。力価に換算すると、紙1gあたりCMC糖化活性として340単位が必要だったが、実用を考慮すると、この添加量を上限とし、満足な糖収率を得つつ、更に酵素量を節減することが望ましい。
前項で述べた通り、酵素GC220の場合は、紙絶乾重量あたり、少なくとも5%[wt/wt]を添加しなければ満足な糖収率は得られない。力価に換算すると、紙1gあたりCMC糖化活性として340単位が必要だったが、実用を考慮すると、この添加量を上限とし、満足な糖収率を得つつ、更に酵素量を節減することが望ましい。
この観点に基づいて、5%紙スラリーに紙絶乾重量あたり、5、10、20%[wt/wt]の酵素を添加して48時間処理して得られた残渣を回収し、それぞれを新しい紙スラリーに酵素として添加した場合の糖化率を検証した。図7に48時間の酵素糖化後のそれぞれの残渣量を示す。静置して2時間程度で沈殿し、24時間を経過すると見た目の体積の低下はほぼ止まった。酵素添加量が多いほど見た目の体積は小さく、20%添加で8mL vol、10%添加で12mL vol、そして5%添加で28mL volであった。
図8にこれらの上澄みを静かに除去し、若干の糖化液を含んだ残渣の全量をそれぞれ新しい紙5gに加え、最終的に100mL容量の5%紙スラリーになるようにメスアップ。これらを50℃、pH4.0の条件で32時間処理した結果を示す(コントロールとして同じ5%スラリーに新しい酵素5%[wt/wt]を添加したパターンも並行して実施)。いずれも前回分の糖化液が若干持ち込まれることによって、開始時(0時間目)には0.5%前後のグルコースが検出されるが、32時間後にはグルコース濃度1.2〜1.3%に達した。開始時のグルコース濃度を差し引くと、0.7〜0.8%であり、これは、図2に示した紙重量あたり1%の酵素を添加した場合のそれ(32時間後にグルコース濃度0.5%弱)よりも高い糖化力だった。なお、各糖の収率は図8の通りであるが、目視によるOA紙の可溶化は、上記残渣を加えたいずれの場合も処理化開始から2〜3時間で大幅に進み、スラリーの粘度が低下して攪拌効率が大幅に改善された。特にセロビオースの生成はコントロールのそれと遜色ないことから、CBHやEGは残渣に残っているものが充分、機能していたと推察される。
一方、各種残渣の次回分における糖化力がほぼ同等である点については、酵素添加量の増加(5、10、20%[wt/wt])に反比例して残渣量は低下(28、12、8mL vol)するが、残渣volあたりの酵素絶対量は異なるため、総合的には酵素総量が同じであったことによると推察する。つまり、残渣に吸着されたままの酵素を再利用する観点においては、5%[wt/wt]の酵素添加量が経済的であると考えられる。
以上の結果から、紙絶乾重量あたり5%[wt/wt]の酵素を添加して発生した1回分の残渣は、少なくとも1%[wt/wt]の新しい酵素と同等以上の糖化力が残っていると考えられた。
(実施例3:残渣の回収・再利用2)
前項で述べた通り、5%OA紙スラリーに紙絶乾重量あたり5%[wt/wt]の酵素を添加して48時間処理して発生した1回分の糖化残渣は、少なくとも1%[wt/wt]の新しい酵素と同等以上の糖化力が残っていると考えられた。この観点に基づいて、同残渣と糖化力を補充するために新しい酵素を5%OA紙スラリーに添加した場合の糖化率を検証した。
前項で述べた通り、5%OA紙スラリーに紙絶乾重量あたり5%[wt/wt]の酵素を添加して48時間処理して発生した1回分の糖化残渣は、少なくとも1%[wt/wt]の新しい酵素と同等以上の糖化力が残っていると考えられた。この観点に基づいて、同残渣と糖化力を補充するために新しい酵素を5%OA紙スラリーに添加した場合の糖化率を検証した。
図9に32時間酵素糖化後のグルコース収率を示す(コントロールとして同じ5%OA紙スラリーに新しい酵素5%[wt/wt]を添加したパターンも並行して実施)。実施例2と同じく前回分の糖化液が若干持ち込まれることによって、開始時(0時間目)には0.5%前後のグルコースが検出されるため、これを差し引いて評価したところ、残渣プラス新しい酵素3%[wt/wt]以上の併用でコントロールと同等もしくはそれ以上のグルコース収率が得られた。つまり、5%濃度のOA紙スラリーが対象の場合、前回分残渣を次回分に適用することにより、従来は5%[wt/wt]を要した酵素量を少なくとも3%[wt/wt]に削減できるという結果が得られた。
糖化酵素はセルロースをグルコースまで加水分解できるのであれば特に限定しないが、トリコデルマ(Trichoderma)属やアスペルギルス(Aspergillus)属、リゾプス(Rhizopus)属等の菌が生産するセルラーゼを主体とする酵素、あるいは商業的に大量生産されている酵素製剤を単独、あるいは併用して使用する。そして、酵素再利用の面からは、時間および熱に対する安定性を高めるため、構成タンパクの改変等が施されている酵素がより望ましい。なお、市販の酵素製剤に表示してあるCMC糖化活性、ろ紙崩壊力などの力価はあくまでも参考値でしかなく、処理対象となるリグノセルロース原料から満足な糖収率を得るために最適な添加量を原料毎に検証することが重要である。
以上、既に脱リグニンされた紙を対象とした実施例を紹介したが、これらの方法、特に酵素の再利用方法は、紙のみならず、他のリグノセルロース資源、例えば針葉樹、広葉樹などの木材、ヤシ類を中心とした南洋材(幹および実の外殻)、稲藁、麦藁、バガス、コーンストーバーなどの農業残渣、そして大型藻類や微細藻類等の酵素糖化にも応用することが可能である。
本発明により、従来よりも酵素使用量を削減することができ、ひいてはリグノセルロース原料から糖類を製造する経済性を高めることが可能となる。これによって糖類を発酵基質としてエタノールや乳酸、その他の化成品を生産・供給する産業全般の経済性も高めることのみならず、糖蜜やデンプンなど、食料に成り得るものを前述の用途に適用するといった道義的問題も回避することに繋がる。
Claims (8)
- 酵素が作用するように前処理が施されたリグノセルロース原料に、セルロース加水分解酵素を添加してC6糖であるグルコースやC5糖を得るリグノセルロースのバッチ式またはセミバッチ式の糖化方法であり、
加水分解されず、かつ添加した酵素が付着しているリグノセルロース残渣を次回分の酵素糖化に再利用することを特徴とするリグノセルロースのバッチ式またはセミバッチ式の糖化方法。 - 酵素が作用するように前処理を施したリグノセルロースを2〜10%[dry wt/wt]のスラリーに調整し、該スラリーにリグノセルロース1g絶乾重量当たり200〜1000単位の糖化酵素を添加し、24〜72時間糖化処理することを特徴とする請求項1記載のリグノセルロースのバッチ式またはセミバッチ式の糖化方法。
- リグノセルロース糖化液に対して、減圧留去または炭素数2〜4個のアルコールを添加した共沸を行うことによって、リグノセルロース糖化液をエタノール発酵に適した10〜15%の濃度に濃縮する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記リグノセルロース糖化液に対して、限外ろ過膜を用いて濃縮する、請求項1または2に記載のリグノセルロースの糖化方法。
- リグノセルロース糖化液を静置することで沈殿するリグノセルロース残渣を回収し、回収した全量または一部を次回分のリグノセルロースの酵素糖化に再利用酵素として添加する、請求項1または2に記載のリグノセルロースのバッチ式またはセミバッチ式の糖化方法。
- 前記リグノセルロース残渣の次回の処理への再利用を複数回にわたって繰り返して行う、請求項1〜5のいずれか1つに記載のリグノセルロースのバッチ式またはセミバッチ式の糖化方法。
- 前記リグノセルロース原料は、従来の古紙回収システムには含まれず、都市ごみ焼却場で焼却処分されていた紙ごみに由来するものである、請求項1〜6のいずれか1つに記載のリグノセルロースのバッチ式またはセミバッチ式糖化方法。
- 前記リグノセルロース原料は、オフィス系紙ごみに由来するものである、請求項7に記載のリグノセルロースのバッチ式またはセミバッチ式糖化方法。
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