BR112016014736B1 - Método para a produção de um líquido de açúcar - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM LÍQUIDO DE AÇÚCAR A presente invenção se refere a um método para a produção de um líquido de açúcar a partir da biomassa que contém a celulose, que compreende: a etapa (1) da hidrólise da biomassa que contém a celulose por uma celulase derivada a partir de fungos filamentosos; e a etapa (2) de filtragem de um hidrolisado obtido na etapa (1) através de uma membrana de ultrafiltração para recuperar a celulase derivada a partir de fungos filamentosos como um não permeado e para se obter um líquido de açúcar como um permeado, em que a biomassa que contém a celulose é tratada com uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em pectinase, glucoamilase e lipase, em um estágio anterior para a etapa (1) ou na etapa (1). O método da presente invenção, de maneira mais eficiente, pode reduzir o consumo de enzima de sacarifi-cação na hidrólise da biomassa que contém a celulose do que os métodos convencionais.-

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere aos métodos para a produção de um líquido de açúcar, o qual é utilizável, por exemplo, em um material bruto de fermentação a partir da biomassa que contém a celulose.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os processos para a produção fermentativa para as substâncias químicas utilizando um açúcar como o material bruto são utilizados na produção de diversos materiais brutos industriais. Como açúcares que servem como materiais brutos para a fermentação, aqueles que são derivados a partir de materiais brutos comestíveis, tais como a cana de açúcar, amido e beterraba de açúcar são industrialmente utilizados no presente. No entanto, em vista do aumento dos preços dos materiais brutos comestíveis, devido ao aumento da população mundial no futuro ou a partir do aspecto ético da concorrência com a utilização comestível, a construção de processos para a produção de maneira eficiente de um líquido de açúcar a partir de um recurso não comestível renovável, isto é, a biomassa que contém a celulose ou os processos para converter, de maneira eficiente, o líquido de açúcar resultante em um material bruto industrial como o material bruto de fermentação é uma tarefa futuro.

[003] Como um método para a produção de líquido de açúcar a partir de um biomassa que contém a celulose, é conhecido um método para a produção de um líquido de açúcar através de hidrólise da biomassa que contém a celulose por um grande número de ácido sulfúrico diluído rebocado por um outro tratamento enzimático com a celulase ou similar (Documento de não Patente 1), em adição ao método para a produção de um líquido de açúcar através de hidrólise ácida de celulose e hemicelulose e por meio de um ácido sulfúrico normalmente conhecido concentrado. Como métodos sem a utilização de um ácido, está descrito um método para a produção de um líquido de açúcar através de um tratamento de água subcrítica da biomassa que contém a celulose em uma ebulição de 250 a 500°C, seguido por um tratamento enzimático de sacarificação adicional (Documento de Patente 1); e um método para a produção de um líquido de açúcar através de hidrólise da biomassa que contém a celulose por água quente pressurizada de 240 a 280°C, seguido por um tratamento enzimático de sacarificação adicional (Documento de Patente 2). Entre esses métodos, no momento são amplamente estudados os métodos para a hidrólise da biomassa, especialmente através da utilização de uma enzima de sacarificação, que fornece menos consumo de energia e apresente menos impactos ambientais, bem como mais rendimento de líquido de açúcar. Tais métodos com uma enzima de sacarificação, no entanto, envolvem desvantagens tais como o custo elevado de enzima.

[004] Para resolver o problema tecnológico mencionado acima envolvido nos métodos para a produção de líquido de açúcar através de um tratamento com a enzima de sacarificação, foram sugeridos os métodos para a recuperação para reutilizar a enzima de sacarificação utilizada na hidrólise. Por exemplo, estão descritos um método que compreende a realização da separação sólido-líquido contínua por meio de um filtro de centrifugação e filtragem do líquido de açúcar resultante através de uma membrana de ultrafiltração para recuperar uma enzima (Documento de Patente 3); e um método que compreende a introdução de um tensoativo para um estágio de sacarificação enzimática para a inibição da absorção da enzima, por conseguinte, aprimorando a eficiência de recuperação (Documento de Patente 4).

REFERÊNCIAS DO ESTADO DE PATENTE ANTERIOR DOCUMENTOS DE PATENTE

[005] Documento de Patente 1: Publicação Aberta do Pedido de Patente Japonesa 2001-95597; - Documento de Patente 2: Patente Japonesa 30 + 1.380; - Documento de Patente 3: Publicação Aberta do Pedido de Patente Japonesa 2006-87319; e - Documento 4: Publicação Aberta do Pedido de Patente Japonesa 563-87994

DOCUMENTO DE NÃO PATENTE

[006] Documento de não Patente 1: “Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover “NREL Relatório Técnico (2002).

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[007] Os métodos para a hidrólise da biomassa que contém a celulose utilizando uma enzima de sacarificação foram desenvolvidos conforme descrito acima, mas ainda são insatisfatoriamente eficientes do ponto de vista de reduzir o consumo de enzima de sacarificação. Por conseguinte, um objeto da presente invenção é o desenvolvimento de processos para a produção de um líquido de açúcar capaz de reduzir, de maneira mais eficiente, o consumo da enzima de sacarificação na hidrólise da biomassa que contém a celulose do que os métodos convencionais.

[008] A presente invenção engloba uma estrutura que consiste nos seguintes de [1] a [7] [1] Um método para a produção de um líquido de açúcar a partir da biomassa que contém a celulose, que compreende: - a etapa (1) da hidrólise da biomassa que contém a celulose por uma celulase derivada a partir de fungos filamentosos; e - a etapa (2) de filtragem de um hidrolisado obtido na etapa (1) através de uma membrana de ultrafiltração para recuperar a celulase derivada a partir de fungos filamentosos como um não permeado e para se obter um líquido de açúcar como um permeado, - em que a biomassa que contém a celulose é tratada com uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em pectinase, glucoamilase e lipase, em um estágio anterior para a etapa (1) ou na etapa (1); [2] O método para a produção de um líquido de açúcar, de acordo com [1], em que dita biomassa que contém a celulose é uma ou mais biomassas selecionadas a partir do grupo que consiste em biomassa de casca de grãos, palha e bagaço; [3] O método para a produção de um líquido de açúcar, de acordo com [2], em que dita biomassa de casca de grãos é uma ou mais biomassas selecionadas a partir do grupo que consiste em uma casca de milho, uma casca de soja, e uma casca de trigo; [4] O método para a produção de um líquido de açúcar, de acordo com qualquer uma de [1] a [3], em que o peso de ditas uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em pectinase, glucoamilase, e lipase é de 1/10 ou inferior com base no peso da celulase derivada a partir de fungos filamentosos; [5] O método para a produção de um líquido de açúcar, de acordo com qualquer um de [1] a [4], em que a biomassa que contém a celulose é tratada com as três enzimas, pectinase, glucoamilase, e lipase no estágio anterior à etapa (1) ou na etapa (1); [6] O método para a produção de um líquido de açúcar, de acordo com qualquer um de [1] a [5], em que a etapa (2) é uma etapa de filtração, através de uma membrana de ultrafiltração, um componente da solução obtida através de submeter o hidrolisado obtido na etapa (1) para a separação sólido-líquido; e [7] O método para a produção de um líquido de açúcar, de acordo com [6], em que dita separação sólido-líquido é realizada por meio de filtração por prensa.

[009] De acordo com a presente invenção, é possível aprimorar a quantidade da enzima de sacarificação para ser recuperada a partir das etapas de produção do líquido de açúcar utilizando a biomassa que contém a celulose como o material bruto.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[010] Cada uma das etapas da presente invenção será individualmente descrita abaixo.

ETAPA 1

[011] A etapa (1) é uma etapa de hidrólise da biomassa que contém a ceIuIose através de uma ceIulase derivada a partir de fungos filamentosos.

[012] A biomassa que contém a celulose utilizada na etapa (1) se refere aos biorecursos que contêm, pelo menos, a celulose. Os exemplos específicos da biomassa que contém a celulose incluem a biomassa herbácea como o bagaço, gramíneas do gênero Panicum (switchgrass), grama napier, Erianthus, palha ou forragem de milho (palha de arroz, palha de trigo / cevada); biomassa de madeira tais como as árvores e arbustos ou materiais de resíduos de construção; biomassa derivada do meio aquático, tais como as algas ou ervas marinhas; e biomassa de casca de grãos, tais como as cascas de milho, cascas de trigo, casca de soja ou cascas de arroz. A biomassa de casca de grãos, palha e bagaço são mais eficientes e, de preferência, são utilizadas.

[013] A hidrólise da biomassa que contém a celulose pretende reduzir o peso molecular da celulose para a produção de monossacarídeos ou oligossacarídeos. Na hidrólise da biomassa que contém a celulose, um componente da hemicelulose, tais como o xilano, manano ou um rabinano também é hidrolisado simultaneamente. Nesta etapa, uma ceIulase derivada a partir de fungos filamentosos é utilizada como uma enzima de sacarídeo para a hidrólise da biomassa que contém a celulose.

[014] A ceIulase derivada a partir de fungos filamentosos é uma composição de enzima que possui uma atividade de hidrólise de celulose para a sacarificação e contém uma pluralidade de componentes de enzima, tais como a celobiohidrolase, endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase, xiIanase e xilosidase. A ceIulase derivada a partir de fungos filamentosos pode realizar a hidrólise eficiente da celulose através dos efeitos de concerto ou efeitos complementares da pluralidade de componentes de enzimas na degradação da celulose.

[015] Os exemplos da celulase derivada a partir de fungos filamentosos incluem as celulases derivadas a partir do gênero Trichoderma, gênero Aspergillus, gênero Cellulomonas, gênero Chlostridium, gênero Streptomyces, gênero Humicola, gênero Acremonium, do gênero Irpex, gênero Mucor, gênero Talaromyces, gênero Phanerochaete, fungo de podridão branca, e fungo de podridão marrom. Entre estas celulases derivadas de fungos filamentosos, a celulase derivada a partir do gênero Trichoderma que possui uma atividade de degradação elevada de celulose, de preferência, é utilizada.

[016] A celulase derivada a partir do gênero Trichoderma é uma composição de enzima que contém a celulase derivada a partir de microrganismos do gênero Trichoderma, como um componente principal. Os microrganismos do gênero Trichoderma não são especialmente restritos, e, de preferência, são o Trichoderma reesei, e seus exemplos específicos podem incluir o Trichoderma reesei Q 19414, Trichoderma reesei QM9 123, Eric / moderno um reesei RUTC-30, Trichoderma reesei PC3 -7, Trichoderma reesei, CL-847, Trichoderma reesei MCG77, Trichoderma reesei MCG80, e Trichoderma viride gM9123. As cepas mutantes com produtividade aprimorada de celulase através de submeter os microrganismos mencionados acima derivados a partir do gênero Trichoderma para a mutagenesis utilizando um mutagênio, irradiação UV, ou similares podem ser utilizadas.

[017] A celobiohidrolase é um termo geral para as enzimas caracterizadas pela hidrólise de celulose, na unidade de celobiose, a partir da sua porção terminal, e os dois tipos seguintes são conhecidos: a Celobiohidrolase I, que inicia a clivagem a partir da redução do lado terminal da cadeia de celulose e Celobiohidrolase II, que realiza a partir do lado terminal não redutor. O grupo de enzimas pertencentes à celobiohidrolase está descrito como o número EC: EC3. 2. 1. 91.

[018] A endoglucanase é um termo geral para as enzimas caracterizadas pela hidrólise de celulose de maneira aleatória a partir da porção central de uma cadeia molecular de celulose. O grupo de enzimas pertencentes à endoglucanase está descrito como o número EC: EC3. 2.1.4, EC3. 2.1.6, EC3. 2.1.39 ou EC3.2. 1,73.

[019] A exoglucanase é um termo geral para as enzimas caracterizadas pela hidrólise de celulose de maneira aleatória a partir da extremidade terminal de uma cadeia molecular celulose. O grupo de enzimas pertencentes à exoglucanase está descrito como o número EC: EC3. 2. 1.7 ou EC3. 2. 1.58.

[020] A β-glucosidase é um termo geral para as enzimas caracterizadas pela ação em celo oligossacarídeos ou celobiose. O grupo de enzimas pertencentes à β-glucosidase está descrito como o número EC: EC3. 2.1.21.

[021] A xilanase é um termo geral para as enzimas caracterizadas pela ação em hemicelulose ou, em especial, o xilano. O grupo de enzimas pertencentes à xilanase está descrito como o número EC: EC3. 2. 1.8.

[022] A xilosidase é um termo geral para as enzimas caracterizadas pela ação em xilo-oligossacarídeos. O grupo de enzimas pertencentes à xilosidase está descrito como o número EC: EC3.2. 1,37.

[023] As enzimas brutas, de preferência, são utilizadas, como a celulase derivada a partir de fungos filamentosos. A enzima bruta é derivada a partir do sobrenadante da cultura do meio em que o microrganismo é cultivado durante qualquer período de tempo, o meio sendo preparado de tal maneira que o fungo filamentoso produz a celulase. Os componentes do meio utilizados não são especialmente restritos; e um meio com a celulose sendo adicionada, em geral, pode ser utilizado, para promover a produção de celulase. Por conseguinte, como a enzima bruta, um líquido de cultura, como é ou o sobrenadante da cultura obtido apenas através da remoção do corpo do fungo, de preferência, é utilizada.

[024] Uma proporção em peso de cada componente de enzima na enzima bruta não é especialmente restrita. Por exemplo, um líquido de cultura derivado a partir de Trichoderma reesei contém de 50 a 95% em peso de celobiohidrolase; e os componentes restantes incluem a endoglucanase, β- glucosidase, e similares. O gênero de microrganismos Trichoderma produz os componentes de celulase fortes em um líquido de cultura. Por outro lado, em relação à β-glucosidase, a enzima é mantida na parte interna da célula ou nas camadas de superfície da célula e, por conseguinte, a atividade de β-glucosidase é baixa no líquido de cultura. Em vista disto, a β-glucosidase de diferentes espécies ou da mesma espécie ainda pode ser adicionada à enzima bruta. Como a β-glucosidase de diferentes espécies, a β-glucosidase derivada a partir do gênero Aspergillus, de preferência, pode ser utilizada. Os exemplos de β- glucosidase derivada a partir do gênero Aspergillus incluem a Novozyme 188, que está comercialmente disponível de Novozymes A / S. A β-gIucosidase a partir de espécies diferentes ou das mesmas espécies pode ser adicionada à enzima bruta através de um método que compreende a introdução de um gene para o gênero de microrganismos Trichoderma, a cultura de microrganismo do gênero Trichoderma que é geneticamente modificada para produzir o produto do gene em um líquido de cultura e isolando o líquido de cuItura.

[025] A biomassa que contém a celulose, de preferência, é pré- tratada, para aprimorar a eficiência de hidrólise, antes da sua hidrólise pela celulase derivada a partir de fungos filamentosos. Um método de pré-tratamento da biomassa que contém a celulose não é especialmente restrito; e seus exemplos específicos incluem um tratamento com o ácido, um tratamento com o ácido sulfúrico, um tratamento com o ácido sulfúrico diluído, um tratamento alcalino, um tratamento com o hidróxido de sódio, um tratamento com a amônia, um tratamento hidrotérmico, um tratamento água subcrítica, um tratamento de pulverização, e um tratamento de vapor. Um tratamento hidrotérmico e um tratamento com o ácido sulfúrico diluído são, de preferência, na presente invenção.

[026] Um tratamento hidrotérmico é realizado a uma temperatura de 100 a 400°C durante de 1 segundo a 60 minutos após a adição de água de maneira que a concentração de sólidos da biomassa alcança de 0,1 a 50% em peso. O tratamento sob tal condição de temperatura provoca a hidrólise da celulose ou hemicelulose. Especialmente, uma temperatura que varia a partir de 100 a 250°C é de preferência; e, de preferência, é um período de tempo para o tratamento que varia a partir de 5 a 30 minutos. O número de vezes do tratamento não é especialmente restrito; e é suficiente para realizar o tratamento, pelo menos, uma vez. Especialmente quando o tratamento é realizado duas vezes ou mais, o primeiro e segundo tratamentos e os tratamentos posteriores podem ser realizados sob condições diferentes.

[027] No tratamento hidrotérmico, pode ser adicionado o ácido sulfúrico para um tratamento com o ácido sulfúrico diluído. A quantidade de ácido sulfúrico para ser adicionada, de preferência, é de 0,1 a 150 mg por g (peso) de biomassa que contém a celulose.

[028] As condições para uma reação de hidrólise de uma celulase derivada a partir de fungos filamentosos não se restringem desde que a hidrólise seja realizada de acordo com as condições de reação de preferência para a celulase derivada a partir de fungos filamentosos. No caso em que a celulase derivada a partir de fungos filamentosos é utilizada, a temperatura de reação, em geral, de preferência, está em um intervalo a partir de 15 a 100°C, de maior preferência, em um intervalo a partir de 40 a 60°C e, de preferência ainda, de 50°C. O pH da hidrólise, de preferência, está em um intervalo a partir de pH 3 a 9, de maior preferência, em um intervalo a partir de pH de 4 a 5, 5 e, de maior preferência ainda, de 5. Deve ser observado que o pH pode ser ajustado através da adição de um ácido ou um alcalino, para alcançar o pH desejado; e um tampão pode ser utilizado de maneira adequada. Além disso, para promover o contato entre a biomassa que contém a celulose e a enzima de sacarificação e para tornar a concentração de açúcar do hidrolisado uniforme, a mistura com agitação, de preferência, é realizada. A água é adicionada para que a concentração de sólidos de celulose, de preferência, esteja em um intervalo a partir de 1 a 25% em peso e, de maior preferência, em um intervalo a partir de 5 a 20% em peso.

ETAPA 2

[029] A etapa (2) envolve a filtração de um hidrolisado obtido na etapa (1) através de uma membrana de ultrafiltração para recuperar a celulase derivada a partir de fungos filamentosos como um não permeado e para obter um líquido de açúcar como um permeado. A enzima recuperada como o permeado não pode ser reutilizada na etapa (1); e o consumo de enzima na etapa (1) pode ser reduzido.

[030] O peso molecular de cisalhamento da membrana de ultrafiltração utilizado na presente invenção não é especialmente restrito, desde que possibilite a passagem de, pelo menos, um monossacarídeo, isto é, a glicose (peso molecular 180) e a xilose (peso molecular 150) e possa bloquear a ceIulase derivada a partir de fungos filamentosos. De preferência, de ser um peso molecular de cisalhamento 500 a 50.000. Do ponto de vista, da separação das substâncias estranhas que exibem as ações inibidoras para a reação enzimática a partir da enzima, o peso molecular de cisalhamento, de maior preferência, está em um intervalo a partir de 5.000 a 50.000 e, de preferência ainda, em um intervalo a partir de 10.000 a 30.000.

[031] Como materiais da membrana de ultrafiltração, a sulfona de poliéter (PES), polissulfona (PS), poliacrilonitrilo (PAN), difluoreto de polivinilideno (PVDF), celulose regenerada, celulose, éster de celulose, polissulfona sulfonada, sulfona sulfonada de poliéter, poliolefina, álcool de polivinila, polimetacrilato de metila, tetrafluoreto de polietileno, e similares podem ser utilizados. Devido à celulose regenerada, celulose, e éster de celulose serem submetidos à degradação por celulase, as membranas de ultrafiltração, com os polímeros sintéticos, tais como o PES ou PVDF como um material, de preferência, são utilizados.

[032] Como um método de filtração com a membrana de ultrafiltração, a filtração sem saída e a filtração de fluxo cruzado estão disponíveis com a filtração de fluxo cruzado sendo de preferência do ponto de vista da inibição de entupimento da membrana.

[033] Como uma forma de membrana da membrana de ultrafiltração, aquelas em uma forma adequada, tais como um tipo de membrana plana, um tipo em espiral, um tipo tubular, ou um tipo de fibra oca podem ser utilizadas. Os seus exemplos específicos incluem o tipo G-5, tipo G-10, tipo G- 20, tipo G-50, tipo PW, e tipo HWSU F, que estão disponíveis a partir de Desal; HFN-180, HFND-183, HFM-251, HFM-300, HFK-131, HFK-328, MPT-U20, MPS- U20P e NPS-U20 S, que estão disponíveis a partir de KOCH; SPE1, SPE3, SPE5, SPE10, SPE30, SPV5, SPV50 e SOW30, que estão disponíveis a partir de Synder; aqueles que correspondem a um peso molecular de cisalhamento de 3.000 a 10.000, em Microza (marca registada) da série F que é fabricado pela Asahi Kasei Corporation; e NTR7410 e NTR7450, que são fabricados pela Nitto Denko Corporation.

TRATAMENTO COM UMA OU MAIS ENZIMAS SELECIONADAS A PARTIR DO GRUPO QUE CONSISTE EM PECTINASE, GLUCOAMILASE E LIPASE

[034] A presente invenção é caracterizada através do tratamento da biomassa que contém a celulose com uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em pectinase, glucoamilase e lipase, em um estágio anterior para a etapa (1) ou na etapa (1). O tratamento da biomassa que contêm a celulose com uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em pectinase, glucoamilase e lipase, em um estágio anterior para a etapa (1) ou na etapa (1) fornece o efeito de aumento na quantidade da celulase derivada a partir de fungos filamentosos que pode ser recuperada na etapa (2), quando comparada para o caso em que esse tratamento não é realizado e, em especial, o efeito de aumento notável na quantidade de celobiohidrolase a ser recuperada, a celobiohidrolase sendo um componente enzimático principal na hidrólise da biomassa que contém a celulose, entre os componentes de enzima contidas na celulase derivada a partir de fungos filamentosos.

[035] A pectinase se refere a uma enzima que possui a atividade de degradação da pectina. A pectina é um polissacarídeo complexo que consiste em vegetais e contém como componente principal um ácido poligalacturônico incluindo os ácidos α-1,4-galacturônicos ligados. A pectinase é definida como incluindo as espécies de enzimas, pelo menos, envolvidas na hidrólise da pectina, tais como a poligalacturonase (EC3.2.1.15), liase de pectina (EC4.2.2.10), liase de pectato (EC4.2.2.2), e esterase de pectato de metila (EC3.1. 1.11).

[036] A glucoamilase (EC3.2.1.3) se refere a uma enzima que possui a atividade de hidrólise em uma ligação α-1,4 na extremidade terminal não redutora de amido.

[037] A lipase se refere a uma enzima que hidrolisa os lipídeos, em especial, uma enzima (EC3.1.1.3) que possui a atividade de ligações de éster hidrolizantes de ácidos graxos e triglicerídeos.

[038] A pectinase, glucoamilase ou lipase utilizada na presente invenção de preferência, é derivada a partir do gênero Aspergillus. Os exemplos do gênero Aspergillus pode incluir o Aspergillus nigar, Aspergillus orizae, Aspergillus awamori,e Aspergillus acretus. As enzimas derivadas do gênero Aspergillus mostram a atividade enzimática máxima a uma temperatura de reação ideal de cerca de 50°C e, por conseguinte, podem ser utilizadas à mesma temperatura, quando utilizadas em combinação com a celulase derivada a partir de fungos filamentosos conforme será descrito abaixo.

[039] O procedimento que a biomassa que contém a celulose é tratada com uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em pectinase, glucoamilase, e lipase, em um estágio anterior para a etapa (1) ou na etapa (1) especificamente é uma etapa de hidrólise da biomassa que contém a celulose, na etapa (1) por uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em pectinase, glucoamilase e lipase antes ou durante a hidrólise pela celulase derivada a partir de fungos filamentosos na etapa (1). Este processo também inclui uma etapa de hidrólise do hidrolisado obtido na etapa (1) por uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em pectinase, glucoamilase e lipase. A biomassa que contém a celulose na etapa (1) pode ser tratada com uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em pectinase, glucoamilase e lipase isoladamente ou em combinação, antes ou durante a hidrólise com a celulase na etapa (1); e o tratamento enzimático, de preferência, é realizado, pelo menos, durante a hidrólise com a celulase na etapa (1).

[040] A quantidade de uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em pectinase, glucoamilase, e lipase a ser adicionada no estágio anterior à etapa (1) ou na etapa (1) não é especialmente restrita, e, de preferência, é de 1/10 ou inferior, em uma proporção em peso da celulase derivada a partir de fungos filamentosos do ponto de vista de reduzir o custo da enzima. Deve ser observado que a quantidade de enzimas a ser adicionada referida no presente, é uma quantidade total de uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em pectinase, gIucoamilase, e Iipase no estágio anterior à etapa (1) ou na etapa (1). O limite inferior da quantidade de enzimas a ser adicionada não é especialmente restrito, desde que os efeitos da presente invenção sejam obtidos, e é de 0,001 mg/g da biomassa, em uma proporção em peso da enzima a ser introduzida no peso da biomassa que contêm a celulose.

[041] A constituição de uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em pectinase, glucoamilase, e lipase a ser adicionada no estágio anterior à etapa (1) ou na etapa (1) pode ser a pectinase, glucoamilase, e lipase, respectivamente, isoladamente ou uma combinação de duas ou mais destas. Uma combinação de duas ou mais das enzimas é de preferência; e uma combinação das três enzimas é de maior preferência.

OUTRAS ETAPAS

[042] Além disso, o hidrolisado obtido na etapa (1), de preferência, é submetido a uma separação sólido-líquido. A separação sólido-líquido pretende separar o hidrolisado em um componente da solução (a seguir também designada como “solução de açúcar aquoso”) que contém os açúcares e um resíduo sólido de sacarificação), por conseguinte, assegurando a separação efetiva e a recuperação do líquido de açúcar e da celulase derivada a partir de fungos filamentosos na etapa (2).

[043] Um método para a separação sólido-líquido não é especialmente restrito; e o hidrolisado pode ser submetido à separação sólido- líquido através da centrifugação com um decantador de parafuso ou através da filtração por prensa com prensa de filtro ou uma prensa de correia. A filtração por prensa com a prensa de filtro ou uma prensa de correia é de preferência, e fornece um componente da solução que contém os sólidos menos insolúveis e as substâncias menos turvos, quando comparado com a centrifugação. As substâncias menos turvas também, de preferência, são do ponto de vista da inibição da incrustação da membrana de ultrafiltração em um estágio posterior. Quando a separação sólido-líquido é realizada através de filtração por prensa por meio de uma prensa de filtro ou uma prensa de correia, um período de tempo para o tratamento para a separação sólido-Iíquido pode ser reduzida, de maneira eficiente, através do tratamento com uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em pectinase, glucoamilase e lipase no estágio anterior à etapa (1) ou na etapa (1). ]

[044] A solução aquosa de açúcar obtida pela separação de sólido-líquido, de preferência, é filtrada através de uma membrana de microfiltração antes de ser submetida à etapa (2). Uma vez que a filtração através de uma membrana de microfiltração possibilita a remoção de teor de sólidos, que não poderia ser completamente separada através da separação sólido-líquido, a etapa (2) pode ser realizada de maneira mais eficiente.

[045] A membrana de microfiltração é uma membra que possui um diâmetro de poro fino médio de 0,01 μm a 5 μm. O material da membrana de microfiltração não é especialmente restrito desde que possa remover os teores de sólidos que não poderiam ser completamente separados pela separação sólido-líquido mencionada acima; e os seus exemplos incluem os materiais orgânicos tais como a celulose, éster de celulose, polissulfona, sulfona de poliéter, polietileno clorinado, polipropileno, poliolefina, álcool de polivinila, polimetilmetacrilato, fluoreto de polivinilideno, e tetrafluoreto de polietileno; metais, tais como o aço inoxidável; e materiais inorgânicos tais como a cerâmica.

[046] O líquido de açúcar obtido pela presente invenção é utilizável como um material bruto de fermentação; e as substâncias químicas podem ser produzidas por cultura de microrganismos. Os exemplos específicos da substância química podem incluir as substâncias produzidas em massa na indústria de fermentação, tais como os álcoois, ácidos orgânicos, amino ácidos e ácidos nucleicos. Por exemplo, podem ser listados os álcoois, tais como o etanol, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol, ou glicerol; ácidos orgânicos tais como o ácido acético, ácido lático, ácido pirúvico, ácido succínico, ácido málico, ácido itacônico, ou ácido cítrico; nucleosídeos tais como a inosina ou guanosina; os nucleotídeos, tais como o ácido inosínico ou ácido guanílico; e os compostos de aminas, tal como a cadaverina. Além disso, o líquido de açúcar pode ser aplicado à produção deenzimas, antibióticos, proteínas recombinantes, ou similares.

EXEMPLOS

[047] A título de Exemplos, a presente invenção será especificamente descrita abaixo. A presente invenção, no entanto, não está limitada aos Exemplos.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1 MÉTODO DE PREPARAÇÃO DA CELULASE DERIVADA A PARTIR DE FUNGOS FILAMENTOSOS (LÍQUIDO DE CULTURA)

[048] A celulase derivada a partir de fungos filamentosos (líquido de cultura) foi preparada através do método seguinte.

PRECULTURA

[049] 5% (p/vol) de licor de infusão de milho, 2% (p/vol) de glicose, 0,37% (p/vol) de tartarato de amônio, 0,14% (p/vol) de sulfato de amônio, 2,0% (p/vol) de fosfato de diidrogênio de potássio, 0,03% (p/vol) de cloreto de cálcio diidratado, 0,03% (p/vol) de heptaidrato de sulfato de magnésio, 0,02% (p/vol) de cloreto de zinco, 0,01% (p/vol) de cloreto de hexaidratado de ferro (III), 0,004% (p/vol) de pentaidrato de sulfato de cobre (II), 0,0008% (p/vol) de cloreto de tetraidrato de manganês, 0,0006% (p/vol) de ácido bórico, e 0,0026% (p/vol) de tetraidrato de heptamolibdato de hexaamônio foram adicionados à água destilada; e 100 mL da solução foram carregados em um balão de Erlenmeyer de 500 mL com um deflector e submetidos à esterilização em autoclave, a uma temperatura de 121°C durante 15 minutos. Em seguida, a solução foi deixada resfriar, PE-M e Tween 80, cada um, foi esterilizado por autoclave a uma temperatura de 121°C durante 15 minutos em separado, foi adicionado em uma quantidade de 0,01% (p/vol) cada. A Trichoderma reesei ATCC66589 foi plantada a 1 x 105 fungos/mL neste meio de pré-cultura, e agitada em cultura em uma temperatura de 28°C e 180 rpm durante 72 horas para preparar uma pré-cultura (agitador: BIO-AGITADOR BR-40 LF fabricado por TAITEC).

CULTURA PRINCIPAL

[050] 5% (p/vol) de licor de infusão de milho, 2% de glicose, 10% (p/vol) de celulose (AviceI), 0,37% (p/vol) de tartarato de amônio, 0,14% (p/vol) de suIfato de amônio, 0,2% (p/vol) de fosfato de diidrogênio de potássio, 0,03% (p/vol) de cloreto de cálcio diidratado, 0,03% (p/vol) de heptaidrato de sulfato de magnésio, 0,02% (v/vol) de cloreto de zinco, 0,01% (v/v) de cloreto de hexaidratado de ferro (III), 0,004% (p/vol) de pentaidrato de sulfato de cobre (II), 0,0008% (p/vol) de cloreto de tetraidrato de manganês, 0,0006% (p/vol) de ácido bórico, e 0,0026% (p/vol) de tetraidrato de heptamolibdato de hexaamônio foram adicionados à água destilada; e 2,5 L da solução foram carregados em um frasco de agitação de 5 L de volume (DPC- 2A fabricado por Able) e submetidos à esterilização em autoclave, a uma temperatura de 121°C durante 15 minutos. Em seguida, a solução foi deixada resfriar, PE-II e Tween 80, cada um, foi esterilizado em autoclave, a uma temperatura de 121°C durante 15 minutos, em separado, cada um foi adicionado em uma quantidade igual a 0,1%. 250 m L de Trichoderma reesei, ATCC66589, que foi precuIturada no meio líquido através do método mencionado acima, foram inoculados, e em seguida, agitados em cultura sob as condições: uma temperatura de 28°C; 87 horas; 300 rpm; e uma quantidade de aeração: 1 vvm. Após a centrifugação, um sobrenadante foi submetido à filtração por membrana (Stericup-GV fabricado pela Millipore Corporation; material: PVDF). O liquido de cultura controlado sob as condições descritas acima foi utilizado como uma celulase derivada a partir de fungos filamentosos nos seguintes Exemplos.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2 MEDIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES

[051] A concentração de glicose e xilose que estava contida em um líquido de açúcar foi quantificada sob as condições de HPLC descritas abaixo, através da comparação com uma amostra padrão. - Coluna: Luna NHz (fabricada por Phenomenex) - Fase móvel: Nilli-Q: acetonitrila = 25:75 (taxa de fluxo de 0,6 mL/min) - Solução de reação: nenhuma - Método de detecção: RI (índice de refração diferencial) - Temperatura: 30°C

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3 MÉTODP PARA A MEDIÇÃO DAS ATIVIDADES DA CELULASE DERIVADA A PARTIR DE FUNGOS FILAMENTOSOS

[052] Tal como para as atividades de celulase, foram determinadas as atividades de celobiohidrolase e endoglucanase na degradaçã da celulose a partir da atividade de degradação (1) 4-nitrofenil-β-D- lactopiranoside (pNP-Lac); a atividade de β-gIucosidase a partir da atividade de degradação (2) 4-nitrofenil-β- D-glucopiranósido (pNP-CIV); e as atividades de endoxilanase e xilosidase envolvida na degradação de xilana como um componente principal da hemicelulose da atividade de degradação (3) 4-nitrofenil- β-D-xilopiranoside (pNP-XiI). Deve ser observado que os substratos de (1) a (3) acima coletivamente se referem aos açúcares pNP.

[053] A 0,9 mL de tampão de ácido acético a 100 mM (pH 5,0) contendo cada substrato a uma concentração de 1 mM cada, 0,1 mL de líquido de enzima foi adicionado e deixado reagir a 30°C. O tempo de reação foi fixado em 60 min quando o substrato era o PNP-Lac, 10 minutos para o pNP-Glc, e 30 minutos para o pNP-Xil. Após a reação, 0,1 mL de solução aquosa de carbonato de sódio a 2 M foi adicionado para terminar a reação e a absorvância a 405 nm foi medida (ODtest). A absorvância a 405 nm também foi medida da mesma maneira conforme descrito acima para, como um branco, preparado através da adição de, na ordem mencionada, uma solução de carbonato de sódio aquoso a 2 N e o líquido de enzima para a solução de substrato (ODblank). A quantidade de enzima que gera um μmol de 4-nitrofenol durante um minuto é definida como 1 U no sistema de reação acima, e um valor de atividade (U/mL) foi calculado de acordo com a seguinte Fórmula. Deve ser observado que o coeficiente de extinção molecular milimolar de 4-nitrofenoI no sistema de reação acima é de 17,2 L/mmol/cm. A atividade de degradação de pNP-Lac (U/mL) = (ODtest - ODblank) x 1,1 (mL) x proporção de diluição da enzima} / 17,2 x 60 (minutos) x 0,1 (mL)}. - A atividade de degradação de pNP-GIc (U/mL) = {(ODtest - ODblank) x 1,1 (mL) proporção de diluição da enzima / 17, 2 x 10 (minutos) x 0,1 (mL)} - A atividade de degradação de pNP-XiI (U/mL) = (ODtest - ODblank) x 1,1 (m L) x proporção de diluição da enzima / {17,2 x 60 (minutos) x 0,1 (mL)

EXEMPLO 1

[054] Como a biomassa que contém a celulose, (1) uma casca de milho), (2) uma casca de soja, (3) palha, e (4) bagaço foram utilizados. O pré-tratamento da biomassa que contém a celulose antes da hidrólise pela celulase derivada a partir de fungos filamentosos foi realizado sob condições de pré-tratamento que eram diferentes dependendo do material bruto como a seguir.

(1) CASCA DE MILHO (CONDIÇÃO DE PRÉ-TRATAMENTO: TRATAMENTO DE ÁCIDO SUIFÚRICO DILUÍDO)

[055] Um produto de casca de milho seco produzido na China foi utilizado (adquirido de GODO Co., Ltd.). 2,3 kg de 13 g/L de água de ácido sulfúrico foram adicionados a 1 kg de uma casca de milho (seco), de maneira que o teor de água alcançou 70% (30 mg de ácido sulfúrico / g de casca de milho). A casca de milho com a água do ácido sulfúrico a ser adicionada foi submetida a um tratamento hidrotérmico utilizando uma autoclave a 120°C durante 30 minutos. Após a autoclavagem, a água de amônia foi adicionada para o produto de pré-tratamento para ajustar o pH a 5. Este produto foi definido como um produto de pré-tratamento 1.

(2) CASCA DE SOJA (CONDIÇÃO DE PRÉ-TRATAMENTO: TRATAMENTO COM O ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO

[056] Um produto de casca de soja seca produzido na China foi utilizado (adquirido de GODO Co., Ltd.). 2,3 kg de 65 g/L de água de ácido sulfúrico foram adicionados a 1 kg de uma casca de soja (seca) de maneira que o teor de água alcançou 70% (150 mg de ácido sulfúrico / g de casca de soja). A casca de soja com a água de ácido sulfúrico sendo adicionada foi submetida a um tratamento hidrotérmico utilizando uma autoclave a 120°C durante 30 minutos. Após a autoclavagem, a água de amônia foi adicionada para o produto de pré-tratamento para ajustar o pH a 5. Este produto foi definido como um produto de pré-tratamento 2.

(3) PALHA (CONDIÇÃO DE PRÉ-TRATAMENTO: TRATAMENTO HIDROTÉRMICO)

[057] Um produto de palha seca (palha de arroz) produzido no Japão foi utilizado (oferecido por um agricultor). A palha foi moída em um moinho cortador rotativo RCM-400 (malha de 8 mm) fabricado por NARA Machinery Co., LTD. a uma velocidade de rotação de 420 rpm e, em seguida, submetida a um tratamento hidrotérmico. Um dispositivo de jateamento (tamanho do reator de 2 L) fabricado pela Nihon Dennetsu Co., Ltd. foi utilizado. Como um gerador de vapor, foi utilizada uma caldeira elétrica de 40 kW. Uma vez que a temperatura de tratamento inequivocamente é determinada quando a pressão de tratamento é definida, o tratamento foi realizado sob as condições de reação: 215°C e 5 minutos. Sob estas condições, a 200 g de palha moída foram introduzidos de cada vez, em um total de cinco vezes. O teor de sólidos contendo a água de jateamento foi agitado enquanto 2 L de água foram adicionados, e separados em uma matéria líquida e sólida hidrotermicamente tratada utilizando uma centrífuga para a utilização em laboratório “HimacCF7D2”, fabricada por Hitachi Koki Co., Ltd. a 5.000 rpm. O teor de água da matéria sólida foi ajustado para 70%, e água de amônia foi utilizada para ajustar o pH a 5. Este produto foi definido como um produto de pré-tratamento 3.

(4) BAGAÇO (CONDIÇÃO DE PRÉ-TRATAMENTO: TRATAMENTO COM O ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO)

[058] Um produto de bagaço seco produzido em Taiwan foi utilizado (adquirido de Taito-Nosan). O bagaço foi moído em um moinho cortador rotativo RCN-400 (malha de 20 mm), fabricado por NARA Machinery CO., LTD. a uma velocidade de rotação de 420 rpm. 2,3 kg de 13 g/L de ácido sulfúrico a água foram adicionados a 1 kg de bagaço (seco) de maneira que o teor de água alcançou 70% (30 mg de ácido sulfúrico / g de bagaço). O bagaço com a água de ácido sulfúrico sendo adicionado foi submetido a um tratamento hidrotérmico utilizando uma autoclave a 120°C durante 30 minutos. Após a autoclavagem, a água de amônia foi adicionada para o produto de pré-tratamento para ajustar o pH a 5. Este produto foi definido como um produto de pré-tratamento 4.

[059] Para os produtos de pré-tratamento de 1 a 4, a água foi adicionada para alcançar uma concentração de teor de sólidos de 10%. Além disso, a celulase derivada a partir de fungos filamentosos, que foi preparada no Exemplo de Referência 1, foi adicionada à hidrólise. A quantidade de celulase derivada a partir de fungos filamentosos adicionada foi: 2 mg/g do produto de pré-tratamento 1; 4 mg/g do produto de pré-tratamento 2; 8 mg/g do produto de pré-tratamento 3; e 8 mg/g do produto de pré-tratamento 4 e, em seguida, a hidrólise foi iniciada. A reação de hidrólise foi realizada a 50°C durante 48 horas.

[060] Na hidrólise na etapa (1), a pectinase (“Pectinase PL Amano”, fabricada por Amano Enzyme Inc.), a glucoamilase (“Amiloglucosidase” fabricada por Megazyme), e lipase (“Lipase AS Amano”, fabricada por Amano Enzyme Inc.) foram adicionadas em cada combinação indicada na Tabela 1 (a quantidade de enzima(s) adicionada foi: 0. 2 mg/g do produto de pré-tratamento quando uma das enzimas foi adicionada; 0,1 mg/g de cada produto de pré- tratamento quando duas das enzimas foram adicionadas em combinação; 0,06 mg/g de cada produto de pré-tratamento quando três enzimas foram adicionadas em combinação) para o tratamento enzimático. O caso em que nenhuma de pectinase, Glucoamilase e lipase foi adicionada foi definido como o Exemplo Comparativo 1.

[061] 8 kg dos respectivos materiais tratados enzimaticamente obtidos na etapa acima foram prensados em uma prensa de filtro fabricada por Yabuta Kikai Co., Ltd. em 0,2 MPa para a separação sólido-líquido. Um tecido T2731C (fabricado de poliéster, pano duplo), fabricado por Yabuta Kikai Co., Ltd. foi utilizado como um pano de filtro. A prensagem pneumática foi conduzida a uma pressão de 0,3 MPa; e um líquido prensado foi recuperado a partir da biomassa submetida à separação sólido-líquido. Este líquido foi misturado com o líquido separado através da separação sólido-líquido; e 6 kg de uma solução aquosa de açúcar foram recuperados como um componente da solução. A Tabela 1 indica um período de tempo necessário para a separação sólido-líquido.

TABELA 1 PERÍODO DE TEMPO NECESSÁRIO PARA COMPLETAR A SEPARAÇÃO SÓLIDO-LÍQUIDO DE 8 KG DE LÍQUIDO DE AÇÚCAR ATRAVÉS DO FILTRO DE PRENSA

[062] Após a filtração de toda a quantidade de 6 kg das respectivas soluções aquosas de açúcar recuperadas através de uma membrana de microfiltração que possui um diâmetro de poro de 0,22 μm, o permeado obtido ainda foi filtrado através de uma membrana de ultrafiltração. Como a membrana de ultrafiltração, o HFU (fabricado por Toray Membrane EUA; material: flúor de polivinilideno; peso molecular de cisalhamento: 150.000) foi utilizado. A ultrafiltração foi realizada através da utilização da unidade de filtração da membrana plana “SEPA-II” (fabricada por GE Osmonics) sob as condições: uma velocidade linear da superfície da membrana de 20 cm/seg e uma pressão de filtração de 3 MPa, até que a quantidade do líquido recuperado a partir do lado do não permeação atingiu 0,6 L. A(s) enzima(s) no não permeado obtida(s) após o tratamento de ultrafiltração foi(foram) definida(s) como enzima(s) recuperada(s), e as atividades da(s) enzima(s) recuperada(s) foram medidas através do método de medição das atividades de celulase derivada a partir de fungos filamentosos no Exemplo de Referência 3. As Tabelas de 2 a 5 indicam as atividades da(s) enzima(s) recuperada(s) em relação à introdução da celulase derivada a partir de fungos filamentosos. TABELA 2 ATIVIDADES DA(S) ENZIMA(S) RECUPERADA(S) DO HIDROLISADO DERIVADO A PARTIR DA CASCA DE MILHO TABELA 3 ATIVIDADES DA(S) ENZIMA(S) RECUPERADA(S) DO HIDROLISADO DERIVADO A PARTIR DA CASCA DE SOJA TABELA 4 ATIVIDADES DA(S) ENZIMA(S) RECUPERADA(S) DO HIDROLISADO DERIVADO A PARTIR DA PALHA (ARROZ) TABELA 5 ATIVIDADES DA(S) ENZIMA(S) RECUPERADA(S) DO HIDROLISADO DERIVADO A PARTIR DO BAGAÇO APLICABILIDADE INDUSTRIAL O método para a produção de um Iíquido de açúcar na presente invenção envolve a utilização da biomassa que contém a celulose como um material bruto, e o líquido de açúcar obtido pode ser utilizado como uma fermentação do material bruto para diversas substâncias químicas.

Claims (7)

1. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM LÍQUIDO DE AÇÚCAR, a partir da biomassa que contém a celulose, caracterizado por compreender: - etapa (1) da hidrólise da biomassa que contém a celulose por uma celulase derivada a partir de fungos filamentosos; e - etapa (2) de filtragem de um hidrolisado obtido na etapa (1) através de uma membrana de ultrafiltração para recuperar a celulase derivada a partir de fungos filamentosos como um não permeado e para se obter um líquido de açúcar como um permeado, - em que a biomassa que contém a celulose é tratada com uma ou mais enzimas selecionadas a partir da (i) combinação de lipase e pectinase, e (ii) combinação de lipase, pectinase e glucoamilase, em um estágio anterior para a etapa (1) ou na etapa (1).

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dita biomassa que contém a celulose ser uma ou mais biomassas selecionadas a partir do grupo que consiste em biomassa de casca de grãos, palha e bagaço.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela dita biomassa de casca de grãos ser uma ou mais biomassas selecionadas a partir do grupo que consiste em uma casca de milho, uma casca de soja, e uma casca de trigo.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo peso de ditas uma ou mais enzimas ser de 1/10 ou inferior com base no peso da celulase derivada a partir de fungos filamentosos.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela biomassa que contém a celulose ser tratada com as três enzimas pectinase, gIucoamilase e lipase, no estágio anterior à etapa (1) ou na etapa (1).

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela etapa (2) ser uma etapa de sujeitar o hidrolisado obtido na etapa (1) à separação sólido-líquido para obter um componente da solução, e filtrar o componente da solução através da membrana de ultrafiltração.

7. MÉTODO, acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela dita separação sólido-líquido ser realizada por meio de filtração por prensa.