BRPI0805560A2 - processo de produção de um preparado enzimático para hidrólise de celulose de resìduos lignocelulósicos e sua aplicação na produção de etanol - Google Patents

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Abstract

PROCESSO DE PRODUçãO DE UM PREPARADO ENZIMáTICO PARA HIDRóLISE DE CELULOSE DE RESìDUOS LIGNOCELULóSICOS E SUA APLICAçãO NA PRODUçãO DE ETANOL O processo da presente invenção baseia-se na produção microbiana de enzimas realizada a partir do crescimento do fungo Penicilllum funiculosum em meio de cultivo adaptado com substrato celulósico. O processo da invenção compreende especialmente o tratamento fermentativo de um substrato lignocelulósico por meio de um fungo especialmente adaptado, visando à obtenção de um preparado enzimático capaz de hidrolisar a celulose e a hemicelulose para a produção de etanol.

Description

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM PREPARADO ENZIMÁTICO PARAHIDRÓLISE DE CELULOSE DE RESÍDUOS LIGNOCELULÓSICOSE SUA APLICAÇÃO NA PRODUÇÃO DE ETANOL
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção trata da produção de um preparado enzimáticoa partir de processo microbiológico, capaz de hidrolisar as fraçõeshemicelulósicas e celulósicas das fibras de resíduos lignocelulósicosprovenientes de ambientes florestais e agroindustriais. O objetivo desteprocesso hidrolítico é gerar altas concentrações de açúcares do tipoglicose e significantes concentrações de xilose que podem serfermentadas por microrganismos com o objetivo de produzir etanol.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
O Brasil possui um excedente substancial de resíduosagroindustriais e agro-florestais sendo um dos maiores produtores deetanol e celulose do mundo. Por conseqüência, uma tecnologia queviabilize a produção de etanol a partir destes resíduos lignocelulósicosexcedentes, além de contribuir para a solução de problemas ambientais,agregará valor a estes excedentes agroindustriais e agro-florestais,gerando vantagens econômicas para o país.
Para que se possa realizar o aproveitamento das fraçõespolissacarídicas visando à produção de etanol é necessário hidrolisarestas frações eficientemente.
O fracionamento desses polissacarídeos é efetuado através de umpré-tratamento, que consiste de uma reação conhecida como hidróliseácida que objetiva a hidrólise da fração hemicelulósica. O sólido resultantedesta etapa, rico na fração celulósica, ainda precisa ser tratado com oobjetivo de remover a Iignina solúvel sob condições alcalinas para garantira acessibilidade das enzimas à fibra celulósica.
A conversão de celulose em etanol envolve dois passosfundamentais: hidrólise das longas cadeias das moléculas de celulose emaçúcares (glicose) e fermentação desses açúcares em etanol. Nanatureza, esses processos são encetados por fungos e bactérias, quesecretam as enzimas capazes de hidrolisar a celulose (chamadascelulases), e principalmente por leveduras, quando se trata dafermentação dos açúcares em álcool.
A maior dificuldade que precisa ser superada se refere ao própriomicrorganismo, que precisa ser resistente às condições operacionais,principalmente no que tange às concentrações de inibidores gerados nomeio reacional.
Atualmente, um dos grandes gargalos para a produção bioquímicade etanol de segunda geração é a obtenção de um preparado enzimáticode baixo custo e que apresente uma boa eficiência de hidrólise depolissacarídeos como a celulose (cujo monômero é a glicose) ehemicelulose (heteropolímero cujo monômero principal é a xilose).
A obtenção dessas enzimas vem sendo alvo de intensa pesquisapelo mundo, com participação de grandes empresas (inclusive petroleiras)e órgãos governamentais, e é fundamental para o desenvolvimento detecnologias denominadas "limpas".
Entretanto, os altos custos dessas enzimas inviabilizam sua grandeaplicação em escala comercial e impedem a implementação de plantasindustriais.
TÉCNICA RELACIONADA
A produção de etanol por tecnologia biológica vem sendo estudadade há muito, porém nos últimos anos sofreu um grande impulso. O grandeobstáculo a ser superado se refere à produtividade, ou seja, conseguir umprocesso economicamente viável e com bons rendimentos, utilizandomatéria-prima com grande disponibilidade e baixo valor agregado.
O documento de patente GB 2253633, que corresponde aodocumento de patente brasileiro Pl 9200100-9 de 15/01/92, descreve umprocesso para produzir etanol a partir de biomassa em que o substratoinclui um hidrolisado de celulose, hemicelulose e amido, visando produziraçúcares fermentáveis de seis carbonos. Para a fermentação é utilizadauma cepa de levedura geneticamente modificada (Brettanomyces custersiiCBS 5512) que produz a enzima β-glucosidade, o que torna esta leveduracom habilidade de fermentar tanto glicose quanto celobiose. No entanto,ainda permanece sem solução a fermentação de pentoses.
Torget e colaboradores (US 5,705,369) descrevem um processogenérico de pré-hidrolise de materiais lignocelulósicos em que sãoinvestigadas diferentes combinações de faixas de temperatura e de tempode reação, visando obter melhor percentual de separação de hemicelulosee lignina da celulose.
Warzwoda e colaboradores (BR 0600409-1) descrevem umprocesso de produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas a partirde resíduos (madeiras de espécies folhosas e palhas de cereais). Taisresíduos são utilizados como fonte de carbono indutora para obtençãodessas enzimas, utilizando-se cepas de Trichoderma reeseigeneticamente melhoradas e notadamente recombinadas. As cepasselvagens deste microorganismo têm a capacidade de secretar, empresença de um substrato indutor (a celulose, por exemplo), o complexoenzimático considerado o mais adaptado à hidrólise da celulose. Trata-se,portanto, de um processo para produção de enzimas celulolíticas e/ouhemicelulolíticas produzidas pela cepa especializada.
Santa Anna e colaboradores (BR 0505299-8) ensinam um processopara produção de etanol visando o tratamento do resíduo sólido resultanteda hidrólise ácida de bagaço de cana. Segundo este processo umhidrolisado da fração hemicelulósica do bagaço de cana, rico em xilose, foiobtido por meio da hidrólise branda com ácido sulfúrico diluído, efermentado utilizando-se uma cepa da levedura Pichia stipitisadequadamente aclimatada ao substrato principal do hidrolisado (xilose).O resíduo sólido resultante da hidrólise ácida (celulignina) foi tratado nopróprio reator para remoção de lignina, através de uma série de lavagensalcalinas a fim de deixar as fibras celulósicas aptas a receberem umacarga enzimática.
Santa Anna e colaboradores (BR 0605017-4) descrevem umprocesso para obtenção de etanol a partir de materiais lignocelulósicos porvia enzimática segundo o qual a fração hemicelulósica é submetida a umahidrólise branda com ácido sulfúrico, e o material sólido resultante destahidrólise, submetido ao processo de sacarificação (hidrólise enzimática)simultânea à fermentação alcoólica rápida, em condições tais quepermitam aumentar significativamente a conversão em etanol em temposmuito reduzidos, utilizando altas concentrações de sólidos (15% a 25 %).
Chung e Day (WO 2008/095098) apresentam um processo paraobtenção de açúcares a partir de biomassa lignocelulósica no qual se fazum pré-tratamento alcalino a quente do material com uma mistura dehidróxido de cálcio e água à temperatura de 80°C a 140°C durante cercade 30 min a 3 horas. Após o tratamento, o bagaço é prensado; o líquidocontém principalmente componentes solúveis de lignina, além de cal (quepode ser recuperada) e o material sólido fibroso é submetido à hidrólisepor enzimas celulásicas. Segundo os autores, este tratamento modifica aestrutura lignocelulósica de modo que possa ser rapidamente solubilizadapela celulase, mesmo usando altos teores de sólidos (10% a 30%), semque a atividade enzimática seja afetada. Foram utilizadas enzimascomerciais, como por exemplo, Spezyme CP (Genecor International Co) eNovo I88 (Novozyme).
O objetivo do processo da presente invenção é oferecer umpreparado enzimático contendo enzimas preparadas in situ (ou dedicadas)de baixo custo, capaz de viabilizar economicamente o escalonamento datecnologia bioquímica para aplicação em processos de obtenção de etanola partir de materiais lignocelulósicos. O preparado obtido pode seraplicado ao sólido gerado após a hidrólise da fração hemicelulósica etambém a processos de fermentação que utilizam sacarificação simultânea(SSF), como os mencionados acima.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
O processo da presente invenção baseia-se na produção microbianade enzimas realizada a partir do crescimento do fungo em meio de cultivoadaptado com substrato celulósico.
A invenção tem por objetivo a produção das enzimas celulásicas porvia fermentativa utilizando o fungo Penicillium funiculosum, na qual podemser usados substratos sintéticos (como o avicel ou carboximetilcelulose -CMC), ou ainda os próprios resíduos lignocelulósico e agrofIorestais, innatura ou pré-tratados.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
O processo da presente invenção compreende especialmente otratamento fermentativo de substratos lignocelulósicos e agro florestais pormeio de um fungo especialmente adaptado, visando à obtenção de umpreparado enzimático capaz de hidrolisar a celulose e a hemicelulose paraa produção de álcool.
A invenção fundamenta-se na produção das enzimas celulásicas porvia fermentativa utilizando o fungo Penicillium funiculosum ATCC 11797,podendo ser usados substratos sintéticos, ou os próprios resíduoslignocelulósicos e agros florestais, in natura ou pré-tratados.
A etapa seguinte do processo compreende a concentração dasenzimas produzidas na fermentação, utilizando sistemas de membrana -como um sistema combinado de microfiltração e ultrafiltração, ou porevaporação - por exemplo, rotaevaporador. Finalmente, adiciona-se a esteconcentrado de enzimas um aditivo, de maneira a melhorar a atuação dasenzimas na quebra da celulose. Este aditivo compreende um biotensoativodo tipo glicolipídeo que promove o aumento da acessibilidade das enzimasà celulose e hemicelulose.
Para melhor compreensão do invento, o processo pode ser descritoresumidamente da seguinte maneira:
O fungo é colocado em contato com o substrato celulósico em ummeio de cultivo adaptado por um período de quatro a sete dias, para queas enzimas sejam produzidas. Durante este tempo, o microrganismo liberapara o meio de cultivo altas concentrações de proteínas com propriedadescatalíticas, ou seja, enzimas celulásicas e hemicelulásicas, tais comoxilanases, endoglucanases, exoglucanases e β-glucosidases, com afinalidade de quebrar as frações celulósicas e hemicelulósicas presentesno substrato. Após este período, o meio de cultivo contendo as enzimas ésubmetido a um processo de concentração pelo uso de membranas ouprocessos evaporativos, seguido de aditivação.
O preparado enzimático (extrato) foi produzido com materiaisresiduais da produção convencional de etanol, como por exemplo, bagaçoe palha de cana-de-açúcar, apresentando baixo custo de produção,permitindo que seja produzido in situ, tornando viável o escalonamento daprodução de etanol de segunda geração.
Também pode ser utilizado como fonte de Iignocelulose materialagro florestal, como por exemplo, cavacos e resíduos da indústria de papele celulose.
Os Exemplos que se seguem são apresentados a título de ilustraçãoapenas, não representando, todavia, qualquer tipo de limitação ao invento.
EXEMPLO 1
Neste Exemplo pretende-se demonstrar a potencialidade deutilização do processo agora proposto para a obtenção do preparadoenzimático.
Utilizando o processo da invenção conforme descrito em detalheanteriormente, foi possível produzir um extrato com altas concentrações deenzimas celulásicas, expressas em atividades enzimáticas (Ul/L) econcentrações protéicas (mg/L). A Tabela 1 a seguir apresenta o resultadoda medida de atividade enzimática dos extratos ao final da fermentação edepois da concentração.
TABELA 1
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Esses extratos enzimáticos concentrados foram testados noprocesso de hidrólise (sacarificação) da celulose e hemicelulose contidasno bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado, ou seja, submetido à hidrólisebranda e lavagens com aquecimento para remoção da lignina, e osresultados estão na Tabela 2.
A medida dos açúcares (glicose, xilose e celobiose) foi avaliadapelos métodos de cromatografia líquida (HPLC) e medidaespectrofotométrica de açúcares redutores totais (ART). Nesta tabela,também são apresentados, a título de comparação, resultados obtidoscom um preparado comercial (GENENCOR®), normalizada na mesmaconcentração enzimática por grama de celulose.
TABELA 2
<table>table see original document page 8</column></row><table>
A Tabela 2 apresenta as quantidades de glicose, proveniente dahidrólise da celulose. Observa-se também que, no extrato concentrado dainvenção, há enzimas xilanásicas que podem converter a hemicelulose emxilose, que também poderá ser aproveitada para conversão a etanol. Istocomprova que o extrato enzimático produzido poder ser aplicado emprocessos de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) esacarificação e co-fermentação simultâneas (SSCF).EXEMPLO 2
Este Exemplo tem por objetivo demonstrar a aplicabilidade dopreparado enzimático, objeto da presente invenção, na hidrólise deresíduo lignocelulósico pré-tratado por hidrólise branda e lavagens comconvencional de etanol de cana-de-açúcar.
O preparado enzimático foi aplicado em concentrações entre 5 e 30FPU/g, em temperaturas entre 30°C e 60°C, durante 6 a 48 horas desacarificação.
A concentração de glicose liberada após o tratamento variou de 10 a40 g/L).
Os resultados alcançados nos permitem afirmar ser esta umagrande vantagem do extrato produzido pelo processo da invenção, por P.funiculosum, em relação ao preparado comercial avaliado, pois sinalizaque esse pool enzimático produzido pode ser aplicado em processos desacarificação e co-fermentação simultâneas, que é uma forma decondução mais integrada e menos complexa em termos de equipamentos.
Outra vantagem do extrato de P. funiculosum é a elevada atividadeβ-glucosidásica, que permite a conversão de todo o dissacarídeo ceiobiosegerado em glicose (açúcar fermentável), enquanto que com o produtocomercial permanece uma quantidade residual de ceiobiose, umdissacarídeo que não pode ser aproveitado para obtenção de etanol, noprocesso fermentativo.
Outra vantagem observada é a ação sinérgica das enzimas destepreparado, na hidrólise da celulose e hemicelulose quebrando essespolissacarídeos a monômeros de açúcares, e não gerando açúcaresintermediários residuais não fermentáveis, que não são aproveitados paraa produção de etanol.
Além disso, foi produzido a partir de resíduos agroindustriais ouagros florestais abundantes no Brasil, e aplicado in situ na hidrólise dessesmesmos resíduos, inclusive resíduos com composições distintas, obtendo-se produtividade superior ou similar àquela resultante de produtoscomerciais.
Outra grande vantagem desta invenção esta relacionada ao altocusto das enzimas celulásicas oferecidas no mercado, fato que até entãoeram impeditivos ao escalonamento da tecnologia bioquímica deconversão de materiais celulósicos para etanol. Esta invenção possibilita aprodução destas enzimas "in situ" ou dedicadas, reduzindo fortemente ocusto de produção das mesmas.

Claims (8)

1.- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM PREPARADO ENZIMÁTICOPARA HIDRÓLISE DE CELULOSE DE RESÍDUOSLIGNOCELULÓSICOS, caracterizado por compreender as etapas de:- colocar o fungo em contato com o substrato celulósico em um meiode cultivo adaptado por um período de quatro a sete dias, para queas enzimas sejam produzidas;- submeter o meio de cultivo contendo as enzimas a um processo deconcentração pelo uso de membranas ou processos evaporativos eaditivação;- aplicar o extrato enzimático produzido no processo de hidrólise dacelulose e hemicelulose para a produção de açúcares fermentáveis.
2.- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM PREPARADO ENZIMÁTICOPARA HIDRÓLISE DE CELULOSE DE RESÍDUOSLIGNOCELULÓSICOS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopor o fungo utilizado ser o Penicillium funiculosum.
3.- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM PREPARADO ENZIMÁTICOPARA HIDRÓLISE DE CELULOSE DE RESÍDUOSLIGNOCELULÓSICOS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadogor o extrato enzimático produzido poder ser aplicado em processos desacarificação e fermentação simultâneas (SSF) e sacarificação e co-fermentação simultâneas (SSCF).
4.- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM PREPARADO ENZIMÁTICOPARA HIDRÓLISE DE CELULOSE DE RESÍDUOSLIGNOCELULÓSICOS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopor o material lignocelulósico compreender o bagaço de cana-de-açúcar innatura ou pré-tratado, submetido à hidrólise branda e lavagens comaquecimento para remoção da lignina; e por o material agro florestalcompreender cavacos e resíduos da indústria de papel.
5.- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM PREPARADO ENZIMÁTICOPARA HIDRÓLISE DE CELULOSE DE RESÍDUOSLIGNOCELULÓSICOS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopor o extrato enzimático produzido poder ser aplicado na hidrólise dacelulose e hemicelulose quebrando esses polissacarídeos a monômerosde açúcares, e não gerando açúcares intermediários residuais nãofermentáveis.
6. - PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM PREPARADO ENZIMÁTICOPARA HIDRÓLISE DE CELULOSE DE RESÍDUOSLIGNOCELULÓSICOS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadoEor o preparado enzimático ser produzido in situ, com materiais residuaisda produção convencional de etanol de cana-de-açúcar.
7. - PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM PREPARADO ENZIMÁTICOPARA HIDRÓLISE DE CELULOSE DE RESÍDUOSLIGNOCELULÓSICOS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopor o aditivo utilizado ser um biotensoativo do tipo glicolipídeo quepromove o aumento da acessibilidade das enzimas à celulose ehemicelulose.
8. - PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL POR HIDRÓLISE DECELULOSE DE RESÍDUOS LIGNOCELULÓSICOS, caracterizado porutilizar o preparado enzimático produzido in situ de acordo com areivindicação 1, com materiais residuais in natura e pré-tratados daprodução convencional de etanol de cana-de-açúcar, tais como bagaço epalha, e cavacos e materiais residuais da indústria de papel e celulose.
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